鲨鱼肉提取物的制作方法
专利名称：鲨鱼肉提取物的制作方法
技术领域：
本发明是关于从鲨鱼的肉中提取的一种提取物，以及它对血管生成的阻碍或抑制作用。特别是，这项发明是关于一种从鲨鱼的肉中提取的一种提取物，这种提取物是运用溶媒提取法，随后通过除去溶媒来获得能作为血管生成抑制剂的一种油。
背景说明很久以来，各种各样鲨鱼产品被认为对预防或治疗某些疾病具有功效。特别是鲨鱼软骨粉已被尝试用来预防或控制某些癌症。
血管生成(新血管的生成)对恶性肿瘤的生存及生长非常重要。这些肿瘤与正常生长或器官相比具有较高的新陈代谢率，因此它们需要更多的血液来满足获取更多养份的需求。于是抑制血管生成成为控制或预防肿瘤生长的一种机制。
鲨鱼软骨已经显示出抑制血管生成的作用。然而目前的问题是在其使用方面上。为了达到预防或治疗癌症的目的，须服用大剂量的鲨鱼软骨粉。所需剂量被认为以每1公斤体重至少1克鲨鱼软骨粉的比例服用。而且鲨鱼软骨有一种令人难以接受的气味和味道。
从鲨鱼肝脏中提取的油也已被报道能减缓癌症生长。抗癌作用也许要归功于鲨鱼肝油中的烷基甘油。烷基甘油也存在于牛奶，血液以及免疫系统器官中，如肝脏、脾脏、骨髓和淋巴组织。
鲨鱼肝油也被认为含有角鲨胺(Squalamine)化合物。动物试验报告显示角鲨胺能使肿瘤丧失发展自身血液供给的能力。因此认为，鲨鱼肝油中所含有的角鲨胺或许对治疗和预防某些癌症有作用。
中国专利申请号CN01174036A中描述了一种经过脱水，冷冻及粉碎等工序处理后的鲨鱼肉。据报告这种经过加工后的肉能预防癌症。在专利中没有对从肉中获得提取物这个过程的描述，也没有任何血管生成抑制作用的描述。
上述鲨鱼产品的缺点是比血管生成抑制活力低，因此必需摄取大剂量的产品。而鲨鱼软骨和器官，例如鲨鱼肝脏是价格相对来说较昂贵的原材料。
加拿大专利申请号2,201,025描述了一种含有从多种原料，包括鲨鱼肉中提取的物质的药。该药被描述为对如丙肝等疾病具有治疗作用。没有任何显示表明该药剂具有抑制血管生成的能力，或是对任何与新生血管有关的疾病或失调有效。此外，这种药剂中所含有的从鲨鱼的肉中提取出的物质，经过了将肉烘干，加热除去油，然后碾碎肉的工艺过程。文件中没有提到碾碎的鲨鱼肉的构成，或什么化合物在加热过程中被除去的信息。
本项发明的发明者发现通过溶媒提取法从鲨鱼肉中得到的该提取物是一种惊人有效的血管生成抑制物，从而成为一种治疗与血管生成相关的一些疾病或失调的潜在试剂。
因此本项发明的目的是为了提供一种从鲨鱼肉中经溶媒提取法所得到的血管生成抑制物，或至少是提供了一种有效抑制血管生成的替代品。
发明描述本发明的第一个方面提供了从鲨鱼肉中提取的，在动物身上具有血管生成抑制作用的一种提取物。
本项发明中的提取物以含有磷脂作为主要成份较为理想。磷脂的最佳含量为提取物重量的20％-40％。典型的磷脂是磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine-PE)和磷酯酰胆碱(phosphatidylcholine-PC)。
进一步而言，磷脂脂肪酸最好含有高浓度的DHA(二十二碳六烯酸)，例如DHA为脂肪酸总重量的20-25％。
而且提取物中甘油三酯(triglycerides)的含量小于10％较为适宜。
本发明的第二个方面提供了从鲨鱼肉中提取具有血管生成抑制作用的提取物的方法，包括-使来自一只或多只鲨鱼的肉与一种溶媒接触足够长的时间，从而从肉中提取一种或多种物质到溶液中，-将肉与溶液分离，和-将溶媒从溶液中除去，从而得到作为血管生成抑制物的提取物。
任何适当的有机溶媒或超临界的CO2也许会用到。最适宜的溶媒是乙醇、甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、或是上述溶剂的混合物。
在本项发明的具体实施中，鲨鱼肉在与溶剂混合前先被冷冻干燥，或被风干。
可以使用能将提取液与肉分离的任何方法，然而最好通过过滤法来分离。
可以使用任何种类的鲨鱼肉作为原料。然而，最好是选用以下的一种或多种鲨鱼的肉斑点星鲨(rig)(柠檬鱼lemonfish)，学鲨(school shark)，魔鬼鲨(ghost shark)，鲭鲨，蓝鲨，象鲨(elephant shark)，鼠鲨和黑尖礁鲨。
本发明的第三个方面提供了一种含有从至少一种鲨鱼的肉中提取的，具有血管生成抑制作用的提取物及其适当载体的制药学成份。
本发明的第四个方面提供了从鲨鱼肉中提取的，具有血管生成抑制作用的提取物在针对某些疾病或失调的药剂制造方面的作用。这些疾病或失调包括癌症，视网膜病，炎症，以及关节炎。
本发明的第五个方面提供了运用从鲨鱼肉中提取的，具有血管生成抑制作用的提取物在动物身上治疗或预防某些疾病或失调的方法。这些疾病或失调包括癌症，视网膜病，炎症，以及关节炎。尽管发明中提到了各种各样的动物，但最理想的动物是人类。
详细说明在这里所说的“鲨鱼肉”是指任何部位的鲨鱼肉，为了避免疑虑，它将不会含有任何鲨鱼的内部器官。
在周围环境温度大约为15-25℃时，本项发明中提取物是一种油或油状物质，如糊状物质。在这里所提及的“油”，也包括那些油状和糊状特征的物质。
这个提取物的主要成份为磷脂，如磷脂酰乙醇胺(PE)和磷酯酰胆碱(PC)。磷脂的含量通常在重量的20-40％的范围内。
磷脂脂肪酸通常含有二十二碳六烯酸(DHA)，花生四烯酸(AA)，二十碳五烯酸(EPA)等。与其他产品和鱼类提取物不同的是本项发明的提取物，其脂肪酸组成中含有高浓度(总重量的20-35％)的DHA。从下表可看出，一个DHA的样品被发现是一种强有力的血管生成抑制物。由于本项发明的提取物含有高浓度的DHA，因此推测DHA是这个提取物中使其具有抑制血管生成特性的有效成份之一。
一般名 构造 样品浓度 血管生成抑制率一价不饱和脂肪酸肉豆蔻烯酸 14∶1(n-5) 10μg/ml 58％十六碳烯酸 16∶1(n-7) 5μg/ml 70％十七碳烯酸 17∶1(n-7) 20μg/ml 83％油酸 18∶1(n-9) 100μg/ml0％伞形花子油酸 18∶1(n-12)100μg/ml58％顺芥子酸 22∶1(n-9) 200μg/ml30％神经酸 24∶1(n-9) 100μg/ml0％
多价不饱和脂肪酸亚油酸 18∶2(n-6)5μg/ml 82％α-亚油酸 18∶3(n-3)20μg/ml66％花生四烯酸 20∶4(n-6)5μg/ml 84％二十碳五烯酸(EPA) 20∶5(n-3)3μg/ml 100％二十二碳五烯酸 22∶5(n-3)4μg/ml 71％二十二碳六烯酸(DHA)22∶6(n-3)5μg/ml 88％强力抑制剂(浓度为5μg/ml，抑制率大于80％)20∶5，22∶6，20∶4，18∶2优良抑制剂(浓度为10μg/ml，抑制率大于90％)22∶5，16∶1中等抑制剂(浓度为20μg/ml，抑制率小于90％)18∶3，17∶1，14∶1无效抑制剂(浓度为100μg/ml，抑制率小于60％)18∶1，22∶1，24∶1本项发明中的提取物也与其他鱼类提取物和产品截然不同，因为它所含的甘油三酯浓度惊人地低(重量上小于10％)。
运用典型的提取法，一种或多种鲨鱼的肉片在经过混合，风干，及与乙醇之类的溶媒混合的工序后，其体积会缩小。通常，混合物在室温下搅拌1-24个小时。随后通过过滤方法将提取液与肉分离。肉片与溶媒混合的工序可以随意重复进行。然后通过蒸发脱水法除去溶媒，得到油状的鲨鱼肉提取物。这种油通常含有各种游离型脂肪酸和甘油结合型脂肪酸。
接下来的实施例1中描述了二氯甲烷和乙醇的作用。在这里乙醇被预期为一种理想的溶媒。
实施例2中描述了鲨鱼肉中脂肪酸的组成。除了脂肪酸以外，预期或许还有其他成份对鲨鱼肉油的抑制血管生成活性起到作用。
实施例3描述了从被风干的蓝鲨(Blue Shark)肉中得到油的提取法。被风干的鲨鱼粉分别采用乙醇(EtOH)和乙酸乙酯(EtOAc)作为溶媒进行提取。这两种方法所得到油的提取率具有惊人的差异(乙醇13.7％，乙酸乙酯1.6％)。尽管运用乙酸乙酯的提取法的提取率较低，但其提取物所具有的独特血管生成抑制活性却较高，这显示这种提取物含有浓度较高的血管生成抑制性化合物。
从实施例3的生物试验中可以看出，鲨鱼肉油是一种比鲨鱼软骨，鲨鱼软骨提取物，或其他鱼油更有效的血管生成抑制物。
这3种方法中得到的油的脂肪酸成份及磷脂成份分别通过气相色谱分析法及31P NMR方法加以分析。薄层色谱分析法(Thin Layer Chromatography，TLC)也被用来定性分析油中所含有的各种脂质。鲨鱼肉中的无极性脂质的含量较低(用TLC法没有探测到甘油三酯，但磷脂的含量较高(24％EtOH，34％EtOAc)。鲨鱼油中脂肪酸(游离型和甘油结合型)的低含量暗示在这些提取物中存在一种高浓度的，未测定物质。
本项发明中的提取物可以是以本项发明过程中所得到的物质的再生成形式加以使用。然而，此提取物最好是与食用油混合，例如橄榄油，再制成胶囊，口服使用。此外，提取物也可以与固体载体混合，例如环糊精(cyclodextrin)，制成片状，颗粒，或粉末。
为了便于口服，颗粒，粉末或其他类似的形状也可以制成胶囊或与其他物质混合，例如食物。也可以考虑将其溶解于某种溶媒中，通过注射法摄取此提取物。而且，额外的成份，例如维他命E，也可以加入配方中。
血管生成与较广范围的疾病和失调有关。因此本项发明中的提取物也许对这些疾病和失调具有治疗或预防作用。这些疾病和失调包括癌症，视网膜症，炎症及关节炎，但不仅仅局限于这些。
另外，当预期该提取物对人类的疾病和失调具有十分有效的治疗和预防作用的同时，也认为其它动物可以受益于该提取物的施用。
实施例接下来的实施例进一步描述了这个提取物。对这个提取物的分析被认为不仅仅局限于以下的实施例。
实施例1-柠檬鱼的提取物1.5公斤柠檬鱼通过搅拌机被切成小块，并与1.5升二氯甲烷及3升甲醇在一个5升的圆锥形瓶中搅拌一整夜。经过滤将提取液与肉分离。接下来再取1.5升二氯甲烷与肉混合，并搅拌一整夜。随后，再次通过过滤将提取液与肉分离，并与前一次的滤出液混合。向两次所得到的总滤出液中加入盐溶液(0.88％KCL，1.5L)，并经振动混合。混合物经静置后，分成两层。处于下方的二氯甲烷层被取出进行再加工，通过旋转蒸发法除去溶媒，提取出油(12克，提取率为0.8％)。
实施例2实施-例1中所提取的油的脂肪酸组成运用气相色谱仪(Gas Chromatography-GC)对实施例1中提取的油的脂肪酸组成加以分析。
在分析之前，脂肪酸(游离型脂肪酸和甘油三酸脂)被转换成脂肪酸甲脂(Fatty Acid Methyl Esters-FAMEs)。待分析的油被溶解在乙烷(0.5ml)中，随后注入含有1％H2SO4甲醇的密封试管中。这个试管被置于50℃的水槽中一整晚。之后加入甲醇(2ml)和5％氯化钠水溶液，有机层(含有FAMEs)被分离出来。接下来用2％碳酸氢钠(sodium bicarbonate)溶液(2ml)清洗。
GC分析所采用的仪器是惠普(Hewlett-Packard)5890 GC。这个仪器带有一个体积为30m×0.25m×0.25μm的EC-Wax(Alltech)柱，其注入压为10psi。
分析过程中，EC-Wax柱在165℃下持续3分钟，随后温度以每分钟4℃的升温速度，上升到195℃，并保持10分钟。最后，温度以每分钟4℃的升温速度上升到225℃，并保持12分钟。FAMEs是通过火焰离子检测器(FID)来进行检测的。峰值(peaks)通过被测油与各种脂肪酸标准及已知的天然油(例如鳕鱼肝油)中的脂肪酸在保持时间上的比较被加以测定。
分析结果见表1。鲨鱼肉油含有高浓度的DHA(二十二碳六烯酸)。
表1鲨鱼肉油的脂肪酸组成脂肪酸百分比14∶0 0.216∶0DMA* 3.416∶0 19.916∶1 0.717∶0 0.517∶1 0.118∶0DMA* 0.518∶1DMA* 1.118∶0 9.618∶1 8.218∶2 1.020∶1 0.520∶4 6.020∶5 2.122∶4 n-6 2.922∶5 n-6 1.022∶5 n-3 5.222∶6 n-3 33.3
*二甲缩醛(dimethylacetal)由缩醛磷脂(磷脂)中的乙烯醚类(vinyl ethers)构成。
实施例3-蓝鲨的提取将冷冻的蓝鲨肉切成2厘米厚的肉片，并置于温度为35℃，压力小于2毫巴的真空烤炉中。24小时后，取出肉片，并将其切成更小的肉片，随后再次置于烤炉中3-4天。通常经过风干工序后，鲨鱼肉的重量会减少80％。经过风干后的鲨鱼肉先通过手工弄碎，再放入韦林氏搅切器(Waring blender)中加以粉碎，生成干燥粉末和纤维的混合物。
分别采用乙醇和乙酸乙酯作为溶媒，进行2次提取试验。
将鲨鱼粉(900克)和溶媒(乙醇或乙酸乙酯，4.5L)混合搅拌一整晚。为了搅拌充份，溶媒与鲨鱼粉的混合比例需为5∶1。为避免光线照射，容器用铝箔包起来。混合物通过Shleicher及Schuell 595滤纸进行过滤。随后，将滤渣与3L新的溶媒混合搅拌一整晚，并将所得混合物进行过滤。将两次提取所得的滤出液混合，再通过旋转蒸发法除去溶媒。
实施例4-实施例3中所提取出的油的脂肪酸的组成象实施例2中所描述的那样，将每种提取物中的脂肪酸(游离型和结合型)转换成甲酯(methyl esters)，通过气相色谱仪加以分析。
用乙醇溶媒提取法从干燥的蓝鲨粉末中所得的提取物具有较高的油提取率(13.7％)。相反，用乙酸乙酯溶媒提取法所得的油的提取率只有1.6％。
表2蓝鲨粉末提取物
用薄层层析显示提取物中所存在的各种脂质的种类。在无极性TLC板上，每一种提取物都只呈现较少含量(胆固醇和微弱的FFA点，没有迹象显示含有甘油三酯)。但是分析显示提取物中极性脂质含量高，例如磷脂酰乙醇胺(PE)，磷酯酰胆碱(PC)，以及鞘磷脂(SM)。
两种鲨鱼提取物在脂肪酸含量及组成上体现出巨大的不同(表3)。运用乙酸乙酯作为溶媒的提取物的脂肪酸总含量为30.1％。相比较而言，运用乙醇为溶媒的提取物的脂肪酸总含量非常低，只有7.3％。由此可见，加上乙醇溶媒提取法的高提取率，乙醇比乙酸乙酯能提取出更多的非脂质物质。
两种提取物的脂肪酸组成非常相似，都含有高浓度的DHA(二十二碳六烯酸)20.0-22.2％，油酸(18∶1)10.0-12.2％，硬脂酸(18∶0)11.2-14.9％，以及棕榈酸16.1-19.1％。
表3蓝鲨提取物的脂肪酸组成(wt/wt％)脂肪酸 保持时间(分钟)乙醇乙酸乙酯16∶0DMA* 9.40 10.14.516∶0 10.07 19.116.116∶1 10.59 2.0 1.718∶0DMA* 13.74 1.4 0.918∶1DMA* 14.24 4.6 2.318∶0 14.85 11.214.918∶1(n-9) 15.53 12.210.018∶1(n-7) 15.74 4.9 4.518∶2(n-6) 17.16 1.220∶1(n-11) 23.45 1.320∶1(n-9) 23.60 1.720∶4(n-6) 27.04 3.6 6.020∶5(n-3) 29.15 5.9 6.722∶5(n-3) 37.53 5.0 4.822∶6(n-3) 39.10 20.022.3脂肪酸总含量 7.3 30.1(％)*二甲缩醛由缩醛磷脂中的乙烯醚类构成。
AA ＝花生四烯酸EPA＝二十碳五烯酸DHA＝二十二碳六烯酸实施例5-实施例3中油的磷脂构成用31P NMR分辨磷脂。六甲基磷酰胺(HMPA)是定量化的内部标准。31P NMR证实了利用TLC的观察结果这种油含有高浓度的磷脂。这种油中磷脂总水平相当高(乙醇提取物为24％，乙酸乙酯提取物为34％)。
表4蓝鲨磷脂成分(wt/wt％)
1PC+AAPC2PE+MPE/LPC？Pl＝磷酯酰肌醇SM＝鞘磷脂PE＝磷酯酰乙醇胺MPE＝一甲基磷酯酰乙醇胺LPC＝溶血磷酯酰胆碱DPE＝二甲基磷酯酰乙醇胺AAPC＝烷基酰基磷酯酰胆碱PC＝磷酯酰胆碱实施例6-在试管中的生物鉴定将实施例1中准备好的油利用主动脉环作血管生成抑制的试验。方法基于Nicosia和Ottinetti等，Lab Invest.63115-122(1990)和Brown等，Lab Invest.75539-555(1996))描述的方法。先把大鼠的脂肪及血管周的纤维组织去除，然后把主动脉切成2mm厚。把0.4毫升纤维凝胶栓(通过将凝血酶加入溶解于MCDB131中的纤维蛋白原培养液制备)放入24-孔培养板。动脉环被放在每一个孔中央，然后盖上0.4毫升纤维凝胶栓。每层纤维凝胶栓盖上1.5毫升的MCDB131，然后放在37度，3％CO2/97％空气的环境下加以培养。待测的鲨鱼肉提取物被放入培养基中。每种提取物做3次试验。
约5天之后，微血管会出现在主动脉坏的周围。在5日至14日之间用数码相机通过相差显微镜拍下每个孔的变化。动脉环周围生长的微血管的每张照片由NIH1.59软件测定定。在每个间隔时间会计算出微血管成长率的平均数值。
与市面上购买到的鱼油和其他鲨鱼产品相比，鲨鱼肉油显示出更高的血管生成抑制效果，见表5。
表5鱼油和其他鲨鱼产品的血管生成抑制活性
将实施例3中每种油(以及运用甲醇所提取的油)的等分，采用类似于前述对实施例1油所运用的大鼠的主动脉环作试验，分析这种油是否具有调节血管生成的能力。
每组待测样本重复做3次，得出的结果是来自这3次的平均数。此外准备了另一组3个孔的对照组，只加入载体。在待测物质存在的情况下，测定了相对于对照组的新生血管生长速度。下图为对运用不同的有机溶媒所提取的不同浓度的油的血管生成抑制率的评估。
表6利用鲨鱼肉提取物抑制血管生成
这个实验显示出乙醇提取物及甲醇提取物在1-3μg/ml浓度下具有很相近的血管生成抑制率，大约为50％。乙酸乙酯提取物在0.2μg/ml下，其血管生成抑制率为50％，是前者的5倍。
将乙醇提取物与橄榄油混合，在主动脉环实验中测定对血管生成的影响。首先，即使高浓度橄榄油都对血管生成无抑制。事实上在浓度为200μg/ml下，它甚至略有促进血管生成的作用，引起达33.6％的刺激。
当将乙醇提取物与橄榄油以1份提取物对4份橄榄油(体积/体积)混合，并在15μg/ml(3μg提取物/ml)下测试时，测得87.5％的抑制。
当将乙醇提取物与橄榄油以1份提取物对9份橄榄油(体积/体积)混合，并在30μg/ml(3μg提取物/ml)下测试时，测得85.8％的抑制。
当将乙醇提取物与β-环糊精以1份提取物对6份β-环糊精(wt/wt)混合，当在15μg/ml(2.5μg提取物/ml)的浓度下保温时，测得40％的抑制。
实施例7-体内生物试验把鲨鱼肉提取物掺入饮用水中，给大鼠饮用。每种提取物被投于饮用水中，浓度为0.166mg/ml。每两日更换新的含有提取物的饮用水。更换时观察其消耗量，确定提取物的剂量。分别对运用乙醇和乙酸乙酯为溶媒的鲨鱼肉提取物做了评估。另外一组的对照组自由摄取不含有提取物的饮用水。每组含有6只(Sprague-Dawley)大鼠(雌雄各3只)。
投放提取物2星期后，开始诱导血管生成。诱导血管生成方法是向大鼠腹膜内注射48/80化合物。一日2次，持续4.5日，逐渐增加剂量。
(参照Davis，等，Microvasc.Res.，54178-182(1997))注射化合物16日之后，每只大鼠的血管系统用India墨水来染色，而且其肠及相连的肠系膜窗被切除，铺在载玻片上晒干。拍摄这些载玻片的数码照片，计算出每个肠系膜窗被微血管占据的比例。
最后，测定每组的血管生成平均数，再采用Student t试验来评估其统计学意义。
在各时间点测定的大鼠组的体重如表7所示。
表7体重(克)(增长率％)
表7的结果显示出两组摄取鲨鱼提取物的大鼠的体重增加率没有明显的差异。它们的生长率与对照组的相近。这个评论同时适用于雄性及雌性大鼠，雄性的基本生长率比雌性大。试验表明添加了鲨鱼肉提取物的饲料对大鼠的生长上並没有显著的影响。
计算相对于大鼠体重的提取物摄取量。这个计算是在测量了大鼠的体重及其对饮用水的摄取量的基础上得出的。
表8鲨鱼肉脂类的每日剂量(mg/kg体重)
测得最高剂量是在实验开始时。在化合物48/80给药期间，大鼠对水的摄取量显著地减少，显示提取物的摄取量相对减少。所以在这个时期用量也是最少的。停止注射48/80化合物后，饮用水的摄取量增加，提取物的摄取量也相对增加了。
测定了上述的肠系膜窗的体内血管生成作用，结果见表9。
乙醇提取物导致在该剂量血管生成被显著抑制(46％)。比较中，乙酸乙酯提取物导致在大约同样的剂量仅有21％抑制。这仍然是显著的。然而，虽然剂量对于两种提取物是大致相同的，已知乙酸乙酯提取物在体外主动脉环试验中抑制更强。
表9鲨鱼肉提取物血管生成抑制率
实施例8-抗炎症作用分析为了评估鲨鱼肉的乙醇提取物在急性炎症方面的作用，将乙醇提取物添加到饮用水中，分别施给6只大鼠(3只雄性，3只雌性)。这是在引发急性炎症开始前一周。对照组没有摄取这种提取物。提取物在饮用水中的添加量为0.2mg/ml。
炎症的引发是通过在每只大鼠的两只后足跖注射100微升浓度为2.5％λ-角叉胶溶液，诱导炎症。在注射之前，测量大鼠的左右足跖的体积，注射4个小时后再次测量。测定每只后足的体积差值。
提取物的平均消耗量为雄性大鼠4.67mg/天，雌性大鼠3.75mg/天。
对于摄取通常饮用水(不含提取物)的6只到大鼠(12只足)，其平均足跖肿胀度为54.21％±2.30(SEM)。对于摄取提取物的6只大鼠(12只足)，其平均足跖肿胀度为47.06％±2.27(SEM)。这表明提取物对急性炎症的抑制反应为13.19％±0.20(SEM)。因此，表现出提取物的确有抗炎症的反应性。
实施例9-配方实施例鲨鱼肉提取物与橄榄油混合物-在橄榄油中添加运用乙醇为溶媒提取的鲨鱼肉提取物及维他命E油。这种混合物(105mg)被加工制成软明胶胶囊。混合物中含有提取物(10mg)，维他命E油(5mg)，及橄榄油(90mg)。
鲨鱼肉提取物与环糊精混合物-鲨鱼肉提取物与β-环糊精(85mg)及维他命E(0.075mg)混合在一起。这种混合物被进一步加工，制成可直接使用的粉末或颗粒。
虽然参照实施例描述了本发明，应理解在不违背本发明的范围的情况下可进行改变或修改。另外，当对于特定特征存在已知等价物时，那么这些等价物也如同在本项说明中被详细地加以描述。
工业应用性本项发明提取物是一种血管生成抑制剂。血管生成与各种各样的疾病或失调有关。因此抑制血管生成也许是预防或治疗这些疾病或失调的一种方法。这些疾病或失调包括癌症、视网膜病、炎症以及关节炎。因此，本发明的提取物至少对这些疾病的治疗有帮助。
权利要求
1.一种从鲨鱼肉获得的提取物，其特征在于，该提取物能抑制动物的血管生成。
2.如权利要求1所述的提取物，其特征在于，该提取物具有总提取物重量20-40％含量的磷脂。
3.如权利要求1或2所述的提取物，其特征在于，该磷脂脂肪酸内容物含有20-35％重量的二十二碳六烯酸。
4.如前任一权利要求所述的提取物，其特征在于，该提取物具有小于总提取物10％重量的甘油三酯含量。
5.如前任一权利要求所述的提取物，其特征在于，该鲨鱼肉是从下列任一获得的柠檬鱼、学鲨、斑点星鲨、魔鬼鲨、鲭鲨、蓝鲨、象鲨、鼠鲨和黑尖礁鲨。
6.一种从鲨鱼肉获得血管生成抑制性提取物的方法，其特征在于，该方法包括-使来自一种或多种鲨鱼的肉与溶剂接触足够的时间，使得从肉提取出一种或多种物质到溶液中，-将肉与溶液分开，和-从溶液中除去溶剂，获得作为血管生成抑制剂的提取物。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述溶剂是有机溶剂或超临界CO2。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂是乙醇、甲醇、乙酸乙酯或二氯甲烷或任何这些溶剂的混合物。
9.如权利要求6-8任一所述的方法，其特征在于，所述鲨鱼肉在接触溶剂前风干或冻干。
10.如权利要求6-9任一所述的方法，其特征在于，所述肉与溶液通过过滤分离。
11.如权利要求6-10任一所述的方法，其特征在于，该鲨鱼肉是从下列任一获得的柠檬鱼、学鲨、斑点星鲨、魔鬼鲨、鲭鲨、蓝鲨、象鲨、鼠鲨和黑尖礁鲨。
12.一种药物组合物，其特征在于，该药物组合物含有从至少一种鲨鱼的肉获得的血管生成抑制性提取物和合适的载体。
13.如权利要求12所述的组合物，其特征在于，所述组合物是提取物在食用油中的溶液或悬液。
14.如权利要求13所述的组合物，其特征在于，所述油是橄榄油。
15.如权利要求14所述的组合物，其特征在于，该组合物是提取物和环糊精的混合物。
16.鲨鱼肉的血管生成抑制性提取物的用途，其特征在于，用于制造治疗或预防疾病或紊乱的药物。
17.如权利要求16所述的用途，其特征在于，所述疾病包括癌症、视网膜病变、炎症和关节炎。
18.一种使用鲨鱼肉获得的血管生成抑制性提取物治疗或预防动物中的疾病或紊乱的方法。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述疾病包括癌症、视网膜病变、炎症和关节炎。
20.如权利要求1所述的提取物，其特征在于，该方法参照本文所述的任何实施例。
21.如权利要求6所述的方法，其特征在于，该方法参照本文所述的任何实施例。
22.一种药物组合物，其特征在于，它含有根据配方实施例的权利要求1所述的提取物。
23.基本如本文所述的权利要求16所述的用途。
24.基本如本文所述的权利要求18所述的方法。
全文摘要
从鲨鱼的肉中提取的，在动物身上具有血管生成抑制作用的一种提取物。一种包括将鲨鱼肉与一种溶媒混合；然后将所得的溶液与鲨鱼肉分离；接下来除去溶媒，并提取出具有血管生成抑制作用的提取物等工序的一种工艺流程。这种提取物对与血管生成有关的疾病，如癌症，视网膜病，炎症，以及关节炎的治疗作用。
文档编号A61P19/02GK1477966SQ01819923
公开日2004年2月25日 申请日期2001年12月18日 优先权日2000年12月20日
发明者P·F·戴维斯, A·D·麦克肯齐, P F 戴维斯, 麦克肯齐 申请人:工业研究有限公司, 奥它古大学
技术领域：
本发明是关于从鲨鱼的肉中提取的一种提取物，以及它对血管生成的阻碍或抑制作用。特别是，这项发明是关于一种从鲨鱼的肉中提取的一种提取物，这种提取物是运用溶媒提取法，随后通过除去溶媒来获得能作为血管生成抑制剂的一种油。
背景说明很久以来，各种各样鲨鱼产品被认为对预防或治疗某些疾病具有功效。特别是鲨鱼软骨粉已被尝试用来预防或控制某些癌症。
血管生成(新血管的生成)对恶性肿瘤的生存及生长非常重要。这些肿瘤与正常生长或器官相比具有较高的新陈代谢率，因此它们需要更多的血液来满足获取更多养份的需求。于是抑制血管生成成为控制或预防肿瘤生长的一种机制。
鲨鱼软骨已经显示出抑制血管生成的作用。然而目前的问题是在其使用方面上。为了达到预防或治疗癌症的目的，须服用大剂量的鲨鱼软骨粉。所需剂量被认为以每1公斤体重至少1克鲨鱼软骨粉的比例服用。而且鲨鱼软骨有一种令人难以接受的气味和味道。
从鲨鱼肝脏中提取的油也已被报道能减缓癌症生长。抗癌作用也许要归功于鲨鱼肝油中的烷基甘油。烷基甘油也存在于牛奶，血液以及免疫系统器官中，如肝脏、脾脏、骨髓和淋巴组织。
鲨鱼肝油也被认为含有角鲨胺(Squalamine)化合物。动物试验报告显示角鲨胺能使肿瘤丧失发展自身血液供给的能力。因此认为，鲨鱼肝油中所含有的角鲨胺或许对治疗和预防某些癌症有作用。
中国专利申请号CN01174036A中描述了一种经过脱水，冷冻及粉碎等工序处理后的鲨鱼肉。据报告这种经过加工后的肉能预防癌症。在专利中没有对从肉中获得提取物这个过程的描述，也没有任何血管生成抑制作用的描述。
上述鲨鱼产品的缺点是比血管生成抑制活力低，因此必需摄取大剂量的产品。而鲨鱼软骨和器官，例如鲨鱼肝脏是价格相对来说较昂贵的原材料。
加拿大专利申请号2,201,025描述了一种含有从多种原料，包括鲨鱼肉中提取的物质的药。该药被描述为对如丙肝等疾病具有治疗作用。没有任何显示表明该药剂具有抑制血管生成的能力，或是对任何与新生血管有关的疾病或失调有效。此外，这种药剂中所含有的从鲨鱼的肉中提取出的物质，经过了将肉烘干，加热除去油，然后碾碎肉的工艺过程。文件中没有提到碾碎的鲨鱼肉的构成，或什么化合物在加热过程中被除去的信息。
本项发明的发明者发现通过溶媒提取法从鲨鱼肉中得到的该提取物是一种惊人有效的血管生成抑制物，从而成为一种治疗与血管生成相关的一些疾病或失调的潜在试剂。
因此本项发明的目的是为了提供一种从鲨鱼肉中经溶媒提取法所得到的血管生成抑制物，或至少是提供了一种有效抑制血管生成的替代品。
发明描述本发明的第一个方面提供了从鲨鱼肉中提取的，在动物身上具有血管生成抑制作用的一种提取物。
本项发明中的提取物以含有磷脂作为主要成份较为理想。磷脂的最佳含量为提取物重量的20％-40％。典型的磷脂是磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine-PE)和磷酯酰胆碱(phosphatidylcholine-PC)。
进一步而言，磷脂脂肪酸最好含有高浓度的DHA(二十二碳六烯酸)，例如DHA为脂肪酸总重量的20-25％。
而且提取物中甘油三酯(triglycerides)的含量小于10％较为适宜。
本发明的第二个方面提供了从鲨鱼肉中提取具有血管生成抑制作用的提取物的方法，包括-使来自一只或多只鲨鱼的肉与一种溶媒接触足够长的时间，从而从肉中提取一种或多种物质到溶液中，-将肉与溶液分离，和-将溶媒从溶液中除去，从而得到作为血管生成抑制物的提取物。
任何适当的有机溶媒或超临界的CO2也许会用到。最适宜的溶媒是乙醇、甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、或是上述溶剂的混合物。
在本项发明的具体实施中，鲨鱼肉在与溶剂混合前先被冷冻干燥，或被风干。
可以使用能将提取液与肉分离的任何方法，然而最好通过过滤法来分离。
可以使用任何种类的鲨鱼肉作为原料。然而，最好是选用以下的一种或多种鲨鱼的肉斑点星鲨(rig)(柠檬鱼lemonfish)，学鲨(school shark)，魔鬼鲨(ghost shark)，鲭鲨，蓝鲨，象鲨(elephant shark)，鼠鲨和黑尖礁鲨。
本发明的第三个方面提供了一种含有从至少一种鲨鱼的肉中提取的，具有血管生成抑制作用的提取物及其适当载体的制药学成份。
本发明的第四个方面提供了从鲨鱼肉中提取的，具有血管生成抑制作用的提取物在针对某些疾病或失调的药剂制造方面的作用。这些疾病或失调包括癌症，视网膜病，炎症，以及关节炎。
本发明的第五个方面提供了运用从鲨鱼肉中提取的，具有血管生成抑制作用的提取物在动物身上治疗或预防某些疾病或失调的方法。这些疾病或失调包括癌症，视网膜病，炎症，以及关节炎。尽管发明中提到了各种各样的动物，但最理想的动物是人类。
详细说明在这里所说的“鲨鱼肉”是指任何部位的鲨鱼肉，为了避免疑虑，它将不会含有任何鲨鱼的内部器官。
在周围环境温度大约为15-25℃时，本项发明中提取物是一种油或油状物质，如糊状物质。在这里所提及的“油”，也包括那些油状和糊状特征的物质。
这个提取物的主要成份为磷脂，如磷脂酰乙醇胺(PE)和磷酯酰胆碱(PC)。磷脂的含量通常在重量的20-40％的范围内。
磷脂脂肪酸通常含有二十二碳六烯酸(DHA)，花生四烯酸(AA)，二十碳五烯酸(EPA)等。与其他产品和鱼类提取物不同的是本项发明的提取物，其脂肪酸组成中含有高浓度(总重量的20-35％)的DHA。从下表可看出，一个DHA的样品被发现是一种强有力的血管生成抑制物。由于本项发明的提取物含有高浓度的DHA，因此推测DHA是这个提取物中使其具有抑制血管生成特性的有效成份之一。
一般名 构造 样品浓度 血管生成抑制率一价不饱和脂肪酸肉豆蔻烯酸 14∶1(n-5) 10μg/ml 58％十六碳烯酸 16∶1(n-7) 5μg/ml 70％十七碳烯酸 17∶1(n-7) 20μg/ml 83％油酸 18∶1(n-9) 100μg/ml0％伞形花子油酸 18∶1(n-12)100μg/ml58％顺芥子酸 22∶1(n-9) 200μg/ml30％神经酸 24∶1(n-9) 100μg/ml0％
多价不饱和脂肪酸亚油酸 18∶2(n-6)5μg/ml 82％α-亚油酸 18∶3(n-3)20μg/ml66％花生四烯酸 20∶4(n-6)5μg/ml 84％二十碳五烯酸(EPA) 20∶5(n-3)3μg/ml 100％二十二碳五烯酸 22∶5(n-3)4μg/ml 71％二十二碳六烯酸(DHA)22∶6(n-3)5μg/ml 88％强力抑制剂(浓度为5μg/ml，抑制率大于80％)20∶5，22∶6，20∶4，18∶2优良抑制剂(浓度为10μg/ml，抑制率大于90％)22∶5，16∶1中等抑制剂(浓度为20μg/ml，抑制率小于90％)18∶3，17∶1，14∶1无效抑制剂(浓度为100μg/ml，抑制率小于60％)18∶1，22∶1，24∶1本项发明中的提取物也与其他鱼类提取物和产品截然不同，因为它所含的甘油三酯浓度惊人地低(重量上小于10％)。
运用典型的提取法，一种或多种鲨鱼的肉片在经过混合，风干，及与乙醇之类的溶媒混合的工序后，其体积会缩小。通常，混合物在室温下搅拌1-24个小时。随后通过过滤方法将提取液与肉分离。肉片与溶媒混合的工序可以随意重复进行。然后通过蒸发脱水法除去溶媒，得到油状的鲨鱼肉提取物。这种油通常含有各种游离型脂肪酸和甘油结合型脂肪酸。
接下来的实施例1中描述了二氯甲烷和乙醇的作用。在这里乙醇被预期为一种理想的溶媒。
实施例2中描述了鲨鱼肉中脂肪酸的组成。除了脂肪酸以外，预期或许还有其他成份对鲨鱼肉油的抑制血管生成活性起到作用。
实施例3描述了从被风干的蓝鲨(Blue Shark)肉中得到油的提取法。被风干的鲨鱼粉分别采用乙醇(EtOH)和乙酸乙酯(EtOAc)作为溶媒进行提取。这两种方法所得到油的提取率具有惊人的差异(乙醇13.7％，乙酸乙酯1.6％)。尽管运用乙酸乙酯的提取法的提取率较低，但其提取物所具有的独特血管生成抑制活性却较高，这显示这种提取物含有浓度较高的血管生成抑制性化合物。
从实施例3的生物试验中可以看出，鲨鱼肉油是一种比鲨鱼软骨，鲨鱼软骨提取物，或其他鱼油更有效的血管生成抑制物。
这3种方法中得到的油的脂肪酸成份及磷脂成份分别通过气相色谱分析法及31P NMR方法加以分析。薄层色谱分析法(Thin Layer Chromatography，TLC)也被用来定性分析油中所含有的各种脂质。鲨鱼肉中的无极性脂质的含量较低(用TLC法没有探测到甘油三酯，但磷脂的含量较高(24％EtOH，34％EtOAc)。鲨鱼油中脂肪酸(游离型和甘油结合型)的低含量暗示在这些提取物中存在一种高浓度的，未测定物质。
本项发明中的提取物可以是以本项发明过程中所得到的物质的再生成形式加以使用。然而，此提取物最好是与食用油混合，例如橄榄油，再制成胶囊，口服使用。此外，提取物也可以与固体载体混合，例如环糊精(cyclodextrin)，制成片状，颗粒，或粉末。
为了便于口服，颗粒，粉末或其他类似的形状也可以制成胶囊或与其他物质混合，例如食物。也可以考虑将其溶解于某种溶媒中，通过注射法摄取此提取物。而且，额外的成份，例如维他命E，也可以加入配方中。
血管生成与较广范围的疾病和失调有关。因此本项发明中的提取物也许对这些疾病和失调具有治疗或预防作用。这些疾病和失调包括癌症，视网膜症，炎症及关节炎，但不仅仅局限于这些。
另外，当预期该提取物对人类的疾病和失调具有十分有效的治疗和预防作用的同时，也认为其它动物可以受益于该提取物的施用。
实施例接下来的实施例进一步描述了这个提取物。对这个提取物的分析被认为不仅仅局限于以下的实施例。
实施例1-柠檬鱼的提取物1.5公斤柠檬鱼通过搅拌机被切成小块，并与1.5升二氯甲烷及3升甲醇在一个5升的圆锥形瓶中搅拌一整夜。经过滤将提取液与肉分离。接下来再取1.5升二氯甲烷与肉混合，并搅拌一整夜。随后，再次通过过滤将提取液与肉分离，并与前一次的滤出液混合。向两次所得到的总滤出液中加入盐溶液(0.88％KCL，1.5L)，并经振动混合。混合物经静置后，分成两层。处于下方的二氯甲烷层被取出进行再加工，通过旋转蒸发法除去溶媒，提取出油(12克，提取率为0.8％)。
实施例2实施-例1中所提取的油的脂肪酸组成运用气相色谱仪(Gas Chromatography-GC)对实施例1中提取的油的脂肪酸组成加以分析。
在分析之前，脂肪酸(游离型脂肪酸和甘油三酸脂)被转换成脂肪酸甲脂(Fatty Acid Methyl Esters-FAMEs)。待分析的油被溶解在乙烷(0.5ml)中，随后注入含有1％H2SO4甲醇的密封试管中。这个试管被置于50℃的水槽中一整晚。之后加入甲醇(2ml)和5％氯化钠水溶液，有机层(含有FAMEs)被分离出来。接下来用2％碳酸氢钠(sodium bicarbonate)溶液(2ml)清洗。
GC分析所采用的仪器是惠普(Hewlett-Packard)5890 GC。这个仪器带有一个体积为30m×0.25m×0.25μm的EC-Wax(Alltech)柱，其注入压为10psi。
分析过程中，EC-Wax柱在165℃下持续3分钟，随后温度以每分钟4℃的升温速度，上升到195℃，并保持10分钟。最后，温度以每分钟4℃的升温速度上升到225℃，并保持12分钟。FAMEs是通过火焰离子检测器(FID)来进行检测的。峰值(peaks)通过被测油与各种脂肪酸标准及已知的天然油(例如鳕鱼肝油)中的脂肪酸在保持时间上的比较被加以测定。
分析结果见表1。鲨鱼肉油含有高浓度的DHA(二十二碳六烯酸)。
表1鲨鱼肉油的脂肪酸组成脂肪酸百分比14∶0 0.216∶0DMA* 3.416∶0 19.916∶1 0.717∶0 0.517∶1 0.118∶0DMA* 0.518∶1DMA* 1.118∶0 9.618∶1 8.218∶2 1.020∶1 0.520∶4 6.020∶5 2.122∶4 n-6 2.922∶5 n-6 1.022∶5 n-3 5.222∶6 n-3 33.3
*二甲缩醛(dimethylacetal)由缩醛磷脂(磷脂)中的乙烯醚类(vinyl ethers)构成。
实施例3-蓝鲨的提取将冷冻的蓝鲨肉切成2厘米厚的肉片，并置于温度为35℃，压力小于2毫巴的真空烤炉中。24小时后，取出肉片，并将其切成更小的肉片，随后再次置于烤炉中3-4天。通常经过风干工序后，鲨鱼肉的重量会减少80％。经过风干后的鲨鱼肉先通过手工弄碎，再放入韦林氏搅切器(Waring blender)中加以粉碎，生成干燥粉末和纤维的混合物。
分别采用乙醇和乙酸乙酯作为溶媒，进行2次提取试验。
将鲨鱼粉(900克)和溶媒(乙醇或乙酸乙酯，4.5L)混合搅拌一整晚。为了搅拌充份，溶媒与鲨鱼粉的混合比例需为5∶1。为避免光线照射，容器用铝箔包起来。混合物通过Shleicher及Schuell 595滤纸进行过滤。随后，将滤渣与3L新的溶媒混合搅拌一整晚，并将所得混合物进行过滤。将两次提取所得的滤出液混合，再通过旋转蒸发法除去溶媒。
实施例4-实施例3中所提取出的油的脂肪酸的组成象实施例2中所描述的那样，将每种提取物中的脂肪酸(游离型和结合型)转换成甲酯(methyl esters)，通过气相色谱仪加以分析。
用乙醇溶媒提取法从干燥的蓝鲨粉末中所得的提取物具有较高的油提取率(13.7％)。相反，用乙酸乙酯溶媒提取法所得的油的提取率只有1.6％。
表2蓝鲨粉末提取物
用薄层层析显示提取物中所存在的各种脂质的种类。在无极性TLC板上，每一种提取物都只呈现较少含量(胆固醇和微弱的FFA点，没有迹象显示含有甘油三酯)。但是分析显示提取物中极性脂质含量高，例如磷脂酰乙醇胺(PE)，磷酯酰胆碱(PC)，以及鞘磷脂(SM)。
两种鲨鱼提取物在脂肪酸含量及组成上体现出巨大的不同(表3)。运用乙酸乙酯作为溶媒的提取物的脂肪酸总含量为30.1％。相比较而言，运用乙醇为溶媒的提取物的脂肪酸总含量非常低，只有7.3％。由此可见，加上乙醇溶媒提取法的高提取率，乙醇比乙酸乙酯能提取出更多的非脂质物质。
两种提取物的脂肪酸组成非常相似，都含有高浓度的DHA(二十二碳六烯酸)20.0-22.2％，油酸(18∶1)10.0-12.2％，硬脂酸(18∶0)11.2-14.9％，以及棕榈酸16.1-19.1％。
表3蓝鲨提取物的脂肪酸组成(wt/wt％)脂肪酸 保持时间(分钟)乙醇乙酸乙酯16∶0DMA* 9.40 10.14.516∶0 10.07 19.116.116∶1 10.59 2.0 1.718∶0DMA* 13.74 1.4 0.918∶1DMA* 14.24 4.6 2.318∶0 14.85 11.214.918∶1(n-9) 15.53 12.210.018∶1(n-7) 15.74 4.9 4.518∶2(n-6) 17.16 1.220∶1(n-11) 23.45 1.320∶1(n-9) 23.60 1.720∶4(n-6) 27.04 3.6 6.020∶5(n-3) 29.15 5.9 6.722∶5(n-3) 37.53 5.0 4.822∶6(n-3) 39.10 20.022.3脂肪酸总含量 7.3 30.1(％)*二甲缩醛由缩醛磷脂中的乙烯醚类构成。
AA ＝花生四烯酸EPA＝二十碳五烯酸DHA＝二十二碳六烯酸实施例5-实施例3中油的磷脂构成用31P NMR分辨磷脂。六甲基磷酰胺(HMPA)是定量化的内部标准。31P NMR证实了利用TLC的观察结果这种油含有高浓度的磷脂。这种油中磷脂总水平相当高(乙醇提取物为24％，乙酸乙酯提取物为34％)。
表4蓝鲨磷脂成分(wt/wt％)
1PC+AAPC2PE+MPE/LPC？Pl＝磷酯酰肌醇SM＝鞘磷脂PE＝磷酯酰乙醇胺MPE＝一甲基磷酯酰乙醇胺LPC＝溶血磷酯酰胆碱DPE＝二甲基磷酯酰乙醇胺AAPC＝烷基酰基磷酯酰胆碱PC＝磷酯酰胆碱实施例6-在试管中的生物鉴定将实施例1中准备好的油利用主动脉环作血管生成抑制的试验。方法基于Nicosia和Ottinetti等，Lab Invest.63115-122(1990)和Brown等，Lab Invest.75539-555(1996))描述的方法。先把大鼠的脂肪及血管周的纤维组织去除，然后把主动脉切成2mm厚。把0.4毫升纤维凝胶栓(通过将凝血酶加入溶解于MCDB131中的纤维蛋白原培养液制备)放入24-孔培养板。动脉环被放在每一个孔中央，然后盖上0.4毫升纤维凝胶栓。每层纤维凝胶栓盖上1.5毫升的MCDB131，然后放在37度，3％CO2/97％空气的环境下加以培养。待测的鲨鱼肉提取物被放入培养基中。每种提取物做3次试验。
约5天之后，微血管会出现在主动脉坏的周围。在5日至14日之间用数码相机通过相差显微镜拍下每个孔的变化。动脉环周围生长的微血管的每张照片由NIH1.59软件测定定。在每个间隔时间会计算出微血管成长率的平均数值。
与市面上购买到的鱼油和其他鲨鱼产品相比，鲨鱼肉油显示出更高的血管生成抑制效果，见表5。
表5鱼油和其他鲨鱼产品的血管生成抑制活性
将实施例3中每种油(以及运用甲醇所提取的油)的等分，采用类似于前述对实施例1油所运用的大鼠的主动脉环作试验，分析这种油是否具有调节血管生成的能力。
每组待测样本重复做3次，得出的结果是来自这3次的平均数。此外准备了另一组3个孔的对照组，只加入载体。在待测物质存在的情况下，测定了相对于对照组的新生血管生长速度。下图为对运用不同的有机溶媒所提取的不同浓度的油的血管生成抑制率的评估。
表6利用鲨鱼肉提取物抑制血管生成
这个实验显示出乙醇提取物及甲醇提取物在1-3μg/ml浓度下具有很相近的血管生成抑制率，大约为50％。乙酸乙酯提取物在0.2μg/ml下，其血管生成抑制率为50％，是前者的5倍。
将乙醇提取物与橄榄油混合，在主动脉环实验中测定对血管生成的影响。首先，即使高浓度橄榄油都对血管生成无抑制。事实上在浓度为200μg/ml下，它甚至略有促进血管生成的作用，引起达33.6％的刺激。
当将乙醇提取物与橄榄油以1份提取物对4份橄榄油(体积/体积)混合，并在15μg/ml(3μg提取物/ml)下测试时，测得87.5％的抑制。
当将乙醇提取物与橄榄油以1份提取物对9份橄榄油(体积/体积)混合，并在30μg/ml(3μg提取物/ml)下测试时，测得85.8％的抑制。
当将乙醇提取物与β-环糊精以1份提取物对6份β-环糊精(wt/wt)混合，当在15μg/ml(2.5μg提取物/ml)的浓度下保温时，测得40％的抑制。
实施例7-体内生物试验把鲨鱼肉提取物掺入饮用水中，给大鼠饮用。每种提取物被投于饮用水中，浓度为0.166mg/ml。每两日更换新的含有提取物的饮用水。更换时观察其消耗量，确定提取物的剂量。分别对运用乙醇和乙酸乙酯为溶媒的鲨鱼肉提取物做了评估。另外一组的对照组自由摄取不含有提取物的饮用水。每组含有6只(Sprague-Dawley)大鼠(雌雄各3只)。
投放提取物2星期后，开始诱导血管生成。诱导血管生成方法是向大鼠腹膜内注射48/80化合物。一日2次，持续4.5日，逐渐增加剂量。
(参照Davis，等，Microvasc.Res.，54178-182(1997))注射化合物16日之后，每只大鼠的血管系统用India墨水来染色，而且其肠及相连的肠系膜窗被切除，铺在载玻片上晒干。拍摄这些载玻片的数码照片，计算出每个肠系膜窗被微血管占据的比例。
最后，测定每组的血管生成平均数，再采用Student t试验来评估其统计学意义。
在各时间点测定的大鼠组的体重如表7所示。
表7体重(克)(增长率％)
表7的结果显示出两组摄取鲨鱼提取物的大鼠的体重增加率没有明显的差异。它们的生长率与对照组的相近。这个评论同时适用于雄性及雌性大鼠，雄性的基本生长率比雌性大。试验表明添加了鲨鱼肉提取物的饲料对大鼠的生长上並没有显著的影响。
计算相对于大鼠体重的提取物摄取量。这个计算是在测量了大鼠的体重及其对饮用水的摄取量的基础上得出的。
表8鲨鱼肉脂类的每日剂量(mg/kg体重)
测得最高剂量是在实验开始时。在化合物48/80给药期间，大鼠对水的摄取量显著地减少，显示提取物的摄取量相对减少。所以在这个时期用量也是最少的。停止注射48/80化合物后，饮用水的摄取量增加，提取物的摄取量也相对增加了。
测定了上述的肠系膜窗的体内血管生成作用，结果见表9。
乙醇提取物导致在该剂量血管生成被显著抑制(46％)。比较中，乙酸乙酯提取物导致在大约同样的剂量仅有21％抑制。这仍然是显著的。然而，虽然剂量对于两种提取物是大致相同的，已知乙酸乙酯提取物在体外主动脉环试验中抑制更强。
表9鲨鱼肉提取物血管生成抑制率
实施例8-抗炎症作用分析为了评估鲨鱼肉的乙醇提取物在急性炎症方面的作用，将乙醇提取物添加到饮用水中，分别施给6只大鼠(3只雄性，3只雌性)。这是在引发急性炎症开始前一周。对照组没有摄取这种提取物。提取物在饮用水中的添加量为0.2mg/ml。
炎症的引发是通过在每只大鼠的两只后足跖注射100微升浓度为2.5％λ-角叉胶溶液，诱导炎症。在注射之前，测量大鼠的左右足跖的体积，注射4个小时后再次测量。测定每只后足的体积差值。
提取物的平均消耗量为雄性大鼠4.67mg/天，雌性大鼠3.75mg/天。
对于摄取通常饮用水(不含提取物)的6只到大鼠(12只足)，其平均足跖肿胀度为54.21％±2.30(SEM)。对于摄取提取物的6只大鼠(12只足)，其平均足跖肿胀度为47.06％±2.27(SEM)。这表明提取物对急性炎症的抑制反应为13.19％±0.20(SEM)。因此，表现出提取物的确有抗炎症的反应性。
实施例9-配方实施例鲨鱼肉提取物与橄榄油混合物-在橄榄油中添加运用乙醇为溶媒提取的鲨鱼肉提取物及维他命E油。这种混合物(105mg)被加工制成软明胶胶囊。混合物中含有提取物(10mg)，维他命E油(5mg)，及橄榄油(90mg)。
鲨鱼肉提取物与环糊精混合物-鲨鱼肉提取物与β-环糊精(85mg)及维他命E(0.075mg)混合在一起。这种混合物被进一步加工，制成可直接使用的粉末或颗粒。
虽然参照实施例描述了本发明，应理解在不违背本发明的范围的情况下可进行改变或修改。另外，当对于特定特征存在已知等价物时，那么这些等价物也如同在本项说明中被详细地加以描述。
工业应用性本项发明提取物是一种血管生成抑制剂。血管生成与各种各样的疾病或失调有关。因此抑制血管生成也许是预防或治疗这些疾病或失调的一种方法。这些疾病或失调包括癌症、视网膜病、炎症以及关节炎。因此，本发明的提取物至少对这些疾病的治疗有帮助。
权利要求
1.一种从鲨鱼肉获得的提取物，其特征在于，该提取物能抑制动物的血管生成。
2.如权利要求1所述的提取物，其特征在于，该提取物具有总提取物重量20-40％含量的磷脂。
3.如权利要求1或2所述的提取物，其特征在于，该磷脂脂肪酸内容物含有20-35％重量的二十二碳六烯酸。
4.如前任一权利要求所述的提取物，其特征在于，该提取物具有小于总提取物10％重量的甘油三酯含量。
5.如前任一权利要求所述的提取物，其特征在于，该鲨鱼肉是从下列任一获得的柠檬鱼、学鲨、斑点星鲨、魔鬼鲨、鲭鲨、蓝鲨、象鲨、鼠鲨和黑尖礁鲨。
6.一种从鲨鱼肉获得血管生成抑制性提取物的方法，其特征在于，该方法包括-使来自一种或多种鲨鱼的肉与溶剂接触足够的时间，使得从肉提取出一种或多种物质到溶液中，-将肉与溶液分开，和-从溶液中除去溶剂，获得作为血管生成抑制剂的提取物。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述溶剂是有机溶剂或超临界CO2。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂是乙醇、甲醇、乙酸乙酯或二氯甲烷或任何这些溶剂的混合物。
9.如权利要求6-8任一所述的方法，其特征在于，所述鲨鱼肉在接触溶剂前风干或冻干。
10.如权利要求6-9任一所述的方法，其特征在于，所述肉与溶液通过过滤分离。
11.如权利要求6-10任一所述的方法，其特征在于，该鲨鱼肉是从下列任一获得的柠檬鱼、学鲨、斑点星鲨、魔鬼鲨、鲭鲨、蓝鲨、象鲨、鼠鲨和黑尖礁鲨。
12.一种药物组合物，其特征在于，该药物组合物含有从至少一种鲨鱼的肉获得的血管生成抑制性提取物和合适的载体。
13.如权利要求12所述的组合物，其特征在于，所述组合物是提取物在食用油中的溶液或悬液。
14.如权利要求13所述的组合物，其特征在于，所述油是橄榄油。
15.如权利要求14所述的组合物，其特征在于，该组合物是提取物和环糊精的混合物。
16.鲨鱼肉的血管生成抑制性提取物的用途，其特征在于，用于制造治疗或预防疾病或紊乱的药物。
17.如权利要求16所述的用途，其特征在于，所述疾病包括癌症、视网膜病变、炎症和关节炎。
18.一种使用鲨鱼肉获得的血管生成抑制性提取物治疗或预防动物中的疾病或紊乱的方法。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述疾病包括癌症、视网膜病变、炎症和关节炎。
20.如权利要求1所述的提取物，其特征在于，该方法参照本文所述的任何实施例。
21.如权利要求6所述的方法，其特征在于，该方法参照本文所述的任何实施例。
22.一种药物组合物，其特征在于，它含有根据配方实施例的权利要求1所述的提取物。
23.基本如本文所述的权利要求16所述的用途。
24.基本如本文所述的权利要求18所述的方法。
全文摘要
从鲨鱼的肉中提取的，在动物身上具有血管生成抑制作用的一种提取物。一种包括将鲨鱼肉与一种溶媒混合；然后将所得的溶液与鲨鱼肉分离；接下来除去溶媒，并提取出具有血管生成抑制作用的提取物等工序的一种工艺流程。这种提取物对与血管生成有关的疾病，如癌症，视网膜病，炎症，以及关节炎的治疗作用。
文档编号A61P19/02GK1477966SQ01819923
公开日2004年2月25日 申请日期2001年12月18日 优先权日2000年12月20日
发明者P·F·戴维斯, A·D·麦克肯齐, P F 戴维斯, 麦克肯齐 申请人:工业研究有限公司, 奥它古大学
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