新抗体纯化方法和由该方法得到的抗体、以及使用了阳离子交换基团的新抗体纯化法和...的制作方法
新抗体纯化方法和由该方法得到的抗体、以及使用了阳离子交换基团的新抗体纯化法和 ...的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明（第一方式)是将具有用于特异性纯化祀分子(例如，抗体或源自抗体的物 质。W下有时将它们总称为抗体等）的亲和配体的载体和具有阳离子交换基团的载体作为 整体来使用而对抗体等进行纯化的方法，本发明设及在一个色谱步骤中实施亲和色谱纯化 和阳离子交换色谱纯化的新抗体纯化方法及由该方法得到的抗体。
[0002] 另外，本发明（第二方式)是使用了阳离子交换基团下也称为具有阳离子交换 基团的载体、阳离子交换载体)的抗体等(抗体或源自抗体的物质）的新纯化法，本发明设及 PH4.0W下的抗体等的纯化方法及由该方法得到的抗体，但作为W簇基为配体的阳离子交 换载体的使用抑，通常不会选择抑4.0W下。
【背景技术】
[0003] 作为W抗体为主药的抗体医药品的主要成分的单克隆抗体，主要使用哺乳类培养 细胞等W重组蛋白质的形式在培养液中表达，通过多步色谱、膜工序纯化至高纯度，然后进 行制剂。抗体医药品为免疫球蛋白G及其类似物，一般而言除了称为抗体的分子W外，还含 有由作为免疫球蛋白分子的恒定区的Fc区与其它功能性蛋白质或肤融合而成的Fc融合蛋 白质(含有化的分子）。而且还包含化b、scFv、W及双抗体(diabody)等低分子化抗体。另外， 运些抗体医药品还包含W微生物为宿主，在其培养上清液中分泌表达的医药品、在菌体内 或菌体外壁和菌体细胞膜之间蓄积表达、纯化、制剂化的医药品。
[0004] 该培养、纯化、制剂化的工序中所形成或残留的凝聚体(二聚体W上的多聚体)成 为副作用的主要原因，因此，降低其含量成为抗体医药品生产的重要课题。在此，所谓单体， 例如在抗体的情况下，将四聚体结构的抗体定义为1个分子单位，所述四聚体结构的抗体具 有下述构成：由作为恒定区的Fc区和可变区构成的重链化链)2分子W及由可变区域构成的 轻链化链)2分子构成。该单位分子的多聚体形成凝聚体，成为抗体医药品的副作用的主要 原因。
[0005] 在培养、纯化、制剂化的工序中通过使用复杂的管理方法及添加剂来尝试了对抑 制凝聚体的生成及其除去进行控制。特别是在纯化工序中，除了抑制凝聚体的生成W外，将 其除去也很重要。因此，在纯化工序中，要求开发一种简便且有效的凝聚体除去技术。
[0006] 抗体医药品的纯化工序中，利用特定单元操作的组合进行的纯化方法的模板化 (平台化)不断发展，在其初期纯化工序（回收工序）中，广泛利用将作为配体的蛋白质A固定 化于水不溶性载体而成的抗体亲和分离基质(蛋白质A载体）。一般而言，使用在中性条件下 使抗体吸附于蛋白质A载体，并在酸性条件下洗脱抗体的方法，但通常通过3步色谱纯化而 使其高纯度化，在蛋白质A色谱工序的后段，可W通过离子交换色谱、疏水性相互作用色谱 等的组合来除去凝聚体等杂质(非专利文献1、非专利文献2、非专利文献3、专利文献5)。
[0007] 亲和配体具有与特定分子特异性结合的功能，将该配体固定化于水不溶性载体而 形成的亲和分离基质（也称为亲和色谱载体、亲和载体)用于从含有生物体成分、重组体的 微生物和哺乳类培养细胞中有效地分离纯化有用物质。作为实际工业上利用的抗体亲和配 体，例如可W举出：由蛋白质A、蛋白G、蛋白L等源自微生物或使它们重组表达而得到的功能 性修饰体(类似物)构成的肤性或蛋白质性配体、骆驼单链抗体（弓夕歹一一本鎖)或抗体的 化受体等重组蛋白质性配体、及嚷挫衍生物等化学合成性配体，可W用于抗体医药品等的 纯化。抗体医药品相对于化学药品显示更低的毒性且显示更高的特异性，因此，作为理想的 医药品，其需求不断增高。
[0008] 对于利用亲和载体的分离纯化而言，其课题在于抗体的凝聚体、源自宿主的杂质、 抗体的分解物等下称为凝聚体等)的除去。
[0009] 例如，作为亲和载体的一个例子，在蛋白质A色谱工序中，通常进行酸性洗脱，但是 由于各种抗体的洗脱抑不同需要时间进行工艺设计，另外洗脱pH越低，形成凝聚体的风险 越高，因此，对蛋白质A配体进行了施加蛋白质工程学修饰的尝试，使得需要抑3左右的较低 pH洗脱的抗体也能够在P册.5~4左右洗脱(专利文献1)。
[0010] 另外，蛋白质A色谱工序后凝聚体含量较多的情况下，在后段的杂质除去工序中会 导致目标单体(monomer)的收率降低，因此，除了尝试抑制蛋白质A色谱工序中的凝聚体形 成W外，还进一步尝试了除去该色谱工序中的凝聚体。
[0011] 另外，在蛋白质A色谱工序的使用中对降低凝聚体等杂质进行了尝试。即，提出了 一种洗脱时的抑或离子强度的优化、W及划分洗脱峰的前半部分和后半部分等的方法。具 体而言，是利用由于作为蛋白质A载体的特性，多聚体化而成的抗体分子W比未多聚体化的 抗体分子有更高的概率与蛋白质A配体接触，因此，解离常数稍微变低，且基于微调疏水性 的分离机制的方法(专利文献2、专利文献3、专利文献4)。但是，运些方法难W进行严密的控 审IJ，而且分离性能较低，无法作为通常的分离方法使用，需要在后段工序中进行杂质除去。
[0012] 蛋白质A色谱所代表的亲和色谱在酸性抑下实施洗脱，但后段的离子交换色谱、疏 水性相互作用色谱等通常在P册W上的抑下进行处理，因此需要调节pH、离子强度。
[0013] 另一方面，阳离子交换载体通常在比其配体的地a更高的pH下使用。另外，对于使 用阳离子交换载体进行纯化的祀蛋白质，在比蛋白质的等电点(pi)更低的抑下进行吸附洗 脱。例如，在pl为8的抗体的纯化中，W地a为2左右的横酸基、pKa为3~5左右的簇基作为配 体的阳离子交换载体使用抑5~6的缓冲液实施吸附洗脱而进行纯化。缓冲液的抑可W设定 为配体的地a与祀蛋白质的pl之间，但使用pH越低于pi，蛋白质的正电荷越多，洗脱离子强 度需要设定得越高，存在回收率降低的倾向。在洗脱液的离子强度较高时，存在必须在后段 的工艺构建中降低离子强度等的限制。另外，在使用抑接近或低于阳离子交换配体的地a的 情况下，配体的负电荷会质子化，导致结合容量降低，通常不选择该情况。因此，在使用阳离 子交换载体的抗体的纯化中，可W对地曰2~5的阳离子交换载体使用抑5~6的缓冲液。
[0014] 在亲和色谱工序之后使用阴离子交换色谱工序、疏水性相互作用色谱工序的情况 下(专利文献8)、在阳离子交换色谱工序之后进行阴离子交换色谱工序的情况下(专利文献 7)或在阳离子交换色谱工序中回收多种目标物质的情况下（专利文献6)，均同样地需要对 pH、离子强度进行调整。
[0015] 对于如上所述对抗体等进行亲和色谱纯化、并在后段的工艺中进行高度纯化而 言，需要调整酸性抑洗脱液的抑、离子强度，连续的初期色谱在提高效率上受到限制。而且， 在进行未采用亲和色谱纯化方法的离子交换色谱工序和疏水性电荷诱导色谱工序时，需要 独立地进行各个工序，无法连续地纯化抗体等，在希望提高效率方面存在限制（专利文献 9)。
[0016] 另外，抗体亲和分离基质对抗体显示出较高的特异性而能够高纯度化，但是，即使 严格地设定使用方法，单体(monomer)与凝聚体等的分离性能也较低，因此作为凝聚体等的 除去工序而旨存在限制。
[0017] 现有技术文献 [0018]专利文献
[0019] 专利文献1:日本专利第4391830号公报
[0020]专利文献 2:W02008/085988
[0021 ] 专利文献3:日本特表2010-507583号公报
[0022] 专利文献 4:W02010/019493
[0023] 专利文献 5:W02010/141039
[0024] 专利文献6:日本特开平05-202098号公报 [00巧]专利文献7:日本特开平06-228200号公报
[0026] 专利文献8:日本特表2010-510963号公报
[0027] 专利文献9:日本特表2008-535913号公报
[0028] 非专利文献
[00巧]非专利文献 1: Hober S.等著、"J. C虹omatogr. B"、2007年、848卷、40-47页
[0030] 非专利文献2:Low D.等著、"J.C虹omatogr.B"、2007年、848卷、48-63页
[0031] 非专利文献3:Roque A. C. A.等著、"J. C虹omatogr.心'、2007年、1160卷、44-55页 [00创发明的内容
[0033] 发明要解决的课题
[0034] 本发明（第一方式)的目的在于提供一种新抗体纯化方法，该方法能够在抗体或含 化分子或化b、scFv等低分子化抗体等源自抗体的物质的纯化工序的第一色谱工序中使作 为亲和纯化的主要目标的抗体自身高纯度化，而且可W提高单体的选择性分离特性，对于 凝聚体等的除去而言，能够降低对后段的杂质除去工序的负荷或省略后段的杂质除去工 序。
[0035] 本发明（第二方式)的目的在于提供一种抗体纯化方法，该方法是在抗体等的纯化 中，作为回收色谱工序在后段的工艺中对亲和色谱纯化物高纯度地进行纯化时需要的抗体 纯化方法，该方法不需要调整酸性pH洗脱液的pH、离子强度而能提高效率。
[0036] 解决课题的方法
[0037] 本发明人对上述课题进行了深入研究，结果发现了如下新分离方法，该方法将具 有对抗体或源自抗体的物质的亲和配体的载体和具有阳离子交换基团的载体两者填充于 同一柱内或连结柱内，同时实施两种色谱，由此，能够兼具特异性吸附性能与优异的凝聚体 等除去性能，从而完成了本发明（第一方式）。
[0038] 另外，本发明者对上述课题进行了深入研究，结果发现了如下阳离子交换载体的 新分离方法，该方法包括:在洗脱抗体亲和载体的酸性抑下进行抗体等对阳离子交换载体 的吸附洗脱，得到抗体的降低了凝聚体等杂质的级分，从而完成了本发明（第二方式）。
[0039] 旨P，本发明（第一方式)的主旨如下：
[0040] [ 1 ] -种抗体或源自抗体的物质的纯化方法，该方法包括:使用载体1和载体2制成 连结柱或混合柱，整体地对抗体或源自抗体的物质进行吸附和洗脱，所述载体1具有对抗体 或源自抗体的物质的亲和配体，所述载体2具有阳离子交换基团。
[0041] [2]-种抗体或源自抗体的物质的纯化方法，该方法是使用了载体1和载体2的抗 体或源自抗体的物质的纯化方法，所述载体1具有对所述抗体或源自抗体的物质的亲和配 体，所述载体2具有阳离子交换基团，
[0042] 该方法包括:使含有抗体或源自抗体的物质的液体通过一体型柱或混合型柱而将 抗体或源自抗体的物质载样于柱中，所述一体型柱在填充有所述载体1的柱的下游侧直接 连结了填充有所述载体2的柱，所述混合型柱填充有所述载体1和载体2两者的混合物，
[0043] 接着，通过使洗脱液通过而对载样后的抗体或源自抗体的物质进行洗脱。
[0044] [3]根据[1]或[2]所述的纯化方法，其中，在酸性pH下、且W离子强度梯度进行所 述抗体或源自抗体的物质的洗脱。
[0045] [4]根据[1]或[2]所述的纯化方法，其中，在酸性pH下、且W离子强度逐级进行所 述抗体或源自抗体的物质的洗脱。
[0046] [5]根据[2]~[4]中任一项所述的纯化方法，其中，用平衡溶液对所述一体型柱或 混合型柱进行平衡，并对所述含有抗体或源自抗体的物质的溶液进行载样，在该载样之后 且洗脱开始之前通入清洗液，所述清洗液的离子强度低于平衡溶液和含有抗体或源自抗体 的物质的溶液，且抑高于洗脱液。
[0047] [6]根据[2]~[4]中任一项所述的纯化方法，其中，用平衡溶液对所述一体型柱或 混合型柱进行平衡，并对所述含有抗体或源自抗体的物质的溶液进行载样，在该载样之后 且洗脱开始之前，通入与平衡溶液和含有抗体或源自抗体的物质的溶液相比具有相同或更 高的离子强度，且抑高于洗脱液的清洗液，接着再通入离子强度低于平衡溶液和含有抗体 或源自抗体的物质的溶液，且抑高于洗脱液的清洗液。
[0048] [7]根据[1]~[6]中任一项所述的纯化方法，其中，所述具有亲和配体的载体1是 W蛋白质A、蛋白质G、蛋白质L或它们的类似物作为配体的载体。
[0049] [引根据[1]~[7]中任一项所述的纯化方法，其中，所述具有亲和配体的载体1是 W蛋白质A或其类似物作为配体的载体。
[0050] [9]根据[1]~[引中任一项所述的纯化方法，其中，所述抗体或源自抗体的物质为 免疫球蛋白G、免疫球蛋白G衍生物、或含Fc分子。
[0051] [10]根据[1]~[9]中任一项所述的纯化方法，其中，所述抗体或源自抗体的物质 为化b、scFv、双抗体、或含有抗原结合部位的分子。
[0052] [11]根据[1]~[10]中任一项所述的纯化方法，其中，所述具有阳离子交换基团的 载体2是W簇基为配体的载体。
[0053] [ 12]根据[11 ]所述的纯化方法，其中，所述簇基源自酸性氨基酸。
[0054] [13]根据[1]~[12]中任一项所述的纯化方法，其中，所述抗体或源自抗体的物质 的洗脱piH小于5.0。
[0055] [14]根据[1]~[13]中任一项所述的纯化方法，其中，所述载体1对IgG的保留时间 为6分钟时的10 % DBC为Img/mL W上且1 OOmg/mL W下。
[0056] [15]根据[1]~[14]中任一项所述的纯化方法，其中，所述载体2的离子交换容量 为ο. OOlmmol/mLW 上且ο. 5mmol/mLW下。
[0057] [16]根据[1]~[15]中任一项所述的纯化方法，其中，所述载体1的体积平均粒径 为Ιμηι W上且1 ΟΟΟμηι W下，所述载体2的体积平均粒径为Ιμηι W上且1 ΟΟΟμηι W下。
[0058] [17]根据[1]~[16]中任一项所述的纯化方法，其中，将含有抗体或源自抗体的物 质的溶液载样于载体2,然后使用PH4.0W下的酸性缓冲液对抗体或源自抗体的物质进行洗 脱，所述载体2具有阳离子交换基团，该阳离子交换基团具有地a为4.0W上且含有簇基的配 体。
[0059] [1引根据[1]~[17]中任一项所述的纯化方法，其中，所述载体2对IgG的保留时间 为6分钟时的10%DBC为Img/血W上且200mg/mLW下，所述载体2具有阳离子交换基团，该阳 离子交换基团具有含有簇基的配体。
[0060] [19]根据[2]~[1引中任一项所述的纯化方法，其中，在填充有所述具有阳离子交 换基团的载体2的柱之前连结填充有具有亲和配体的载体1的柱，制作一体型柱，在中性pH 条件下将含有抗体或源自抗体的物质的溶液载样于所述一体型柱中，然后使用抑4.0W下 的酸性缓冲液对抗体或源自抗体的物质进行洗脱。
[0061] [20]根据[2]~[19]中任一项所述的纯化方法，其中，构成所述一体型柱的载体1 与载体2的比例W体积标准计为1/20W上且20/1W下。
[0062] [21]根据[2]~[1引中任一项所述的纯化方法，其中，制作W混合状态具有 所述具 有阳离子交换基团的载体2和具有亲和配体的载体1的混合型柱，在中性pH条件下对含有抗 体或源自抗体的物质的溶液进行载样，并使用抑4.0W下的酸性缓冲液对抗体或源自抗体 的物质进行洗脱。
[0063] [22]根据[2]~[1引、[21]中任一项所述的纯化方法，其中，所述构成混合型柱的 载体1与载体2的比例W体积标准计为1/20W上且20/1W下。
[0064] [23]根据[1]~[22]中任一项所述的纯化方法，其中，在吸附条件下，相对于载体1 对I gG的保留时间为6分钟时的10 % DBC，载体2对I gG的保留时间为6分钟时的10 % DBC为1 / 10倍W上且10倍W下。
[0065] [24]-种抗体或源自抗体的物质，其是用[1]~[23]中任一项所述的纯化方法进 行纯化而得到的。
[0066] 本发明（第二方式)的主旨如下：
[0067] [1] -种具有阳离子交换基团的载体的使用方法，该方法包括:将含有抗体或源自 抗体的物质的溶液载样于载体2中，然后使用pH4.0W下的酸性缓冲液对抗体或源自抗体的 物质进行洗脱，所述载体2具有阳离子交换基团，该阳离子交换基团具有地a为4.0W上且含 有簇基的配体。
[0068] [2]根据[1]所述的使用方法，其中，所述含有簇基的配体源自酸性氨基酸。
[0069] [3]根据[1]或[2]所述的使用方法，其中，所述载体2对IgG的保留时间为6分钟时 的10%DBC为Img/mLW上且200mg/mLW下，所述载体2具有阳离子交换基团，该阳离子交换 基团具有含有簇基的配体。
[0070] [4]根据[1]~[3]中任一项所述的使用方法，其中，所述具有阳离子交换基团的载 体2的离子交换容量为0.0 Olmmol/mLW上且0.5mmol/mLW下。
[0071] [5]根据[1]~[4]中任一项所述的使用方法，其中，所述具有阳离子交换基团的载 体2的体积平均粒径为Ιμηι W上且1 ΟΟΟμηι W下。
[0072] [6]根据[1]~[引中任一项所述的使用方法，其中，在填充有所述具有阳离子交换 基团的载体2的柱之前连结填充有具有亲和配体的载体1的柱，制作一体型柱，在中性pH条 件下将含有抗体或源自抗体的物质的溶液载样于所述一体型柱中，然后使用抑4.0W下的 酸性缓冲液对抗体或源自抗体的物质进行洗脱。
[0073] [7]根据[1]~[引中任一项所述的使用方法，其中，制作W混合状态具有所述具有 阳离子交换基团的载体2和具有亲和配体的载体1的混合型柱，在中性pH条件下对含有抗体 或源自抗体的物质的溶液进行载样，并使用抑4.0W下的酸性缓冲液对抗体或源自抗体的 物质进行洗脱。
[0074] [引根据[6]或[7]所述的使用方法，其中，用平衡溶液对所述一体型柱或混合型柱 进行平衡，并对所述含有抗体或源自抗体的物质的溶液进行载样，在该载样之后且洗脱开 始之前通入清洗液，所述清洗液的离子强度低于平衡溶液和含有抗体或源自抗体的物质的 溶液，且抑高于洗脱液。
[0075] [9]根据[6]或[7]所述的使用方法，其中，用平衡溶液对所述一体型柱或混合型柱 进行平衡，并对所述含有抗体或源自抗体的物质的溶液进行载样，在该载样之后且洗脱开 始之前，通入与平衡溶液和含有抗体或源自抗体的物质的溶液相比具有相同或更高的离子 强度，且pH高于洗脱液的清洗液，接着再通入离子强度低于平衡溶液和含有抗体或源自抗 体的物质的溶液，且抑高于洗脱液的清洗液。
[0076] [10]根据[1]~[9]中任一项所述的使用方法，其中，所述抗体或源自抗体的物质 为免疫球蛋白G、免疫球蛋白G衍生物、含化分子、或者化b、scFv、双抗体或含有抗原结合部 位的分子。
[0077] [11]根据[1]~[10]中任一项所述的使用方法，其中，在酸性pH下、且W离子强度 梯度进行所述抗体或源自抗体的物质的洗脱。
[0078] [12]根据[1]~[10]中任一项所述的使用方法，其中，在酸性pH下、且W离子强度 逐级进行所述抗体或源自抗体的物质的洗脱。
[0079] [13]-种抗体或源自抗体的物质，其是用[1]~[12]中任一项所述的使用方法进 行纯化而得到的。
[0080] 发明的效果
[0081] 根据本发明（第一方式），能够在作为抗体或含化分子或化b、scFv等低分子化抗体 等源自抗体的物质的纯化工序的第一工序的亲和色谱工序中，使作为亲和纯化的主要目标 的抗体自身高纯度化，而且可W提高单体的选择性分离特性，能够减轻对后段的杂质除去 工序的负荷。
[0082] 根据本发明（第二方式），在作为抗体等的纯化工序的第一工序的亲和色谱工序之 后，能够直接用阳离子交换色谱处理其洗脱液，另外，能够在与亲和载体的酸性洗脱抑相同 的pH下进行抗体等对阳离子交换载体的吸附洗脱，因此，能够通过亲和色谱纯化与阳离子 交换色谱纯化整体处理来有效地构建工艺。另外，根据本发明（第二方式），能够W较高的含 量(纯度)得到纯化后的单体抗体。需要说明说的是，在W下的附图的简单说明中，第一方式 参照图1~10、12~16,第二方式参照图1~16。
【附图说明】
[0083] 图1是示出按照蛋白质A亲和色谱工序、病毒失活工序、及阳离子交换色谱工序的 顺序进行的现有流程的图。
[0084] 图2是示出本发明的一个例子的流程图，是示出了在同时进行蛋白质A亲和色谱工 序及阳离子交换色谱工序之后进行病毒失活工序的流程的图。
[0085] 图3是示出抑3.7、口^.2、口^.7时的具有各阳离子交换基团的载体的10%漏出080 的图。
[0086] 图4是示出使用了填充有具有阳离子交换基团的载体（阳离子交换载体A)的柱时 的单体抗体(空白）和凝聚体抗体(斜线）的洗脱的图（横轴表示洗脱体积(mU、左纵轴表示 峰面积比率（％ )、右纵轴表示离子强度(mM))。
[0087] 图5是示出使用了填充有具有阳离子交换基团的载体（阳离子交换载体B)的柱时 的单体抗体(空白）和凝聚体抗体(斜线）的洗脱的图（横轴表示洗脱体积(mU、左纵轴表示 峰面积比率（％ )、右纵轴表示离子强度(mM))。
[0088] 图6是示出使用了填充有具有阳离子交换基团的载体（阳离子交换载体C)的柱时 的单体抗体(空白）和凝聚体抗体(斜线）的洗脱的图（横轴表示洗脱体积(mU、左纵轴表示 峰面积比率（％ )、右纵轴表示离子强度(mM))。
[0089] 图7是示出使用了填充有具有阳离子交换基团的载体（阳离子交换载体D)的柱时 的单体抗体(空白）和凝聚体抗体(斜线）的洗脱的图（横轴表示洗脱体积(mU、左纵轴表示 峰面积比率（％ )、右纵轴表示离子强度(mM))。
[0090] 图8是示出使用填充了具有蛋白质A亲和配体的载体(蛋白质A载体）的柱、且抗体 载样量为lOmg时的单体抗体（空白）和凝聚体抗体(斜线）的洗脱的图（横轴表示洗脱体积 (mU、左纵轴表示峰面积值、右纵轴表示离子强度(mM))。
[0091] 图9是示出使用填充了具有蛋白质A亲和配体的载体(蛋白质A载体）的柱、且抗体 载样量为30mg时的单体抗体（空白）和凝聚体抗体(斜线）的洗脱的图（横轴表示洗脱体积 (mU、左纵轴表示峰面积值、右纵轴表示离子强度(mM))。
[0092] 图10是示出使用填充了具有蛋白质A亲和配体的载体(蛋白质A载体)的柱、且抗体 载样量为40mg时的单体抗体（空白）和凝聚体抗体(斜线）的洗脱的图（横轴表示洗脱体积 (mU、左纵轴表示峰面积值、右纵轴表示离子强度(mM))。
[0093] 图11是示出在填充了具有蛋白质A亲和配体的载体(蛋白质A载体）的柱的正下方 连结有具有阳离子交换基团的载体(SP-Se地arose Fast Flow、阳离子交换载体A)的柱时 的单体抗体(空白）和凝聚体抗体(斜线）的洗脱的图（横轴表示洗脱体积(mU、左纵轴表示 峰面积值、右纵轴表示离子强度(mM))。
[0094] 图12是示出在填充了具有蛋白质A亲和配体的载体(蛋白质A载体）的柱的正下方 连结有具有阳离子交换基团的载体(阳离子交换载体A)的柱时的单体抗体(空白）和凝聚体 抗体(斜线）的洗脱的图（横轴表示洗脱体积(mU、左纵轴表示峰面积值、右纵轴表示离子强 度(mM))。
[0095] 图13是示出在填充了具有蛋白质A亲和配体的载体(蛋白质A载体）的柱的正下方 连结有具有阳离子交换基团的载体(阳离子交换载体B)的柱时的单体抗体(空白）和凝聚体 抗体(斜线）的洗脱的图（横轴表示洗脱体积(mU、左纵轴表示峰面积值、右纵轴表示离子强 度(mM))。
[0096] 图14是示出在填充了具有蛋白质A亲和配体的载体(蛋白质A载体）的柱的正下方 连结有具有阳离子交换基团的载体(阳离子交换载体C)的柱时的单体抗体(空白）和凝聚体 抗体(斜线）的洗脱的图（横轴表示洗脱体积(mU、左纵轴表示峰面积值、右纵轴表示离子强 度(mM))。
[0097] 图15是示出在填充了具有蛋白质A亲和配体的载体(蛋白质A载体）的柱的正下方 连结有具有阳离子交换基团的载体(阳离子交换载体D)的柱时的单体抗体(空白）和凝聚体 抗体(斜线）的洗脱的图（横轴表示洗脱体积(mU、左纵轴表示峰面积值、右纵轴表示离子强 度(mM))。
[0098] 图16是示出将具有蛋白质A亲和配体的载体(蛋白质A载体)与具有阳离子交换基 团的载体(阳离子交换载体D)混合于同一柱中时的单体抗体(空白）和凝聚体抗体(斜线）的 洗脱的图（横轴表示洗脱体积(mU、左纵轴表示峰面积值、右纵轴表示离子强度(mM))。
【具体实施方式】
[0099] 本发明（第一方式)的抗体等(抗体或源自抗体的物质）的新纯化方法的特征在于， 将具有对抗体等的亲和配体的载体与具有阳离子交换基团的载体制成连结柱或混合柱，整 体地对抗体等进行附和洗脱(在本发明（第一方式）中，连结柱、混合柱有时分别称为一体型 柱、混合型柱，"吸附"有时指"载样'。）。
[0100] 例如，本发明（第一方式）的纯化方法是使用了具有对上述抗体等的亲和配体的载 体1和具有阳离子交换基团的载体2的抗体等的纯化方法，其特征在于，使含有抗体等的液 体通过一体型柱或混合型柱而将抗体等载样于柱中，所述一体型柱在填充有上述载体1的 柱的下游侧直接连结了填充有上述载体2的柱，所述混合型柱填充有所述载体1和载体2两 者的混合物，接着，使洗脱液通过而对载样后的抗体等进行洗脱。需要说明的是，在本发明 (第一方式）中，具有亲和配体的载体1优选不含有阳离子交换基团，具有阳离子交换基团的 载体2优选不含有亲和配体。
[0101] 本发明（第二方式)的特征在于，在从亲和载体上洗脱祀分子(抗体等）的酸性洗脱 pH下进行从阳离子交换载体上对抗体等的分离，或者，将亲和载体与阳离子交换载体制成 连结柱或混合柱，整体地对抗体等进行吸附和洗脱(在本发明中，连结柱、混合柱有时分别 称为一体型柱、混合型柱，"吸附"有时指"载样"。）。即，本发明（第二方式）的具有阳离子交 换基团的载体的使用方法的特征在于，将含有抗体或源自抗体的物质的溶液载样于具有阳 离子交换基团的载体上，所述阳离子交换基团具有地a4.〇W上的含有簇基的配体，然后使 用PH4.0W下的酸性缓冲液对抗体或源自抗体的物质进行洗脱。需要说明的是，在本发明 (第二方式）中，具有亲和配体的载体1优选不含有阳离子交换基团，具有阳离子交换基团的 载体2优选不含有亲和配体。上述第二方式的特征可W在第一方式中使用，也可W作为第一 方式的构成要件。
[0102] 本发明（第一方式、第二方式)可W通过操作将抗体亲和色谱纯化与阳离子交换色 谱纯化制成整体的柱来实施。即，能够通过一个色谱工序(参照图2,本发明（第一方式、第二 方式）的纯化流程)来实施两个色谱工序(参照图1，目前的流程），可W节省工时，不使用各 工序所需的溶液，能够提高生产效率。而且，还能够实现抗体单体的高含量(高纯度）。
[0103] W下，对本发明（第一方式、第二方式）中的阳离子交换载体和抗体亲和载体与阳 离子交换载体的整体色谱化详细地进行说明。
[0104] 具有亲和配体的载体(亲和载体）
[0105] 本发明（第一方式、第二方式）中的"具有亲和配体的载体"（W下有时也称为具有 亲和配体的载体1、亲和载体或亲和载体1)是指W如下所述物质作为配体固定于水不溶性 载体所形成的载体，所述物质能基于W抗原与抗体的结合为代表的特异性分子间亲和力而 从某个分子集合中选择性地捕捉(结合）目标（目的)分子。
[0106] 可W用于本发明（第一方式、第二方式)的亲和配体只要具有能与作为祀分子的抗 体等特异性结合的特征即可，没有特别限定，优选为肤性配体、蛋白质性配体、或化学合成 性配体(合成化合物）。从对祀分子的特异性的观点考虑，更优选为肤性配体或蛋白质性配 体，其中，对抗体等的亲和配体特别优选为蛋白质A、蛋白质G、蛋白质L、蛋白质H、蛋白质D、 蛋白质Arp、蛋白质化丫 R、抗体结合性合成肤配体及它们的类似物。在第一和第二方式中， 特别在第一方式中，作为上述亲和配体，更优选为蛋白质A、蛋白质G、蛋白质L或它们的类似 物，最优选为蛋白质A或其类似物。
[0107] 在第一方式、第二方式中，上述亲和配体只要具有祀分子结合结构域(单体肤或蛋 白质、单结构域）即可，没有特别限制，优选2个W上的结构域连结而成的多聚体肤或蛋白质 (多结构域），更优选2~10个，更优选2~8个，进一步优选2~6个结构域连结而成的多聚体 蛋白质。运些多聚体蛋白质也可W是作为单一祀分子结合结构域的连结体的同源二聚体、 同源Ξ聚体等均聚物，如果祀分子相同，则也可W是作为多种祀分子结合结构域的连结体 的异源二聚体、异源Ξ聚体等杂聚物。
[0108] 作为连结本发明（第一方式、第二方式)的上述亲和配体的祀分子结合结构域的方 法，优选使多聚体蛋白质的Ξ维立体结构稳定的方法，例如可W举出：经由结构域序列的末 端氨基酸的连结方法、不经由结构域序列的氨基酸残基而进行连结的方法、或用1个或多个 结构域序列W外的氨基酸残基进行连结的方法，并不限定于运些方法。
[0109] 作为本发明（第一方式、第二方式）的上述抗体亲和配体，可W优选使用将多聚体 蛋白质作为1个构成成分且与功能不同的其它蛋白质融合而成的融合蛋白质。作为融合蛋 白质，可W举出：融合了白蛋白、GST(谷脫甘肤S-转移酶)的蛋白质、融合了DNA适体等核酸、 抗生素等药物、PEG(聚乙二醇)等高分子的蛋白质等，但并不限定于运些蛋白质。
[0110] 在第一方式中，亲和载体1对IgG的保留时间为6分钟时的10%DBC通常优选为Img/ mLW上且lOOmg/血W下，更优选为lOmg/mLW上，进一步优选为15mg/mLW上，更进一步优选 为20mg/mLW上，特别优选为30mg/mLW上。
[0111] 上述10%DBC例如可W通过下式求出。
[011 ^ DBCio% = (Vio%-Vd) Co/Vc (式中，Vio%为I gG漏出10 %时的溶液体积、Vd为管路内体积 (例如，包括从注射至柱入口的管路内体积和从柱出口至检测 器的管路内体积）、Co为载样 液的抗体浓度(mg/mL)、Vc为柱体积）。在测定DBCio%时，优选在给定的流速、即给定的保留时 间（例如1分钟~10分钟，优选3~6分钟)下进行。
[0113] 在第一方式、第二方式中，上述亲和载体的体积平均粒径为例如lymW上且ΙΟΟΟμπι W下，优选为扣mW上且500皿W下，更优选为10皿W上且200皿W下，进一步优选为150皿W 下，更进一步优选为120μπι w下，特别优选为100μπι w下。
[0114] 具有阳离子交换基团的载体(阳离子交换载体）
[0115] 本发明（第一方式、第二方式）中的"具有阳离子交换基团的载体"（W下，也称为具 有阳离子交换基团的载体2、阳离子交换载体或阳离子交换载体2)只要将如下所述阳离子 交换基团固定于水不溶性载体上即可，所述阳离子交换基团能够在将作为祀分子的抗体等 从抗体亲和配体中洗脱(溶出）的条件下作为阳离子交换基团发挥作用而捕捉祀分子，同时 能够通过钢离子、钟离子等抗衡离子按照该祀分子的单体(monomer)、凝聚体的顺序离子强 度依赖性地洗脱(溶出）。在从亲和配体中洗脱祀分子的pH的酸性抑范围内，为了 W80% W 上的回收率回收祀分子，作为阳离子交换基团，优选利用W弱酸性基团的簇基作为配体的 阳离子交换基团（含有簇基的配体）。另外，上述含有簇基的配体可W源自酸性氨基酸，更优 选源自谷氨酸。通常，从亲和载体中的洗脱使用抑4.0W下的酸性pH，因此，为了在该抑下得 到较高的回收率，作为本发明（第一方式、第二方式）的阳离子交换配体的含有簇基的配体 的地a为4.0W上。上述含有簇基的配体的地a优选为4.05W上且6.5W下，更优选为4.10W 上且6.45 W下。地a较低时，存在抗体收率降低的隐患。
[0116] 对于第一方式而言，在其优选的方式中，优选阳离子交换基团为簇基、横酸基等。 其中，优选为簇基，更优选为地a为4.0 W上的簇基。另外，上述簇基可W源自酸性氨基酸，更 优选源自谷氨酸。另外，在从亲和配体中洗脱祀分子的抑范围中，优选避免形成局部酸性环 境，优选为弱酸性基团。例如，在使用W蛋白质A作为亲和配体的载体时，作为阳离子交换基 团，优选利用W簇基为配体的阳离子交换基团。
[0117] 在第一方式中，上述阳离子交换基团的pKa优选为3.5W上且6.5W下，更优选为 4.0W上且6.0W下，进一步优选为4. m上且5.5W下。地a较低时，存在抗体收率降低的隐 出 小>、〇
[0118] 在本发明（第一方式、第二方式）中，在将具有阳离子交换基团的载体和亲和载体 用于连结型柱或混合型柱的情况下，阳离子交换基团的pKa与洗脱抑优选满足阳离子交换 基团地a >洗脱抑的关系，更优选满足阳离子交换基团地曰>洗脱抑的关系。
[0119] W往在单独使用具有阳离子交换基团的载体时，在阳离子交换基团pKa<洗脱pH 的条件下进行，而本发明中发现了用于组合使用具有阳离子交换基团的载体和亲和载体的 优选条件。可W认为，只要满足上述关系，则在洗脱时相对于祀蛋白质(抗体等)的电荷带有 较多正电，能够相对地抑制阳离子交换基团的配体从负电转变为正电，因此能够回收进一 步带有正电荷的凝聚抗体等，使抗体单体的纯化变得容易。
[0120] 在第一方式、第二方式中，上述阳离子交换载体的体积平均粒径为例如lymW上且 lOOOymW下，优选为扣mW上且500ymW下，更优选为lOymW上且200ymW下，进一步优选为 150μπι W下，更进一步优选为120μπι W下，特别优选为100μπι W下。
[0121] 在第一方式、第二方式中，上述阳离子交换载体的离子交换容量优选为 0.0 Olmmol/mLW 上且 0.5mmol/mLW下。
[0122] 在第一方式、第二方式中，上述含有具有包含簇基的配体的阳离子交换基团的载 体（上述阳离子交换载体2)对IgG的保留时间为6分钟时的10%DBC优选为Img/mLW上且 200mg/mL W下，更优选为1 Omg/mL W上，进一步优选为15mg/mL W上，更进一步优选为20mg/ mLW上，特别优选为30mg/mLW上。需要说明的是，上述10%DBC例如可W通过下式来求出。
[012；3 ] DBCio% = (Vio%-Vd) Co/Vc (式中，Vio%为I gG漏出10 %时的溶液体积、Vd为管路内体积 (例如，包括从注射至柱入口的管路内体积和从柱出口至检测器的管路内体积）、Co为载样 液的抗体浓度(mg/mL)、Vc为柱体积）。在测定DBCio%时，优选在给定的流速、即给定的保留时 间（例如1分钟~10分钟，优选3~6分钟）、给定抑(例如3~5，特别是4)下进行。
[0124] 水不溶性载体(载体）
[0125] 可W用于本发明（第一方式、第二方式）的"水不溶性载体"为不溶于水的基材，只 要能够将抗体亲和配体与阳离子交换基团固定化即可，没有特别限制，例如可W举出：玻璃 珠、硅胶等无机载体，由交联聚乙締醇、交联聚丙締酸醋、交联聚丙締酷胺、交联聚苯乙締等 合成高分子、结晶性纤维素、交联纤维素、交联琼脂糖、交联葡聚糖等多糖类构成的有机载 体，W及由它们的组合得到的有机-有机、有机-无机等复合载体等。作为市售品，可W例示 出：作为多孔质纤维素凝胶的GCL2000、将締丙基葡聚糖与亚甲基双丙締酷胺W共价键交联 而成的S邱hac巧1 S-1000、作为丙締酸醋类载体的T0Y0PEARL、作为琼脂糖类交联载体的 Sepharose 化4B、Rapid Run Agarose Beads、及作为纤维素类交联载体的Cellufine等。
[0126] 另外，用于本发明（第一方式、第二方式）的水不溶性载体从每单位时间的处理容 量的观点考虑，希望其表面积较大，优选为具有多个适当大小的细孔的多孔质。作为载体的 形态，可W为珠状、整体柱状、纤维状、膜状(包含中空纤维）等的任一种，可选择任意的形 态。为了使配置在水不溶性载体上的抗体亲和配体与阳离子交换基发挥协同作用，其物理 距离接近，能得到一定的保留时间，运样可W有效地发挥该分离基质的功能，从该方面考 虑，优选多孔质珠。在将阳离子交换基团在固定化有抗体亲和配体的载体上进行固定化的 情况下，从抗体亲和配体导入的难易度的方面考虑，优选由多糖类构成的、或者用单糖或多 糖类进行了修饰的载体。具体而言，优选琼脂糖或纤维素载体，但并不特别限定于此。
[0127] 在第一方式中，作为将亲和配体固定于水不溶性载体、分离基质的方法，可W使用 一般的方法。例如抗体亲和配体的氨基可W经由导入在载体上的甲酯基与载体结合，抗体 亲和配体的氨基也可W经由载体上的被活化的簇基与载体结合。
[0128] 另外，运些水不溶性载体可W在抗体亲和配体导入之前进行活化W使配体能与载 体共价键合，也可W使用市售的活化载体，也可W自行进行活化。
[0129] 在第一方式中，作为通过活化导入水不溶性载体的官能团，只要是能与抗体亲和 配体形成共价键的官能团即可，没有特别限定，例如可W举出环氧基(环氧氯丙烷）、漠化 氯、N，N-二班巧酷亚胺基碳酸盐(DSC)等活化的径基、醒基或活化簇基（例如N-径基班巧酷 亚胺(NHS)醋、幾基二咪挫(CDI)活化醋)等反应性官能团Γ活化基团"）等化ermanson G. T. 等著、"Immobilized Affinity Ligand Techniques,Academic Press"、1992年、美国专利 第5,874,165号、美国专利第3,932,557号、美国专利第4,772,653号、美国专利第4,210,723 号、美国专利第5，250，6123号、欧州专利公开第1352957号、W02004/074471)。其中包含将亲 和配体直接共价键合于载体的官能团和使用直链、支链、或环状连接基团（linker)或间隔 基团（spacer)的官能团。需要说明的是，在将导入了抗体亲和配体的载体活化时，优选不与 抗体亲和配体直接发生反应的活化方法。
[0130] 在第一方式中，在亲和配体内，将蛋白质性配体固定化于载体的方法可W使用使 蛋白质的官能团的一部分与载体的官能团的一部分发生反应的方法，能够用于该反应的蛋 白质侧的主要官能团（活性基团）可W举出：N末端氨基酸和赖氨酸化ys)侧链的氨基、或者 半脫氨酸(切S)侧链的硫醇基、或者C末端氨基酸及谷氨酸(Glu)侧链及天冬氨酸(Asp)侧链 的簇基等，但并不限定于运些官能团。
[0131] 在第一方式中，作为控制配体的取向性并将蛋白质性抗体亲和配体固定化于水不 溶性载体的方法，提出了一种利用在C末端具有半脫氨酸的蛋白A的方法（美国专利第6， 399，750号、ljungquist C.等著，巧ur. J. Biochem/'，1989年，186卷，557-561 页）。
[0132] 作为利用连接基团的固定化技术，除了确保载体和配体的距离、排除立体位阻而 谋求高性能化的方法W外，还可W举出：在连接基团或间隔基团中赋予、形成官能团（例如 带电胺）的方法等。一直在对通过在抗体亲和配体固定化时配体有效地聚集于连接基团或 间隔基团部分，从而提高固定化收率来提高分离性能进行研究。例如可W举出：向利用作为 连接臂的一部分的经N服活化的簇酸进行衍生物化而成的琼脂糖载体上固定化蛋白质性配 体的固定化技术（美国专利第5,260,373号、日本特开2010-133733、日本特开2010- 133734)。
[0133] 另外，也提出了一种除连接基团或间隔基团W外，在载体上利用缔合性基团使抗 体亲和配体聚集于载体，然后，缔合性基团和抗体亲和配体之间不形成共价键而在水不溶 性载体上将抗体亲和配体分别固定化的方法（日本特开2011-256176)。
[0134] 在第一方式、第二方式中，作为将阳离子交换基团固定化或导入水不溶性载体的 方法，通常可W利用阳离子交换基团的制作中所使用的方法。例如:作为向糖骨架导入簇甲 基的方法，有在碱性条件下使一氯乙酸进行反应的方法;作为导入硫酸基的方法，有在碱条 件下使硫酸进行反应的方法;但并不限定于运些方法。也可W通过在向水不溶性载体导入 与氨基反应的活性基团之后经由氨基酸的氨基将氨基酸固定化来导入簇基。另外，阳离子 交换基团可W直接地固定化于水不溶性载体，也可W经由间隔基团、连接基团等进行固定 化，所述阳离子交换基团可W使高舰酸钢与水不溶性载体上存在或导入的二醇基反应而使 载体活化来导入醒基，添加在同一分子内具有氨基和阳离子交换基团的分子，在亚胺形成 后进行还原处理，由此通过还原氨基化法使载体上的醒基和氨基共价键合而导入阳离子交 换基团。另外，只要能在将祀分子从亲和载体上洗脱(溶出）的酸性抑条件下作为阳离子交 换基团而发挥作用，阳离子交换基团、间隔基团、连接基团还可W含有具有其它功能的官能 团，对其分子形状也没有特别限制。从配体溶出时的毒性的观点考虑，氨基酸的簇基导入方 法也优选W抗体纯化用分离基质的材料的方式进行。
[0135] 本发明（第一方式、第二方式）的特征在于，在从亲和载体上进行祀分子的洗脱的 酸性洗脱抑下进行从阳离子交换载体上的抗体等的分离，或者使用亲和载体与阳离子交换 载体制成连结柱或混合柱，整体地进行抗体等的吸附和洗脱。
[0136] 作为抗体医药品的纯化平台工艺中所利用的第一色谱和第二色谱的代表例子，可 W使用例如蛋白质A色谱和阳离子色谱的组合。
[0137] 在第一方式、第二方式中，第一色谱的蛋白质A色谱的单体与凝聚体的分离性能较 低，分离的稳定性也不足，因此，通常选择将作为祀分子的抗体或含Fc分子的变性或凝聚抑 制在最小限度、且同时可得到较高回收率的洗脱条件，而凝聚体等的除去由后段工艺来承 担。
[0138] 在第一方式、第二方式中，在选择阳离子交换色谱作为第二色谱的情况下，一般而 言W吸附洗脱模式进行凝聚体、其它杂质的除去，但需要将来自蛋白质A载体下也称为 蛋白质A载体)的洗脱液调整为适于阳离子交换色谱吸附的抑和离子强度。因此，在蛋白质A 色谱工序的条件设定之后需要对阳离子交换色谱工序的条件进行设定。因此，存在多种限 制因素，而不能说可W进行有效地进行凝聚体等的分离。
[0139] 另一方面，在使用本发明（第一方式、第二方式）的方法时，使用亲和载体与阳离子 交换载体制成连结柱或混合柱，整体地进行抗体等的吸附和洗脱，由此能够将两个工序的 色谱操作缩短为一个工序，可W期待所使用的缓冲液的种类和使用量的减少、W及操作时 间的缩短。
[0140] 另外，对于本发明（第一方式、第二方式)的新抗体纯化法而言，通过在从亲和配体 上洗脱祀分子的狭窄的抑范围内对离子强度等进行设定，能够得到单体含量较高的洗脱级 分。特别是在单克隆抗体的纯化中，该洗脱抑大幅偏离祀分子的等电点，因此，每个抗体的 洗脱离子强度的幅度没有较大的差异，可期待能够在狭窄的范围内设定各种祀分子的使用 条件。进而，在使用修饰蛋白质A配体作为亲和配体的情况下，除了能够进一步狭窄地设定 洗脱pH范围W外，还可W通过使用碱CIP(cleaning in place;原位清洗)进行有效的清洗， 因此，从构建稳定的工艺的观点考虑，优选利用修饰蛋白A。
[0141] 在第一方式、第二方式中，未使用亲和载体而将其它色谱载体用作连结柱或混合 柱时，例如，在将离子交换载体与疏水色谱载体连结或混合使用的情况下，即使祀分子为单 克隆抗体，除了由于疏水性和等电点的差异等而使各种祀分子的使用条件的设定不同W 夕h特异性也较低，作为回收工序，可W认为其难W平台化。
[0142] 在第一方式、第二方式中，亲和载体与阳离子交换载体的连结柱或混合柱在吸附 时可W通过抗体亲和配体而发挥较高的特异性，而且通过在亲和配体的洗脱条件范围内设 定离子强度，可W容易地设定其使用条件，从该观点考虑，比未使用亲和载体1的其它载体 的组合更优异。
[0143] 虽然公开了在蛋白质A色谱柱中经过吸附/洗脱的抗体全部被阳离子交换色谱柱 捕捉之后用pH5.0-9.0的缓冲液进行洗脱，由此取消蛋白质A色谱与阳离子交换色谱之间的 收集槽化olding tank)的方法，但是在使用比从亲和载体中洗脱的抑更高的pH作为从阳离 子交换载体中洗脱的pH方面与本发明（第二方式)存在区别。另外，本发明（第一方式、第二 方式)可W将亲和载体与阳离子交换载体制成连结柱或混合柱，作为整体的柱而使用，从W 单一的洗脱操作进行洗脱的过程中能够分级祀物质的观点、W及该洗脱抑小于5.0或为4.0 W下、直接W亲和载体的洗脱抑进行阳离子交换载体的洗脱的观点考虑，是本质上不同的 技述领域(W02011/017514)。
[0144] 更具体而言，关于本发明（第一方式、第二方式）的亲和载体与阳离子交换载体的 连结柱或混合柱的使用方法，在中性附近下吸附抗体等祀分子时，优选添加一定浓度W上 的阳离子交换基团的抗衡离子来使用，在该条件下，阳离子交换基团的功能不发挥作用，另 夕h即使发挥作用，也可W通过更高离子强度的清洗来清洗除去源自该阳离子交换基团的 非特异性吸附物。另一方面，离子强度不阻碍抗体亲和配体的吸附，能够W较高的特异性吸 附目标物质，此外，通过使用高离子强度的清洗液，可有效地清洗除去非特异性地吸附于基 材、连接基团、间隔基团、配体及祀分子的分 子。
[0145] 通常，使重组单克隆抗体表达的培养上清液由于具有接近于人等的体液的离子强 度，因此，即使直接供于本发明（第一方式、第二方式)的连结柱或混合柱也可保持较高的特 异性，此外，还可通过更高离子强度的清洗液进一步减少杂质。优选在从亲和载体上洗脱含 有祀分子的组合物之前通过离子强度较低的缓冲液，使得离子交换基团的功能能够发挥， 然后与从亲和配体中的低pH洗脱联动地进行阳离子交换基团的依赖离子强度的洗脱。
[0146] 在本发明（第一方式、第二方式)中，在将填充有亲和载体的柱A与填充有阳离子交 换载体的柱B进行连结时，优选在上述柱A的正下方连接上述柱B，连结部分优选在中途未设 置分支阀而W直管进行连接，但是作为流路，只要能够直接连结，也可W在中途加入分支 阀。
[0147] 本发明（第一方式、第二方式)的亲和载体与阳离子交换载体的连结柱或混合柱可 W通过亲和配体和阳离子交换基的比率来调节其功能。在亲和载体在中性条件下的祀物质 的结合容量大于从亲和载体酸性洗脱的抑下的阳离子交换载体的结合容量时，存在酸性洗 脱时即使在低离子强度下祀物质也可W从柱中洗脱的倾向，在亲和载体的结合容量接近或 低于阳离子交换载体的结合容量时，为了使低离子强度下从亲和载体洗脱的抗体全部转移 到阳离子交换载体上且得到更高的回收率，需要将洗脱离子强度设定得较高。在任一种情 况下均可W通过对离子强度和/或抑的调节来控制回收率和其单体比率。
[0148] 在第一方式、第二方式中，亲和载体的结合容量(例如10%DBC)与阳离子交换载体 的结合容量(例如10%DBC)的比率没有特别限制，相对于吸附条件下的亲和载体对IgG的保 留时间为6分钟时的结合容量，阳离子交换载体对IgG的保留时间为6分钟时的结合容量优 选为10倍W下，更优选为5倍W下。另外，下限优选为1/10倍W上，更优选为倍W上。上述 结合容量的比率例如可W是从亲和载体、阳离子交换载体各自的10%DBC值而求得的比率。
[0149] 在第一方式、第二方式中，构成上述一体型柱或上述混合型柱的亲和载体与阳离 子交换载体的比例（亲和载体/阳离子交换载体）W体积标准计优选为1/20W上且20/1W 下，更优选为1/5W上且5/1W下。
[0150] 通过本发明（第一方式、第二方式)的亲和载体与阳离子交换载体的连结柱或混合 柱而纯化的祀分子是抗体等(免疫球蛋白G及其类似物），一般而言除称为抗体的分子W外， 还包括将免疫球蛋白分子的恒定区即Fc区和其它的功能性蛋白质或肤融合而成的Fc融合 蛋白质(含Fc分子）、及低分子化抗体，可W用作抗体医药品的原料。具体而言，抗体等优选 含有免疫球蛋白G、免疫球蛋白G衍生物、含化分子、W及化b、scFv、及双抗体等低分子化抗 体。
[0151] W下，举例示出祀分子为免疫球蛋白G的情况对本发明（第一方式、第二方式)的W 亲和载体与阳离子交换载体的连结柱或混合柱为整体进行抗体等的吸附和洗脱的使用方 法进行详细的说明，但本发明（第一方式、第二方式)并不限定于此。
[0152] 本发明（第一方式、第二方式）中的优选使用方法为如下方法:例如，（1)在填充有 阳离子交换载体的柱之前连结填充有亲和载体的柱，制作成一体型柱，在中性pH条件(例如 P册W上且9W下)下将含有抗体等的溶液载样于一体型柱中，然后使用PH4.0W下的酸性缓 冲液对抗体等进行洗脱的方法；（2)制作W混合状态一起具有上述阳离子交换载体和亲和 载体的混合型柱，在中性抑条件下对含有抗体等的溶液进行载样，并使用PH4.0W下的酸性 缓冲液对抗体等进行洗脱的方法等。
[0153] 在第一方式、第二方式中，使用了亲和载体与阳离子交换载体的连结柱或混合柱 的祀分子(抗体)纯化除了基本上由吸附工序、清洗工序、离子强度调节工序、洗脱工序等四 个工序构成W外，还可W包括其后的再生工序和/或CIP工序、再平衡化工序等用于再利用 的工序。
[0154] 在第一方式、第二方式中，吸附工序中欧可W使用普通的亲和柱色谱纯化方法。 良P，在其一例中，将含有抗体等(例如，免疫球蛋白G)的蛋白质溶液的抑调节至中性附近，然 后使该溶液通过本发明（第一方式、第二方式）的亲和载体与阳离子交换基团（阳离子交换 载体)的连结柱或混合柱，使抗体等(例如，免疫球蛋白G)特异性地吸附于填充有亲和载体 的柱或亲和载体中。例如，在W蛋白质A载体作为亲和载体的情况下，其载样pH优选为6W 上，更优选为6.3W上且9W下，进一步优选为6.5W上且8.5W下。在利用哺乳类培养细胞生 产的免疫球蛋白G的纯化中，不需要特别调节离子强度，此外，还可W预先提高离子强度而 进一步抑制非特异吸附。在吸附工序中使给定浓度的含有抗体或源自抗体的物质的溶液吸 附于载体，作为含有抗体或源自抗体的物质的溶液的溶剂，可W使用例如PBS(约lOmM憐酸、 约150mM NaCl等）。另外，在吸附工序之前可W进行平衡化工序，作为平衡化溶液的溶剂，可 W使用例如PBS(约1 OmM憐酸、约150mM NaCl等）。
[0155] 在第一方式、第二方式中，在清洗工序中，适量通过在亲和配体发挥作用的条件范 围内的缓冲液来清洗柱内部。即，pH的优选范围也可W为与上述载样时相同的范围（中性附 近的抑），例如优选为6W上。此时，作为祀分子的抗体等(例如，免疫球蛋白G)吸附于亲和载 体。运时，通过在中性附近的抑下对离子强度、组合物进行优化，有时能够有效地除去杂质。 在载样、清洗时，优选阳离子交换载体不发挥作用的条件，即，优选利用中性附近的pH且具 有一定W上高离子强度的清洗液，通过该过程，能够清洗两种分离基质和/或通过免疫球蛋 白G而非特异性地残留于柱的杂质。
[0156] 在第一方式、第二方式中，在对含有抗体等的溶液进行载样并开始下述洗脱之前 进行清洗工序，清洗工序的次数例如至少为1次W上，优选为2次W上。清洗工序的优选例子 例如可W列举W下的例子，但并不限定于W下例子。
[0157] (1)用平衡化溶液对上述一体型柱或混合型柱进行平衡化，对上述含有抗体或源 自抗体的物质的溶液进行载样，并优选在该载样之后且洗脱之前通过清洗液(第2清洗液）， 所述清洗液(第2清洗液)的离子强度低于平衡化溶液和含有抗体或源自抗体的物质的溶液 且抑高于洗脱液，（2)用平衡化溶液对上述一体型柱或混合型柱进行平衡化，对上述含有抗 体或源自抗体的物质的溶液进行载样，并优选在该载样之后且洗脱之前通过清洗液(第1清 洗液），所述清洗液(第1清洗液)的离子强度接近或高于平衡化溶液和含有抗体或源自抗体 的物质的溶液且pH高于洗脱液，接下来再通过清洗液(第2清洗液），所述清洗液(第2清洗 液)的离子强度低于平衡化溶液和含有抗体或源自抗体的物质的溶液且抑高于洗脱液。上 述（1)和(2)的方法是将普通的蛋白质A色谱中使用的清洗方法适用于一体型柱或混合型柱 的方法，可W冲洗非特异性地吸附于蛋白质A载体的杂质，也能够冲洗吸附于阳离子交换载 体的杂质。另外，上述（1)优选对例如纯化纯度较高的抗体进行，而上述(2)优选对例如培养 上清液进行。上述(1)和(2)中使用的第2清洗液为例如lOmM Tris/HCl pH7等溶液，上述(2) 中使用的第1清洗液为例如lOmM Tris IM化Cl pH7、10mM Tris pH7等溶液。需要说明的 是，也可W在上述（1)和(2)之前用与平衡化溶液相同离子强度和抑的溶液(例如，PBS)进行 预清洗。
[0158] 在第一方式、第二方式中，在离子强度调节工序中，用中性附近且离子强度较低的 缓冲液置换柱，为在洗脱时基于阳离子交换载体的离子强度依赖性洗脱功能的发挥而准 备。离子强度更优选低于洗脱液的离子强度。
[0159] 在第一方式、第二方式中，在洗脱工序中，通过酸性抑、离子强度的组合，在从亲和 配体洗脱时，阳离子交换分离模式发挥作用，能够将单体含量较高的级分回收于低离子强 度洗脱级分中。洗脱液的抑可W应用抗体等(例如，免疫球蛋白G)从亲和配体洗脱的抑。该 抑W由亲和载体和抗体等(例如、免疫球蛋白G)的种类而确定的分离条件为中屯、来确定，因 此，不需要特别的条件设定，从抑制凝聚体等的生成的观点考虑，优选为比能够从亲和载体 上进行洗脱的范围更高的抑。在第一方式、第二方式中，抗体等的洗脱抑为4.0W下，优选为 3.95W下，更优选为3.9W下，进一步优选为3.8W下。需要说明的是，洗脱pH为例如3.0W 上，优选为3.2W上，更优选为3.5W上。
[0160] 在第一方式的其它方式中，抗体等的洗脱pH优选小于5.0,更优选为4.5W下，进一 步优选为4.0W下。需要说明的是，洗脱pH为例如3.0W上，优选为3.2W上，更优选为3.5W 上。
[0161] 在第一方式、第二方式中，亲和载体为蛋白质A载体的情况的洗脱液抑设定为例如 pH为小于5.0且2W上、4.0W下且2W上之间。其中，从避免祀分子的酸变性的目的考虑，更 优选为PH3.0W上，特别优选为PH3.5W上。洗脱液抑的上限值优选与上述相同。
[0162] 在第一方式、第二方式中，使用碱耐性型的修饰型蛋白质A载体的情况下，通常其 洗脱抑W3.5~4.0之间为中屯、进行设定，但并不限定于此。另外，洗脱离子强度不仅依赖于 亲和配体与阳离子交换载体的比率，还也依赖于每单位体积的抗体等(例如，免疫球蛋白G) 的载样量，可W通过梯度实验、逐步洗脱实验容易地设定优化点。
[0163] 本发明（第二方式）的阳离子交换载体的洗脱条件或本发明（第一方式）的洗脱条 件可W应用盐浓度梯度洗脱、逐步洗脱，为了简化操作，优选设定为能实现通过逐步洗脱进 行抗体的回收并实现高单体含量的条件，但梯度洗脱更容易进行条件设定。
[0164] 在第一方式、第二方式中，例如，可W在酸性抑下W离子强度梯度进行抗体等的洗 脱，也可W在酸性pH下W离子强度逐级进行抗体等的洗脱。需要说明的是，在即使进行清洗 工序的离子强度与酸性抑的组合，凝聚体也残留于柱而不会混入洗脱级分的情况下，可W 省略离子强度调节工序。
[0165] 在第一方式、第二方式中，在开始洗脱时，优选使洗脱液的pH恒定，并连续或阶段 性地增大洗脱液的离子强度。洗脱液只要是通常使用的即可，例如可W为乙酸、巧樣酸等。 洗脱液的pH优选为3W上且4.0W下，更优选为3.1 W上且3.95W下，进一步优选为3.2W上 且3.90W下。特别是在第一方式中，洗脱液的抑优选为3W上且5W下，更优选为3.1~4.5， 进一步优选为3.2~4.0。在第一方式、第二方式中，离子强度优选在0.111^^上且200011^^ 下，更优选在0.5mlW上且lOOOmlW下，进一步优选在ImlW上且500mlW下的范围内连续或 阶段性地增大。
[0166] 使用本发明（第一方式、第二方式)的亲和载体与阳离子交换载体的连结柱或混合 柱进行纯化的抗体等(例如，免疫球蛋白G)显示出比基于单一分离模式的抗体亲和分离基 质更高的单体选择性，其洗脱液中的单体含量较高。
[0167] 在使用基于单一分离模式的亲和载体的情况下，也可通过洗脱抑和离子强度等的 优化来稍微提高单体含量，但其效果较差，且其效果的显现伴有更大的回收率的降低。通过 使用本发明（第一方式、第二方式）的亲和载体与阳离子交换载体的连结柱或混合柱，能够 通过单一色谱操作有效地实现单体含量的提高，所述单体含量的提高可W通过特异性较高 的亲和纯化及主要通过阳离子交换色谱来实现，因此，能够降低对后段工艺的负荷，可W有 助于工艺整体的收率提高和单体含量的提高。即，通过使用本发明（第一方式、第二方式)的 亲和载体与阳离子交换载体的连结柱或混合柱的新抗体纯化法，能够有助于抗体医药品的 制造工艺的生产率提高和高纯度化。
[0168] 本申请要求基于在2013年9月17日申请的日本专利申请第2013-192378号和2013 年9月17日申请的日本专利申请第2013-192379号的优先权。W参考的方式将在2013年9月 17日申请的日本专利申请第2013-192378号和2013年9月17日申请的日本专利申请第2013- 192379号的说明书的全部内容引用到本申请中。
[0169] 实施例
[0170] W下，基于实施例对本发明（第一方式、第二方式）更详细地进行说明，但本发明 (第一方式、第二方式)并不限定于运些实施例。
[0171] (阳离子交换载体的制备例）
[0172] 簇基导入载体的制备(制备例1)
[0173] 在反应容器中取W湿润体积计为4mL量的用冷水置换的Low density Glyoxal 4Rapid Run(ABT公司）作为4%琼脂糖珠，用冷却的IM谷氨酸(pH6)清洗5次，并在回收后使 浆料的液量为7mL。在色谱槽内翻转揽拌2小时，然后追加投入1M的二甲基胺棚烧水溶液 0.5mL，并在色谱槽内揽拌1小时30分钟。再在室溫下翻转揽拌过夜。进行离屯、使载体沉降 后，除去上清液使液面为6mL，并在其中直接加入20mg的棚氨化钢，在室溫下进一步翻转揽 拌2小时。用添加了水、0.1M巧樣酸、0.1M氨氧化钢、及0.5M的NaCl的PBS充分清洗，得到了用 还原氨基化法经由谷氨酸的氨基向醒基导入了簇基的琼脂糖载体。本阳离子交换载体为 Glyoxal-COOH。
[0174] (阳离子交换载体(含有簇基的配体)的地a和离子交换容量的测定）
[01巧]作为簇基导入阳离子交换载体，将CM-Sepharose Fast Flow(GE Healthcare公 司；阳离子交换载体A)、Τ0Υ0阳ARL CM-650M(东曹株式会社；阳离子交换载体B)、FRACT0GEL C00(M)(Merck公司；阳离子交换载体C)、Glyoxal-C00H(制备例1;阳离子交换载体D)用IM KC1 (抑2)进行置换，并用0.1M NaOH滴定来求得地a和离子交换容量。将结果示于表1。
[0176] 表1
[0177]
[0178](阳离子交换载体在酸性抑下的结合容量的测定）
[01巧]作为簇基导入阳离子交换载体，将CM-Sepharose Fast Flow(GE Healthcare公 司）、Τ0Υ0阳ARL CM-650M(东曹株式会社）、Fractogel COO(M) (Merck公司）、Glyoxal-C00H (制备例1)填充于Omnifit公司制的柱（ID 0.66cmX柱长化ei曲t)7cm)，将制备为0.5mg/mL 的人多克隆抗体(GAMMA-GLOBULIN-NICHIYAKU(人免疫球蛋白G):日本制药)作为载样液，在 W下的色谱条件下测定结合容量。将载样液的pH调节为3.7、4.2、或4.7,测定各个结合容 量，作为10%漏出的动态结合容量(10%DBC)。
[0180] 阳离子交换载体的10%DBC测定所使用的色谱条件
[0181] 柱：ID 0.66cmX柱长巧ei曲t)7cm、2.4mL容量(Omnifit公司制）
[0182] 流速:0.4mL/分(保留时间：6分钟）
[0183] 多克隆抗体（IgG) :GAMMA-GL0脚LIN-NICHIYAKU(日本制药）
[0184] 载样液:0.5mg-IgG/mL( 5mM 巧樣酸:P册.7、4.2、 或4.7)
[01化]平衡化液:5mM巧樣酸(P册.7、4.2、或4.7)
[0186] 洗脱液:50mM巧樣酸、0.5M氯化钢(P册.7)
[0187] CIP液:0.1M氨氧化钢、1M氯化钢
[018引中和-再平衡化液:51111巧樣酸(口册.7、4.2、或4.7)
[0189] 将各载体的结合容量（10%DBC)示于图3。根据其结果，没有发现W簇基作为配体 的各种阳离子交换载体的结合容量有很大差别。另外，没有发现表1的离子交换容量与结合 容量之间相互关联。存在地a越低，结合容量的抑依赖性越大的倾向。
[0190] (单体含量的测定）
[0191] 将各色谱洗脱液供于凝胶过滤，对凝聚体和单体进行分级，根据其峰面积值的比 较而求出单体含量。W下示出凝胶过滤的条件。
[0192] 凝胶过滤色谱条件
[0193] 柱：Superdex200 10/300GL(ID IcmX柱长（Height)30cm)(GE Healthcare公司）
[0194] 流速:0.5mL/分
[0195] 检测波长:214nm
[0196] 载样液:100μLν样品注射(Injection)(稀释至吸光度值不超过1的范围）
[0197] 洗脱液:PBS(pH7.4)
[019引（比较例1)
[0199] 使用了阳离子交换载体在p册缓冲液中进行的抗体分离
[0200] 作为阳离子交换载体，将CM-Sepharose Fast Flow(GE Healthcare公司）、 TOYOPEA化 CM-650M(东曹株式会社）、Fractogel COO(M) (Merck公司）、Glyoxal-C00H(制备 例1)填充于Omnifit公司制的柱（ID 0.66cmX柱长化ei曲t)7cm)中，W制备成0.5mg/mL的 人多克隆抗体(GAMMA-化OB化IN-NICHIYAKU:日本制药)作为载样液，在W下的色谱条件下 进行了分离。在洗脱级分中添加精氨酸使得最终浓度为50-100mM，在抑5~6下用凝胶过滤 色谱进行了单体含量的测定。另外，根据其峰面积值分析求出各级分的单体量和凝聚体量。
[0201] 阳离子交换色谱条件
[0202] 柱：ID 0.66cmX柱长化eight)7cm、2.4mL容量(Omnifit公司制）
[0203] 流速:0.4mL/分(保留时间：6分钟），其中CIP W后为0.8mL/分
[0204] 多克隆抗体（IgG) :GAMMA-GL0脚LIN-NICHIYAKU(日本制药）
[0205] 载样液:0.5mg-IgG/mL( lOmM 巧樣酸、P册）
[0206] 平衡化(5柱体积）：lOmM巧樣酸、P册
[0207] 载样量(30mg)
[0208] 清洗(5柱体积）：lOmM巧樣酸、P册
[0209] 洗脱梯度(40柱体积）:A^B线性梯度
[0210] A液：10mM巧樣酸、P册 B液:250mM巧樣酸、抑5
[0212] 再生(4柱体积）：50mM料蒙酸、250mM氯化钢、抑5
[0213] CIP(4柱体积氨氧化钢、1M氯化钢 [0214]中和?再平衡化(4柱体积）：lOmM料蒙酸、抑5
[0215] 级分:1柱体积
[0216] 作为各载体的色谱的结果，将CIP级分为止的全部洗脱级分中的单体和凝聚体量 的总和设为100,将单体和凝聚体的分离示于图4至7。其结果确认了如下情况:载样的抗体 回收于洗脱级分中，且凝聚体的峰顶部与单体的峰顶部仅稍微错开，未明显分离。
[0217] (比较例2)
[0218] 使用了蛋白质A载体的抗体的分离
[0219] 作为蛋白质A载体，将MabSelect SuRe(GE Healthcare公司）填充于Omnifit公司 制的柱（ID0.66cmX柱长化ei曲t)7cm)中，W制备成2.5mg/mL的人多克隆抗体(GAMMA- 化OB化IN-NICHIYAKU:日本制药)作为载样液，在W下的色谱条件下进行分离。在洗脱液中 添加精氨酸使最终浓度为50-100mM，在抑5~6下用凝胶过滤色谱进行单体含量的测定。另 夕h根据其峰面积值分析求出各级分的单体量和凝聚体量。
[0220] 蛋白质A色谱条件
[0221] 柱：ID 0.66cmX柱长化eight)7cm、2.4mL容量(Omnifit公司制）
[0222] 流速:0.4mL/分(保留时间：6分钟），其中CIP W后为0.8mL/分
[0223] 多克隆抗体（IgG) :GAMMA-GL0脚LIN-NICHIYAKU(日本制药）
[0224] 载样液：2.5mg-IgG/mL(PBS、pH7.4)
[02巧]平衡化(5柱体积）：PBS、pH7.4
[0226]载样量（10mg、30mg 或 40mg)
[0227]清洗(5 柱体积）:PBS、pH7.4
[022引清洗2(4柱体积）：10mM Tris/肥l、pH7
[0229] 洗脱梯度(40柱体积）:A^B线性梯度
[0230] A液：lmM巧樣酸、P册.7
[0231] B液：250mM巧樣酸、P 册.7
[0232] 再生(4柱体积）：50mM巧樣酸、250mM氯化钢、P册.7
[0233] CIP(4柱体积）：0.1M氨氧化钢、1M氯化钢
[0234] 中和?再平衡化(4柱体积）：PBS、pH7.4
[0235] 作为各色谱的结果，将CIP级分为止的各级分的单体和凝聚体的峰面积值示于图8 至10。根据其结果，虽然载样的抗体回收到了洗脱级分中，但是凝聚体的峰顶部与单体峰一 起在初期被洗脱，任一种载样量均为确认到凝聚体的分离。需要说明的是，该蛋白质A载体 的结合容量（10 % DBC)约为50.3mg/mL左右。
[0236] (比较例3)
[0237] 将填充有蛋白质A载体的柱与填充有W横丙基为配体的阳离子交换载体（SP- S巧harose化St Flow)的柱连结制成一体型柱，使用该一体型柱进行抗体的分离。
[023引在Omnifit公司制的柱（ID 0.66cmX柱长化ei曲t)7cm)中分别填充作为蛋白质A 载体的MabSelect SuRe(GE Healthcare公司）、作为阳离子交换载体的SP-Sepharose Fast Flow(GE化althcare公司），将两根柱按照填充有蛋白质A载体的柱、填充有阳离子交换载 体的柱的顺序进行连结，作为整体的柱实施色谱操作。W制备成2.5mg/mL的人多克隆抗体 (GAMMA-GLOBULIN-NICHIYAKU:日本制药)作为载样液，在W下的色谱条件下进行分离。需要 说明的是，1柱体积是W1根柱体积为2.4mL进行操作。在洗脱液中添加精氨酸使最终浓度为 50-100mM，在P册~6下用凝胶过滤色谱进行单体含量的测定。另外，根据其峰面积值分析求 出各级分的单体量和凝聚体量。
[0239] 连结柱色谱条件
[0240] 柱：ID 0.66cmX柱长化eight)7cm、2.4mL容量(Omnifit公司制）的连结体
[0241] 流速:0.4mL/分(保留时间：6分钟），其中CIP W后为0.8mL/分
[0242] 多克隆抗体（IgG) :GAMMA-GL0脚LIN-NICHIYAKU(日本制药）
[0243] 载样液：2.5mg-IgG/mL(PBS、抑7.4;10mM憐酸、150mM NaCl等）
[0244] 平衡化(5 柱体积）:PBS、pH7.4
[0245] 载样量(40mg)
[0246] 清洗(5 柱体积）:PBS、pH7.4
[0247] 清洗2(4柱体积）：10mM Tris/肥l、pH7
[0248] 洗脱梯度(40柱体积）:A一B线性梯度
[0249] A液：lmM巧樣酸、P册.7 [0巧0] B液：250mM巧樣酸、P册.7
[0251] 再生(4柱体积）：50mM巧樣酸、250mM氯化钢、P册.7
[0252] CIP(4柱体积）：0.1M氨氧化钢、1M氯化钢 [0巧3] 中和?再平衡化(4柱体积）：PBS、pH7.4
[0254]作为色谱的结果，将CIP级分为止的各级分的单体和凝聚体的峰面积值示于图11。 运时，在将比较例2的40mg抗体载样试验的洗脱级分中的单体量设为100的情况下，比较例3 中再生级分为止回收得到的单体为21.0%，另外，单体含量为94.1%XIP级分为止回收得 到的单体为22.9%，将填充有W横丙基作为配体的阳离子交换载体的柱与填充有蛋白质A 载体的柱连结使用时，能够离子强度洗脱的单体回收率较差。
[0巧5](参考例1)
[0256]将填充有蛋白质A载体的柱与填充有W地a小于4.0的簇基作为配体的阳离子交换 载体A(CM-Sepha;rose化st Flow)的柱连结制成一体型柱，使用该一体型柱进行抗体的分 离。
[0巧7] 在Omnif it公司制的柱（ID 0.66cmX柱长化ei曲t)7cm)中分别填充作为蛋白质A 载体的MabSelect SuRe(GE Healthcare公司）、作为阳离子交换载体A的CM-Sepharose 化St Flow(GE化althcare公司），将两根柱按照填充有蛋白质A载体的柱、填充有阳离子交 换载体A的柱的顺序进行连结，作为整体的柱实施色谱操作。W制备成2.5mg/mL的人多克隆 抗体(GAMMA-GL0脚LIN-NICHIYAKU:日本制药)作为载样液，在比较例3的色谱条件下进行分 离。需要说明的是，1柱体积是W1根柱体积为2.4mL进行操作。在洗脱液中添加精氨酸使最 终浓度为50-100mM，在抑5~6下用凝胶过滤色谱进行单体含量的测定。另外，根据其峰面积 值分析求出各级分的单体量和凝聚体量。
[0258]连结柱色谱条件
[0巧9]柱：ID 0.66cmX柱长(Height)7cm、2.4mL容量(Omnifit公司制）的连结体 [0260] 流速:0.4mL/分(保留时间：6分钟），其中CIP W后为0.8mL/分 惦61] 多克隆抗体（IgG) :GAMMA-GL0脚LIN-NICHIYAKU(日本制药）
[0%2]载样液：2.5mg-IgG/mL(PBS、抑7.4;10mM憐酸、150mM NaCl等）
[0%3] 平衡化(5柱体积）:PBS、pH7.4
[0264] 载样量(40mg)
[0265] 清洗(5 柱体积）：PBS、pH7.4
[0%6]清洗2(4柱体积）：10mM Tris/肥l、pH7 [0267]洗脱梯度(40柱体积）:A^B线性梯度 [0%引 A液：lmM巧樣酸、P册.7
[0269] B液：250mM巧樣酸、P 册.7
[0270] 再生(4柱体积）：50mM巧樣酸、250mM氯化钢、P册.7
[0271] CIP(4柱体积）：0.1M氨氧化钢、1M氯化钢
[0272] 中和?再平衡化(4柱体积）：PBS、pH7.4
[0273] 作为色谱的结果，将CIP分级为止的各分级的单体和凝聚体的峰面积值示于图12。 运时，在将比较例2的40mg抗体载样试验的洗脱级分中的单体量设为100的情况下，参考例1 中再生级分为止回收得到的单体为21.2%，另外，单体含量为99.0% XIP级分为止回收得 到的单体为73.7%，单体含量为83.3%。在将填充有W地a小于4.0的簇基作为配体的阳离 子交换载体A的柱与填充有蛋白质A载体的柱连结使用时，能够离子强度洗脱的单体回收率 较差。
[0274] (实施例1)
[0275] 将填充有蛋白质A载体的柱与填充有W簇基作为配体的阳离子交换载体B (TOYOPEARL CM-650M)的柱连结制成一体型柱，使用该一体型柱进行抗体的分离。
[0276] 在Omnif it公司制的柱（ID 0.66cmX柱长化ei曲t)7cm)中分别填充作为蛋白质A 载体的MabSelect SuRe(GE Healthcare公司）、作为阳离子交换载体B的TOYOPEARL CM- 650M(东曹株式会社），将两根柱按照填充有蛋白质A载体的柱、填充有阳离子交换载体B的 柱的顺序进行连结，作为整体的柱实施色谱操作。W制备成2.5mg/mL的人多克隆抗体 (GAMMA-GLOBULIN-NICHIYAKU:日本制药)作为载样液，在比较例3的色谱条件下进行分离。 需要说明的是，1柱体积是W1根柱体积为2.4mL进行操作。在洗脱液中添加精氨酸使最终浓 度为50-100mM，在抑5~6下用凝胶过滤色谱进行单体含量的测定。另外，根据其峰面积值分 析求出各级分的单体量和凝聚体量。
[0277] 作为色谱的结果，将CIP级分为止的各级分的单体和凝聚体的峰面积值示于图13。 运时，在将相同载样量的比较例2的40mg抗体载样试验的洗脱级分中的单体量设为100的情 况下，实施例1中再生级分为止回收得到的单体为91.6%，另外，单体含量为96.7%。
[0278] 对于表2的各连结柱的评价结果，将再生级分为止的单体回收率、再生级分为止的 混合液中的单体含量、单体回收率80%为止的洗脱液混合液中的单体含量与比较例2进行 比较而示出。比较例2的再生级分为止的CIP级分为止回收得到的单体为99.9%，单体含量 为93.5%。即使在单体回收率为80%的时刻进行比较，相对于比较例2的单体含量为 93.4 %，实施例1的单体含量为97.1 %，单体含量也得到了提高。
[0279] (实施例2)
[0280] 将填充有蛋白质A载体的柱与填充有W簇基作为配体的阳离子交换载体C (化actogel COO(M))的柱连结制成一体型柱，使用该一体型柱进行抗体的分离。
[0281] 在Omnifit公司制的柱（ID 0.66cmX柱长化ei曲t)7cm)中分别填充作为蛋白质A 载体的MabSelect SuRe(GE Healthcare公司）、作为阳离子交换载体C的化actogel COO(M) (Merck公司），将两根柱按照填充有蛋白质A载体的柱、填充有阳离子交换载体C的柱的顺序 进行连结，作为整体的柱实施色谱操作。W制备成2.5mg/mL的人多克隆抗体（GAMMA- 化0B化IN-NICHIYAKU:日本制药)作为载样液，在比较例3的色谱条件下进行分离。需要说明 的是，1柱体积是W1根柱体积为2.4mL进行操作。在洗脱液中添加精氨酸使最终浓度为50- lOOmM，在pH5~6下用凝胶过滤色谱进行单体含量的测定。另外，根据其峰面积值分析求出 各级分的单体量和凝聚体量。
[0282] 作为色谱的结果，将CIP级分为止的各级分的单体和凝聚体的峰面积值示于图14。 运时，将与相同载样量的比较例2的40mg抗体载样试验的洗脱级分中的单体量设为100的情 况下，实施例 2中再生级分为止回收得到的单体为86.7%，另外，单体含量为99.2%。
[0283] 对于表2的各连结柱的评价结果，将再生级分为止的单体回收率、再生级分为止的 混合液中的单体含量、单体回收率80%为止的洗脱液混合液中的单体含量与比较例2进行 比较而示出。比较例2的再生级分为止的CIP级分为止回收得到的单体为99.9%，单体含量 为93.5%。即使在单体回收率为80%的时刻进行比较，相对于比较例2的单体含量为 93.4%，实施例2的单体含量为99.2%，单体含量也得到了提高。
[0284] (实施例3)
[0285] 使用将填充有蛋白质A载体的柱与填充有W簇基为配体的阳离子交换载体D (G ly oxa ^COOH)的柱连结而成的柱进行抗体的分离。
[0286] 在Omnifit公司制的柱（ID 0.66cmX柱长化ei曲t)7cm)中分别填充作为蛋白质A 载体的MabSelect SuRe(GE Healthcare公司）、作为阳离子交换载体D的Glyoxal-COOH，将 两根柱按照填充有蛋白质A载体的柱、填充有阳离子交换载体D的柱的顺序进行连结，作为 整体的柱实施色谱操作。W制备成2.5mg/血的人多克隆抗体(GAMMA-GL0脚LIN-NICHIYAKU: 日本制药)作为载样液，在比较例3的色谱条件下进行分离。需要说明的是，1柱体积是根 柱体积为2.4mL进行操作。在洗脱液中添加精氨酸使最终浓度为50-100mM，在抑5~6下用凝 胶过滤色谱进行单体含量的测定。另外，根据其峰面积值分析求出各级分的单体量和凝聚 体量。
[0287] 作为色谱的结果，将CIP级分为止的各级分的单体和凝聚体的峰面积值示于图15。 运时，在将相同载样量的比较例2的40mg抗体载样试验的洗脱级分中的单体量设为100的情 况下，实施例3中再生级分为止回收得到的单体为102.0%，另外，单体含量为96.7%。回收 率超过100%可W认为是凝胶过滤时注入量的误差，根据图15的单体与凝聚体的分离行为 可W判断，不会对与比较例的单体含量的比较造成影响。
[0288] 对于表2的各连结柱的评价结果，将再生级分为止的单体回收率、再生级分为止的 混合液中的单体含量、单体回收率80%为止的洗脱液混合液中的单体含量与比较例2进行 比较而示出。比较例2的再生级分为止的CIP级分为止回收得到的单体为99.9%，单体含量 为93.5%。即使在单体回收率为80%的时刻进行比较，相对于比较例2的单体含量为 93.4%，实施例3的单体含量为99.1 %，单体含量也得到了提高。
[0289] (实施例4)
[0290] 将蛋白质A载体与W簇基作为配体的阳离子交换载体D(Glyoxal-COOH)混合填充 于一个柱内制成混合型柱，使用该混合型柱进行抗体的分离。
[0291] 将作为蛋白质A载体的MabSelect SuRe(GE化althcare公司）与作为阳离子交换 载体D的Glyoxal-COOH分别W4:1 (体积比）进行混合而填充于Omnif it公司制的柱（ID 0.66cm X柱长化e i曲t) 7cm)中，W制备成2.5mg/mL的人多克隆抗体（GAMMA-GL0BULIN- NICHIYAKU:日本制药)作为载样液，在比较例2的色谱条件下进行分离。抗体载样量为lOmg。 需要说明的是，1柱体积是W1根柱体积为2.4mL进行操作。在洗脱液中添加精氨酸使最终浓 度为50-100mM，在抑5~6下用凝胶过滤色谱进行单体含量的测定。另外，根据其峰面积值分 析求出各级分的单体量和凝聚体量。
[0292] 作为色谱的结果，将CIP级分为止的各级分的单体和凝聚体的峰面积值示于图16。 运时，在将相同载样量的比较例2的lOmg抗体载样试验的洗脱级分中的单体量设为100的情 况下，实施例4中再生级分为止回收得到的单体为103.0%，另外，单体含量为97.3%。回收 率超过100%可W认为是凝胶过滤时的注入量的误差，根据图16的单体与凝聚体的分离行 为可W判断，不会对与比较例的单体含量的比较造成影响。
[0293] 对于表3的各连结柱的评价结果，将再生级分为止的单体回收率、再生级分为止的 混合液中的单体含量、单体回收率80%为止的洗脱液混合液中的单体含量与比较例2进行 比较而示出。比较例2的再生级分为止的CIP级分为止回收得到的单体为99.9%，单体含量 为96.5%。即使在单体回收率为80%的时刻进行比较，相对于比较例2的单体含量为 97.1 %，实施例4的单体含量为99.1 %，单体含量也得到了提高。
[0巧4] 表2
[0295]
[0298] W上，根据本发明（第一方式），可W提供一种新分离模式和使用方法，能够有助于 抗体医药品的制造工艺的生产率提高和高纯度化，所述新分离模式和使用方法在将亲和载 体与阳离子交换载体制成连结柱或混合柱而整体地进行抗体等的吸附和洗脱的抗体等的 纯化方法中，能够实现80% W上的高回收率，或者即使未实现80% W上的回收率也能使单 体(monomer)含量提高。
[0299] 此外，根据本发明（第二方式），在将地a为4.0W上的阳离子交换载体用于亲和色 谱洗脱的抑4.0W下的酸性溶液中进行依赖离子强度的洗脱时，抗体回收率为80% W上且 能够提高单体含量。另外，根据本发明（第二方式），不需要临时回收蛋白质A载体的洗脱液， 将亲和载体与阳离子交换载体制成连结柱或混合柱能够整体地进行抗体等的吸附和洗脱。
[0300] 目P，通过利用本发明（第二方式）的使用方法，在从亲和载体上进行祀分子的洗脱 的酸性洗脱抑下从阳离子交换载体上进行抗体等的分离、或者将亲和载体与阳离子交换载 体制成连结柱或混合柱而整体地进行抗体等的吸附和洗脱，由此，能够有助于抗体医药品 的制造工艺的生产率提高和高纯度化。
【主权项】
1. 一种抗体或源自抗体的物质的纯化方法，该方法包括:使用载体1和载体2制成连结 柱或混合柱，整体地对抗体或源自抗体的物质进行吸附和洗脱，所述载体1具有对抗体或源 自抗体的物质的亲和配体，所述载体2具有阳离子交换基团。2. -种抗体或源自抗体的物质的纯化方法，该方法是使用了载体1和载体2的抗体或源 自抗体的物质的纯化方法，所述载体1具有对抗体或源自抗体的物质的亲和配体，所述载体 2具有阳呙子交换基团， 该方法包括:使含有抗体或源自抗体的物质的液体通过一体型柱或混合型柱而将抗体 或源自抗体的物质载样于柱中，所述一体型柱在填充有所述载体1的柱的下游侧直接连结 了填充有所述载体2的柱，所述混合型柱填充有所述载体1和载体2两者的混合物， 接着，通过使洗脱液通过而对载样后的抗体或源自抗体的物质进行洗脱。3. 根据权利要求1或2所述的纯化方法，其中，在酸性pH下、且以离子强度梯度进行所述 抗体或源自抗体的物质的洗脱。4. 根据权利要求1或2所述的纯化方法，其中，在酸性pH下、且以离子强度逐级进行所述 抗体或源自抗体的物质的洗脱。5. 根据权利要求2~4中任一项所述的纯化方法，其中，用平衡溶液对所述一体型柱或 混合型柱进行平衡，并对所述含有抗体或源自抗体的物质的溶液进行载样，在该载样之后 且洗脱开始之前通入清洗液，所述清洗液的离子强度低于平衡溶液和含有抗体或源自抗体 的物质的溶液，且pH高于洗脱液。6. 根据权利要求2~4中任一项所述的纯化方法，其中，用平衡溶液对所述一体型柱或 混合型柱进行平衡，并对所述含有抗体或源自抗体的物质的溶液进行载样，在该载样之后 且洗脱开始之前，通入与平衡溶液和含有抗体或源自抗体的物质的溶液相比具有相同或更 高的离子强度，且pH高于洗脱液的清洗液，接着再通入离子强度低于平衡溶液和含有抗体 或源自抗体的物质的溶液，且pH高于洗脱液的清洗液。7. 根据权利要求1~6中任一项所述的纯化方法，其中，所述具有亲和配体的载体1是以 蛋白质A、蛋白质G、蛋白质L或它们的类似物作为配体的载体。8. 根据权利要求1~7中任一项所述的纯化方法，其中，所述具有亲和配体的载体1是以 蛋白质A或其类似物作为配体的载体。9. 根据权利要求1~8中任一项所述的纯化方法，其中，所述抗体或源自抗体的物质为 免疫球蛋白G、免疫球蛋白G衍生物、或含Fc分子。10. 根据权利要求1~9中任一项所述的纯化方法，其中，所述抗体或源自抗体的物质为 Fab、scFv、双抗体、或含有抗原结合部位的分子。11. 根据权利要求1~10中任一项所述的纯化方法，其中，所述具有阳离子交换基团的 载体2是以羧基为配体的载体。12. 根据权利要求11所述的纯化方法，其中，所述羧基源自酸性氨基酸。13. 根据权利要求1~12中任一项所述的纯化方法，其中，所述抗体或源自抗体的物质 的洗脱pH小于5.0。14. 根据权利要求1~13中任一项所述的纯化方法，其中，所述载体1对IgG的保留时间 为6分钟时的10 % DBC为lmg/mL以上且100mg/mL以下。15. 根据权利要求1~14中任一项所述的纯化方法，其中，所述载体2的离子交换容量为 Ο. OOlmmol/mL 以上且 0.5mmol/mL以下。16. 根据权利要求1~15中任一项所述的纯化方法，其中，所述载体1的体积平均粒径为 Ιμπι以上且ΙΟΟΟμηι以下，所述载体2的体积平均粒径为Ιμπι以上且ΙΟΟΟμηι以下。17. 根据权利要求1~16中任一项所述的纯化方法，其中，将含有抗体或源自抗体的物 质的溶液载样于载体2,然后使用ρΗ4.0以下的酸性缓冲液对抗体或源自抗体的物质进行洗 脱，所述载体2具有阳离子交换基团，该阳离子交换基团具有pKa为4.0以上且含有羧基的配 体。18. 根据权利要求1~17中任一项所述的纯化方法，其中，所述载体2对IgG的保留时间 为6分钟时的10%DBC为lmg/mL以上且200mg/mL以下，所述载体2具有阳离子交换基团，该阳 离子交换基团具有含有羧基的配体。19. 根据权利要求2~18中任一项所述的纯化方法，其中，在填充有所述具有阳离子交 换基团的载体2的柱之前连结填充有具有亲和配体的载体1的柱，制作一体型柱，在中性pH 条件下将含有抗体或源自抗体的物质的溶液载样于所述一体型柱中，然后使用PH4.0以下 的酸性缓冲液对抗体或源自抗体的物质进行洗脱。20. 根据权利要求2~19中任一项所述的纯化方法，其中，构成所述一体型柱的载体1与 载体2的比例以体积标准计为1/20以上且20/1以下。21. 根据权利要求2~18中任一项所述的纯化方法，其中，制作以混合状态具有所述具 有阳离子交换基团的载体2和具有亲和配体的载体1的混合型柱，在中性pH条件下对含有抗 体或源自抗体的物质的溶液进行载样，并使用PH4.0以下的酸性缓冲液对抗体或源自抗体 的物质进行洗脱。22. 根据权利要求2~18、21中任一项所述的纯化方法，其中，构成所述混合型柱的载体 1与载体2的比例以体积标准计为1/20以上且20/1以下。23. 根据权利要求1~22中任一项所述的纯化方法，其中，在吸附条件下，相对于载体1 对I gG的保留时间为6分钟时的10 % DBC，载体2对I gG的保留时间为6分钟时的10 % DBC为1 / 10倍以上且10倍以下。24. -种抗体或源自抗体的物质，其是用权利要求1~23中任一项所述的纯化方法进行 纯化而得到的。25. -种具有阳离子交换基团的载体的使用方法，该方法包括:将含有抗体或源自抗体 的物质的溶液载样于载体2中，然后使用pH4.0以下的酸性缓冲液对抗体或源自抗体的物质 进行洗脱，所述载体2具有阳离子交换基团，该阳离子交换基团具有pKa为4.0以上且含有羧 基的配体。26. 根据权利要求25所述的使用方法，其中，所述含有羧基的配体源自酸性氨基酸。27. 根据权利要求25或26所述的使用方法，其中，所述载体2对IgG的保留时间为6分钟 时的10%DBC为lmg/mL以上且200mg/mL以下，所述载体2具有阳离子交换基团，该阳离子交 换基团具有含有羧基的配体。28. 根据权利要求25~27中任一项所述的使用方法，其中，所述具有阳离子交换基团的 载体2的离子交换容量为0.001mmol/mL以上且0.5mmol/mL以下。29. 根据权利要求25~28中任一项所述的使用方法，其中，所述具有阳离子交换基团的 载体2的体积平均粒径为Ιμπι以上且1 ΟΟΟμπι以下。30. 根据权利要求25~29中任一项所述的使用方法，其中，在填充有所述具有阳离子交 换基团的载体2的柱之前连结填充有具有亲和配体的载体1的柱，制作一体型柱，在中性pH 条件下将含有抗体或源自抗体的物质的溶液载样于所述一体型柱中，然后使用PH4.0以下 的酸性缓冲液对抗体或源自抗体的物质进行洗脱。31. 根据权利要求25~29中任一项所述的使用方法，其中，制作以混合状态具有所述具 有阳离子交换基团的载体2和具有亲和配体的载体1的混合型柱，在中性pH条件下对含有抗 体或源自抗体的物质的溶液进行载样，并使用PH4.0以下的酸性缓冲液对抗体或源自抗体 的物质进行洗脱。32. 根据权利要求30或31所述的使用方法，其中，用平衡溶液对所述一体型柱或混合型 柱进行平衡，并对所述含有抗体或源自抗体的物质的溶液进行载样，在该载样之后且洗脱 开始之前通入清洗液，所述清洗液的离子强度低于平衡溶液和含有抗体或源自抗体的物质 的溶液，且pH高于洗脱液。33. 根据权利要求30或31所述的使用方法，其中，用平衡溶液对所述一体型柱或混合型 柱进行平衡，并对所述含有抗体或源自抗体的物质的溶液进行载样，在该载样之后且洗脱 开始之前，通入与平衡溶液和含有抗体或源自抗体的物质的溶液相比具有相同或更高的离 子强度、且pH高于洗脱液的清洗液，接着再通入离子强度低于平衡溶液和含有抗体或源自 抗体的物质的溶液、且pH高于洗脱液的清洗液。34. 根据权利要求25~33中任一项所述的使用方法，其中，所述抗体或源自抗体的物质 为免疫球蛋白G、免疫球蛋白G衍生物、含Fc分子、或者Fab、scFv、双抗体或含有抗原结合部 位的分子。35. 根据权利要求25~34中任一项所述的使用方法，其中，在酸性pH下、且以离子强度 梯度进行所述抗体或源自抗体的物质的洗脱。36. 根据权利要求25~34中任一项所述的使用方法，其中，在酸性pH下、且以离子强度 逐级进行所述抗体或源自抗体的物质的洗脱。37. -种抗体或源自抗体的物质，其是用权利要求25~36中任一项所述的使用方法进 行纯化而得到的。
【专利摘要】本发明(第一方式)是一种抗体或源自抗体的物质的纯化方法，其特征在于，使用具有对抗体或源自抗体的物质的亲和配体的载体1与具有阳离子交换基团的载体2制成连结柱或混合柱，整体地对抗体或源自抗体的物质进行吸附和洗脱；本发明(第二方式)是具有阳离子交换基团的载体的使用方法，该方法包括，将含有抗体或源自抗体的物质的溶液载样于具有pKa为4.0以上的含有羧基的配体的阳离子交换基团的载体，然后使用pH4.0以下的酸性缓冲液对抗体或源自抗体的物质进行洗脱。
【IPC分类】C07K16/00, C07K1/18, C07K1/22
【公开号】CN105555795
【申请号】CN201480051360
【发明人】水口和信
【申请人】株式会社钟化
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2014年9月16日
【公告号】EP3048109A1, WO2015041218A1
【技术领域】
[0001] 本发明（第一方式)是将具有用于特异性纯化祀分子(例如，抗体或源自抗体的物 质。W下有时将它们总称为抗体等）的亲和配体的载体和具有阳离子交换基团的载体作为 整体来使用而对抗体等进行纯化的方法，本发明设及在一个色谱步骤中实施亲和色谱纯化 和阳离子交换色谱纯化的新抗体纯化方法及由该方法得到的抗体。
[0002] 另外，本发明（第二方式)是使用了阳离子交换基团下也称为具有阳离子交换 基团的载体、阳离子交换载体)的抗体等(抗体或源自抗体的物质）的新纯化法，本发明设及 PH4.0W下的抗体等的纯化方法及由该方法得到的抗体，但作为W簇基为配体的阳离子交 换载体的使用抑，通常不会选择抑4.0W下。
【背景技术】
[0003] 作为W抗体为主药的抗体医药品的主要成分的单克隆抗体，主要使用哺乳类培养 细胞等W重组蛋白质的形式在培养液中表达，通过多步色谱、膜工序纯化至高纯度，然后进 行制剂。抗体医药品为免疫球蛋白G及其类似物，一般而言除了称为抗体的分子W外，还含 有由作为免疫球蛋白分子的恒定区的Fc区与其它功能性蛋白质或肤融合而成的Fc融合蛋 白质(含有化的分子）。而且还包含化b、scFv、W及双抗体(diabody)等低分子化抗体。另外， 运些抗体医药品还包含W微生物为宿主，在其培养上清液中分泌表达的医药品、在菌体内 或菌体外壁和菌体细胞膜之间蓄积表达、纯化、制剂化的医药品。
[0004] 该培养、纯化、制剂化的工序中所形成或残留的凝聚体(二聚体W上的多聚体)成 为副作用的主要原因，因此，降低其含量成为抗体医药品生产的重要课题。在此，所谓单体， 例如在抗体的情况下，将四聚体结构的抗体定义为1个分子单位，所述四聚体结构的抗体具 有下述构成：由作为恒定区的Fc区和可变区构成的重链化链)2分子W及由可变区域构成的 轻链化链)2分子构成。该单位分子的多聚体形成凝聚体，成为抗体医药品的副作用的主要 原因。
[0005] 在培养、纯化、制剂化的工序中通过使用复杂的管理方法及添加剂来尝试了对抑 制凝聚体的生成及其除去进行控制。特别是在纯化工序中，除了抑制凝聚体的生成W外，将 其除去也很重要。因此，在纯化工序中，要求开发一种简便且有效的凝聚体除去技术。
[0006] 抗体医药品的纯化工序中，利用特定单元操作的组合进行的纯化方法的模板化 (平台化)不断发展，在其初期纯化工序（回收工序）中，广泛利用将作为配体的蛋白质A固定 化于水不溶性载体而成的抗体亲和分离基质(蛋白质A载体）。一般而言，使用在中性条件下 使抗体吸附于蛋白质A载体，并在酸性条件下洗脱抗体的方法，但通常通过3步色谱纯化而 使其高纯度化，在蛋白质A色谱工序的后段，可W通过离子交换色谱、疏水性相互作用色谱 等的组合来除去凝聚体等杂质(非专利文献1、非专利文献2、非专利文献3、专利文献5)。
[0007] 亲和配体具有与特定分子特异性结合的功能，将该配体固定化于水不溶性载体而 形成的亲和分离基质（也称为亲和色谱载体、亲和载体)用于从含有生物体成分、重组体的 微生物和哺乳类培养细胞中有效地分离纯化有用物质。作为实际工业上利用的抗体亲和配 体，例如可W举出：由蛋白质A、蛋白G、蛋白L等源自微生物或使它们重组表达而得到的功能 性修饰体(类似物)构成的肤性或蛋白质性配体、骆驼单链抗体（弓夕歹一一本鎖)或抗体的 化受体等重组蛋白质性配体、及嚷挫衍生物等化学合成性配体，可W用于抗体医药品等的 纯化。抗体医药品相对于化学药品显示更低的毒性且显示更高的特异性，因此，作为理想的 医药品，其需求不断增高。
[0008] 对于利用亲和载体的分离纯化而言，其课题在于抗体的凝聚体、源自宿主的杂质、 抗体的分解物等下称为凝聚体等)的除去。
[0009] 例如，作为亲和载体的一个例子，在蛋白质A色谱工序中，通常进行酸性洗脱，但是 由于各种抗体的洗脱抑不同需要时间进行工艺设计，另外洗脱pH越低，形成凝聚体的风险 越高，因此，对蛋白质A配体进行了施加蛋白质工程学修饰的尝试，使得需要抑3左右的较低 pH洗脱的抗体也能够在P册.5~4左右洗脱(专利文献1)。
[0010] 另外，蛋白质A色谱工序后凝聚体含量较多的情况下，在后段的杂质除去工序中会 导致目标单体(monomer)的收率降低，因此，除了尝试抑制蛋白质A色谱工序中的凝聚体形 成W外，还进一步尝试了除去该色谱工序中的凝聚体。
[0011] 另外，在蛋白质A色谱工序的使用中对降低凝聚体等杂质进行了尝试。即，提出了 一种洗脱时的抑或离子强度的优化、W及划分洗脱峰的前半部分和后半部分等的方法。具 体而言，是利用由于作为蛋白质A载体的特性，多聚体化而成的抗体分子W比未多聚体化的 抗体分子有更高的概率与蛋白质A配体接触，因此，解离常数稍微变低，且基于微调疏水性 的分离机制的方法(专利文献2、专利文献3、专利文献4)。但是，运些方法难W进行严密的控 审IJ，而且分离性能较低，无法作为通常的分离方法使用，需要在后段工序中进行杂质除去。
[0012] 蛋白质A色谱所代表的亲和色谱在酸性抑下实施洗脱，但后段的离子交换色谱、疏 水性相互作用色谱等通常在P册W上的抑下进行处理，因此需要调节pH、离子强度。
[0013] 另一方面，阳离子交换载体通常在比其配体的地a更高的pH下使用。另外，对于使 用阳离子交换载体进行纯化的祀蛋白质，在比蛋白质的等电点(pi)更低的抑下进行吸附洗 脱。例如，在pl为8的抗体的纯化中，W地a为2左右的横酸基、pKa为3~5左右的簇基作为配 体的阳离子交换载体使用抑5~6的缓冲液实施吸附洗脱而进行纯化。缓冲液的抑可W设定 为配体的地a与祀蛋白质的pl之间，但使用pH越低于pi，蛋白质的正电荷越多，洗脱离子强 度需要设定得越高，存在回收率降低的倾向。在洗脱液的离子强度较高时，存在必须在后段 的工艺构建中降低离子强度等的限制。另外，在使用抑接近或低于阳离子交换配体的地a的 情况下，配体的负电荷会质子化，导致结合容量降低，通常不选择该情况。因此，在使用阳离 子交换载体的抗体的纯化中，可W对地曰2~5的阳离子交换载体使用抑5~6的缓冲液。
[0014] 在亲和色谱工序之后使用阴离子交换色谱工序、疏水性相互作用色谱工序的情况 下(专利文献8)、在阳离子交换色谱工序之后进行阴离子交换色谱工序的情况下(专利文献 7)或在阳离子交换色谱工序中回收多种目标物质的情况下（专利文献6)，均同样地需要对 pH、离子强度进行调整。
[0015] 对于如上所述对抗体等进行亲和色谱纯化、并在后段的工艺中进行高度纯化而 言，需要调整酸性抑洗脱液的抑、离子强度，连续的初期色谱在提高效率上受到限制。而且， 在进行未采用亲和色谱纯化方法的离子交换色谱工序和疏水性电荷诱导色谱工序时，需要 独立地进行各个工序，无法连续地纯化抗体等，在希望提高效率方面存在限制（专利文献 9)。
[0016] 另外，抗体亲和分离基质对抗体显示出较高的特异性而能够高纯度化，但是，即使 严格地设定使用方法，单体(monomer)与凝聚体等的分离性能也较低，因此作为凝聚体等的 除去工序而旨存在限制。
[0017] 现有技术文献 [0018]专利文献
[0019] 专利文献1:日本专利第4391830号公报
[0020]专利文献 2:W02008/085988
[0021 ] 专利文献3:日本特表2010-507583号公报
[0022] 专利文献 4:W02010/019493
[0023] 专利文献 5:W02010/141039
[0024] 专利文献6:日本特开平05-202098号公报 [00巧]专利文献7:日本特开平06-228200号公报
[0026] 专利文献8:日本特表2010-510963号公报
[0027] 专利文献9:日本特表2008-535913号公报
[0028] 非专利文献
[00巧]非专利文献 1: Hober S.等著、"J. C虹omatogr. B"、2007年、848卷、40-47页
[0030] 非专利文献2:Low D.等著、"J.C虹omatogr.B"、2007年、848卷、48-63页
[0031] 非专利文献3:Roque A. C. A.等著、"J. C虹omatogr.心'、2007年、1160卷、44-55页 [00创发明的内容
[0033] 发明要解决的课题
[0034] 本发明（第一方式)的目的在于提供一种新抗体纯化方法，该方法能够在抗体或含 化分子或化b、scFv等低分子化抗体等源自抗体的物质的纯化工序的第一色谱工序中使作 为亲和纯化的主要目标的抗体自身高纯度化，而且可W提高单体的选择性分离特性，对于 凝聚体等的除去而言，能够降低对后段的杂质除去工序的负荷或省略后段的杂质除去工 序。
[0035] 本发明（第二方式)的目的在于提供一种抗体纯化方法，该方法是在抗体等的纯化 中，作为回收色谱工序在后段的工艺中对亲和色谱纯化物高纯度地进行纯化时需要的抗体 纯化方法，该方法不需要调整酸性pH洗脱液的pH、离子强度而能提高效率。
[0036] 解决课题的方法
[0037] 本发明人对上述课题进行了深入研究，结果发现了如下新分离方法，该方法将具 有对抗体或源自抗体的物质的亲和配体的载体和具有阳离子交换基团的载体两者填充于 同一柱内或连结柱内，同时实施两种色谱，由此，能够兼具特异性吸附性能与优异的凝聚体 等除去性能，从而完成了本发明（第一方式）。
[0038] 另外，本发明者对上述课题进行了深入研究，结果发现了如下阳离子交换载体的 新分离方法，该方法包括:在洗脱抗体亲和载体的酸性抑下进行抗体等对阳离子交换载体 的吸附洗脱，得到抗体的降低了凝聚体等杂质的级分，从而完成了本发明（第二方式）。
[0039] 旨P，本发明（第一方式)的主旨如下：
[0040] [ 1 ] -种抗体或源自抗体的物质的纯化方法，该方法包括:使用载体1和载体2制成 连结柱或混合柱，整体地对抗体或源自抗体的物质进行吸附和洗脱，所述载体1具有对抗体 或源自抗体的物质的亲和配体，所述载体2具有阳离子交换基团。
[0041] [2]-种抗体或源自抗体的物质的纯化方法，该方法是使用了载体1和载体2的抗 体或源自抗体的物质的纯化方法，所述载体1具有对所述抗体或源自抗体的物质的亲和配 体，所述载体2具有阳离子交换基团，
[0042] 该方法包括:使含有抗体或源自抗体的物质的液体通过一体型柱或混合型柱而将 抗体或源自抗体的物质载样于柱中，所述一体型柱在填充有所述载体1的柱的下游侧直接 连结了填充有所述载体2的柱，所述混合型柱填充有所述载体1和载体2两者的混合物，
[0043] 接着，通过使洗脱液通过而对载样后的抗体或源自抗体的物质进行洗脱。
[0044] [3]根据[1]或[2]所述的纯化方法，其中，在酸性pH下、且W离子强度梯度进行所 述抗体或源自抗体的物质的洗脱。
[0045] [4]根据[1]或[2]所述的纯化方法，其中，在酸性pH下、且W离子强度逐级进行所 述抗体或源自抗体的物质的洗脱。
[0046] [5]根据[2]~[4]中任一项所述的纯化方法，其中，用平衡溶液对所述一体型柱或 混合型柱进行平衡，并对所述含有抗体或源自抗体的物质的溶液进行载样，在该载样之后 且洗脱开始之前通入清洗液，所述清洗液的离子强度低于平衡溶液和含有抗体或源自抗体 的物质的溶液，且抑高于洗脱液。
[0047] [6]根据[2]~[4]中任一项所述的纯化方法，其中，用平衡溶液对所述一体型柱或 混合型柱进行平衡，并对所述含有抗体或源自抗体的物质的溶液进行载样，在该载样之后 且洗脱开始之前，通入与平衡溶液和含有抗体或源自抗体的物质的溶液相比具有相同或更 高的离子强度，且抑高于洗脱液的清洗液，接着再通入离子强度低于平衡溶液和含有抗体 或源自抗体的物质的溶液，且抑高于洗脱液的清洗液。
[0048] [7]根据[1]~[6]中任一项所述的纯化方法，其中，所述具有亲和配体的载体1是 W蛋白质A、蛋白质G、蛋白质L或它们的类似物作为配体的载体。
[0049] [引根据[1]~[7]中任一项所述的纯化方法，其中，所述具有亲和配体的载体1是 W蛋白质A或其类似物作为配体的载体。
[0050] [9]根据[1]~[引中任一项所述的纯化方法，其中，所述抗体或源自抗体的物质为 免疫球蛋白G、免疫球蛋白G衍生物、或含Fc分子。
[0051] [10]根据[1]~[9]中任一项所述的纯化方法，其中，所述抗体或源自抗体的物质 为化b、scFv、双抗体、或含有抗原结合部位的分子。
[0052] [11]根据[1]~[10]中任一项所述的纯化方法，其中，所述具有阳离子交换基团的 载体2是W簇基为配体的载体。
[0053] [ 12]根据[11 ]所述的纯化方法，其中，所述簇基源自酸性氨基酸。
[0054] [13]根据[1]~[12]中任一项所述的纯化方法，其中，所述抗体或源自抗体的物质 的洗脱piH小于5.0。
[0055] [14]根据[1]~[13]中任一项所述的纯化方法，其中，所述载体1对IgG的保留时间 为6分钟时的10 % DBC为Img/mL W上且1 OOmg/mL W下。
[0056] [15]根据[1]~[14]中任一项所述的纯化方法，其中，所述载体2的离子交换容量 为ο. OOlmmol/mLW 上且ο. 5mmol/mLW下。
[0057] [16]根据[1]~[15]中任一项所述的纯化方法，其中，所述载体1的体积平均粒径 为Ιμηι W上且1 ΟΟΟμηι W下，所述载体2的体积平均粒径为Ιμηι W上且1 ΟΟΟμηι W下。
[0058] [17]根据[1]~[16]中任一项所述的纯化方法，其中，将含有抗体或源自抗体的物 质的溶液载样于载体2,然后使用PH4.0W下的酸性缓冲液对抗体或源自抗体的物质进行洗 脱，所述载体2具有阳离子交换基团，该阳离子交换基团具有地a为4.0W上且含有簇基的配 体。
[0059] [1引根据[1]~[17]中任一项所述的纯化方法，其中，所述载体2对IgG的保留时间 为6分钟时的10%DBC为Img/血W上且200mg/mLW下，所述载体2具有阳离子交换基团，该阳 离子交换基团具有含有簇基的配体。
[0060] [19]根据[2]~[1引中任一项所述的纯化方法，其中，在填充有所述具有阳离子交 换基团的载体2的柱之前连结填充有具有亲和配体的载体1的柱，制作一体型柱，在中性pH 条件下将含有抗体或源自抗体的物质的溶液载样于所述一体型柱中，然后使用抑4.0W下 的酸性缓冲液对抗体或源自抗体的物质进行洗脱。
[0061] [20]根据[2]~[19]中任一项所述的纯化方法，其中，构成所述一体型柱的载体1 与载体2的比例W体积标准计为1/20W上且20/1W下。
[0062] [21]根据[2]~[1引中任一项所述的纯化方法，其中，制作W混合状态具有 所述具 有阳离子交换基团的载体2和具有亲和配体的载体1的混合型柱，在中性pH条件下对含有抗 体或源自抗体的物质的溶液进行载样，并使用抑4.0W下的酸性缓冲液对抗体或源自抗体 的物质进行洗脱。
[0063] [22]根据[2]~[1引、[21]中任一项所述的纯化方法，其中，所述构成混合型柱的 载体1与载体2的比例W体积标准计为1/20W上且20/1W下。
[0064] [23]根据[1]~[22]中任一项所述的纯化方法，其中，在吸附条件下，相对于载体1 对I gG的保留时间为6分钟时的10 % DBC，载体2对I gG的保留时间为6分钟时的10 % DBC为1 / 10倍W上且10倍W下。
[0065] [24]-种抗体或源自抗体的物质，其是用[1]~[23]中任一项所述的纯化方法进 行纯化而得到的。
[0066] 本发明（第二方式)的主旨如下：
[0067] [1] -种具有阳离子交换基团的载体的使用方法，该方法包括:将含有抗体或源自 抗体的物质的溶液载样于载体2中，然后使用pH4.0W下的酸性缓冲液对抗体或源自抗体的 物质进行洗脱，所述载体2具有阳离子交换基团，该阳离子交换基团具有地a为4.0W上且含 有簇基的配体。
[0068] [2]根据[1]所述的使用方法，其中，所述含有簇基的配体源自酸性氨基酸。
[0069] [3]根据[1]或[2]所述的使用方法，其中，所述载体2对IgG的保留时间为6分钟时 的10%DBC为Img/mLW上且200mg/mLW下，所述载体2具有阳离子交换基团，该阳离子交换 基团具有含有簇基的配体。
[0070] [4]根据[1]~[3]中任一项所述的使用方法，其中，所述具有阳离子交换基团的载 体2的离子交换容量为0.0 Olmmol/mLW上且0.5mmol/mLW下。
[0071] [5]根据[1]~[4]中任一项所述的使用方法，其中，所述具有阳离子交换基团的载 体2的体积平均粒径为Ιμηι W上且1 ΟΟΟμηι W下。
[0072] [6]根据[1]~[引中任一项所述的使用方法，其中，在填充有所述具有阳离子交换 基团的载体2的柱之前连结填充有具有亲和配体的载体1的柱，制作一体型柱，在中性pH条 件下将含有抗体或源自抗体的物质的溶液载样于所述一体型柱中，然后使用抑4.0W下的 酸性缓冲液对抗体或源自抗体的物质进行洗脱。
[0073] [7]根据[1]~[引中任一项所述的使用方法，其中，制作W混合状态具有所述具有 阳离子交换基团的载体2和具有亲和配体的载体1的混合型柱，在中性pH条件下对含有抗体 或源自抗体的物质的溶液进行载样，并使用抑4.0W下的酸性缓冲液对抗体或源自抗体的 物质进行洗脱。
[0074] [引根据[6]或[7]所述的使用方法，其中，用平衡溶液对所述一体型柱或混合型柱 进行平衡，并对所述含有抗体或源自抗体的物质的溶液进行载样，在该载样之后且洗脱开 始之前通入清洗液，所述清洗液的离子强度低于平衡溶液和含有抗体或源自抗体的物质的 溶液，且抑高于洗脱液。
[0075] [9]根据[6]或[7]所述的使用方法，其中，用平衡溶液对所述一体型柱或混合型柱 进行平衡，并对所述含有抗体或源自抗体的物质的溶液进行载样，在该载样之后且洗脱开 始之前，通入与平衡溶液和含有抗体或源自抗体的物质的溶液相比具有相同或更高的离子 强度，且pH高于洗脱液的清洗液，接着再通入离子强度低于平衡溶液和含有抗体或源自抗 体的物质的溶液，且抑高于洗脱液的清洗液。
[0076] [10]根据[1]~[9]中任一项所述的使用方法，其中，所述抗体或源自抗体的物质 为免疫球蛋白G、免疫球蛋白G衍生物、含化分子、或者化b、scFv、双抗体或含有抗原结合部 位的分子。
[0077] [11]根据[1]~[10]中任一项所述的使用方法，其中，在酸性pH下、且W离子强度 梯度进行所述抗体或源自抗体的物质的洗脱。
[0078] [12]根据[1]~[10]中任一项所述的使用方法，其中，在酸性pH下、且W离子强度 逐级进行所述抗体或源自抗体的物质的洗脱。
[0079] [13]-种抗体或源自抗体的物质，其是用[1]~[12]中任一项所述的使用方法进 行纯化而得到的。
[0080] 发明的效果
[0081] 根据本发明（第一方式），能够在作为抗体或含化分子或化b、scFv等低分子化抗体 等源自抗体的物质的纯化工序的第一工序的亲和色谱工序中，使作为亲和纯化的主要目标 的抗体自身高纯度化，而且可W提高单体的选择性分离特性，能够减轻对后段的杂质除去 工序的负荷。
[0082] 根据本发明（第二方式），在作为抗体等的纯化工序的第一工序的亲和色谱工序之 后，能够直接用阳离子交换色谱处理其洗脱液，另外，能够在与亲和载体的酸性洗脱抑相同 的pH下进行抗体等对阳离子交换载体的吸附洗脱，因此，能够通过亲和色谱纯化与阳离子 交换色谱纯化整体处理来有效地构建工艺。另外，根据本发明（第二方式），能够W较高的含 量(纯度)得到纯化后的单体抗体。需要说明说的是，在W下的附图的简单说明中，第一方式 参照图1~10、12~16,第二方式参照图1~16。
【附图说明】
[0083] 图1是示出按照蛋白质A亲和色谱工序、病毒失活工序、及阳离子交换色谱工序的 顺序进行的现有流程的图。
[0084] 图2是示出本发明的一个例子的流程图，是示出了在同时进行蛋白质A亲和色谱工 序及阳离子交换色谱工序之后进行病毒失活工序的流程的图。
[0085] 图3是示出抑3.7、口^.2、口^.7时的具有各阳离子交换基团的载体的10%漏出080 的图。
[0086] 图4是示出使用了填充有具有阳离子交换基团的载体（阳离子交换载体A)的柱时 的单体抗体(空白）和凝聚体抗体(斜线）的洗脱的图（横轴表示洗脱体积(mU、左纵轴表示 峰面积比率（％ )、右纵轴表示离子强度(mM))。
[0087] 图5是示出使用了填充有具有阳离子交换基团的载体（阳离子交换载体B)的柱时 的单体抗体(空白）和凝聚体抗体(斜线）的洗脱的图（横轴表示洗脱体积(mU、左纵轴表示 峰面积比率（％ )、右纵轴表示离子强度(mM))。
[0088] 图6是示出使用了填充有具有阳离子交换基团的载体（阳离子交换载体C)的柱时 的单体抗体(空白）和凝聚体抗体(斜线）的洗脱的图（横轴表示洗脱体积(mU、左纵轴表示 峰面积比率（％ )、右纵轴表示离子强度(mM))。
[0089] 图7是示出使用了填充有具有阳离子交换基团的载体（阳离子交换载体D)的柱时 的单体抗体(空白）和凝聚体抗体(斜线）的洗脱的图（横轴表示洗脱体积(mU、左纵轴表示 峰面积比率（％ )、右纵轴表示离子强度(mM))。
[0090] 图8是示出使用填充了具有蛋白质A亲和配体的载体(蛋白质A载体）的柱、且抗体 载样量为lOmg时的单体抗体（空白）和凝聚体抗体(斜线）的洗脱的图（横轴表示洗脱体积 (mU、左纵轴表示峰面积值、右纵轴表示离子强度(mM))。
[0091] 图9是示出使用填充了具有蛋白质A亲和配体的载体(蛋白质A载体）的柱、且抗体 载样量为30mg时的单体抗体（空白）和凝聚体抗体(斜线）的洗脱的图（横轴表示洗脱体积 (mU、左纵轴表示峰面积值、右纵轴表示离子强度(mM))。
[0092] 图10是示出使用填充了具有蛋白质A亲和配体的载体(蛋白质A载体)的柱、且抗体 载样量为40mg时的单体抗体（空白）和凝聚体抗体(斜线）的洗脱的图（横轴表示洗脱体积 (mU、左纵轴表示峰面积值、右纵轴表示离子强度(mM))。
[0093] 图11是示出在填充了具有蛋白质A亲和配体的载体(蛋白质A载体）的柱的正下方 连结有具有阳离子交换基团的载体(SP-Se地arose Fast Flow、阳离子交换载体A)的柱时 的单体抗体(空白）和凝聚体抗体(斜线）的洗脱的图（横轴表示洗脱体积(mU、左纵轴表示 峰面积值、右纵轴表示离子强度(mM))。
[0094] 图12是示出在填充了具有蛋白质A亲和配体的载体(蛋白质A载体）的柱的正下方 连结有具有阳离子交换基团的载体(阳离子交换载体A)的柱时的单体抗体(空白）和凝聚体 抗体(斜线）的洗脱的图（横轴表示洗脱体积(mU、左纵轴表示峰面积值、右纵轴表示离子强 度(mM))。
[0095] 图13是示出在填充了具有蛋白质A亲和配体的载体(蛋白质A载体）的柱的正下方 连结有具有阳离子交换基团的载体(阳离子交换载体B)的柱时的单体抗体(空白）和凝聚体 抗体(斜线）的洗脱的图（横轴表示洗脱体积(mU、左纵轴表示峰面积值、右纵轴表示离子强 度(mM))。
[0096] 图14是示出在填充了具有蛋白质A亲和配体的载体(蛋白质A载体）的柱的正下方 连结有具有阳离子交换基团的载体(阳离子交换载体C)的柱时的单体抗体(空白）和凝聚体 抗体(斜线）的洗脱的图（横轴表示洗脱体积(mU、左纵轴表示峰面积值、右纵轴表示离子强 度(mM))。
[0097] 图15是示出在填充了具有蛋白质A亲和配体的载体(蛋白质A载体）的柱的正下方 连结有具有阳离子交换基团的载体(阳离子交换载体D)的柱时的单体抗体(空白）和凝聚体 抗体(斜线）的洗脱的图（横轴表示洗脱体积(mU、左纵轴表示峰面积值、右纵轴表示离子强 度(mM))。
[0098] 图16是示出将具有蛋白质A亲和配体的载体(蛋白质A载体)与具有阳离子交换基 团的载体(阳离子交换载体D)混合于同一柱中时的单体抗体(空白）和凝聚体抗体(斜线）的 洗脱的图（横轴表示洗脱体积(mU、左纵轴表示峰面积值、右纵轴表示离子强度(mM))。
【具体实施方式】
[0099] 本发明（第一方式)的抗体等(抗体或源自抗体的物质）的新纯化方法的特征在于， 将具有对抗体等的亲和配体的载体与具有阳离子交换基团的载体制成连结柱或混合柱，整 体地对抗体等进行附和洗脱(在本发明（第一方式）中，连结柱、混合柱有时分别称为一体型 柱、混合型柱，"吸附"有时指"载样'。）。
[0100] 例如，本发明（第一方式）的纯化方法是使用了具有对上述抗体等的亲和配体的载 体1和具有阳离子交换基团的载体2的抗体等的纯化方法，其特征在于，使含有抗体等的液 体通过一体型柱或混合型柱而将抗体等载样于柱中，所述一体型柱在填充有上述载体1的 柱的下游侧直接连结了填充有上述载体2的柱，所述混合型柱填充有所述载体1和载体2两 者的混合物，接着，使洗脱液通过而对载样后的抗体等进行洗脱。需要说明的是，在本发明 (第一方式）中，具有亲和配体的载体1优选不含有阳离子交换基团，具有阳离子交换基团的 载体2优选不含有亲和配体。
[0101] 本发明（第二方式)的特征在于，在从亲和载体上洗脱祀分子(抗体等）的酸性洗脱 pH下进行从阳离子交换载体上对抗体等的分离，或者，将亲和载体与阳离子交换载体制成 连结柱或混合柱，整体地对抗体等进行吸附和洗脱(在本发明中，连结柱、混合柱有时分别 称为一体型柱、混合型柱，"吸附"有时指"载样"。）。即，本发明（第二方式）的具有阳离子交 换基团的载体的使用方法的特征在于，将含有抗体或源自抗体的物质的溶液载样于具有阳 离子交换基团的载体上，所述阳离子交换基团具有地a4.〇W上的含有簇基的配体，然后使 用PH4.0W下的酸性缓冲液对抗体或源自抗体的物质进行洗脱。需要说明的是，在本发明 (第二方式）中，具有亲和配体的载体1优选不含有阳离子交换基团，具有阳离子交换基团的 载体2优选不含有亲和配体。上述第二方式的特征可W在第一方式中使用，也可W作为第一 方式的构成要件。
[0102] 本发明（第一方式、第二方式)可W通过操作将抗体亲和色谱纯化与阳离子交换色 谱纯化制成整体的柱来实施。即，能够通过一个色谱工序(参照图2,本发明（第一方式、第二 方式）的纯化流程)来实施两个色谱工序(参照图1，目前的流程），可W节省工时，不使用各 工序所需的溶液，能够提高生产效率。而且，还能够实现抗体单体的高含量(高纯度）。
[0103] W下，对本发明（第一方式、第二方式）中的阳离子交换载体和抗体亲和载体与阳 离子交换载体的整体色谱化详细地进行说明。
[0104] 具有亲和配体的载体(亲和载体）
[0105] 本发明（第一方式、第二方式）中的"具有亲和配体的载体"（W下有时也称为具有 亲和配体的载体1、亲和载体或亲和载体1)是指W如下所述物质作为配体固定于水不溶性 载体所形成的载体，所述物质能基于W抗原与抗体的结合为代表的特异性分子间亲和力而 从某个分子集合中选择性地捕捉(结合）目标（目的)分子。
[0106] 可W用于本发明（第一方式、第二方式)的亲和配体只要具有能与作为祀分子的抗 体等特异性结合的特征即可，没有特别限定，优选为肤性配体、蛋白质性配体、或化学合成 性配体(合成化合物）。从对祀分子的特异性的观点考虑，更优选为肤性配体或蛋白质性配 体，其中，对抗体等的亲和配体特别优选为蛋白质A、蛋白质G、蛋白质L、蛋白质H、蛋白质D、 蛋白质Arp、蛋白质化丫 R、抗体结合性合成肤配体及它们的类似物。在第一和第二方式中， 特别在第一方式中，作为上述亲和配体，更优选为蛋白质A、蛋白质G、蛋白质L或它们的类似 物，最优选为蛋白质A或其类似物。
[0107] 在第一方式、第二方式中，上述亲和配体只要具有祀分子结合结构域(单体肤或蛋 白质、单结构域）即可，没有特别限制，优选2个W上的结构域连结而成的多聚体肤或蛋白质 (多结构域），更优选2~10个，更优选2~8个，进一步优选2~6个结构域连结而成的多聚体 蛋白质。运些多聚体蛋白质也可W是作为单一祀分子结合结构域的连结体的同源二聚体、 同源Ξ聚体等均聚物，如果祀分子相同，则也可W是作为多种祀分子结合结构域的连结体 的异源二聚体、异源Ξ聚体等杂聚物。
[0108] 作为连结本发明（第一方式、第二方式)的上述亲和配体的祀分子结合结构域的方 法，优选使多聚体蛋白质的Ξ维立体结构稳定的方法，例如可W举出：经由结构域序列的末 端氨基酸的连结方法、不经由结构域序列的氨基酸残基而进行连结的方法、或用1个或多个 结构域序列W外的氨基酸残基进行连结的方法，并不限定于运些方法。
[0109] 作为本发明（第一方式、第二方式）的上述抗体亲和配体，可W优选使用将多聚体 蛋白质作为1个构成成分且与功能不同的其它蛋白质融合而成的融合蛋白质。作为融合蛋 白质，可W举出：融合了白蛋白、GST(谷脫甘肤S-转移酶)的蛋白质、融合了DNA适体等核酸、 抗生素等药物、PEG(聚乙二醇)等高分子的蛋白质等，但并不限定于运些蛋白质。
[0110] 在第一方式中，亲和载体1对IgG的保留时间为6分钟时的10%DBC通常优选为Img/ mLW上且lOOmg/血W下，更优选为lOmg/mLW上，进一步优选为15mg/mLW上，更进一步优选 为20mg/mLW上，特别优选为30mg/mLW上。
[0111] 上述10%DBC例如可W通过下式求出。
[011 ^ DBCio% = (Vio%-Vd) Co/Vc (式中，Vio%为I gG漏出10 %时的溶液体积、Vd为管路内体积 (例如，包括从注射至柱入口的管路内体积和从柱出口至检测 器的管路内体积）、Co为载样 液的抗体浓度(mg/mL)、Vc为柱体积）。在测定DBCio%时，优选在给定的流速、即给定的保留时 间（例如1分钟~10分钟，优选3~6分钟)下进行。
[0113] 在第一方式、第二方式中，上述亲和载体的体积平均粒径为例如lymW上且ΙΟΟΟμπι W下，优选为扣mW上且500皿W下，更优选为10皿W上且200皿W下，进一步优选为150皿W 下，更进一步优选为120μπι w下，特别优选为100μπι w下。
[0114] 具有阳离子交换基团的载体(阳离子交换载体）
[0115] 本发明（第一方式、第二方式）中的"具有阳离子交换基团的载体"（W下，也称为具 有阳离子交换基团的载体2、阳离子交换载体或阳离子交换载体2)只要将如下所述阳离子 交换基团固定于水不溶性载体上即可，所述阳离子交换基团能够在将作为祀分子的抗体等 从抗体亲和配体中洗脱(溶出）的条件下作为阳离子交换基团发挥作用而捕捉祀分子，同时 能够通过钢离子、钟离子等抗衡离子按照该祀分子的单体(monomer)、凝聚体的顺序离子强 度依赖性地洗脱(溶出）。在从亲和配体中洗脱祀分子的pH的酸性抑范围内，为了 W80% W 上的回收率回收祀分子，作为阳离子交换基团，优选利用W弱酸性基团的簇基作为配体的 阳离子交换基团（含有簇基的配体）。另外，上述含有簇基的配体可W源自酸性氨基酸，更优 选源自谷氨酸。通常，从亲和载体中的洗脱使用抑4.0W下的酸性pH，因此，为了在该抑下得 到较高的回收率，作为本发明（第一方式、第二方式）的阳离子交换配体的含有簇基的配体 的地a为4.0W上。上述含有簇基的配体的地a优选为4.05W上且6.5W下，更优选为4.10W 上且6.45 W下。地a较低时，存在抗体收率降低的隐患。
[0116] 对于第一方式而言，在其优选的方式中，优选阳离子交换基团为簇基、横酸基等。 其中，优选为簇基，更优选为地a为4.0 W上的簇基。另外，上述簇基可W源自酸性氨基酸，更 优选源自谷氨酸。另外，在从亲和配体中洗脱祀分子的抑范围中，优选避免形成局部酸性环 境，优选为弱酸性基团。例如，在使用W蛋白质A作为亲和配体的载体时，作为阳离子交换基 团，优选利用W簇基为配体的阳离子交换基团。
[0117] 在第一方式中，上述阳离子交换基团的pKa优选为3.5W上且6.5W下，更优选为 4.0W上且6.0W下，进一步优选为4. m上且5.5W下。地a较低时，存在抗体收率降低的隐 出 小>、〇
[0118] 在本发明（第一方式、第二方式）中，在将具有阳离子交换基团的载体和亲和载体 用于连结型柱或混合型柱的情况下，阳离子交换基团的pKa与洗脱抑优选满足阳离子交换 基团地a >洗脱抑的关系，更优选满足阳离子交换基团地曰>洗脱抑的关系。
[0119] W往在单独使用具有阳离子交换基团的载体时，在阳离子交换基团pKa<洗脱pH 的条件下进行，而本发明中发现了用于组合使用具有阳离子交换基团的载体和亲和载体的 优选条件。可W认为，只要满足上述关系，则在洗脱时相对于祀蛋白质(抗体等)的电荷带有 较多正电，能够相对地抑制阳离子交换基团的配体从负电转变为正电，因此能够回收进一 步带有正电荷的凝聚抗体等，使抗体单体的纯化变得容易。
[0120] 在第一方式、第二方式中，上述阳离子交换载体的体积平均粒径为例如lymW上且 lOOOymW下，优选为扣mW上且500ymW下，更优选为lOymW上且200ymW下，进一步优选为 150μπι W下，更进一步优选为120μπι W下，特别优选为100μπι W下。
[0121] 在第一方式、第二方式中，上述阳离子交换载体的离子交换容量优选为 0.0 Olmmol/mLW 上且 0.5mmol/mLW下。
[0122] 在第一方式、第二方式中，上述含有具有包含簇基的配体的阳离子交换基团的载 体（上述阳离子交换载体2)对IgG的保留时间为6分钟时的10%DBC优选为Img/mLW上且 200mg/mL W下，更优选为1 Omg/mL W上，进一步优选为15mg/mL W上，更进一步优选为20mg/ mLW上，特别优选为30mg/mLW上。需要说明的是，上述10%DBC例如可W通过下式来求出。
[012；3 ] DBCio% = (Vio%-Vd) Co/Vc (式中，Vio%为I gG漏出10 %时的溶液体积、Vd为管路内体积 (例如，包括从注射至柱入口的管路内体积和从柱出口至检测器的管路内体积）、Co为载样 液的抗体浓度(mg/mL)、Vc为柱体积）。在测定DBCio%时，优选在给定的流速、即给定的保留时 间（例如1分钟~10分钟，优选3~6分钟）、给定抑(例如3~5，特别是4)下进行。
[0124] 水不溶性载体(载体）
[0125] 可W用于本发明（第一方式、第二方式）的"水不溶性载体"为不溶于水的基材，只 要能够将抗体亲和配体与阳离子交换基团固定化即可，没有特别限制，例如可W举出：玻璃 珠、硅胶等无机载体，由交联聚乙締醇、交联聚丙締酸醋、交联聚丙締酷胺、交联聚苯乙締等 合成高分子、结晶性纤维素、交联纤维素、交联琼脂糖、交联葡聚糖等多糖类构成的有机载 体，W及由它们的组合得到的有机-有机、有机-无机等复合载体等。作为市售品，可W例示 出：作为多孔质纤维素凝胶的GCL2000、将締丙基葡聚糖与亚甲基双丙締酷胺W共价键交联 而成的S邱hac巧1 S-1000、作为丙締酸醋类载体的T0Y0PEARL、作为琼脂糖类交联载体的 Sepharose 化4B、Rapid Run Agarose Beads、及作为纤维素类交联载体的Cellufine等。
[0126] 另外，用于本发明（第一方式、第二方式）的水不溶性载体从每单位时间的处理容 量的观点考虑，希望其表面积较大，优选为具有多个适当大小的细孔的多孔质。作为载体的 形态，可W为珠状、整体柱状、纤维状、膜状(包含中空纤维）等的任一种，可选择任意的形 态。为了使配置在水不溶性载体上的抗体亲和配体与阳离子交换基发挥协同作用，其物理 距离接近，能得到一定的保留时间，运样可W有效地发挥该分离基质的功能，从该方面考 虑，优选多孔质珠。在将阳离子交换基团在固定化有抗体亲和配体的载体上进行固定化的 情况下，从抗体亲和配体导入的难易度的方面考虑，优选由多糖类构成的、或者用单糖或多 糖类进行了修饰的载体。具体而言，优选琼脂糖或纤维素载体，但并不特别限定于此。
[0127] 在第一方式中，作为将亲和配体固定于水不溶性载体、分离基质的方法，可W使用 一般的方法。例如抗体亲和配体的氨基可W经由导入在载体上的甲酯基与载体结合，抗体 亲和配体的氨基也可W经由载体上的被活化的簇基与载体结合。
[0128] 另外，运些水不溶性载体可W在抗体亲和配体导入之前进行活化W使配体能与载 体共价键合，也可W使用市售的活化载体，也可W自行进行活化。
[0129] 在第一方式中，作为通过活化导入水不溶性载体的官能团，只要是能与抗体亲和 配体形成共价键的官能团即可，没有特别限定，例如可W举出环氧基(环氧氯丙烷）、漠化 氯、N，N-二班巧酷亚胺基碳酸盐(DSC)等活化的径基、醒基或活化簇基（例如N-径基班巧酷 亚胺(NHS)醋、幾基二咪挫(CDI)活化醋)等反应性官能团Γ活化基团"）等化ermanson G. T. 等著、"Immobilized Affinity Ligand Techniques,Academic Press"、1992年、美国专利 第5,874,165号、美国专利第3,932,557号、美国专利第4,772,653号、美国专利第4,210,723 号、美国专利第5，250，6123号、欧州专利公开第1352957号、W02004/074471)。其中包含将亲 和配体直接共价键合于载体的官能团和使用直链、支链、或环状连接基团（linker)或间隔 基团（spacer)的官能团。需要说明的是，在将导入了抗体亲和配体的载体活化时，优选不与 抗体亲和配体直接发生反应的活化方法。
[0130] 在第一方式中，在亲和配体内，将蛋白质性配体固定化于载体的方法可W使用使 蛋白质的官能团的一部分与载体的官能团的一部分发生反应的方法，能够用于该反应的蛋 白质侧的主要官能团（活性基团）可W举出：N末端氨基酸和赖氨酸化ys)侧链的氨基、或者 半脫氨酸(切S)侧链的硫醇基、或者C末端氨基酸及谷氨酸(Glu)侧链及天冬氨酸(Asp)侧链 的簇基等，但并不限定于运些官能团。
[0131] 在第一方式中，作为控制配体的取向性并将蛋白质性抗体亲和配体固定化于水不 溶性载体的方法，提出了一种利用在C末端具有半脫氨酸的蛋白A的方法（美国专利第6， 399，750号、ljungquist C.等著，巧ur. J. Biochem/'，1989年，186卷，557-561 页）。
[0132] 作为利用连接基团的固定化技术，除了确保载体和配体的距离、排除立体位阻而 谋求高性能化的方法W外，还可W举出：在连接基团或间隔基团中赋予、形成官能团（例如 带电胺）的方法等。一直在对通过在抗体亲和配体固定化时配体有效地聚集于连接基团或 间隔基团部分，从而提高固定化收率来提高分离性能进行研究。例如可W举出：向利用作为 连接臂的一部分的经N服活化的簇酸进行衍生物化而成的琼脂糖载体上固定化蛋白质性配 体的固定化技术（美国专利第5,260,373号、日本特开2010-133733、日本特开2010- 133734)。
[0133] 另外，也提出了一种除连接基团或间隔基团W外，在载体上利用缔合性基团使抗 体亲和配体聚集于载体，然后，缔合性基团和抗体亲和配体之间不形成共价键而在水不溶 性载体上将抗体亲和配体分别固定化的方法（日本特开2011-256176)。
[0134] 在第一方式、第二方式中，作为将阳离子交换基团固定化或导入水不溶性载体的 方法，通常可W利用阳离子交换基团的制作中所使用的方法。例如:作为向糖骨架导入簇甲 基的方法，有在碱性条件下使一氯乙酸进行反应的方法;作为导入硫酸基的方法，有在碱条 件下使硫酸进行反应的方法;但并不限定于运些方法。也可W通过在向水不溶性载体导入 与氨基反应的活性基团之后经由氨基酸的氨基将氨基酸固定化来导入簇基。另外，阳离子 交换基团可W直接地固定化于水不溶性载体，也可W经由间隔基团、连接基团等进行固定 化，所述阳离子交换基团可W使高舰酸钢与水不溶性载体上存在或导入的二醇基反应而使 载体活化来导入醒基，添加在同一分子内具有氨基和阳离子交换基团的分子，在亚胺形成 后进行还原处理，由此通过还原氨基化法使载体上的醒基和氨基共价键合而导入阳离子交 换基团。另外，只要能在将祀分子从亲和载体上洗脱(溶出）的酸性抑条件下作为阳离子交 换基团而发挥作用，阳离子交换基团、间隔基团、连接基团还可W含有具有其它功能的官能 团，对其分子形状也没有特别限制。从配体溶出时的毒性的观点考虑，氨基酸的簇基导入方 法也优选W抗体纯化用分离基质的材料的方式进行。
[0135] 本发明（第一方式、第二方式）的特征在于，在从亲和载体上进行祀分子的洗脱的 酸性洗脱抑下进行从阳离子交换载体上的抗体等的分离，或者使用亲和载体与阳离子交换 载体制成连结柱或混合柱，整体地进行抗体等的吸附和洗脱。
[0136] 作为抗体医药品的纯化平台工艺中所利用的第一色谱和第二色谱的代表例子，可 W使用例如蛋白质A色谱和阳离子色谱的组合。
[0137] 在第一方式、第二方式中，第一色谱的蛋白质A色谱的单体与凝聚体的分离性能较 低，分离的稳定性也不足，因此，通常选择将作为祀分子的抗体或含Fc分子的变性或凝聚抑 制在最小限度、且同时可得到较高回收率的洗脱条件，而凝聚体等的除去由后段工艺来承 担。
[0138] 在第一方式、第二方式中，在选择阳离子交换色谱作为第二色谱的情况下，一般而 言W吸附洗脱模式进行凝聚体、其它杂质的除去，但需要将来自蛋白质A载体下也称为 蛋白质A载体)的洗脱液调整为适于阳离子交换色谱吸附的抑和离子强度。因此，在蛋白质A 色谱工序的条件设定之后需要对阳离子交换色谱工序的条件进行设定。因此，存在多种限 制因素，而不能说可W进行有效地进行凝聚体等的分离。
[0139] 另一方面，在使用本发明（第一方式、第二方式）的方法时，使用亲和载体与阳离子 交换载体制成连结柱或混合柱，整体地进行抗体等的吸附和洗脱，由此能够将两个工序的 色谱操作缩短为一个工序，可W期待所使用的缓冲液的种类和使用量的减少、W及操作时 间的缩短。
[0140] 另外，对于本发明（第一方式、第二方式)的新抗体纯化法而言，通过在从亲和配体 上洗脱祀分子的狭窄的抑范围内对离子强度等进行设定，能够得到单体含量较高的洗脱级 分。特别是在单克隆抗体的纯化中，该洗脱抑大幅偏离祀分子的等电点，因此，每个抗体的 洗脱离子强度的幅度没有较大的差异，可期待能够在狭窄的范围内设定各种祀分子的使用 条件。进而，在使用修饰蛋白质A配体作为亲和配体的情况下，除了能够进一步狭窄地设定 洗脱pH范围W外，还可W通过使用碱CIP(cleaning in place;原位清洗)进行有效的清洗， 因此，从构建稳定的工艺的观点考虑，优选利用修饰蛋白A。
[0141] 在第一方式、第二方式中，未使用亲和载体而将其它色谱载体用作连结柱或混合 柱时，例如，在将离子交换载体与疏水色谱载体连结或混合使用的情况下，即使祀分子为单 克隆抗体，除了由于疏水性和等电点的差异等而使各种祀分子的使用条件的设定不同W 夕h特异性也较低，作为回收工序，可W认为其难W平台化。
[0142] 在第一方式、第二方式中，亲和载体与阳离子交换载体的连结柱或混合柱在吸附 时可W通过抗体亲和配体而发挥较高的特异性，而且通过在亲和配体的洗脱条件范围内设 定离子强度，可W容易地设定其使用条件，从该观点考虑，比未使用亲和载体1的其它载体 的组合更优异。
[0143] 虽然公开了在蛋白质A色谱柱中经过吸附/洗脱的抗体全部被阳离子交换色谱柱 捕捉之后用pH5.0-9.0的缓冲液进行洗脱，由此取消蛋白质A色谱与阳离子交换色谱之间的 收集槽化olding tank)的方法，但是在使用比从亲和载体中洗脱的抑更高的pH作为从阳离 子交换载体中洗脱的pH方面与本发明（第二方式)存在区别。另外，本发明（第一方式、第二 方式)可W将亲和载体与阳离子交换载体制成连结柱或混合柱，作为整体的柱而使用，从W 单一的洗脱操作进行洗脱的过程中能够分级祀物质的观点、W及该洗脱抑小于5.0或为4.0 W下、直接W亲和载体的洗脱抑进行阳离子交换载体的洗脱的观点考虑，是本质上不同的 技述领域(W02011/017514)。
[0144] 更具体而言，关于本发明（第一方式、第二方式）的亲和载体与阳离子交换载体的 连结柱或混合柱的使用方法，在中性附近下吸附抗体等祀分子时，优选添加一定浓度W上 的阳离子交换基团的抗衡离子来使用，在该条件下，阳离子交换基团的功能不发挥作用，另 夕h即使发挥作用，也可W通过更高离子强度的清洗来清洗除去源自该阳离子交换基团的 非特异性吸附物。另一方面，离子强度不阻碍抗体亲和配体的吸附，能够W较高的特异性吸 附目标物质，此外，通过使用高离子强度的清洗液，可有效地清洗除去非特异性地吸附于基 材、连接基团、间隔基团、配体及祀分子的分 子。
[0145] 通常，使重组单克隆抗体表达的培养上清液由于具有接近于人等的体液的离子强 度，因此，即使直接供于本发明（第一方式、第二方式)的连结柱或混合柱也可保持较高的特 异性，此外，还可通过更高离子强度的清洗液进一步减少杂质。优选在从亲和载体上洗脱含 有祀分子的组合物之前通过离子强度较低的缓冲液，使得离子交换基团的功能能够发挥， 然后与从亲和配体中的低pH洗脱联动地进行阳离子交换基团的依赖离子强度的洗脱。
[0146] 在本发明（第一方式、第二方式)中，在将填充有亲和载体的柱A与填充有阳离子交 换载体的柱B进行连结时，优选在上述柱A的正下方连接上述柱B，连结部分优选在中途未设 置分支阀而W直管进行连接，但是作为流路，只要能够直接连结，也可W在中途加入分支 阀。
[0147] 本发明（第一方式、第二方式)的亲和载体与阳离子交换载体的连结柱或混合柱可 W通过亲和配体和阳离子交换基的比率来调节其功能。在亲和载体在中性条件下的祀物质 的结合容量大于从亲和载体酸性洗脱的抑下的阳离子交换载体的结合容量时，存在酸性洗 脱时即使在低离子强度下祀物质也可W从柱中洗脱的倾向，在亲和载体的结合容量接近或 低于阳离子交换载体的结合容量时，为了使低离子强度下从亲和载体洗脱的抗体全部转移 到阳离子交换载体上且得到更高的回收率，需要将洗脱离子强度设定得较高。在任一种情 况下均可W通过对离子强度和/或抑的调节来控制回收率和其单体比率。
[0148] 在第一方式、第二方式中，亲和载体的结合容量(例如10%DBC)与阳离子交换载体 的结合容量(例如10%DBC)的比率没有特别限制，相对于吸附条件下的亲和载体对IgG的保 留时间为6分钟时的结合容量，阳离子交换载体对IgG的保留时间为6分钟时的结合容量优 选为10倍W下，更优选为5倍W下。另外，下限优选为1/10倍W上，更优选为倍W上。上述 结合容量的比率例如可W是从亲和载体、阳离子交换载体各自的10%DBC值而求得的比率。
[0149] 在第一方式、第二方式中，构成上述一体型柱或上述混合型柱的亲和载体与阳离 子交换载体的比例（亲和载体/阳离子交换载体）W体积标准计优选为1/20W上且20/1W 下，更优选为1/5W上且5/1W下。
[0150] 通过本发明（第一方式、第二方式)的亲和载体与阳离子交换载体的连结柱或混合 柱而纯化的祀分子是抗体等(免疫球蛋白G及其类似物），一般而言除称为抗体的分子W外， 还包括将免疫球蛋白分子的恒定区即Fc区和其它的功能性蛋白质或肤融合而成的Fc融合 蛋白质(含Fc分子）、及低分子化抗体，可W用作抗体医药品的原料。具体而言，抗体等优选 含有免疫球蛋白G、免疫球蛋白G衍生物、含化分子、W及化b、scFv、及双抗体等低分子化抗 体。
[0151] W下，举例示出祀分子为免疫球蛋白G的情况对本发明（第一方式、第二方式)的W 亲和载体与阳离子交换载体的连结柱或混合柱为整体进行抗体等的吸附和洗脱的使用方 法进行详细的说明，但本发明（第一方式、第二方式)并不限定于此。
[0152] 本发明（第一方式、第二方式）中的优选使用方法为如下方法:例如，（1)在填充有 阳离子交换载体的柱之前连结填充有亲和载体的柱，制作成一体型柱，在中性pH条件(例如 P册W上且9W下)下将含有抗体等的溶液载样于一体型柱中，然后使用PH4.0W下的酸性缓 冲液对抗体等进行洗脱的方法；（2)制作W混合状态一起具有上述阳离子交换载体和亲和 载体的混合型柱，在中性抑条件下对含有抗体等的溶液进行载样，并使用PH4.0W下的酸性 缓冲液对抗体等进行洗脱的方法等。
[0153] 在第一方式、第二方式中，使用了亲和载体与阳离子交换载体的连结柱或混合柱 的祀分子(抗体)纯化除了基本上由吸附工序、清洗工序、离子强度调节工序、洗脱工序等四 个工序构成W外，还可W包括其后的再生工序和/或CIP工序、再平衡化工序等用于再利用 的工序。
[0154] 在第一方式、第二方式中，吸附工序中欧可W使用普通的亲和柱色谱纯化方法。 良P，在其一例中，将含有抗体等(例如，免疫球蛋白G)的蛋白质溶液的抑调节至中性附近，然 后使该溶液通过本发明（第一方式、第二方式）的亲和载体与阳离子交换基团（阳离子交换 载体)的连结柱或混合柱，使抗体等(例如，免疫球蛋白G)特异性地吸附于填充有亲和载体 的柱或亲和载体中。例如，在W蛋白质A载体作为亲和载体的情况下，其载样pH优选为6W 上，更优选为6.3W上且9W下，进一步优选为6.5W上且8.5W下。在利用哺乳类培养细胞生 产的免疫球蛋白G的纯化中，不需要特别调节离子强度，此外，还可W预先提高离子强度而 进一步抑制非特异吸附。在吸附工序中使给定浓度的含有抗体或源自抗体的物质的溶液吸 附于载体，作为含有抗体或源自抗体的物质的溶液的溶剂，可W使用例如PBS(约lOmM憐酸、 约150mM NaCl等）。另外，在吸附工序之前可W进行平衡化工序，作为平衡化溶液的溶剂，可 W使用例如PBS(约1 OmM憐酸、约150mM NaCl等）。
[0155] 在第一方式、第二方式中，在清洗工序中，适量通过在亲和配体发挥作用的条件范 围内的缓冲液来清洗柱内部。即，pH的优选范围也可W为与上述载样时相同的范围（中性附 近的抑），例如优选为6W上。此时，作为祀分子的抗体等(例如，免疫球蛋白G)吸附于亲和载 体。运时，通过在中性附近的抑下对离子强度、组合物进行优化，有时能够有效地除去杂质。 在载样、清洗时，优选阳离子交换载体不发挥作用的条件，即，优选利用中性附近的pH且具 有一定W上高离子强度的清洗液，通过该过程，能够清洗两种分离基质和/或通过免疫球蛋 白G而非特异性地残留于柱的杂质。
[0156] 在第一方式、第二方式中，在对含有抗体等的溶液进行载样并开始下述洗脱之前 进行清洗工序，清洗工序的次数例如至少为1次W上，优选为2次W上。清洗工序的优选例子 例如可W列举W下的例子，但并不限定于W下例子。
[0157] (1)用平衡化溶液对上述一体型柱或混合型柱进行平衡化，对上述含有抗体或源 自抗体的物质的溶液进行载样，并优选在该载样之后且洗脱之前通过清洗液(第2清洗液）， 所述清洗液(第2清洗液)的离子强度低于平衡化溶液和含有抗体或源自抗体的物质的溶液 且抑高于洗脱液，（2)用平衡化溶液对上述一体型柱或混合型柱进行平衡化，对上述含有抗 体或源自抗体的物质的溶液进行载样，并优选在该载样之后且洗脱之前通过清洗液(第1清 洗液），所述清洗液(第1清洗液)的离子强度接近或高于平衡化溶液和含有抗体或源自抗体 的物质的溶液且pH高于洗脱液，接下来再通过清洗液(第2清洗液），所述清洗液(第2清洗 液)的离子强度低于平衡化溶液和含有抗体或源自抗体的物质的溶液且抑高于洗脱液。上 述（1)和(2)的方法是将普通的蛋白质A色谱中使用的清洗方法适用于一体型柱或混合型柱 的方法，可W冲洗非特异性地吸附于蛋白质A载体的杂质，也能够冲洗吸附于阳离子交换载 体的杂质。另外，上述（1)优选对例如纯化纯度较高的抗体进行，而上述(2)优选对例如培养 上清液进行。上述(1)和(2)中使用的第2清洗液为例如lOmM Tris/HCl pH7等溶液，上述(2) 中使用的第1清洗液为例如lOmM Tris IM化Cl pH7、10mM Tris pH7等溶液。需要说明的 是，也可W在上述（1)和(2)之前用与平衡化溶液相同离子强度和抑的溶液(例如，PBS)进行 预清洗。
[0158] 在第一方式、第二方式中，在离子强度调节工序中，用中性附近且离子强度较低的 缓冲液置换柱，为在洗脱时基于阳离子交换载体的离子强度依赖性洗脱功能的发挥而准 备。离子强度更优选低于洗脱液的离子强度。
[0159] 在第一方式、第二方式中，在洗脱工序中，通过酸性抑、离子强度的组合，在从亲和 配体洗脱时，阳离子交换分离模式发挥作用，能够将单体含量较高的级分回收于低离子强 度洗脱级分中。洗脱液的抑可W应用抗体等(例如，免疫球蛋白G)从亲和配体洗脱的抑。该 抑W由亲和载体和抗体等(例如、免疫球蛋白G)的种类而确定的分离条件为中屯、来确定，因 此，不需要特别的条件设定，从抑制凝聚体等的生成的观点考虑，优选为比能够从亲和载体 上进行洗脱的范围更高的抑。在第一方式、第二方式中，抗体等的洗脱抑为4.0W下，优选为 3.95W下，更优选为3.9W下，进一步优选为3.8W下。需要说明的是，洗脱pH为例如3.0W 上，优选为3.2W上，更优选为3.5W上。
[0160] 在第一方式的其它方式中，抗体等的洗脱pH优选小于5.0,更优选为4.5W下，进一 步优选为4.0W下。需要说明的是，洗脱pH为例如3.0W上，优选为3.2W上，更优选为3.5W 上。
[0161] 在第一方式、第二方式中，亲和载体为蛋白质A载体的情况的洗脱液抑设定为例如 pH为小于5.0且2W上、4.0W下且2W上之间。其中，从避免祀分子的酸变性的目的考虑，更 优选为PH3.0W上，特别优选为PH3.5W上。洗脱液抑的上限值优选与上述相同。
[0162] 在第一方式、第二方式中，使用碱耐性型的修饰型蛋白质A载体的情况下，通常其 洗脱抑W3.5~4.0之间为中屯、进行设定，但并不限定于此。另外，洗脱离子强度不仅依赖于 亲和配体与阳离子交换载体的比率，还也依赖于每单位体积的抗体等(例如，免疫球蛋白G) 的载样量，可W通过梯度实验、逐步洗脱实验容易地设定优化点。
[0163] 本发明（第二方式）的阳离子交换载体的洗脱条件或本发明（第一方式）的洗脱条 件可W应用盐浓度梯度洗脱、逐步洗脱，为了简化操作，优选设定为能实现通过逐步洗脱进 行抗体的回收并实现高单体含量的条件，但梯度洗脱更容易进行条件设定。
[0164] 在第一方式、第二方式中，例如，可W在酸性抑下W离子强度梯度进行抗体等的洗 脱，也可W在酸性pH下W离子强度逐级进行抗体等的洗脱。需要说明的是，在即使进行清洗 工序的离子强度与酸性抑的组合，凝聚体也残留于柱而不会混入洗脱级分的情况下，可W 省略离子强度调节工序。
[0165] 在第一方式、第二方式中，在开始洗脱时，优选使洗脱液的pH恒定，并连续或阶段 性地增大洗脱液的离子强度。洗脱液只要是通常使用的即可，例如可W为乙酸、巧樣酸等。 洗脱液的pH优选为3W上且4.0W下，更优选为3.1 W上且3.95W下，进一步优选为3.2W上 且3.90W下。特别是在第一方式中，洗脱液的抑优选为3W上且5W下，更优选为3.1~4.5， 进一步优选为3.2~4.0。在第一方式、第二方式中，离子强度优选在0.111^^上且200011^^ 下，更优选在0.5mlW上且lOOOmlW下，进一步优选在ImlW上且500mlW下的范围内连续或 阶段性地增大。
[0166] 使用本发明（第一方式、第二方式)的亲和载体与阳离子交换载体的连结柱或混合 柱进行纯化的抗体等(例如，免疫球蛋白G)显示出比基于单一分离模式的抗体亲和分离基 质更高的单体选择性，其洗脱液中的单体含量较高。
[0167] 在使用基于单一分离模式的亲和载体的情况下，也可通过洗脱抑和离子强度等的 优化来稍微提高单体含量，但其效果较差，且其效果的显现伴有更大的回收率的降低。通过 使用本发明（第一方式、第二方式）的亲和载体与阳离子交换载体的连结柱或混合柱，能够 通过单一色谱操作有效地实现单体含量的提高，所述单体含量的提高可W通过特异性较高 的亲和纯化及主要通过阳离子交换色谱来实现，因此，能够降低对后段工艺的负荷，可W有 助于工艺整体的收率提高和单体含量的提高。即，通过使用本发明（第一方式、第二方式)的 亲和载体与阳离子交换载体的连结柱或混合柱的新抗体纯化法，能够有助于抗体医药品的 制造工艺的生产率提高和高纯度化。
[0168] 本申请要求基于在2013年9月17日申请的日本专利申请第2013-192378号和2013 年9月17日申请的日本专利申请第2013-192379号的优先权。W参考的方式将在2013年9月 17日申请的日本专利申请第2013-192378号和2013年9月17日申请的日本专利申请第2013- 192379号的说明书的全部内容引用到本申请中。
[0169] 实施例
[0170] W下，基于实施例对本发明（第一方式、第二方式）更详细地进行说明，但本发明 (第一方式、第二方式)并不限定于运些实施例。
[0171] (阳离子交换载体的制备例）
[0172] 簇基导入载体的制备(制备例1)
[0173] 在反应容器中取W湿润体积计为4mL量的用冷水置换的Low density Glyoxal 4Rapid Run(ABT公司）作为4%琼脂糖珠，用冷却的IM谷氨酸(pH6)清洗5次，并在回收后使 浆料的液量为7mL。在色谱槽内翻转揽拌2小时，然后追加投入1M的二甲基胺棚烧水溶液 0.5mL，并在色谱槽内揽拌1小时30分钟。再在室溫下翻转揽拌过夜。进行离屯、使载体沉降 后，除去上清液使液面为6mL，并在其中直接加入20mg的棚氨化钢，在室溫下进一步翻转揽 拌2小时。用添加了水、0.1M巧樣酸、0.1M氨氧化钢、及0.5M的NaCl的PBS充分清洗，得到了用 还原氨基化法经由谷氨酸的氨基向醒基导入了簇基的琼脂糖载体。本阳离子交换载体为 Glyoxal-COOH。
[0174] (阳离子交换载体(含有簇基的配体)的地a和离子交换容量的测定）
[01巧]作为簇基导入阳离子交换载体，将CM-Sepharose Fast Flow(GE Healthcare公 司；阳离子交换载体A)、Τ0Υ0阳ARL CM-650M(东曹株式会社；阳离子交换载体B)、FRACT0GEL C00(M)(Merck公司；阳离子交换载体C)、Glyoxal-C00H(制备例1;阳离子交换载体D)用IM KC1 (抑2)进行置换，并用0.1M NaOH滴定来求得地a和离子交换容量。将结果示于表1。
[0176] 表1
[0177]
[0178](阳离子交换载体在酸性抑下的结合容量的测定）
[01巧]作为簇基导入阳离子交换载体，将CM-Sepharose Fast Flow(GE Healthcare公 司）、Τ0Υ0阳ARL CM-650M(东曹株式会社）、Fractogel COO(M) (Merck公司）、Glyoxal-C00H (制备例1)填充于Omnifit公司制的柱（ID 0.66cmX柱长化ei曲t)7cm)，将制备为0.5mg/mL 的人多克隆抗体(GAMMA-GLOBULIN-NICHIYAKU(人免疫球蛋白G):日本制药)作为载样液，在 W下的色谱条件下测定结合容量。将载样液的pH调节为3.7、4.2、或4.7,测定各个结合容 量，作为10%漏出的动态结合容量(10%DBC)。
[0180] 阳离子交换载体的10%DBC测定所使用的色谱条件
[0181] 柱：ID 0.66cmX柱长巧ei曲t)7cm、2.4mL容量(Omnifit公司制）
[0182] 流速:0.4mL/分(保留时间：6分钟）
[0183] 多克隆抗体（IgG) :GAMMA-GL0脚LIN-NICHIYAKU(日本制药）
[0184] 载样液:0.5mg-IgG/mL( 5mM 巧樣酸:P册.7、4.2、 或4.7)
[01化]平衡化液:5mM巧樣酸(P册.7、4.2、或4.7)
[0186] 洗脱液:50mM巧樣酸、0.5M氯化钢(P册.7)
[0187] CIP液:0.1M氨氧化钢、1M氯化钢
[018引中和-再平衡化液:51111巧樣酸(口册.7、4.2、或4.7)
[0189] 将各载体的结合容量（10%DBC)示于图3。根据其结果，没有发现W簇基作为配体 的各种阳离子交换载体的结合容量有很大差别。另外，没有发现表1的离子交换容量与结合 容量之间相互关联。存在地a越低，结合容量的抑依赖性越大的倾向。
[0190] (单体含量的测定）
[0191] 将各色谱洗脱液供于凝胶过滤，对凝聚体和单体进行分级，根据其峰面积值的比 较而求出单体含量。W下示出凝胶过滤的条件。
[0192] 凝胶过滤色谱条件
[0193] 柱：Superdex200 10/300GL(ID IcmX柱长（Height)30cm)(GE Healthcare公司）
[0194] 流速:0.5mL/分
[0195] 检测波长:214nm
[0196] 载样液:100μLν样品注射(Injection)(稀释至吸光度值不超过1的范围）
[0197] 洗脱液:PBS(pH7.4)
[019引（比较例1)
[0199] 使用了阳离子交换载体在p册缓冲液中进行的抗体分离
[0200] 作为阳离子交换载体，将CM-Sepharose Fast Flow(GE Healthcare公司）、 TOYOPEA化 CM-650M(东曹株式会社）、Fractogel COO(M) (Merck公司）、Glyoxal-C00H(制备 例1)填充于Omnifit公司制的柱（ID 0.66cmX柱长化ei曲t)7cm)中，W制备成0.5mg/mL的 人多克隆抗体(GAMMA-化OB化IN-NICHIYAKU:日本制药)作为载样液，在W下的色谱条件下 进行了分离。在洗脱级分中添加精氨酸使得最终浓度为50-100mM，在抑5~6下用凝胶过滤 色谱进行了单体含量的测定。另外，根据其峰面积值分析求出各级分的单体量和凝聚体量。
[0201] 阳离子交换色谱条件
[0202] 柱：ID 0.66cmX柱长化eight)7cm、2.4mL容量(Omnifit公司制）
[0203] 流速:0.4mL/分(保留时间：6分钟），其中CIP W后为0.8mL/分
[0204] 多克隆抗体（IgG) :GAMMA-GL0脚LIN-NICHIYAKU(日本制药）
[0205] 载样液:0.5mg-IgG/mL( lOmM 巧樣酸、P册）
[0206] 平衡化(5柱体积）：lOmM巧樣酸、P册
[0207] 载样量(30mg)
[0208] 清洗(5柱体积）：lOmM巧樣酸、P册
[0209] 洗脱梯度(40柱体积）:A^B线性梯度
[0210] A液：10mM巧樣酸、P册 B液:250mM巧樣酸、抑5
[0212] 再生(4柱体积）：50mM料蒙酸、250mM氯化钢、抑5
[0213] CIP(4柱体积氨氧化钢、1M氯化钢 [0214]中和?再平衡化(4柱体积）：lOmM料蒙酸、抑5
[0215] 级分:1柱体积
[0216] 作为各载体的色谱的结果，将CIP级分为止的全部洗脱级分中的单体和凝聚体量 的总和设为100,将单体和凝聚体的分离示于图4至7。其结果确认了如下情况:载样的抗体 回收于洗脱级分中，且凝聚体的峰顶部与单体的峰顶部仅稍微错开，未明显分离。
[0217] (比较例2)
[0218] 使用了蛋白质A载体的抗体的分离
[0219] 作为蛋白质A载体，将MabSelect SuRe(GE Healthcare公司）填充于Omnifit公司 制的柱（ID0.66cmX柱长化ei曲t)7cm)中，W制备成2.5mg/mL的人多克隆抗体(GAMMA- 化OB化IN-NICHIYAKU:日本制药)作为载样液，在W下的色谱条件下进行分离。在洗脱液中 添加精氨酸使最终浓度为50-100mM，在抑5~6下用凝胶过滤色谱进行单体含量的测定。另 夕h根据其峰面积值分析求出各级分的单体量和凝聚体量。
[0220] 蛋白质A色谱条件
[0221] 柱：ID 0.66cmX柱长化eight)7cm、2.4mL容量(Omnifit公司制）
[0222] 流速:0.4mL/分(保留时间：6分钟），其中CIP W后为0.8mL/分
[0223] 多克隆抗体（IgG) :GAMMA-GL0脚LIN-NICHIYAKU(日本制药）
[0224] 载样液：2.5mg-IgG/mL(PBS、pH7.4)
[02巧]平衡化(5柱体积）：PBS、pH7.4
[0226]载样量（10mg、30mg 或 40mg)
[0227]清洗(5 柱体积）:PBS、pH7.4
[022引清洗2(4柱体积）：10mM Tris/肥l、pH7
[0229] 洗脱梯度(40柱体积）:A^B线性梯度
[0230] A液：lmM巧樣酸、P册.7
[0231] B液：250mM巧樣酸、P 册.7
[0232] 再生(4柱体积）：50mM巧樣酸、250mM氯化钢、P册.7
[0233] CIP(4柱体积）：0.1M氨氧化钢、1M氯化钢
[0234] 中和?再平衡化(4柱体积）：PBS、pH7.4
[0235] 作为各色谱的结果，将CIP级分为止的各级分的单体和凝聚体的峰面积值示于图8 至10。根据其结果，虽然载样的抗体回收到了洗脱级分中，但是凝聚体的峰顶部与单体峰一 起在初期被洗脱，任一种载样量均为确认到凝聚体的分离。需要说明的是，该蛋白质A载体 的结合容量（10 % DBC)约为50.3mg/mL左右。
[0236] (比较例3)
[0237] 将填充有蛋白质A载体的柱与填充有W横丙基为配体的阳离子交换载体（SP- S巧harose化St Flow)的柱连结制成一体型柱，使用该一体型柱进行抗体的分离。
[023引在Omnifit公司制的柱（ID 0.66cmX柱长化ei曲t)7cm)中分别填充作为蛋白质A 载体的MabSelect SuRe(GE Healthcare公司）、作为阳离子交换载体的SP-Sepharose Fast Flow(GE化althcare公司），将两根柱按照填充有蛋白质A载体的柱、填充有阳离子交换载 体的柱的顺序进行连结，作为整体的柱实施色谱操作。W制备成2.5mg/mL的人多克隆抗体 (GAMMA-GLOBULIN-NICHIYAKU:日本制药)作为载样液，在W下的色谱条件下进行分离。需要 说明的是，1柱体积是W1根柱体积为2.4mL进行操作。在洗脱液中添加精氨酸使最终浓度为 50-100mM，在P册~6下用凝胶过滤色谱进行单体含量的测定。另外，根据其峰面积值分析求 出各级分的单体量和凝聚体量。
[0239] 连结柱色谱条件
[0240] 柱：ID 0.66cmX柱长化eight)7cm、2.4mL容量(Omnifit公司制）的连结体
[0241] 流速:0.4mL/分(保留时间：6分钟），其中CIP W后为0.8mL/分
[0242] 多克隆抗体（IgG) :GAMMA-GL0脚LIN-NICHIYAKU(日本制药）
[0243] 载样液：2.5mg-IgG/mL(PBS、抑7.4;10mM憐酸、150mM NaCl等）
[0244] 平衡化(5 柱体积）:PBS、pH7.4
[0245] 载样量(40mg)
[0246] 清洗(5 柱体积）:PBS、pH7.4
[0247] 清洗2(4柱体积）：10mM Tris/肥l、pH7
[0248] 洗脱梯度(40柱体积）:A一B线性梯度
[0249] A液：lmM巧樣酸、P册.7 [0巧0] B液：250mM巧樣酸、P册.7
[0251] 再生(4柱体积）：50mM巧樣酸、250mM氯化钢、P册.7
[0252] CIP(4柱体积）：0.1M氨氧化钢、1M氯化钢 [0巧3] 中和?再平衡化(4柱体积）：PBS、pH7.4
[0254]作为色谱的结果，将CIP级分为止的各级分的单体和凝聚体的峰面积值示于图11。 运时，在将比较例2的40mg抗体载样试验的洗脱级分中的单体量设为100的情况下，比较例3 中再生级分为止回收得到的单体为21.0%，另外，单体含量为94.1%XIP级分为止回收得 到的单体为22.9%，将填充有W横丙基作为配体的阳离子交换载体的柱与填充有蛋白质A 载体的柱连结使用时，能够离子强度洗脱的单体回收率较差。
[0巧5](参考例1)
[0256]将填充有蛋白质A载体的柱与填充有W地a小于4.0的簇基作为配体的阳离子交换 载体A(CM-Sepha;rose化st Flow)的柱连结制成一体型柱，使用该一体型柱进行抗体的分 离。
[0巧7] 在Omnif it公司制的柱（ID 0.66cmX柱长化ei曲t)7cm)中分别填充作为蛋白质A 载体的MabSelect SuRe(GE Healthcare公司）、作为阳离子交换载体A的CM-Sepharose 化St Flow(GE化althcare公司），将两根柱按照填充有蛋白质A载体的柱、填充有阳离子交 换载体A的柱的顺序进行连结，作为整体的柱实施色谱操作。W制备成2.5mg/mL的人多克隆 抗体(GAMMA-GL0脚LIN-NICHIYAKU:日本制药)作为载样液，在比较例3的色谱条件下进行分 离。需要说明的是，1柱体积是W1根柱体积为2.4mL进行操作。在洗脱液中添加精氨酸使最 终浓度为50-100mM，在抑5~6下用凝胶过滤色谱进行单体含量的测定。另外，根据其峰面积 值分析求出各级分的单体量和凝聚体量。
[0258]连结柱色谱条件
[0巧9]柱：ID 0.66cmX柱长(Height)7cm、2.4mL容量(Omnifit公司制）的连结体 [0260] 流速:0.4mL/分(保留时间：6分钟），其中CIP W后为0.8mL/分 惦61] 多克隆抗体（IgG) :GAMMA-GL0脚LIN-NICHIYAKU(日本制药）
[0%2]载样液：2.5mg-IgG/mL(PBS、抑7.4;10mM憐酸、150mM NaCl等）
[0%3] 平衡化(5柱体积）:PBS、pH7.4
[0264] 载样量(40mg)
[0265] 清洗(5 柱体积）：PBS、pH7.4
[0%6]清洗2(4柱体积）：10mM Tris/肥l、pH7 [0267]洗脱梯度(40柱体积）:A^B线性梯度 [0%引 A液：lmM巧樣酸、P册.7
[0269] B液：250mM巧樣酸、P 册.7
[0270] 再生(4柱体积）：50mM巧樣酸、250mM氯化钢、P册.7
[0271] CIP(4柱体积）：0.1M氨氧化钢、1M氯化钢
[0272] 中和?再平衡化(4柱体积）：PBS、pH7.4
[0273] 作为色谱的结果，将CIP分级为止的各分级的单体和凝聚体的峰面积值示于图12。 运时，在将比较例2的40mg抗体载样试验的洗脱级分中的单体量设为100的情况下，参考例1 中再生级分为止回收得到的单体为21.2%，另外，单体含量为99.0% XIP级分为止回收得 到的单体为73.7%，单体含量为83.3%。在将填充有W地a小于4.0的簇基作为配体的阳离 子交换载体A的柱与填充有蛋白质A载体的柱连结使用时，能够离子强度洗脱的单体回收率 较差。
[0274] (实施例1)
[0275] 将填充有蛋白质A载体的柱与填充有W簇基作为配体的阳离子交换载体B (TOYOPEARL CM-650M)的柱连结制成一体型柱，使用该一体型柱进行抗体的分离。
[0276] 在Omnif it公司制的柱（ID 0.66cmX柱长化ei曲t)7cm)中分别填充作为蛋白质A 载体的MabSelect SuRe(GE Healthcare公司）、作为阳离子交换载体B的TOYOPEARL CM- 650M(东曹株式会社），将两根柱按照填充有蛋白质A载体的柱、填充有阳离子交换载体B的 柱的顺序进行连结，作为整体的柱实施色谱操作。W制备成2.5mg/mL的人多克隆抗体 (GAMMA-GLOBULIN-NICHIYAKU:日本制药)作为载样液，在比较例3的色谱条件下进行分离。 需要说明的是，1柱体积是W1根柱体积为2.4mL进行操作。在洗脱液中添加精氨酸使最终浓 度为50-100mM，在抑5~6下用凝胶过滤色谱进行单体含量的测定。另外，根据其峰面积值分 析求出各级分的单体量和凝聚体量。
[0277] 作为色谱的结果，将CIP级分为止的各级分的单体和凝聚体的峰面积值示于图13。 运时，在将相同载样量的比较例2的40mg抗体载样试验的洗脱级分中的单体量设为100的情 况下，实施例1中再生级分为止回收得到的单体为91.6%，另外，单体含量为96.7%。
[0278] 对于表2的各连结柱的评价结果，将再生级分为止的单体回收率、再生级分为止的 混合液中的单体含量、单体回收率80%为止的洗脱液混合液中的单体含量与比较例2进行 比较而示出。比较例2的再生级分为止的CIP级分为止回收得到的单体为99.9%，单体含量 为93.5%。即使在单体回收率为80%的时刻进行比较，相对于比较例2的单体含量为 93.4 %，实施例1的单体含量为97.1 %，单体含量也得到了提高。
[0279] (实施例2)
[0280] 将填充有蛋白质A载体的柱与填充有W簇基作为配体的阳离子交换载体C (化actogel COO(M))的柱连结制成一体型柱，使用该一体型柱进行抗体的分离。
[0281] 在Omnifit公司制的柱（ID 0.66cmX柱长化ei曲t)7cm)中分别填充作为蛋白质A 载体的MabSelect SuRe(GE Healthcare公司）、作为阳离子交换载体C的化actogel COO(M) (Merck公司），将两根柱按照填充有蛋白质A载体的柱、填充有阳离子交换载体C的柱的顺序 进行连结，作为整体的柱实施色谱操作。W制备成2.5mg/mL的人多克隆抗体（GAMMA- 化0B化IN-NICHIYAKU:日本制药)作为载样液，在比较例3的色谱条件下进行分离。需要说明 的是，1柱体积是W1根柱体积为2.4mL进行操作。在洗脱液中添加精氨酸使最终浓度为50- lOOmM，在pH5~6下用凝胶过滤色谱进行单体含量的测定。另外，根据其峰面积值分析求出 各级分的单体量和凝聚体量。
[0282] 作为色谱的结果，将CIP级分为止的各级分的单体和凝聚体的峰面积值示于图14。 运时，将与相同载样量的比较例2的40mg抗体载样试验的洗脱级分中的单体量设为100的情 况下，实施例 2中再生级分为止回收得到的单体为86.7%，另外，单体含量为99.2%。
[0283] 对于表2的各连结柱的评价结果，将再生级分为止的单体回收率、再生级分为止的 混合液中的单体含量、单体回收率80%为止的洗脱液混合液中的单体含量与比较例2进行 比较而示出。比较例2的再生级分为止的CIP级分为止回收得到的单体为99.9%，单体含量 为93.5%。即使在单体回收率为80%的时刻进行比较，相对于比较例2的单体含量为 93.4%，实施例2的单体含量为99.2%，单体含量也得到了提高。
[0284] (实施例3)
[0285] 使用将填充有蛋白质A载体的柱与填充有W簇基为配体的阳离子交换载体D (G ly oxa ^COOH)的柱连结而成的柱进行抗体的分离。
[0286] 在Omnifit公司制的柱（ID 0.66cmX柱长化ei曲t)7cm)中分别填充作为蛋白质A 载体的MabSelect SuRe(GE Healthcare公司）、作为阳离子交换载体D的Glyoxal-COOH，将 两根柱按照填充有蛋白质A载体的柱、填充有阳离子交换载体D的柱的顺序进行连结，作为 整体的柱实施色谱操作。W制备成2.5mg/血的人多克隆抗体(GAMMA-GL0脚LIN-NICHIYAKU: 日本制药)作为载样液，在比较例3的色谱条件下进行分离。需要说明的是，1柱体积是根 柱体积为2.4mL进行操作。在洗脱液中添加精氨酸使最终浓度为50-100mM，在抑5~6下用凝 胶过滤色谱进行单体含量的测定。另外，根据其峰面积值分析求出各级分的单体量和凝聚 体量。
[0287] 作为色谱的结果，将CIP级分为止的各级分的单体和凝聚体的峰面积值示于图15。 运时，在将相同载样量的比较例2的40mg抗体载样试验的洗脱级分中的单体量设为100的情 况下，实施例3中再生级分为止回收得到的单体为102.0%，另外，单体含量为96.7%。回收 率超过100%可W认为是凝胶过滤时注入量的误差，根据图15的单体与凝聚体的分离行为 可W判断，不会对与比较例的单体含量的比较造成影响。
[0288] 对于表2的各连结柱的评价结果，将再生级分为止的单体回收率、再生级分为止的 混合液中的单体含量、单体回收率80%为止的洗脱液混合液中的单体含量与比较例2进行 比较而示出。比较例2的再生级分为止的CIP级分为止回收得到的单体为99.9%，单体含量 为93.5%。即使在单体回收率为80%的时刻进行比较，相对于比较例2的单体含量为 93.4%，实施例3的单体含量为99.1 %，单体含量也得到了提高。
[0289] (实施例4)
[0290] 将蛋白质A载体与W簇基作为配体的阳离子交换载体D(Glyoxal-COOH)混合填充 于一个柱内制成混合型柱，使用该混合型柱进行抗体的分离。
[0291] 将作为蛋白质A载体的MabSelect SuRe(GE化althcare公司）与作为阳离子交换 载体D的Glyoxal-COOH分别W4:1 (体积比）进行混合而填充于Omnif it公司制的柱（ID 0.66cm X柱长化e i曲t) 7cm)中，W制备成2.5mg/mL的人多克隆抗体（GAMMA-GL0BULIN- NICHIYAKU:日本制药)作为载样液，在比较例2的色谱条件下进行分离。抗体载样量为lOmg。 需要说明的是，1柱体积是W1根柱体积为2.4mL进行操作。在洗脱液中添加精氨酸使最终浓 度为50-100mM，在抑5~6下用凝胶过滤色谱进行单体含量的测定。另外，根据其峰面积值分 析求出各级分的单体量和凝聚体量。
[0292] 作为色谱的结果，将CIP级分为止的各级分的单体和凝聚体的峰面积值示于图16。 运时，在将相同载样量的比较例2的lOmg抗体载样试验的洗脱级分中的单体量设为100的情 况下，实施例4中再生级分为止回收得到的单体为103.0%，另外，单体含量为97.3%。回收 率超过100%可W认为是凝胶过滤时的注入量的误差，根据图16的单体与凝聚体的分离行 为可W判断，不会对与比较例的单体含量的比较造成影响。
[0293] 对于表3的各连结柱的评价结果，将再生级分为止的单体回收率、再生级分为止的 混合液中的单体含量、单体回收率80%为止的洗脱液混合液中的单体含量与比较例2进行 比较而示出。比较例2的再生级分为止的CIP级分为止回收得到的单体为99.9%，单体含量 为96.5%。即使在单体回收率为80%的时刻进行比较，相对于比较例2的单体含量为 97.1 %，实施例4的单体含量为99.1 %，单体含量也得到了提高。
[0巧4] 表2
[0295]
[0298] W上，根据本发明（第一方式），可W提供一种新分离模式和使用方法，能够有助于 抗体医药品的制造工艺的生产率提高和高纯度化，所述新分离模式和使用方法在将亲和载 体与阳离子交换载体制成连结柱或混合柱而整体地进行抗体等的吸附和洗脱的抗体等的 纯化方法中，能够实现80% W上的高回收率，或者即使未实现80% W上的回收率也能使单 体(monomer)含量提高。
[0299] 此外，根据本发明（第二方式），在将地a为4.0W上的阳离子交换载体用于亲和色 谱洗脱的抑4.0W下的酸性溶液中进行依赖离子强度的洗脱时，抗体回收率为80% W上且 能够提高单体含量。另外，根据本发明（第二方式），不需要临时回收蛋白质A载体的洗脱液， 将亲和载体与阳离子交换载体制成连结柱或混合柱能够整体地进行抗体等的吸附和洗脱。
[0300] 目P，通过利用本发明（第二方式）的使用方法，在从亲和载体上进行祀分子的洗脱 的酸性洗脱抑下从阳离子交换载体上进行抗体等的分离、或者将亲和载体与阳离子交换载 体制成连结柱或混合柱而整体地进行抗体等的吸附和洗脱，由此，能够有助于抗体医药品 的制造工艺的生产率提高和高纯度化。
【主权项】
1. 一种抗体或源自抗体的物质的纯化方法，该方法包括:使用载体1和载体2制成连结 柱或混合柱，整体地对抗体或源自抗体的物质进行吸附和洗脱，所述载体1具有对抗体或源 自抗体的物质的亲和配体，所述载体2具有阳离子交换基团。2. -种抗体或源自抗体的物质的纯化方法，该方法是使用了载体1和载体2的抗体或源 自抗体的物质的纯化方法，所述载体1具有对抗体或源自抗体的物质的亲和配体，所述载体 2具有阳呙子交换基团， 该方法包括:使含有抗体或源自抗体的物质的液体通过一体型柱或混合型柱而将抗体 或源自抗体的物质载样于柱中，所述一体型柱在填充有所述载体1的柱的下游侧直接连结 了填充有所述载体2的柱，所述混合型柱填充有所述载体1和载体2两者的混合物， 接着，通过使洗脱液通过而对载样后的抗体或源自抗体的物质进行洗脱。3. 根据权利要求1或2所述的纯化方法，其中，在酸性pH下、且以离子强度梯度进行所述 抗体或源自抗体的物质的洗脱。4. 根据权利要求1或2所述的纯化方法，其中，在酸性pH下、且以离子强度逐级进行所述 抗体或源自抗体的物质的洗脱。5. 根据权利要求2~4中任一项所述的纯化方法，其中，用平衡溶液对所述一体型柱或 混合型柱进行平衡，并对所述含有抗体或源自抗体的物质的溶液进行载样，在该载样之后 且洗脱开始之前通入清洗液，所述清洗液的离子强度低于平衡溶液和含有抗体或源自抗体 的物质的溶液，且pH高于洗脱液。6. 根据权利要求2~4中任一项所述的纯化方法，其中，用平衡溶液对所述一体型柱或 混合型柱进行平衡，并对所述含有抗体或源自抗体的物质的溶液进行载样，在该载样之后 且洗脱开始之前，通入与平衡溶液和含有抗体或源自抗体的物质的溶液相比具有相同或更 高的离子强度，且pH高于洗脱液的清洗液，接着再通入离子强度低于平衡溶液和含有抗体 或源自抗体的物质的溶液，且pH高于洗脱液的清洗液。7. 根据权利要求1~6中任一项所述的纯化方法，其中，所述具有亲和配体的载体1是以 蛋白质A、蛋白质G、蛋白质L或它们的类似物作为配体的载体。8. 根据权利要求1~7中任一项所述的纯化方法，其中，所述具有亲和配体的载体1是以 蛋白质A或其类似物作为配体的载体。9. 根据权利要求1~8中任一项所述的纯化方法，其中，所述抗体或源自抗体的物质为 免疫球蛋白G、免疫球蛋白G衍生物、或含Fc分子。10. 根据权利要求1~9中任一项所述的纯化方法，其中，所述抗体或源自抗体的物质为 Fab、scFv、双抗体、或含有抗原结合部位的分子。11. 根据权利要求1~10中任一项所述的纯化方法，其中，所述具有阳离子交换基团的 载体2是以羧基为配体的载体。12. 根据权利要求11所述的纯化方法，其中，所述羧基源自酸性氨基酸。13. 根据权利要求1~12中任一项所述的纯化方法，其中，所述抗体或源自抗体的物质 的洗脱pH小于5.0。14. 根据权利要求1~13中任一项所述的纯化方法，其中，所述载体1对IgG的保留时间 为6分钟时的10 % DBC为lmg/mL以上且100mg/mL以下。15. 根据权利要求1~14中任一项所述的纯化方法，其中，所述载体2的离子交换容量为 Ο. OOlmmol/mL 以上且 0.5mmol/mL以下。16. 根据权利要求1~15中任一项所述的纯化方法，其中，所述载体1的体积平均粒径为 Ιμπι以上且ΙΟΟΟμηι以下，所述载体2的体积平均粒径为Ιμπι以上且ΙΟΟΟμηι以下。17. 根据权利要求1~16中任一项所述的纯化方法，其中，将含有抗体或源自抗体的物 质的溶液载样于载体2,然后使用ρΗ4.0以下的酸性缓冲液对抗体或源自抗体的物质进行洗 脱，所述载体2具有阳离子交换基团，该阳离子交换基团具有pKa为4.0以上且含有羧基的配 体。18. 根据权利要求1~17中任一项所述的纯化方法，其中，所述载体2对IgG的保留时间 为6分钟时的10%DBC为lmg/mL以上且200mg/mL以下，所述载体2具有阳离子交换基团，该阳 离子交换基团具有含有羧基的配体。19. 根据权利要求2~18中任一项所述的纯化方法，其中，在填充有所述具有阳离子交 换基团的载体2的柱之前连结填充有具有亲和配体的载体1的柱，制作一体型柱，在中性pH 条件下将含有抗体或源自抗体的物质的溶液载样于所述一体型柱中，然后使用PH4.0以下 的酸性缓冲液对抗体或源自抗体的物质进行洗脱。20. 根据权利要求2~19中任一项所述的纯化方法，其中，构成所述一体型柱的载体1与 载体2的比例以体积标准计为1/20以上且20/1以下。21. 根据权利要求2~18中任一项所述的纯化方法，其中，制作以混合状态具有所述具 有阳离子交换基团的载体2和具有亲和配体的载体1的混合型柱，在中性pH条件下对含有抗 体或源自抗体的物质的溶液进行载样，并使用PH4.0以下的酸性缓冲液对抗体或源自抗体 的物质进行洗脱。22. 根据权利要求2~18、21中任一项所述的纯化方法，其中，构成所述混合型柱的载体 1与载体2的比例以体积标准计为1/20以上且20/1以下。23. 根据权利要求1~22中任一项所述的纯化方法，其中，在吸附条件下，相对于载体1 对I gG的保留时间为6分钟时的10 % DBC，载体2对I gG的保留时间为6分钟时的10 % DBC为1 / 10倍以上且10倍以下。24. -种抗体或源自抗体的物质，其是用权利要求1~23中任一项所述的纯化方法进行 纯化而得到的。25. -种具有阳离子交换基团的载体的使用方法，该方法包括:将含有抗体或源自抗体 的物质的溶液载样于载体2中，然后使用pH4.0以下的酸性缓冲液对抗体或源自抗体的物质 进行洗脱，所述载体2具有阳离子交换基团，该阳离子交换基团具有pKa为4.0以上且含有羧 基的配体。26. 根据权利要求25所述的使用方法，其中，所述含有羧基的配体源自酸性氨基酸。27. 根据权利要求25或26所述的使用方法，其中，所述载体2对IgG的保留时间为6分钟 时的10%DBC为lmg/mL以上且200mg/mL以下，所述载体2具有阳离子交换基团，该阳离子交 换基团具有含有羧基的配体。28. 根据权利要求25~27中任一项所述的使用方法，其中，所述具有阳离子交换基团的 载体2的离子交换容量为0.001mmol/mL以上且0.5mmol/mL以下。29. 根据权利要求25~28中任一项所述的使用方法，其中，所述具有阳离子交换基团的 载体2的体积平均粒径为Ιμπι以上且1 ΟΟΟμπι以下。30. 根据权利要求25~29中任一项所述的使用方法，其中，在填充有所述具有阳离子交 换基团的载体2的柱之前连结填充有具有亲和配体的载体1的柱，制作一体型柱，在中性pH 条件下将含有抗体或源自抗体的物质的溶液载样于所述一体型柱中，然后使用PH4.0以下 的酸性缓冲液对抗体或源自抗体的物质进行洗脱。31. 根据权利要求25~29中任一项所述的使用方法，其中，制作以混合状态具有所述具 有阳离子交换基团的载体2和具有亲和配体的载体1的混合型柱，在中性pH条件下对含有抗 体或源自抗体的物质的溶液进行载样，并使用PH4.0以下的酸性缓冲液对抗体或源自抗体 的物质进行洗脱。32. 根据权利要求30或31所述的使用方法，其中，用平衡溶液对所述一体型柱或混合型 柱进行平衡，并对所述含有抗体或源自抗体的物质的溶液进行载样，在该载样之后且洗脱 开始之前通入清洗液，所述清洗液的离子强度低于平衡溶液和含有抗体或源自抗体的物质 的溶液，且pH高于洗脱液。33. 根据权利要求30或31所述的使用方法，其中，用平衡溶液对所述一体型柱或混合型 柱进行平衡，并对所述含有抗体或源自抗体的物质的溶液进行载样，在该载样之后且洗脱 开始之前，通入与平衡溶液和含有抗体或源自抗体的物质的溶液相比具有相同或更高的离 子强度、且pH高于洗脱液的清洗液，接着再通入离子强度低于平衡溶液和含有抗体或源自 抗体的物质的溶液、且pH高于洗脱液的清洗液。34. 根据权利要求25~33中任一项所述的使用方法，其中，所述抗体或源自抗体的物质 为免疫球蛋白G、免疫球蛋白G衍生物、含Fc分子、或者Fab、scFv、双抗体或含有抗原结合部 位的分子。35. 根据权利要求25~34中任一项所述的使用方法，其中，在酸性pH下、且以离子强度 梯度进行所述抗体或源自抗体的物质的洗脱。36. 根据权利要求25~34中任一项所述的使用方法，其中，在酸性pH下、且以离子强度 逐级进行所述抗体或源自抗体的物质的洗脱。37. -种抗体或源自抗体的物质，其是用权利要求25~36中任一项所述的使用方法进 行纯化而得到的。
【专利摘要】本发明(第一方式)是一种抗体或源自抗体的物质的纯化方法，其特征在于，使用具有对抗体或源自抗体的物质的亲和配体的载体1与具有阳离子交换基团的载体2制成连结柱或混合柱，整体地对抗体或源自抗体的物质进行吸附和洗脱；本发明(第二方式)是具有阳离子交换基团的载体的使用方法，该方法包括，将含有抗体或源自抗体的物质的溶液载样于具有pKa为4.0以上的含有羧基的配体的阳离子交换基团的载体，然后使用pH4.0以下的酸性缓冲液对抗体或源自抗体的物质进行洗脱。
【IPC分类】C07K16/00, C07K1/18, C07K1/22
【公开号】CN105555795
【申请号】CN201480051360
【发明人】水口和信
【申请人】株式会社钟化
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2014年9月16日
【公告号】EP3048109A1, WO2015041218A1
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