一种亲和生物膜、制备方法及其应用
一种亲和生物膜、制备方法及其应用
【技术领域】
[0001 ]本发明属于膜技术领域，具体涉及一种亲和生物膜、制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 内毒素是一种毒性极强的致炎和热原物质，是内毒素血症及感染性休克的主要致 病介质，低剂量的内毒素就能够诱发全身炎症反应综合症(SIRs)、多器官功能衰竭综合症 (MODS)、脓毒症等导致各年龄组重要死亡的疾病。
[0003] 随着生物制药和生物医学工程相关领域的发展，人们对生物产品中可能存在的微 量有害物质的清除越来越重视。由于内毒素的相对分子质量较大，与大分子生物制品在同 一数量级，有效清除制品中、特别是生物制品中污染的内毒素一直是医学、制药、生物工程 等领域研究的热点。
[0004] 迄今为止，在实际生产过程中能够应用的除去生物制品中内毒素的材料和方法并 不多。一些己经商品化的产品也存在吸附效率低，生产成本高等问题，很难大范围的推广使 用。因此，找到一种制备简单，价格低廉，高效的除去生物制品中内毒素的材料，仍然是生物 材料领域研究的热点和难点，仍具有十分重要的价值和实际意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种亲和生物膜、制备方法及其应用。
[0006] 基于上述目的，本发明采取如下技术方案： 一种亲和生物膜的制备方法，包括如下步骤： (1) 两亲性碳材料的制备:将大肠杆菌或酵母菌震摇分散均匀，取其上层菌悬液离 心，弃去废液，然后加入丙酮，震摇，离心，弃去丙酮，同法重复操作3~5次，得到大肠杆菌或 酵母菌的细胞壁，向得到的细胞壁中再加入2%(v/v)pH=6.0的戊二醛roS缓冲液，于150~ 200°C下反应(水热碳化合成法)8~10h，反应结束后，冷至室温，将下层沉淀洗涤，干燥，即得 两亲性碳材料； (2) 两亲性碳材料表面接枝聚乙烯亚胺或多粘菌素 B:取两亲性碳材料分散于pH=5.5 的PBS缓冲液中，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚 胺进行活化后，将其用pH=5.5的PBS缓冲液均匀分散，加入用pH=5.5的PBS缓冲液溶解的 聚乙烯亚胺或硫酸多粘菌素 B，振荡反应4~8h，反应结束后，洗涤，干燥，得到聚乙烯亚胺或 多粘菌素功能化的两亲性碳材料； (3)以聚乙烯亚胺或多粘菌素 B功能化的两亲性碳材料为添加剂制备亲和生物膜:向上 述聚乙烯亚胺或多粘菌素功能化的两亲性碳材料加入N，N二甲基甲酰胺，超声分散均匀，加 入聚偏氟乙烯树脂和聚乙烯吡咯烷酮，机械搅拌18~24h至均匀分散的铸膜液;将铸膜液均 匀铺膜，在空气中预蒸发卜3min后浸入到凝固液中待膜固化析出，在纯水中浸泡后即得厚 度为150~200um的亲和生物膜。
[0007] 进一步地，步骤(2)中两亲性碳材料与1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸 盐、N-羟基丁二酰亚胺质量比为1: (1~4) : (1~4)。
[0008]步骤(2)中两亲性碳材料与聚乙烯亚胺或多粘菌素 B的质量比为1:(1~3)。
[0009]步骤(3)中凝固液为乙醇和蒸馏水体积比为1: (3~6)的混合液。
[0010]上述的制备方法所制得的亲和生物膜。
[0011]所述亲和生物膜在去除生物制品中内毒素的应用。
[0012] 本发明中的接枝亲和配基的功能化两亲性碳材料其粒度分布均匀，单分散性较 好，能够在成膜机制中均匀分散且不易集聚，和疏水膜具有很好的相容性。以上述功能化的 两亲性碳材料为添加剂与疏水性膜材料聚偏氟乙烯共混制备的亲和生物膜，具备微孔滤膜 所具有微孔/大孔结构，大的内表面区域，高连通性和机械稳定性的特点。该亲和生物膜既 具有内毒素分子的识别功能，能够高选择去除生物产品中的内毒素，又具有很好的机械性 能和抗污性能，且制备简单，价格低廉。
[0013] 本发明中充分利用碳材料的两亲性和表面富含功能基团的特性，将亲和配基接枝 到两亲性碳材料表面的方法，可用来作为多种富含氨基和亚氨基的亲和配基(例如:聚乙烯 亚胺、壳聚糖、组胺、组氨酸等)在两亲性碳材料表面的固定、制备功能化两亲性碳材料。
[0014] 本发明以接枝后的两亲性碳材料为添加剂制备的亲和生物膜，可用于与其他疏水 性膜材共混制备亲和生物膜。
[0015] 本发明制备的亲和生物膜，克服了无机纳米粒子作为添加剂改善膜性质时易集聚 的缺点，提高膜的亲水性能和机械性能，使膜抗污性能提高，大大提高膜的使用寿命。
[0016] 本发明的亲和生物膜作为一种亲和滤膜可用于生物制品的纯化、提取与制剂和血 清中有毒、有害物质的去除，中药提取，血液灌流，水处理等方面。
[0017] 本发明的亲和生物膜可广泛的应用于生物化工和医药卫生领域。
【附图说明】
[0018] 图1为接枝了亲和基团的的两亲性碳材料结构示意图，其中：a为两亲性碳材料;b 为酰胺键连接;c为内毒素亲和配基。
[0019] 图2为聚偏氟乙烯亲和生物膜的样品图，其中：a为聚偏氟乙烯膜;b为添加两亲性 碳材料的聚偏氟乙烯膜;c为添加接枝聚乙烯亚胺的两亲性碳材料的聚偏氟乙烯膜;d为添 加接枝多粘菌素 B的两亲性碳材料的聚偏氟乙烯膜；由图可知，图中添加两亲性碳材料或用 聚偏氟乙烯或多粘菌素 B功能化的两亲性碳材料均能够制备颗粒分散均匀的聚偏氟乙烯 膜。
[0020] 图3为聚偏氟乙烯亲和生物膜的接触角图，其中：a为聚偏氟乙烯膜;b为添加两亲 性碳材料的聚偏氟乙烯膜;c为添加接枝聚乙烯亚胺的两亲性碳材料的聚偏氟乙烯膜;d为 添加接枝多粘菌素 B的两亲性碳材料的聚偏氟乙烯膜。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合附图及具体实施例，对本发明作详细描述。
[0022] 实施例1 以聚乙烯亚胺或多粘菌素 B为配基亲和生物膜的制备： (1)两亲性碳材料(ACPs)的制备:取10g啤酒酵母菌(河南奥克啤酒厂提供)震摇分散 均匀，取其上层灰白色菌悬液离心，弃去废液，然后加入10~15ml丙酮，放置摇床上180 r/ min震摇10~20 min，离心，弃去丙酮上清，同法重复操作3~5次，得到啤酒酵母的细胞壁，将 底物（即得到的细胞壁)用l〇〇ml 2%(v/v)pH=6.0的戊二醛ros缓冲液分散，倒入高温高压反 应釜中后放入烘箱，于150~200°C下水热碳化合成8~10h，反应结束后，冷却至室温，倒掉上 层溶液，向下层沉淀中加入100~150ml的蒸馏水超声分散洗涤，静止1~2min后，保留上层分 散较好的溶液，将下层较浓的溶液继续用蒸馏水继续超声分散洗涤，重复7~10次，弃去不易 分散的残渣，将上层溶液合并后，离心，弃去上清液，将下层沉淀置于烘箱中60°C干燥6~10h 即得两亲性碳材料标记为ACPs。
[0023] (2)两亲性碳材料表面接枝聚乙烯亚胺或多粘菌素 B:取干燥的两亲性碳材料 100mg分散于10ml ρΗ=5·5的roS缓冲液中，依次加入192 mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基 碳二亚胺盐酸盐和123 mg的N-羟基丁二酰亚胺，进行活化1~2 h。活化结束后离心，弃去上 清液，用pH=5.5的PBS缓冲液洗涤3~5次，再向其中加入5ml pH=5.5的PBS缓冲液，震荡分散 后向其中加入用5ml pH=5.5的PBS缓冲液溶解的50mg聚乙烯亚胺（aladdin，E107079， M.W. 10000,99%)或25mg硫酸多粘菌素 B(购自于军事医学科学院），振荡反应4~8h，反应结束 后，离心，弃去上清液，将沉淀洗涤3~5次，于烘箱中50°C干燥8~10h，得到聚乙烯亚胺或多粘 菌素 B功能化的两亲性碳材料。将聚乙烯亚胺功能化的两亲性碳材料和多粘菌素 B功能化的 两亲性碳材料分别标记为ACPs-PEI和ACPs-PMB。
[0024] (3)以聚乙烯亚胺或多粘菌素 B功能化的两亲性碳材料为添加剂制备亲和生物膜： 取85.5mg聚乙烯亚胺或多粘菌素 B功能化两亲性碳材料，加入到10 ml的N，N二甲基甲酰胺 中，超声分散均匀，然后加入1.71g聚偏氟乙烯树脂（上海三爱富新材料股份有限公司， FR904)和0.285g聚乙烯吡咯烷酮，机械搅拌18~24h至均匀分散的铸膜液;将铸膜液均匀铺 膜，在空气中预蒸发1~3min后浸入到凝固液（乙醇和蒸馏水体积比为1:3~6的混合液）中待 膜固化析出，将膜用纯水冲洗3~5次，然后置于纯水中浸泡，每8~12h换水一次，换水7~8次 后，常温下自然晾干，得到膜厚度为150~200μπι的亲和生物膜，分别标记为ACPs-PEI/PVDF膜 和ACPs-PMB/PVDF膜。作为对照按照上述同样的方法制备空白的聚偏氟乙烯膜和添加未功 能化的两亲性碳材料制备的亲和生物膜分别标记为PVDF膜和ACPs/PVDF膜。
[0025] 对于上述实施例，图1，为功能化两亲性碳材料结构示意图。
[0026]对于上述实施例，本发明通过激光粒度及Zeta电位分析仪对聚乙烯亚胺和多粘菌 素 B的接枝结果进行验证，测试结果如表1所示： 表1
通过表1中聚乙烯亚胺和多粘菌素 B功能化的两亲性碳材料电位和粒径的变化可以确 定聚乙烯亚胺和多粘菌素 B在两亲性碳材料表面的成功接枝。
[0027] 对于上述实施例，图2,为制备的亲和生物膜样品图。
[0028] 本发明采用接触角测定仪对实施1制得的亲和生物膜的亲水性测试结果如下： 如图3:0a:86.1°，0b:65.1°，0C:53.4°，0d:62.4°(a:聚偏氟乙烯膜;b:添加有两亲性 碳材料的聚偏氟乙烯膜;c:添加接枝聚乙烯亚胺的两亲性碳材料的聚偏氟乙烯膜;d:添加 接枝多粘菌素 B的两亲性碳材料的聚偏氟乙烯膜）。图3中，在疏水性膜材料聚偏氟乙烯中添 加聚乙烯亚胺或多粘菌素 B功能化的两亲性碳材料可以使亲水性提高，进而增加膜的抗污 性能。
[0029] 本发明采用万能电子试验机对实施例1制得的亲和生物膜的机械性质进行测试， 测试速度为l〇mm/min，结果如下表2: 表2
由表2可知，在聚偏氟乙烯中添加聚乙烯亚胺或多粘菌素 B功能化的两亲性碳材料能够 增强膜的机械性能。
[0030] 本发明用牛血清蛋白作为污染物，对实施例1制得的亲和生物膜的抗蛋白污染性 能进行测试，测试结果如下表3: 表3
由表3可知，在聚偏氟乙烯中添加聚乙烯亚胺或多粘菌素 B功能化两亲性碳材料可以提 高膜的抗蛋白粘附性，使膜的抗污性能大大提高。
[0031] 试验例1 : 以聚乙烯亚胺为配基制备的亲和生物膜内毒素吸附性能评价： 将制备的亲和生物膜装配在亲和膜分离器中，依次用l〇〇ml无热源水，50ml 0. lmol/ml 的氢氧化钠溶液，50ml 1.5mol/ml的氯化钠溶液、50ml生理盐水溶液，100ml无热源水以 2ml/min的速度通过亲和膜分离器，对亲和生物膜分离器进行预处理。
[0032] 将预处理过的亲和生物膜分离器用于自来水中内毒素的去除，内毒素剩余量低于 0.01EU/ml，膜再生5次去除效率仍高于99%。
[0033] 将预处理过的膜分离器用于去除0.9wt.% NaCl溶液和浓度为lmg/mL的牛血清蛋 白溶液中的内毒素，实验结果如下表4: 表4
ACPs-PEI/PVDF膜首次用于处理生理盐水中的内毒素去除率接近98%;用于牛血清蛋白 溶液中内毒素的处理，内毒素去除率在94%左右。本发明的ACPs-PEI/PVDF膜再生五次后，去 除率仍高于93% 蛋白回收率，结果如下表5: 表5
试验例2: 以多粘菌素 B为配基制备的亲和生物膜内毒素吸附性能评价： 将制备的亲和生物膜装配在亲和膜分离器中，依次用l〇〇ml无热源水，50ml 0. lmol/ml 的氢氧化钠溶液，50ml 1.5mol/ml的氯化钠溶液、50ml生理盐水溶液，100ml无热源水以 2ml/min的速度通过亲和膜分离器，对亲和膜分离器进行预处理。
[0034]将预处理过的亲和生物膜分离器用于自来水中内毒素的去除，内毒素剩余量低于 0.01EU/ml，膜再生5次去除效率仍高于99%. 将预处理过的膜分离器分别用于去除0.9wt.% NaCl溶液和浓度为lmg/ml牛血清蛋白 溶液中的内毒素，实验结果如下表6: 表6
ACPs-PMB/PVDF膜首次用于处理生理盐水中的内毒素去除率达到95%;用于蛋白溶液中 内毒素的处理，内毒素去除率在92%以上。本发明的ACPs-PMB/PVDF膜再生五次后，去除率仍 高于92.4%。
[0035]蛋白回收率，结果如下表7: 表7
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，在不背离本发明精神及其 实质的情况下，所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明所附的权利要求的 保护范围之内。
【主权项】
1. 一种亲和生物膜的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 两亲性碳材料的制备：将大肠杆菌或酵母菌震摇分散均匀，取其上层菌悬液离 心，弃去废液，然后加入丙酮，震摇，离心，弃去丙酮，同法重复操作3~5次，得到大肠杆菌或 酵母菌的细胞壁，向得到的细胞壁中加入戊二醛PBS缓冲液，于150~200°C下反应8~1 Oh，反 应结束后，冷至室温，将下层沉淀洗涤，干燥，即得两亲性碳材料； (2) 两亲性碳材料表面接枝聚乙烯亚胺或多粘菌素 B:取两亲性碳材料分散于pH=5.5 的PBS缓冲液中，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚 胺进行活化，结束后，用pH=5.5的PBS缓冲液洗涤3~5次，然后将其用pH=5.5的PBS缓冲液均 匀分散，加入用pH=5.5的PBS缓冲液溶解的聚乙烯亚胺或硫酸多粘菌素 B，振荡反应4~8h， 反应结束后，洗涤，干燥，得到聚乙烯亚胺或多粘菌素 B功能化的两亲性碳材料； (3)以聚乙烯亚胺或多粘菌素B功能化的两亲性碳材料为添加剂制备亲和生物膜:取上 述聚乙烯亚胺或多粘菌素 B功能化的两亲性碳材料加入到N，N二甲基甲酰胺中，超声分散均 匀，加入聚偏氟乙烯树脂和聚乙烯吡咯烷酮，机械搅拌18~24h得均匀分散的铸膜液;将铸膜 液均匀铺膜，在空气中预蒸发1~3min后浸入到凝固液中待膜固化析出，在纯水中浸泡后即 得厚度150~200μπι的亲和生物膜。2. 根据权利要求1所述的亲和生物膜的制备方法，其特征在于，步骤(2)中两亲性碳材 料与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、Ν-羟基丁二酰亚胺质量比为1:(1~4): (1~4) 〇3. 根据权利要求1所述的亲和生物膜的制备方法，其特征在于，步骤(2)中两亲性碳材 料与聚乙烯亚胺或硫酸多粘菌素B的质量比均为1: (1~3)。4. 根据权利要求1所述的亲和生物膜的制备方法，其特征在于，步骤(3)中凝固液为乙 醇和蒸馏水体积比为1: (3~6)的混合液。5. 采用权利要求1至4任一所述的制备方法所制得的亲和生物膜。6. 权利要求5所述亲和生物膜在去除生物制品中内毒素的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种亲和生物膜、制备方法及其应用。它是以两亲性碳材料为基质载体，在其表面上以共价结合的方法接枝亲和配基，并以该功能化的两亲性碳材料为添加剂，与疏水性膜材料共混制备出亲和生物膜。本发明通过共价偶联的方法将亲和配基均匀的固定在两亲性碳材料的表面，得到功能化两亲性碳材料，并以该功能化的两亲性碳材料为添加剂，制备亲和生物膜。本发明制备的亲和生物膜具有微孔/大孔结构，大的内表面区域，高连通性和机械稳定性，能够高选择的去除蛋白溶液中的内毒素。
【IPC分类】C08K3/04, C08J5/18, C08L27/16, C08K9/04, C08L39/06
【公开号】CN105504320
【申请号】CN201511002359
【发明人】吴强, 杨凯, 李旭鹏, 徐玥玥, 崔海磊, 张旭
【申请人】河南大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月29日
【技术领域】
[0001 ]本发明属于膜技术领域，具体涉及一种亲和生物膜、制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 内毒素是一种毒性极强的致炎和热原物质，是内毒素血症及感染性休克的主要致 病介质，低剂量的内毒素就能够诱发全身炎症反应综合症(SIRs)、多器官功能衰竭综合症 (MODS)、脓毒症等导致各年龄组重要死亡的疾病。
[0003] 随着生物制药和生物医学工程相关领域的发展，人们对生物产品中可能存在的微 量有害物质的清除越来越重视。由于内毒素的相对分子质量较大，与大分子生物制品在同 一数量级，有效清除制品中、特别是生物制品中污染的内毒素一直是医学、制药、生物工程 等领域研究的热点。
[0004] 迄今为止，在实际生产过程中能够应用的除去生物制品中内毒素的材料和方法并 不多。一些己经商品化的产品也存在吸附效率低，生产成本高等问题，很难大范围的推广使 用。因此，找到一种制备简单，价格低廉，高效的除去生物制品中内毒素的材料，仍然是生物 材料领域研究的热点和难点，仍具有十分重要的价值和实际意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种亲和生物膜、制备方法及其应用。
[0006] 基于上述目的，本发明采取如下技术方案： 一种亲和生物膜的制备方法，包括如下步骤： (1) 两亲性碳材料的制备:将大肠杆菌或酵母菌震摇分散均匀，取其上层菌悬液离 心，弃去废液，然后加入丙酮，震摇，离心，弃去丙酮，同法重复操作3~5次，得到大肠杆菌或 酵母菌的细胞壁，向得到的细胞壁中再加入2%(v/v)pH=6.0的戊二醛roS缓冲液，于150~ 200°C下反应(水热碳化合成法)8~10h，反应结束后，冷至室温，将下层沉淀洗涤，干燥，即得 两亲性碳材料； (2) 两亲性碳材料表面接枝聚乙烯亚胺或多粘菌素 B:取两亲性碳材料分散于pH=5.5 的PBS缓冲液中，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚 胺进行活化后，将其用pH=5.5的PBS缓冲液均匀分散，加入用pH=5.5的PBS缓冲液溶解的 聚乙烯亚胺或硫酸多粘菌素 B，振荡反应4~8h，反应结束后，洗涤，干燥，得到聚乙烯亚胺或 多粘菌素功能化的两亲性碳材料； (3)以聚乙烯亚胺或多粘菌素 B功能化的两亲性碳材料为添加剂制备亲和生物膜:向上 述聚乙烯亚胺或多粘菌素功能化的两亲性碳材料加入N，N二甲基甲酰胺，超声分散均匀，加 入聚偏氟乙烯树脂和聚乙烯吡咯烷酮，机械搅拌18~24h至均匀分散的铸膜液;将铸膜液均 匀铺膜，在空气中预蒸发卜3min后浸入到凝固液中待膜固化析出，在纯水中浸泡后即得厚 度为150~200um的亲和生物膜。
[0007] 进一步地，步骤(2)中两亲性碳材料与1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸 盐、N-羟基丁二酰亚胺质量比为1: (1~4) : (1~4)。
[0008]步骤(2)中两亲性碳材料与聚乙烯亚胺或多粘菌素 B的质量比为1:(1~3)。
[0009]步骤(3)中凝固液为乙醇和蒸馏水体积比为1: (3~6)的混合液。
[0010]上述的制备方法所制得的亲和生物膜。
[0011]所述亲和生物膜在去除生物制品中内毒素的应用。
[0012] 本发明中的接枝亲和配基的功能化两亲性碳材料其粒度分布均匀，单分散性较 好，能够在成膜机制中均匀分散且不易集聚，和疏水膜具有很好的相容性。以上述功能化的 两亲性碳材料为添加剂与疏水性膜材料聚偏氟乙烯共混制备的亲和生物膜，具备微孔滤膜 所具有微孔/大孔结构，大的内表面区域，高连通性和机械稳定性的特点。该亲和生物膜既 具有内毒素分子的识别功能，能够高选择去除生物产品中的内毒素，又具有很好的机械性 能和抗污性能，且制备简单，价格低廉。
[0013] 本发明中充分利用碳材料的两亲性和表面富含功能基团的特性，将亲和配基接枝 到两亲性碳材料表面的方法，可用来作为多种富含氨基和亚氨基的亲和配基(例如:聚乙烯 亚胺、壳聚糖、组胺、组氨酸等)在两亲性碳材料表面的固定、制备功能化两亲性碳材料。
[0014] 本发明以接枝后的两亲性碳材料为添加剂制备的亲和生物膜，可用于与其他疏水 性膜材共混制备亲和生物膜。
[0015] 本发明制备的亲和生物膜，克服了无机纳米粒子作为添加剂改善膜性质时易集聚 的缺点，提高膜的亲水性能和机械性能，使膜抗污性能提高，大大提高膜的使用寿命。
[0016] 本发明的亲和生物膜作为一种亲和滤膜可用于生物制品的纯化、提取与制剂和血 清中有毒、有害物质的去除，中药提取，血液灌流，水处理等方面。
[0017] 本发明的亲和生物膜可广泛的应用于生物化工和医药卫生领域。
【附图说明】
[0018] 图1为接枝了亲和基团的的两亲性碳材料结构示意图，其中：a为两亲性碳材料;b 为酰胺键连接;c为内毒素亲和配基。
[0019] 图2为聚偏氟乙烯亲和生物膜的样品图，其中：a为聚偏氟乙烯膜;b为添加两亲性 碳材料的聚偏氟乙烯膜;c为添加接枝聚乙烯亚胺的两亲性碳材料的聚偏氟乙烯膜;d为添 加接枝多粘菌素 B的两亲性碳材料的聚偏氟乙烯膜；由图可知，图中添加两亲性碳材料或用 聚偏氟乙烯或多粘菌素 B功能化的两亲性碳材料均能够制备颗粒分散均匀的聚偏氟乙烯 膜。
[0020] 图3为聚偏氟乙烯亲和生物膜的接触角图，其中：a为聚偏氟乙烯膜;b为添加两亲 性碳材料的聚偏氟乙烯膜;c为添加接枝聚乙烯亚胺的两亲性碳材料的聚偏氟乙烯膜;d为 添加接枝多粘菌素 B的两亲性碳材料的聚偏氟乙烯膜。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合附图及具体实施例，对本发明作详细描述。
[0022] 实施例1 以聚乙烯亚胺或多粘菌素 B为配基亲和生物膜的制备： (1)两亲性碳材料(ACPs)的制备:取10g啤酒酵母菌(河南奥克啤酒厂提供)震摇分散 均匀，取其上层灰白色菌悬液离心，弃去废液，然后加入10~15ml丙酮，放置摇床上180 r/ min震摇10~20 min，离心，弃去丙酮上清，同法重复操作3~5次，得到啤酒酵母的细胞壁，将 底物（即得到的细胞壁)用l〇〇ml 2%(v/v)pH=6.0的戊二醛ros缓冲液分散，倒入高温高压反 应釜中后放入烘箱，于150~200°C下水热碳化合成8~10h，反应结束后，冷却至室温，倒掉上 层溶液，向下层沉淀中加入100~150ml的蒸馏水超声分散洗涤，静止1~2min后，保留上层分 散较好的溶液，将下层较浓的溶液继续用蒸馏水继续超声分散洗涤，重复7~10次，弃去不易 分散的残渣，将上层溶液合并后，离心，弃去上清液，将下层沉淀置于烘箱中60°C干燥6~10h 即得两亲性碳材料标记为ACPs。
[0023] (2)两亲性碳材料表面接枝聚乙烯亚胺或多粘菌素 B:取干燥的两亲性碳材料 100mg分散于10ml ρΗ=5·5的roS缓冲液中，依次加入192 mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基 碳二亚胺盐酸盐和123 mg的N-羟基丁二酰亚胺，进行活化1~2 h。活化结束后离心，弃去上 清液，用pH=5.5的PBS缓冲液洗涤3~5次，再向其中加入5ml pH=5.5的PBS缓冲液，震荡分散 后向其中加入用5ml pH=5.5的PBS缓冲液溶解的50mg聚乙烯亚胺（aladdin，E107079， M.W. 10000,99%)或25mg硫酸多粘菌素 B(购自于军事医学科学院），振荡反应4~8h，反应结束 后，离心，弃去上清液，将沉淀洗涤3~5次，于烘箱中50°C干燥8~10h，得到聚乙烯亚胺或多粘 菌素 B功能化的两亲性碳材料。将聚乙烯亚胺功能化的两亲性碳材料和多粘菌素 B功能化的 两亲性碳材料分别标记为ACPs-PEI和ACPs-PMB。
[0024] (3)以聚乙烯亚胺或多粘菌素 B功能化的两亲性碳材料为添加剂制备亲和生物膜： 取85.5mg聚乙烯亚胺或多粘菌素 B功能化两亲性碳材料，加入到10 ml的N，N二甲基甲酰胺 中，超声分散均匀，然后加入1.71g聚偏氟乙烯树脂（上海三爱富新材料股份有限公司， FR904)和0.285g聚乙烯吡咯烷酮，机械搅拌18~24h至均匀分散的铸膜液;将铸膜液均匀铺 膜，在空气中预蒸发1~3min后浸入到凝固液（乙醇和蒸馏水体积比为1:3~6的混合液）中待 膜固化析出，将膜用纯水冲洗3~5次，然后置于纯水中浸泡，每8~12h换水一次，换水7~8次 后，常温下自然晾干，得到膜厚度为150~200μπι的亲和生物膜，分别标记为ACPs-PEI/PVDF膜 和ACPs-PMB/PVDF膜。作为对照按照上述同样的方法制备空白的聚偏氟乙烯膜和添加未功 能化的两亲性碳材料制备的亲和生物膜分别标记为PVDF膜和ACPs/PVDF膜。
[0025] 对于上述实施例，图1，为功能化两亲性碳材料结构示意图。
[0026]对于上述实施例，本发明通过激光粒度及Zeta电位分析仪对聚乙烯亚胺和多粘菌 素 B的接枝结果进行验证，测试结果如表1所示： 表1
通过表1中聚乙烯亚胺和多粘菌素 B功能化的两亲性碳材料电位和粒径的变化可以确 定聚乙烯亚胺和多粘菌素 B在两亲性碳材料表面的成功接枝。
[0027] 对于上述实施例，图2,为制备的亲和生物膜样品图。
[0028] 本发明采用接触角测定仪对实施1制得的亲和生物膜的亲水性测试结果如下： 如图3:0a:86.1°，0b:65.1°，0C:53.4°，0d:62.4°(a:聚偏氟乙烯膜;b:添加有两亲性 碳材料的聚偏氟乙烯膜;c:添加接枝聚乙烯亚胺的两亲性碳材料的聚偏氟乙烯膜;d:添加 接枝多粘菌素 B的两亲性碳材料的聚偏氟乙烯膜）。图3中，在疏水性膜材料聚偏氟乙烯中添 加聚乙烯亚胺或多粘菌素 B功能化的两亲性碳材料可以使亲水性提高，进而增加膜的抗污 性能。
[0029] 本发明采用万能电子试验机对实施例1制得的亲和生物膜的机械性质进行测试， 测试速度为l〇mm/min，结果如下表2: 表2
由表2可知，在聚偏氟乙烯中添加聚乙烯亚胺或多粘菌素 B功能化的两亲性碳材料能够 增强膜的机械性能。
[0030] 本发明用牛血清蛋白作为污染物，对实施例1制得的亲和生物膜的抗蛋白污染性 能进行测试，测试结果如下表3: 表3
由表3可知，在聚偏氟乙烯中添加聚乙烯亚胺或多粘菌素 B功能化两亲性碳材料可以提 高膜的抗蛋白粘附性，使膜的抗污性能大大提高。
[0031] 试验例1 : 以聚乙烯亚胺为配基制备的亲和生物膜内毒素吸附性能评价： 将制备的亲和生物膜装配在亲和膜分离器中，依次用l〇〇ml无热源水，50ml 0. lmol/ml 的氢氧化钠溶液，50ml 1.5mol/ml的氯化钠溶液、50ml生理盐水溶液，100ml无热源水以 2ml/min的速度通过亲和膜分离器，对亲和生物膜分离器进行预处理。
[0032] 将预处理过的亲和生物膜分离器用于自来水中内毒素的去除，内毒素剩余量低于 0.01EU/ml，膜再生5次去除效率仍高于99%。
[0033] 将预处理过的膜分离器用于去除0.9wt.% NaCl溶液和浓度为lmg/mL的牛血清蛋 白溶液中的内毒素，实验结果如下表4: 表4
ACPs-PEI/PVDF膜首次用于处理生理盐水中的内毒素去除率接近98%;用于牛血清蛋白 溶液中内毒素的处理，内毒素去除率在94%左右。本发明的ACPs-PEI/PVDF膜再生五次后，去 除率仍高于93% 蛋白回收率，结果如下表5: 表5
试验例2: 以多粘菌素 B为配基制备的亲和生物膜内毒素吸附性能评价： 将制备的亲和生物膜装配在亲和膜分离器中，依次用l〇〇ml无热源水，50ml 0. lmol/ml 的氢氧化钠溶液，50ml 1.5mol/ml的氯化钠溶液、50ml生理盐水溶液，100ml无热源水以 2ml/min的速度通过亲和膜分离器，对亲和膜分离器进行预处理。
[0034]将预处理过的亲和生物膜分离器用于自来水中内毒素的去除，内毒素剩余量低于 0.01EU/ml，膜再生5次去除效率仍高于99%. 将预处理过的膜分离器分别用于去除0.9wt.% NaCl溶液和浓度为lmg/ml牛血清蛋白 溶液中的内毒素，实验结果如下表6: 表6
ACPs-PMB/PVDF膜首次用于处理生理盐水中的内毒素去除率达到95%;用于蛋白溶液中 内毒素的处理，内毒素去除率在92%以上。本发明的ACPs-PMB/PVDF膜再生五次后，去除率仍 高于92.4%。
[0035]蛋白回收率，结果如下表7: 表7
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，在不背离本发明精神及其 实质的情况下，所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明所附的权利要求的 保护范围之内。
【主权项】
1. 一种亲和生物膜的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 两亲性碳材料的制备：将大肠杆菌或酵母菌震摇分散均匀，取其上层菌悬液离 心，弃去废液，然后加入丙酮，震摇，离心，弃去丙酮，同法重复操作3~5次，得到大肠杆菌或 酵母菌的细胞壁，向得到的细胞壁中加入戊二醛PBS缓冲液，于150~200°C下反应8~1 Oh，反 应结束后，冷至室温，将下层沉淀洗涤，干燥，即得两亲性碳材料； (2) 两亲性碳材料表面接枝聚乙烯亚胺或多粘菌素 B:取两亲性碳材料分散于pH=5.5 的PBS缓冲液中，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚 胺进行活化，结束后，用pH=5.5的PBS缓冲液洗涤3~5次，然后将其用pH=5.5的PBS缓冲液均 匀分散，加入用pH=5.5的PBS缓冲液溶解的聚乙烯亚胺或硫酸多粘菌素 B，振荡反应4~8h， 反应结束后，洗涤，干燥，得到聚乙烯亚胺或多粘菌素 B功能化的两亲性碳材料； (3)以聚乙烯亚胺或多粘菌素B功能化的两亲性碳材料为添加剂制备亲和生物膜:取上 述聚乙烯亚胺或多粘菌素 B功能化的两亲性碳材料加入到N，N二甲基甲酰胺中，超声分散均 匀，加入聚偏氟乙烯树脂和聚乙烯吡咯烷酮，机械搅拌18~24h得均匀分散的铸膜液;将铸膜 液均匀铺膜，在空气中预蒸发1~3min后浸入到凝固液中待膜固化析出，在纯水中浸泡后即 得厚度150~200μπι的亲和生物膜。2. 根据权利要求1所述的亲和生物膜的制备方法，其特征在于，步骤(2)中两亲性碳材 料与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、Ν-羟基丁二酰亚胺质量比为1:(1~4): (1~4) 〇3. 根据权利要求1所述的亲和生物膜的制备方法，其特征在于，步骤(2)中两亲性碳材 料与聚乙烯亚胺或硫酸多粘菌素B的质量比均为1: (1~3)。4. 根据权利要求1所述的亲和生物膜的制备方法，其特征在于，步骤(3)中凝固液为乙 醇和蒸馏水体积比为1: (3~6)的混合液。5. 采用权利要求1至4任一所述的制备方法所制得的亲和生物膜。6. 权利要求5所述亲和生物膜在去除生物制品中内毒素的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种亲和生物膜、制备方法及其应用。它是以两亲性碳材料为基质载体，在其表面上以共价结合的方法接枝亲和配基，并以该功能化的两亲性碳材料为添加剂，与疏水性膜材料共混制备出亲和生物膜。本发明通过共价偶联的方法将亲和配基均匀的固定在两亲性碳材料的表面，得到功能化两亲性碳材料，并以该功能化的两亲性碳材料为添加剂，制备亲和生物膜。本发明制备的亲和生物膜具有微孔/大孔结构，大的内表面区域，高连通性和机械稳定性，能够高选择的去除蛋白溶液中的内毒素。
【IPC分类】C08K3/04, C08J5/18, C08L27/16, C08K9/04, C08L39/06
【公开号】CN105504320
【申请号】CN201511002359
【发明人】吴强, 杨凯, 李旭鹏, 徐玥玥, 崔海磊, 张旭
【申请人】河南大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月29日
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