纳米聚合物对免疫调节剂的肿瘤靶向递送的制作方法
专利名称：纳米聚合物对免疫调节剂的肿瘤靶向递送的制作方法
技术领域：
阐述了包含生物可降解聚合物的纳米构建物(nanoconstruct),所述生物可降解聚合物与可靶向肿瘤并增强在肿瘤位点驻留的肿瘤结合配体和抗体缀合。通过让纳米构建物与正协同刺激信号激动剂和负免疫调节信号抑制剂联合，来进一步提高抗肿瘤免疫力。
背景技术：
因其遍及全身广泛转移的倾向，黑素瘤是皮肤癌中最为致命的。一旦其扩散到远端部位，则生存中值小于6个月。当前常规疗法对抗转移性黑素瘤的功效有限。现在有强有力的证据表明，对于一些转移性黑素瘤患者，免疫系统可在诱导长期益处中发挥重要作用。一种发展强烈免疫应答的方法涉及通过使用特异性toll样受体(“TLR”)来激活先天免疫细胞，例如浆细胞样树突细胞(“PDC”)。在直接应答CpG寡脱氧核苷酸刺激的pDC和B细胞中，TLR9是人TLR表达中最特异性的。不幸的是，CpG的全身注射导致主要免疫器官中pDC细胞的激活，并耗尽肿瘤之外的这一重要类型的抗肿瘤细胞库。因此，存在将CpG靶向递送至黑素瘤以增强抗肿瘤活性同时降低或消除PDC的全身性激活的需求。发明简述
本文提出了通过生物可降解的L-PG在体内将CpG靶向递送至黑素瘤，其中该递送系统有效产生所需的保护性免疫，增强抗肿瘤活性，并降低或甚至消除PDC的全身性激活。阐述了与可靶向肿瘤并增强在肿瘤位点驻留的肿瘤结合配体及抗体缀合的可降解聚合物。举 例而言，一种所述聚合缀合物为多聚(L-谷氨酸)-CpG缀合物(“L-PG-CpG”)。已表明L-PG-CpG比游离CpG更好地降低肿瘤生长，并引发更强的对肿瘤抗原(OVA)的全身性⑶8T细胞应答。这种亲巨曬细胞的(macrophage-tropic)聚合物与肿瘤浸润巨曬细胞相互作用，并聚积在肿瘤位点。附图简述
图1提供的两幅图说明通过TLR激动剂肿瘤内激活PDC引发肿瘤抗原特异性的CD8应答，该应答随后导致对远端肿瘤的排斥。具体而言，图1A显示瘤内注射CpG诱导免疫应答的“引发阶段”，将其定义为引发抗原特异性的适应性免疫细胞(CD4和CD8 T细胞)。在弓丨发阶段，CpG激活pDC以产生INF-α，INF-α进一步激活NK细胞。NK细胞裂解肿瘤细胞并释放肿瘤抗原至mDC。INF-α亦激活mDC以变成有效的专门抗原呈递细胞。随后mDC迁移至肿瘤引流淋巴结，在此其诱导抗原-特异性⑶4和⑶8 T细胞扩增。图1B说明⑶4和CD8 T细胞在淋巴结中扩增后，其进入血液循环，触发适应性免疫应答的“效应阶段”。在效应阶段，抗原特异性的CD8 T细胞和其它肿瘤杀伤细胞(NK细胞)被募集至肿瘤位点。最重要的是，CD8 T细胞和NK细胞不但可进入接受瘤内注射的原发肿瘤，而且还可进入瘤内注射不可及的远端转移性肿瘤。远端肿瘤的免疫排斥是肿瘤内CpG治疗的另一个主要优势。图2说明了决定⑶8 T细胞的肿瘤杀伤活性的负和正协同刺激途径。⑶8细胞的肿瘤杀伤活性不但受通过T细胞受体信号转导途径的肿瘤抗原识别的调控，而且还受负和正协同刺激途径的调控。以CTLA4途径为代表的B7负协同刺激途径，关闭CD8 T细胞的肿瘤杀伤活性。正协同刺激途径例如0X40和细胞因子(IL-2)增强CD8细胞的肿瘤杀伤活性。已开发出靶向免疫-协同刺激途径的抗肿瘤试剂。在治疗人肾脏细胞癌中，针对CTLA4的拮抗剂抗体已显示出初始希望。0X40的激动剂抗体已显示荷瘤小鼠的存活显著提高。可合理地将这些试剂与TLR9激动剂联合用于癌症治疗。 图3显示用于磁共振成像(PG-Gd)、近红外荧光成像(PG-NIR)、双光学/MR成像(PG-Gd-NIR)的PG和基于PG的缀合物的结构，以及为用光学/MR成像可显现的免疫刺激试剂的PG-CpG缀合物[PG-Gd(111In)-CpG和PG-NIR-CpG]的结构。当多聚氨基酸由L-谷氨酸组成时，用L-PG来表示PG ;当多聚氨基酸由D-谷氨酸组成时，用D-PG来表示PG，NIR、近红外。DTPA为二亚乙基三胺五乙酸。图4显示仅瘤内注射CpG来治疗小鼠中的B16F10黑素瘤。在C57BL6小鼠的右侧皮下接种B16F10黑素瘤细胞。在肿瘤接种的同一天采用流体动力学的方法将FLT3配体DNA (10 μ g/小鼠)注射进小鼠中，以在体内扩增树突细胞。在肿瘤接种和树突细胞扩增后7天，注射20 yg CpG0对照组意指仅有FLT3配体治疗而无CpG治疗的荷瘤小鼠。通过肿瘤内或腹膜内注射来递送CpG，剂量为每次注射20 Ug CpG (在50 μ I PBS中)。图5Α、5Β和5C显示PG-CpG增强CpG的免疫刺激效力和抗肿瘤功效。图5Α显示在小鼠模型中，当肿瘤内给予时，L-PG-CpG比CpG更有效地抵抗黑素瘤肿瘤移植物。给C57B6小鼠皮下接种B16-0VA肿瘤细胞七天之后，将L-PG-CpG (50 Pg当量CpG)、CpG (50 Pg)或L-PG (500 Pg)注射到肿瘤中。每3天通过测量肿瘤的垂直直径来测量肿瘤的大小(η =
5)。图5Β显示当肿瘤内给予时，L-PG-CpG在触发抗原特异性的免疫应答中比CpG更有效。以A图中的方式处理荷有皮下B16-0VA肿瘤的小鼠。用荷载0VA257-264肽的四聚体(BDPharmingen, San Diego, CA)，将肿瘤抗原-特异性的⑶8应答测量为OVA-特异性的⑶8T细胞计数。图5C显示L-PG-CpG(而非可溶性CpG)特异性地激活肿瘤中的免疫细胞。在瘤内注射每种药物之后5天，提取来自肿瘤和脾脏的免疫细胞，通过用抗CD69抗体染色来分析NK细胞的激活作用。PG-CpG保留了其对肿瘤的特异性。相比之下，可溶性CpG同样可激活脾脏中的NK细胞。实线未处理对照。虚线用CpG或L-PG-CpG处理。图6说明瘤内注射后L-PG聚合物的分布。图6A为注射L-PG-NIR至裸小鼠舌的人DM14鳞状细胞癌中后24小时获得的NIRF图像，其显示了聚合物在注射位点和引流颈淋巴结中的驻留(箭头)。图6B为所切除的肿瘤和淋巴结的NIRF图像。图6C为所切除的淋巴结经H&E染色后的显微照片。图6D显示通过放射自显影检查的111In-标记的L-PG-CpG和CpG在B16黑素瘤中的驻留。
图7为接种B16-0VA黑素瘤后获得的数据，用PBS、CpG、抗小鼠0X40或CpG加抗小鼠0X40治疗小鼠。图7A提供随时间变化的肿瘤面积(mm3)。图7B提供随时间变化的特异性OVA抗原-阳性的⑶8+ T细胞占总的⑶8 T细胞的百分比。图8为静脉内注射后CpG和PG-CpG的生物分布。肝和脾对PG-CpG的摄取显著更少。图9显示PG-Gd-NIR被肿瘤中的巨噬细胞/APC所摄取。图9A显示静脉内注射后24小时，PG-Gd-NIR与CD68巨噬细胞/APC标记共同位于裸大鼠的C6肿瘤中。图9B-D显示，在荷有A20 B-细胞淋巴瘤的同基因Balb/c小鼠中，用氯膦酸盐(clodronate)脂质体消耗巨噬细胞/APC，导致肿瘤中PG-Gd-NIR的摄取减少。在注射PG-Gd-NIR (O. 02毫摩尔当量Gd/kg，48纳摩尔NIR染料/小鼠)的24小时之前注射氯膦酸盐脂质体。图9B提供用FMT2500 3D光学成像系统获得的近红外荧光图像。图9C为注射Pg-Gd-NIR后2天在
4.7T获得的Tl-加权MR图像。图9D为经切除肿瘤的免疫组织学染色，其证实了与注射盐 水对照的小鼠相比，注射氯膦酸盐脂质体的小鼠肿瘤中，消耗了 CD68+细胞，并且荧光强度和MRI信号显著降低。图10显示MSH-PG-CpG被表达MSH受体的B16-F10细胞代谢。在6孔板中将200Kg/ml 浓度的 MSH-L-PG-CpG 与 B16-F10 细胞一起孵育。让 B16-F10 细胞摄取 MSH-PG-CpG2小时。然后用RPMI培养基洗涤细胞3次。加入新鲜培养基，培养细胞12小时，以使其处理内化的MSH-PG-CpG。收获培养基，用其刺激小鼠脾细胞产生IFN- Y的活性来量化释放到培养基中的CpG。IFN-y的产量用来自Pharmingen (San Diego, CA)的试剂盒经ELISA测定来测定。图11显示以下物质的结构单谷氨酸L-Glu-CpG、Gd(111In)-或荧光染料标记的L-PG-CpG (4 种不同 MW)、D-PG-CpG、多聚(L-Glu-Tyr)-CpG、多聚(L_Glu_Ala)-CpG、多聚(羟丙基L-谷氨酸)-CpG (L-PHPG-CpG)和带有酸敏感接头的L-PG-缩酮-CpG及D-PG-缩酮-CpG0图12为GcK111In-或染料-标记的L-PHPG-CpG的合成方案。图13为用于靶向递送CpG的Gd (111In)或染料-标记的NDP-MSH-PEG-L-PG-CpG(聚合物5)的合成。图14A描述通过酪氨酸酶将酪氨酸氧化为L-DOPA再氧化为邻醌。图14B为靶向MClR的酪氨酸酶可激活的、结合CpG的DNP-MSH-PEG-D-PG纳米构建物的合成。在酪氨酸酶存在时，该聚合缀合物经历迈克尔-型环化以释放游离CpG。图14C显示CpG通过尿素接头与衍生自Tyr的异氰酸酯偶联。图15显示在瘤内注射后的4小时时，PG-CpG-NIR与B16/F10黑素瘤中的巨噬细胞(⑶68 +)缔合。PG-CpG-NIR及肿瘤相关巨噬细胞高度散布于整个肿瘤中。以更高倍放大显示巨噬细胞吞噬聚合物到囊泡区室(箭头)。巨噬细胞可能在内溶酶体区室中吞噬聚合物。图16为肿瘤靶向聚合物-药物缀合物的图解。图17为递送纳米聚合物-CpG的假设机理的另一图解。图18显示纳米聚合物CpG的纯度。图19A和B显示PG-CpG在体外激活脾脏NK细胞。
图20A、B、C和D显示肿瘤相关的巨噬细胞(CDllb+)对PG聚合物的选择性摄取。图21显示引流淋巴结中巨噬细胞和DC(而非B细胞)对PG聚合物的选择性摄取。发明详述
免疫治疗将免疫抑制性微环境转化为免疫刺激性微环境。对免疫系统先天装备(innate arm)起作用的药物因其在“跳跃式启动(jump-starting) ”免疫应答中的独特特征而已显示出巨大前景。在过去十年中，先天免疫细胞受体的分子鉴定已导致一系列免疫调节剂的发现和设计。本文提供了新型纳米技术平台和递送系统，用于通过用刺激免疫细胞中的TLR9信号转导的toll样受体(TLR) TLR激动剂激活浆细胞样树突细胞(pDC)，来产生抗肿瘤免疫应答。本文阐述了通过有效产生保护性免疫并增强抗肿瘤活性 (但降低或甚至消除pDC的全身性激活)的生物可降解聚合物在体内靶向递送TLR9激动剂CpG至黑素瘤。主要免疫器官如肝和脾中PDC的激活可耗尽肿瘤外的这一重要类型的抗肿瘤细胞库。在体内通过有效产生保护性免疫并增强抗肿瘤活性的生物可降解聚合物来靶向递送TLR9激动剂CpG至黑素瘤，降低或甚至消除pDC的全身性激活。本文所述技术在与以下靶向递送联合时亦是有用的TLRl/2激动剂，例如Pam3CSK4 ；TLR3激动剂，例如多聚(1:C) ；TLR4激动剂，例如合成的脂质A模拟物；TLR5激动剂，例如鞭毛蛋白；TLR6/2激动剂，例如FSL-1(Pam2CGDPKHPKSF) ;TLR7 激动剂，例如咪喹莫特(Imiquimod) ;TLR8 激动剂，例如 ssRNA40 ;和N0D1/2激动剂，例如三-DAP和胞壁酰二肽(MDP)。如本文所提供，开发出了通过受体介导的摄取主动靶向黑素瘤细胞的PG-CpG纳米构建物。通过让PG-CpG纳米构建物与正协同刺激信号激动剂和负免疫调节信号抑制剂合理联合，提高了抗肿瘤免疫。具体而言，在黑素瘤的小鼠模型中，我们已应用了这种亲巨噬细胞的聚合物技术递送CpG 0DN2216至肿瘤位点。我们合成了多聚(L-谷氨酸)-CpG缀合物(“L-PG-CpG”)，在将其肿瘤内给予B16-0VA黑素瘤皮下移植物时，通过与非缀合的CpG 0DN2216比较检测了其抗癌作用。我们发现，L-PG-CpG比游离CpG更大程度地降低肿瘤生长。此外，对肿瘤抗原OVA，L-PG-CpG触发更强的全身性⑶8 T细胞应答。为进一步开发本发明在黑素瘤的免疫治疗中的应用和瘤内注射纳米-CpG对CpG的抗肿瘤免疫应答的作用，可建立聚合物载体的理化特性和瘤内注射后CpG的免疫刺激活性之间的结构-活性关系。靶向黑素瘤细胞的纳米-CpG (其中纳米-CpG由黑素瘤细胞进行局部处理)可以以肿瘤-特异性的方式激活PDC。而且，基于免疫系统是复杂的这一事实，本文所述的黑素瘤的免疫治疗可能需要对多种免疫刺激途径的联合干涉，需要纳米-CpG与正协同刺激途径的其它激动剂和/或负协同刺激途径的拮抗剂相联合。此外，黑素瘤是对免疫疗法敏感的几种实体瘤之一。已显示成功用于治疗黑素瘤患者的其它类型的免疫疗法包括高剂量的细胞因子，例如干扰素-α ( “IFN-α ”)和白细胞介素2 (“IL-2”)；基于黑素瘤肿瘤抗原的肽疫苗；树突细胞疫苗和过继转移的肿瘤抗原-特异性的CD8 T细胞。可导致黑素瘤对免疫疗法产生应答的机理为免疫抑制的肿瘤微环境向免疫刺激的肿瘤微环境的转换。免疫激活剂，例如含有未甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤基序(本文中通常称作“CpG”)的Toll -样受体(“TLR”)激动剂CpG寡核苷酸，显著提高了免疫疗法的功效，其如在黑素瘤小鼠模型中所示。
合成的CpG模仿微生物DNA，引起一组协调的免疫应答，包括先天性免疫和获得性免疫。浆细胞样树突细胞(“PDC”)是人CpG的主要靶细胞。pDC具有产生IFN-α的特殊能力，IFN-α随后激活T细胞、自然杀伤(NK)细胞和抗肿瘤免疫的其它组分。如小鼠模型中所示，CpG是癌症的有效免疫调节剂，已证明其在人类临床试验中是安全的。但是，如全身注射CpG—样，肿瘤位点-特异性地递送游离CpG导致主要免疫器官例如肝和脾中pDC的激活，并耗尽肿瘤外的这类重要的抗肿瘤细胞库。通过将免疫刺激“集中”在肿瘤位点，瘤内注射CpG显著提高了其抗肿瘤作用。但是，瘤内注射可溶性CpG存在两个问题。第一，难以控制所注射的CpG在肿瘤内的保留时间。第二，可溶性CpG仍可通过扩散吸收而进入循环。为解决这些问题，我们建议使用生物相容的生物可降解聚合物平台来指引和控制CpG在肿瘤位点的释放。为此目标，如我们在本文中所示，只要有可行的药物递送系统，就可通过肿瘤相关的巨噬细胞的吞噬作用将合成的多聚(L-谷氨酸)(“L-PG”)和其它聚合物选择性地保留在肿瘤中。可与本发明联合使用的适宜聚合物包括但不限于多聚(DL-谷氨酸)；多聚 (L-天冬氨酸)；多聚(羟丙基谷氨酸酯)；多聚(羟乙基谷氨酸酯)；多聚(氨基酸)的共聚物；和其它合成的和天然的水溶性聚合物，包括但不限于聚乙烯醇、多羟基乙基甲基丙烯酰胺、葡聚糖、多糖、人血清白蛋白、透明质酸等等。我们发现与通过瘤内注射递送游离CpG相比，通过瘤内注射递送的L-PG-CpG缀合物即与L-PG化学结合的CpG表现出显著更强的针对已建立黑素瘤的抗肿瘤活性。如本文进一步所提供，可通过合成和表征具有不同分子量(并因此大小不同)、降解性和电荷的一系列结合CpG的PG聚合物(本文中有时亦称作“纳米-CpG”)，来测定瘤内注射后对其抗癌作用的最佳理化特性。然后就可评估瘤内注射后纳米构建物诱导先天性和获得性免疫的能力。此外，如下所述，业已开发并验证了通过受体介导的摄取和酪氨酸酶介导的CpG释放两者来主动靶向黑素瘤细胞的PG-CpG纳米构建物。如本文更进一步所述，通过PG-CpG纳米构建物与正及负协同刺激分子的联合，可提高抗肿瘤免疫。例如，提出了纳米-CpG与正协同刺激分子(例如0X40)的激动剂抗体或负协同刺激分子(例如CTLA-4和B7)的拮抗剂抗体联合的抗肿瘤作用。提供了用于测定纳米-CpG和对协同刺激途径起作用的治疗性抗体连同细胞因子方案联合的抗肿瘤作用的方法。用整个肿瘤作为抗原，基于本文所述的新型纳米-CpG的疫苗可诱导对黑素瘤的有效的T-细胞免疫应答。通过利用这些新型纳米构建物来靶向递送免疫刺激剂，可产生改进的抗肿瘤功效。此外，虽然已证明黑素瘤是测试免疫策略的极好模型系统，但本文所述的策略亦可用于治疗其它类型的癌症，例如肺癌和结肠癌。黑素瘤的免疫疗法
2009年，美国约有69，000男性及女性被诊断为患黑素瘤，估计大约有8，600将死于这种疾病。Jemal k 等，Cancer Statistics (癌症统计)，CA Cancer J Clin 59:225-49，2009。有意义的是，诊断为黑素瘤的频率正不断增加，发病率每年增加3%。黑素瘤特征为其强大的侵入和转移能力。在黑素瘤患者中，大约20%最后死于转移性疾病。因此，黑素瘤仍是因恶性肿瘤而死亡的最常见原因之一。一旦黑素瘤扩散到远端位点，则生存中值小于6个月。
在二十多年以前，发现黑素瘤患者可针对其肿瘤引发T-细胞应答。Boon T等，Human T Cell Responses Against Melanom (针对黑素瘤的人 T 细胞应答)，Annu RevImmunol 24:175-208, 2006。在黑素瘤患者中测试了几种免疫疗法,包括干扰素疗法、同种异体全细胞疫苗、重组病毒载体、与淋巴耗尽联合的过继免疫疗法和同种异体细胞裂解物。现有有力证据表明，对一些转移性黑素瘤患者，免疫系统在诱导长期益处中有重要作用。但是总体应答率仍低，这可能是因为缺乏黑素瘤-特异性的抗肿瘤免疫应答及在复杂的免疫应答中仅激活单一步骤的策略缺陷。免疫的全面激活需要正协同刺激信号的刺激和负免疫调控信号的抑制。新兴的纳米技术和本文所述的新方法允许刺激正免疫应答而不逆转免疫抑制性微环境。在黑素瘤小鼠模型中，瘤内注射免疫激活剂例如TLR9激动剂CpG可提高杀死CD8(+)的功效。先天性免疫的激活是产生有效适应性免疫应答的关键 发展强烈的免疫应答所涉及的关键步骤包括通过使用特异性的TLR来激活先天免疫细胞例如 pDC。Degl1-Esposti MA, Smyth MJ. Close Encounters of Different Kinds:Dendritic Cells and NK Cells Take Centre Stage (不同种类的紧密相遇树突细胞和 NK 细胞成为关注焦点)，Nat Rev Immunol 5:112-24，2005 ；Kadowaki N, Liu YJ.Natural Type I In terferon-Producing Cell as a Link Be tween Innate and AdaptiveImmunity (作为先天性免疫和适应性免疫之间连接的产生天然I型干扰素的细胞)，Hum Tmmunol 63:1126-32, 2002 ；Krutzik SR TLR Activation Triggers the RapidDifferentiation of Monocytes into Macrophages and Dendritic Cells (TLRi舌化弓I发单核细胞向巨噬细胞和树突细胞的快速分化)，Nat Med 11:653-60, 2005。这进而导致NK细胞和骨髓树突细胞(mDC)的激活、靶细胞裂解后抗原的释放和最后激活特异性T细胞(适应性免疫)。先天性免疫的激活诱导产生促炎细胞因子，促炎细胞因子可直接激活对引发适应性免疫应答重要的细胞。例如，以IFN- α和IFN- β为代表的I型IFN和肿瘤坏死因子(TNF- β )，是mDC成熟的有效诱导物，其诱导主要组织相容性复合物(MHC)和协同刺激分子的上调以及IL-12的产生，这两者对幼稚T细胞的引发都是重要的。Banchereau J, Steinman RM. DendriticCells and The Control of Immunity (树突细胞和免疫的控制)，Nature 392:245-52,1998 ；Montoya M^, Type I Interferons Produced By Dendritic Cells Promote TheirPhenotypic and Functional Activation (由树突细胞产生的I型干扰素提高了其表型和功能的激活)，Blood 99:3263-71, 2002。另外，由pDC、细胞因子和TLR激动剂激活NK细胞可导致增加肿瘤的裂解，并进而可提供抗原至mDC以提呈至T细胞。先天性免疫的激活不但对抗原-特异性的T细胞的产生重要，而且对诱导炎症也重要，所述炎症导致抗原-特异性的T细胞向肿瘤位点的迁移增加。代表先天性和适应性免疫之间的关键连接物
作为I型IFN的主要产生者，pDC代表先天性和适应性免疫之间的最重要的连接物之一。Apostolou I 等，Origin of Regulatory T Cells With Known Specificity ForAntigen (具已知抗原特异性的调控T细胞的起源)，Nat Immunol 3:756-63, 2002 ；Bjorck P. , The Multifaceted Murine Plasmacytoid Dendritic Cell (多层面的鼠衆细胞样树突细胞)，Hum Immunol 63:1094-102，2002 ；Gilliet M 等，Developmentof Murine Plasmacytoid Dendritic Cell Precursors is Differentially Regulatedby FLT3~Ligand and Granulocyte/Macrophage Colony-Stimulating Factor (鼠衆细胞样树突细胞前体的发育受FLT3-配体和粒细胞/巨噬细胞集落剌激因子的差异化调控)，J Exp Med 195:953-8，2002 ；Kadowaki N 等，Subsets Of Human Dendritic CellPrecursors Express Different Toll-Like Receptors And Respond To DifferentMicrobial Antigens (人树突细胞前体的亚组表达不同的Toll-样受体并对不同的微生物抗原进行应答)，J Exp Med 194:863-9，2001 ；Liu YJ.，IPC: Professional Type IIn terferon-Producing Cells and Plasmacytoid Dendri tic Cell Precursors (IPC 专门产生I型干扰素的细胞和浆细胞样树突细胞前体)，Annu Rev Immunol 23:275-306，2005ο在触发TLR7或TLR9时，pDC快速产生大量I型IFN，激活多种免疫细胞，例如B细胞、NK细胞和巨噬细胞，并分化为APC以诱导抗原-特异性的T-细胞应答。Nestle FO等，Plasmacytoid Predendritic Cells Initiate Psoriasis Through Interferon-AIpha Production (衆细胞样前树突细胞通过产生干扰素_ α来引发银屑病)，J Exp Med202:135-43，2005。mDC和NK细胞二者的激活亦可部分由I型IFN来诱导。IFN-a Re -/-mDC在充分应答病毒感染的能力上是有缺陷的，这表明产生IFN的pDC可对mDC的激活和随后适应性免疫的发展至关重要。Honda I等，Spatiotemporal Regulation of Myd88~IRF~7Signaling For Robust Type-1 Interferon Induction (Myd88-1RF_7 信号转导对强烈的I型干扰素诱导的时空调节)，Nature 434:1035-40，2005。很多证据表明，pDC可与mDC相互作用来诱导抗病毒免疫发展过程中增强的适应性免疫应答。Dalod I等，Dendritic Cell Responses To Early Murine CytomegalovirusInfection: Subset Functional Specialization and Differential RegulationBy Interferon Alpha/Beta (树突细胞对早期鼠巨细胞病毒感染的应答干扰素α/β的亚组功能特化和差异调控)，J Exp Med 197:885-98，2003 ；Fonteneau JF等，Human Iwmunodeficiency Virus Type I Ac tiva tes Plasmacytoid Dendri tic Cellsand Concomitantly Induces the Bystander Maturation Of Myeloid DendriticCells (人免疫缺陷I型病毒激活浆细胞样树突细胞并伴随性诱发骨髓树突细胞的旁邻成熟)，J Virol 78:5223-32，2004 ；Teleshova ^{等，Cpg-C IwmunostimulatoryOligodeoxyribonυαIeotide Activation of Plasmacytoid Dendritic Cells InRhesus Macaques to Augment The Acti vat ion of IFN-Gamma -Secre ti ng SimianImmunodefi ci ency Virus-Specific T Cells (恒河猴中衆细胞样树突细胞的Cpg-C免疫剌激性寡脱氧核苷酸激活对IFN- Y -分泌型猿猴免疫缺陷病毒-特异的T细胞的激活的增强)，J Immunol 173:1647-57，2004。已表明由双链RNA或病毒感染对mDC的激活依赖于与 IFN-α 的接触。Honda I 等，Selective Contribution of IFN-Alpha/BetaSignaling To The Maturation of Dendritic Cells Induced By Double-Stranded RNAor Viral Infection (IFN-a / β信号转导对由双链RNA或病毒感染诱导的树突细胞的成熟的选择性贡献)，Proc Natl Acad Sci USA 100:10872-7，2003 ；Radvanyi LG 等，Low Levels of Interferon-Alpha Induce CD86 (Β7· 2) Expression and AcceleratesDendritic Cell Maturation From Human Peripheral Blood Mononuclear Cells (低水平干扰素-α诱导CD86 (B7. 2)的表达并加速来自人外周血单核细胞的树突细胞的成熟)，Scand J Immunol 50:499—509， 1999 ；Tough DF.， Type I In terferon as A Link BetweenInnate and Adaptive Inmunity Through Dendritic Cell Stimulation (I 型干扰素通过剌激树突细胞作为先天性和适应性免疫之间的连接物)，Leuk Lymphoma 45:257-64，2004。另外，发现HIV能够激活pDC，pDC随后可激活共培养时的mDC。Fonteneau JF等，Human Iwmunodefi ci ency Virus Type I Activates Plasmacytoi d Dendri ti c Cells andConcomitantly Induces the Bystander Maturation Of Myeloid Dendritic Cells (人免疫缺陷I型病毒激活浆细胞样树突细胞并伴随性诱发骨髓树突细胞的旁观成熟)，J Virol78:5223-32，2004。另外，近来已证明在产生抗-HSV CTL的过程中，pDC可与淋巴结mDC相互作用。Tough DF.，Type I In terferon as A Link Be tween Innate and AdaptiveImmunity Through Dendritic Cell Stimulation (I型干扰素通过刺激树突细胞作为先天性和适应性免疫之间的连接物)，Leuk Lymphoma 45:257-64, 2004。这些观测结果表明PDC是对病毒感染和癌症的适应性免疫应答的“跳跃式启动剂(jump-starter) ”。
作为免疫刺激剂的TLR9和CpG
TLR家族由识别微生物DNA和RNA结构的13种不同受体组成。已发现在pDC、mDC、B细胞和巨噬细胞的激活中，TLR激动剂发挥必不可少的作用。因其在直接应答CpG刺激的pDC和B细胞中的选择性表达，TLR9是最特异的人TLR。到目前为止，已鉴定出三类CpG TLR激动剂。硫代磷酸B-类CpG例如CpG7909，刺激B细胞和NK细胞但仅自pDC诱导中等量的IFN- α。相比之下，A-类CpG例如0DN2336和0DN2216，自pDC诱导极高量的I型IFN并高度刺激NK，但几乎没有B细胞刺激能力。在小鼠和人中A-类CpG配体0DN2216激活pDC-口 NK 细胞。Vollmer J. , Progress in Drug Development of Tmmunns timula tory CpGOligodeoxynucleo ti de Ligands For TLR9 (TLR9的免疫刺激性CpG寡脱氧核苷酸配体的药物开发进展)，Expert Opin Biol Ther 5:673-82，2005 ；Colonna, Μ. , TLR Pathwaysand IFN-Regulatory Factors: To Each Its Own (TLR途径和 IFN-调控因子各自针对其自身)，Eur J Immunol 37:306-9, 2007。这些细胞随后激活mDC，诱导肿瘤抗原-特异性的⑶8应答。参见图1。重要的是，我们已证明瘤内注射CpG-活化的pDC导致远端肿瘤的免疫排斥。Liu C Plasmacy to id Dendri tic Cells Induce NK Cell-Dependent, TumorAntigen-Specific T Cell Cross-Priming and Tumor Regression in Mice (小鼠中衆细胞样树突细胞诱导NK细胞依赖性的肿瘤抗原特异性的T细胞的交叉引发和肿瘤消退)，JClin Invest 118:1165-75， 2008。靶向协同刺激途径
尽管有大量浸润肿瘤的CD8 T细胞，但很多黑素瘤仍是免疫疗法难以治疗的。免疫治疗失败的主要机制之一是肿瘤内的免疫抑制微环境。Lizee G等，Improving AntitumorTmmiine Responses by Circumventing Immunoregulatory Cells and Mechanisms (通过避开免疫调节细胞及机理来提高抗肿瘤免疫应答)，Clin Cancer Res 12:4794-803,2006 ;Liizee G 等，Immunosuppression in Melanoma Tmmunntherapy: PotentialOpportunities for Intervention (黑素瘤免疫治疗中的免疫抑制干预的潜在机会)，Clin Cancer Res 12:2359s_65s， 2006。我们已经表明(i)⑶8 CTL是导致肿瘤消退的主要因素，消耗⑶8 T细胞显著降低CpG的治疗效果；和(ii) CD8 T细胞是多种免疫调节剂的效应细胞群，所述免疫调节剂包括抗-CTLA-4抗体和抗-0X40抗体。Liu C，Lou Y，Lizee G等，Plasmacytoid Dendri tic Cells Induce NK Cell-Dependent，Tumor An ti gen -Sped fi cT Cell Cross -Priming and Tumor Regression in Mice (小鼠中衆细胞样树突细胞诱导NK细胞依赖性的肿瘤抗原特异性的T细胞的交叉引发和肿瘤消退)，J Clin Invest118:1165-75，2008 ；Croft M 等，The Significance of 0X40 And 0X40L to T-CellBiology and Immune Disease (0X40和0X40L对T-细胞生物学和免疫疾病的重要性)，Immunol Rev 229:173-91，2009 ；Redmond WLj Ruby CE，Weinberg ADj The Role Of0X40~Media ted CoStimula ti on in T-Cell Activation and Survival (OX4O 介导的共剌激在T-细胞的激活和生存中的作用)，Crit Rev Immunol 29:187-201，2009。TNF家族配体限定T细胞记忆的小生境(niche)。Trends Immunol 28:333-9， 2007。这些结果形成将TLR-激动剂和靶向免疫协同剌激途径的试剂联合的基础(基本原理)。参见图2。已将阻断负协同剌激信号用于抗肿瘤治疗。使用针对CTLA_4(其为T细胞上抑制最初的T-细胞活化和增殖的分子)的阻断抗体的临床试验，已在激活宿主对黑素瘤的免疫应答方面取得了一些成功。Montoya M 等，Type I Interferons Produced By DendriticCells Promote Their Phenotypic and Functional Activation (由树突细胞产生的 I 型干扰素提高了其表型和功能的激活)，Blood 99:3263-71, 2002 ;Apostolou I等，
of Regulatory T Cells With Known Specific!ty For Antigen (具已知抗原特异性的调控性 T 细胞的起源)，Nat Immunol 3:756-63，2002 ；Bjorck P.，The Mul ti facetedMurine Plasmacytoid Dendritic Cell (多层面的鼠衆细胞样树突细胞)，Hum Immunol63:1094-102，2002。但是，阻断CTLA-4对多种T-细胞应答的程度具有深远的影响，而自身免疫是主要的副作用。在T-细胞(尤其是肿瘤位点的浸润肿瘤的淋巴细胞)的激活过程中和激活之后运行的抑制其它负协同剌激信号进一步定向的方法，是为治疗目的而操纵这些负信号的另一种方法。在T细胞上表达的B7家族的分子及其受体是阻碍对肿瘤进行有效免疫应答的“关闭”机制之一。Martin-Orozco N，Dong C·，New Battlefields forCostimulation (协同剌激的新场所)，J Exp Med 203:817-20，2006 ；Martin-0rozco N，Dong C.1nhibitory Costimulation and An t1-Tumor Immunity (抑制性协同剌激和抗肿瘤免疫)，Semin Cancer Biol 17:288-98，2007。近来阐述了几种新的B7分子及其作为T细胞的负调控物的功能，所述B7分子包括 B7S1、B7S3 和 B7H3。Prasad，m 等，B7S1，A Novel B7 Family Member ThatNegatively Regulates T Cell Activation (负调控 T 细胞活化的 B7 家族新成员 B7S1)，Immunity 18:863—73，2003 ；Sica GL 等，B7-H4，a Molecule Of The B7Family，Negatively Regulates T Cell Inmunity (负调控 T 细胞免疫的 B7 家族的分子 B7-H4)，Immunity 18:849-61，2003 ;Zang，\ 等，B7x:A Widely Expressed B7 FamilyMember That Inhibits T Cell Activation, (B7x :抑制 T 细胞活化的广泛表达的 B7 家族成员)，Proc Natl Acad Sci USA 100:10388-92，2003。这些新分子在淋巴和非淋巴组织尤其是在APC中广泛表达。亦发现这些分子中的一些在肿瘤中被上调，例如SZSi存在于源于卵巢、乳房、肾脏和肺组织的肿瘤中。Prasad，等，B7S1，A Novel B7 FamilyMember That Negatively Regulates T Cell Activation (负调控 T 细胞活化的 B7 家族新成员 B7S1)，Immunity 18:863-73，2003 ；Krambeck KE等，B7-H4 Expression in RenalCell Carcinoma And Tumor Vasculature: Associations with Cancer Progression andSurvival (肾细胞癌和肿瘤脉管系统中B7-H4的表达与癌症进展和存活的相关性)，Proc Natl Acad Sci USA 103:10391-6，2006 ；Tringler 义等，B7-H4 Overexpressionin Ovarian Tumors (卵巢肿瘤中 B7-H4 的过表达)，Gynecol Oncol 100:44-52，2006 ；Tringler B 等，B7—H4 is Highly Expressed in Ductal And Lobular Breast Cancer(B7-H4在导管和小叶乳腺癌中高表达)，Clin Cancer Res 11:1842-8, 2005。阻断这些B7分子有效提高了 T-细胞的增殖和体外IL-2的产生，增加了体内自体反应性T细胞。Prasad, W 等，B7S1，A Novel B7 Family Member That Nega ti vely Regula tes T Cell
Activation (负调控 T 细胞活化的 B7 家族新成员 B7S1)，Immunity 18:863-73，2003。在转移性黑素瘤的小鼠模型中在T-细胞疫苗接种期间阻断B7S1，似乎基本上保护小鼠免于肿瘤发展，且完全保护存活的小鼠免于第二次肿瘤攻击(未发表数据)。与TLR激动剂协作的靶向B7分子可在治疗人黑素瘤中有巨大的治疗价值。因此，靶向激活协同刺激分子例如0X40、⑶40和4-1BB，是增强T-细胞激活以提高T-细胞-介导的抗肿瘤应答的另一选择。先前发表的关于通迎的研究显示了其在增强所述T-细胞的诸如增殖、细胞因子的产生和存活等效应功能的重要性，并且已发现通过0X40来刺激是记忆T-细胞的发育中所必不可少的。Croft, M. , The Role of TNF SuperfamiIyMembers in T-Cell Function and Diseases (TNF超家族成员在T_细胞功能和疾病中的作用)，Nat Rev Immunol 9:271-85, 2009。具体到肿瘤微环境，已发现全身性给予激动剂抗-0X40抗体降低了调控T细胞的数量，其功能为抑制效应T细胞的活性并增加肿瘤内CD8+ T细胞的数量。Redmond WL, Ruby, CE和Weinberg, AD, The Role of 0X40~MediatedCo-stimulation in T-Cell Activation and Survival (在 T-细胞的激活和生存中 0X40介导的共刺激的作用)，Crit Rev Immunol 29:187-201, 2009。在其它肿瘤系统例如肉瘤、结肠直肠癌和乳腺癌的小鼠模型中使用的针对小鼠0X40的激动剂抗体，显示出显著
Redmond, WL Ligation of the 0X40 Cos timula tory Receptor ReversesSelf-Ag and Tumor-1nduced CD8 T-Cell Anergy In Vivo (连接 0X40 协同刺激受体逆转了体内自身抗原和肿瘤诱导的⑶8 T-细胞无反应性)，Eur J Immunol 39:2184-94,2009 ；Song k等,0X40 and Bcl-xL Promote The Persistence Of CD8 T Cells To RecallTumor-Associated Antigen (0X40和Bcl_xL促进⑶8 T细胞调用肿瘤相关抗原的持久性)，J Immunol 175:3534-41， 2005。先前已发现⑶40在B细胞激活、增殖和抗原提呈以及在树突细胞激活和抗原提呈中起重要作用。Croft, M. , The Role of TNF Super family Members in T-Cell Functionand Diseases (TNF超家族成员在T-细胞功能和疾病中的作用)，Nat Rev Immunol9:271-85, 2009。已发现针对⑶40的激动剂抗体克服了⑶4+ T细胞耐性并增强了 T细胞的细胞毒性。引人关注的是，CD40在大致70%的实体恶性肿瘤中表达，包括乳腺癌、结肠癌、肺癌和前列腺癌以及黑素瘤。Hurwitz AA, Kwon ED, van Elsas A. , Cos timula toryWars: The Tumor Menace (协同刺激战争肿瘤胁迫)，Curr Opin Tmmunol 12:589-96，
2000。已在癌症的多种鼠模型中评估了激动剂抗-CD40抗体，但是具体到黑素瘤，发现所述抗体仅减缓肿瘤的生长。Melief, CJ. , Cancer iimunotherapy by Dendritic Cells (树突细胞的癌症免疫治疗)，Immunity 29:372-83, 2008。正在用靶向多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、黑素瘤和慢性淋巴细胞白血病的激动剂抗体进行I期临床试验。Schattner，EJ. , CD40 Ligand in CLL Pathogenesis and Therapy (在CLL发病机制和治疗中的CD40配体)，Leuk Lymphoma 37:461-72，2000。已表明4-1BB可增强T细胞的细胞因子产生、增殖和细胞毒性活性。其在建立记忆CTL中亦起必不可少的作用。在肉瘤和肥大细胞瘤小鼠模型中，激动剂抗体可根除建立的肿瘤。Lynch, DH. , The Promise of 4_1BB (CD 137) -Media ted Immunomodula ti on andthe Immunotherapy of Cancer, (4-1BB (0)137)-介导的免疫调节和癌症的免疫治疗的前景)，Immunol Rev 222:277-86, 2008。引人关注的是，在小鼠中，激动剂抗-4-1BB抗体可 发挥改善自身免疫状况和限制免疫治疗的自身免疫副作用的作用。同前。虽然已充分研究了基于单独的TLR激动剂或抗体治疗的癌症治疗，但却没有研究联合TLR激动剂和抗体治疗的最佳策略，尽管这有很大潜力。最后，在给予IL-2和IFN-α至黑素瘤患者中所观察到的临床上的中等成功，留下了改进的空间，所述改进可能是通过加入TLR-激动剂。IFN-α是在晚期黑素瘤中第一个显示抗肿瘤活性的外源性细胞因子。1995年，IFN-α的不同重组形式INF-2 β ,成为首个FDA批准的辅助治疗II Β/ΙΙΙ期黑素瘤的免疫疗法。Kirkwood JM等,Akri Generation ofImmunotherapy for Melanoma (黑素瘤的下一代免疫疗法)，J Clin Oncol 26:3445-55,2008。研究显不高剂量的IFN-2 β显著降低了复发风险。Kirkwood ]y[等，Meehan isms andManagement of Toxicities Associated with High-Dose In terferon alfa~2b Therapy
(与高剂量干扰素a-2b治疗有关的毒性的机理和控制)，J Clin Oncol 20:3703-18，2002。第二种显示针对黑素瘤的抗肿瘤活件的外源件细胞因子IL-2,于1998年被FDA批准用于治疗患有晚期转移性黑素瘤的成人。Phan GQ等，Factors Associated with Responseto High-Dose Interleukin-2 in Patients with Metastatic Melanoma (在转移性黑素瘤患者中与对高剂量的白细胞介素-2应答有关的因子)，J Clin Oncol 19:3477-82,
2001。IL-2在免疫调节和T-细胞增殖中发挥重要作用。在晚期转移性黑素瘤患者中，表明高剂量静脉内推注IL-2显示具有抗肿瘤作用。Stoutenburg JP, Schrope B和Kaufman, HL, Adjuvant Therapy for Malignant Melanoma (恶性黑素瘤的辅助治疗)，Expert Rev Anticancer Ther 4:823-35，2004 ；Rosenberg SA 和 White, DE. , Vitiligoin Patients with Melanoma: Normal Tissue Antigens can be Targets for CancerImmunotherapy (黑素瘤患者中的白癜风正常组织抗原可为癌症免疫治疗的靶标)，JImmunother Emphasis Tumor Tmmunol 19:81-4，1996。这些 II 期研究的追溯性长期分析显示客观应答率为16%，持久应答率为4%，这表明建立了记忆T-细胞应答。Kirkwood JM等，Next Generation of Immunotherapy for Melanoma (黑素瘤的下一代免疫疗法)，JClin Oncol 26:3445-55， 2008。用于递送CpG的纳米颗粒
CpG作为有效的和肿瘤-特异性的免疫刺激剂在临床上应用的主要障碍是需要有效的递送系统。通过静脉内注射给予的游离CpG以及其它稳定的硫代磷酸寡核苷酸会随着广泛的组织分布而被迅速清除。Link撒等，Oligodeoxynucleotide CpG 7909 Deliveredas Intravenous Infusion Demonstrates Immunologic Modulation in Patients VithPre viously Trea ted Non -Hodgkin Lymphoma (以静脉输注递送的寡脱氧核苷酸CpG7909在先前治疗过的非霍奇金淋巴瘤患者中显示免疫调节)，J Immunother 29:558-68，2006 ；Wang H 等，Inmunomodulatory Oligonucleotides as Novel Therapy for BreastCancer: Pharmacokine ti cs, In Vitro And In Vi vo Anticancer Acti vi ty, andPotentiation Of Antibody Therapy (作为乳腺癌的新型疗法的免疫调节的寡核苷酸药代动力学、体外和体内抗癌活性和抗体治疗的增强)，Mol Cancer Ther 5:2106-14，2006 ；Yu RZ 等，Comparison of Pharmacokinetics and Tissue Disposition of anAnti sense Phosphorothioate O ligonucleotide Targeting Human Ha-Ras mRNA in Mouseand Monkey (在小鼠和猴中祀向人Ha-Ras mRNA的反义硫代磷酸寡核苷酸的药代动力学和组织分布的比较)，J Pharm Sci 90:182-93，2001。认为这促成以下所观测到的在人志愿者中全身给予游离CpG未能引发可察觉的免疫应答；和诱导可能有害的对免疫系统的非特异全身性激活。Krieg AM 等，Induction of Systemic THl-Like Innate Immunity inNormal Volunteers Following Subcutaneous but not Intravenous Administration OfCPG 7909，A Synthetic B-Class CpG Oligodeoxynucleotide TLR9 Agonist (正常志愿者皮下而非静脉内给予合成的B-类CpG寡脱氧核苷酸TLR9激动剂CPG 7909后的全身性THl-样先天性免疫的诱导)，J Immunother 27:460-71，2004 ；Krieg AM. Therapeuticpotential of Toll-like Receptor 9 Activation (Toll-样受体 9 激活的治疗潜能)，Nat Rev Drug Discov 5:471-84， 2006。纳米技术提供了使CpG靶向APC的可能性，特别是靶向肿瘤中的pDC。全身性给予之后，含有CpG的纳米颗粒通常发挥出比游离CpG更好的免疫治疗活性，这是由于APC对CpG纳米颗粒的天然聚集能力和贮库作用，其中CpG在作用位点的持久性将提供增强的活性。Whitmore WA 等，Systemic Administration of LPD Prepared With CpgOligonucleotides Inhibits the Growth of Established Pulmonary Metastases ByStimulating Innate and Acquired An ti tumor Immune Responses (全身给予用 Cpg 寡核苷酸制备的LPD通过剌激先天性和获得性抗肿瘤免疫应答来抑制建立的肺转移的生长)，Cancer Immunol Immunother 50:503—14， 2001 ；Sakurai F 等，Therapeutic Effect ofIntravenous Deli very of Lipoplexes Containing The In terferon-[Be ta] Gene AndPoly1: Poly C In A Murine Lung Metastasis Model (在鼠肺转移模型中静脉内递送含有干扰素-[β ]基因和聚/ :聚C的Lipoplex的疗效)，Cancer Gene Ther 10:661-8;Higgins R等，Growth Inhibition Of An Orthotopic Glioblastoma In InmunocompetentMice By Cationic Lipid-DNA Complexes (阳离子脂质-DNA复合物对免疫活性小鼠中原位胶质母细胞瘤的生长抑制)，Cancer Immunol Immunother 53:338-44，2004。迄今为止，已测试了皮下给药途径，表明在黑素瘤动物模型中用一些CpG纳米颗粒导致显著增加的免疫剌激和抗肿瘤活性。de Jong S 等，Encapsulation in Liposomal NanoparticlesEnhances The Immunos timula tory, Adjuvant and An t1-Tumor Acti vi ty ofSubcutaneously Administered CpG ODN (在脂质体纳米颗粒中包封增强皮下给予的CpGODN 的免疫刺激、佐剂和抗肿瘤活性)，Cancer Tmmunol Immunother 56:1251-64，2007 ；Standley SM ^, Incorpora ti on of CpG Oligonucleo ti de Ligand Into Pro tein~LoadedParticle Vaccines Promo tes Anti gen -Sped fi c CD8 T-Cell Immunity ( ^ CpG 寡核苷酸配体纳入装载蛋白质的颗粒疫苗中提高抗原-特异性的CD8 T-细胞免疫)，Bioconjug Chem 18:77-83， 2007 ；Li WM, Bally MB, Schutze-Redelmeier MP, EnhancedImmune Response To T-1ndependent Antigen By Using CpG OligodeoxynucleotidesEncapsula ted In Liposomes (通过使用脂质体包封的CpG寡脱氧核苷酸提高对T-非依赖性抗原的免疫应答)，Vaccine20:148-57，2001 ；Bourquin C 等，TargetingCpG Oligonucleo ti des to the Lymph Node by Nanopar ti cles Elicits EfficientAntitumoral Iimunity (由纳米颗粒将CpG寡核苷酸祀向淋巴结引发有效的抗肿瘤免疫)，J Immunol 181:2990-8, 2008。但是，皮下CpG纳米颗粒通常需要将肿瘤相关抗原(TAA)共同引入到CpG纳米颗粒中，以诱导肿瘤-特异性的CTL应答。另一方面，在TAA存在下或紧密接近TAA时，肿瘤内或肿瘤旁给予可允许自肿瘤本身发出TLR9 “危险信号”。在我们的初步研究中，在黑素瘤动物模型中，直接瘤内注射游离CpG已显示有前 景。此外,瘤内注射聚合物-CpG缀合物已显示出比瘤内注射游离CpG更好的抗肿瘤活性。这些鼓舞人心的初步数据引导我们假设递送至肿瘤的聚合物-CpG缀合物可显著提高抗肿瘤免疫应答而不激活全身性免疫，其中所述聚合物-CpG缀合物直接暴露在特异性的肿瘤微环境和免疫细胞群中。最终，杀死黑素瘤患者的是转移性疾病。因此，在理想的情形下，应全身递送CpG以便该TLR9激动剂有机会深入黑素瘤转移灶。挑战是获得局部免疫激活而不诱导全身性免疫应答。纳米技术提供了实现这一目标的极好机会。迄今为止，尚未研究肿瘤-选择性递送CpG纳米颗粒。在所提出的这项工作中，我们意欲配制和评估靶向黑素瘤以诱导肿瘤-特异性的免疫应答的水溶性聚合物_CpG。作为药物载体的L-PG
L-PG的独特性在于其是由通过酰胺键主链连接在一起的天然存在的L-谷氨酸组成。L-谷氨酸的每一重复单元中侧链自由Y-羧基在中性pH下带负电，这使得聚合物是水溶性的。羧基亦提供连接多种组分的官能团(functionality),所述多种组分包括药物分子和显像剂。参见图3。例如，我们实验室开发的L-PG-紫杉醇缀合物，在许多临床前动物肿瘤模型和早期I期试验中显示出显著抗肿瘤活性，其中紫杉醇在其2’-羟基通过酯键与L-PG共价连接0Li C等,Biodistribution of Paclitaxel and Poly (L-glutamic acid)-paclitaxelConjugate in Mice with Ovarian OCa-1 Tumor (紫杉醇和多聚(L_ 谷氨酸)-紫杉醇缀合物在患卵巢Oca-1肿瘤的小鼠中的生物分布)，Cancer Chemother Pharmacol46:416-22, 2000 ；Li C等，Antitumor Activity of Poly (L-glutamic acid) -pacli taxelon Syngeneic and Xenografted Tumors (多聚(L_谷氨酸)-紫杉醇对同源和异种移植肿瘤的抗肿瘤活性)，Clin Cancer Res 5:891-7，1999 ；Li C 等，Complete Regressionof Wel !-Established Tumors Using a Novel Water-soluble poly (L ~gl utamicacid) -paclitaxel Conjugate (使用新型水溶性多聚(L_谷氨酸)-紫杉醇缀合物使完全建立的肿瘤完全消退)，Cancer Res 58:2404-9，1998 ；Boddy AV 等，J Phase I andPharmacokine ti c Study of Pacli taxel Poliglumex (XYOTAX), Investigating Both3-Weekly and 2-Weekly Schedules (聚谷氨酸紫杉醇(XYOTAX)的I期和药代动力学研究研究每周3次和每周2次两种方案)，Clin Cancer Res 11:7834-40, 2005。在体外通过巨噬细胞-样细胞和在体内通过多种肿瘤将L-PG-紫杉醇降解为单谷氨酸紫杉醇和二谷氨酸紫杉醇。Shaffer SA等,// Vitro and In Vivo Metabolism ofPacli taxel Poliglumex:1dentification of Metaboli tes and Active Pro teases (聚谷氨酸紫杉醇的体外和体内代谢代谢产物和活性蛋白酶的鉴定)，Cancer ChemotherPharmacol 59:537-48, 2007。半胱氨酸蛋白酶组织蛋白酶B是肿瘤中L-PG降解的重要介导物，但其它蛋白降解途径亦有贡献。Shaffer SA等,J/ Vitro and In Vivo Metabolismof Pacli taxel Poliglumex:1dentification of Metabolites and Acti ve Pro teases(聚谷氨酸紫杉醇的体外和体内代谢代谢产物和活性蛋白酶的鉴定)，Cancer ChemotherPharmacol 59:537-48，2007 ；Melancon MP 等，J Novel Method for Imaging In VivoDegradation of Poly(L-Glutamic Acid), a Biodegradable Drug Carrier (用于生物可降解的药物载体一多聚(L-谷氨酸)的体内降解的新型成像方法)，Pharm Res 24:1217-24, 2007。这种基于L-PG的抗癌剂是首个已经进行到III期临床研究的合成
M ^lo Li C, Wallace S. , Polymer-Drug Conjugates: Recent Development InClinical Oncology (聚合物-药物缀合物临床肿瘤学的最新进展)，Adv Drug DelivRev 60:886-98, 2008。L-PG是水溶性的、生物可降解的且无毒性的。通用化学可用于合成基于PG的聚合物，且具有完全受控的分子量、降解性和电荷。这些特征使得L-PG成为作为CpG载体以及用于了解聚合物载体和CpG的免疫刺激活性之间的结构-活性关系的特别有前景的候选物。作为黑素瘤治疗靶标的黑皮质素I型受体和酪氨酸酶
黑皮质素I型受体(MClR)在黑素瘤细胞中过量表达。Giblin細等，Design andCharac teriza ti on of Alpha-Melanotropin Peptide Analogs Cyclized Through Rheniumand Technetium Metal Coordination (通过铼和锝金属配位而环化的α-促黑素细胞激素肽类似物的设计和表征)，Proc Natl Acad Sci USA 95:12814-8，1998 ；Miao Y,Benwell K, Quinn TP. , 99mTc~ and lllln-labeled Alpha-Melanocytes timula tingHormone Pep ti des as Imaging Probes for Primary and Pulmonary MetastaticMelanoma Detection (99mTc_和IllIn-标记的α -促黑素细胞激素肽作为用于检测原发性和肺转移性黑素瘤的成像探针)，J Nucl Med 48:73-80, 2007 ；Lopez MN等，Melanocortin I Receptor is Expressed by Uveal Malignant Melanoma and can beConsidered a New Target for Diagnosis and Immunotherapy (由葡萄膜恶性黑素瘤表达黑皮质素I受体并可作为诊断和免疫治疗的新祀标)，Invest Ophthalmol Vis Sci48:1219-27， 2007。小分子量肽[Nle4，D-Phe7] α -促黑素细胞激素(“NDP-MSH”)是MClR的有效激动剂，其与 MClR 以高亲和力(IC5tl= O. 21 ηΜ)结合。Chen J 等，Melanoma-Targeting·Properties of (99m) Technetium-Labeled Cyclic Alpha-MelanocyteStimulatingHormone Pep ti de Analogues ((99m)锝标记的环状α -促黑素细胞激素肽类似物的黑素瘤 _祀向特性)，Cancer Res 60:5649-58，2000 ； Sawyer Ι 等，4_Nor I euc ine，7 ~D~Ph enylalan ine~Alpha -Melan ocyte~S timula ti ng Hormone: A Highly PotentA Ipha -Melano tropin With Ultralong Biological Acti vi ty (4_ 正亮氨酸、7_D_ 苯丙氨酸-α -促黑素细胞激素具有超长生物活性的高效α -促黑素细胞激素)，Proc NatlAcad Sci USA 77:5754-8，1980。已提出将NDP-MSH和其它a-MSH类似物作为黑素瘤-预防性药剂，其通过防止黑素细胞向黑素瘤的恶性转化来发挥作用。Abdel-Malek ZA等，The Melanocortin I Receptor and The UV Response of Human MelanocytesA ShiftIn Paradigm (黑皮质素I受体和人黑素细胞的UV应答一示例性的转变)，PhotochemPhotobiol 84:501-8, 2008。最近，我们让NDP-MSH与中空金纳米颗粒(直径约40 nm)缀合，在静脉内注射后用光学和正电子成像术两种成像技术，已显示MClR介导金纳米颗粒主动革巴向 B16 黑素瘤。Lu ff, Xiong C，Zhang G 等，Targeted Photothermal Ablation ofMurine Melanomas wi th MelanocyteSt imula ting Hormone Analog-Conjugated HollowGold Nanospheres (用缀合促黑素细胞激素类似物的中空纳米金球对鼠黑素瘤的靶向光热切除)，Clin Cancer Res 15:876-86, 2009。静脉内注射后，注射剂量的约12. 6%被递送至B16黑素瘤，这显著多于递送至脾脏的剂量(4%)。这些数据表明NDP-MSH是用于靶向递送纳米颗粒至黑素瘤的极好寻靶配体。
将纳米颗粒靶向肿瘤-相关受体虽然有吸引力，但不能完全避免肝和脾中吞噬细胞对纳米颗粒的摄取。在理想情况下，CpG纳米颗粒在肿瘤特异性的酶的作用下仅可在肿瘤位点释放CpG。以这种方式，在器官而不是肿瘤中，CpG-诱导的免疫效应细胞的激活将大幅降低，即使一些注射纳米颗粒分布在这些器官(即肝和脾)中亦如此。在抗体定向的酶前药治疗(“ADEPT”)方案中癌症的化学疗法已经利用了这一方法。Jungheim L, ShepherdT. , Design of Anti tumor Prodrugs: Substrates for Antibody Targeted Enzymes (抗肿瘤前药的设计用于祀向抗体的酶的底物)，Chem Rev 94:1553-66, 1994。但是，由于抗体-酶缀合物可与其它组织非特异性结合，ADEPT方法有其自身的局限性。幸运的是，可能依赖酪氨酸酶这种酶，酪氨酸酶已经存在于黑素瘤细胞中，其与黑素细胞有着独特的关系。当黑素细胞变成恶性时，表达酪氨酸酶的基因变得上调，导致癌细胞中酪氨酸酶的水平显著增力口° Land EJ, Ramsden CA, Riley PA, Quinone Chemistry and Melanogenesis(醌化学和黑素生成)，Methods Enzymol 378:88-109，2004 ；Riley PA. , Melanogenesisand Melanoma (黑素生成和黑素瘤)，Pigment Cell Res 16:548-52，2003。因此，由于酪氨酸酶天然存在于肿瘤中并事实上不存在于其它细胞中，其提供了内置式的药物靶向机制。Alena F，Jimbow K, Ito S·，Melanocytotoxicity and An time lanoma Effectsof Phenolic Amine Compounds in Mice In Vivo (小鼠体内酌■胺化合物的黑素细胞毒性和抗黑素瘤作用)，Cancer Res 50:3743-7，1990 ；Jordan 狐等，Melanocyte-DirectedEnzyme Prodrug Therapy (MDEPT):Development of Second Generation Prodrugs ForTargeted Treatment of Malignant Melanoma (黑素细胞定向的酶前药治疗(MDEPT)用于靶向治疗恶性黑素瘤的第二代前药的开发)，Bioorg Med Chem 9:1549-58，2001 ；Jordan ,Melanocyte-directed Enzyme Prodrug Therapy (MDEPT): Development ofa Targeted Treatment for Malignant Melanoma (黑素细胞定向的酶前药治疗(MDEPT)开发针对恶性黑素瘤的靶向治疗)，Bioorg Med Chem 7:1775-80, 1999 ；Knaggs S等，New Prodrugs Derived from 6-amino dopamine and 4-aminophenol as Candidatesfor Melanocyte-Directed Enzyme Prodrug Therapy (MDEPT)(衍生自 6_ 氨基多巴胺和4-氨基苯酚的新型前药作为黑素细胞定向的酶前药治疗(MDEPT)的候选物)，OrgBiomol Chem 3:4002-10，2005 ；Morrison ME, Yagi MJj Cohen G.，In Vitro Studies of2，4-Dihydroxyphenylalanine, A Prodrug Targeted Against Malignant Melanoma Cells(靶向恶性黑素瘤细胞的前药2，4-二羟苯丙氨酸的体外研究)，Proc Natl Acad Sci USA82:2960-4, 1985。亦测试了用于治疗黑素瘤的很多酪氨酸酶-依赖性的前药。例如，经由环化-药物释放机制，利用酪氨酸酶以介导自氨基甲酸酯和尿素前药释放细胞毒素剂。Jordan 碰等，Melanocyte-Directed Enzyme Prodrug Therapy(MDEPT): Development of Second Generation Prodrugs For Targe ted Treatmentof Malignan t Melanoma (黑素细胞定向的酶前药治疗(MDEPT):用于靶向治疗恶性黑素瘤的第二代前药的发展)，Bioorg Med Chem 9:1549-58，2001 ;Jordan AM 等，Melanocyte-directed Enzyme Prodrug Therapy (MDEPT): Development of a Targe tedTreatment for Malignant Melanoma (黑素细胞定向的酶前药治疗(MDEPT):恶性黑素瘤 的靶向治疗的开发)，Bioorg Med Chem 7:1775-80, 1999。但是，尚未使用所述机制来递送免疫刺激剂。初步结果
瘤内注射CpG比全身性注射更好
如图4所示，我们发现瘤内注射CpG显著降低了 B16F10肿瘤的生长，而这种作用在腹膜内注射CpG中没有观察到。我们亦发现CpG与癌症疫苗联合的途径是关键性的。虽然静脉内注射CpG能够诱导肿瘤抗原-特异性的T-细胞应答的激活和扩增，但大多数激活后的T细胞无法迁移至肿瘤。相比之下，瘤内注射CpG导致抗原-特异性T细胞的广泛的肿瘤浸润。这些结果导致我们推断CpG在局部起作用，并且必须集中在肿瘤位点。增强CpG的免疫刺激效力和抗肿瘤功效
使用皮下小鼠B16黑素瘤模型，我们证明与用游离CpG作为针对已建立的肿瘤的独立药剂相比，瘤内注射L-PG-CpG缀合物触发显著更强的抗肿瘤活性，导致抑制肿瘤生长(图5A)。与游离CpG相比，L-PG-CpG显著增强了对肿瘤-非特异性的⑶8 T-细胞群的激活。有意义的是，尽管游离CpG诱导全身性免疫效应NK细胞的非特异性激活，但PG-CpG却不能(图5C)。这些结果表明L-PG-CpG增强了 CpG的免疫刺激效力和抗肿瘤功效而不导致全身性免疫应答。尚未完全了解增强CpG的免疫效力和介导L-PG-CpG的强烈抗肿瘤作用的机制，但是若干因素可促成这种活性，包括(i)贮库作用，PG-CpG藉此在延长的时间内驻留在肿瘤中，CpG从其注射位点缓慢释放；(ii)增强CpG至肿瘤内的pDC和APC的递送；(iii)L-PG-CpG和用于抗原呈递的肿瘤内肿瘤抗原的共定位。自发的肿瘤细胞死亡/重塑可提供“危险”信号，这可形成L-PG和肿瘤相关抗原之间的物理联系，导致抗癌免疫力增强。我们已实施了若干初步研究来评估这些可能方案的潜在贡献。递送系统增加了瘤内注射后的肿瘤内驻留
为评价L-PG的体内分布和肿瘤内分布，我们使用了近红外荧光(NIRF)成像，其中用L-PG-NIR (图3)作为L-PG-CpG的替代物，用111In-标记的L-PG-CpG进行放射自显影(图
6)。瘤内注射后，L-PG-NIR大部分驻留在注射位点。注射剂量的显著部分亦转运至引流淋巴结(图6A-C)。在B16黑素瘤中，与CpG相比，更多的111In-标记的L-PG-CpG驻留在肿瘤内，而且L-PG-CpG在整个肿瘤内的分布更加广泛，而CpG主要局限在肿瘤周围区域(图6D)。肿瘤内CpG治疗和靶向协同刺激途径的试剂联合增强抗肿瘤作用
我们对瘤内注射CpG和靶向协同刺激途径的全身性抗体治疗联合是否导致强烈抗肿瘤活性进行了研究。例如，我们的初步研究表明，0X40抗体和CpG的联合产生比单独的CpG显著更强的CTL应答和抗肿瘤作用(图7)。基于这些结果，我们进一步用如下所述的最好的纳米-CpG探索靶向正和负协同刺激分子二者的新方法，以提高T-细胞对黑素瘤的免疫力。静脉内给药后肝和脾对L-PG-CpG的摄取显著少于CpG
除鉴定在瘤内注射后具有显著免疫刺激活性的基于PG的纳米-CpG外，还开发了用于 肿瘤-特异性免疫应答而无全身性激活的基于PG的纳米-CpG。为测试可行性，我们进行了三个关键实验来解决以下问题1) L-PG是否可显著降低肝和脾中CpG的摄取；2)分布于肿瘤中的L-PG聚合物是否被肿瘤中的巨噬细胞摄取；和3)靶向黑素瘤细胞的L-PG-CpG是否被黑素瘤细胞处理以引发强烈免疫应答。在以下三个研究中总结了这些问题的答案。为比较静脉内注射后CpG与PG-CpG的生物分布，我们用111In (半衰期为3天的Y发射体)标记了这两种化合物。如图8所示，肝和脾对PG-CpG的摄取显著少于CpG。这一结果表明L-PG是全身给药后靶向递送CpG的有前景的纳米载体。静脉内注射后肿瘤相关巨噬细胞摄取L-PG聚合物
使用经Gd和NIR染料二者标记的L-PG-Gd-NIR (图3)，用磁共振和NIRF成像来非侵袭性监测组织和肿瘤内分布，我们发现通过静脉内途径给药后，PG-Gd-NIR被肿瘤相关巨噬细胞摄取(图9)。PG-Gd-NIR和CD-68+共同定位于裸大鼠的C6神经胶质瘤中(图9A)。此夕卜，消耗巨噬细胞导致肿瘤中PG-Gd-NIR的摄取显著减少(图9B-D)。定量研究显示用氯膦酸盐脂质体消耗巨噬细胞后，肿瘤区域的荧光强度降低超过100倍。该数据表明PG-Gd-NIR被递送至肿瘤中的巨噬细胞/APC。被B16黑素瘤细胞摄取和处理
我们合成MSH-L-PG-CpG来测试黑素瘤细胞经由受体介导的内吞作用摄取的L-PG-CpG是否可被处理并保持其免疫刺激活性。如图10所示，B16细胞摄取的MSH-L-PG-CpG能够释放活性CpG至培养基中来诱导小鼠脾细胞产生IFN-Y。用过量MSH肽共同处理的B16细胞阻断了 MSH-L-PG-CpG的摄取，消除了随后由脾细胞导致的IFN- Y产生，这暗示黑素瘤细胞能够处理MSH-L-PG-CpG并呈递活性CpG物质至肿瘤中的pDC。因此，这些结果证实了将CpG靶向黑素瘤细胞可作为用于诱导肿瘤-特异性免疫的新策略。引人关注的是，不含MSH的PG-CpG可被B16F10黑素瘤细胞有效摄取，这不依赖于MClR-介导的摄取。很明显，需要更多的研究来阐明黑素瘤细胞中L-PG-CpG和MSH-L-PG-CpG的细胞运输和处理。初步数据推论
归纳起来，我们的初步结果表明L-PG是用于治疗黑素瘤的免疫刺激TLR激动剂的有前景的新型CpG载体。通过延长其肿瘤驻留，L-PG可显著增强CpG的活性，并因此充当允许持续释放CpG的药物储库。包括巨噬细胞和DC在内的APC，大量积聚基于L-PG的聚合造影剂。亦有可能在黑素瘤-特异性的酪氨酸酶的作用下，将L-PG-CpG靶向黑素瘤细胞并产生“智能的(smart) ”基于L-PG的CpG递送系统来仅释放CpG,这可让肿瘤-特异性的CTL应答进一步增强。因为免疫系统是复杂的，有必要探索纳米-CpG与调节协同刺激途径及询问(interrogate)肿瘤微环境的其它分子的组合。通过这些组合方法，我们了解了肿瘤中普遍的局部免疫作用，并且可开发有效的抗肿瘤免疫疗法，可将所述抗肿瘤免疫疗法转移到临床上，以对黑素瘤患者的护理产生显著的积极作用。预示性实施例1
测定瘤内注射后PG-CpG对于其抗癌作用的最佳理化特性· 瘤内注射后,具有最佳理化性质的基于PG的CpG纳米构建物局部激活pDC，而不诱导全身性免疫应答，这导致有效的免疫治疗效果。基本原理和总体策略
在以上初步研究中，我们已表明瘤内注射L-PG-CpG比瘤内注射游离CpG的抗肿瘤活性显著增强。但是，未完全了解增强CpG的免疫效力和介导PG-CpG的强抗肿瘤作用的机制。若干因素可促成这种活性，包括(i)贮库作用，L-PG-CpG藉此在延长的时间内驻留在肿瘤内，且CpG从其注射位点缓慢释放；(ii)在肿瘤内增强将CpG递送至APC和DC ; (iii)在肿瘤内共同递送L-PG-CpG和TAA至DC。自发的肿瘤细胞死亡/重塑可提供TAA，其然后在肿瘤中形成L-PG聚合物和抗原之间的物理联系，导致抗癌免疫力增强。为了完全了解这些可促成L-PG-CpG的抗肿瘤活性增强的因素所起的可能作用，系统的方法是必要的。另外，期望获自这些类型的研究的数据，导致鉴别在瘤内注射基于PG的CpG纳米构建物后PG聚合物对激活有效的免疫效应细胞起关键作用的理化特性，这将有助于设计新一代改进的CpG递送系统。与将CpG掺合在纳米颗粒内的其它研究相比，让CpG与水溶性L-PG缀合，这可有利于确保以其完整形式，或作为因聚合物降解而致的活性物质，PG-CpG可容易地接近结合内体中的TLR9。具体而言，可通过系统性地检测聚合物的大小(分子量;MW)、电荷和降解性如何影响其在B16黑素瘤中的驻留和其在肿瘤pDC中的摄取，来研究瘤内注射PG-CpG增强抗肿瘤活性的作用机制。PG-CpG的肿瘤驻留和pDC对PG-CpG的摄取可与先天性和适应性免疫应答的增强有关联。下表I总结了为所提出的研究而合成和测试的基于PG的聚合物。包括单谷氨酸-CpG缀合物作为对照。期望瘤内注射后L-PG-CpG的肿瘤驻留受其MW支配，因为分子扩散系数的大小约为其MW的立方根的倒数。较小尺寸的分子可从注射位点迅速清除，而较大尺寸的大分子则大多数可以以极不均匀的肿瘤内分布限定在注射位点。另外，多聚阴离子PG和肿瘤中带正电荷的蛋白质之间的结合亲和力亦应该作为多聚阴离子链长度增加的函数而增加。自PG-CpG降解和释放CpG可通过两种方法开始聚合物主链降解；和在CpG与PG聚合物之间引入水解不稳定接头。因此，CpG可与不可降解的多聚(D-谷氨酸)(D-PG)及含L-酪氨酸和L-丙氨酸的L-PG共聚物[多聚(L-Glu-Tyr)和多聚(L-Glu-Ala)]缀合，所述 L-PG 共聚物比 L-PG 的降解更迅速。Chiu Vl-C 等，Lysosomal Degradability ofPoly (alpha-amino acids)(多聚(ct -氨基酸)的溶酶体降解性)，J Biomed Mat Res34:381-92, 1997。CpG亦可通过酸不稳定的接头与L-PG和D-PG缀合，这可在酸性的内体环境下迅速释放CpG。最后，让CpG与可降解但电荷中性的多聚(羟丙基L-谷氨酸)(L-PHPG)缀合，允许检测多聚阴离子L-PG-CpG和来自肿瘤本身的带正电荷的蛋白质之间的物理相互作用的可能作用。同前。因此，可检测CpG递送对体内先天性和适应性免疫应答二者的影响。但是，考虑到因免疫系统的复杂性，体外研究预测疫苗功效的能力有限，我们的焦点集中在用同基因的B16黑素瘤模型进行体内评估。在很多临床前的黑素瘤研究中一直使用C57BL/6小鼠的B16黑素瘤。弱免疫原性和B16细胞表达非常少量的MHC I类分子这一事实使得B16模型为基于T-细胞的免疫治疗的挑战性模型。Mansour 等，Therapyof Established B16-F10 Melanoma Tumors by a Single Vaccina tion of CTL/T HelperPeptides in VacciMax(R)(单独接种 VacciMax (R)中的 CTL/R 辅助肽对建立的 B16-F10黑素瘤肿瘤的治疗)，2007.第20页。采用了各种方法用于产生CTL对B16的应答，包括在纳米颗粒中共同递送分离的TAA和CpG。但是，我们提出的研究显著不同于这些其它研究，因为在其它研究中在注射之前没有纯化的TAA与PG-CpG的混合。应该使用来自肿瘤本身的更加接近实际的及临床相关的黑素瘤原位抗原
表1.待合成和测试的基于PG的聚合物
rSttSfWFSftScicli ;
I ff% l-C|iC丨 ΦΠ·丨{1I
Ii MW ^ 2κ ; V r 'ν^ρ1:
jFMw = κ...........1;
j L-PG-CpC fMW = 5 K—I
f -1iiiK......jj
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图11总结了靶化合物的结构。在於羟基苯并三唑存在下，可用1，3-二异丙基碳二亚胺-介导的在Boc-Glu(OH)-OtBu的侧链羧基和3’-NH2-CpG氨基之间的偶联反应来合成单体L-谷氨酸CpG。可用三氟乙酸除去所得产物的Boc和叔丁基保护基团。通常通过用溴化氢去除苄基保护基自多聚(L-谷氨酸Y-苄酯)(L-PBLG)获得L-PG。为制备同聚物和随机共聚物，三乙胺-引发的L-谷氨酸Y-苄酯(NCA-L-Glu)中的羧基酸酐(NCA)和相应氨基酸(即NCA-D-Glu、NCA-L-Tyr或NCA-L-Ana)的聚合是最常使用的方法。Li C·，Poly (L-glutamic acid)-■Anticancer Drug Conjugates(多聚(L-谷氨酸)一抗癌药物缀合物)，Adv Drug Deliv Rev 54:695-713, 2002。这种方法通常产生广泛丽分布(多分散性>2.0)的多聚氨基酸。过去十年报道了一些受控的NCA聚合作用，包括使用过渡金属络合物和六甲基二硅氮烷作为引发剂。Deming TJ.， Cobalt and Iron Initiators for the Controlled Polymerizationof Alpha-Amino Aci d-N~Carboxyanhydri des (用于 α -氨基酸-N-羧基酸酐的受控聚合作用的钴和铁引发剂)，Macromolecules 32:4500-2，1999 ；Lu H，Cheng J.，Hexame thyIdi si Iazane-Medi a ted Controlled Polymerization of Alpha-Amino AcidN-Carboxyanhydrides (六甲基二娃氮焼介导的α -氨基酸-N-羧基酸酐的受控的聚合作用)，J Am Chem Soc 129:14114-5, 2007。因为该方法可容易地提供具可预测MW和窄MW分布的多聚氨基酸，所以使用六甲基二硅氮烷作为引发剂的反应尤其有吸引力。因此，将该方法用于合成Glu = Tyr和Glu = Ala摩尔比为5:1的多聚(L-Glu-Tyr)和多聚(L-Glu-Ala)。Chiu等的研究表明L-Glu与L-Tyr和L-Ala的共聚物的降解比L-PG 的同聚物快约 3 倍。Chiu H-C 等，Lysosomal Degradabili ty of Poly (alpha-aminoacids)(多聚(ct -氛基酸)的溶酶体降解性)，J Biomed Mat Res 34:381-92，1997。为促进体外和体内成像研究，按照前面报道的程序让DTPA或适宜的荧光染料与不同MW的L-PG (MW = 2K、20K、50K 或 100Κ)、D-PG (MW = 50Κ)、多聚(L-Glu-Tyr) (MW = 50Κ)和多聚(L-Glu-Ala) (MW = 50Κ)缀合。可在最后阶段用水溶性的偶联剂(1-乙基_3_( 二甲基氨基丙基)碳二亚胺)在2-吗啉乙磺酸缓冲液中让3’ -氨基-CpG (0DC 2216)与这些缀合物缀合。Melancon MP 等，A Novel Method for Imaging In Vivo Degradation ofPoly (L-Glutamic Acid), a Biodegradable Drug Carrier (用于体内成像降解生物可降解的药物载体多聚(L-谷氨酸)的新型方法)，Pharm Res 24:1217-24, 2007 ；Melancon
MP Development of a Macromolecular Dual-Modality MR-Optical Imaging forSentinel Lymph Node Mapping (用于警戒淋巴结作图的大分子双重模态MR-光学成像的进展)，Invest Radiol 42:569-78，2007; Wen \ 等，Synthesis and Characterizationof Poly (L-glutamic acid) Gadolinium Chelate: A New Biodegradable MRI ContrastAgent (多聚(L-谷氨酸)钆螯合物的合成和表征生物可降解的新型MRI造影剂)，Bioconjug Chem 15:1408-15, 2004。可用Gd标记所得缀合物用于MRI，用111In标记所得缀合物用于核成像研究。染料的选择可视研究目的而定。对于体内成像，使用在813nm处发射荧光信号的NIR染料。对于流式细胞术研究，可选择FACS-相容的染料(即AlexaFluor488)。用装有superdex-75 SEC柱的AKTA快速蛋白液相色谱系统来纯化缀合物并用PBS缓冲液洗脱。对于L-PHPG-CpG合成，可通过3_氨基丙醇氨解L-PBLG来获得L-PHPG。用对-硝基氯甲酸酯活化L-PHPG的羟基后，可用胺终止的DTPA或染料分子经由氨基甲酸酯键来处理聚合物。然后可让CpG与聚合物缀合，接着是螯合Gd或111In以得到Gd-、mIn-或染料-标记的 L-PHPG-CpG (图 12)。自含CpG(其经由稳定的酰胺或氨基甲酸酯键与PG连接)的PG-CpG纳米构建物释放CpG，依赖于肿瘤中组织蛋白酶B和/或其它酶对PG主链的降解来释放单体和寡聚谷氨酸CpG。因为肿瘤与肿瘤之间和患者与患者之间酶的活性可不同，我们希望设计一个系统，其释放CpG不依赖酶的活性，而是依赖内吞溶酶体区室的酸性环境。这种方法可降低CpG递送中的变化，并增加CpG的细胞内递送。为达到该目的，我们通过酸敏感的缩酮接头将CpG接枝到L-PG和D-PG上(图11)。与pH为7. 4的胞质大不相同，内体和溶酶体存在于5. 0-6. 5的酸性pH值下。已在设计pH-应答的寡核苷酸和蛋白质疫苗的递送中米用了酸敏感的连接。Knorr V, Ogris M, Wagner E. , An Acid SensitiveKetal—based Polyethylene Glycol-Oligo e thylenimine Copolymer Media tes ImprovedTransfection Efficiency at Reduced Toxicity (酸敏感的基于缩酮的聚乙烯乙二醇-寡乙烯亚胺共聚物以低毒性介导提高的转染率)，Pharm Res 25:2937-45, 2008 ；Murthy N 等，Design and Synthesis of pH~responsive polymeric Carriers thatTarget Uptake and Enhance the Intracellular Deli very of Oligonucleo ti des (革巴向摄取和增强细胞内递送寡核苷酸的pH-应答的聚合物载体的设计和合成)，J ControlRelease 89:365-74，2003 ；Murthy N 等，J Macromolecular Deli very Vehicle forProtein-Based Vaccine: A ci d~Degradable Pro tein~Loaded Mi crogels (用于基于蛋白质的疫苗的大分子递送溶媒装载酸可降解的蛋白质的微凝胶)，Proc Natl Acad SciUSA 100:4995-5000， 2003。我们将在我们的设计中采用相似的缩酮接头来让CpG与L-PG和D-PG 二者缀合。此处包括D-PG以便可排除主链降解对CpG释放的可能作用。从丙酮-二 _(氨乙基)缩酮开始，我们将马来酰亚胺引入到二胺缩酮的一个末端以得到丙酮_(马来酰亚胺基氨乙基)缩酮。然后用碳二亚胺介导的偶联反应让该接头与PG缀合，接着将3’-SH-CpG与马来酰亚胺基接头连接。如前所述，让成像探针与聚合物缀合。表征
从下列几方面来表征所得聚合的缀合物1)共聚物的结构和组成比率；2)与每一聚合物连接的CpG、DTPA-Gd和染料的数量；3)丽和丽分布；和4)降解性。可通过1H-核磁共振来表征共聚物的组成比率。可通过从起始物质的量中减去反应混合物中回收的分子的量，来测定与每一聚合物连接的CpG、DTPA-Gd和染料的数量。需要时，亦可根据聚合物完全水解后的氨基酸分析来测定CpG、DTPA-Gd和染料分子的数量。可通过元素分析来测定Gd含量。可用装有记录折光率、粘度和光散射信号的Viscotek E-Zpm三元检测器的系统(Viscotek, Houston, TX)，通过凝胶渗透色谱法(GPC)来测量每一聚合的缀合物的MW和碼分布。在组织蛋白酶B存在和不存在下按照Wen等的方法用GPC来实施每一聚合的缀合物的酶降解。Wen \^，Synthesis and Charac teri za ti on of Poly (L ~glu tami c acid)Gadolinium Chelate: A New Biodegradable MRI Contrast Agent (新型生物可降解的MRI造影剂多聚(L-谷氨酸)礼螯合物的合成和表征)，Bioconjug Chem 15:1408-15,2004。随时间监测每一聚合的缀合物的峰面积的减少，并表示为“降解百分率”。通过在pH
5、pH 6和pH 7. 4下用高效液相色谱-质谱系统分析随时间变化的CpG释放，来研究PG-缩酮-CpG缀合物的水解降解。为评估新合成的CpG-结合的纳米构建物在体外的细胞摄取和运输及在瘤内注射至B16肿瘤后的体内驻留，可按照我们发表的实验方案自C57BL/6小鼠的骨髓产生巨噬细胞 ο Thapa P, Zhang G, Xia C ^,Nanoparti cle Formula ted A Ipha -Galac tosylcerami deActivates NKT Cells Without Inducing Anergy (a半乳糖神经酰胺制成的纳米颗粒激活NKT细胞而不诱导无反应性)，Vaccine 27:3484-8，2009。为研究聚合物-CpG的内化，可用荧光标记的聚合物脉冲巨噬细胞达I小时，固定，用针对EEA (早期内体标记)、甘露糖-6磷酸受体(晚期内体受体)和LAMPl (溶酶体标记)的单克隆抗体来染色。所有的抗体都来自Abeam (Cambridge, MA)。可通过共焦显微术来研究聚合物的共区域化和不同的内吞溶酶体标记。体内驻留、肿瘤内分布和降解
我们将使用核和MR成像技术来非侵袭性地评估B16黑素瘤中PG-CpG纳米构建物的驻留和分布(共11种制备物)(表I和图11)。仅用mIn标记的游离CpG作对照。用Gd/mIn对所有PG-CpG纳米构建物进行双重标记。在单次注射中通过瘤内注射将每种标记的试剂递送至C57BL/6小鼠皮下已长成的B16黑素瘤(直径6-8 mm) (100 μ Ci, 100 μ I)。在注射后的不同时间用Y-照相机对小鼠成像。可通过将目的区域放置在整个身体、肝/脾区域和肿瘤周围，来量化肿瘤中和身体其它部位的放射性。这允许我们测量在同一小鼠中随时间推移从肿瘤中清除的CpG和PG-CpG的量。因为MRI提供极好的空间分辨率，我们亦将使用MRI来监测不同时间点PG-CpG纳米构建物的肿瘤内分布。在成像期结束(注射后3天)时，杀死小鼠。移出肝、脾、引流淋巴结和肿瘤，计数其放射性。肿瘤驻留可表示为注射剂量的百分比。可对所有切除的肿瘤进行放射自显影研究。可通过测量放射性区域和整个肿瘤区的比率(以百分比表示)来分析肿瘤内分布的均匀性。可根据其肿瘤驻留(%)以及肿瘤内分布的程度(%)来对CpG和基于PG的CpG纳米构建物分等级。为检测聚合物在Β16黑素瘤中的生物降解，对每一切除肿瘤组织的一半进行处理，以便用NaCl晶体检测器监测柱中放射性完整聚合物和聚合物片段的洗脱来进行GPC分析。(12组X 10只小鼠)。评估瘤内注射后通过CpG和基于PG的CpG纳米构建物诱导的先天性免疫和获得 性免疫
体内细胞的摄取
为评价CpG-结合的PG纳米构建物在不同免疫细胞群中的摄取，可将图11中所示的L-Glu-染料单体和每一种PG-CpG-染料缀合物(染料=AlexaFluor 647)经瘤内注射至Β16肿瘤中(η = 10)。使用CpG-染料作为对照。可在1、3和7天之后，通过流式细胞术测量肿瘤、引流淋巴结和脾中⑶lie+ DC和⑶llb+F480+巨噬细胞对CpG的摄取。因为当聚合物分解时，与PG聚合物连接的荧光染料将自连接到同一聚合物链上的CpG解离，其直接报告聚合物或聚合物片段的细胞摄取。为此，我们亦将荧光标记的CpG (例如3’-NH2-CpG-AlexaFluor 647, Alpha DNA, Montreal, Canada)与图 11 所不的 PG 聚合物连接，用于对CpG和PG-CpG缀合物中的CpG的细胞摄取进行FACS研究。以下抗体将用于细胞标记对于DC为CDllc ;对于巨噬细胞，为CDllb和F480。另外，将在单核细胞谱系细胞中表达GFP的转基因小鼠(在鼠c-fms启动子的控制下)用作肿瘤移植受者，这允许我们在活体动物中用非侵袭性成像来研究NIR荧光染料标记的聚合物和单核细胞-巨曬细胞的共区域化。动物得自Jackson实验室(Bar Harbor,Maine)。局部细胞因子产生
用来自 R&D systems (Minneapolis, MN)的标准 ELISA 试剂盒来测量 IFN-α、IL-12和 IFN- Y。在B16黑素瘤中递送至APA激活pDC
用针对DC (⑶IIc+)和巨噬细胞(⑶llb+F480+)的抗体经多色流式细胞仪来研究聚合物至肿瘤APC的递送。通过用⑶69对pDC (BDCA2+)进行IHC染色来监测pDC的激活。肿瘤中黑素瘤-特异的⑶8+ T-细胞应答
作为OVA-特异性的四聚体(Pharmingen, San Jose, CA)来监测肿瘤-特异性的⑶8应答。全身性应答
通过测量包括IFN- α、IFN- Y、TNF- α和IL-12在内的细胞因子的血清水平来研究全身性应答。可用来自R&D systems的ELISA试剂盒或Luminex来测量所有细胞因子。
最终，在以上所有研究中，用不含CpG的L-PG (MW = 50K)作为对照。抗肿瘤活性的确认
研究瘤内注射后所有结合CpG的PG及单谷氨酸CpG (共11种化合物)的抗肿瘤活性。这是因为在体外测定(刺激淋巴细胞)和体内抗肿瘤活性之间没有明确的关联。将盐水和游离CpG作为对照。将在双腿上都荷有皮下B16黑素瘤肿瘤(平均直径4-6 mm)的C57BL/6小鼠随机分配到13个处理组中(10只小鼠/组)。在1、7和10天时每组中的小鼠都将接受盐水、CpG和表I中所列的每种药剂的瘤内注射，剂量为50 μ g当量CpG/注射(100 μ I)。仅处理每只小鼠的2个肿瘤中的I个。从第7天开始测量肿瘤大小，然后每2-3天测量一次直至第21天。将最长长度(β)和与最长长度垂直的长度如用于公式V =1A3 (幻2中，来获得肿瘤体积(mm3)。在21天时，处死所有动物，移走引流淋巴结、脾和经处理及未经处理的肿瘤二者，用于pDC群和细胞死亡(TUNEL)的IHC和FACS分 析。第21天时记录单个肿瘤的重量并用作肿瘤控制的量度。将未经处理的肿瘤用作评估黑素瘤-特异性的CTL应答是否能够表现出对远端位点肿瘤的抗肿瘤活性的工具。数据分析和统计
可使用广义线性模型来分析纳米-CpG的肿瘤内驻留及其在pDC中的摄取。虽然在拟合数据之前不能确定这些模型的最终形式，但我们注意到所提出的设计在检测每一成对比较的20%差异时具有>85%的功效。对于抗肿瘤作用研究，将肿瘤接种后每3天测量的肿瘤大小用作主要的终点。我们开始使用5-6只小鼠/组来进行统计分析和确定方差及统计功效。加入另外的动物(多达总共10只小鼠/组)来获得统计显著性。如果我们保守估计每一组的变异系数约为O. 25，并假设肿瘤大小有两倍的降低，则对每组10只小鼠在t_检验O. 005水平时，我们具有>85%的功效来检测组间差异(假设每一组方差相等)。用Microsoft Windows的SAS软件8. O版(SAS Institute)用单向ANOVA来进行组间比较。将显著性水平设为O. 05。预期结果、缺陷和解决方法
我们期望鉴定对与CpG结合的PG纳米构建物的有效抗肿瘤活性而言重要的PG聚合物的理化特性。具体地，有相对高MW的带负电荷PG可诱导更强的免疫刺激应答，因为这些聚合物可在肿瘤中驻留更久并以持续方式释放CpG。比起其较小尺寸的对应物，较大尺寸的聚合物亦可更易于被APC吞噬，并与黑素瘤中的带正电荷蛋白质的相互作用更强。将Tyr和Ala引入到L-PG中，由于共聚物疏水性的增加，不仅影响聚合物的降解性，而且还影响APC对其的摄取及其与碱性蛋白质的相互作用。不太可能但潜在的缺陷是PG聚合物可直接与其内体受体(TLR9)相互作用，而不需要从聚合物中释放CpG。在那种情况下，我们将在进一步的研究中鉴定具有最强抗癌功效的聚合物_CpG。初始L-PG1-CpG和在体内抗肿瘤功效研究中表现出最好功效的与CpG结合的PG纳米构建物(称为PG2-CpG)，可被改进至目标2以设计和开发靶向黑素瘤受体和黑素瘤-特异性的酶的与CpG结合的PG纳米构建物。预示性实施例1I
开发并确认通过受体-介导的摄取和酪氨酸酶-介导的CpG释放二者主动靶向黑素瘤细胞的PG-CpG纳米构建物
主动靶向黑素瘤细胞并仅在黑素瘤-特异性的酪氨酸酶作用下释放CpG的PG-CpG纳米构建物，进一步增强CpG的免疫刺激和抗肿瘤活性，而不诱导免疫系统的非特异性激活。
基本原理和总体策略
对于治疗致命的转移性黑素瘤，强烈希望CpG到达整个身体的每一个病灶而不触发全身性免疫应答和由此引起的对在肿瘤位点需要的效应T细胞的消耗。Sharma等最近使用靶向Her2/neU-阳性肿瘤细胞的抗体-CpG缀合物的研究和我们自己的关于靶向黑素瘤细胞的L-PG-CpG的初步数据，表明间接地将CpG靶向黑素瘤细胞是用于免疫治疗黑素瘤的可行的策略。我们提出使用两种方法来将CpG靶向黑素瘤细胞。在第一种方法中，我们将通过黑皮质素I型受体(MClR)-介导的摄取，用α -促黑色素细胞激素作为寻靶配体，直接将与CpG结合的PG纳米构建物定向至黑素瘤细胞。将纳米颗粒靶向肿瘤相关受体，虽然有吸引力，但不能完全避免肝和脾对纳米颗粒的摄取。在理想情况下，与CpG结合的纳米颗粒，或更特别地与CpG结合的PG，在肿瘤特异性的酶的作用下可在肿瘤位点单独释放CpG。以这种方式，在非肿瘤的位点，CpG-诱导的免疫效应细胞的激活将大幅降低，即使一些注射纳米颗粒分布在这些次级淋巴器官中亦如此。
因此，在第二种方法中，我们将制备仅在高度黑素瘤特异性的-酶酪氨酸酶的酶激活时才释放CpG的“智能的”纳米构建物。一旦获得了所提出的纳米结构，我们将研究在肿瘤内和静脉内注射后，CpG至B16肿瘤的体内选择性递送的效率。然后我们将再次用肿瘤内和静脉内两种给药途径，来评估靶向的PG-PG纳米构建物对黑素瘤和全身性免疫系统的免疫刺激活性。在没有非特异性激活免疫应答的情况下，全身性抗肿瘤活性的成功论证，可使黑素瘤以及其它转移性实体瘤的免疫治疗领域发生变革。研究设计
靶向MClR的CpG的合成和表征
我们已成功地证明用 a -MSH 类似物 NDP-MSH (Cys-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-1/-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2)作为寻祀配体将中空纳米金球祀向递送至B16黑素瘤中的MC1R，其中通过聚乙二醇(PEG)接头让NDP-MSH与纳米金球表面连接。此处我们将使用类似的策略，通过PEG接头让NDP-MSH与L-PG链连接以增加MClR对NDP-MSH肽的可及性，其如图13所示。简言之，通过用三氟乙酰胺-PEG-胺作为引发剂的L-Glu(0Bzl)-NCA的开环聚合化作用，来制备嵌段共聚物PEG-PBLG (聚合物I)。随后在NaOH水溶液中脱保护并用N-琥珀酰亚胺基-3-马来酰亚胺基丙酸酯活化末端胺，可得聚合物3。然后用6.1. 3. a章节中所述的相同程序将NH2-DTPA或NH2-染料与NH2-CpG与聚合物3缀合，接着引入SH-NDP-MSH，得到所提出的聚合物(图13)。如6.1. 3. a章节中所述来表征所得聚合物5。可使用类似的方法，自以上预示性实施例1中所鉴定的PG2-CpG合成靶向MClR的纳米构建物。细胞摄取和运输
按照我们报道的方法来研究聚合物5和相应的Gd (111In)或染料-标记的NDP-MSH-PEG-PG2-CpG在B16/F10细胞中的细胞摄取。Lu ff, Xiong C，Zhang TargetedPho to thermal Abla tion of Murine Melanomas wi th MelanocyteSt imula ting HormoneAnalog-Conjugated Hollow Gold Nanospheres (缀合促黑素细胞激素类似物的中空纳米金球对鼠黑素瘤的靶向光热切除)，Clin Cancer Res 15:876-86, 2009。简言之，让细胞与每种AleXFluor647-标记的受试化合物在37°C下孵育I小时，接着用4%的低聚甲醛固定。对于抑制研究，在加入每种化合物之前，让细胞与游离NDP-MSH (200 Pg/mL)孵育30分钟。洗涤和固定后，用DAPI对细胞核染色。为评估β_抑制蛋白的激活和募集，可用AleXFluor647-标记的5或6处理细胞15分钟，然后用山羊抗-β -抑制蛋白_2多克隆抗体和驴抗-山羊IgG异硫氰酸四甲基罗丹明缀合物对β -抑制蛋白进行免疫组织化学染色。用Zeiss Axio Observer. Zl荧光显微镜检测细胞的荧光。用不含寻靶配体的AlexFluor647-标记的 L-PG-CpG 或 PG2_CpG 作为对照。酪氨酸酶可激活的结合CpG的纳米构建物的合成和表征
酪氨酸是酪氨酸酶的天然底物，且发生氧化后得到相应的L-DOPA和邻醌(图14A)。先前的研究已表明可将酪氨酸酶用于介导细胞毒性剂经由药物环化释放机理从氨基甲酸酯和尿素前药中的释放。设想可通过尿素接头让Tyr-CpG中间体6与马来酰亚胺封端的PEG-PG共聚物3连接，来形成靶向MClR的聚合的CpG前药7，接着通过迈克尔加成反应引Λ SH-DNP-MSH (图14Β)。在酪氨酸酶-介导的氧化7后，发生迅速的分子内环化以引发游离CpG的切除和释放(图14Β)。化合物6可经由NH2-CpG与异氰酸酯8反应合成，其可通过用三光气处理Tyr (Bn)-NH-(CH2)2-NH-tBoc来合成。然后去除9中的保护基团来获得6 (图14C)。我们亦基于不可降解的D-PG聚合物来合成7，以降低非特异性的CpG释放。另夕卜，亦合成通过来自PEG-D-PG的Tyr连接的相应非靶向CpG缀合物作为对照。我们将用LC-MS来评估酪氨酸酶-介导的CpG释放的生存力。将聚合物7和非靶向缀合物溶解在PBS中，用酪氨酸酶进行处理，通过液相色谱-质谱来分析溶液以证明药物释放。为确保药物释放真正依赖于酪氨酸酶，将检测每种纳米构建物在PBS和牛血清中的稳定性。靶向的CpG和酪氨酸酶可激活的CpG纳米构建物的体外和体内免疫刺激活性的评估
接下来，我们将评估酪氨酸酶-激活的纳米构建物的免疫刺激活性。用每种聚合物处理B16细胞。二十四小时后，收集培养物上清液，用于用分离的pDC来测定pDC激活。体外细胞的摄取和运输
按照我们发表的实验方案从C57BL/6小鼠的骨髓产生巨噬细胞。为研究聚合物-CpG的内化作用，用荧光标记的聚合物脉冲巨噬细胞I小时，固定，用针对EEA (早期内体标记)、甘露糖-6磷酸受体(晚期内体受体)和LAMPl (溶酶体标记)的单克隆抗体来染色。所有的抗体都来自Abeam (Cambridge, MA)。通过共焦显微术来研究聚合物的共区域化和不同内吞溶酶体标记。体内细胞的摄取
为评价结合CpG的PG纳米构建物在不同免疫细胞群中的摄取，可用AlexaFluor647 标记三种靶向的纳米-CpG (NDP-MSH-PEG-L-PG-CpG、PEG-D-PG-Tyr-CpG 和DNP-MSH-PEG-D-PG-Tyr-CpG)中的每一种,经肿瘤内或静脉内注射至B16肿瘤中(η = 10)。用盐水、CpG、非靶向的L-PG-CpG和非靶向的D-PG-CpG作为对照。在1、3和7天之后，通过流式细胞术测量肿瘤、引流淋巴结和脾中⑶IIc+ DC和⑶llb+F480+巨噬细胞对CpG的摄取。另外，可将在单核细胞谱系细胞中表达GFP的转基因小鼠(在鼠c-fms启动子的控制下)用作肿瘤移植受者，这允许我们在活体动物中用非侵袭性成像活体成像来研究聚合物和单核细胞-巨噬细胞的共区域化。可如上所述实施局部细胞因子产生、递送至B16黑素瘤中的APC、激活pDC、肿瘤中黑素瘤-特异性的⑶8+ T-细胞应答和全身性应答。肿瘤内和静脉内注射后的抗肿瘤活性
在预示性实施例1的抗肿瘤活性确认中所述的实验设计，在此适用于研究靶向的PG-CpG缀合物的抗肿瘤活性。简言之，在C57BL/6小鼠双腿上皮下接种稳定敲除了酪氨酸酶基因的B16F10细胞或B16F10黑素瘤细胞(平均直径4-6 mm)。将小鼠分配到8个组中(10只小鼠/组)，用如下方式进行肿瘤内处理第I组，靶向MClR的NDP-MSH-PEG-L-PG-CpG ；第2组，靶向MClR的酪氨酸酶可激活的DNP-MSH-PEG-D-PG-Tyr-CpG ;第3组，在处理酪氨酸酶-敲除的肿瘤中靶向MCIR的酪氨酸酶可激活的DNP-MSH-PEG-D-PG-Tyr-CpG ；第4组，未处理；第5组，非靶向的PEG-L-PG-CpG ;第6组，酪氨酸酶可激活的但非靶向的PEG-D-PG-Tyr-CpG ;第7组，在处理酪氨酸酶-敲除的肿瘤中酪氨酸酶可激活的但非靶向的PEG-D-PG-Tyr-CpG ;第8组，不可降解的非靶向的纳米构建物PEG-D-PG-CpG。第4-8组作为对照。除第3组和第7组外的所有组将使用B16F10细胞。对于第3组和第7组，使用通过RNA干扰而稳定敲除了酪氨酸酶基因的B16F10细胞。通过稳定转染市购自Invitrogen (Carlsberg, CA)的质粒来实施酪氨酸酶基因的稳定敲除。在1、7和10天时每组中的小鼠将接受每种药剂的瘤内注射，剂量为50 μ g当量CpG/注射(100 μ I)。第21天时测量肿瘤大小，将动物处死，移出引流淋巴结、脾和经处理及未处理的肿瘤二者用于PDC群和细胞死亡(TUNEL)的IHC和FACS分析。第21天时记录单个肿瘤的重量并用作肿瘤控制的量度。在分开的研究中，将荷瘤小鼠分成8组，每组由10只小鼠组成。用与上述相同的药剂静脉内注射每组中的小鼠，并如上所述测定抗肿瘤活性。可如实施例1的数据分析和统计中所述来实施统计分析。预期结果、缺陷和解决方法
我们期望靶向MCRl的纳米构建物和酪氨酸酶可激活的纳米构建物二者都高度选择性地激活肿瘤-特异性的免疫应答。但是，因为酪氨酸酶对于黑素瘤的独特性，预期酪氨酸酶可激活的纳米构建物比靶向的纳米构建物可诱导更加特异的应答。在酪氨酸酶-介导的自纳米构建物的CpG释放不成功的不太可能的事件中，我们用L-DOPA替代酪氨酸作为酪氨酸酶的底物。或者，可使用氨基甲酸酯来替代尿素接头。期望这些方法可有效介导CpG的释放。本预示性实施例的主要缺陷是即使在我们加倍努力之后，靶向MClR的和酪氨酸酶-介导的CpG释放仍不能够避免全身刺激免疫细胞。失去激活黑素瘤-特异性的免疫应答这一“焦点”将不利地影响CpG治疗的有效性。如果发生这种情况，我们将寻求两种备选方法。第一，我们尝试将L-PG-CpG靶向其它的黑素瘤-特异性的生物标记。我们将使用黑素瘤细胞特异性的单克隆抗体例如抗-GD2抗体和抗-GM3抗体作为寻祀配体。这些抗体对细胞表面受体具有高亲和力(Kd=IO ηΜ),并且可改进纳米-CpG与肿瘤细胞的结合。第二，我们将使用长环状核-交联聚合的微团作为CpG的载体。我们先前已证明这些纳米材料可有效逃避单核吞噬系统的细胞。通过防止单核吞噬系统对纳米-CpG的摄取，我们期望降低全身性摄取和肿瘤外纳米-CpG的释放。预示性实施例1II
单独使用L-PG-Cpg纳米构建物及与T调控细胞消耗联合使用对抗肿瘤免疫的作用 瘤内注射纳米-CpG (来自实施例1的最好的)或静脉内注射靶向的纳米-CpG (来自实施例1I的最好的)与靶向协同刺激途径的治疗联合，将通过激活多种先天性和适应性免疫细胞来导致强烈的抗肿瘤活性。另外，这些治疗计划可进一步包括使用诸如IL-2和IFN-α等细胞因子，其在临床领域显示出一些前景，但仍有改进的空间。基本原理和总体策略
普遍认为，癌症的有效免疫治疗依赖于对免疫刺激的多个检查点起作用。联合使用通过不同机制协同作用的免疫治疗剂已成为研究中的关键领域。免疫的完全激活需要刺激正协同刺激信号和抑制负免疫调控信号。成功的免疫治疗将涉及合理联合药剂以激活在发展强烈的免疫应答中所涉及的关键步骤。因此，在B16黑素瘤鼠模型中确定了最有效的抗肿瘤纳米-CpG之后，我们将让这些TLR激动剂与全身性免疫调节联合，所述全身性免疫调节使用正免疫刺激剂或负协同刺激分子，所述正免疫刺激剂例如针对0X40、CD40和4-1BB的激动剂抗体，所述负协同刺激分 子例如针对B7家族的分子B7S1和B7H3的抗体和抗-CTLA-4抗体。考虑到这些细胞因子在先前临床上的中等成功，故一旦鉴定出最佳的联合，便可将其用于与IL-2和IFN- α建立细胞因子疗法。联合针对TAA的疫苗，评价了这些针对协同刺激分子的激动剂抗体中的每一种。将这些抗体与替代疫苗的TLR激动剂联合，具有接种患者来抵抗多种肿瘤特异性抗原的潜力，适合针对单个患者的肿瘤。最后，将IL-2和IFN-α给予黑素瘤患者而观察到的中等临床成功仍留有改进的空间，所述改进可能通过加入TLR-激动剂抗体组合来实现。研究计划
评估有效纳米-CpG与针对协同刺激分子的激动剂抗体或B7负协同刺激分子的治疗将B16黑素瘤植入到小鼠中。一周后，在建立起实体瘤之后，用两种TLR激动剂(来自以上实施例1和2中的最佳候选物)中任一种加上针对0X40、⑶40或4-1BB的激动剂抗体，或针对B7负协同刺激分子的拮抗剂抗体(抗-B7S1和抗-B7H3抗体)和抗-CTLA-4开始治疗，所有抗体均为腹膜内给予。TLR激动剂的给药途径将视经确定为最有效的激动剂而定。可在注射纳米-CpG 5天之后，以预定剂量给予抗体。我们的初步数据表明肿瘤-特异性的CD8 T细胞应答在瘤内注射L-PG-CpG后5天达到顶峰(图5)。终点是肿瘤大小减小和小鼠存活。亦研究最佳协同作用组合的机理，特别是关于肿瘤微环境中的细胞变化、抗原-特异性的T细胞的发育和CTL活性，基于这些发现将研究进一步改良。我们期望TLR激动剂与抗体-介导的刺激途径的参与的联合将进一步提闻抗肿瘤应答。评估有效纳米-CpG和针对协同刺激途径的激动剂抗体或B7负协同刺激分子与细胞因子联合的方案
将B16黑素瘤植入到小鼠中，I周后开始治疗。已鉴定出TLR激动剂加上刺激性抗体或B7负协同刺激分子的最佳联合，将IL-2和IFN-α加入到这一方案中。IL_2或IFN-α将与抗体一起腹膜内给予。监测联合疗法的治疗应答 治疗方案
对于自预示性实施例1鉴定的最佳纳米_CpG，研究以下组
与针对负协同刺激途径的拮抗剂抗体的联合 第I组，纳米-CpG ;第2组，纳米-CpG+抗-CTLA-4 ;第 3 组，抗-B7S1+ 纳米-CpG ’第 4 组，抗-B7H3 + 纳米-CpG0与针对正刺激途径的激动剂抗体的联合第5组，纳米-CpG +抗-0X40 ;第6组，纳米-CpG + 抗-CD40 ;第 7 组，纳米-CpG + 抗-4-1-1BBL。与细胞因子的联合第8组，纳米-CpG + IL-2 + —种协同刺激途径试剂；第9组，纳米-CpG +IFN- α +—种协同刺激途径试剂。对于在以上预示性实施例1I中鉴定的最佳纳米_CpG，制定相同的治疗方案。数据分析和统计可如实施例1的数据分析和统计中所述来实施统计分析。如上所述来实施局部细胞因子的产生、至B16黑素瘤中APC的递送、pDC的激活、肿瘤中黑素 瘤-特异性的CD8+ T-细胞应答和全身性应答。预期结果、缺陷和解决方法
我们期望通过联合使用协同刺激试剂和细胞因子观察到抗肿瘤应答增强。我们尤其期望看到由于协同刺激试剂导致的CD8 T细胞的肿瘤杀伤活性增强，对远端肿瘤治疗的效果大巾畐提闻。如对于IFN- α和IL_2所观察到的免疫调节剂的毒性可妨碍其与纳米-CpG的联合使用。因为纳米-CpG经设计以避免全身性激活免疫系统，所以纳米-CpG不太可能增加协同刺激试剂和细胞因子的已知毒性。作为备选方法，我们有两个计划1)我们将降低在初步研究中我们所使用的单一试剂的剂量，检测纳米-CpG是否可降低此特定试剂所需的有效剂量；和/或2)我们将尝试低剂量的多种协同刺激试剂来检测这些试剂之间的协同作用是否可降低每一种单独试剂的所需剂量。预示性实施例1V 体内分析
这些实验中将使用C57BL/6纯系株雌性小鼠(约600只/年)和GFP-转基因小鼠。对小鼠实施的主要程序包括以下
因为体内肿瘤消除和体内免疫应答是了解待开发的纳米载体-CpG候选物的抗癌功效的关键，所以仅可在动物内测试所提出的研究。对于所产生数据的统计学显著性，我们将重复测定至少一次，每一测试每组使用10只小鼠。动物将于M. D. Anderson供养在用于小动物的无病原容纳设施中，其以12小时为周期变换光照和黑暗，按照美国实验动物护理认定协会(AAALAC)批准的条件来控制温度和湿度。所有程序都将由受过训练的工作人员来执行，并经机构动物护理及使用委员会批准。将使用等同于10mg/mL氯胺酮和lmg/mL赛拉嗪(xylazine)的氯胺酮/赛拉嗪混合物经腹腔内注射(1. P)递送来麻醉小鼠。使用的麻醉剂是标准的、安全的，并经批准可用于小鼠。麻醉下的免疫期间，将观察小鼠的任何问题，在整个期间将保持小鼠温暖。通过在小鼠的左和/或右侧注射3xl05个B16黑素瘤细胞来进行肿瘤接种。在肿瘤接种7天后瘤内注射纳米-CpG和对照。通过腺病毒载体转导的细胞系所接种动物的操作在动物设施中的BSL-2条件下进行，且BSL-2规范用于实施实验的个人。每周测量2-3次小鼠肿瘤的生长。当肿瘤大小达到直径为1. 2 cm时(约接种3xl05个B16细胞后21天)，将小鼠处死。研究这21天期间纳米-CpG的抗癌作用。每天检查动物以确保健康，在研究过程中任何濒死的动物将实施安乐死。基于动物身体外观、活性水平、食欲和呼吸速率来测定发病率。在麻醉的动物中抽取血样样品。在实验结束时处死动物，收获各种组织(脾、淋巴结和肿瘤)进行T细胞测定，收获血清进行细胞因子测定。在所有这些程序中预期无毒性事件，因为纳米-CpG和CpG不是毒性的，用于转导B16黑素瘤细胞的重组病毒是复制缺陷型的。使用的所有剂量都低于公开的研究中已知有毒的剂量。处死任何表现出嗜睡、皮毛起皱或痛苦的动物以避免更长的痛苦。如果在肿瘤中观察到溃疡，则应迅速处死该小鼠。安乐死将涉及CO2暴露。一旦动物熟睡并对外界刺激无反应，将通过颈部脱臼法将其处死。这一过程与AVMA安乐死专家组的推荐一致。收获组织之后，在生物-危险性的动物废物中处理动物躯体。以下表格包括以上提出的不同实验(预示性实施例1、11和III)中所使用的各组小鼠和时间线。 对于预示性实施例1
共计:620只C57BL/6小鼠，120只转基因小鼠 表2
......S...................丽.....................................................「丽................1......万 丽
......1....................1..... .丽-...........................1..........].....JJlf1........................................1
2-12 11 S-CpG I 科I 扣I。
13 I Vink Cpo fWErTl 1-2 ψ ；预示性实施例1的抗肿瘤活性确认
肿瘤驻留10只小鼠/组X 13组=130只小鼠
预示性实施例1，瘤内注射后通过CpG和基于PG的纳米构建物诱导的先天性和获得性免疫的评估。pDC的体内摄取。10只小鼠/组X 12组(除盐水之外)x 3个时间点=360只小鼠
GFP转基因小鼠。10只小鼠/组X 12组=120只转基因小鼠 表3
对于预示性实施例1I，共计300只C57BL/6小鼠，140只转基因小鼠
权利要求
1.一种用于治疗黑素瘤的纳米构建物，所述纳米构建物包含多聚(L-谷氨酸)-CpG缀合物，其中所述纳米构建物在体内提供将CpG靶向递送至黑素瘤，增强黑素瘤抗肿瘤活性，同时降低或消除PDC的全身性激活。
2.一种用于将免疫调节剂给予肿瘤位点的递送系统，所述递送系统包含纳米构建物，其中纳米聚合物与免疫调节剂缀合，其中所述免疫调节剂为CpG或CpG与其它肿瘤结合配体及抗体的组合。
3.权利要求2的递送系统，其中所述纳米聚合物为多聚(L-谷氨酸)，并且所述其它肿瘤配体为针对黑皮质素I型受体(MClR)、适配体或抗体的MSH衍生的配体。
4.一种治疗需要治疗的受试者的黑素瘤的方法，所述方法包括将治疗量的纳米构建物给予所述受试者，所述纳米构建物具有与亲巨噬细胞的聚合物缀合的CpG。
5.一种治疗需要治疗的受试者的黑素瘤的方法，所述方法包括将治疗量的缀合纳米聚合物的免疫药物给予所述受试者。
6.权利要求5的方法，其中所述缀合纳米聚合物的免疫药物为多聚(L-谷氨酸)-CpG缀合物(〃L-PG-Cp-G〃)。
7.权利要求5的方法，其中将正协同刺激信号激动剂和负免疫调控信号抑制剂共同给予所述受试者。
全文摘要
阐述了具有以下三种组分的纳米构建物及使用所述纳米构建物的方法(1)生物可降解的纳米聚合物和纳米颗粒；(2)免疫药物，例如CpG；和(3)肿瘤结合装置，其通过受体-介导的摄取主动靶向肿瘤细胞，例如黑素瘤细胞。通过将PG-CpG纳米构建物与正协同刺激信号激动剂和负免疫调控信号抑制剂联合，进一步增强了抗肿瘤免疫。
文档编号A61K39/395GK103002919SQ201180017094
公开日2013年3月27日 申请日期2011年2月3日 优先权日2010年2月4日
发明者周大鹏, 李春, P.吴 申请人:得克萨斯系统大学评议会
技术领域：
阐述了包含生物可降解聚合物的纳米构建物(nanoconstruct),所述生物可降解聚合物与可靶向肿瘤并增强在肿瘤位点驻留的肿瘤结合配体和抗体缀合。通过让纳米构建物与正协同刺激信号激动剂和负免疫调节信号抑制剂联合，来进一步提高抗肿瘤免疫力。
背景技术：
因其遍及全身广泛转移的倾向，黑素瘤是皮肤癌中最为致命的。一旦其扩散到远端部位，则生存中值小于6个月。当前常规疗法对抗转移性黑素瘤的功效有限。现在有强有力的证据表明，对于一些转移性黑素瘤患者，免疫系统可在诱导长期益处中发挥重要作用。一种发展强烈免疫应答的方法涉及通过使用特异性toll样受体(“TLR”)来激活先天免疫细胞，例如浆细胞样树突细胞(“PDC”)。在直接应答CpG寡脱氧核苷酸刺激的pDC和B细胞中，TLR9是人TLR表达中最特异性的。不幸的是，CpG的全身注射导致主要免疫器官中pDC细胞的激活，并耗尽肿瘤之外的这一重要类型的抗肿瘤细胞库。因此，存在将CpG靶向递送至黑素瘤以增强抗肿瘤活性同时降低或消除PDC的全身性激活的需求。发明简述
本文提出了通过生物可降解的L-PG在体内将CpG靶向递送至黑素瘤，其中该递送系统有效产生所需的保护性免疫，增强抗肿瘤活性，并降低或甚至消除PDC的全身性激活。阐述了与可靶向肿瘤并增强在肿瘤位点驻留的肿瘤结合配体及抗体缀合的可降解聚合物。举 例而言，一种所述聚合缀合物为多聚(L-谷氨酸)-CpG缀合物(“L-PG-CpG”)。已表明L-PG-CpG比游离CpG更好地降低肿瘤生长，并引发更强的对肿瘤抗原(OVA)的全身性⑶8T细胞应答。这种亲巨曬细胞的(macrophage-tropic)聚合物与肿瘤浸润巨曬细胞相互作用，并聚积在肿瘤位点。附图简述
图1提供的两幅图说明通过TLR激动剂肿瘤内激活PDC引发肿瘤抗原特异性的CD8应答，该应答随后导致对远端肿瘤的排斥。具体而言，图1A显示瘤内注射CpG诱导免疫应答的“引发阶段”，将其定义为引发抗原特异性的适应性免疫细胞(CD4和CD8 T细胞)。在弓丨发阶段，CpG激活pDC以产生INF-α，INF-α进一步激活NK细胞。NK细胞裂解肿瘤细胞并释放肿瘤抗原至mDC。INF-α亦激活mDC以变成有效的专门抗原呈递细胞。随后mDC迁移至肿瘤引流淋巴结，在此其诱导抗原-特异性⑶4和⑶8 T细胞扩增。图1B说明⑶4和CD8 T细胞在淋巴结中扩增后，其进入血液循环，触发适应性免疫应答的“效应阶段”。在效应阶段，抗原特异性的CD8 T细胞和其它肿瘤杀伤细胞(NK细胞)被募集至肿瘤位点。最重要的是，CD8 T细胞和NK细胞不但可进入接受瘤内注射的原发肿瘤，而且还可进入瘤内注射不可及的远端转移性肿瘤。远端肿瘤的免疫排斥是肿瘤内CpG治疗的另一个主要优势。图2说明了决定⑶8 T细胞的肿瘤杀伤活性的负和正协同刺激途径。⑶8细胞的肿瘤杀伤活性不但受通过T细胞受体信号转导途径的肿瘤抗原识别的调控，而且还受负和正协同刺激途径的调控。以CTLA4途径为代表的B7负协同刺激途径，关闭CD8 T细胞的肿瘤杀伤活性。正协同刺激途径例如0X40和细胞因子(IL-2)增强CD8细胞的肿瘤杀伤活性。已开发出靶向免疫-协同刺激途径的抗肿瘤试剂。在治疗人肾脏细胞癌中，针对CTLA4的拮抗剂抗体已显示出初始希望。0X40的激动剂抗体已显示荷瘤小鼠的存活显著提高。可合理地将这些试剂与TLR9激动剂联合用于癌症治疗。 图3显示用于磁共振成像(PG-Gd)、近红外荧光成像(PG-NIR)、双光学/MR成像(PG-Gd-NIR)的PG和基于PG的缀合物的结构，以及为用光学/MR成像可显现的免疫刺激试剂的PG-CpG缀合物[PG-Gd(111In)-CpG和PG-NIR-CpG]的结构。当多聚氨基酸由L-谷氨酸组成时，用L-PG来表示PG ;当多聚氨基酸由D-谷氨酸组成时，用D-PG来表示PG，NIR、近红外。DTPA为二亚乙基三胺五乙酸。图4显示仅瘤内注射CpG来治疗小鼠中的B16F10黑素瘤。在C57BL6小鼠的右侧皮下接种B16F10黑素瘤细胞。在肿瘤接种的同一天采用流体动力学的方法将FLT3配体DNA (10 μ g/小鼠)注射进小鼠中，以在体内扩增树突细胞。在肿瘤接种和树突细胞扩增后7天，注射20 yg CpG0对照组意指仅有FLT3配体治疗而无CpG治疗的荷瘤小鼠。通过肿瘤内或腹膜内注射来递送CpG，剂量为每次注射20 Ug CpG (在50 μ I PBS中)。图5Α、5Β和5C显示PG-CpG增强CpG的免疫刺激效力和抗肿瘤功效。图5Α显示在小鼠模型中，当肿瘤内给予时，L-PG-CpG比CpG更有效地抵抗黑素瘤肿瘤移植物。给C57B6小鼠皮下接种B16-0VA肿瘤细胞七天之后，将L-PG-CpG (50 Pg当量CpG)、CpG (50 Pg)或L-PG (500 Pg)注射到肿瘤中。每3天通过测量肿瘤的垂直直径来测量肿瘤的大小(η =
5)。图5Β显示当肿瘤内给予时，L-PG-CpG在触发抗原特异性的免疫应答中比CpG更有效。以A图中的方式处理荷有皮下B16-0VA肿瘤的小鼠。用荷载0VA257-264肽的四聚体(BDPharmingen, San Diego, CA)，将肿瘤抗原-特异性的⑶8应答测量为OVA-特异性的⑶8T细胞计数。图5C显示L-PG-CpG(而非可溶性CpG)特异性地激活肿瘤中的免疫细胞。在瘤内注射每种药物之后5天，提取来自肿瘤和脾脏的免疫细胞，通过用抗CD69抗体染色来分析NK细胞的激活作用。PG-CpG保留了其对肿瘤的特异性。相比之下，可溶性CpG同样可激活脾脏中的NK细胞。实线未处理对照。虚线用CpG或L-PG-CpG处理。图6说明瘤内注射后L-PG聚合物的分布。图6A为注射L-PG-NIR至裸小鼠舌的人DM14鳞状细胞癌中后24小时获得的NIRF图像，其显示了聚合物在注射位点和引流颈淋巴结中的驻留(箭头)。图6B为所切除的肿瘤和淋巴结的NIRF图像。图6C为所切除的淋巴结经H&E染色后的显微照片。图6D显示通过放射自显影检查的111In-标记的L-PG-CpG和CpG在B16黑素瘤中的驻留。
图7为接种B16-0VA黑素瘤后获得的数据，用PBS、CpG、抗小鼠0X40或CpG加抗小鼠0X40治疗小鼠。图7A提供随时间变化的肿瘤面积(mm3)。图7B提供随时间变化的特异性OVA抗原-阳性的⑶8+ T细胞占总的⑶8 T细胞的百分比。图8为静脉内注射后CpG和PG-CpG的生物分布。肝和脾对PG-CpG的摄取显著更少。图9显示PG-Gd-NIR被肿瘤中的巨噬细胞/APC所摄取。图9A显示静脉内注射后24小时，PG-Gd-NIR与CD68巨噬细胞/APC标记共同位于裸大鼠的C6肿瘤中。图9B-D显示，在荷有A20 B-细胞淋巴瘤的同基因Balb/c小鼠中，用氯膦酸盐(clodronate)脂质体消耗巨噬细胞/APC，导致肿瘤中PG-Gd-NIR的摄取减少。在注射PG-Gd-NIR (O. 02毫摩尔当量Gd/kg，48纳摩尔NIR染料/小鼠)的24小时之前注射氯膦酸盐脂质体。图9B提供用FMT2500 3D光学成像系统获得的近红外荧光图像。图9C为注射Pg-Gd-NIR后2天在
4.7T获得的Tl-加权MR图像。图9D为经切除肿瘤的免疫组织学染色，其证实了与注射盐 水对照的小鼠相比，注射氯膦酸盐脂质体的小鼠肿瘤中，消耗了 CD68+细胞，并且荧光强度和MRI信号显著降低。图10显示MSH-PG-CpG被表达MSH受体的B16-F10细胞代谢。在6孔板中将200Kg/ml 浓度的 MSH-L-PG-CpG 与 B16-F10 细胞一起孵育。让 B16-F10 细胞摄取 MSH-PG-CpG2小时。然后用RPMI培养基洗涤细胞3次。加入新鲜培养基，培养细胞12小时，以使其处理内化的MSH-PG-CpG。收获培养基，用其刺激小鼠脾细胞产生IFN- Y的活性来量化释放到培养基中的CpG。IFN-y的产量用来自Pharmingen (San Diego, CA)的试剂盒经ELISA测定来测定。图11显示以下物质的结构单谷氨酸L-Glu-CpG、Gd(111In)-或荧光染料标记的L-PG-CpG (4 种不同 MW)、D-PG-CpG、多聚(L-Glu-Tyr)-CpG、多聚(L_Glu_Ala)-CpG、多聚(羟丙基L-谷氨酸)-CpG (L-PHPG-CpG)和带有酸敏感接头的L-PG-缩酮-CpG及D-PG-缩酮-CpG0图12为GcK111In-或染料-标记的L-PHPG-CpG的合成方案。图13为用于靶向递送CpG的Gd (111In)或染料-标记的NDP-MSH-PEG-L-PG-CpG(聚合物5)的合成。图14A描述通过酪氨酸酶将酪氨酸氧化为L-DOPA再氧化为邻醌。图14B为靶向MClR的酪氨酸酶可激活的、结合CpG的DNP-MSH-PEG-D-PG纳米构建物的合成。在酪氨酸酶存在时，该聚合缀合物经历迈克尔-型环化以释放游离CpG。图14C显示CpG通过尿素接头与衍生自Tyr的异氰酸酯偶联。图15显示在瘤内注射后的4小时时，PG-CpG-NIR与B16/F10黑素瘤中的巨噬细胞(⑶68 +)缔合。PG-CpG-NIR及肿瘤相关巨噬细胞高度散布于整个肿瘤中。以更高倍放大显示巨噬细胞吞噬聚合物到囊泡区室(箭头)。巨噬细胞可能在内溶酶体区室中吞噬聚合物。图16为肿瘤靶向聚合物-药物缀合物的图解。图17为递送纳米聚合物-CpG的假设机理的另一图解。图18显示纳米聚合物CpG的纯度。图19A和B显示PG-CpG在体外激活脾脏NK细胞。
图20A、B、C和D显示肿瘤相关的巨噬细胞(CDllb+)对PG聚合物的选择性摄取。图21显示引流淋巴结中巨噬细胞和DC(而非B细胞)对PG聚合物的选择性摄取。发明详述
免疫治疗将免疫抑制性微环境转化为免疫刺激性微环境。对免疫系统先天装备(innate arm)起作用的药物因其在“跳跃式启动(jump-starting) ”免疫应答中的独特特征而已显示出巨大前景。在过去十年中，先天免疫细胞受体的分子鉴定已导致一系列免疫调节剂的发现和设计。本文提供了新型纳米技术平台和递送系统，用于通过用刺激免疫细胞中的TLR9信号转导的toll样受体(TLR) TLR激动剂激活浆细胞样树突细胞(pDC)，来产生抗肿瘤免疫应答。本文阐述了通过有效产生保护性免疫并增强抗肿瘤活性 (但降低或甚至消除pDC的全身性激活)的生物可降解聚合物在体内靶向递送TLR9激动剂CpG至黑素瘤。主要免疫器官如肝和脾中PDC的激活可耗尽肿瘤外的这一重要类型的抗肿瘤细胞库。在体内通过有效产生保护性免疫并增强抗肿瘤活性的生物可降解聚合物来靶向递送TLR9激动剂CpG至黑素瘤，降低或甚至消除pDC的全身性激活。本文所述技术在与以下靶向递送联合时亦是有用的TLRl/2激动剂，例如Pam3CSK4 ；TLR3激动剂，例如多聚(1:C) ；TLR4激动剂，例如合成的脂质A模拟物；TLR5激动剂，例如鞭毛蛋白；TLR6/2激动剂，例如FSL-1(Pam2CGDPKHPKSF) ;TLR7 激动剂，例如咪喹莫特(Imiquimod) ;TLR8 激动剂，例如 ssRNA40 ;和N0D1/2激动剂，例如三-DAP和胞壁酰二肽(MDP)。如本文所提供，开发出了通过受体介导的摄取主动靶向黑素瘤细胞的PG-CpG纳米构建物。通过让PG-CpG纳米构建物与正协同刺激信号激动剂和负免疫调节信号抑制剂合理联合，提高了抗肿瘤免疫。具体而言，在黑素瘤的小鼠模型中，我们已应用了这种亲巨噬细胞的聚合物技术递送CpG 0DN2216至肿瘤位点。我们合成了多聚(L-谷氨酸)-CpG缀合物(“L-PG-CpG”)，在将其肿瘤内给予B16-0VA黑素瘤皮下移植物时，通过与非缀合的CpG 0DN2216比较检测了其抗癌作用。我们发现，L-PG-CpG比游离CpG更大程度地降低肿瘤生长。此外，对肿瘤抗原OVA，L-PG-CpG触发更强的全身性⑶8 T细胞应答。为进一步开发本发明在黑素瘤的免疫治疗中的应用和瘤内注射纳米-CpG对CpG的抗肿瘤免疫应答的作用，可建立聚合物载体的理化特性和瘤内注射后CpG的免疫刺激活性之间的结构-活性关系。靶向黑素瘤细胞的纳米-CpG (其中纳米-CpG由黑素瘤细胞进行局部处理)可以以肿瘤-特异性的方式激活PDC。而且，基于免疫系统是复杂的这一事实，本文所述的黑素瘤的免疫治疗可能需要对多种免疫刺激途径的联合干涉，需要纳米-CpG与正协同刺激途径的其它激动剂和/或负协同刺激途径的拮抗剂相联合。此外，黑素瘤是对免疫疗法敏感的几种实体瘤之一。已显示成功用于治疗黑素瘤患者的其它类型的免疫疗法包括高剂量的细胞因子，例如干扰素-α ( “IFN-α ”)和白细胞介素2 (“IL-2”)；基于黑素瘤肿瘤抗原的肽疫苗；树突细胞疫苗和过继转移的肿瘤抗原-特异性的CD8 T细胞。可导致黑素瘤对免疫疗法产生应答的机理为免疫抑制的肿瘤微环境向免疫刺激的肿瘤微环境的转换。免疫激活剂，例如含有未甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤基序(本文中通常称作“CpG”)的Toll -样受体(“TLR”)激动剂CpG寡核苷酸，显著提高了免疫疗法的功效，其如在黑素瘤小鼠模型中所示。
合成的CpG模仿微生物DNA，引起一组协调的免疫应答，包括先天性免疫和获得性免疫。浆细胞样树突细胞(“PDC”)是人CpG的主要靶细胞。pDC具有产生IFN-α的特殊能力，IFN-α随后激活T细胞、自然杀伤(NK)细胞和抗肿瘤免疫的其它组分。如小鼠模型中所示，CpG是癌症的有效免疫调节剂，已证明其在人类临床试验中是安全的。但是，如全身注射CpG—样，肿瘤位点-特异性地递送游离CpG导致主要免疫器官例如肝和脾中pDC的激活，并耗尽肿瘤外的这类重要的抗肿瘤细胞库。通过将免疫刺激“集中”在肿瘤位点，瘤内注射CpG显著提高了其抗肿瘤作用。但是，瘤内注射可溶性CpG存在两个问题。第一，难以控制所注射的CpG在肿瘤内的保留时间。第二，可溶性CpG仍可通过扩散吸收而进入循环。为解决这些问题，我们建议使用生物相容的生物可降解聚合物平台来指引和控制CpG在肿瘤位点的释放。为此目标，如我们在本文中所示，只要有可行的药物递送系统，就可通过肿瘤相关的巨噬细胞的吞噬作用将合成的多聚(L-谷氨酸)(“L-PG”)和其它聚合物选择性地保留在肿瘤中。可与本发明联合使用的适宜聚合物包括但不限于多聚(DL-谷氨酸)；多聚 (L-天冬氨酸)；多聚(羟丙基谷氨酸酯)；多聚(羟乙基谷氨酸酯)；多聚(氨基酸)的共聚物；和其它合成的和天然的水溶性聚合物，包括但不限于聚乙烯醇、多羟基乙基甲基丙烯酰胺、葡聚糖、多糖、人血清白蛋白、透明质酸等等。我们发现与通过瘤内注射递送游离CpG相比，通过瘤内注射递送的L-PG-CpG缀合物即与L-PG化学结合的CpG表现出显著更强的针对已建立黑素瘤的抗肿瘤活性。如本文进一步所提供，可通过合成和表征具有不同分子量(并因此大小不同)、降解性和电荷的一系列结合CpG的PG聚合物(本文中有时亦称作“纳米-CpG”)，来测定瘤内注射后对其抗癌作用的最佳理化特性。然后就可评估瘤内注射后纳米构建物诱导先天性和获得性免疫的能力。此外，如下所述，业已开发并验证了通过受体介导的摄取和酪氨酸酶介导的CpG释放两者来主动靶向黑素瘤细胞的PG-CpG纳米构建物。如本文更进一步所述，通过PG-CpG纳米构建物与正及负协同刺激分子的联合，可提高抗肿瘤免疫。例如，提出了纳米-CpG与正协同刺激分子(例如0X40)的激动剂抗体或负协同刺激分子(例如CTLA-4和B7)的拮抗剂抗体联合的抗肿瘤作用。提供了用于测定纳米-CpG和对协同刺激途径起作用的治疗性抗体连同细胞因子方案联合的抗肿瘤作用的方法。用整个肿瘤作为抗原，基于本文所述的新型纳米-CpG的疫苗可诱导对黑素瘤的有效的T-细胞免疫应答。通过利用这些新型纳米构建物来靶向递送免疫刺激剂，可产生改进的抗肿瘤功效。此外，虽然已证明黑素瘤是测试免疫策略的极好模型系统，但本文所述的策略亦可用于治疗其它类型的癌症，例如肺癌和结肠癌。黑素瘤的免疫疗法
2009年，美国约有69，000男性及女性被诊断为患黑素瘤，估计大约有8，600将死于这种疾病。Jemal k 等，Cancer Statistics (癌症统计)，CA Cancer J Clin 59:225-49，2009。有意义的是，诊断为黑素瘤的频率正不断增加，发病率每年增加3%。黑素瘤特征为其强大的侵入和转移能力。在黑素瘤患者中，大约20%最后死于转移性疾病。因此，黑素瘤仍是因恶性肿瘤而死亡的最常见原因之一。一旦黑素瘤扩散到远端位点，则生存中值小于6个月。
在二十多年以前，发现黑素瘤患者可针对其肿瘤引发T-细胞应答。Boon T等，Human T Cell Responses Against Melanom (针对黑素瘤的人 T 细胞应答)，Annu RevImmunol 24:175-208, 2006。在黑素瘤患者中测试了几种免疫疗法,包括干扰素疗法、同种异体全细胞疫苗、重组病毒载体、与淋巴耗尽联合的过继免疫疗法和同种异体细胞裂解物。现有有力证据表明，对一些转移性黑素瘤患者，免疫系统在诱导长期益处中有重要作用。但是总体应答率仍低，这可能是因为缺乏黑素瘤-特异性的抗肿瘤免疫应答及在复杂的免疫应答中仅激活单一步骤的策略缺陷。免疫的全面激活需要正协同刺激信号的刺激和负免疫调控信号的抑制。新兴的纳米技术和本文所述的新方法允许刺激正免疫应答而不逆转免疫抑制性微环境。在黑素瘤小鼠模型中，瘤内注射免疫激活剂例如TLR9激动剂CpG可提高杀死CD8(+)的功效。先天性免疫的激活是产生有效适应性免疫应答的关键 发展强烈的免疫应答所涉及的关键步骤包括通过使用特异性的TLR来激活先天免疫细胞例如 pDC。Degl1-Esposti MA, Smyth MJ. Close Encounters of Different Kinds:Dendritic Cells and NK Cells Take Centre Stage (不同种类的紧密相遇树突细胞和 NK 细胞成为关注焦点)，Nat Rev Immunol 5:112-24，2005 ；Kadowaki N, Liu YJ.Natural Type I In terferon-Producing Cell as a Link Be tween Innate and AdaptiveImmunity (作为先天性免疫和适应性免疫之间连接的产生天然I型干扰素的细胞)，Hum Tmmunol 63:1126-32, 2002 ；Krutzik SR TLR Activation Triggers the RapidDifferentiation of Monocytes into Macrophages and Dendritic Cells (TLRi舌化弓I发单核细胞向巨噬细胞和树突细胞的快速分化)，Nat Med 11:653-60, 2005。这进而导致NK细胞和骨髓树突细胞(mDC)的激活、靶细胞裂解后抗原的释放和最后激活特异性T细胞(适应性免疫)。先天性免疫的激活诱导产生促炎细胞因子，促炎细胞因子可直接激活对引发适应性免疫应答重要的细胞。例如，以IFN- α和IFN- β为代表的I型IFN和肿瘤坏死因子(TNF- β )，是mDC成熟的有效诱导物，其诱导主要组织相容性复合物(MHC)和协同刺激分子的上调以及IL-12的产生，这两者对幼稚T细胞的引发都是重要的。Banchereau J, Steinman RM. DendriticCells and The Control of Immunity (树突细胞和免疫的控制)，Nature 392:245-52,1998 ；Montoya M^, Type I Interferons Produced By Dendritic Cells Promote TheirPhenotypic and Functional Activation (由树突细胞产生的I型干扰素提高了其表型和功能的激活)，Blood 99:3263-71, 2002。另外，由pDC、细胞因子和TLR激动剂激活NK细胞可导致增加肿瘤的裂解，并进而可提供抗原至mDC以提呈至T细胞。先天性免疫的激活不但对抗原-特异性的T细胞的产生重要，而且对诱导炎症也重要，所述炎症导致抗原-特异性的T细胞向肿瘤位点的迁移增加。代表先天性和适应性免疫之间的关键连接物
作为I型IFN的主要产生者，pDC代表先天性和适应性免疫之间的最重要的连接物之一。Apostolou I 等，Origin of Regulatory T Cells With Known Specificity ForAntigen (具已知抗原特异性的调控T细胞的起源)，Nat Immunol 3:756-63, 2002 ；Bjorck P. , The Multifaceted Murine Plasmacytoid Dendritic Cell (多层面的鼠衆细胞样树突细胞)，Hum Immunol 63:1094-102，2002 ；Gilliet M 等，Developmentof Murine Plasmacytoid Dendritic Cell Precursors is Differentially Regulatedby FLT3~Ligand and Granulocyte/Macrophage Colony-Stimulating Factor (鼠衆细胞样树突细胞前体的发育受FLT3-配体和粒细胞/巨噬细胞集落剌激因子的差异化调控)，J Exp Med 195:953-8，2002 ；Kadowaki N 等，Subsets Of Human Dendritic CellPrecursors Express Different Toll-Like Receptors And Respond To DifferentMicrobial Antigens (人树突细胞前体的亚组表达不同的Toll-样受体并对不同的微生物抗原进行应答)，J Exp Med 194:863-9，2001 ；Liu YJ.，IPC: Professional Type IIn terferon-Producing Cells and Plasmacytoid Dendri tic Cell Precursors (IPC 专门产生I型干扰素的细胞和浆细胞样树突细胞前体)，Annu Rev Immunol 23:275-306，2005ο在触发TLR7或TLR9时，pDC快速产生大量I型IFN，激活多种免疫细胞，例如B细胞、NK细胞和巨噬细胞，并分化为APC以诱导抗原-特异性的T-细胞应答。Nestle FO等，Plasmacytoid Predendritic Cells Initiate Psoriasis Through Interferon-AIpha Production (衆细胞样前树突细胞通过产生干扰素_ α来引发银屑病)，J Exp Med202:135-43，2005。mDC和NK细胞二者的激活亦可部分由I型IFN来诱导。IFN-a Re -/-mDC在充分应答病毒感染的能力上是有缺陷的，这表明产生IFN的pDC可对mDC的激活和随后适应性免疫的发展至关重要。Honda I等，Spatiotemporal Regulation of Myd88~IRF~7Signaling For Robust Type-1 Interferon Induction (Myd88-1RF_7 信号转导对强烈的I型干扰素诱导的时空调节)，Nature 434:1035-40，2005。很多证据表明，pDC可与mDC相互作用来诱导抗病毒免疫发展过程中增强的适应性免疫应答。Dalod I等，Dendritic Cell Responses To Early Murine CytomegalovirusInfection: Subset Functional Specialization and Differential RegulationBy Interferon Alpha/Beta (树突细胞对早期鼠巨细胞病毒感染的应答干扰素α/β的亚组功能特化和差异调控)，J Exp Med 197:885-98，2003 ；Fonteneau JF等，Human Iwmunodeficiency Virus Type I Ac tiva tes Plasmacytoid Dendri tic Cellsand Concomitantly Induces the Bystander Maturation Of Myeloid DendriticCells (人免疫缺陷I型病毒激活浆细胞样树突细胞并伴随性诱发骨髓树突细胞的旁邻成熟)，J Virol 78:5223-32，2004 ；Teleshova ^{等，Cpg-C IwmunostimulatoryOligodeoxyribonυαIeotide Activation of Plasmacytoid Dendritic Cells InRhesus Macaques to Augment The Acti vat ion of IFN-Gamma -Secre ti ng SimianImmunodefi ci ency Virus-Specific T Cells (恒河猴中衆细胞样树突细胞的Cpg-C免疫剌激性寡脱氧核苷酸激活对IFN- Y -分泌型猿猴免疫缺陷病毒-特异的T细胞的激活的增强)，J Immunol 173:1647-57，2004。已表明由双链RNA或病毒感染对mDC的激活依赖于与 IFN-α 的接触。Honda I 等，Selective Contribution of IFN-Alpha/BetaSignaling To The Maturation of Dendritic Cells Induced By Double-Stranded RNAor Viral Infection (IFN-a / β信号转导对由双链RNA或病毒感染诱导的树突细胞的成熟的选择性贡献)，Proc Natl Acad Sci USA 100:10872-7，2003 ；Radvanyi LG 等，Low Levels of Interferon-Alpha Induce CD86 (Β7· 2) Expression and AcceleratesDendritic Cell Maturation From Human Peripheral Blood Mononuclear Cells (低水平干扰素-α诱导CD86 (B7. 2)的表达并加速来自人外周血单核细胞的树突细胞的成熟)，Scand J Immunol 50:499—509， 1999 ；Tough DF.， Type I In terferon as A Link BetweenInnate and Adaptive Inmunity Through Dendritic Cell Stimulation (I 型干扰素通过剌激树突细胞作为先天性和适应性免疫之间的连接物)，Leuk Lymphoma 45:257-64，2004。另外，发现HIV能够激活pDC，pDC随后可激活共培养时的mDC。Fonteneau JF等，Human Iwmunodefi ci ency Virus Type I Activates Plasmacytoi d Dendri ti c Cells andConcomitantly Induces the Bystander Maturation Of Myeloid Dendritic Cells (人免疫缺陷I型病毒激活浆细胞样树突细胞并伴随性诱发骨髓树突细胞的旁观成熟)，J Virol78:5223-32，2004。另外，近来已证明在产生抗-HSV CTL的过程中，pDC可与淋巴结mDC相互作用。Tough DF.，Type I In terferon as A Link Be tween Innate and AdaptiveImmunity Through Dendritic Cell Stimulation (I型干扰素通过刺激树突细胞作为先天性和适应性免疫之间的连接物)，Leuk Lymphoma 45:257-64, 2004。这些观测结果表明PDC是对病毒感染和癌症的适应性免疫应答的“跳跃式启动剂(jump-starter) ”。
作为免疫刺激剂的TLR9和CpG
TLR家族由识别微生物DNA和RNA结构的13种不同受体组成。已发现在pDC、mDC、B细胞和巨噬细胞的激活中，TLR激动剂发挥必不可少的作用。因其在直接应答CpG刺激的pDC和B细胞中的选择性表达，TLR9是最特异的人TLR。到目前为止，已鉴定出三类CpG TLR激动剂。硫代磷酸B-类CpG例如CpG7909，刺激B细胞和NK细胞但仅自pDC诱导中等量的IFN- α。相比之下，A-类CpG例如0DN2336和0DN2216，自pDC诱导极高量的I型IFN并高度刺激NK，但几乎没有B细胞刺激能力。在小鼠和人中A-类CpG配体0DN2216激活pDC-口 NK 细胞。Vollmer J. , Progress in Drug Development of Tmmunns timula tory CpGOligodeoxynucleo ti de Ligands For TLR9 (TLR9的免疫刺激性CpG寡脱氧核苷酸配体的药物开发进展)，Expert Opin Biol Ther 5:673-82，2005 ；Colonna, Μ. , TLR Pathwaysand IFN-Regulatory Factors: To Each Its Own (TLR途径和 IFN-调控因子各自针对其自身)，Eur J Immunol 37:306-9, 2007。这些细胞随后激活mDC，诱导肿瘤抗原-特异性的⑶8应答。参见图1。重要的是，我们已证明瘤内注射CpG-活化的pDC导致远端肿瘤的免疫排斥。Liu C Plasmacy to id Dendri tic Cells Induce NK Cell-Dependent, TumorAntigen-Specific T Cell Cross-Priming and Tumor Regression in Mice (小鼠中衆细胞样树突细胞诱导NK细胞依赖性的肿瘤抗原特异性的T细胞的交叉引发和肿瘤消退)，JClin Invest 118:1165-75， 2008。靶向协同刺激途径
尽管有大量浸润肿瘤的CD8 T细胞，但很多黑素瘤仍是免疫疗法难以治疗的。免疫治疗失败的主要机制之一是肿瘤内的免疫抑制微环境。Lizee G等，Improving AntitumorTmmiine Responses by Circumventing Immunoregulatory Cells and Mechanisms (通过避开免疫调节细胞及机理来提高抗肿瘤免疫应答)，Clin Cancer Res 12:4794-803,2006 ;Liizee G 等，Immunosuppression in Melanoma Tmmunntherapy: PotentialOpportunities for Intervention (黑素瘤免疫治疗中的免疫抑制干预的潜在机会)，Clin Cancer Res 12:2359s_65s， 2006。我们已经表明(i)⑶8 CTL是导致肿瘤消退的主要因素，消耗⑶8 T细胞显著降低CpG的治疗效果；和(ii) CD8 T细胞是多种免疫调节剂的效应细胞群，所述免疫调节剂包括抗-CTLA-4抗体和抗-0X40抗体。Liu C，Lou Y，Lizee G等，Plasmacytoid Dendri tic Cells Induce NK Cell-Dependent，Tumor An ti gen -Sped fi cT Cell Cross -Priming and Tumor Regression in Mice (小鼠中衆细胞样树突细胞诱导NK细胞依赖性的肿瘤抗原特异性的T细胞的交叉引发和肿瘤消退)，J Clin Invest118:1165-75，2008 ；Croft M 等，The Significance of 0X40 And 0X40L to T-CellBiology and Immune Disease (0X40和0X40L对T-细胞生物学和免疫疾病的重要性)，Immunol Rev 229:173-91，2009 ；Redmond WLj Ruby CE，Weinberg ADj The Role Of0X40~Media ted CoStimula ti on in T-Cell Activation and Survival (OX4O 介导的共剌激在T-细胞的激活和生存中的作用)，Crit Rev Immunol 29:187-201，2009。TNF家族配体限定T细胞记忆的小生境(niche)。Trends Immunol 28:333-9， 2007。这些结果形成将TLR-激动剂和靶向免疫协同剌激途径的试剂联合的基础(基本原理)。参见图2。已将阻断负协同剌激信号用于抗肿瘤治疗。使用针对CTLA_4(其为T细胞上抑制最初的T-细胞活化和增殖的分子)的阻断抗体的临床试验，已在激活宿主对黑素瘤的免疫应答方面取得了一些成功。Montoya M 等，Type I Interferons Produced By DendriticCells Promote Their Phenotypic and Functional Activation (由树突细胞产生的 I 型干扰素提高了其表型和功能的激活)，Blood 99:3263-71, 2002 ;Apostolou I等，
of Regulatory T Cells With Known Specific!ty For Antigen (具已知抗原特异性的调控性 T 细胞的起源)，Nat Immunol 3:756-63，2002 ；Bjorck P.，The Mul ti facetedMurine Plasmacytoid Dendritic Cell (多层面的鼠衆细胞样树突细胞)，Hum Immunol63:1094-102，2002。但是，阻断CTLA-4对多种T-细胞应答的程度具有深远的影响，而自身免疫是主要的副作用。在T-细胞(尤其是肿瘤位点的浸润肿瘤的淋巴细胞)的激活过程中和激活之后运行的抑制其它负协同剌激信号进一步定向的方法，是为治疗目的而操纵这些负信号的另一种方法。在T细胞上表达的B7家族的分子及其受体是阻碍对肿瘤进行有效免疫应答的“关闭”机制之一。Martin-Orozco N，Dong C·，New Battlefields forCostimulation (协同剌激的新场所)，J Exp Med 203:817-20，2006 ；Martin-0rozco N，Dong C.1nhibitory Costimulation and An t1-Tumor Immunity (抑制性协同剌激和抗肿瘤免疫)，Semin Cancer Biol 17:288-98，2007。近来阐述了几种新的B7分子及其作为T细胞的负调控物的功能，所述B7分子包括 B7S1、B7S3 和 B7H3。Prasad，m 等，B7S1，A Novel B7 Family Member ThatNegatively Regulates T Cell Activation (负调控 T 细胞活化的 B7 家族新成员 B7S1)，Immunity 18:863—73，2003 ；Sica GL 等，B7-H4，a Molecule Of The B7Family，Negatively Regulates T Cell Inmunity (负调控 T 细胞免疫的 B7 家族的分子 B7-H4)，Immunity 18:849-61，2003 ;Zang，\ 等，B7x:A Widely Expressed B7 FamilyMember That Inhibits T Cell Activation, (B7x :抑制 T 细胞活化的广泛表达的 B7 家族成员)，Proc Natl Acad Sci USA 100:10388-92，2003。这些新分子在淋巴和非淋巴组织尤其是在APC中广泛表达。亦发现这些分子中的一些在肿瘤中被上调，例如SZSi存在于源于卵巢、乳房、肾脏和肺组织的肿瘤中。Prasad，等，B7S1，A Novel B7 FamilyMember That Negatively Regulates T Cell Activation (负调控 T 细胞活化的 B7 家族新成员 B7S1)，Immunity 18:863-73，2003 ；Krambeck KE等，B7-H4 Expression in RenalCell Carcinoma And Tumor Vasculature: Associations with Cancer Progression andSurvival (肾细胞癌和肿瘤脉管系统中B7-H4的表达与癌症进展和存活的相关性)，Proc Natl Acad Sci USA 103:10391-6，2006 ；Tringler 义等，B7-H4 Overexpressionin Ovarian Tumors (卵巢肿瘤中 B7-H4 的过表达)，Gynecol Oncol 100:44-52，2006 ；Tringler B 等，B7—H4 is Highly Expressed in Ductal And Lobular Breast Cancer(B7-H4在导管和小叶乳腺癌中高表达)，Clin Cancer Res 11:1842-8, 2005。阻断这些B7分子有效提高了 T-细胞的增殖和体外IL-2的产生，增加了体内自体反应性T细胞。Prasad, W 等，B7S1，A Novel B7 Family Member That Nega ti vely Regula tes T Cell
Activation (负调控 T 细胞活化的 B7 家族新成员 B7S1)，Immunity 18:863-73，2003。在转移性黑素瘤的小鼠模型中在T-细胞疫苗接种期间阻断B7S1，似乎基本上保护小鼠免于肿瘤发展，且完全保护存活的小鼠免于第二次肿瘤攻击(未发表数据)。与TLR激动剂协作的靶向B7分子可在治疗人黑素瘤中有巨大的治疗价值。因此，靶向激活协同刺激分子例如0X40、⑶40和4-1BB，是增强T-细胞激活以提高T-细胞-介导的抗肿瘤应答的另一选择。先前发表的关于通迎的研究显示了其在增强所述T-细胞的诸如增殖、细胞因子的产生和存活等效应功能的重要性，并且已发现通过0X40来刺激是记忆T-细胞的发育中所必不可少的。Croft, M. , The Role of TNF SuperfamiIyMembers in T-Cell Function and Diseases (TNF超家族成员在T_细胞功能和疾病中的作用)，Nat Rev Immunol 9:271-85, 2009。具体到肿瘤微环境，已发现全身性给予激动剂抗-0X40抗体降低了调控T细胞的数量，其功能为抑制效应T细胞的活性并增加肿瘤内CD8+ T细胞的数量。Redmond WL, Ruby, CE和Weinberg, AD, The Role of 0X40~MediatedCo-stimulation in T-Cell Activation and Survival (在 T-细胞的激活和生存中 0X40介导的共刺激的作用)，Crit Rev Immunol 29:187-201, 2009。在其它肿瘤系统例如肉瘤、结肠直肠癌和乳腺癌的小鼠模型中使用的针对小鼠0X40的激动剂抗体，显示出显著
Redmond, WL Ligation of the 0X40 Cos timula tory Receptor ReversesSelf-Ag and Tumor-1nduced CD8 T-Cell Anergy In Vivo (连接 0X40 协同刺激受体逆转了体内自身抗原和肿瘤诱导的⑶8 T-细胞无反应性)，Eur J Immunol 39:2184-94,2009 ；Song k等,0X40 and Bcl-xL Promote The Persistence Of CD8 T Cells To RecallTumor-Associated Antigen (0X40和Bcl_xL促进⑶8 T细胞调用肿瘤相关抗原的持久性)，J Immunol 175:3534-41， 2005。先前已发现⑶40在B细胞激活、增殖和抗原提呈以及在树突细胞激活和抗原提呈中起重要作用。Croft, M. , The Role of TNF Super family Members in T-Cell Functionand Diseases (TNF超家族成员在T-细胞功能和疾病中的作用)，Nat Rev Immunol9:271-85, 2009。已发现针对⑶40的激动剂抗体克服了⑶4+ T细胞耐性并增强了 T细胞的细胞毒性。引人关注的是，CD40在大致70%的实体恶性肿瘤中表达，包括乳腺癌、结肠癌、肺癌和前列腺癌以及黑素瘤。Hurwitz AA, Kwon ED, van Elsas A. , Cos timula toryWars: The Tumor Menace (协同刺激战争肿瘤胁迫)，Curr Opin Tmmunol 12:589-96，
2000。已在癌症的多种鼠模型中评估了激动剂抗-CD40抗体，但是具体到黑素瘤，发现所述抗体仅减缓肿瘤的生长。Melief, CJ. , Cancer iimunotherapy by Dendritic Cells (树突细胞的癌症免疫治疗)，Immunity 29:372-83, 2008。正在用靶向多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、黑素瘤和慢性淋巴细胞白血病的激动剂抗体进行I期临床试验。Schattner，EJ. , CD40 Ligand in CLL Pathogenesis and Therapy (在CLL发病机制和治疗中的CD40配体)，Leuk Lymphoma 37:461-72，2000。已表明4-1BB可增强T细胞的细胞因子产生、增殖和细胞毒性活性。其在建立记忆CTL中亦起必不可少的作用。在肉瘤和肥大细胞瘤小鼠模型中，激动剂抗体可根除建立的肿瘤。Lynch, DH. , The Promise of 4_1BB (CD 137) -Media ted Immunomodula ti on andthe Immunotherapy of Cancer, (4-1BB (0)137)-介导的免疫调节和癌症的免疫治疗的前景)，Immunol Rev 222:277-86, 2008。引人关注的是，在小鼠中，激动剂抗-4-1BB抗体可 发挥改善自身免疫状况和限制免疫治疗的自身免疫副作用的作用。同前。虽然已充分研究了基于单独的TLR激动剂或抗体治疗的癌症治疗，但却没有研究联合TLR激动剂和抗体治疗的最佳策略，尽管这有很大潜力。最后，在给予IL-2和IFN-α至黑素瘤患者中所观察到的临床上的中等成功，留下了改进的空间，所述改进可能是通过加入TLR-激动剂。IFN-α是在晚期黑素瘤中第一个显示抗肿瘤活性的外源性细胞因子。1995年，IFN-α的不同重组形式INF-2 β ,成为首个FDA批准的辅助治疗II Β/ΙΙΙ期黑素瘤的免疫疗法。Kirkwood JM等,Akri Generation ofImmunotherapy for Melanoma (黑素瘤的下一代免疫疗法)，J Clin Oncol 26:3445-55,2008。研究显不高剂量的IFN-2 β显著降低了复发风险。Kirkwood ]y[等，Meehan isms andManagement of Toxicities Associated with High-Dose In terferon alfa~2b Therapy
(与高剂量干扰素a-2b治疗有关的毒性的机理和控制)，J Clin Oncol 20:3703-18，2002。第二种显示针对黑素瘤的抗肿瘤活件的外源件细胞因子IL-2,于1998年被FDA批准用于治疗患有晚期转移性黑素瘤的成人。Phan GQ等，Factors Associated with Responseto High-Dose Interleukin-2 in Patients with Metastatic Melanoma (在转移性黑素瘤患者中与对高剂量的白细胞介素-2应答有关的因子)，J Clin Oncol 19:3477-82,
2001。IL-2在免疫调节和T-细胞增殖中发挥重要作用。在晚期转移性黑素瘤患者中，表明高剂量静脉内推注IL-2显示具有抗肿瘤作用。Stoutenburg JP, Schrope B和Kaufman, HL, Adjuvant Therapy for Malignant Melanoma (恶性黑素瘤的辅助治疗)，Expert Rev Anticancer Ther 4:823-35，2004 ；Rosenberg SA 和 White, DE. , Vitiligoin Patients with Melanoma: Normal Tissue Antigens can be Targets for CancerImmunotherapy (黑素瘤患者中的白癜风正常组织抗原可为癌症免疫治疗的靶标)，JImmunother Emphasis Tumor Tmmunol 19:81-4，1996。这些 II 期研究的追溯性长期分析显示客观应答率为16%，持久应答率为4%，这表明建立了记忆T-细胞应答。Kirkwood JM等，Next Generation of Immunotherapy for Melanoma (黑素瘤的下一代免疫疗法)，JClin Oncol 26:3445-55， 2008。用于递送CpG的纳米颗粒
CpG作为有效的和肿瘤-特异性的免疫刺激剂在临床上应用的主要障碍是需要有效的递送系统。通过静脉内注射给予的游离CpG以及其它稳定的硫代磷酸寡核苷酸会随着广泛的组织分布而被迅速清除。Link撒等，Oligodeoxynucleotide CpG 7909 Deliveredas Intravenous Infusion Demonstrates Immunologic Modulation in Patients VithPre viously Trea ted Non -Hodgkin Lymphoma (以静脉输注递送的寡脱氧核苷酸CpG7909在先前治疗过的非霍奇金淋巴瘤患者中显示免疫调节)，J Immunother 29:558-68，2006 ；Wang H 等，Inmunomodulatory Oligonucleotides as Novel Therapy for BreastCancer: Pharmacokine ti cs, In Vitro And In Vi vo Anticancer Acti vi ty, andPotentiation Of Antibody Therapy (作为乳腺癌的新型疗法的免疫调节的寡核苷酸药代动力学、体外和体内抗癌活性和抗体治疗的增强)，Mol Cancer Ther 5:2106-14，2006 ；Yu RZ 等，Comparison of Pharmacokinetics and Tissue Disposition of anAnti sense Phosphorothioate O ligonucleotide Targeting Human Ha-Ras mRNA in Mouseand Monkey (在小鼠和猴中祀向人Ha-Ras mRNA的反义硫代磷酸寡核苷酸的药代动力学和组织分布的比较)，J Pharm Sci 90:182-93，2001。认为这促成以下所观测到的在人志愿者中全身给予游离CpG未能引发可察觉的免疫应答；和诱导可能有害的对免疫系统的非特异全身性激活。Krieg AM 等，Induction of Systemic THl-Like Innate Immunity inNormal Volunteers Following Subcutaneous but not Intravenous Administration OfCPG 7909，A Synthetic B-Class CpG Oligodeoxynucleotide TLR9 Agonist (正常志愿者皮下而非静脉内给予合成的B-类CpG寡脱氧核苷酸TLR9激动剂CPG 7909后的全身性THl-样先天性免疫的诱导)，J Immunother 27:460-71，2004 ；Krieg AM. Therapeuticpotential of Toll-like Receptor 9 Activation (Toll-样受体 9 激活的治疗潜能)，Nat Rev Drug Discov 5:471-84， 2006。纳米技术提供了使CpG靶向APC的可能性，特别是靶向肿瘤中的pDC。全身性给予之后，含有CpG的纳米颗粒通常发挥出比游离CpG更好的免疫治疗活性，这是由于APC对CpG纳米颗粒的天然聚集能力和贮库作用，其中CpG在作用位点的持久性将提供增强的活性。Whitmore WA 等，Systemic Administration of LPD Prepared With CpgOligonucleotides Inhibits the Growth of Established Pulmonary Metastases ByStimulating Innate and Acquired An ti tumor Immune Responses (全身给予用 Cpg 寡核苷酸制备的LPD通过剌激先天性和获得性抗肿瘤免疫应答来抑制建立的肺转移的生长)，Cancer Immunol Immunother 50:503—14， 2001 ；Sakurai F 等，Therapeutic Effect ofIntravenous Deli very of Lipoplexes Containing The In terferon-[Be ta] Gene AndPoly1: Poly C In A Murine Lung Metastasis Model (在鼠肺转移模型中静脉内递送含有干扰素-[β ]基因和聚/ :聚C的Lipoplex的疗效)，Cancer Gene Ther 10:661-8;Higgins R等，Growth Inhibition Of An Orthotopic Glioblastoma In InmunocompetentMice By Cationic Lipid-DNA Complexes (阳离子脂质-DNA复合物对免疫活性小鼠中原位胶质母细胞瘤的生长抑制)，Cancer Immunol Immunother 53:338-44，2004。迄今为止，已测试了皮下给药途径，表明在黑素瘤动物模型中用一些CpG纳米颗粒导致显著增加的免疫剌激和抗肿瘤活性。de Jong S 等，Encapsulation in Liposomal NanoparticlesEnhances The Immunos timula tory, Adjuvant and An t1-Tumor Acti vi ty ofSubcutaneously Administered CpG ODN (在脂质体纳米颗粒中包封增强皮下给予的CpGODN 的免疫刺激、佐剂和抗肿瘤活性)，Cancer Tmmunol Immunother 56:1251-64，2007 ；Standley SM ^, Incorpora ti on of CpG Oligonucleo ti de Ligand Into Pro tein~LoadedParticle Vaccines Promo tes Anti gen -Sped fi c CD8 T-Cell Immunity ( ^ CpG 寡核苷酸配体纳入装载蛋白质的颗粒疫苗中提高抗原-特异性的CD8 T-细胞免疫)，Bioconjug Chem 18:77-83， 2007 ；Li WM, Bally MB, Schutze-Redelmeier MP, EnhancedImmune Response To T-1ndependent Antigen By Using CpG OligodeoxynucleotidesEncapsula ted In Liposomes (通过使用脂质体包封的CpG寡脱氧核苷酸提高对T-非依赖性抗原的免疫应答)，Vaccine20:148-57，2001 ；Bourquin C 等，TargetingCpG Oligonucleo ti des to the Lymph Node by Nanopar ti cles Elicits EfficientAntitumoral Iimunity (由纳米颗粒将CpG寡核苷酸祀向淋巴结引发有效的抗肿瘤免疫)，J Immunol 181:2990-8, 2008。但是，皮下CpG纳米颗粒通常需要将肿瘤相关抗原(TAA)共同引入到CpG纳米颗粒中，以诱导肿瘤-特异性的CTL应答。另一方面，在TAA存在下或紧密接近TAA时，肿瘤内或肿瘤旁给予可允许自肿瘤本身发出TLR9 “危险信号”。在我们的初步研究中，在黑素瘤动物模型中，直接瘤内注射游离CpG已显示有前 景。此外,瘤内注射聚合物-CpG缀合物已显示出比瘤内注射游离CpG更好的抗肿瘤活性。这些鼓舞人心的初步数据引导我们假设递送至肿瘤的聚合物-CpG缀合物可显著提高抗肿瘤免疫应答而不激活全身性免疫，其中所述聚合物-CpG缀合物直接暴露在特异性的肿瘤微环境和免疫细胞群中。最终，杀死黑素瘤患者的是转移性疾病。因此，在理想的情形下，应全身递送CpG以便该TLR9激动剂有机会深入黑素瘤转移灶。挑战是获得局部免疫激活而不诱导全身性免疫应答。纳米技术提供了实现这一目标的极好机会。迄今为止，尚未研究肿瘤-选择性递送CpG纳米颗粒。在所提出的这项工作中，我们意欲配制和评估靶向黑素瘤以诱导肿瘤-特异性的免疫应答的水溶性聚合物_CpG。作为药物载体的L-PG
L-PG的独特性在于其是由通过酰胺键主链连接在一起的天然存在的L-谷氨酸组成。L-谷氨酸的每一重复单元中侧链自由Y-羧基在中性pH下带负电，这使得聚合物是水溶性的。羧基亦提供连接多种组分的官能团(functionality),所述多种组分包括药物分子和显像剂。参见图3。例如，我们实验室开发的L-PG-紫杉醇缀合物，在许多临床前动物肿瘤模型和早期I期试验中显示出显著抗肿瘤活性，其中紫杉醇在其2’-羟基通过酯键与L-PG共价连接0Li C等,Biodistribution of Paclitaxel and Poly (L-glutamic acid)-paclitaxelConjugate in Mice with Ovarian OCa-1 Tumor (紫杉醇和多聚(L_ 谷氨酸)-紫杉醇缀合物在患卵巢Oca-1肿瘤的小鼠中的生物分布)，Cancer Chemother Pharmacol46:416-22, 2000 ；Li C等，Antitumor Activity of Poly (L-glutamic acid) -pacli taxelon Syngeneic and Xenografted Tumors (多聚(L_谷氨酸)-紫杉醇对同源和异种移植肿瘤的抗肿瘤活性)，Clin Cancer Res 5:891-7，1999 ；Li C 等，Complete Regressionof Wel !-Established Tumors Using a Novel Water-soluble poly (L ~gl utamicacid) -paclitaxel Conjugate (使用新型水溶性多聚(L_谷氨酸)-紫杉醇缀合物使完全建立的肿瘤完全消退)，Cancer Res 58:2404-9，1998 ；Boddy AV 等，J Phase I andPharmacokine ti c Study of Pacli taxel Poliglumex (XYOTAX), Investigating Both3-Weekly and 2-Weekly Schedules (聚谷氨酸紫杉醇(XYOTAX)的I期和药代动力学研究研究每周3次和每周2次两种方案)，Clin Cancer Res 11:7834-40, 2005。在体外通过巨噬细胞-样细胞和在体内通过多种肿瘤将L-PG-紫杉醇降解为单谷氨酸紫杉醇和二谷氨酸紫杉醇。Shaffer SA等,// Vitro and In Vivo Metabolism ofPacli taxel Poliglumex:1dentification of Metaboli tes and Active Pro teases (聚谷氨酸紫杉醇的体外和体内代谢代谢产物和活性蛋白酶的鉴定)，Cancer ChemotherPharmacol 59:537-48, 2007。半胱氨酸蛋白酶组织蛋白酶B是肿瘤中L-PG降解的重要介导物，但其它蛋白降解途径亦有贡献。Shaffer SA等,J/ Vitro and In Vivo Metabolismof Pacli taxel Poliglumex:1dentification of Metabolites and Acti ve Pro teases(聚谷氨酸紫杉醇的体外和体内代谢代谢产物和活性蛋白酶的鉴定)，Cancer ChemotherPharmacol 59:537-48，2007 ；Melancon MP 等，J Novel Method for Imaging In VivoDegradation of Poly(L-Glutamic Acid), a Biodegradable Drug Carrier (用于生物可降解的药物载体一多聚(L-谷氨酸)的体内降解的新型成像方法)，Pharm Res 24:1217-24, 2007。这种基于L-PG的抗癌剂是首个已经进行到III期临床研究的合成
M ^lo Li C, Wallace S. , Polymer-Drug Conjugates: Recent Development InClinical Oncology (聚合物-药物缀合物临床肿瘤学的最新进展)，Adv Drug DelivRev 60:886-98, 2008。L-PG是水溶性的、生物可降解的且无毒性的。通用化学可用于合成基于PG的聚合物，且具有完全受控的分子量、降解性和电荷。这些特征使得L-PG成为作为CpG载体以及用于了解聚合物载体和CpG的免疫刺激活性之间的结构-活性关系的特别有前景的候选物。作为黑素瘤治疗靶标的黑皮质素I型受体和酪氨酸酶
黑皮质素I型受体(MClR)在黑素瘤细胞中过量表达。Giblin細等，Design andCharac teriza ti on of Alpha-Melanotropin Peptide Analogs Cyclized Through Rheniumand Technetium Metal Coordination (通过铼和锝金属配位而环化的α-促黑素细胞激素肽类似物的设计和表征)，Proc Natl Acad Sci USA 95:12814-8，1998 ；Miao Y,Benwell K, Quinn TP. , 99mTc~ and lllln-labeled Alpha-Melanocytes timula tingHormone Pep ti des as Imaging Probes for Primary and Pulmonary MetastaticMelanoma Detection (99mTc_和IllIn-标记的α -促黑素细胞激素肽作为用于检测原发性和肺转移性黑素瘤的成像探针)，J Nucl Med 48:73-80, 2007 ；Lopez MN等，Melanocortin I Receptor is Expressed by Uveal Malignant Melanoma and can beConsidered a New Target for Diagnosis and Immunotherapy (由葡萄膜恶性黑素瘤表达黑皮质素I受体并可作为诊断和免疫治疗的新祀标)，Invest Ophthalmol Vis Sci48:1219-27， 2007。小分子量肽[Nle4，D-Phe7] α -促黑素细胞激素(“NDP-MSH”)是MClR的有效激动剂，其与 MClR 以高亲和力(IC5tl= O. 21 ηΜ)结合。Chen J 等，Melanoma-Targeting·Properties of (99m) Technetium-Labeled Cyclic Alpha-MelanocyteStimulatingHormone Pep ti de Analogues ((99m)锝标记的环状α -促黑素细胞激素肽类似物的黑素瘤 _祀向特性)，Cancer Res 60:5649-58，2000 ； Sawyer Ι 等，4_Nor I euc ine，7 ~D~Ph enylalan ine~Alpha -Melan ocyte~S timula ti ng Hormone: A Highly PotentA Ipha -Melano tropin With Ultralong Biological Acti vi ty (4_ 正亮氨酸、7_D_ 苯丙氨酸-α -促黑素细胞激素具有超长生物活性的高效α -促黑素细胞激素)，Proc NatlAcad Sci USA 77:5754-8，1980。已提出将NDP-MSH和其它a-MSH类似物作为黑素瘤-预防性药剂，其通过防止黑素细胞向黑素瘤的恶性转化来发挥作用。Abdel-Malek ZA等，The Melanocortin I Receptor and The UV Response of Human MelanocytesA ShiftIn Paradigm (黑皮质素I受体和人黑素细胞的UV应答一示例性的转变)，PhotochemPhotobiol 84:501-8, 2008。最近，我们让NDP-MSH与中空金纳米颗粒(直径约40 nm)缀合，在静脉内注射后用光学和正电子成像术两种成像技术，已显示MClR介导金纳米颗粒主动革巴向 B16 黑素瘤。Lu ff, Xiong C，Zhang G 等，Targeted Photothermal Ablation ofMurine Melanomas wi th MelanocyteSt imula ting Hormone Analog-Conjugated HollowGold Nanospheres (用缀合促黑素细胞激素类似物的中空纳米金球对鼠黑素瘤的靶向光热切除)，Clin Cancer Res 15:876-86, 2009。静脉内注射后，注射剂量的约12. 6%被递送至B16黑素瘤，这显著多于递送至脾脏的剂量(4%)。这些数据表明NDP-MSH是用于靶向递送纳米颗粒至黑素瘤的极好寻靶配体。
将纳米颗粒靶向肿瘤-相关受体虽然有吸引力，但不能完全避免肝和脾中吞噬细胞对纳米颗粒的摄取。在理想情况下，CpG纳米颗粒在肿瘤特异性的酶的作用下仅可在肿瘤位点释放CpG。以这种方式，在器官而不是肿瘤中，CpG-诱导的免疫效应细胞的激活将大幅降低，即使一些注射纳米颗粒分布在这些器官(即肝和脾)中亦如此。在抗体定向的酶前药治疗(“ADEPT”)方案中癌症的化学疗法已经利用了这一方法。Jungheim L, ShepherdT. , Design of Anti tumor Prodrugs: Substrates for Antibody Targeted Enzymes (抗肿瘤前药的设计用于祀向抗体的酶的底物)，Chem Rev 94:1553-66, 1994。但是，由于抗体-酶缀合物可与其它组织非特异性结合，ADEPT方法有其自身的局限性。幸运的是，可能依赖酪氨酸酶这种酶，酪氨酸酶已经存在于黑素瘤细胞中，其与黑素细胞有着独特的关系。当黑素细胞变成恶性时，表达酪氨酸酶的基因变得上调，导致癌细胞中酪氨酸酶的水平显著增力口° Land EJ, Ramsden CA, Riley PA, Quinone Chemistry and Melanogenesis(醌化学和黑素生成)，Methods Enzymol 378:88-109，2004 ；Riley PA. , Melanogenesisand Melanoma (黑素生成和黑素瘤)，Pigment Cell Res 16:548-52，2003。因此，由于酪氨酸酶天然存在于肿瘤中并事实上不存在于其它细胞中，其提供了内置式的药物靶向机制。Alena F，Jimbow K, Ito S·，Melanocytotoxicity and An time lanoma Effectsof Phenolic Amine Compounds in Mice In Vivo (小鼠体内酌■胺化合物的黑素细胞毒性和抗黑素瘤作用)，Cancer Res 50:3743-7，1990 ；Jordan 狐等，Melanocyte-DirectedEnzyme Prodrug Therapy (MDEPT):Development of Second Generation Prodrugs ForTargeted Treatment of Malignant Melanoma (黑素细胞定向的酶前药治疗(MDEPT)用于靶向治疗恶性黑素瘤的第二代前药的开发)，Bioorg Med Chem 9:1549-58，2001 ；Jordan ,Melanocyte-directed Enzyme Prodrug Therapy (MDEPT): Development ofa Targeted Treatment for Malignant Melanoma (黑素细胞定向的酶前药治疗(MDEPT)开发针对恶性黑素瘤的靶向治疗)，Bioorg Med Chem 7:1775-80, 1999 ；Knaggs S等，New Prodrugs Derived from 6-amino dopamine and 4-aminophenol as Candidatesfor Melanocyte-Directed Enzyme Prodrug Therapy (MDEPT)(衍生自 6_ 氨基多巴胺和4-氨基苯酚的新型前药作为黑素细胞定向的酶前药治疗(MDEPT)的候选物)，OrgBiomol Chem 3:4002-10，2005 ；Morrison ME, Yagi MJj Cohen G.，In Vitro Studies of2，4-Dihydroxyphenylalanine, A Prodrug Targeted Against Malignant Melanoma Cells(靶向恶性黑素瘤细胞的前药2，4-二羟苯丙氨酸的体外研究)，Proc Natl Acad Sci USA82:2960-4, 1985。亦测试了用于治疗黑素瘤的很多酪氨酸酶-依赖性的前药。例如，经由环化-药物释放机制，利用酪氨酸酶以介导自氨基甲酸酯和尿素前药释放细胞毒素剂。Jordan 碰等，Melanocyte-Directed Enzyme Prodrug Therapy(MDEPT): Development of Second Generation Prodrugs For Targe ted Treatmentof Malignan t Melanoma (黑素细胞定向的酶前药治疗(MDEPT):用于靶向治疗恶性黑素瘤的第二代前药的发展)，Bioorg Med Chem 9:1549-58，2001 ;Jordan AM 等，Melanocyte-directed Enzyme Prodrug Therapy (MDEPT): Development of a Targe tedTreatment for Malignant Melanoma (黑素细胞定向的酶前药治疗(MDEPT):恶性黑素瘤 的靶向治疗的开发)，Bioorg Med Chem 7:1775-80, 1999。但是，尚未使用所述机制来递送免疫刺激剂。初步结果
瘤内注射CpG比全身性注射更好
如图4所示，我们发现瘤内注射CpG显著降低了 B16F10肿瘤的生长，而这种作用在腹膜内注射CpG中没有观察到。我们亦发现CpG与癌症疫苗联合的途径是关键性的。虽然静脉内注射CpG能够诱导肿瘤抗原-特异性的T-细胞应答的激活和扩增，但大多数激活后的T细胞无法迁移至肿瘤。相比之下，瘤内注射CpG导致抗原-特异性T细胞的广泛的肿瘤浸润。这些结果导致我们推断CpG在局部起作用，并且必须集中在肿瘤位点。增强CpG的免疫刺激效力和抗肿瘤功效
使用皮下小鼠B16黑素瘤模型，我们证明与用游离CpG作为针对已建立的肿瘤的独立药剂相比，瘤内注射L-PG-CpG缀合物触发显著更强的抗肿瘤活性，导致抑制肿瘤生长(图5A)。与游离CpG相比，L-PG-CpG显著增强了对肿瘤-非特异性的⑶8 T-细胞群的激活。有意义的是，尽管游离CpG诱导全身性免疫效应NK细胞的非特异性激活，但PG-CpG却不能(图5C)。这些结果表明L-PG-CpG增强了 CpG的免疫刺激效力和抗肿瘤功效而不导致全身性免疫应答。尚未完全了解增强CpG的免疫效力和介导L-PG-CpG的强烈抗肿瘤作用的机制，但是若干因素可促成这种活性，包括(i)贮库作用，PG-CpG藉此在延长的时间内驻留在肿瘤中，CpG从其注射位点缓慢释放；(ii)增强CpG至肿瘤内的pDC和APC的递送；(iii)L-PG-CpG和用于抗原呈递的肿瘤内肿瘤抗原的共定位。自发的肿瘤细胞死亡/重塑可提供“危险”信号，这可形成L-PG和肿瘤相关抗原之间的物理联系，导致抗癌免疫力增强。我们已实施了若干初步研究来评估这些可能方案的潜在贡献。递送系统增加了瘤内注射后的肿瘤内驻留
为评价L-PG的体内分布和肿瘤内分布，我们使用了近红外荧光(NIRF)成像，其中用L-PG-NIR (图3)作为L-PG-CpG的替代物，用111In-标记的L-PG-CpG进行放射自显影(图
6)。瘤内注射后，L-PG-NIR大部分驻留在注射位点。注射剂量的显著部分亦转运至引流淋巴结(图6A-C)。在B16黑素瘤中，与CpG相比，更多的111In-标记的L-PG-CpG驻留在肿瘤内，而且L-PG-CpG在整个肿瘤内的分布更加广泛，而CpG主要局限在肿瘤周围区域(图6D)。肿瘤内CpG治疗和靶向协同刺激途径的试剂联合增强抗肿瘤作用
我们对瘤内注射CpG和靶向协同刺激途径的全身性抗体治疗联合是否导致强烈抗肿瘤活性进行了研究。例如，我们的初步研究表明，0X40抗体和CpG的联合产生比单独的CpG显著更强的CTL应答和抗肿瘤作用(图7)。基于这些结果，我们进一步用如下所述的最好的纳米-CpG探索靶向正和负协同刺激分子二者的新方法，以提高T-细胞对黑素瘤的免疫力。静脉内给药后肝和脾对L-PG-CpG的摄取显著少于CpG
除鉴定在瘤内注射后具有显著免疫刺激活性的基于PG的纳米-CpG外，还开发了用于 肿瘤-特异性免疫应答而无全身性激活的基于PG的纳米-CpG。为测试可行性，我们进行了三个关键实验来解决以下问题1) L-PG是否可显著降低肝和脾中CpG的摄取；2)分布于肿瘤中的L-PG聚合物是否被肿瘤中的巨噬细胞摄取；和3)靶向黑素瘤细胞的L-PG-CpG是否被黑素瘤细胞处理以引发强烈免疫应答。在以下三个研究中总结了这些问题的答案。为比较静脉内注射后CpG与PG-CpG的生物分布，我们用111In (半衰期为3天的Y发射体)标记了这两种化合物。如图8所示，肝和脾对PG-CpG的摄取显著少于CpG。这一结果表明L-PG是全身给药后靶向递送CpG的有前景的纳米载体。静脉内注射后肿瘤相关巨噬细胞摄取L-PG聚合物
使用经Gd和NIR染料二者标记的L-PG-Gd-NIR (图3)，用磁共振和NIRF成像来非侵袭性监测组织和肿瘤内分布，我们发现通过静脉内途径给药后，PG-Gd-NIR被肿瘤相关巨噬细胞摄取(图9)。PG-Gd-NIR和CD-68+共同定位于裸大鼠的C6神经胶质瘤中(图9A)。此夕卜，消耗巨噬细胞导致肿瘤中PG-Gd-NIR的摄取显著减少(图9B-D)。定量研究显示用氯膦酸盐脂质体消耗巨噬细胞后，肿瘤区域的荧光强度降低超过100倍。该数据表明PG-Gd-NIR被递送至肿瘤中的巨噬细胞/APC。被B16黑素瘤细胞摄取和处理
我们合成MSH-L-PG-CpG来测试黑素瘤细胞经由受体介导的内吞作用摄取的L-PG-CpG是否可被处理并保持其免疫刺激活性。如图10所示，B16细胞摄取的MSH-L-PG-CpG能够释放活性CpG至培养基中来诱导小鼠脾细胞产生IFN-Y。用过量MSH肽共同处理的B16细胞阻断了 MSH-L-PG-CpG的摄取，消除了随后由脾细胞导致的IFN- Y产生，这暗示黑素瘤细胞能够处理MSH-L-PG-CpG并呈递活性CpG物质至肿瘤中的pDC。因此，这些结果证实了将CpG靶向黑素瘤细胞可作为用于诱导肿瘤-特异性免疫的新策略。引人关注的是，不含MSH的PG-CpG可被B16F10黑素瘤细胞有效摄取，这不依赖于MClR-介导的摄取。很明显，需要更多的研究来阐明黑素瘤细胞中L-PG-CpG和MSH-L-PG-CpG的细胞运输和处理。初步数据推论
归纳起来，我们的初步结果表明L-PG是用于治疗黑素瘤的免疫刺激TLR激动剂的有前景的新型CpG载体。通过延长其肿瘤驻留，L-PG可显著增强CpG的活性，并因此充当允许持续释放CpG的药物储库。包括巨噬细胞和DC在内的APC，大量积聚基于L-PG的聚合造影剂。亦有可能在黑素瘤-特异性的酪氨酸酶的作用下，将L-PG-CpG靶向黑素瘤细胞并产生“智能的(smart) ”基于L-PG的CpG递送系统来仅释放CpG,这可让肿瘤-特异性的CTL应答进一步增强。因为免疫系统是复杂的，有必要探索纳米-CpG与调节协同刺激途径及询问(interrogate)肿瘤微环境的其它分子的组合。通过这些组合方法，我们了解了肿瘤中普遍的局部免疫作用，并且可开发有效的抗肿瘤免疫疗法，可将所述抗肿瘤免疫疗法转移到临床上，以对黑素瘤患者的护理产生显著的积极作用。预示性实施例1
测定瘤内注射后PG-CpG对于其抗癌作用的最佳理化特性· 瘤内注射后,具有最佳理化性质的基于PG的CpG纳米构建物局部激活pDC，而不诱导全身性免疫应答，这导致有效的免疫治疗效果。基本原理和总体策略
在以上初步研究中，我们已表明瘤内注射L-PG-CpG比瘤内注射游离CpG的抗肿瘤活性显著增强。但是，未完全了解增强CpG的免疫效力和介导PG-CpG的强抗肿瘤作用的机制。若干因素可促成这种活性，包括(i)贮库作用，L-PG-CpG藉此在延长的时间内驻留在肿瘤内，且CpG从其注射位点缓慢释放；(ii)在肿瘤内增强将CpG递送至APC和DC ; (iii)在肿瘤内共同递送L-PG-CpG和TAA至DC。自发的肿瘤细胞死亡/重塑可提供TAA，其然后在肿瘤中形成L-PG聚合物和抗原之间的物理联系，导致抗癌免疫力增强。为了完全了解这些可促成L-PG-CpG的抗肿瘤活性增强的因素所起的可能作用，系统的方法是必要的。另外，期望获自这些类型的研究的数据，导致鉴别在瘤内注射基于PG的CpG纳米构建物后PG聚合物对激活有效的免疫效应细胞起关键作用的理化特性，这将有助于设计新一代改进的CpG递送系统。与将CpG掺合在纳米颗粒内的其它研究相比，让CpG与水溶性L-PG缀合，这可有利于确保以其完整形式，或作为因聚合物降解而致的活性物质，PG-CpG可容易地接近结合内体中的TLR9。具体而言，可通过系统性地检测聚合物的大小(分子量;MW)、电荷和降解性如何影响其在B16黑素瘤中的驻留和其在肿瘤pDC中的摄取，来研究瘤内注射PG-CpG增强抗肿瘤活性的作用机制。PG-CpG的肿瘤驻留和pDC对PG-CpG的摄取可与先天性和适应性免疫应答的增强有关联。下表I总结了为所提出的研究而合成和测试的基于PG的聚合物。包括单谷氨酸-CpG缀合物作为对照。期望瘤内注射后L-PG-CpG的肿瘤驻留受其MW支配，因为分子扩散系数的大小约为其MW的立方根的倒数。较小尺寸的分子可从注射位点迅速清除，而较大尺寸的大分子则大多数可以以极不均匀的肿瘤内分布限定在注射位点。另外，多聚阴离子PG和肿瘤中带正电荷的蛋白质之间的结合亲和力亦应该作为多聚阴离子链长度增加的函数而增加。自PG-CpG降解和释放CpG可通过两种方法开始聚合物主链降解；和在CpG与PG聚合物之间引入水解不稳定接头。因此，CpG可与不可降解的多聚(D-谷氨酸)(D-PG)及含L-酪氨酸和L-丙氨酸的L-PG共聚物[多聚(L-Glu-Tyr)和多聚(L-Glu-Ala)]缀合，所述 L-PG 共聚物比 L-PG 的降解更迅速。Chiu Vl-C 等，Lysosomal Degradability ofPoly (alpha-amino acids)(多聚(ct -氨基酸)的溶酶体降解性)，J Biomed Mat Res34:381-92, 1997。CpG亦可通过酸不稳定的接头与L-PG和D-PG缀合，这可在酸性的内体环境下迅速释放CpG。最后，让CpG与可降解但电荷中性的多聚(羟丙基L-谷氨酸)(L-PHPG)缀合，允许检测多聚阴离子L-PG-CpG和来自肿瘤本身的带正电荷的蛋白质之间的物理相互作用的可能作用。同前。因此，可检测CpG递送对体内先天性和适应性免疫应答二者的影响。但是，考虑到因免疫系统的复杂性，体外研究预测疫苗功效的能力有限，我们的焦点集中在用同基因的B16黑素瘤模型进行体内评估。在很多临床前的黑素瘤研究中一直使用C57BL/6小鼠的B16黑素瘤。弱免疫原性和B16细胞表达非常少量的MHC I类分子这一事实使得B16模型为基于T-细胞的免疫治疗的挑战性模型。Mansour 等，Therapyof Established B16-F10 Melanoma Tumors by a Single Vaccina tion of CTL/T HelperPeptides in VacciMax(R)(单独接种 VacciMax (R)中的 CTL/R 辅助肽对建立的 B16-F10黑素瘤肿瘤的治疗)，2007.第20页。采用了各种方法用于产生CTL对B16的应答，包括在纳米颗粒中共同递送分离的TAA和CpG。但是，我们提出的研究显著不同于这些其它研究，因为在其它研究中在注射之前没有纯化的TAA与PG-CpG的混合。应该使用来自肿瘤本身的更加接近实际的及临床相关的黑素瘤原位抗原
表1.待合成和测试的基于PG的聚合物
rSttSfWFSftScicli ;
I ff% l-C|iC丨 ΦΠ·丨{1I
Ii MW ^ 2κ ; V r 'ν^ρ1:
jFMw = κ...........1;
j L-PG-CpC fMW = 5 K—I
f -1iiiK......jj
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图11总结了靶化合物的结构。在於羟基苯并三唑存在下，可用1，3-二异丙基碳二亚胺-介导的在Boc-Glu(OH)-OtBu的侧链羧基和3’-NH2-CpG氨基之间的偶联反应来合成单体L-谷氨酸CpG。可用三氟乙酸除去所得产物的Boc和叔丁基保护基团。通常通过用溴化氢去除苄基保护基自多聚(L-谷氨酸Y-苄酯)(L-PBLG)获得L-PG。为制备同聚物和随机共聚物，三乙胺-引发的L-谷氨酸Y-苄酯(NCA-L-Glu)中的羧基酸酐(NCA)和相应氨基酸(即NCA-D-Glu、NCA-L-Tyr或NCA-L-Ana)的聚合是最常使用的方法。Li C·，Poly (L-glutamic acid)-■Anticancer Drug Conjugates(多聚(L-谷氨酸)一抗癌药物缀合物)，Adv Drug Deliv Rev 54:695-713, 2002。这种方法通常产生广泛丽分布(多分散性>2.0)的多聚氨基酸。过去十年报道了一些受控的NCA聚合作用，包括使用过渡金属络合物和六甲基二硅氮烷作为引发剂。Deming TJ.， Cobalt and Iron Initiators for the Controlled Polymerizationof Alpha-Amino Aci d-N~Carboxyanhydri des (用于 α -氨基酸-N-羧基酸酐的受控聚合作用的钴和铁引发剂)，Macromolecules 32:4500-2，1999 ；Lu H，Cheng J.，Hexame thyIdi si Iazane-Medi a ted Controlled Polymerization of Alpha-Amino AcidN-Carboxyanhydrides (六甲基二娃氮焼介导的α -氨基酸-N-羧基酸酐的受控的聚合作用)，J Am Chem Soc 129:14114-5, 2007。因为该方法可容易地提供具可预测MW和窄MW分布的多聚氨基酸，所以使用六甲基二硅氮烷作为引发剂的反应尤其有吸引力。因此，将该方法用于合成Glu = Tyr和Glu = Ala摩尔比为5:1的多聚(L-Glu-Tyr)和多聚(L-Glu-Ala)。Chiu等的研究表明L-Glu与L-Tyr和L-Ala的共聚物的降解比L-PG 的同聚物快约 3 倍。Chiu H-C 等，Lysosomal Degradabili ty of Poly (alpha-aminoacids)(多聚(ct -氛基酸)的溶酶体降解性)，J Biomed Mat Res 34:381-92，1997。为促进体外和体内成像研究，按照前面报道的程序让DTPA或适宜的荧光染料与不同MW的L-PG (MW = 2K、20K、50K 或 100Κ)、D-PG (MW = 50Κ)、多聚(L-Glu-Tyr) (MW = 50Κ)和多聚(L-Glu-Ala) (MW = 50Κ)缀合。可在最后阶段用水溶性的偶联剂(1-乙基_3_( 二甲基氨基丙基)碳二亚胺)在2-吗啉乙磺酸缓冲液中让3’ -氨基-CpG (0DC 2216)与这些缀合物缀合。Melancon MP 等，A Novel Method for Imaging In Vivo Degradation ofPoly (L-Glutamic Acid), a Biodegradable Drug Carrier (用于体内成像降解生物可降解的药物载体多聚(L-谷氨酸)的新型方法)，Pharm Res 24:1217-24, 2007 ；Melancon
MP Development of a Macromolecular Dual-Modality MR-Optical Imaging forSentinel Lymph Node Mapping (用于警戒淋巴结作图的大分子双重模态MR-光学成像的进展)，Invest Radiol 42:569-78，2007; Wen \ 等，Synthesis and Characterizationof Poly (L-glutamic acid) Gadolinium Chelate: A New Biodegradable MRI ContrastAgent (多聚(L-谷氨酸)钆螯合物的合成和表征生物可降解的新型MRI造影剂)，Bioconjug Chem 15:1408-15, 2004。可用Gd标记所得缀合物用于MRI，用111In标记所得缀合物用于核成像研究。染料的选择可视研究目的而定。对于体内成像，使用在813nm处发射荧光信号的NIR染料。对于流式细胞术研究，可选择FACS-相容的染料(即AlexaFluor488)。用装有superdex-75 SEC柱的AKTA快速蛋白液相色谱系统来纯化缀合物并用PBS缓冲液洗脱。对于L-PHPG-CpG合成，可通过3_氨基丙醇氨解L-PBLG来获得L-PHPG。用对-硝基氯甲酸酯活化L-PHPG的羟基后，可用胺终止的DTPA或染料分子经由氨基甲酸酯键来处理聚合物。然后可让CpG与聚合物缀合，接着是螯合Gd或111In以得到Gd-、mIn-或染料-标记的 L-PHPG-CpG (图 12)。自含CpG(其经由稳定的酰胺或氨基甲酸酯键与PG连接)的PG-CpG纳米构建物释放CpG，依赖于肿瘤中组织蛋白酶B和/或其它酶对PG主链的降解来释放单体和寡聚谷氨酸CpG。因为肿瘤与肿瘤之间和患者与患者之间酶的活性可不同，我们希望设计一个系统，其释放CpG不依赖酶的活性，而是依赖内吞溶酶体区室的酸性环境。这种方法可降低CpG递送中的变化，并增加CpG的细胞内递送。为达到该目的，我们通过酸敏感的缩酮接头将CpG接枝到L-PG和D-PG上(图11)。与pH为7. 4的胞质大不相同，内体和溶酶体存在于5. 0-6. 5的酸性pH值下。已在设计pH-应答的寡核苷酸和蛋白质疫苗的递送中米用了酸敏感的连接。Knorr V, Ogris M, Wagner E. , An Acid SensitiveKetal—based Polyethylene Glycol-Oligo e thylenimine Copolymer Media tes ImprovedTransfection Efficiency at Reduced Toxicity (酸敏感的基于缩酮的聚乙烯乙二醇-寡乙烯亚胺共聚物以低毒性介导提高的转染率)，Pharm Res 25:2937-45, 2008 ；Murthy N 等，Design and Synthesis of pH~responsive polymeric Carriers thatTarget Uptake and Enhance the Intracellular Deli very of Oligonucleo ti des (革巴向摄取和增强细胞内递送寡核苷酸的pH-应答的聚合物载体的设计和合成)，J ControlRelease 89:365-74，2003 ；Murthy N 等，J Macromolecular Deli very Vehicle forProtein-Based Vaccine: A ci d~Degradable Pro tein~Loaded Mi crogels (用于基于蛋白质的疫苗的大分子递送溶媒装载酸可降解的蛋白质的微凝胶)，Proc Natl Acad SciUSA 100:4995-5000， 2003。我们将在我们的设计中采用相似的缩酮接头来让CpG与L-PG和D-PG 二者缀合。此处包括D-PG以便可排除主链降解对CpG释放的可能作用。从丙酮-二 _(氨乙基)缩酮开始，我们将马来酰亚胺引入到二胺缩酮的一个末端以得到丙酮_(马来酰亚胺基氨乙基)缩酮。然后用碳二亚胺介导的偶联反应让该接头与PG缀合，接着将3’-SH-CpG与马来酰亚胺基接头连接。如前所述，让成像探针与聚合物缀合。表征
从下列几方面来表征所得聚合的缀合物1)共聚物的结构和组成比率；2)与每一聚合物连接的CpG、DTPA-Gd和染料的数量；3)丽和丽分布；和4)降解性。可通过1H-核磁共振来表征共聚物的组成比率。可通过从起始物质的量中减去反应混合物中回收的分子的量，来测定与每一聚合物连接的CpG、DTPA-Gd和染料的数量。需要时，亦可根据聚合物完全水解后的氨基酸分析来测定CpG、DTPA-Gd和染料分子的数量。可通过元素分析来测定Gd含量。可用装有记录折光率、粘度和光散射信号的Viscotek E-Zpm三元检测器的系统(Viscotek, Houston, TX)，通过凝胶渗透色谱法(GPC)来测量每一聚合的缀合物的MW和碼分布。在组织蛋白酶B存在和不存在下按照Wen等的方法用GPC来实施每一聚合的缀合物的酶降解。Wen \^，Synthesis and Charac teri za ti on of Poly (L ~glu tami c acid)Gadolinium Chelate: A New Biodegradable MRI Contrast Agent (新型生物可降解的MRI造影剂多聚(L-谷氨酸)礼螯合物的合成和表征)，Bioconjug Chem 15:1408-15,2004。随时间监测每一聚合的缀合物的峰面积的减少，并表示为“降解百分率”。通过在pH
5、pH 6和pH 7. 4下用高效液相色谱-质谱系统分析随时间变化的CpG释放，来研究PG-缩酮-CpG缀合物的水解降解。为评估新合成的CpG-结合的纳米构建物在体外的细胞摄取和运输及在瘤内注射至B16肿瘤后的体内驻留，可按照我们发表的实验方案自C57BL/6小鼠的骨髓产生巨噬细胞 ο Thapa P, Zhang G, Xia C ^,Nanoparti cle Formula ted A Ipha -Galac tosylcerami deActivates NKT Cells Without Inducing Anergy (a半乳糖神经酰胺制成的纳米颗粒激活NKT细胞而不诱导无反应性)，Vaccine 27:3484-8，2009。为研究聚合物-CpG的内化，可用荧光标记的聚合物脉冲巨噬细胞达I小时，固定，用针对EEA (早期内体标记)、甘露糖-6磷酸受体(晚期内体受体)和LAMPl (溶酶体标记)的单克隆抗体来染色。所有的抗体都来自Abeam (Cambridge, MA)。可通过共焦显微术来研究聚合物的共区域化和不同的内吞溶酶体标记。体内驻留、肿瘤内分布和降解
我们将使用核和MR成像技术来非侵袭性地评估B16黑素瘤中PG-CpG纳米构建物的驻留和分布(共11种制备物)(表I和图11)。仅用mIn标记的游离CpG作对照。用Gd/mIn对所有PG-CpG纳米构建物进行双重标记。在单次注射中通过瘤内注射将每种标记的试剂递送至C57BL/6小鼠皮下已长成的B16黑素瘤(直径6-8 mm) (100 μ Ci, 100 μ I)。在注射后的不同时间用Y-照相机对小鼠成像。可通过将目的区域放置在整个身体、肝/脾区域和肿瘤周围，来量化肿瘤中和身体其它部位的放射性。这允许我们测量在同一小鼠中随时间推移从肿瘤中清除的CpG和PG-CpG的量。因为MRI提供极好的空间分辨率，我们亦将使用MRI来监测不同时间点PG-CpG纳米构建物的肿瘤内分布。在成像期结束(注射后3天)时，杀死小鼠。移出肝、脾、引流淋巴结和肿瘤，计数其放射性。肿瘤驻留可表示为注射剂量的百分比。可对所有切除的肿瘤进行放射自显影研究。可通过测量放射性区域和整个肿瘤区的比率(以百分比表示)来分析肿瘤内分布的均匀性。可根据其肿瘤驻留(%)以及肿瘤内分布的程度(%)来对CpG和基于PG的CpG纳米构建物分等级。为检测聚合物在Β16黑素瘤中的生物降解，对每一切除肿瘤组织的一半进行处理，以便用NaCl晶体检测器监测柱中放射性完整聚合物和聚合物片段的洗脱来进行GPC分析。(12组X 10只小鼠)。评估瘤内注射后通过CpG和基于PG的CpG纳米构建物诱导的先天性免疫和获得 性免疫
体内细胞的摄取
为评价CpG-结合的PG纳米构建物在不同免疫细胞群中的摄取，可将图11中所示的L-Glu-染料单体和每一种PG-CpG-染料缀合物(染料=AlexaFluor 647)经瘤内注射至Β16肿瘤中(η = 10)。使用CpG-染料作为对照。可在1、3和7天之后，通过流式细胞术测量肿瘤、引流淋巴结和脾中⑶lie+ DC和⑶llb+F480+巨噬细胞对CpG的摄取。因为当聚合物分解时，与PG聚合物连接的荧光染料将自连接到同一聚合物链上的CpG解离，其直接报告聚合物或聚合物片段的细胞摄取。为此，我们亦将荧光标记的CpG (例如3’-NH2-CpG-AlexaFluor 647, Alpha DNA, Montreal, Canada)与图 11 所不的 PG 聚合物连接，用于对CpG和PG-CpG缀合物中的CpG的细胞摄取进行FACS研究。以下抗体将用于细胞标记对于DC为CDllc ;对于巨噬细胞，为CDllb和F480。另外，将在单核细胞谱系细胞中表达GFP的转基因小鼠(在鼠c-fms启动子的控制下)用作肿瘤移植受者，这允许我们在活体动物中用非侵袭性成像来研究NIR荧光染料标记的聚合物和单核细胞-巨曬细胞的共区域化。动物得自Jackson实验室(Bar Harbor,Maine)。局部细胞因子产生
用来自 R&D systems (Minneapolis, MN)的标准 ELISA 试剂盒来测量 IFN-α、IL-12和 IFN- Y。在B16黑素瘤中递送至APA激活pDC
用针对DC (⑶IIc+)和巨噬细胞(⑶llb+F480+)的抗体经多色流式细胞仪来研究聚合物至肿瘤APC的递送。通过用⑶69对pDC (BDCA2+)进行IHC染色来监测pDC的激活。肿瘤中黑素瘤-特异的⑶8+ T-细胞应答
作为OVA-特异性的四聚体(Pharmingen, San Jose, CA)来监测肿瘤-特异性的⑶8应答。全身性应答
通过测量包括IFN- α、IFN- Y、TNF- α和IL-12在内的细胞因子的血清水平来研究全身性应答。可用来自R&D systems的ELISA试剂盒或Luminex来测量所有细胞因子。
最终，在以上所有研究中，用不含CpG的L-PG (MW = 50K)作为对照。抗肿瘤活性的确认
研究瘤内注射后所有结合CpG的PG及单谷氨酸CpG (共11种化合物)的抗肿瘤活性。这是因为在体外测定(刺激淋巴细胞)和体内抗肿瘤活性之间没有明确的关联。将盐水和游离CpG作为对照。将在双腿上都荷有皮下B16黑素瘤肿瘤(平均直径4-6 mm)的C57BL/6小鼠随机分配到13个处理组中(10只小鼠/组)。在1、7和10天时每组中的小鼠都将接受盐水、CpG和表I中所列的每种药剂的瘤内注射，剂量为50 μ g当量CpG/注射(100 μ I)。仅处理每只小鼠的2个肿瘤中的I个。从第7天开始测量肿瘤大小，然后每2-3天测量一次直至第21天。将最长长度(β)和与最长长度垂直的长度如用于公式V =1A3 (幻2中，来获得肿瘤体积(mm3)。在21天时，处死所有动物，移走引流淋巴结、脾和经处理及未经处理的肿瘤二者，用于pDC群和细胞死亡(TUNEL)的IHC和FACS分 析。第21天时记录单个肿瘤的重量并用作肿瘤控制的量度。将未经处理的肿瘤用作评估黑素瘤-特异性的CTL应答是否能够表现出对远端位点肿瘤的抗肿瘤活性的工具。数据分析和统计
可使用广义线性模型来分析纳米-CpG的肿瘤内驻留及其在pDC中的摄取。虽然在拟合数据之前不能确定这些模型的最终形式，但我们注意到所提出的设计在检测每一成对比较的20%差异时具有>85%的功效。对于抗肿瘤作用研究，将肿瘤接种后每3天测量的肿瘤大小用作主要的终点。我们开始使用5-6只小鼠/组来进行统计分析和确定方差及统计功效。加入另外的动物(多达总共10只小鼠/组)来获得统计显著性。如果我们保守估计每一组的变异系数约为O. 25，并假设肿瘤大小有两倍的降低，则对每组10只小鼠在t_检验O. 005水平时，我们具有>85%的功效来检测组间差异(假设每一组方差相等)。用Microsoft Windows的SAS软件8. O版(SAS Institute)用单向ANOVA来进行组间比较。将显著性水平设为O. 05。预期结果、缺陷和解决方法
我们期望鉴定对与CpG结合的PG纳米构建物的有效抗肿瘤活性而言重要的PG聚合物的理化特性。具体地，有相对高MW的带负电荷PG可诱导更强的免疫刺激应答，因为这些聚合物可在肿瘤中驻留更久并以持续方式释放CpG。比起其较小尺寸的对应物，较大尺寸的聚合物亦可更易于被APC吞噬，并与黑素瘤中的带正电荷蛋白质的相互作用更强。将Tyr和Ala引入到L-PG中，由于共聚物疏水性的增加，不仅影响聚合物的降解性，而且还影响APC对其的摄取及其与碱性蛋白质的相互作用。不太可能但潜在的缺陷是PG聚合物可直接与其内体受体(TLR9)相互作用，而不需要从聚合物中释放CpG。在那种情况下，我们将在进一步的研究中鉴定具有最强抗癌功效的聚合物_CpG。初始L-PG1-CpG和在体内抗肿瘤功效研究中表现出最好功效的与CpG结合的PG纳米构建物(称为PG2-CpG)，可被改进至目标2以设计和开发靶向黑素瘤受体和黑素瘤-特异性的酶的与CpG结合的PG纳米构建物。预示性实施例1I
开发并确认通过受体-介导的摄取和酪氨酸酶-介导的CpG释放二者主动靶向黑素瘤细胞的PG-CpG纳米构建物
主动靶向黑素瘤细胞并仅在黑素瘤-特异性的酪氨酸酶作用下释放CpG的PG-CpG纳米构建物，进一步增强CpG的免疫刺激和抗肿瘤活性，而不诱导免疫系统的非特异性激活。
基本原理和总体策略
对于治疗致命的转移性黑素瘤，强烈希望CpG到达整个身体的每一个病灶而不触发全身性免疫应答和由此引起的对在肿瘤位点需要的效应T细胞的消耗。Sharma等最近使用靶向Her2/neU-阳性肿瘤细胞的抗体-CpG缀合物的研究和我们自己的关于靶向黑素瘤细胞的L-PG-CpG的初步数据，表明间接地将CpG靶向黑素瘤细胞是用于免疫治疗黑素瘤的可行的策略。我们提出使用两种方法来将CpG靶向黑素瘤细胞。在第一种方法中，我们将通过黑皮质素I型受体(MClR)-介导的摄取，用α -促黑色素细胞激素作为寻靶配体，直接将与CpG结合的PG纳米构建物定向至黑素瘤细胞。将纳米颗粒靶向肿瘤相关受体，虽然有吸引力，但不能完全避免肝和脾对纳米颗粒的摄取。在理想情况下，与CpG结合的纳米颗粒，或更特别地与CpG结合的PG，在肿瘤特异性的酶的作用下可在肿瘤位点单独释放CpG。以这种方式，在非肿瘤的位点，CpG-诱导的免疫效应细胞的激活将大幅降低，即使一些注射纳米颗粒分布在这些次级淋巴器官中亦如此。
因此，在第二种方法中，我们将制备仅在高度黑素瘤特异性的-酶酪氨酸酶的酶激活时才释放CpG的“智能的”纳米构建物。一旦获得了所提出的纳米结构，我们将研究在肿瘤内和静脉内注射后，CpG至B16肿瘤的体内选择性递送的效率。然后我们将再次用肿瘤内和静脉内两种给药途径，来评估靶向的PG-PG纳米构建物对黑素瘤和全身性免疫系统的免疫刺激活性。在没有非特异性激活免疫应答的情况下，全身性抗肿瘤活性的成功论证，可使黑素瘤以及其它转移性实体瘤的免疫治疗领域发生变革。研究设计
靶向MClR的CpG的合成和表征
我们已成功地证明用 a -MSH 类似物 NDP-MSH (Cys-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-1/-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2)作为寻祀配体将中空纳米金球祀向递送至B16黑素瘤中的MC1R，其中通过聚乙二醇(PEG)接头让NDP-MSH与纳米金球表面连接。此处我们将使用类似的策略，通过PEG接头让NDP-MSH与L-PG链连接以增加MClR对NDP-MSH肽的可及性，其如图13所示。简言之，通过用三氟乙酰胺-PEG-胺作为引发剂的L-Glu(0Bzl)-NCA的开环聚合化作用，来制备嵌段共聚物PEG-PBLG (聚合物I)。随后在NaOH水溶液中脱保护并用N-琥珀酰亚胺基-3-马来酰亚胺基丙酸酯活化末端胺，可得聚合物3。然后用6.1. 3. a章节中所述的相同程序将NH2-DTPA或NH2-染料与NH2-CpG与聚合物3缀合，接着引入SH-NDP-MSH，得到所提出的聚合物(图13)。如6.1. 3. a章节中所述来表征所得聚合物5。可使用类似的方法，自以上预示性实施例1中所鉴定的PG2-CpG合成靶向MClR的纳米构建物。细胞摄取和运输
按照我们报道的方法来研究聚合物5和相应的Gd (111In)或染料-标记的NDP-MSH-PEG-PG2-CpG在B16/F10细胞中的细胞摄取。Lu ff, Xiong C，Zhang TargetedPho to thermal Abla tion of Murine Melanomas wi th MelanocyteSt imula ting HormoneAnalog-Conjugated Hollow Gold Nanospheres (缀合促黑素细胞激素类似物的中空纳米金球对鼠黑素瘤的靶向光热切除)，Clin Cancer Res 15:876-86, 2009。简言之，让细胞与每种AleXFluor647-标记的受试化合物在37°C下孵育I小时，接着用4%的低聚甲醛固定。对于抑制研究，在加入每种化合物之前，让细胞与游离NDP-MSH (200 Pg/mL)孵育30分钟。洗涤和固定后，用DAPI对细胞核染色。为评估β_抑制蛋白的激活和募集，可用AleXFluor647-标记的5或6处理细胞15分钟，然后用山羊抗-β -抑制蛋白_2多克隆抗体和驴抗-山羊IgG异硫氰酸四甲基罗丹明缀合物对β -抑制蛋白进行免疫组织化学染色。用Zeiss Axio Observer. Zl荧光显微镜检测细胞的荧光。用不含寻靶配体的AlexFluor647-标记的 L-PG-CpG 或 PG2_CpG 作为对照。酪氨酸酶可激活的结合CpG的纳米构建物的合成和表征
酪氨酸是酪氨酸酶的天然底物，且发生氧化后得到相应的L-DOPA和邻醌(图14A)。先前的研究已表明可将酪氨酸酶用于介导细胞毒性剂经由药物环化释放机理从氨基甲酸酯和尿素前药中的释放。设想可通过尿素接头让Tyr-CpG中间体6与马来酰亚胺封端的PEG-PG共聚物3连接，来形成靶向MClR的聚合的CpG前药7，接着通过迈克尔加成反应引Λ SH-DNP-MSH (图14Β)。在酪氨酸酶-介导的氧化7后，发生迅速的分子内环化以引发游离CpG的切除和释放(图14Β)。化合物6可经由NH2-CpG与异氰酸酯8反应合成，其可通过用三光气处理Tyr (Bn)-NH-(CH2)2-NH-tBoc来合成。然后去除9中的保护基团来获得6 (图14C)。我们亦基于不可降解的D-PG聚合物来合成7，以降低非特异性的CpG释放。另夕卜，亦合成通过来自PEG-D-PG的Tyr连接的相应非靶向CpG缀合物作为对照。我们将用LC-MS来评估酪氨酸酶-介导的CpG释放的生存力。将聚合物7和非靶向缀合物溶解在PBS中，用酪氨酸酶进行处理，通过液相色谱-质谱来分析溶液以证明药物释放。为确保药物释放真正依赖于酪氨酸酶，将检测每种纳米构建物在PBS和牛血清中的稳定性。靶向的CpG和酪氨酸酶可激活的CpG纳米构建物的体外和体内免疫刺激活性的评估
接下来，我们将评估酪氨酸酶-激活的纳米构建物的免疫刺激活性。用每种聚合物处理B16细胞。二十四小时后，收集培养物上清液，用于用分离的pDC来测定pDC激活。体外细胞的摄取和运输
按照我们发表的实验方案从C57BL/6小鼠的骨髓产生巨噬细胞。为研究聚合物-CpG的内化作用，用荧光标记的聚合物脉冲巨噬细胞I小时，固定，用针对EEA (早期内体标记)、甘露糖-6磷酸受体(晚期内体受体)和LAMPl (溶酶体标记)的单克隆抗体来染色。所有的抗体都来自Abeam (Cambridge, MA)。通过共焦显微术来研究聚合物的共区域化和不同内吞溶酶体标记。体内细胞的摄取
为评价结合CpG的PG纳米构建物在不同免疫细胞群中的摄取，可用AlexaFluor647 标记三种靶向的纳米-CpG (NDP-MSH-PEG-L-PG-CpG、PEG-D-PG-Tyr-CpG 和DNP-MSH-PEG-D-PG-Tyr-CpG)中的每一种,经肿瘤内或静脉内注射至B16肿瘤中(η = 10)。用盐水、CpG、非靶向的L-PG-CpG和非靶向的D-PG-CpG作为对照。在1、3和7天之后，通过流式细胞术测量肿瘤、引流淋巴结和脾中⑶IIc+ DC和⑶llb+F480+巨噬细胞对CpG的摄取。另外，可将在单核细胞谱系细胞中表达GFP的转基因小鼠(在鼠c-fms启动子的控制下)用作肿瘤移植受者，这允许我们在活体动物中用非侵袭性成像活体成像来研究聚合物和单核细胞-巨噬细胞的共区域化。可如上所述实施局部细胞因子产生、递送至B16黑素瘤中的APC、激活pDC、肿瘤中黑素瘤-特异性的⑶8+ T-细胞应答和全身性应答。肿瘤内和静脉内注射后的抗肿瘤活性
在预示性实施例1的抗肿瘤活性确认中所述的实验设计，在此适用于研究靶向的PG-CpG缀合物的抗肿瘤活性。简言之，在C57BL/6小鼠双腿上皮下接种稳定敲除了酪氨酸酶基因的B16F10细胞或B16F10黑素瘤细胞(平均直径4-6 mm)。将小鼠分配到8个组中(10只小鼠/组)，用如下方式进行肿瘤内处理第I组，靶向MClR的NDP-MSH-PEG-L-PG-CpG ；第2组，靶向MClR的酪氨酸酶可激活的DNP-MSH-PEG-D-PG-Tyr-CpG ;第3组，在处理酪氨酸酶-敲除的肿瘤中靶向MCIR的酪氨酸酶可激活的DNP-MSH-PEG-D-PG-Tyr-CpG ；第4组，未处理；第5组，非靶向的PEG-L-PG-CpG ;第6组，酪氨酸酶可激活的但非靶向的PEG-D-PG-Tyr-CpG ;第7组，在处理酪氨酸酶-敲除的肿瘤中酪氨酸酶可激活的但非靶向的PEG-D-PG-Tyr-CpG ;第8组，不可降解的非靶向的纳米构建物PEG-D-PG-CpG。第4-8组作为对照。除第3组和第7组外的所有组将使用B16F10细胞。对于第3组和第7组，使用通过RNA干扰而稳定敲除了酪氨酸酶基因的B16F10细胞。通过稳定转染市购自Invitrogen (Carlsberg, CA)的质粒来实施酪氨酸酶基因的稳定敲除。在1、7和10天时每组中的小鼠将接受每种药剂的瘤内注射，剂量为50 μ g当量CpG/注射(100 μ I)。第21天时测量肿瘤大小，将动物处死，移出引流淋巴结、脾和经处理及未处理的肿瘤二者用于PDC群和细胞死亡(TUNEL)的IHC和FACS分析。第21天时记录单个肿瘤的重量并用作肿瘤控制的量度。在分开的研究中，将荷瘤小鼠分成8组，每组由10只小鼠组成。用与上述相同的药剂静脉内注射每组中的小鼠，并如上所述测定抗肿瘤活性。可如实施例1的数据分析和统计中所述来实施统计分析。预期结果、缺陷和解决方法
我们期望靶向MCRl的纳米构建物和酪氨酸酶可激活的纳米构建物二者都高度选择性地激活肿瘤-特异性的免疫应答。但是，因为酪氨酸酶对于黑素瘤的独特性，预期酪氨酸酶可激活的纳米构建物比靶向的纳米构建物可诱导更加特异的应答。在酪氨酸酶-介导的自纳米构建物的CpG释放不成功的不太可能的事件中，我们用L-DOPA替代酪氨酸作为酪氨酸酶的底物。或者，可使用氨基甲酸酯来替代尿素接头。期望这些方法可有效介导CpG的释放。本预示性实施例的主要缺陷是即使在我们加倍努力之后，靶向MClR的和酪氨酸酶-介导的CpG释放仍不能够避免全身刺激免疫细胞。失去激活黑素瘤-特异性的免疫应答这一“焦点”将不利地影响CpG治疗的有效性。如果发生这种情况，我们将寻求两种备选方法。第一，我们尝试将L-PG-CpG靶向其它的黑素瘤-特异性的生物标记。我们将使用黑素瘤细胞特异性的单克隆抗体例如抗-GD2抗体和抗-GM3抗体作为寻祀配体。这些抗体对细胞表面受体具有高亲和力(Kd=IO ηΜ),并且可改进纳米-CpG与肿瘤细胞的结合。第二，我们将使用长环状核-交联聚合的微团作为CpG的载体。我们先前已证明这些纳米材料可有效逃避单核吞噬系统的细胞。通过防止单核吞噬系统对纳米-CpG的摄取，我们期望降低全身性摄取和肿瘤外纳米-CpG的释放。预示性实施例1II
单独使用L-PG-Cpg纳米构建物及与T调控细胞消耗联合使用对抗肿瘤免疫的作用 瘤内注射纳米-CpG (来自实施例1的最好的)或静脉内注射靶向的纳米-CpG (来自实施例1I的最好的)与靶向协同刺激途径的治疗联合，将通过激活多种先天性和适应性免疫细胞来导致强烈的抗肿瘤活性。另外，这些治疗计划可进一步包括使用诸如IL-2和IFN-α等细胞因子，其在临床领域显示出一些前景，但仍有改进的空间。基本原理和总体策略
普遍认为，癌症的有效免疫治疗依赖于对免疫刺激的多个检查点起作用。联合使用通过不同机制协同作用的免疫治疗剂已成为研究中的关键领域。免疫的完全激活需要刺激正协同刺激信号和抑制负免疫调控信号。成功的免疫治疗将涉及合理联合药剂以激活在发展强烈的免疫应答中所涉及的关键步骤。因此，在B16黑素瘤鼠模型中确定了最有效的抗肿瘤纳米-CpG之后，我们将让这些TLR激动剂与全身性免疫调节联合，所述全身性免疫调节使用正免疫刺激剂或负协同刺激分子，所述正免疫刺激剂例如针对0X40、CD40和4-1BB的激动剂抗体，所述负协同刺激分 子例如针对B7家族的分子B7S1和B7H3的抗体和抗-CTLA-4抗体。考虑到这些细胞因子在先前临床上的中等成功，故一旦鉴定出最佳的联合，便可将其用于与IL-2和IFN- α建立细胞因子疗法。联合针对TAA的疫苗，评价了这些针对协同刺激分子的激动剂抗体中的每一种。将这些抗体与替代疫苗的TLR激动剂联合，具有接种患者来抵抗多种肿瘤特异性抗原的潜力，适合针对单个患者的肿瘤。最后，将IL-2和IFN-α给予黑素瘤患者而观察到的中等临床成功仍留有改进的空间，所述改进可能通过加入TLR-激动剂抗体组合来实现。研究计划
评估有效纳米-CpG与针对协同刺激分子的激动剂抗体或B7负协同刺激分子的治疗将B16黑素瘤植入到小鼠中。一周后，在建立起实体瘤之后，用两种TLR激动剂(来自以上实施例1和2中的最佳候选物)中任一种加上针对0X40、⑶40或4-1BB的激动剂抗体，或针对B7负协同刺激分子的拮抗剂抗体(抗-B7S1和抗-B7H3抗体)和抗-CTLA-4开始治疗，所有抗体均为腹膜内给予。TLR激动剂的给药途径将视经确定为最有效的激动剂而定。可在注射纳米-CpG 5天之后，以预定剂量给予抗体。我们的初步数据表明肿瘤-特异性的CD8 T细胞应答在瘤内注射L-PG-CpG后5天达到顶峰(图5)。终点是肿瘤大小减小和小鼠存活。亦研究最佳协同作用组合的机理，特别是关于肿瘤微环境中的细胞变化、抗原-特异性的T细胞的发育和CTL活性，基于这些发现将研究进一步改良。我们期望TLR激动剂与抗体-介导的刺激途径的参与的联合将进一步提闻抗肿瘤应答。评估有效纳米-CpG和针对协同刺激途径的激动剂抗体或B7负协同刺激分子与细胞因子联合的方案
将B16黑素瘤植入到小鼠中，I周后开始治疗。已鉴定出TLR激动剂加上刺激性抗体或B7负协同刺激分子的最佳联合，将IL-2和IFN-α加入到这一方案中。IL_2或IFN-α将与抗体一起腹膜内给予。监测联合疗法的治疗应答 治疗方案
对于自预示性实施例1鉴定的最佳纳米_CpG，研究以下组
与针对负协同刺激途径的拮抗剂抗体的联合 第I组，纳米-CpG ;第2组，纳米-CpG+抗-CTLA-4 ;第 3 组，抗-B7S1+ 纳米-CpG ’第 4 组，抗-B7H3 + 纳米-CpG0与针对正刺激途径的激动剂抗体的联合第5组，纳米-CpG +抗-0X40 ;第6组，纳米-CpG + 抗-CD40 ;第 7 组，纳米-CpG + 抗-4-1-1BBL。与细胞因子的联合第8组，纳米-CpG + IL-2 + —种协同刺激途径试剂；第9组，纳米-CpG +IFN- α +—种协同刺激途径试剂。对于在以上预示性实施例1I中鉴定的最佳纳米_CpG，制定相同的治疗方案。数据分析和统计可如实施例1的数据分析和统计中所述来实施统计分析。如上所述来实施局部细胞因子的产生、至B16黑素瘤中APC的递送、pDC的激活、肿瘤中黑素 瘤-特异性的CD8+ T-细胞应答和全身性应答。预期结果、缺陷和解决方法
我们期望通过联合使用协同刺激试剂和细胞因子观察到抗肿瘤应答增强。我们尤其期望看到由于协同刺激试剂导致的CD8 T细胞的肿瘤杀伤活性增强，对远端肿瘤治疗的效果大巾畐提闻。如对于IFN- α和IL_2所观察到的免疫调节剂的毒性可妨碍其与纳米-CpG的联合使用。因为纳米-CpG经设计以避免全身性激活免疫系统，所以纳米-CpG不太可能增加协同刺激试剂和细胞因子的已知毒性。作为备选方法，我们有两个计划1)我们将降低在初步研究中我们所使用的单一试剂的剂量，检测纳米-CpG是否可降低此特定试剂所需的有效剂量；和/或2)我们将尝试低剂量的多种协同刺激试剂来检测这些试剂之间的协同作用是否可降低每一种单独试剂的所需剂量。预示性实施例1V 体内分析
这些实验中将使用C57BL/6纯系株雌性小鼠(约600只/年)和GFP-转基因小鼠。对小鼠实施的主要程序包括以下
因为体内肿瘤消除和体内免疫应答是了解待开发的纳米载体-CpG候选物的抗癌功效的关键，所以仅可在动物内测试所提出的研究。对于所产生数据的统计学显著性，我们将重复测定至少一次，每一测试每组使用10只小鼠。动物将于M. D. Anderson供养在用于小动物的无病原容纳设施中，其以12小时为周期变换光照和黑暗，按照美国实验动物护理认定协会(AAALAC)批准的条件来控制温度和湿度。所有程序都将由受过训练的工作人员来执行，并经机构动物护理及使用委员会批准。将使用等同于10mg/mL氯胺酮和lmg/mL赛拉嗪(xylazine)的氯胺酮/赛拉嗪混合物经腹腔内注射(1. P)递送来麻醉小鼠。使用的麻醉剂是标准的、安全的，并经批准可用于小鼠。麻醉下的免疫期间，将观察小鼠的任何问题，在整个期间将保持小鼠温暖。通过在小鼠的左和/或右侧注射3xl05个B16黑素瘤细胞来进行肿瘤接种。在肿瘤接种7天后瘤内注射纳米-CpG和对照。通过腺病毒载体转导的细胞系所接种动物的操作在动物设施中的BSL-2条件下进行，且BSL-2规范用于实施实验的个人。每周测量2-3次小鼠肿瘤的生长。当肿瘤大小达到直径为1. 2 cm时(约接种3xl05个B16细胞后21天)，将小鼠处死。研究这21天期间纳米-CpG的抗癌作用。每天检查动物以确保健康，在研究过程中任何濒死的动物将实施安乐死。基于动物身体外观、活性水平、食欲和呼吸速率来测定发病率。在麻醉的动物中抽取血样样品。在实验结束时处死动物，收获各种组织(脾、淋巴结和肿瘤)进行T细胞测定，收获血清进行细胞因子测定。在所有这些程序中预期无毒性事件，因为纳米-CpG和CpG不是毒性的，用于转导B16黑素瘤细胞的重组病毒是复制缺陷型的。使用的所有剂量都低于公开的研究中已知有毒的剂量。处死任何表现出嗜睡、皮毛起皱或痛苦的动物以避免更长的痛苦。如果在肿瘤中观察到溃疡，则应迅速处死该小鼠。安乐死将涉及CO2暴露。一旦动物熟睡并对外界刺激无反应，将通过颈部脱臼法将其处死。这一过程与AVMA安乐死专家组的推荐一致。收获组织之后，在生物-危险性的动物废物中处理动物躯体。以下表格包括以上提出的不同实验(预示性实施例1、11和III)中所使用的各组小鼠和时间线。 对于预示性实施例1
共计:620只C57BL/6小鼠，120只转基因小鼠 表2
......S...................丽.....................................................「丽................1......万 丽
......1....................1..... .丽-...........................1..........].....JJlf1........................................1
2-12 11 S-CpG I 科I 扣I。
13 I Vink Cpo fWErTl 1-2 ψ ；预示性实施例1的抗肿瘤活性确认
肿瘤驻留10只小鼠/组X 13组=130只小鼠
预示性实施例1，瘤内注射后通过CpG和基于PG的纳米构建物诱导的先天性和获得性免疫的评估。pDC的体内摄取。10只小鼠/组X 12组(除盐水之外)x 3个时间点=360只小鼠
GFP转基因小鼠。10只小鼠/组X 12组=120只转基因小鼠 表3
对于预示性实施例1I，共计300只C57BL/6小鼠，140只转基因小鼠
权利要求
1.一种用于治疗黑素瘤的纳米构建物，所述纳米构建物包含多聚(L-谷氨酸)-CpG缀合物，其中所述纳米构建物在体内提供将CpG靶向递送至黑素瘤，增强黑素瘤抗肿瘤活性，同时降低或消除PDC的全身性激活。
2.一种用于将免疫调节剂给予肿瘤位点的递送系统，所述递送系统包含纳米构建物，其中纳米聚合物与免疫调节剂缀合，其中所述免疫调节剂为CpG或CpG与其它肿瘤结合配体及抗体的组合。
3.权利要求2的递送系统，其中所述纳米聚合物为多聚(L-谷氨酸)，并且所述其它肿瘤配体为针对黑皮质素I型受体(MClR)、适配体或抗体的MSH衍生的配体。
4.一种治疗需要治疗的受试者的黑素瘤的方法，所述方法包括将治疗量的纳米构建物给予所述受试者，所述纳米构建物具有与亲巨噬细胞的聚合物缀合的CpG。
5.一种治疗需要治疗的受试者的黑素瘤的方法，所述方法包括将治疗量的缀合纳米聚合物的免疫药物给予所述受试者。
6.权利要求5的方法，其中所述缀合纳米聚合物的免疫药物为多聚(L-谷氨酸)-CpG缀合物(〃L-PG-Cp-G〃)。
7.权利要求5的方法，其中将正协同刺激信号激动剂和负免疫调控信号抑制剂共同给予所述受试者。
全文摘要
阐述了具有以下三种组分的纳米构建物及使用所述纳米构建物的方法(1)生物可降解的纳米聚合物和纳米颗粒；(2)免疫药物，例如CpG；和(3)肿瘤结合装置，其通过受体-介导的摄取主动靶向肿瘤细胞，例如黑素瘤细胞。通过将PG-CpG纳米构建物与正协同刺激信号激动剂和负免疫调控信号抑制剂联合，进一步增强了抗肿瘤免疫。
文档编号A61K39/395GK103002919SQ201180017094
公开日2013年3月27日 申请日期2011年2月3日 优先权日2010年2月4日
发明者周大鹏, 李春, P.吴 申请人:得克萨斯系统大学评议会
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