抑制肽对治疗炎性疾病的用图
抑制肽对治疗炎性疾病的用图
【专利说明】抑制化对治疗炎性疾病的用途
[0001] 发明领域和发明背景 本发明设及可W用来防止蛋白质核转位的肤，作为转位至细胞核的方式，所述蛋白质 天然地与Imp7缔合。所述肤可W用于治疗炎性疾病和免疫疾病。进一步的，所述肤可W用于 促进蛋白质和其他化合物核转位至细胞核中（当其连接于其时）。
[0002] 为确保精确的细胞功能，蛋白质的空间分布需要紧密调节与协调。运在许多信号 蛋白质上特别明显，所述蛋白质受到细胞外刺激后显著地并迅速地改变他们的定位。为了 维持运样的调节，细胞核通过双层膜包膜从细胞质中分离，其允许通过特异性核孔复合体 (NPC)具有蛋白质的选择性入口。核定位的选择性主要由核内蛋白序列内含有的核定位信 号（化S)介导[G. Schlenste化，阳BS Lett 389,75 (Jun 24,1996)]。
[0003] 迄今鉴定的主要类型的化S是由碱性氨基酸构成的，所述氨基酸是通过NPC进入的 原理所需的。运些碱性序列有两种：（i)五至六个碱性氨基酸的单一延伸，例如猴肾病毒（ SV) 40大T抗原化S;与（ii)二分的化S，其由两个碱性氨基酸、10 - 12个氨基酸的间隔区 和其中五个氨基酸中的Ξ个必须是碱性的一个簇构成。该类型的代表是核质蛋白。为了使 化S -介导的核输入发生，NLS首先与细胞质输入-受体蛋白质输入蛋白α和β缔合，使其停靠 (docking)在核膜孔的细胞质侧[Ε. J. Tran,S. R. Wente，Cell 125,1041 (Jun 16， 2006)]。通过核膜孔的移动是由小GTP酶Ran调节，所述GTP酶Ran在其GTP -结合状态促进 输入的蛋白质从输入蛋白上的解离并使其回收返回细胞质[J. Moroianuij Cell Biochem Suppl 32-33,76 (1999)]〇
[0004] 然而，不是所有的细胞-核穿梭蛋白质都含有规范的NLS，因此使用其他的，不依赖 化S使他们的通过NPC的通道机制。一些表征的不依赖化S的机制包括小蛋白质（<30 - 40 kDa)的被动扩散、特殊核引导基序（distinct nuclear-directing motif)[D. 化1'131:09116，〔.化1'131:09116-化661'1：113，13.?;[油0]1，〔6115;[即日1 12,337 (1日7,2000)]、与 含化S的蛋白质的相互作用，或可选地，与核膜孔蛋白质（NUP)的直接相互作用；[L. Xu，J. Massague，化t Rev Mol Cell Biol 5,209 (Mar,2004)]。然而，通过运些机制的穿梭和核 保留的动力学通常太慢W至于不能及时进行瞬时转录，且因此允许信号蛋白在刺激后迅速 和可逆的不依赖NLS转位的分子机制仍然是不清楚的。
[000引 畑uderland等人，2008，M01 Cell 31,850-861 和 Plotnikov等人，2011，Mol 0611810131，3515-3530教导了6版1/2转位设及0(2-介导的6版1/2。核转运信号（ NTS)中的两个丝氨酸残基的憐酸化作用。该憐酸化作用允许与Imp7相互作用，其进一步促 进邸K1 / 2通过核膜孔穿梭。
[0006] 调节生物学组分的细胞定位的能力对于许多功能如调节核酸表达、真核细胞转 染，基因治疗、保护免受有毒化学品侵害W及运输抗癌剂是重要的。因此广泛意识到鉴定能 调节核转运的新型序列是需要的，且是非常有利的。
[0007] 另外的【背景技术】包括美国专利申请号20100099627。
[000引发明概述 根据本发明的一些实施方案的一方面，在此提供了一种经分离的肤，其包含与SEQ ID NO : 1 ( PERYQNLSPV)至少80 %同源的氨基酸序列，所述经分离的肤包含核祀向活性，所 述肤长度不超过20个氨基酸。
[0009] 根据本发明的一些实施方案的一方面，在此提供了一种经分离的肤，其包含与SEQ ID NO : 1 (阳RYQNLSPV)至少80 %同源的氨基酸序列，所述经分离的肤能够防止Ρ38α核 转位，所述肤长度不超过20个氨基酸。
[0010] 根据本发明的一些实施方案的一方面，在此提供了在受试者中治疗炎症性或免疫 病症的方法，所述方法包含对受试者施用治疗有效量的本文描述的经分离的肤，从而治疗 炎性疾病或免疫疾病。
[0011] 根据本发明的一些实施方案的一方面，在此提供了一种物质组合物，其包含本文 描述的经分离的肤W及通过接头与所述肤的氨基酸序列连接的异源物质。
[0012] 根据本发明的一些实施方案的一方面，在此提供了一种经分离的多核巧酸，其包 含能够编码本文描述的肤的核酸序列。
[0013] 根据本发明的一些实施方案的一方面，在此提供了一种核酸构建体，其包含本文 描述的经分离的多核巧酸。
[0014] 根据本发明的一些实施方案的一方面，在此提供了将物质祀向至宿主细胞的细胞 核的方法，所述方法包括将物质导入宿主细胞中，所述物质连接于本文描述的肤上。
[001引根据本发明的一些实施方案的一方面，在此提供了将物质祀向至宿主细胞的细胞 核的方法，所述方法包括将本文描述的肤引入宿主细胞，所述肤连接至能够结合所述物质 的亲和部分。
[0016] 根据本发明的一些实施方案的一方面，在此提供了包含本文描述核酸的分离的细 胞。
[0017] 根据本发明的一些实施方案的一方面，在此提供了药物组合物，包含作为活化剂 的本文描述的肤和药物可接受载体。
[001引根据本发明的一些实施方案，所述肤包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 8所示的 序列。
[0019] 根据本发明的一些实施方案，至少一个氨基酸是合成氨基酸。
[0020] 根据本发明的一些实施方案，至少一个氨基酸是D立体异构体。
[0021] 根据本发明的一些实施方案，至少一个氨基酸是L立体异构体。
[0022] 根据本发明的一些实施方案，一种异源物质通过接头与氨基酸序列连接。
[002引根据本发明的一些实施方案，经分离的肤包含选自SEQ ID NO: 2 (P邸YQ化SPVG)、沈Q ID NO: 3 (P邸YQ化SPVGS)、沈Q ID NO: 4 (阳RYQNLSPVGSG)、SEQ ID NO: 5 (PERYQ化SPVGSGA) SEQ ID NO: 6 (KPERYQNLSPVGSGA)和SEQ ID NO: 7 化阳RYQNLSPVAAAA)的氨基酸序列。
[0024] 根据本发明的一些实施方案，经分离的肤包含与SEQ ID NO: 8化阳RYQ化SPV)所 示的序列至少80%同一性的序列。
[0025] 根据本发明的一些实施方案，经分离的肤是肉豆違酷化的(myristoylated)。
[0026] 根据本发明的一些实施方案，免疫病症是自身免疫病症。
[0027 ]根据本发明的一些实施方案，炎性疾病是结肠炎。
[0028]根据本发明的一些实施方案，所述肤用于在治疗炎性病症或免疫病症中使用。
[0029] 根据本发明的一些实施方案，异源物质选自多肤、核酸、小分子和碳水化合物。
[0030] 根据本发明的一些实施方案，异源物质是多肤。
[0031 ]根据本发明的一些实施方案，异源物质是药剂。
[0032] 根据本发明的一些实施方案，药剂是治疗剂，化妆剂或诊断剂。
[0033] 根据本发明的一些实施方案，组合物通过接头与可检测部分连接。
[0034] 根据本发明的一些实施方案，接头包含肤键。
[0035] 根据本发明的一些实施方案，接头包含非肤键。
[0036] 根据本发明的一些实施方案，物质组合物通过接头与亲和部分连接。
[0037 ]根据本发明的一些实施方案，亲和部分选自抗体，受体配体和碳水化合物。
[0038] 根据本发明的一些实施方案，构建体进一步包含用于调节多核巧酸表达的顺式调 节元件。
[0039] 根据本发明的一些实施方案，经分离的多核巧酸转录地融合至编码目的异源多肤 序列的核酸序列中。
[0040] 根据本发明的一些实施方案，分离的细胞是真核细胞。
[0041 ]根据本发明的一些实施方案，真核细胞是酵母细胞。
[0042] 根据本发明的一些实施方案，所述物质是内源物质。
[0043] 根据本发明的一些实施方案，所述物质是外源物质。
[0044] 根据本发明的一些实施方案，所述方法进一步包括在引入之前、伴随引入或在引 入之后对宿主细胞施用外源物质。
[004引根据本发明的一些实施方案，宿主细胞是分裂细胞。
[0046 ]根据本发明的一些实施方案，宿主细胞是非分裂细胞。
[0047] 根据本发明的一些实施方案，所述物质选自多肤、核酸、小分子和碳水化合物。
[0048] 根据本发明的一些实施方案，所述物质是核酸。
[0049] 根据本发明的一些实施方案，通过选自下述的方法将核酸被引入至宿主细胞中： 显微注射，电穿孔，憐酸巧共沉淀，DEAE葡聚糖引入，脂质体介导的引入，病毒介导的引入， 裸DNA注射，和生物射弹轰击。
[0050] 根据本发明的一些实施方案，祀向在体内有效。
[0051] 根据本发明的一些实施方案，祀向在先体外后体内有效。
[0052] 根据本发明的一些实施方案，祀向在体外有效。
[0053] 根据本发明的一些实施方案，宿主细胞是真核细胞。
[0054] 根据本发明的一些实施方案，真核细胞是酵母细胞。
[0055] 除非另有限定，本文中使用的所有技术和/或科学术语具有如本发明所属的本领 域的普通技术人员通常理解的相同含义。虽然与本发明描述的那些类似或等同的方法和材 料可W用于实践或测试本发明的实施方案，但本文在下文描述了示例性的方法和/或材料。 W防冲突，本专利说明书，包括定义，将进行控制。另外，材料、方法W及实施例仅用做示例 性的，并且不意在必须是限制性的。
[0056] 附图简述 仅W例子的方式，本文描述了本发明的一些实施方案。通过参考附图细节，强调了显示 的运些细节仅是示例性的，用于说明本发明的实施方案。在运点上，【附图说明】对本领域技术 人员如何实施本发明来说是显而易见的。
[0057] 在附图中： 图1A-B阐明了在HeLa细胞中JNK1/2和ρ38α/β与Imp3、7和9相互作用。（A) Co - IP研 究。HeLa细胞在血清饥饿（0.1% FBS，16小时）下生长至70%汇合，随后用茵香霉素（Anis; 0.扣g/ ml, 15分钟）和TPA (250 nM，15分钟）刺激，或者不进行处理(NT)。随后将细胞提取 物与抗1服1、1服2、938〇、93地抗体或兔1旨6(作为阴性对照)进行(：〇-1?实验。使用具有指示 的抗Imp抗体的蛋白免疫印迹检测相互作用的Imp。如指示的（底部小图），Iped MAPK的量 通过抗JNKl、JNK2、p38α、p38β抗体进行检测，IgG作为对照。印迹使用NBT/BCIP或ECL显 色。箭头指示了相互作用的Imp。（B)使用化A研究。胎La细胞在血清饥饿（0.1% FBS，16小 时）下长至70%汇合，并随后用茵香霉素（Anis)刺激，或者不进行处理(NT)。将细胞固定，且 根据生产厂商的说明书进行化A测定，其如指示的使用了抗Imp抗体连同抗JNK (上部小 图）或抗p38(下部小图）。使用DAPI检测细胞核，且使用巧光显微镜观察载玻片。信号强度定 量使用ImageJ分析工具（显示的数据代表平均数+ S. E. p<0.0001 (经处理的相对于对照)执 行。 -
[005引图2A-C阐明了Imp3、7和9是JNK和p38转位和诱导转录所需的。（A)Imp3、7、9的Si RNA，而不是Imp5的Si RNA，抑制经刺激的JNK和p38的核转位。化La细胞在盖玻片上生长至 30%聚集。根据生产商说明书使用化armafeCt将指示的Imp的Si RNA和公司提供的Si对照的 (si Scr，阴性对照)转染至细胞中。转染48小时后，细胞是血清饥饿的，随后如指示的用茵 香霉素（0.5μg/ml，15分钟）刺激，或不处理(NT)。随后固定细胞，使用指示的（左侧）抗 MPK抗体染色，并用巧光显微镜观察。（B)在刺激之前和刺激后JNKs/p38s核定位的定量。 显示的数据代表平均数+ S.EJmp3相对于Imp7/Imp9 (*)的显著性为p<0.0003。刺激的 1111口3/7/9相对于5沈的显著性为9<0.00001。（0111193、7、9的511?酷抑制1服3/9383的下 游转录因子祀的活化。根据厂商说明手册使用化armafect方法使用指示的Imp的si RNA和 生产厂商提供的si对照（si Scr，阴性对照）转染化La细胞。转染48小时后，细胞是血清饥 饿的，且随后W指示的时间用茵香霉素(0.5μg/ml，15分钟）刺激，或不处理(NT)。使用抗 口]1^、口16尸24、口4了尸2、指示的11]1口和微管蛋白抗体对细胞提取物进行蛋白质印迹分析。
[0059] 图3A-B阐明了 JNK1/2和ρ38α/β与Imp7或Imp9,但不与Imp3直接相互作用。（A) JNK1/2和ρ38α/β与Imp3/7/9的体外相互作用。由IPW如下制备纯化的Imp3/7/9的:HeLa 细胞生长至70%汇合，血清饥饿，且随后用茵香霉素（Anis，0.5 pg/ml，15分钟）、TPA (250 nM，15分钟）刺激，或不处理（NT)。随后从细胞提取物中获得Imp3/7/9,充分洗涂（使用 RIPA缓冲液洗涂两次，使用0.5M LiCl洗涂一次）。根据材料和方法中所述的从细菌中制备 指示的GST-MAPK。为了检测缔合作用，将50化g的各GST-MAPK与20 μ1在PBS中得指示的经 IP的Imp溫育（4°C下振荡2小时）。随后用含有150 ml NaCl的洗涂缓冲液洗涂小珠，且使 用具有指示的抗体的蛋白质印迹分析检测相互作用的MAPKe(B)Imp3不是Imp7/9与JNK1/2 和ρ38α/β的相互作用所需的。根据厂商说明书，使用Imp3的Si RNA处理化La细胞。转染48 小时后，细胞是血清饥饿的，随后使用茵香霉素 (Anis 0.5 pg/ml)或TPA (TPA 250 ng) 刺激，或不处理（NT)。随后细胞提取物与抗Imp7或Imp9进行Co-IP,使用指示的抗体W蛋 白质印迹检测相互作用的MAPK。通过指示的抗体检测经IP的Imp的量。
[0060] 图4A-B阐明了衍生自ρ38α的第21位-第33位氨基酸的肉豆違酷化肤抑制刺激-依 赖的核转位和JNKl/2和ρ38α与Imp7的相互作用。（A)所述肤抑制JNKl/2和ρ38α/β的刺 激-依赖的核转位。HeLa细胞在载玻片上生长至70%汇合，血清饥饿(0.1% FBS，16小时），并 随后与抑制肤（肤，lOyM)或乱序肤（scrambled peptide) (Scr肤，lOyM)溫育，细胞随后 用茵香霉素（Anis，0.5 pg/ml)处理或不处理(NT)。将细胞固定，并如指示的抗JNKUJNK2、 ρ38α或ρ38β抗体染色，且WDAPI检测细胞核。使用巧光显微镜观察载玻片。（B)所述肤抑 制JNK1/2和ρ38α/β与Imp7的相互作用。HeLa细胞生长至70%汇合，血清饥饿(0.1% FBS，16 小时），并随后与抑制肤（肤，1化Μ)、乱序肤（Scr肤，1化Μ)或DMS0溫育，之后用茵香霉素 (Anis，0.5 μg/ml)处理或模拟对照(NT)。随后将细胞提取物与抗JNKl、JNK2、p38a、p38i^jt 体进行Co-IP。使用指示的抗Imp抗体通过蛋白质印迹检测相互作用的Imp7。经IP的MAPK的 量如指示的通过抗JNKl、JNK2、p38a和ρ38β进行检测。
[0061 ]图 5A-D阐明了 Imp3W憐-依赖(phospho-dependent)的方式与Imp7/9-MAPK 二聚 体的相互作用。（A)使用PLA检测异源二聚化的Imp3/7/9"HeLa细胞在载玻片上生长至70% 汇合，血清饥饿，并用茵香霉素（Anis，0.5μg/ml 15分钟)刺激。其后，将细胞固定，并进 行PLA，使用图上部标示的抗体。使用DAPI检测细胞核，并使用巧光显微镜观察载玻片。（B) 使用ImageJ分析工具对信号强度进行定量。显示的数据代表了平均数± S.E。经刺激的相对 于NT的显著性为p<0.0005e(C)通过CoIP检测Imp3/7/9相互作用。使用茵香霉素 （Anis 0.5 μg/ml)或TPA (250 nM)将血清-饥饿的HeLa细胞(0.1% FBS，16小时）处理15分钟。随 后将细胞提取物与右侧指示的抗体进行Co-IP。左侧指示的抗体和NBT/BCIP或E化使 CoIPs和经IP的Imp (底部小图）的印迹显色。（D)Imp3对Imp7/9的相互作用依赖于Imp3 的憐酸化作用。通过IPW如下制备纯化的Imp3:化La细胞生长至70%汇合，血清饥饿，并随后 用TPA (250 nM，15分钟）刺激或不进行处理（NT)。随后，Imp3从细胞提取物中经IP的， 并充分洗涂(使用RIPA缓冲液洗涂两次，使用0.5M LiCl洗涂一次）。随后，纯化的蛋白质与 小牛小肠憐酸酶溫育(CIP，1小时，37°C)或不进行处理。将50化g指示的重组Imp与经IP的 Imp3溫育（2小时，4°C下振荡）。随后用含有150 mM化C1的洗涂缓冲液洗涂小珠，并使用具 有指示的抗体的蛋白质印迹分析检测相互作用的Imp。
[0062] 图6A-B阐明了在刺激后p38和JNK与Imp3/7或Imp3/9的二聚体形成复合体。 (A)凝胶过滤研究显示在刺激后Imp3/7/9的MW移动。HeLa细胞是血清饥饿的，并随后用茵 香霉素（Anis，0.5 μg/ml，15分钟）和TPA (250 nM，15分钟)刺激，或不处理(NT)。将细 胞提取物(各处理20 mg)加载于16/60 superdex 200大小的柱上(速率1ml/分钟），并收集 1ml级分。随后使用具有左侧指示的抗Imp3/7/9抗体的蛋白质印迹分析级分。（B) CoIP证 实了JNK和p38与Imp二聚体在约280 W)a峰处而不是在约120 W)a峰处的的缔合。来源于未 处理的Anis或TPA刺激的柱的代表约280 kDa和约120 W)a峰(级分号9和22)的级分与指 示的（右侧)抗体进行CoIP。使用具有指示的（左侧)抗体的蛋白质印迹分析检测相互作用的 蛋白质。
[0063]图7A-B阐明了 JNK1/2和ρ38α/β独立于他们的活化憐酸化作用而转位至细胞核 中。（Α) JNK1/2和ρ38α/β的核转位。HeLa细胞生长至70%汇合，血清饥饿(0.1% FBS，16小 时），并随后在指示的时间点用茵香霉素(Anis，0.5 μg/ml)和TPA (250 nM)刺激，或不处 理（NT)。将细胞固定，用指示的抗JNKl、JNK2、p38a或ρ38β抗体染色，并使用DAPI检测细胞 核。使用巧光显微镜(〇171119113 8乂51，义40放大率)观察载玻片。（8)内源1服1/^2和938〇/0的 核转位独立于他们的憐酸化作用。HeLa细胞生长至70%汇合，血清饥饿，并随后用茵香霉素 (0.5 pg/ml)或TPA (250 nM)刺激指示的时间。产生细胞提取物，并与指示的抗体进行蛋 白质印迹分析。使用NBT/BCIP或E化将印迹显色。
[0064] 图8A-B阐明了在MCF10A和皿2细胞中JNK1/2和ρ38α/β转位至细胞核中。（A， Β)在MCF10A和皿2细胞中JNK1/2和ρ38α/β的核转位。（Α)皿2和（Β) MCF10A细胞在 载玻片上生长至70%汇合，血清饥饿，并用茵香霉素(Anis，0.5 μg/ml)或ΤΡΑ (250 ηΜ，只 对皿2)刺激。将细胞固定，使用图中上部标示的抗JNK和ρ38抗体染色。使用DAPI检测细胞 核，并使用巧光显微镜（Olympus ΒΧ51，χ40放大率)观察载玻片。
[0065] 图9阐明了 1服1/^2和口38〇/0使用不依赖^5机制转位至细胞核中。在^5-同源区内 的突变不影响JNK1/2和ρ38α/β的核穿梭。HeLa细胞生长至70%汇合，使用抓1(1-6。？（讯*- JNK1)、JNK2-GFP (wt-JNK2)、p38a-GFP (wt-p38a)或p380-GFP (wt-p380) W及他们的突 变体（APA或EPE)进行转染。转染16小时后，细胞是血清饥饿的、经固定的，使用巧光显微镜 (Olympus BX5l，x40 放大率)观察。
[0066] 图10A-B阐明了内源的和过表达的JNK1/2和ρ38α/β与Imp3、7和9的CoIPd(A) 进行Co-IP筛选在MCF7细胞中W检测输入蛋白与JNK1/2和ρ38α/β相互作用。MCF7细胞在 载玻片上生长至70%汇合，血清饥饿，并随后用茵香霉素 (Anis 0.5 μg/ml，15分钟）或ΤΡΑ (250 nM，15分钟）刺激，或不处理（NT)。细胞提取物随后与抗JNKl、JNK2、p38a或ρ38β抗 体，和兔IgG(作为阴性对照）(对照)进行Co-IP。使用具有指示的Imp或ΜΑΡΚ抗体的蛋白质 印迹检测相互作用的Imp或经IP的MAPK。（B)化La细胞中过表达的MAPK的相互作用。使用 JNK2-GFP (wt-JNK2)、p38地-GFP (wt-p3她）或GFP单独转染HeLa细胞。细胞是血清饥饿 的，并且随后使用茵香霉素 (Anis 0.5 μg/ml，15分钟），TPA (250 nM，15分钟)处理。随后 将细胞提取物与抗GFP抗体进行CoIP。使用具有指示的（左侧)抗体的蛋白质印迹分析检测 相互作用的Imp和负载的提取物。使用NBT/BCIP或E化与所述印迹显色。箭头指示了相互作 用的Imp。
[0067] 图11阐明了敲除Imp3/9不影响E服底物cMyc的憐酸化作用。Imp3、9的Si RNA不 抑制邸K1/2的下游转录因子祀的活化。使用化armafect根据制造商说明书，使用指示的Imp 的si RNA和厂商提供的si对照（si Scr，阴性对照）转染化La细胞。转染48小时后，细胞是 血清饥饿的，并随后在指示的时间点用茵香霉素 (Anis 0.5 pg/ml)刺激或不刺激(NT)。使 细胞提取物进行具有指示的抗体的蛋白质印迹分析，印迹与NBT/BCIP或E化显色。
[0068] 图12A-B阐明了应答刺激的Imp3/7/9的转位。HeLa (A)或皿2 (B)细胞在载玻 片上生长至70%汇合，血清饥饿，并随后用茵香霉素 （Anis 0.5μg/ml 15分钟）刺激或不处 理（NT)。将细胞固定，并使用指示的抗体染色。使用DAPI检测细胞核，并且使用巧光显微镜 观测(Olympus BX51，x40放大率)载玻片。
[0069] 图13阐明了Ran是JNK1/2和ρ38α/β核转位所需的。Ran的siRNA抑制刺激-依赖的 JNKl/^2和p38α/β的核转位。HeLa细胞在盖玻片上生长至30%汇合。随后使用化armafect根据 制造商说明书，将SiRNA Ran和公司提供的si对照（si Scr，阴性对照)转染至细胞。转染 48小时后，细胞是血清饥饿的，随后如指示的用茵香霉素(0.5μg/ml，15分钟）刺激，或不处 理（NT)。随后固定细胞，使用指示的抗MAPK抗体染色，并使用巧光显微镜观察（Olympus 8乂51，义40放大率）。
[0070]图14A-C阐明了ρ38αα与输入蛋白7相互作用的位点的鉴定 。（A)示意图代表p38 α的截短突变。（B)p38α的N末端缺失突变抑制其核转位。构建p38α-GFPΔC(40a.a)或 ΔΝ (20或30a.a)末端缺失突变，并转染至化La细胞。转染16小时后，细胞是血清饥饿的， 使用茵香霉素(0.5μg/ml，15分钟）刺激，或不处理(NT)。固定细胞，用DAPI检测细胞核，使 用巧光显微镜(Olympus BX51，x40放大率)观测载玻片。（C) ρ38α的N末端缺失突变抑制 其与Imp7/9的相互作用。构建p38a-GFP的Ν末端连续缺失突变，转染16小时后，细胞是血清 饥饿的，使用茵香霉素（〇.5μg/ml，15分钟）刺激，或不处理(NT)。随后使细胞提取物与抗 GFP抗体进行CoIP。相互作用的Imp7和负载的提取物用使用指示的抗体(左侧）的蛋白质印 迹分析检测。印迹使用NBT/BCIP或E化显色。箭头指示了相互作用的Imp。
[00川图15A-B阐明了JNK (图15A)和p38 (图15B) MAPK在刺激后形成复合体。HeLa细 胞是血清饥饿的，之后用茵香霉素(Anis，0.5 μg/ml，15分钟），TPA (250 nM，15分钟）刺 激或不处理（NT)。将细胞提取物负载于16/60 superdex 200大小柱(速率1ml/分钟），并 收集1ml级分。随后分析各级分，如指示的使用具有抗JNK/P38抗体的蛋白质印迹进行分 析。印迹与NBT/BCIP或E化显色。
[0072]图16阐明了肉豆違酷化肤的胞内分布和稳定性。HeLa细胞在盖玻片上生长至70% 汇合，血清饥饿(0.1% FBS，16小时），并在指示的时间用N -末端共辆肉豆寇酸、C-末端共辆 生物素的肤处理。用3% PFA固定细胞，并使用抗生物素蛋白-FITC染色，并进行DAPI。使用 巧光显微镜（x40放大率)观察肤。
[007引图17A-C阐明了在结肠炎模型中抑制肤作为潜在治疗剂的用途。21只雄性巧7BL小 鼠用肤（15mg/Ki 10)，乱序肤（15mg/Ki 10)或DMS0 (2%)处理(每48小时静脉注射）。使用DSS (饮用水中1.25%)诱导结肠炎，并在诱导7天后处死小鼠。使用内窥镜成像评估结肠炎，并使 用结肠中病灶的数目和小鼠体重进行评分。
[0074] 图18A-B阐明了肉豆違酷化肤阻断p38与输入蛋白7的相互作用。(A)肉豆違酷化肤 是经修饰的（将3个残基置换为丙氨酸）]?7'-胖61?￥9化5?￥6564-569 10肋：9;17'- K阳RYQNLSPVAAAA -SEQ ID NO: 10。（B) HeLa细胞与经修饰的肤预解育（2小时），随后用 茵香霉素刺激(Anis，0.5 pg/ml，15分钟），或不处理。随后将细胞提取物与抗ρ38α进行 CoIP。通过具有指示的抗体的蛋白质印迹法检测相互作用的Imp7或经IP的ρ38。
[0075] 图19A-C阐明了肉豆違酷化肤抑制ρ38的刺激依赖的核转位。HeLa细胞在载玻片上 生长至70%汇合，血清饥饿，并与新肤（NP)、肤或乱序肤预解育，并随后用茵香霉素刺激 (Anis 0.5μg/ml 15分钟），或不处理(NT)。固定细胞，并使用指示的抗体染色。用DAPI检测 细胞核，并使用旋转盘共焦显微镜（spinning disc confocal microscope )(Zeiss，x100 放大率)观察载玻片。
[0076] 图20A-C阐明了肉豆違酷化肤抑制JNK的刺激依赖的核转位。HeLa细胞在载玻片 上生长至70%汇合，血清饥饿，并与新肤（NP)、肤或乱序肤预解育，并随后用茵香霉素刺激 (Anis 0.5μg/ml 15分钟），或不处理(NT)。固定细胞并使用指示的抗体染色。使用DAPI检测 细胞核，并使用旋转盘共焦显微镜(Zeiss,xlOO放大率)观察载玻片。
[OOW]图21阐明了肉豆違酷化肤不影响MAPK的刺激依赖活化作用。HeLa细胞在载玻片上 生长至70%汇合，血清饥饿，并与新肤（NP)、肤或乱序肤预解育，并随后用茵香霉素 （Anis 0.化g/ml)、TPA (250 nM)刺激，或不处理(NT)。产生细胞提取物，并使细胞提取物进行具 有指示的抗体的蛋白免疫印迹分析。
[誦]本发明实施方案描述 本发明的一些实施方案设及可W用于防止蛋白质核转位的肤，所述蛋白质天然地W与 Imp7缔合的方式转位至细胞核中。所述肤可W用于治疗炎症和免疫相关疾病。进一步的，所 述肤可W用于促进当连接细胞核时蛋白质和其他化合物转移至细胞核。
[0079] 根据附图和附加的描述可W更好地理解根据本发明的核转移信号的原理和操作。
[0080] 在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，应当理解本发明不将其应用限于下 文的描述或实施例给出的示例。本发明可W包含其他的实施方案，或W不同的方式进行或 执行。并且，应当理解本文使用措辞和术语是用于描述性目的，并且不应当被认为是限制性 的。
[0081 ] JNK和p38是促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的成员。哺乳动物中，存在Ξ种JNK 同种型(JNK1-3)和四种p38同种型(ρ38α-δ)，其调控多个细胞过程，其主要包括应激反应。
[0082] 本发明人研究了JNK1/2和ρ38α/β的刺激核转位，并发现在应激和促有丝分裂刺 激后全部四种均迅速转位至细胞核中。本发明人获得的实验结果表明JNK1/2和ρ38α/β各 自通过不依赖活化的机制从其细胞质错定上释放。其允许活化的或不活化的ΜΑΡΚ与Imp7或 Imp9结合，然后结合到Imp3。随后Imp3/lmp7或Imp3/Imp9二聚体护送连接的MAPK至核膜， 在核膜初保留了 Imp3，而Imp7/9进一步穿过核孔。很可能MAPK/lmp复合体随后通过GTP-Ran 解离，所述GTP-Ran在细胞核中使MPK游离。
[0083] 本发明人接着试图鉴定JNK和p38中介导与Imp7和Imp9相互作用的位点，并且显示 了位于ρ38α的第20位-第30位残基中的重要序列（图14A-C)。
[0084] 当减少执行本发明时，本发明人合成了基于ρ38α的第21位-第34位残基序列的14 个氨基酸肉豆違酷化的肤，并且显示当其在刺激前应用于化La细胞时，其阻止了核转位（图 4A)，W及测试的MAPK的Imp7/9的相互作用（图4B)。
[0085] 因为本发明的肤能够特异地抑制JNK1/2和P38 α/β的核活性，而不调节其细胞质 活动，运些肤可W用于在细胞中抑制JNK1/2和Ρ38 α/β的核活动(例如，细胞调亡活性，炎症 活性），而不损害其他的JNK1/2和Ρ38 α/β相关的细胞质活性。因此，本发明的该方面的肤 可W用作炎症和细胞调亡相关疾病的治疗剂，而没有其他JNK1/2和Ρ38 α/β的抑制剂的副 作用。
[0086] 因此，根据本发明的一个方面，在此提供了经分离的肤，其包含与SEQ ID NO: 1所 示的序列至少80%同源的氨基酸序列，所述经分离的肤包含核祀向活性，所述肤不多于20个 氨基酸。
[0087] 根据另一个实施方案，所述肤包含与SEQ ID NO: 2所示的序列至少80%同源的氨 基酸序列，其包含核祀向活性，且不多于20个氨基酸。
[0088] 根据另一个实施方案，所述肤包含与SEQ ID NO: 3所示的序列至少80%同源的氨 基酸序列，其包含核祀向活性，且不多于20个氨基酸。
[0089] 根据另一个实施方案，所述肤包含与SEQ ID NO: 4所示的序列至少80%同源的氨 基酸序列，其包含核祀向活性，且不多于20个氨基酸。
[0090] 根据另一个实施方案，所述肤包含与SEQ ID NO: 5所示的序列至少80%同源的氨 基酸序列，其包含核祀向活性，且不多于20个氨基酸。
[0091] 根据另一个实施方案，所述肤包含与SEQ ID NO: 6所示的序列至少80%同源的氨 基酸序列，其包含核祀向活性，且不多于20个氨基酸。
[0092] 根据另一个实施方案，所述肤包含与SEQ ID NO: 7所示的序列至少80%同源的氨 基酸序列，其包含核祀向活性，且不多于20个氨基酸。
[0093] 根据另一个实施方案，所述肤包含与SEQ ID NO: 8所示的序列至少80%同源的氨 基酸序列，其包含核祀向活性，且不多于20个氨基酸。
[0094] 因此，根据本发明的一方面，在此提供了经分离的肤，其包含与SEQ ID NO: 1所示 的序列至少80%同源的氨基酸序列，所述经分离的肤能够防止经分离的肤能够防止Ρ38α核 转位，所述肤不多于20个氨基酸。
[0095] 根据另一个实施方案，所述肤包含与SEQ ID NO: 2所示的序列至少80%同源的氨 基酸序列，其能够防止所述经分离的肤能够防止Ρ38α核转位，所述肤不多于20个氨基酸。
[0096] 根据另一个实施方案，所述肤包含与SEQ ID NO: 3所示的序列至少80%同源的氨 基酸序列，其能够防止所述经分离的肤能够防止Ρ38α核转位，所述肤不多于20个氨基酸。
[0097] 根据另一个实施方案，所述肤包含与SEQ ID NO: 4所示的序列至少80%同源的氨 基酸序列，其能够防止所述经分离的肤能够防止Ρ38α核转位，所述肤不多于20个氨基酸。
[0098] 根据另一个实施方案，所述肤包含与SEQ ID NO: 5所示的序列至少80%同源的氨 基酸序列，其能够防止所述经分离的肤能够防止Ρ38α核转位，所述肤不多于20个氨基酸。
[0099] 根据另一个实施方案，所述肤包含与SEQ ID NO: 6所示的序列至少80%同源的氨 基酸序列，其能够防止所述经分离的肤能够防止Ρ38α核转位，所述肤不多于20个氨基酸。
[0100] 根据另一个实施方案，所述肤包含与SEQ ID NO: 7所示的序列至少80%同源的氨 基酸序列，其能够防止所述经分离的肤能够防止Ρ38α核转位，所述肤不多于20个氨基酸。
[0101] 根据另一个实施方案，所述肤包含与SEQ ID NO: 8所示的序列至少80%同源的氨 基酸序列，其能够防止所述经分离的肤能够防止Ρ38α核转位，所述肤不多于20个氨基酸。
[0102] 如提及的，根据本发明的该方面的肤优选地不多于20个氨基酸。
[0103] 根据一个特别的实施方案，肤长度为19个氨基酸。
[0104] 根据一个特别的实施方案，肤长度为18个氨基酸。
[0105] 根据一个特别的实施方案，肤长度为17个氨基酸。
[0106] 根据一个特别的实施方案，肤长度为16个氨基酸。
[0107] 根据一个特别的实施方案，肤长度为15个氨基酸。
[0108] 根据一个特别的实施方案，肤长度为14个氨基酸。
[0109] 根据一个特别的实施方案，肤长度为13个氨基酸。
[0110] 根据一个特别的实施方案，肤长度为12个氨基酸。
[0111] 根据一个特别的实施方案，肤长度为11个氨基酸。
[0112] 根据一个特别的实施方案，肤长度为10个氨基酸。
[0113] 更优选地本发明的肤的氨基酸序列与SEQ ID NOs: 1、2、3、4、5、6、7或8的同源性 为81%、更优选地为82%、更优选地为83%、更优选地为84%、更优选地为85%、更优选地为86%、 更优选地为87%、更优选地为88%、更优选地为89%、更优选地为90%、更优选地为91%、更优选 地为92%、更优选地为93%、更优选地为94%、更优选地为95%、更优选地为96%、更优选地为 97%、更优选地为98%、更优选地为99%、最优选地为100%。
[0114] 根据一个实施方案，本发明的肤具有与SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7或8所示序列 同一的氨基酸序列。
[0115] 根据还另一个实施方案，本发明的肤由SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7或8所示的氨 基酸序列组成。
[0116] 样品多肤与参考多肤的同源性或同一性百分比，例如本发明的核祀向肤与具有 SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7或8所示的氨基酸序列的多肤的同源性或同一性的百分比，可 W通过多种方法中任一的进行确定。优选地，多肤之间的同源性或同一性百分比使用NCBI 的标准蛋白质-蛋白质BLAST[blastp]软件来确定。
[0117] 本发明人预期本文公开的肤的氨基酸序列可W被保守地或非保守地取代。
[0118] 本文使用的术语"保守取代"，指的是将存在于肤中天然序列的氨基酸替换为天然 的或非天然存在的氨基酸或具有相似空间特性的模拟肤。当将天然氨基酸的侧链替换为极 性的或疏水的，保守取代应当使用天然存在的氨基酸、非天然存在的氨基酸或模拟肤部分 (其也是极性或疏水的）（另外其具有如置换的氨基酸的侧链的相同的空间特性）。
[0119] 天然存在的氨基酸通常根据他们的特性进行分组，由天然存在的氨基酸的保守取 代可W容易地根据牢记的事实来确定，根据本发明的带电荷的氨基酸被空间相似的不带电 荷的氨基酸取代被认为是保守取代。
[0120] 对于产生非天然存在的氨基酸的保守取代，还可能使用本领域熟知的氨基酸类似 物(合成氨基酸）。天然存在的氨基酸的模拟肤在技术人员已知的文献中详细记载。
[0121] 当进行保守取代时，取代的氨基酸在侧链上应当具有与原氨基酸相同或相似的官 能团。
[0122] 本文使用的短语"非保守取代"指的是将亲本序列中存在的氨基酸取代为另一个 天然或非天然存在的氨基酸，其具有不同的电化学和/或空间特性。因此，取代的氨基酸的 侧链可W显著地比被取代的天然氨基酸的侧链更大(或更小)和/或可W具有与被取代的氨 基酸显著不同电子特性的官能团。运类的非保守取代的例子包括将苯丙氨酸或环己基甲基 甘氨酸取代为丙氨酸、将异亮氨酸取代为甘氨酸，或将-NH-CH[(-CH2)5-C00H]-C0-取代为 天冬氨酸。落入本发明范围内的那些非保守取代是那些仍构成具有抗细菌特性的肤的那些 取代。
[0123] 本文使用的短语"核祀向活性"指的是肤增加其核:细胞质定位比率，或其连接的 剂至少10%、更优选地至少20%和甚至更优选地至少30%、50%、80%或更多的能力。
[0124] 核祀向活性可W通过直接或间接方法检测：当使用巧光染料(标记试剂盒是商业 上可W获得的，例如从Pierce或Molecular Probes)标记核祀向肤时，可W通过巧光或共聚 焦激光扫描显微镜的直接观察。如果所述核祀向肤使用电子密度材料如胶体金标记，核祀 向活性还可W通过电子显微镜来评价（〇live;r，Methods Mol. Biol. 115 (1999)，341- 345) 。
[0125] 可W理解如果核祀向肤与异源剂(例如多核巧酸)连接，则可W通过观察异源剂的 位置来检测活性。
[0126] 如果连接的分子(例如核酸)在细胞核内发挥功能，可间接方式评价核祀向活 性。该功能可W是，例如，由连接的核酸编码的基因的表达，其包括运样的基因表达的结果， 其可W在其他细胞分子或过程中发挥。
[0127] 本文使用的术语"肤"或"多肤"指的是天然或合成氨基酸的聚合物，其包括天然肤 (降解产物，综合地合成多肤或者重组多肤)和模拟肤(通常地，综合地合成肤），W及类肤和 半肤，其是多肤的类似物，其可W具有，例如，使所述肤在体内甚至更稳定或更能够穿透细 胞的修饰。因此，本发明预期了例如对肤的肉豆違酷化。优选地肉豆違酷化发生在N末端残 基。肉豆違酷化是不可逆的蛋白质脂化修饰，其中衍生自肉豆違酸的肉豆違酷基团通过酷 胺键共价连接至N-末端残基的α-氨基上。通过本发明预期肉豆違酷化的肤的例子包括SEQ ID NO: 9-16。
[0128] 运样的修饰包括，但不限于N末端修饰、C末端修饰、多肤键修饰，其包括，但不限于 CH2-NH、CH2-S、CH2-S=0、0=C-NH、CH2-0、CH2-CH2、S=C-NH、CH=CH 或 CF=CH、主链修饰和残疾 修饰。制备模拟肤化合物的方法是本领域熟知的，并且在例如如ant;Uative Drug Design， C.A. Ramsden Gd.，Qiapter 17.2，F. Qioplin 化rgamon Press (1992)中说明，其在此W 充分引用并入本文。下文中提供该方面的进一步细节。
[0129] 可W取代多肤中的多肤键(-C0-NH-)，例如，通过N-甲基化键(-N(C册)-C0-)、醋键 (-C(R化-C-0-0-C(R)-N-)、酬基亚甲基键(-C0-CH2-)、α-氮杂键(-NH-N(R)-C0-)，其中R是 任何烷基、例如，甲基胺基（-CH2-NH-)、径基乙締键(-CH(0H)-CH2-)、硫代酷胺键（-CS- 畑-)、締双键(-CH=CH-)、酷胺键(retro amide bond) (-NH-C0-)、多肤衍生物（-N(R)-CH2- C0-)，其中R是"正常"侧链，天然存在于C原子上。
[0130] 运些修饰可W发生在多肤链的任何键上，并甚至同时在若干处(2-3)发生。
[0131] 天然芳香族氨基酸，Trp，、Tyr和Phe可W被取代为合成的非天然氨基酸例如，苯 基甘氨酸，TIC，糞基丙氨酸(Nol)，Phe的环甲基化衍生物，Phe或0-甲基-Tyr的面化衍生 物。
[0132] 除了上文所述，本发明的多肤还可W包括一个或多个经修饰的氨基酸或一个或多 个非氨基酸单体(例如，脂肪酸，复合碳水化合物等）。
[0133] 本文说明书和下文权利要求部分使用的术语"氨基酸"应理解为包括20个天然存 在的氨基酸;那些氨基酸在体内经常进行翻译后修饰，包括，例如，径脯氨酸、憐酸丝氨酸和 憐酸苏氨酸;和其他的不常见的氨基酸，其包括但不限于，2 -氨基已二酸、径基赖氨酸、异 锁链赖氨酸、正鄉氨酸、正亮氨酸和鸟氨酸。此外，术语"氨基酸"包括D -和L -氨基酸(立体 异构体)两者。
[0134] 表1和表2在下文列出了本发明可W使用的天然存在的氨基酸(表1)和非保守的或 经修饰的氨基酸(表2)。
[0135] 表 1
[0137] 本发明的肤可W包括在细胞中调节其分泌的前导序列。示例性的前导序列可W包 括TAT前导序列。
[0138] 本发明的肤的N和C末端可W通过官能团保护。合适的官能团在Green和Wilts的" Protecting Groups in Organic Synthesis"，John Wiley 和 Sons，Chapters 5 和7， 1991中描述，其教导在此通过引用并入本文。优选的保护基团是能够促进连接于其上的化 合物运输至细胞中的那些，例如，通过减少化合物的亲水性和增加其亲油性。
[0139] 运些部分可W在体内在细胞内通过水解或酶促裂开。径基保护基团包括醋、碳酸 盐和氨基甲酸醋保护基团。胺保护基包括烷氧基和芳氧基幾基，如上所述用于N末端保护基 团。簇酸保护基包括脂肪族的、苄基的和芳基醋，如上所述用于C末端保护基团。在一个实施 方案中，本发明的肤的一个或多个谷氨酸或天冬氨酸残基侧链的簇酸基团是受保护的，其 优选使用甲基，乙基，苄基或取代的苯甲基醋。
[0140] N末端保护基团的例子包括酷基（-C0-R1)和烷氧基幾基或芳氧基幾基，其中R1 是脂肪族的、取代的脂肪族的、苄基、取代的苄基，芳香族的或取代的芳香族基团。酷基的特 定例子包括乙酷基，（乙基)-C0-、正丙基-C0-、异丙基-C0-、正下基-C0-、仲下基-C0-、叔下 基-C0-、己基、十二烧酷、十六烧酷、肉豆違酷、硬脂酷、油酷基苯基-C0 -、取代的苯基-C0 -、苄基-C0-和(取代的苄基）-C0 -。烷氧基幾基和芳氧基幾基的例子包括CH3-0-C0 -、 (乙基)-〇-CO -、正丙基-0-C0 -、异丙基〇-C〇-、正下基-〇-C〇-、仲下基-〇-C〇-、叔下基- 0-C0-、苯基0-C0-、取代苯基0-C0-和苄基0-C0-、（取代苄基)-0-C0-。金刚烧、糞、tuluen、联 苯、肉桂酷、硝基苯甲酯，甲苯酷、慷酷、苯甲酯基、环己烧降茨烧、Z-己酸。为了促进N酷化， 在分子的N-末端可W存在1-4个甘氨酸残基。
[0141] 化合物的C末端的簇基可W被保护，例如，通过酷胺（即C末端径基替换为-NH 2，- NHR2和-NR2R3)或醋（即C末端的径基替换为-0R2)dR2和R3是独立的脂肪族、取代的脂肪 族、苄基、取代的苄基、芳基或取代的芳基。此外，与氮原子一起，与来自约0-2个另外的杂原 子如氮，氧或硫一起R2和R3可W形成C4到C8的杂环。合适的杂环的例子包括赃晚基，化咯烧 基、吗嘟基、硫代吗嘟基或赃嗦基。C末端保护基团的例子包括-N肥、-NHC册、-N (C册）2、-NH (乙基）、-N(乙基2、-N(甲基）（乙基）、-NH(苄基）、-N(Cl-C4烷基）（苄基）、-NH(苯基）、-N (C1-C4烷基）（苯基）、-〇CH3、-〇-(乙基）、-〇-(正丙基）、-〇-(正下基）、-〇-(异-丙基）、-〇- (仲下基）、-0-(叔下基）、-0-苄基和-0-苯基。
[0142] 本发明的肤还可W包含非氨基酸部分，例如，连接于肤上的疏水部分（各种线性 的、枝化的、环状的、多环的或杂环碳氨化合物和碳氨化合物衍生物）；各种保护基团，特别 是线性的化合物，其连接于化合物的末端W减少降解。化合物中存在的化学(非氨基酸)基 团可W为了改善各种生理特性;减少降解或清除;减少各种细胞累的排斥、改善免疫原性活 性、改善各种施用模式(如各种序列的连接，所述连接允许穿过各种屏障、内脏等）；增加特 异性、提高亲合性、减少毒性等而包括。
[0143] 根据本发明的一个实施方案，本发明的肤连接于持续释放增强剂。示例性的持续 释放增强剂包括，但不限于透明质酸(HA)、藻酸(AA)、聚径乙基异下締酸(Poly-肥MA)、聚乙 二醇(PEG)、甘醇二甲酸和聚异丙締酷胺。
[0144] 本发明的肤的氨基酸序列元件与其他非氨基酸试剂的连接可W通过共价连接、通 过非共价进行，例如，通过复合至疏水聚合物，其可W降解或裂解，产生能够持续释放的化 合物;通过在脂质体或胶粒上捕获肤的氨基酸部分来产生本发明的最终肤。连接可W通过 在另一个元件(脂质体，胶粒）中捕获氨基酸序列或在聚合物中渗入氨基酸序列从而产生本 发明的最终肤。
[0145] 本发明的化合物可W是线性的或环状的（成环作用可W改善稳定性）。成环作用可 W通过本领域已知的任何方法发生。当化合物主要由氨基酸构成时，成环作用可W通过N- 至C-末端，、N末端至侧链和N末端至主链、C末端至侧链、C末端至主链、侧链至主链和侧链至 侧链，W及主链至主链来成环。肤的成环作用也可W通过肤中包含的非氨基酸有机部分来 发生。
[0146] 本发明的肤可W是生物化学合成的，例如通过使用标准固相技术。运些方法包括 专一固相合成、部分固相合成方法、片段冷凝、经典溶液合成。当肤相对短（即10 kDa)和/或 不能通过重组技术生产（即，不通过核酸序列编码）时优选使用运些方法，并因此设及不同 的化学作用。
[0147] 固相多肤合成程序是本领域熟知的，并通过John Morrow Stewart和化nis Dillaha Young,Solid Phase Polypeptide Syntheses (2nd Ed.,Pierce Chemical Company，1984)进一步描述。
[0148] 合成肤可W通过制备的高效液相层析[Creighton Τ. (1983) Proteins, structures and molecular principles. WH Freeman and Co. N.Y.]纯 化，并且可通过 氨基酸测序来证实其组合物。
[0149] 重组体技术也可W用于生产本发明的肤和/或多肤。当肤连接于异源蛋白质（即融 合蛋白质）时，运些技术可W是优选的，因为重组技术更适合用于生产相对长的多肤(例如， 长于20个氨基酸）和对其大量生产。运样的重组技术在Bitter等人，（1987) Methods in Enzymol. 153:516-544，Sl:udie;r等人（1990) Methods in Enzymol. 185:6〇-89，&risson 等（1984)化Uire 310:511-514，Takamatsu等人（1987) EMBO J. 6:307-311，Coruzzi等人 (1984) EMBO J. 3:1671-1680 和化ogli等人，（1984) Science 224:838-843，Gurley等 人（1986) Mol. Cell. Biol. 6:559-565和 Weissbach & Weissbach，1988，Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，NY，Section ν?ΙΙ,ρρ 421-463中描述。在下 文中提供异源蛋白质的例子。
[0150] 为生产本发明的肤和/或多肤，其使用重组技术，将本发明的编码核祀向肤的多核 巧酸连接至核酸表达载体，所述载体包含位于顺式调节序列（例如，启动子序列)转录控制 下的多核巧酸序列，所述顺式调节序列适合在宿主细胞中指导本发明的多肤的组成的、组 织特异性的或可诱导的转录。
[0151] 短语"经分离的多核巧酸"指的是单链或双链核酸序列，其是经分离的，并且WRNA 序列形式、互补多核巧酸序列（cDNA)形式、基因组多核巧酸序列形式和/或复合多核巧酸 序列(例如，W上的组合)形式提供。
[0152] 本文使用的短语"互补多核巧酸序列"指的是一种序列，其使用反转录酶或任何其 他RNA依赖的DNA聚合酶由信使RNA反转录产生。运样的序列可W随后在体内或体外使用DNA 依赖的DNA聚合酶扩增。
[0153] 本文使用的短语"基因组多核巧酸序列"指的是衍生自（分离)染色体的序列，并因 此其代表染色体的连续部分。
[0154] 本文使用的短语"复合多核巧酸序列"指的是一种序列，其至少部分是互补的，并 至少部分是基因组。复合序列可W包括一些编码本发明的多肤所需的外显子序列，W及渗 入其间的内含子序列。内含子序列可W是任何来源，包括其他基因，通常包括保守的剪接信 号序列。运样的内含子序列可W进一步包括顺式作用表达调控元件。
[0155] 如上文提及的，本发明的多核巧酸序列插入至表达载体中（即，核酸构建体）W能 够表达重组肤。本发明的表达载体可W包括另外的序列，所述序列使得该载体适合在原核 生物、真核生物或优选在两者中（例如，穿梭载体)复制和整合。通常的克隆载体含有转录和 翻译起始序列（例如，启动子、增强子)和转录和翻译终止子(例如，多腺巧酸化信号）。可w 理解表达载体还可W包含编码其他多肤的多核巧酸序列，所述多肤转录地连接至本发明的 核祀向肤。运样的多肤在下文中进一步描述。
[0156] 多种原核或真核细胞可W用作宿主表达系统W表达本发明的肤。运些包括，但不 限于，微生物，使用例如具有含有多肤编码序列的重组隧菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达 载体转化的细菌;使用含有多肤编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母;使用包含多肤 编码序列的重组病毒表达载体(例如，花挪菜花叶病毒，CaMV;烟草花叶病毒，TMV)感染或使 用重组质粒表达载体，例如Ti质粒转化的植物细胞系统。
[0157] 可W理解本发明的多核巧酸还可W在受试者中直接表达（即，体内基因治疗)或可 W在体外在细胞系统中表达（自体的或非自体的），并随后施用于受试者。基因治疗技术在 下文中进一步描述。
[0158] 除了含有转录和翻译插入编码序列(编码所述多肤)所需的元件外，本发明的表达 构建体还可W包括经工程改造的序列，W优化表达的肤的稳定性、生产、纯化、产量或活性。
[0159] 可W使用多种方法将本发明的表达载体引入宿主细胞系统。运些方法通常在 Sambrook等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Springs Harbor Laboratory,New York (1989,1992)，Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology , John Wiley and Sons ,Baltimore ,Md . (1989),Chang 等人，Somatic Gene Therapy，CRC Press，Ann Arbor'Mich. (1995)，Vega 等人，Gene Targeting，CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995)，Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses,Butte;rwo;rths，Boston Mass. (1988)和Gi化oa 等人[Biotechniques 4 (6): 504-512,1986]中描述，并且包括，例如，稳定或瞬时转染、脂质转染、电穿孔和用重 组病毒载体感染。另外，正负选择法参见美国专利号5，464，764和5，487，992。
[0160] 在有效条件下培养转化的细胞，所述条件允许重组多肤大量表达。有效的条件包 括，但不限于，允许蛋白质生产的有效培养基、生物反应器、溫度、pH和氧条件。有效培养基 指的是可W培养生产本发明的重组多肤的任何培养基。运样的培养基通常包括含有可吸收 的碳源、氮源和憐酸源，和合适的盐类、矿物质、金属和其他营养物，如维生素的水溶液。本 发明的细胞可W在常规的发酵生物反应器、摇瓶、试管、微量滴定盘和陪替氏平皿中培养。 培养可W在适于重组细胞的溫度、pH和氧含量条件下进行。运样的培养条件在本领域技术 人员的知识中。
[0161] 依赖于生产所需的载体和宿主系统，本发明的生成肤和/或多肤可W保留在重组 细胞中、分泌至发酵介质中、分泌至两个细胞膜的间隙中，例如大肠杆菌(E. coin的周质 间隙;或保留在细胞或病毒膜的外表面上。
[0162] 随培养预定的时间，对重组肤和/或多肤进行回收。
[0163] 本文使用的短语"回收重组多肤"指的是收集含有多肤的全部发酵培养基，且不需 要暗示另外的分离或纯化步骤。
[0164] 因此，本发明的肤和/或多肤可W使用多种标准蛋白质纯化技术进行纯化，例如， 但不限于亲和层析、离子交换层析、过滤、电泳、疏水相互作用层析、凝胶过滤层析、反相层 析、伴刀豆球蛋白A层析、层析聚焦和差异溶解作用。
[0165] 为了促进回收，表达的编码序列可W经工程改造 W编码本发明的肤，并融合可切 割部分。可w设计运样的融合蛋白质而使得多肤可w容易地通过亲和层析分离;例如，通过 固定在对可切割部分特异的柱上。当切割位点在多肤和可切割部分之间进行工程改造时， 多肤可W用能够特异性地在该位置切割融合蛋白质的合适的酶或剂处理后从层析柱释放 (例如，参见 Booth 等人，Immunol. Lett. 19:65-70 (1988);和Gardella 等人，J. Biol. Chem. 265:15854-15859 (1990))。
[0166] 本发明的肤和/或多肤优选W"基本纯净的"形式回收。
[0167] 本文使用的短语"基本纯净的"指的是允许在本文描述的应用中使蛋白质可W有 效发挥作用的纯度。
[0168] 除了在宿主细胞中合成，本发明的肤和/或多肤还可W使用体外表达系统合成。运 些方法是本领域熟知的，并且系统的各组分是商业上可W获得的。
[0169] 如上文提及的，还可W直接对受试者使用本发明的多核巧酸，其中所述多核巧酸 在祀细胞翻译，即基因治疗。
[0170] 本文使用的基因治疗指的是将目的遗传物质（例如DNA或RNA)转移至宿主W治疗 或防止遗传性或后天性疾病或病症或表现型。目的遗传物质编码期望在体内产生的产物 (例如蛋白质、多肤、肤、功能RNA、反义）。例如，目的遗传物质可W编码治疗价值的激素、受 体、酶、多肤或肤。综述一般参见"Gene Therapy" (Advanced in Pharmacology 40， Academic Press,1997)的文本。
[0171] 已经发展了基因治疗的两种基本方法：（1)先体外后体内的和(2)在体内的基因治 疗。将先体外后体内的基因治疗细胞中从患者体内移除，并在体外培养治疗。通常，通过合 适的基因送递载体/方法(转染、转导、同源重组等)和按需要的表达系统，将功能置换基因 引入细胞中，并随后将经修饰的细胞在培养基中增殖，然后返回宿主/患者。运些遗传重植 细胞在原位置已经显示了表达转染的遗传物质。细胞可W是受试者自体的或非自体的细 胞。因为当施用给身体时，非自体细胞可W诱导免疫反应，已经开发了几种方法来降低对非 自体细胞排斥的可能性。运些方法包括在移植前抑制接受者免疫系统或将非自体细胞封装 入免疫隔离的半透膜内。
[0172] 体内基因治疗中，祀细胞不是从受试者中取出，而是将遗传物质转移至接受者机 体原位的细胞中（在接受者体内）。在一个可选的实施方案中，如果宿主基因是有缺陷的，贝U 基因可W在原位修复（Culver, 1998.(抗体stract) Antisense DNA & RNA based therapeutics,February 1998，Coronado，CA)。
[0173] 运些遗传改变的细胞已经显示在原位表达转染的遗传物质。
[0174] 为了给予特异性，优选地使用于表达本发明的肤和/或多肤的核酸构建体包含细 胞特异性启动子序列元件，例如癌症特异性启动子(例如生存素启动子-化en等人，Cancer Gene Therapy,2004'Volume 11'Number 11，Pages 740-747)。
[0175] 对于基因治疗，核酸通常通过与病毒剂转染引入到细胞中。运是由于他们的感染 特性可W获得更高的效率。此外，病毒是非常特异性的，并通常在特定细胞类型中感染和繁 殖。因此，他们的天然特异性可W用于在体内或在组织内或细胞混合培养物内祀向载体至 特定细胞类型。病毒载体还可W用特异性受体或配体修饰W通过受体介导的事件改变祀向 特异性。
[0176] 另外，重组病毒载体可用于体内表达期望的核酸，因为他们提供了例如横向感染 和祀向特异性的优点。横向感染是例如反转录病毒等的生存周期中固有的，并且是一种单 个受感染细胞生产许多出芽和感染相邻细胞的后代病毒颗粒的过程。结果是大区域迅速感 染，其中大多数都不是由原始病毒粒子感染的。该情况与垂直型感染相反，垂直型感染中传 染物的传播仅通过子代后代。还可W生产没有能力横向传播的病毒载体。如果所需的目的 是将特异性基因仅引入局部数量的祀细胞，可W使用该特征。
[0177] 本发明的核祀向肤可W用来在宿主细胞中调节内源性和外源性多肤的核转位，其 包括分裂的（例如细胞系）和非分裂的细胞(例如初级细胞)和真核细胞例如哺乳动物细胞 和酵母细胞中。
[0178] 例如，本发明人已经显示本发明的核祀向肤自发地表现并与内源信号竞争，所述 内源信号例如那些包含在C-化η N末端激酶(JNK1/2)和p38促分裂原活化蛋白激酶α/e (P38 α/β)中。运导致了所述内源信号的核转位的下调。
[0179] 因为本发明的肤能够特异地抑制JNK1/2和Ρ38 α/β的细胞核内活性而不调节他 们的细胞质内活性，运些肤可W用于在细胞中抑制JNKl/^2和Ρ38 〇/0的核活性(例如，细胞 调亡活性，炎症活性），而不损害其他的JNK1/2和Ρ38 α/β相关的细胞质活性。因此，本发明 的该方面的肤可W提供针对炎症和细胞调亡相关疾病的治疗剂，而不具有其他JNK1/2和 Ρ38 α/β抑制剂的副作用。
[0180] 因此，根据本发明的另一个方面，在此提供了在受试者中治疗炎性病症或免疫病 症症的方法，所述方法包括对受试者施用治疗有效量的经分离的肤，从而治疗炎性疾病或 免疫疾病。
[0181] 本文使用的，术语"受试者"指的是哺乳动物受试者，优选地是人。
[0182] 许多设及炎症应答的疾病和症状，可W通过上述的方法来治疗。运些疾病和症状 在下文中进行总结。
[0183] 炎性疾病-包括，但不限于，慢性炎性疾病和急性炎性疾病。
[0184] 超敏反应相关炎性疾病 超敏反应的例子包括，但不限于，I型超敏反应、Π 型超敏反应，III型超敏反应，IV型超 敏反应、速发型超敏反应、抗体介导超敏反应、免疫复合体介导超敏反应、Τ淋己细胞介导的 超敏反应和DTH。
[018引I型或速发型超敏反应，例如哮喘。
[0186] II型超敏反应包括，但不限于，类风湿性疾病、类风湿自身免疫疾病、类风湿性关 节炎化renn V等人，Histol Histopathol 2000 Jul;15 (3):791)、脊椎炎、强直脊椎炎 (Jan Voswinkel等人，Adhritis Res 2001; 3 (3): 189)、系统性疾病、系统性自身免疫 疾病、系统性红斑狼疮化rikson J.等人，Immunol Res 1998; 17 (1-2) :49)、硬化症、系统 性硬化（Renaudineau Y.等人，Clin Dia即 Lab Immunol. 1999 Ma;r;6 (2):156);化an ΟΤ.等人，Immunol Rev 1999 Jun;169:107)、腺疾病、腺自身免疫疾病、膜腺自身免疫疾 病、糖尿病、I型糖尿病（Zimmet P. Diabetes Res Clin Pract 1996 0ct;34 S叫pi: S125)、甲状腺病、自发性自身免疫甲状腺病、格雷夫斯氏病（Orgiazzi J. Endocrinol Metab Clin North Am 2000化n;29 (2):339),甲状腺炎自发的自身免疫甲状腺炎 (化aky-Mullen Η. and 化 S，J Immunol 2000 Dec 15; 165 (12):7262),桥本氏甲状腺 炎(ToyodaN.等人，NipponRinshol999 Aug;57(8):1810)、粘液水肿、自发粘液性水肿 (]?113皿曰1'.化口口〇11化邮}1〇.1999 411邑;57 (8):1759)、自身免疫再生疾病、卵巢疾病、卵 巢自身免疫(Garza KM.等人，J Reprod Immunol 1998 Feb;37 (2) :87)、自身免疫抗精液 不育（Diekman AB.等人，Am J Reprod Immunol. 2000 Mar; 43 (3):1:34)、重复性流产 (Tincani A.等人，Lupus 1998;7 Suppl 2:S107-9)、神经变性的疾病、神经疾病、神经自 身免疫疾病、多发性硬化（Cross AH.等人，J 化uroimmunol 2001 Jan 1;112 (1-2):1)、 阿尔茨海默氏病（Oron L.等人，J Neural Transm S叫pi. 1997;49:77)、重症肌无力 (Infante AJ. And Kraig E，Int Rev Immunol 1999;18 (1-2):83)、原动神经病 化ornberg AJ. J Clin Neurosci. 2000 May;7 (3):191)、急性感染性多发性神经炎，神 经病和自身免疫神经病化usunoki S. Am J Med Sci. 2000 Apr;319 (4):234)、重症肌无 力疾病、Lambe;rt-Eaton类重症肌无力综合征（Takamori Μ. Am J Med Sci. 2000 Ap;r;319 (4) :204)、附肿瘤性神经病疾病、小脑的萎缩、附肿瘤性小脑的萎缩、非附肿瘤性僵硬人综 合症、小脑的萎缩、渐进小脑萎缩脑炎、Rasmussen's脑炎、肌萎缩性侧索硬化、Sydeham舞 蹈病、Gilles de la Tourette综合症、多内分泌腺疾病、自身免疫多内分泌腺疾病 (Antoine JC. and Honnorat J. Rev 化urol (Paris) 2000 Jan; 156 (1):23);神经病、 免疫异常神经病（Nobile-Orazio E.等人，Electroence地alogr Clin Neurophysiol Suppl 1999;50:419);神经性肌强直、获得性神经性肌强直、关节弯曲多重凹陷（Vincent A.等人，Ann N Y Acad Sci. 1998 May 13;841:482)、屯、血管疾病、屯、血管自身免疫疾病、 动脉粥样硬化（Matsuura E.等人，Lupus. 1998;7 Suppl 2:S135)、屯、肌梗死（Vaarala 0. L叫us. 1998;7 Suppl 2:S132)、血栓（Tincani A.等人，L叫us 1998;7 S叫pi 2: S107-9)、肉芽肿病、眶坏死性肉芽肿病、动脉炎、Takayasu氏动脉炎和川崎综合症 (Praprotnik S.等人，Wien Klin Wochenschr 2000 Aug 25; 112 (15-16) :660);抗凝血 因子自身免疫病(Xacroix-Desmazes S.等人，Semin Thromb Hemost.2000;26 (2):157): 血管炎，引起坏死的小型血管炎、显微多血管炎、化urg和Strauss综合症、肾小球性肾炎、少 免疫的焦点的坏死血管球性肾炎肾小球肾炎、新月形的血管球性肾炎（Noel LH. Ann Med Interne (Paris). 2000 May; 151 (3):178):抗憐脂综合症（Flamholz R.等人，J Clin Apheresis 1999; 14 (4) :171);屯、力衰竭、类兴奋剂β-肾上腺素能受体抗体屯、脏衰竭 Wallukat G.等人，Am J Cardiol. 1999 化η 17;83 (12Α):75Η)、血小板减少性紫齋 (Moccia F. Ann Ital Med Int. 1999 Apr-Jun;14 (2):114);溶血性贫血、自身免疫性 溶血性贫血化fremov DG.等人，Leuk Lymphoma 1998化n;28 (3-4):285)、胃肠疾病、胃 肠道自身免疫疾病、肠疾病、慢性炎症肠道病（Garcia Herola A.等人，Gastroenterol 胎patol. 2000 Jan;23 (1):16)、脂泻病化andau YE. and Shoenfeld Υ. Harefuah 2000 Jan 16; 138 (2) :122)、肌肉系统自身免疫疾病、肌炎、自身免疫肌炎、Sjogren ' s综 合症(Feist E.等人，Int Arch Alle巧y Immunol 2000 S邱；123 (1):92);平滑肌自身免 疫病（Zauli D.等人，Biomed Pharmaco化er 1999 化n;53 (5-6):234)、肝脏疾病、肝自身 免疫疾病、自身免疫肝炎(Manns MP. J胎patol 2000 Aug;33 (2):326)和夏科氏肝硬变 (Strassburg CP.等人，Eur J Gastroenterol Hepatol. 1999 Jun; 11 (6) :595)。
[0187] IV型或Τ细胞介导的超敏反应，包括但不限于，类风湿性疾病、类风湿性关节炎 (TischR，McDevitt册.Proc化tlAcadSciUSA 1994 Janl8;91 (2):437)、系统性 疾病、全身自身免疫疾病、系统性红斑狼疮(Datta SK.，Lupus 1998;7 (9):591),腺疾病、 腺自身免疫疾病、膜腺疾病、膜腺自身免疫疾病、1型糖尿病(Castano L. and Eisenbadh GS. Ann. Rev. Immunol. 8:647);甲状腺病、自身免疫甲状腺病、格雷夫斯氏病（Sakata S.等人，Mol Cell Endocrinol 1993 Mar ;92 (1):77);卵巢疾病（Garza KM.等人，J Reprod Immunol 1998 Feb; 37 (2) :87)，前列腺炎、自身免疫前列腺炎(Alexander RB.等 人，Urology 1997 Dec;50 (6) :893)、多腺综合症、自身免疫多腺综合症、I型自身免疫多腺 综合症化ara T.等人，Blood. 1991 Mar 1; 77巧）：1127)、神经疾病、自身免疫神经疾病、 多发性硬化、神经炎、视神经炎（Soderstrom M.等人，J Neurol Neu;rosu;rg Psychiatry 1994 May;57 (5) :544)、重症肌无力（Oshima Μ.等人，Eur J Immunol 1990 Dec;20 (12):2563)、全身肌强直综合征化iemstra HS.等人，Proc 化tl Acad Sci U S A 2001 Mar 27;98 (7):3988)、屯、血管疾病、Chagas'病的屯、脏自身免疫（Cunha-Neto E.等人，J Clin Invest 1996 Oct 15; 98 (8) :1709)、自身免疫性血小板减少性紫齋（Semple JW. 等人，Bloodl996 Mayl5;87α0):4245)、抗辅助性T细胞自身免疫（CaporossiAP.等 人，Viral Immunol 1998; 11 (1) :9)、溶血性贫血（Sallah S.等人，Ann 胎matol 1997 1曰。74 (3):139)、肝脏疾病、肝自身免疫疾病、肝炎、慢性活动型肝炎巧^11(3〇4.等人， Clin Immunol Immunopathol 1990 Mar; 54 (3): 382)、胆汁性肝硬变、夏科氏肝硬变 (Jones DE. Clin Sci (Colch) 1996 Νον;91 (5):551)、肾病、肾自身免疫疾病、肾炎、间 质性肾炎化ellyCJ.JAmSocNe地roll990 Aug;l(2):140)、结缔组织疾病、耳病、自 身免疫结缔组织疾病、自身免疫耳疾病（Yoo TJ.等人，Cell Immunol 1994 Aug; 157 α):249)、内耳疾病（GloddekB.等人，AnnNYAcadScil997 Dec29;830:266)、皮肤 病、皮肤的疾病、真皮的疾病、大瘤的皮肤病、寻常天瘤疮、大瘤的天瘤疮样的和落叶状天瘤 疮。
[0188] 迟发型超敏反应的例子包括，但不局限于，接触性皮炎和药疹。
[0189] T淋己细胞介导的超敏反应的例子包括，但不局限于，辅助T细胞和细胞毒性T淋己 细胞。
[0190] 辅助T细胞介导的超敏反应例子包括，但不局限于，Thl淋己细胞介导的超敏反应 和Th2淋己细胞介导的超敏反应。
[0191] 自身免疫疾病 包括，但不限于屯、血管疾病、类风湿疾病、腺疾病、胃肠疾病、皮肤疾病、肝脏疾病、神经 疾病、肌肉疾病、肾疾病、生殖有关疾病、结缔组织疾病和系统性疾病。
[0192] 自身免疫屯、血管疾病例子包括，但不限于动脉粥样硬化（Matsimra E.等人， Lupus. 1998;7 Suppl 2:S135)、屯、肌梗死（化arala 0. Lupus. 1998;7 Suppl 2:S132)， 血栓（Tincani A.等人，Lupus 1998;7 Suppl 2:S107-9)、眶坏死性肉芽肿病、 Takayasu 氏动脉炎、川崎综合症（Praprotnik S.等人，Wien Klin Wochenschr 2000 Aug 25;112 (15-16) :660)、抗凝血因子自身免疫病化 acroix-Desmazes S.等人，Semin Thromb Hemost. 2000; 26 (2) :157)、引起坏死小型脉管血管炎，微观的多脉管炎、化urg和Strauss 综合症、少免疫的焦点的坏死和新月形肾小球肾炎（Noel LH. Ann Med Interne (Paris). 2000 May; 151 (3) :178)、抗憐脂综合症化lamholz R.等人，J Clin Apheresis 1"9;14 (4):m)、抗体诱导屯、力衰竭(Wall址at G.等人，Am J Cardiol. I"9 Jun I7; 83 (12A):75H)、血小板减少性紫齋(Moccia F. Ann Ital Med Int. 1999 Apr-化n;14 (2):114; Semple JW.等人，Blood 1996 May 15;87 (10):4245),自身免疫性溶血性贫血 化fremov DG.等人，Leuk Lymphoma 1998 Jan;28 (3-4) :285; Sallah S.等人，Ann 胎111日1〇1 1997]\&1。74 (3):139)、化日邑日3氏疾病中的屯、脏自身免疫（加血日-化1〇6.等 人，J Clin Invest 1996 Oct 15;98 (8):1709)和抗辅助Τ细胞自身免疫（Caporossi AP. 等人，Viral Immunol 1998; 11 (1):9)。
[0193] 自身免疫类风湿性的疾病例子包括，但不限于类风湿性关节炎化renn V.等人， Histol Histopathol 2000 Jul;15 (3):791; Tisch R，McDevitt 册.Proc 化tl Acad Sci units S A 1994 Jan 18;91 (2):437)和强直性脊柱炎（Jan Voswinkel 等人， Art虹itis Res 2001; 3 (3): 189)。
[0194] 自身免疫腺疾病例子包括，但不限于膜腺疾病、I型糖尿病、甲状腺疾病、Graves ' 病甲状腺炎、自发的自身免疫甲状腺炎、桥本氏甲状腺炎、自发粘液性水肿、卵巢的自身免 疫、自身免疫抗精液不育，自身免疫前列腺炎和I型自身免疫多腺综合症疾病、但不限于膜 腺的、1 型糖尿病自身免疫疾病（Castano L. and Eisenbarth GS. Ann. Rev. Immunol. 8:647; Zimmet P. Diabetes Res Clin Pract 1996 Oct; 34 Suppl:S125)、自身免疫甲状 腺病，Graves '病（0;rgiazzi J. Endocrinol Metab Clin North Am 2000 Jun; 29 (2): 339; Sakata S.等人，Mol Cell Endocrinol 1993 Mar;92 (1):77)、自发的自身免疫甲 状腺炎（化al巧-Mullen Η. and 化 S，J Immunol 2000 Dec 15; 165 (12) :7262)、桥本氏 甲状腺炎（ToyodaN.等人，Ni卵onRinshol999 Aug;57(8):1810)、自发粘液性水肿 (Mitsuma Τ. Nippon Rinsho. 1999 Aug;57 (8):1759)、卵巢的自身免疫（Garza KM.等 人，JR巧rodImmunoll998 Feb;37 (2):87)、自身免疫抗精液不育化iekmanAB.等人， Am J Reprod Immunol. 2000 Mar ;43 (3):1:34)、自身免疫前列腺炎（Alexander RB.等 人，Urology 1997 Dec;50 (6):893)和I型自身免疫多腺综合症化ara Τ.等人，Blood. 1991 Mar 1;77 (5):1127)〇
[0195] 自身免疫胃肠疾病例子包括，但不限于，慢性的炎症性的肠疾病(Garcia Herola A.等人，Gastroenterol Hepatol. 2000 Jan;23 (1):16)、脂泻病化andau YE. and Shoenfeld Y.化refu址2000 Jan 16;138 (2):122)、结肠炎回肠炎和克罗恩氏病。
[0196] 根据本发明的一个特定实施方案，所述疾病为结肠炎。
[0197] 自身免疫皮肤的疾病例子包括，但不限于，自身免疫大瘤皮肤病，例如，但不限于， 寻常天瘤疮、大瘤性类天瘤疮和落叶状天瘤疮。
[0198] 自身免疫肝脏疾病例子包括，但不限于，肝炎、自身免疫慢性活动型肝炎（化anco A.等人，Clin Immunol Immunopathol 1990 Ma;r;54 (3) :382)、夏科氏肝硬变(Jones DE. Clin Sci (Colch) 1996 Νον;91 (5) :551; Strassburg CP.等人，Eur J Gastroenterol Hepatol. 1999 化n;ll (6):595)和自身免疫肝炎（Manns MP. J Hepatol 2000 Aug;33 (2):326)0
[0199] 自身免疫神经疾病例子包括，但不限于，多发性硬化（Cross AH.等人，J 化111'〇;[1]111111]1〇1 2001 化]11;112(1-2):1)、阿尔茨海默氏病（01'〇]11^.等人，]"化11抑1 Transm S叩pi. 1997;49:77)、，重症肌无力（Infante AJ. And Kraig E，Int Rev Immunol 1999; 18 (1-2) :83; Oshima M.等人，Eur J Immunol 1990 Dec;20 (12): 2563)、神经病、原动力神经病化ornberg AJ. J Clin Neurosci. 2000 May;7 (3):191); 急性感染性多发性神经炎和自身免疫神经病化usunoki S. Am J Med Sci. 2000 Apr; 319 (4):234)、肌无力、Lambe;rt-Eaton类重症肌无力综合征(Takamo;riM.AmJMedSci. 2000 Apr;319 (4):204):类瘤神经疾病、小脑的萎缩、类瘤小脑萎缩和全身肌强直综合征 化iemstraHS.等人，Proc化tlAcadSciunitsSA 2001 Mar27;98 (7):3988);非类 瘤全身肌强直综合征、渐进的小脑萎缩、脑炎、Rasmussen氏脑炎、肌萎缩性侧索硬化、 Sydeham舞蹈病、Gilies de la Tourette综合症和自身免疫多内分泌腺疾病(Antoine JC. and Honnorat J. Rev Neurol (Paris) 2000 Jan; 156 (1):23);免疫异常神经病 (Nobile-Orazio E.等人，Electroenc邱halogr Clin Neurophysiol Suppl 1999 ; 50: 419);获得性神经性肌强直，关节弯曲多重的congenita(Vincent A.等人，Ann N Y Acad Sci. 1998 May 13;841:482)、神经炎、视神经炎（Soderstrom M.等人，J Neurol Neu;rosu;rg Psychiatry 1994 May; 57 (5):544)和神经变性疾病。
[0200] 自身免疫肌肉疾病例子包括，但不限于，肌炎、自身免疫肌炎和主要的Sjogren氏 综合症（Feist E.等人，Int Arch Allergy Immunol 2000 S邱；123 (1):92)和平滑肌自 身免疫病（Zauli D.等人，Biomed Pharmacother 1999 Jun;53 (5-6):234)。
[0201] 自身免疫肾疾病例子包括，但不限于，肾炎和自身免疫间质性肾炎化elly CJ. J Am Soc Nep虹〇1 1990 Aug;l (2):140)。
[0202] 生殖相关自身免疫疾病例子包括，但不限于，重复性流产（Tincani A.等人， Lupus 1998;7 Suppl 2:S107-9)。
[0203] 自身免疫结缔组织疾病例子包括，但不限于，自身免疫耳病（Yoo TJ.等人，Cell Immunol 1994 Aug; 157 (1):249)和内耳自身免疫疾病(Gloddek B.等人，Ann N Υ Acad Sci 1997 Dec 29;830:266)〇
[0204] 自身免疫系统性疾病例子包括，但不限于，系统性红斑狼疮化rikson J.等人， Immunol Res 1998; 17 (1-2):49)和系统性硬化（Renaudineau Y.等人，Clin Dia即 Lab Immunol. 1999 Ma;r;6 (2):156); Qian ΟΤ.等人，Immunol Rev 1999 Jun;169:107)。
[020引传染性疾病 传染性疾病的例子包括，但不限于，慢性的传染病、亚急性的传染病、急性的传染病、病 毒性疾病、细菌性疾病、原生动物性疾病、寄生虫病、真菌病、支原体疾病和航病毒疾病。
[0206] 移植排斥疾病 移植排斥相关疾病的例子包括，但不限于，移植排斥、慢性移植排斥、亚急性移植排斥、 过急性移植排斥、急性移植排斥和移植物抗宿主疾病。
[0207] 过敏性疾病 过敏性疾病例子包括，但不限于，哮喘、蜂疹、等麻疹、花粉过敏、灰尘蛾过敏、毒液过 敏、化妆品过敏、乳液过敏、化学品过敏、药物过敏、昆虫叮咬敏症、动物毛发皮屑过敏、带刺 植物敏症、毒常春藤过敏和食物过敏。
[020引 癌症 癌症例子包括，但不限于，癌、淋己瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。癌症疾病的特别的但 不限制的例子:骨髓性白血病如慢性粒性白血病、伴随成熟的急性髓性白血病、急性早幼粒 细胞性白血病、伴随嗜碱性白细胞提高的急性非淋己细胞白血病、急性单核细胞性白血病、 伴随嗜曙红细胞增多白血病急性髓单核细胞白血病；恶性淋己瘤，如Birkitt ' S非 化dgkin ' s;淋己细胞白血病，如急性的成淋己细胞白血病。慢性淋己细胞性白血病;骨 髓及外骨髓增殖的疾病、如实性肿瘤良性的脑膜瘤、诞腺混合瘤、结肠腺瘤;腺癌、如小细胞 肺癌、肾、子宫、前列腺、膀脫、卵巢、结肠、肉瘤、脂肉瘤、粘液样的、滑膜肉瘤、横纹肌肉瘤 (肺泡的）、外骨骼粘液样软骨肉瘤、尤因氏肉瘤;其他的包括双丸状的和卵巢的无性细胞 瘤、成视网膜细胞瘤、维耳姆斯瘤、成神经细胞瘤、恶性黑色素瘤、间皮瘤、乳房、皮肤、前列 腺和卵巢。
[0209] 本发明还预期阻止多肤的核转位，所述多肤内源性地包含本发明确定的信号肤， 通过使用敲入策略等将本发明确定的序列进行突变。
[0210] 另一种调整内源性多肤核转位的方法是通过蛋白质/蛋白质相互作用。因此，例 如，核祀向肤与抗体连接，可W被引入细胞中。抗体识别并结合其祀多肤使得祀多肤间接地 连接于核祀向肤。
[0211] 可W理解，如调整内源多肤的转位功能，本发明的肤可W通过接头连接到异源物 质上，从而作为载体运输异源物质至细胞核中。可W理解本发明的核祀向肤还可W在细胞 中而不是在体外连接至异源物质。因此异源物质可W在核祀向肤施用之前，伴随施用或施 用之后施用至细胞。
[0212] 异源物质可W是祀向细胞核期望的任何材料，例如，药剂如治疗剂、诊断剂或化妆 剂。因此，根据本发明的该方面，异源物质可W是多肤、多核巧酸、脂质、碳水化合物、激素、 类固醇、小化学品，病毒和其任何组合等。
[0213] 根据本发明该方面的一个实施方案，异源物质是多肤。多肤可W是，例如，永生化 蛋白质（例如、SV40大T抗原和端粒酶）、抗细胞调亡蛋白质（例如，突变p53和Bel. sub. xL)、 抗体、致癌基因（例如，ras、myc、HPV E6/E7和腺病毒Ela)、细胞周期调节蛋白（例如，细胞周 期素和细胞周期素依赖蛋白激酶）、或酶(例如，绿色巧光蛋白质、0-半乳糖巧酶和氯霉素乙 酷转移酶）。
[0214] 根据本发明的该方面的另一个实施方案，异源物质是核酸。该核酸可W是，例如， RNA、DNA或cDNA。核酸的序列可W是编码或非编码序列（例如，反义寡核巧酸）。
[0215] 将核酸安全和有效转移进入细胞的能力是生物技术中的一项基本目标。当前的合 成递送系统虽然安全，但是相对低效的。有效基因递送的一个主要障碍是将遗传物质祀向 至细胞核。在目前的基因递送方法中，DNA通过扩散从细胞质向细胞核移动，运是较慢的过 程，在此过程中遗传物质暴露于降解的细胞质环境中。已经实现了通过渗入核祀向肤上调 核酸核转位的效率，参见，例如Zanta等人，PNAS，Vol. 96，Issue l，91-96January 5， 1999; Subramanian'A.等人，（1999) Nat. Biotechnol. 17:873-877。
[0216] 因此本发明人预想本发明的核祀向肤将增加各种转染方案的效率，其包括但不限 于显微注射、电穿孔、憐酸巧共沉淀、DEAE右旋糖酢引入、脂质体介导的引入、病毒介导引 入、裸DNA注射和生物射弹轰击。
[0217] 根据本发明的该方面的还另一个实施方案，异源物质是病毒。病毒可W是全病毒 或含有病毒核酸的病毒核屯、（即，包装的病毒核酸，但没有病毒包膜）。可W被运输的病毒和 病毒核屯、的例子包括，但不限于，乳头状瘤病毒、腺病毒、杆状病毒、反转录病毒核屯、、和 Semliki病毒核屯、。
[0218] 根据本发明的该方面的还另一个实施方案，异源物质是小分子。所述小分子可W 是，例如，放射性核素、巧光标记物或染料。
[0219] 根据本发明的该方面的另一个实施方案，异源物质是药物递送系统，、例如，磁性 颗粒、二氧化娃珠、PLGA、纳米球或微球、壳聚糖等。
[0220] 根据本发明的该方面的还另一个实施方案，异源物质是亲合部分，例如抗体、受体 配位体或碳水化合物。当期望使用核祀向肤祀向具体细胞类型时，亲和部分与本发明的核 祀向肤之间的连接是特别有益的。根据本发明的该方面可W使用的抗体的例子包括但不限 于肿瘤抗体、抗CD20抗体和抗IL 2Ra抗体。示例性的受体包括，但不限于叶酸受体和EGF受 体。根据本发明的该方面可W使用的示例性的碳水化合物为凝集素。
[0221] 根据本发明的该方面的还另一个实施方案，异源物质是可检测部分。
[0222] 可检测部分可W是直接可检测的，通常通过发出其具体波长的福射(例如巧光剂、 憐光剂或化学发光剂）。可选地，可检测部分可W非直接可检测的。例如，可检测剂部分是酶 促反应的底物，其能够产生可检测的产物。
[0223] 可W理解本发明的核祀向肤可W直接和/或间接地与不止一个异源物质连接。
[0224] 异源物质可W通过本领域已知的并适合用于特别的异源物质的任何方法与本发 明的核祀向肤连接。因此例如，如果异源的物质是多肤，接头可W包含肤键或取代肤键，如 上文所述的。如果该异源物质是小分子，接头可W包含非肤键。
[0225] 连接方法的例子包括，但不限于，化学交联法、遗传融合和桥接。
[0226] 化学交联法：同源双功能交联接头或异源双功能交联接头可W用于交联本发明的 核祀向肤与异源物质。在核祀向肤运输该异源物质通过细胞膜后，同源双功能或异源双功 能交联接头可W可切割的促进核祀向肤从异源的物质上分离。同源双功能交联接头有至少 两个同一的反应基团。使用的同双功能交联剂可W导致自共辆，分子内的交联和/或聚合。 同双功能交联接头主要是伯胺反应(例如，亚氨酸醋、N-班巧酷醋、异硫氯酸醋、簇酸类和 横酷氯)或琉基反应(例如，2-二硫基化晚、3-硝基-2-二硫基化晚顺下締二酷亚胺、乙締讽、 芳基面、二硝基氣苯、有机隶制剂、对氯隶苯甲酸、双马来酷亚胺正己烧、1,5-二氣-2,4- 二硝基苯、和1,4-二（3'-( 2'-二硫代化晚)-丙酷胺基)下烧）。同双功能亚氨酸醋例子包 括，但不限于二甲基己二亚酷胺、二甲基辛二亚酷胺和二硫代双丙亚胺。同双功能NHS醋的 例子包括，但不限于，二班巧酷亚胺戊二酸、双班巧酷辛二酸、二(班巧酷亚讽)辛二酸、二硫 基二(班巧酷丙酸盐)和双班巧酷酒石酸。
[0227] 异双功能交联接头拥有两个或更多个不同的反应基团，其允许与特定的基团连续 共辆，因此将不期望的聚合或自共辆最小化。一些异双功能交联接头在一个末端进行胺反 应，在另一末端进行琉基反应。运样的交联剂的例子包括，但不限于班巧酷亚胺4-(N-马来 酷亚胺基甲基）环己烧--簇酸醋、m-马来酷亚胺基苯甲基-N-径基班巧酷亚胺醋、班巧酷 4-( P-马来酷亚胺基苯基)-下酸醋、双马来酷亚胺基己烧和N-( g-马来酷亚胺基下酷氧） 班巧酷亚胺醋。
[0228] 同双功能和异双功能交联反应可W在添加连接同双功能或异双功能交联剂至核 祀向肤之后停止。可W通过本领域熟知的方法将核祀向肤与同双功能或异双功能交联剂纯 化，且用作添加异源物质的原料。运样的连接同双功能或异双功能交联剂的纯化的核祀向 肤可等分试样储存在，例如-20 °C，并随后解冻。一旦解冻，可W通过完成交联反应添 加异源物质。
[0229] 基因融合:基因融合可W通过连接核祀向肤的框内编码序列与多肤异源物质的编 码序列连接产生。本领域中存在很多将编码序列连接在一起的方法。示例性的方法包括，但 不限于，聚合酶链式反应（PCR)、拼接PCR和限制性核酸内切酶消化和连接。优选地，核祀向 肤的阅读框和异源物质在框架内并转录地融合。
[0230] 核祀向肤和多肤异源物质之间可W包括蛋白酶切割位点。运样的蛋白酶切割位点 的例子包括，但不限于Xa因子和烟草蚀纹病毒（TEV)蛋白酶。
[0231] 桥联分子:可W使用成对的桥联分子使核祀向肤和异源物质复合。运样的成对的 例子包括，但不限于，（a)抗生蛋白链菌素和生物素、（b)谷脫甘肤和谷脫甘肤-S-转移酶 和（C)聚组氨酸和亲和层析剂(例如，四次氮基Ξ乙酸（NTA)或亚氨基二乙酸（IDA))，其 通过离子如Ni+2相互作用。核祀向肤可W连接到成对的任一成员上，且异源物质连接到另一 个桥联分子。例如，如果核祀向肤连接在谷脫甘肤-S-转移酶上，随后负载物连接到谷脫甘 肤。可选地，核祀向肤可W连接到抗生蛋白链菌素，且异源物质可W连接到生物素。核祀向 肤与抗生蛋白链菌素可W通过本领域已知的用于连接肤和桥分子的任意方法进行连接。运 样的方法例子包括，但不限于，化学交联或遗传融合。异源物质随后通过本领域已知的生物 素化小分子、蛋白质或核酸的任意方法，例如化学交联与生物素连接。核祀向肤/异源物质 复合物可W通过将核祀向肤-抗生蛋白链菌素与生物素化的异源的物质接触形成。
[0232] 核祀向肤和异源物质可W在核祀向肤或异源物质的任意位置化学地或使用成对 桥联分子复合，只要保证核祀向肤或异源物质的功能性不被破坏。例如，交联剂将与位于氨 基末端或簇基末端(对于蛋白质）、位于5'端或3'端的(对于核酸)或位于整个分子的合适 的官能团反应。
[0233] 本领域技术人员将能够确定核祀向肤/异源的物质复合物的各部分是否保留了生 物活性。如果核祀向肤能够将连接的异源物质转位至细胞核，则核祀向肤保留了其生物学 活性。转运活性可W通过，例如，添加核祀向肤/异源物质复合物至细胞并测定细胞W确定 异源物质是否被递送至细胞核中，其使用本领域已知的方法来测定，例如，免疫组织化学染 色。异源物质可W分析其活性，使用适于此类型异源物质的方法(例如，对于酶进行酶活性 测定，对于癌基因蛋白质进行转化分析，对于抗细胞调亡蛋白质进行抗细胞调亡测定，对于 永生化蛋白质进行永生化测定）。运些测定都是本领域熟知的，并描述于Sambrook等人， 1989 and Ausubel 等人，1989中。
[0234] 如果核祀向肤和多肤异源物质是基因操作连接的，该多肤负载部分可W复合至核 祀向肤的氨基的末端或核祀向肤的簇基末端。优选地，多肤负载部分复合至核祀向肤的N末 玉山 乂而。
[0235] 本发明的核祀向肤可W直接施用于细胞本身或作为药物组合物的一部分，所述药 物组合物与药物可接受载体混合。
[0236] 本文使用的"药物组合物"指的是本文描述的一种或多种活性成分与其他化学组 分如生理学合适的载体和赋形剂的制剂。药物组合物的目的是促进化合物对生物体的施 用。
[0237] 本文的术语"活性成分"指的是本发明的核祀向肤，其单独地或与异源试剂连接； 或是编码所述肤的多核巧酸，其用于产生生物学效应。
[0238] 在下文中，短语"生理学可接受载体"和"药物可接受载体"可W互换使用，指的是 不会对生物造成显著刺激的载体或稀释剂，也不会使施用的化合物生物活性和性能丧失。 佐剂也包括在运些短语范围内。一种药物可接受载体中的成分例子可W是例如聚乙二醇 (PEG),具有有机介质的和水介质两者的广范围的溶解度的生物相容的聚合物（Mutter等 人(1979)。
[0239] 本文的术语"赋形剂"指的是添加到药物组合物中W进一步促进活性成分的施用 的惰性物质。赋形剂的例子，但不限于，包括碳酸巧、憐酸巧、各种的糖和各类淀粉、纤维素 衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
[0240] 药物配制和施用的技术可W在"Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co.，Easton，PA，latest edition中找到，其在此通过引用并入本文。
[0241] 合适的施用途径可W，例如，包括口服、直肠、引入粘液质、经鼻的、肠的或肠胃外 的递送，包括肌肉、皮下和髓内注射W及銷内、直接屯喧内、静脉内、腹膜内、子宫内，或眼内 注射。
[0242] 可选地，可W在局部而不是全身施用该制剂，例如，通过直接在患者身体的特定区 域注射制剂。
[0243] 重组载体可多种方法施用。例如，如果使用的载体包含细胞特异性启动子，施 用的方法可W利用其祀向特异性并因此不需要在疾病位置局部施用。
[0244] 本发明的药物组合物可W通过本领域熟知的制造方法来制备，例如，通过常规的 混合、溶解、粒化、糖衣丸制造、研磨、乳化、包封、包埋或冻干处理。
[024引根据本发明使用的药物组合物可W使用传统的方法配制，其使用一种或多种生理 学可接受载体，其包括可药物地使用的赋形剂和辅剂，其促进活性成分进入制剂的过程。合 适的制剂取决于选择的施用途径。
[0246] 对于注射，本发明的活性成分可W配制在水溶液中，优选地是生理学相容的缓冲 液如化nk氏溶液、林格氏液或生理盐水缓冲液。对于转化粘液质施用，在制剂中使用合适对 屏障渗透的渗透剂。运样的渗透剂通常是本领域已知的。
[0247] 对于口服施用，该化合物可W容易地通过将活性化合物与本领域熟知的药物可接 受载体组合配制。运些载体能够使本发明的化合物配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊剂、液 体、凝胶、糖浆、膏剂、悬浮液等，用于由患者口服摄取。用于口服的药物制剂可W使用固体 赋形剂制备，如果需要，任选地研磨形成的混合物，并在添加合适的辅剂之后加工成颗粒混 合物，W获得片剂或糖衣丸的核。具体地，合适的赋形剂是，填料例如糖，其包括乳糖、薦糖、 甘露糖醇或山梨糖醇;纤维素制剂例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃馨淀粉、明胶、 黄巧胶、甲基纤维素、径基丙基甲基纤维素、簇甲基纤维素钢;和/或生理地可接受的聚合物 如聚乙締化咯烧酬（PVP)。如果期望， 可W添加崩解剂，例如交联的聚乙締基化咯烧酬、琼 脂或藻酸或其盐类例如海藻酸钢。
[0248] 糖衣丸具有合适的包衣。为了该目的，可W使用浓缩糖溶液，其可W任选地含有阿 拉伯树胶、滑石、聚乙締基化咯烧酬、聚簇乙締凝胶、聚乙二醇、二氧化铁、漆溶液和合适的 有机溶剂或溶剂混合物。可W在片剂或糖衣丸包衣添加着色剂或色素，用于鉴定或表征活 性化合物剂量的不同组合。
[0249] 可W 口服使用的药物组合物包括明胶制的推合胶囊(push-fit capsule) W及明 胶和增塑剂(如甘油或山梨糖醇）制备的软的，密封的胶囊。推合胶囊可W包含活性成分混 合有填料如乳糖、粘合剂如淀粉、润滑剂如滑石或硬脂酸儀和任选地，稳定剂。软胶囊中，活 性成分可W溶解或悬浮在合适的液体中，如脂肪油类、液体石蜡或液体聚乙二醇。此外，可 W添加稳定剂。口服施用的全部配方都应该是适合所选施用途径的剂量。
[0250] 对于口腔施用，组合物可W是W传统方法配制的片剂或锭剂形式。
[0251] 对于经鼻施用，根据本发明的活性成分方便地W来自压缩包的喷雾剂形式或使用 合适推进器的气雾剂递送，例如，二氯二氣甲烧、Ξ氯氣甲烧、二氯-四氣乙締或二氧化碳。 在加压气溶胶的情况中，剂量单位可W通过提供阀W递送计量的量确定。例如，在分配器中 使用的明胶制成的胶囊和盒，可W配制为含有化合物和合适的粉末基质如乳糖或淀粉的粉 末混合物。
[0252] 本文描述的制剂可W配制用于肠胃外施用，例如，通过快速浓注或连续输注。注射 制剂可W是单位剂型存在，例如，W安飯或在任选添加防腐剂的多剂量容器中。组合物可W 是在油或水媒介中的悬浮液、溶液或乳剂，并可W含有配方剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散 剂。
[0253] 肠胃外施用的药物组合物包括W水溶形式的活性剂的水溶液。另外地，活性成分 的悬浮液可W作为合适的油基或水基注射悬浮液配制。合适的亲脂性的溶剂或媒介物包括 脂肪油如芝麻油或合成脂肪酸醋例如油酸乙醋、Ξ酸甘油醋或脂质体。水注射悬浮液可W 含有增加悬浮液粘性的物质，如簇甲基纤维素钢盐、山梨糖醇或葡聚糖。可选地，悬浮液也 可W含有合适的稳定剂或提高活性成分可溶性的试剂，其允许高高浓度溶液的制备。
[0254] 可选地，在使用前活性成分可W是粉末形式，用于与合适的媒介物，例如无菌的、 无热原的水基溶液构建。
[0255] 本发明的制剂还可W配制成直肠施用组合物，如栓剂或灌肠制剂，使用例如常规 的栓剂基础例如可可脂或其他的甘油醋。
[0256] 本发明背景下适合使用的药物组合物包括其中W实现意图目的有效量含有的活 性成分的组合物。更具体地，治疗有效量意指对防止、减轻或改善病症或延长受治疗的受试 者的生存的活性成分的量。
[0257] 确定治疗有效剂量在本领域技术人员能力之内。
[0258] 对于本发明的方法中使用的任何制剂，治疗有效量或剂量可W首先根据体外测定 评估。例如，剂量可W在动物模型中配制，且运样的信息可W用于更准确地确定可用于人的 剂量。
[0259] 本文描述的活性成分的毒性和治疗功效可W通过体外、细胞培养物中或实验动物 中进行标准药物程序来确定。从运些体外和细胞培养测定和动物研究中获得的数据可用于 配制在人中使用的剂量范围。剂量可W根据使用的剂型和施用途径而变化。精确的配方，施 用途径和剂量可W由医生根据患者状况选择。[参见，Fingl，等人，（ 1975) "The Pharmacological Basis of Ther曰peutics"，Ch. 1 p.l]。
[0260] 取决于受治疗的状况的严重性和应答，可WW单剂量或多剂量施用，治疗过程持 续数天至数周或直到实现治愈或实现疾病状态的降低。
[0261] 施用的组合物的量，当然将取决于受治疗的对象、痛苦严重性、施用方式、处方医 生的判断等。
[0262] 可W理解本发明的多肤和多核巧酸可W与其他的活性剂一起提供给个体，W实现 相比分别使用各自剂治疗改善的治疗效果。在运样的治疗中，量度(例如，补充剂的剂量和 选择)可W与组合治疗相关的不良副作用。
[0263] 还可W制备将包括本发明的制剂配制于适合的药物载体中的组合物，将其放置在 合适的容器中，并标记用于治疗指示的状况。
[0264] 如果期望，本发明的组合物，可W存在于包装或分配装置中，例如FDA批准的试剂 盒，其可W包含一个或多个含有活性成分的单位剂型。包装可W例如，包含金属或塑料薄 膜，如薄膜包装。包装或分配装置可W附有施用说明。包装或分配装置可W还包含一个连接 于容器上的政府部口管理该药物的生产、使用或销售的注意事项，该注意事项反映了政府 批准该组合物或人或兽医的施用形式。运样的注意事项，例如，可W通过U.S. Food and Drug A血inistration批准标记用于处方药或插入批准的产品。
[0265] 本文使用的，术语"约"指的是± 10 %。
[0266] 术语"包含"、"包括""具有"W及他们的结合意思是"包括但不限于"。
[0267] 术语"由……组成"指的是"包含并且限于……"。
[0268] 术语"基本上由…组成"指的是组合物、方法或结构可W包含另外的成分、步骤和/ 或部分，但是仅当运些另外的组分、步骤和/或部分不实际改变要求保护的组合物、方法或 结构的基本的或新型的特征时。
[0269] 本文使用的，术语"方法"指的是完成给定目标的手段、方法、技术和步骤，其包括， 但不限于，那些化学、药理、生物、生物化学和医学领域技术人员已知的方式，方法，技术和 步骤，或很容易从已知的方式、方法、技术和步骤中发展出的那些方法。
[0270] 本文使用的，术语"治疗"包括终止、基本抑制、减缓或逆转状况的进程，基本改善 症状临床症状或表现症状，或基本上防止出现临床或表现症状。
[0271] 可W理解本发明的特征，为了清楚地说明，在各个实施方案的范围中进行了描述， 可W在单个实施方案联用中也进行了提供。反之，本发明的各种特征，为了简洁，在单个实 施方案的范围内进行了描述，也可W分别地或任意再组合或W任何本发明其他的实施方案 中所描述的内容中提供。各种实施方案的范围内特定特征的描述不应认为是那些实施方案 的基本特征，除非在没有那些要素时该实施方案无法进行。
[0272] 在前文进行描述，并在下文的权利要求部分进行了要求的本发明的各种实施方案 和方面在W下实施例中发现了实验支持。 实施例
[0273] 给出了针对W下的实施例的参考，其与上文描述一同W非限制性的方式阐明了本 发明的一些实施方案。
[0274] 通常地，本文使用的命名法和本发明使用的实验室程序包括分子、生物化学、微生 物学和重组dm技术。运些技术在文献中得到了详细解释。参见，例如，"Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook 等人，（1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel'R. M.，ed. (1994); Ausubel 等人，" Current Protocols in Molecular Biology"，John Wiley and Sons ,Baltimore , Maryland (1989); Perbal，"A Practical Guide to Molecular Cloning"John Wiley & Sons ,New York (1988) ; Watson 等人，"Recombinant DNA"，Scientif ic American Books，New York; Birren 等人(eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series"，Vols. 1-4,Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York (1998);美国专 利号4,666,828; 4,683,202; 4,801，531; 5,192,659 和 5,272,057所示的方法；"Cell Biology: A Laboratory Handbook"，Volumes I-III Cellis,J. E.，ed. (1994);" Culture of Animal Cells-A Manual of Basic Technique" by Freshney，Wiley-Liss， N. Y. (1994),Third Edition; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E.，ed. (1994); Stites 等人（eds)/'Basic and Clinical Immunology" (8th Edition),Appleton & Lange，Norwalk，CT (1994); Mishell and Shiigi (eds)，" Selected Methods in Cellular Immunology"，！. H. Freeman and Co.，New York (1980);可W得到的免疫学测定在专利和科学文献中进行了深入描述，参见，例如美国专 利号3,791，932; 3,839，153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879， 262; 3,901，654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996，：345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879， 219; 5,011，771 和 5,281，521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait,M. J.，ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames'B. D.，和Higgins S. J.'eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames，B. D.，和Higgins S. J.，eds. (1984);" Animal Cell Culture" Freshney,R. I.，ed. (1986) ; "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press，（1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal， B. ,(1984)和"Methods in E；nz;ymology" Vol. l-317，Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications"，Academic Press , San Diego,CA (1990); Marshak 等人，"Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratoiy Course Manual" CSHL Press (1996);所有的运些文献在此通过全文引入并 入本文。其他的常规参考在本文档中也有提供。运些操作过程相信是本领域熟知的，并为读 者便利而提供。本文包含的所有信息通过引用并入本文。
[02巧]材料与方法 DNA 构建体与突变：将GFP-JNKl/2、p38a/e克隆至pEGFP-Cl(Clontech，Mountain View，CA)。从HeLa细胞中扩增JNK1/2 和 ρ38α/β序列，JNK2 和ρ38β侧翼为EcoRI / BamHI， 且JNKl和ρ38α侧翼为趾ol / BamHI酶切位点。JNKl/2和ρ38α/β的点突变通过定点突变执 行。将GST-JNKl/2、p38a/e克隆至PGEX-2T载体（GE healthcare，Buckin曲amshire，UK)，侧 翼为Spel / Notl限制性位点。使用特异性引物执行GFP- ρ38α的N和C末端的缺失突变，W 构建Δ7 / Δ20 / Δ30Ν末端缺失突变或Δ40的C末端缺失突变。将输入蛋白3、7和9克隆 至pEGFP-C。使用特异性引物将输入蛋白7和9从化La细胞cDNA中扩增，输入蛋白7侧翼为 BamHI / Sail限制位点，输入蛋白9侧翼为Xhol / Sail限制位点。输入蛋白3从 Forchheimer库质粒集合中获得，并使用侧翼为化〇1 / EcoRI限制位点的特异性引物扩增。 [0276] 细胞培养和转染：化La和MC巧细胞在使用有2 mM k谷氨酷胺，1 % Pen / Strep 和10 %胎牛血清（FBS)补充的Du化ecco氏改良Eagle氏培养基（DMEM)中培养。皿2细胞在 添加氨化可的松（0.5 mg / ml)和膜岛素（lOyg/ ml)的相同培养基中培养。MCF10A细胞 在添加5%马血清、EGF (200 ng /ml)、氨化可的松(0.5 mg /ml)、霍乱菌毒素（100 ng / ml)、膜岛素（10μg/ml)、2 mMk谷氨酷胺、1% pen / strep和 10% FBS的DMEM F-12培养基中 培养。所有细胞均在37°C、95%空气湿度和5%C02环境中维持。HeLa细胞用聚乙締亚胺（ Sigma)进行转染。siRNA用 Dharmafect ( Thermo Fisher Scientific,CO,USA)进行转染。 [0277]免疫巧光显微术:将细胞在3%仲甲醒的PBS溶液中固定（20分钟，23 °C)，并在含2 %牛血清白蛋白（BSA)的PBS中溫育（15分钟，23 随后用Triton X-100 ( PBS中浓度 为0.1 %，5分钟，23 "C)透化。随后将固定的细胞与初级抗体溫育（60分钟，23 °C)，用 PBS洗涂Ξ次，与罗丹明-共辆二级抗体和DAPI溫育（60分钟，23 °C)。通过巧光显微镜（ Olympus BX51，x40放大率)观测载玻片。并使用化otoshop ( Adobe,CA，USA)进行原始数据 图像的背景校正、对比度调节。
[027引免疫共沉淀反应:HeLa细胞生长至分汇合，血清-饥饿（0.1% FBS，16小时），并随 后用其他药物刺激或处理。细胞抽提物按照如前所述的方法产生，并与预先连接有特异性 抗体（1小时，23 °C)的A / G-琼脂糖珠子（Santa Cruz Biotechnology)共同溫育2小时（ 4 "C，震荡）。用冰冷的洗涂缓冲液洗涂结合的A / G珠子Ξ次。经IP的珠子随后使用1.5X样 品缓冲液重悬并煮沸;使用具有指示的抗体的蛋白质印迹分析分解蛋白质。
[0279] 邻近连接现憶（PLA):使用Duolink PLA试齐Ij盒(Olink Bioscience)根据生产商 的方案分析蛋白质-蛋白质相互作用。简言之，使细胞如描述的生长、固定和透化处理。随后 将样品与针对两种受检测的蛋白质的初级抗体进行溫育（60分钟，23 °〇、洗涂（0.01 Μ Tris肥1 pH 7.4,0.15 Μ化α和0.05%吐溫20)，并随后使用特异性探针溫育(60分钟，37 °C)，然后使用DAPI染色W观察细胞核，并使用缓冲液Β : 0.2 Μ Tris HC1 pH 7.5,0.1 Μ 化Cl洗涂。通过巧光显微镜（Olympus ΒΧ51，χ40放大率)可观测到作为区别的巧光点的信 号。使用化otoshop ( Adobe)和ImageJ执行原始数据图像的背景校正、对比度调节和巧光 信号的定量。
[0280] 体外相互作用：化La细胞长至分汇合，血清-饥饿（0.1 % FBS，16小时），并随后 使用其他药物或刺激处理。将细胞提取物如描述的生产，并与预先与特异性抗体连接（1 小时，23 "C)的A / G-琼脂糖小珠溫育2小时（4 °C)。将结合的A / G小珠随后使用RIP A 缓冲液洗涂一次，然后使用0.5M LiCl洗涂两次，并使用缓冲液A.洗涂两次。结合的A / G小 珠随后在含有0.01 % BSA的缓冲液A中重悬并等分。GST标记蛋白质与小珠溫育2小时（4 °C)，随后在1.5 X样品缓冲液中洗涂并重悬，并煮沸。
[0281] 凝胶过滤：使化La细胞血清饥饿（如上文），随后用茵香霉素（Anis，0.5yg/ ml, 15分钟）和ΤΡΑ (250 nM，15分钟)刺激或不处理(NT)。细胞提取物(各个处理25 mg)负载 于16 /60 superdex 200大小的柱(流速1ml /分钟），并收集1ml级分。使用具有合适抗体的 蛋白质印迹分析级分。
[0282] 统计学分析:数据用平均数+ S.E表达。统计学评估使用泛函分析和Student t检 验(双尾)检测对照和实验结果之间的差异。P < 0.05的值被认为是统计学显著的。
[0283] 实施例1 JNK和p38使用不依赖NTS机制转位至细胞核中 在寻找不依赖NLS的穿梭蛋白质中，本发明人查找了 JNK1 / 2和ρ38α/β的亚细胞定位。 使用具有特异性抗体(Ab)的免疫染色发现，与Ε服1 / 2相似，JNK1 / 2和ρ38α/β主要定位 于静止细胞的细胞质中（图7Α和图8Α-Β)。使用应激或促有丝分裂刺激物(分别地茵香霉素 和ΤΡΑ)处理细胞，在所有四种ΜΑΡΚ同种型中观察到了快速而强劲的核转位，在他们的转位 动力学中仅有较小的差异。有趣地，该转位与JNK1 / 2和ρ38α/β活化憐酸化作用无关（图 7B)，指示运四种ΜΑΡΚ的转位机制与E服1/2的不同。此外，JNK或p38蛋白质均不包含NTS,并 且仅有两种，JNK2和ρ38β，在相同的激酶区域含有可憐酸化序列（T-P-S)。然而，JNK1 / 2 和ρ38α/β与Ε服1 / 2之间显著的序列和构型相似性可W表明前者在他们的激酶插入域仍 使用NTS样序列用于转位。为了排除运种可能性，本发明人在所有的四个ΜΑΡΚ中将JNK1或 口38〇中的憐酸化的^5比对残基突变为均突变为41曰或6111残基。与6服1/^2不同，运些突变的 过表达导致与WT蛋白质相似的分布（图9)，指示JNK1/ 2和ρ38α/β不仅在从错蛋白质上释放 不同，而且他们的转位机制也不同。
[0284] 实施例2 刺激后JNK1/2和ρ38α/β与Imp3、7和9的相互作用 缺乏E服1/2样NTS，W及标准的或任何非典型的化S，和JNK1 / 2和ρ38α/β不能与Impa 或Impb直接或间接相互作用，促使寻找他们转位作用的实际机制。因为β-样Imp(下文表3) 已经设及信号蛋白质的刺激转位，假设运些Imp中的一种或多种设及到所述过程。为了检验 运一假设，使用免疫共沉淀反应（CoIP)筛选检测他们中的任一是否与JNK1 / 2和ρ38α/β 相互作用。除了在运些测试细胞中Imp的表达，没有在静止化La细胞中检测到显著的Imp/ ΜΑΡΚ相互作用（图1A)。然而，在受刺激化La细胞的提取物中，JNK1 / 2和ρ38α/β的IP展示了 所有四个ΜΑΡΚ与Imps 3、7和9的相互作用的多个程度。重要地，筛选和其他IP实验证明在组 分间的缔合或相互作用的时间上仅有小的差异，表明他们之间的相似调节模式。
[0285] 表 3 Ιπφβ-样蛋白质列表
[0286] 表3的参考 1. Chook，Y.M. & Suel，K.E. Nuclearimport by karyopherin-betas: recognition and inhibition. Biochim Biophys Acta 1813,1593-1606 (2011). 2. Waldmann，I.，Walde，S. & Kehlenbach，民.H. Nuclearimport of c-Jun is mediated by multiple transport receptors. J Biol Qiem 282,27685-27692 (2007). 3. Wu，F.，Wang，P.，Young，L.C.，Lai，民.& Li，L. Proteome-wide identification of novel binding partners to the oncogenic fusion gene protein?NPM-ALK?using tandem affinity purification and mass spectrometry. Am J Pathol 174?361-370 (2009). 4. Zakaryan，民.P. & Gehring，H. Identification and characterization of the nuclear localization/retention signal in the EWS proto-oncoprotein. J Mol Biol 363,27-38 (2006). 5 . Miyauchi，Y.等人Importin 4 is responsible for 1 igand-independent nuclear translocation of vitamin D receptor. J Biol Chem 280,40901-40908 (2005). 6. Chachami，G.，Paraskeva，E.，Georgatsou，E.，Bonanou，S. & Simos，G. Bacterially produced human HIF-lalpha is competent for heterodimerization and specific DNA-binding. Biochem Biophys Res Commun 331,464-470 (2005). 7. Heese，K.等人 Characterizing the new transcription regulator protein p60TRP. J Cell Biochem 91,1030-1042 (2004). 8. Chuderland，D.，Konson，A. & Seger，民.Identification and characterization of a general nuclear translocation signal in signaling proteins. Mol Cell 31， 850-861 (2008). 9. Lorenzen，J . A.等人 Nuclearimport of activated D-E 民 K by DIM-7 , animportin family member encoded by the gene moleskin. Development 128,1403- 1414 (2001). 10. Yao，X.，Chen，X.，Cottonham，C. & Xu，L. Preferential utilization ofImp7/8 in nuclearimport of Smads. J Biol Qiem 283,22867-22874 (2008). 11. Chen，J.，Liu，M.Y.，Parish，C.民.，Chong，B.H. & Khachigian，L. Nuclearimport of early growth response-1 involvesImportin-7 and the novel nuclear localization signal serine-proline-serine. Int J Biochem Cell Biol 43,905-912 (2011). 12. Freedman,N.D. & Yamamoto，K.民.Importin 7 andimporti n alpha/importin beta are nuclearimport receptors for the glucocorticoid receptor. Mol Biol Cell 15,2276-2286 (2004). 13. Lubert，E.J.狂 Sarge，K.D. Interaction between protein phosphatase 2A and members of theimportin beta superfamily. Biochem Biophys Res Commun 303， 908-913 (2003). 14. Lai，M.C.，Kuo，H.W.，Chang，W.C. & Tarn，W.Y. A novel splicing regulator shares a nuclearimport pathway with S民 proteins. Embo J 22,1359-1369 (2003). 15. Tao，T.，Lan，J.，Lukacs，G.L.，Hache，民.J. & Kaplan,F.Importin 13 regulates nuclearimport of the glucocorticoid receptor in airway epithelial cells. American journal of respiratory cell and molecular biology 35,668-680 (2006)〇
[0287] 为了验证这些相互作用，在MC巧细胞中重复CoIP实验，并在HeLa细胞中检测表达 的MAPK与Imp的相互作用。两个实验均证实Imp3/7/9的IP不仅对内源HeLa蛋白质是特异的 (图10A-B)。另外，执行邻近连接测定（PLA)，其是蛋白质-蛋白质相互作用研究的不依赖 CoIP的工具。类似于CoIP的结果，在测试的Imp和MPK之间没有检测到显著的基本相互作用 (图1B)。然而，茵香霉素或TPA刺激引起JNK1 / 2或ρ38α/目与Imps 3 / 7 / 9之间的相互作 用的显著增加。如预计的Imps的穿梭作用，相互作用主要在细胞质和核周区域发现。这些结 果表明Imp 3 / 7 / 9与MAPK的刺激的相互作用首先发生在细胞质中，输入蛋白在穿梭时 或在转位之后立即从MAPK脱离。
[0288] 实施例3 Imp3、7和9是JNK1/2或ρ38α/目转位至细胞核所需的 为了进一步证实Imp3/7/9在JNK1 / 2或ρ38α/目的核转位中的作用，使用他们的Si-RNA 执行敲除实验。将Imp5敲除。且将不相关的Si-RNA作为对照。四种测试Imp的Si-RNA的相应 Imp量在48小时内减少超过85% (图2A-C)。这些敲除在静止细胞中没有影响内源JNK1 / 2 或ρ38α/β的胞质定位。然而，敲除Imp3/7/9,而不是Imp5或Si-对照，显著调整了测试的ΜΑΡΚ 的受刺激的核穿梭。敲除Imps抑制了约80%细胞的转位作用，而Imp?和Imp9的Si-RNA仅抑制 了~60%的转位作用。为了进一步研究敲除Imp3/7/9对JNK1 / 2或ρ38α/β转位作用的影响， 本发明人检验了核JNK / ρ38底物C-化η、ATF-2和MEF2A的憐酸化作用。重要地，全部Ξ种 Si-RNA显著抑制了运些转录因子的刺激-诱导的憐酸化作用，虽然Imp3的Si-RNA的效果比 Imp7 / 9的效果略高（图2C)。在任何其他的蛋白质的检验中没有发现Si-RNAs对ER畔己C- Myc (图11)的效果或其他的非祀效果。因此，其显示Ξ种Imp对JNK1 / 2和ρ38α/β的转位作 用是重要的，虽然Imp3的作用可W更一般。
[0289] 为了参与转位过程，可W不同于Imp α/β，在刺激下Imps 3 / 7 / 9改变他们的定 位。的确，发现（图12A-B)对HeLa和HB2细胞的刺激引起Imp3/7/9从细胞质到核周区 (Imp3)，或进入细胞核（Imp? / 9Μπφβ定位完全不受刺激影响。运些结果表明所有Ξ个 Imp对JNK1 / 2或ρ38α/β的核转位来说都是重要的，其可W通过交换，或可W通过转位复合 物的形成来发挥作用。最后，如依赖b-类似Imp在Ran活性中预期的，使用Ran的Si-RNA，发 现JNK和p38的转位确实是Ran-依赖的（图13)。运些观测暗示β-样Imp在应激-和促有丝分裂 的-诱导过程中的作用，表明他们在细胞刺激下可W调节转录。
[0290] 实施例4 通过特异性N-末端序列，JNK1/2和ρ38α/β与Imp?或Imp9相互作用 为了获得对MAPK-Imp相互作用的更好的了解，本发明人研究了GST-p38a/e和GST- JNK1 / 2与从不受刺激或受刺激的化La细胞的提取物中的Imp的体外相互作用。虽然预期 MAPK与来自受刺激的细胞的Imp7 / 9相互作用，但是没有检测到与Imp3的体外相互作用 (图3A)。此外，CoIP实验展示Imp 3对于JNK和p38与Imp? / 9的相互作用不是必须的（图3B 相对于图1)。运些结果表明JNK和p38仅与Imp7或Imp9直接相互作用，并且该相互作用不需 要Imp3。
[0291] 本发明人接下来对JNK和p38上介导与Imp7和Imp9相互作用的位点进行确定。为了 该目的，将靠近ρ38α激酶结构域的C和N末端区域的各区域缺失，并且检测运些缺失对其在 亚细胞定位和激酶的输入蛋白相互作用中的影响（图14A-C)。Ν和C末端结构域两者的缺失 都会导致ρ38α的胞质定位，然而，仅有Ν末端缺失（ΑΑ 1-30)防止了刺激性转位和Imp? / 9 相互作用，指示了该区域对转位的重要性。为了定位转位所需的正合序列，发明人进一步细 分了 N-末端，通过缺失激酶首先的7个或20个残基。重要地，运两个另外的突变没有影响转 位或与Imp? / 9的结合，显著表明重要的序列位于ρ38α的第20位-第30位残基。
[0292] 为了进一步研究ΜΑΡΚ的核转位中确定区域的作用，本发明人合成了一条基于ρ38α 的21-34残基序列肤序列：Myr-阳RYQ化SPVGSGA-SEQ ID NO : 16)的14个氨基酸的肉豆違 酷化的肤。因为该区域在p38bW及JNK1和JNK2中相似，假设其应当与所有四个ΜΑΡΚ和Imp? / 9的相互作用相竞争，并从而影响他们的核转位。的确，当该肤在刺激前应用于HeLa细胞 时，其阻止了检验的MPK的核转位（图4A)和Imp? / 9相互作用（图4B)。因此，运些结果清楚 地证实JNK / p38同种型中氨基末端调节核转位的重要性，并且表明该肤可W用于研究转 位的作用和其临床参与。
[0293] 实施例5 Imp7/9-JNK/p38复合物与憐酸化Imp3相互作用 ΜΑΡΚ与Imp3/7/9在细胞中的相互作用（图1A-B)提出了一个问题，即每个输入蛋白在核 转位过程的作用是什么。事实是Imp3的SiRNA比Imp7 / 9的siRNA具有更高的效果（图2A- C)，Imp3不与JNK1 / 2或ρ38α/β在体外直接相互作用（图3A)，且Imp3不是MAPK与Imp? / 9 的相互作用所需的（图3B)，导致产生运样一种假设，MAPKs结合至Imp7或Imp9，随后Imp3加 入二聚体使其进行核转位。
[0294]为了验证该假设，并确立内源Imp3/7/9之间的复合物形成，本发明人通过PLA监控 运些可能的相互作用。在静止化La细胞中没有检测到任何测试输入蛋白之间的相互作用 (图5A，B)。然而，在刺激后会发生显著改变，其诱导了 Imp3和Imp7或Imp9之间的相互作用， 但Imp7和Imp9之间没有。运些结果随后通过受刺激的化La细胞提取物的CoIP实验进行了 确认。有趣地，来自未受刺激或刺激细胞的重组Imp7和Imp9与Imp3的体外相互作用（图加） 证明在刺激后Imp3被修饰，使得其可W发生相互作用。使用碱性憐酸酶（CIP)处理细胞提 取物减少了相互作用，显著指示Imp3与Imp? / 9的相互作用需要Imp3的憐酸化。
[029引实施例6 MAPK-Imp相互作用的凝胶过滤分析 为了进一步验证该机制，执行凝胶过滤W将未结合的蛋白质从更高MW的复合物分离。 的确，来自静止细胞的Imp3/7/9显示了他们预期的单体MW (Imp3:约90 W)a;Imp7 / 9:约 120 kDa;图5A)Jmp3也显示了约160 kDa的峰，其可W代表蛋白质的同源或异源二聚体/Ξ 聚体。有趣的是，在另一个220-400 W)a (指定为约280 kDa)的峰发现了少量的所有Ξ种未 受刺激的Imp(图6A)。相对宽的约280峰可W对应于Imps的二聚体，或包含Imps的二聚体与 其他的30-80 W)a蛋白质（例如MAPKs)的异源Ξ聚体，或Imps与任意高MW蛋白质（100-200 kDa)的复合物。重要的是，来自刺激细胞提取物的各种峰的Imps的相对量都发生了显著的 改变。因此，较低峰的Imps3 / 7 / 9的量显著减少，而较高的那些对相应升高。平行地， 在刺激后JNK和p38从约40 kDa的尖峰变成了很宽的峰（图15A-B)。
[0296] 为了确定Imp和MAPK的较高丽峰是由（至少部分地)MAPK和Imp的二聚体之间的相 互作用形成，执行了CoIP实验。正期望的，在约120 W)a峰没有发现组分之间的结合（图6B); 在Imp3的较高的歷峰（约160 kDa)也是该情况。在另一方面，来自刺激的、280 kDa峰的 Imp3/7/9免疫共沉淀JNK和p38蛋白质。另外，Imp3于Imp7和Imp9两者CoIP，而在Imp7和Imp9 之间没有发现相互作用。还在较高MV部分中观察到Imp7和Imp9之间缺少相互作用，清楚地 指出在刺激后没有形成Imp3/7/9S聚体。在不同的刺激下没有观测到MAPK^mp结合亲合性 上可区分的刺激，指示了二聚体与MAPK的剩余活性。运些结果进一步支持了该观点：在刺激 后Imp3与Imp7/MA服或Imp9/MAPK二聚体相互作用，并且异源Ξ聚体是合适转位至核中所需 的。
[0297] 实施例7 肉豆違酷化肤治疗结肠炎的用途 材料和方法 细胞培养和转染：将化La细胞培养于补充有2 ml k谷氨酷胺、1% Pen/S化ep和10% 胎牛血清(FBS)的Du化ecco氏改良化gle氏培养基中。
[0298] 免疫巧光显微术:将细胞在3%仲甲醒的PBS溶液中固定（20分钟，23 并在含2 %牛血清白蛋白（BSA)的PBS中溫育（15分钟，23 随后用Triton X-100 ( PBS中浓度 为0.1 %，5分钟，23 η〇透化。将固定细胞与初级抗体（60分钟，23 °C)，用PBS洗涂Ξ次， 与罗丹明-共辆二级抗体和DAPI溫育（60分钟，23 °C)。之后用巧光显微镜（Olympus BX51，x40放大率)观察载玻片。使用化otoshop ( Adobe，CA，USA)执行原始数据图像的背景 校正和对比度调节。
[0299] DNA 构建体和突变。将 GFP-JNKl/2、p38a/e 克隆至祀 GFP-C1 (Clontech，Mountain View，CA)。从HeLa细胞cDNA中扩增JNK1/2 和ρ38α/β序列，并对JNK2和ρ38β由EcoRI / BamHI作为侧翼，对JNK1和ρ38α由趾〇1 / BamHI作为侧翼。JNK1/2和ρ38α/β的点突变通过 定位诱变执行。将GST-JNKl/2、p38a/e克隆至PGEX-2T载体中（GE healthcare, Buckin曲amshire，UK)并由翼Spel / Notl限制位点作为侧翼。GFP- ρ38α的N或C末端缺失 突变使用特异性引物来构建Α7 / Δ20 / Δ30 Ν-末端缺失突变或Δ40 C-缺失突变。将 输入蛋白3、7、9克隆至祀GFP-C。使用特异性引物从化La细胞cDNA中扩增输入蛋白7和9，其 使用对输入蛋白7引由BamHI / Sail作为侧翼的特异性引物、对输入蛋白9由趾〇1 / Sail 作为侧翼的特异性引物。从Fore化eimer库质粒保存站获得输入蛋白3,使用由趾〇1 / EcoRI作为侧翼的特异性引物进行扩增。
[0300] 肉豆違酷化肤：肉豆違酷化肤是特异性设计的（口6口^(162.0，￥4，1]54)。肤序列： KPERYQ化SPVGSGA - SEQ ID NO: 9 (ρ38α的第21 位-第：34位残基）和 KPERYQNLSPVAAAA (沈Q ID NO: 10)。
[0301 ] CoIP:产生细胞提取物并与预连接特异性抗体(1小时，23°C)的A/G-琼脂糖小珠 溫育2小时(4T，震荡）。洗涂结合的A/G小珠、重悬（1.5X样品缓冲液）、煮沸，并进行蛋白免 疫印迹。
[030引邻近连接分析（化A):根据生产商的方案使用Duolink PLA试剂盒（Olink Bioscience)检测蛋白质-蛋白质相互作用。简言之，使细胞如前文描述的生长、固定和透 化。随后将样品与针对两种受检验的蛋白质的初级抗体溫育（60分钟，23 °C)、洗涂（ 0.01 Μ Tris HC1 pH 7.4,0.15 Μ化C1和0.05%吐溫20)，并随后与特异性探针溫育（60 分钟，37 °C)，然后使用DAPI染色W使得细胞核显像，并进行洗涂（0.2 Μ Tris HC1 pH 7.5,0.15 Μ化Cl)。信号通过巧光显微镜（Olympus BX51，x40放大率)观察到清楚的巧光 点。使用化otoshop和ImageJ执行原始数据图像的背景校正、对比度调节和巧光信号定量。
[0303] 体外相互作用测定：细胞提取物如上文所述的方法生产，与预先与特异性抗体连 接（1小时23 °C)的A / G-琼脂糖小珠溫育2小时（4 °〇。结合的A / G小珠随后用RIPA 缓冲液洗涂一次，然后用0.5M LiCl洗涂两次，用缓冲液A.洗涂两次。使用含有0.01 % BSA 的缓冲液A重悬结合的A / G小珠并等分。GST标记的蛋白质与小珠溫育2小时（4 "C，振 荡），随后在1.5 X样品缓冲液中洗涂并重悬，并煮沸。
[0304] 体外憐酸化测定:HeLa细胞长至分汇合，血清饥饿(0.1% FBS，16小时），随后用刺 激物或其他药物处理。如上文所述的方法生产细胞提取物，并与预先与特异性抗体连接（1 小时23 °C)的A / G-琼脂糖小珠溫育2小时（4句。结合的A / G小珠随后用RIPA缓冲 液洗涂一次，然后用0.5M LiCl洗涂两次，用缓冲液A.洗涂两次。源自刺激细胞的结合的A / G小珠样品随后与小牛小肠憐酸酶（37°C，1小时，肥B，ΜΑ，USA)溫育，随后洗涂。随后样品 在含有0.01 % BSA的缓冲液A中重悬。等分-GST标记蛋白质与小珠溫育2小时（4 °C，2小 时），随后洗涂并重悬于样品缓冲液中，煮沸。
[0305] 亚细胞分级：{ TC"细胞分级"\1 2}。亚细胞分级按照如下执行，将收获的细胞重 悬于200 μ1含有0.1% Nonidet P-40的缓冲液Η中。将裂解产物如上文用力混合并立即离 屯、，W产生含有细胞质级分的上层清液。通过下列步骤提取核蛋白质:在20化1提取缓冲液 中重悬细胞核团块，在冰上放置5分钟，短暂超声处理(2巧秒，40W，4°C)，用力混合并离屯、。 使用Coomassie蛋白质测定试剂(Pierce)确定蛋白质浓度。对细胞质和核级分两者均进行 蛋白质印迹。
[0306] 凝胶过滤：使化La细胞血清饥饿（如上），并随后用茵香霉素（Anis，0.5yg/ ml, 15分钟)和ΤΡΑ (250 nM，15分钟)刺激或不处理(NT)。细胞提取物(各处理25 mg)置于16/ 60 superdex200大小的柱中（流速1ml /分钟），收集1ml级分。使用具有合适抗体的蛋白质 印迹法对级分进行分析。
[0307] 统计学分析:数据用平均数+ S.E来表示。统计学评估用泛函分析和Student's t 检验(双尾)来检测对照和实验结果之间的差异。P < 0.05的值被认为是统计学显著的。
[0308] 体内实验:将21只雄性C57BL小鼠称重，随后注射（I.V)肤（15 mg/千克）、乱序肤 (15mg/Kilo)或DMS0 (2%)。注射24小时后将小鼠的饮用水换为含有DSS ( 1.25%)的水、 肤、乱序肤或DMS0每48小时注射。在替换饮用水7天后将小鼠处死，并使用内窥镜和小鼠体 重来评价结肠炎。
[0309] 结果 本发明人检验了使用FITC-共辆的肉豆違酷化肤的肉豆違酷化肤的胞内分布和稳定 性，并发现肤有效地穿透细胞，并甚至在24小时后还留在细胞质中（图16)。接着我们证明了 肤在DSS-诱导结肠炎模式中的潜在治疗利用。使用肤治疗的小鼠证明相比于使用对照肤治 疗的小鼠，减轻了DSS-诱导结肠炎(展示了平均体重损失和结肠中病灶的数目（图17A-C))。 然而该肤与熟知的激酶结构域1( 一种保守的蛋白质结构域)部分重合。为了克服该问题，发 明人通过使用Ala残基取代该区域而对肤进行了修饰(图18A-B)。他们接着证明该新设计的 肤抑制p38与Imp7的相互作用，并防止了 JNK和p38 MAPK的刺激-诱导的核转位，而不影响 MPK的刺激-依赖的激酶活性(图19-21)。
[0310] 虽然发明已经连同其特定的实施方案进行了描述，对于本领域技术人员很多代 替、修改和变化是显而易见的。因此，意在将所有运样的代替、修改和变化包含在在附带的 权利要求的精神和范围内。
[0311] 该说明书中的所有出版物、专利和专利申请都在W其整体通过引用并入说明书， W相同的程度好像各个出版物、专利或专利申请是具体地和分别地指示在此通过引用并入 本文。另外，该申请中的任何参考的应用和鉴定不应当被解释为承认的，运样的参考可作为 本发明的现有技术获得。在运一程度上，先前使用的部分不应当被解释为必要限制性的。
【主权项】
1. 一种经分离的肽，其包含与SEQ ID NO: 1 (PERYQNLSPV)所示的序列至少80%同源的 氨基酸序列，所述经分离的肽包含核靶向活性，所述肽不超过20个氨基酸。2. -种经分离的肽，其包含与SEQ ID NO: 1 (PERYQNLSPV)所示的序列至少80%同源的 氨基酸序列，所述经分离的肽能够防止Ρ38α核转位，所述肽不超过20个氨基酸。3. 权利要求1或2的经分离的肽，其包含与SEQ ID NO: 8 (KPERYQNLSPV)所示的序列至 少80%同源的序列。4. 权利要求1或2的经分离的肽，其包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO :8所示的序列。5. 权利要求1或2的经分离的肽，其中所述氨基酸中至少一个是合成氨基酸。6. 权利要求1或2的经分离的肽，其中所述氨基酸中至少一个是D型立体异构体。7. 权利要求1或2的经分离的肽，其中所述氨基酸中至少一个是L型立体异构体。8. 权利要求1或2的经分离的肽，其中异源物质通过接头连接至所述氨基酸序列上。9. 权利要求1或2的经分离的肽，其包含选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO: 2 (PERYQNLSPVG)、SEQ ID NO: 3 (PERYQNLSPVGS)、SEQ ID NO: 4 (PERYQNLSPVGSG)和SEQ ID NO: 5 (PERYQNLSPVGSGA)、SEQ ID NO: 6 (KPERYQNLSPVGSGA)和SEQ ID NO: 7 (KPERYQNLSPVAAAA)〇10. 权利要求1-3中任一项的经分离的肽，其是肉豆蔻酰化的。11. 在受试者中治疗炎性病症或免疫病症的方法，所述方法包括对受试者施用治疗有 效量的权利要求1-10中任一项所述的经分离的肽，从而治疗所述炎性疾病或免疫疾病。12. 权利要求11的方法，其中所述免疫病症是自身免疫病症。13. 权利要求11的方法，其中所述炎性疾病是结肠炎。14. 权利要求1-10中任一项的肽，其用于在治疗炎性病症或免疫病症中使用。15. -种物质组合物，其包含权利要求1-10中任一项的经分离的肽和通过接头连接至 所述氨基酸序列的异源物质。16. 权利要求15的物质组合物，其中所述异源物质选自多肽、核酸、小分子和碳水化合 物。17. 权利要求15的物质组合物，其中所述异源物质是多肽。18. 权利要求15的物质组合物，其中所述异源物质是药剂。19. 权利要求18的物质组合物，其中所述药剂是治疗剂、化妆剂或诊断剂。20. 权利要求15的物质组合物，其通过接头连接至可检测部分。21. 权利要求15的物质组合物，其中所述接头包含肽键。22. 权利要求15的物质组合物，其中所述接头包含非肽键。23. 权利要求15的物质组合物，其通过接头连接至亲和部分。24. 权利要求23的物质组合物，其中所述亲和部分选自抗体、受体配体和碳水化合物。25. -种经分离的多核苷酸，其包含编码权利要求1-9中任何的肽的核酸序列。26. -种核酸构建体，其包含权利要求25的经分离的多核苷酸。27. 权利要求26的核酸构建体，其进一步包含用于调节多核苷酸表达的顺式调节元件。28. 权利要求26的核酸构建体，其中所述经分离的多核苷酸转录地融合至编码目的异 源多肽序列的核酸序列中。29. -种经分离的细胞，其包含权利要求26的核酸构建体。30. 权利要求29的经分离的细胞，其是真核的。31. 权利要求30的经分离的细胞，其中所述真核细胞是酵母细胞。32. -种将物质靶向至宿主细胞的细胞核的方法，所述方法包括将物质引入至宿主细 胞中，所述物质连接于权利要求1-10的肽上。33. -种将物质靶向至宿主细胞的细胞核的方法，所述方法包括将权利要求1-10中任 一项的肽引入至宿主细胞，将所述肽连接至能够结合所述物质的亲和部分。34. 权利要求33的方法，其中所述物质是内源物质。35. 权利要求33的方法，其中所述物质是外源物质。36. 权利要求35的方法，其进一步包括在所述引入之前、伴随所述引入或在所述引入之 后对所述宿主细胞施用所述外源物质。37. 权利要求32或33的方法，其中所述宿主细胞是分裂细胞。38. 权利要求32或33的方法，其中所述宿主细胞是非分裂细胞。39. 权利要求32或33的方法，其中所述物质选自多肽、核酸、小分子或碳水化合物。40. 权利要求32或33的方法，其中所述物质是核酸。41. 权利要求40的方法，其中所述核酸通过选自下述的方法引入至所述宿主细胞中：显 微注射、电穿孔、磷酸钙共沉淀、DEAE葡聚糖引入、脂质体介导的引入、病毒介导的引入、裸 DNA注射和生物射弹轰击。42. 权利要求32或33的方法，其中所述靶向在体内有效。43. 权利要求32或33的方法，其中所述靶向在先体外后体内有效。44. 权利要求32或33的方法，其中所述靶向在体外有效。45. 权利要求32的方法，其中所述宿主细胞是真核细胞。46. 权利要求45的方法，其中所述真核细胞是酵母细胞。47. -种药物组合物，其包含权利要求1-9中任一项所述的肽，作为活性剂，和药物可接 受载体。
【专利摘要】公开了一种经分离的肽，所述肽包含与SEQ？ID？NO：1（PERYQNLSPV）所示的序列至少80%同源的氨基酸序列，所述经分离的肽包含核靶向活性，所述肽长度不超过20个氨基酸。
【IPC分类】C07K7/06, A61K38/10, A61P37/00, C07K7/08, A61K38/08
【公开号】CN105555796
【申请号】CN201480036061
【发明人】R.塞格, E.泽霍赖
【申请人】耶达研究及发展有限公司
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2014年4月24日
【公告号】EP2989119A1, US20160052967, WO2014174520A1, WO2014174520A8
【专利说明】抑制化对治疗炎性疾病的用途
[0001] 发明领域和发明背景 本发明设及可W用来防止蛋白质核转位的肤，作为转位至细胞核的方式，所述蛋白质 天然地与Imp7缔合。所述肤可W用于治疗炎性疾病和免疫疾病。进一步的，所述肤可W用于 促进蛋白质和其他化合物核转位至细胞核中（当其连接于其时）。
[0002] 为确保精确的细胞功能，蛋白质的空间分布需要紧密调节与协调。运在许多信号 蛋白质上特别明显，所述蛋白质受到细胞外刺激后显著地并迅速地改变他们的定位。为了 维持运样的调节，细胞核通过双层膜包膜从细胞质中分离，其允许通过特异性核孔复合体 (NPC)具有蛋白质的选择性入口。核定位的选择性主要由核内蛋白序列内含有的核定位信 号（化S)介导[G. Schlenste化，阳BS Lett 389,75 (Jun 24,1996)]。
[0003] 迄今鉴定的主要类型的化S是由碱性氨基酸构成的，所述氨基酸是通过NPC进入的 原理所需的。运些碱性序列有两种：（i)五至六个碱性氨基酸的单一延伸，例如猴肾病毒（ SV) 40大T抗原化S;与（ii)二分的化S，其由两个碱性氨基酸、10 - 12个氨基酸的间隔区 和其中五个氨基酸中的Ξ个必须是碱性的一个簇构成。该类型的代表是核质蛋白。为了使 化S -介导的核输入发生，NLS首先与细胞质输入-受体蛋白质输入蛋白α和β缔合，使其停靠 (docking)在核膜孔的细胞质侧[Ε. J. Tran,S. R. Wente，Cell 125,1041 (Jun 16， 2006)]。通过核膜孔的移动是由小GTP酶Ran调节，所述GTP酶Ran在其GTP -结合状态促进 输入的蛋白质从输入蛋白上的解离并使其回收返回细胞质[J. Moroianuij Cell Biochem Suppl 32-33,76 (1999)]〇
[0004] 然而，不是所有的细胞-核穿梭蛋白质都含有规范的NLS，因此使用其他的，不依赖 化S使他们的通过NPC的通道机制。一些表征的不依赖化S的机制包括小蛋白质（<30 - 40 kDa)的被动扩散、特殊核引导基序（distinct nuclear-directing motif)[D. 化1'131:09116，〔.化1'131:09116-化661'1：113，13.?;[油0]1，〔6115;[即日1 12,337 (1日7,2000)]、与 含化S的蛋白质的相互作用，或可选地，与核膜孔蛋白质（NUP)的直接相互作用；[L. Xu，J. Massague，化t Rev Mol Cell Biol 5,209 (Mar,2004)]。然而，通过运些机制的穿梭和核 保留的动力学通常太慢W至于不能及时进行瞬时转录，且因此允许信号蛋白在刺激后迅速 和可逆的不依赖NLS转位的分子机制仍然是不清楚的。
[000引 畑uderland等人，2008，M01 Cell 31,850-861 和 Plotnikov等人，2011，Mol 0611810131，3515-3530教导了6版1/2转位设及0(2-介导的6版1/2。核转运信号（ NTS)中的两个丝氨酸残基的憐酸化作用。该憐酸化作用允许与Imp7相互作用，其进一步促 进邸K1 / 2通过核膜孔穿梭。
[0006] 调节生物学组分的细胞定位的能力对于许多功能如调节核酸表达、真核细胞转 染，基因治疗、保护免受有毒化学品侵害W及运输抗癌剂是重要的。因此广泛意识到鉴定能 调节核转运的新型序列是需要的，且是非常有利的。
[0007] 另外的【背景技术】包括美国专利申请号20100099627。
[000引发明概述 根据本发明的一些实施方案的一方面，在此提供了一种经分离的肤，其包含与SEQ ID NO : 1 ( PERYQNLSPV)至少80 %同源的氨基酸序列，所述经分离的肤包含核祀向活性，所 述肤长度不超过20个氨基酸。
[0009] 根据本发明的一些实施方案的一方面，在此提供了一种经分离的肤，其包含与SEQ ID NO : 1 (阳RYQNLSPV)至少80 %同源的氨基酸序列，所述经分离的肤能够防止Ρ38α核 转位，所述肤长度不超过20个氨基酸。
[0010] 根据本发明的一些实施方案的一方面，在此提供了在受试者中治疗炎症性或免疫 病症的方法，所述方法包含对受试者施用治疗有效量的本文描述的经分离的肤，从而治疗 炎性疾病或免疫疾病。
[0011] 根据本发明的一些实施方案的一方面，在此提供了一种物质组合物，其包含本文 描述的经分离的肤W及通过接头与所述肤的氨基酸序列连接的异源物质。
[0012] 根据本发明的一些实施方案的一方面，在此提供了一种经分离的多核巧酸，其包 含能够编码本文描述的肤的核酸序列。
[0013] 根据本发明的一些实施方案的一方面，在此提供了一种核酸构建体，其包含本文 描述的经分离的多核巧酸。
[0014] 根据本发明的一些实施方案的一方面，在此提供了将物质祀向至宿主细胞的细胞 核的方法，所述方法包括将物质导入宿主细胞中，所述物质连接于本文描述的肤上。
[001引根据本发明的一些实施方案的一方面，在此提供了将物质祀向至宿主细胞的细胞 核的方法，所述方法包括将本文描述的肤引入宿主细胞，所述肤连接至能够结合所述物质 的亲和部分。
[0016] 根据本发明的一些实施方案的一方面，在此提供了包含本文描述核酸的分离的细 胞。
[0017] 根据本发明的一些实施方案的一方面，在此提供了药物组合物，包含作为活化剂 的本文描述的肤和药物可接受载体。
[001引根据本发明的一些实施方案，所述肤包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 8所示的 序列。
[0019] 根据本发明的一些实施方案，至少一个氨基酸是合成氨基酸。
[0020] 根据本发明的一些实施方案，至少一个氨基酸是D立体异构体。
[0021] 根据本发明的一些实施方案，至少一个氨基酸是L立体异构体。
[0022] 根据本发明的一些实施方案，一种异源物质通过接头与氨基酸序列连接。
[002引根据本发明的一些实施方案，经分离的肤包含选自SEQ ID NO: 2 (P邸YQ化SPVG)、沈Q ID NO: 3 (P邸YQ化SPVGS)、沈Q ID NO: 4 (阳RYQNLSPVGSG)、SEQ ID NO: 5 (PERYQ化SPVGSGA) SEQ ID NO: 6 (KPERYQNLSPVGSGA)和SEQ ID NO: 7 化阳RYQNLSPVAAAA)的氨基酸序列。
[0024] 根据本发明的一些实施方案，经分离的肤包含与SEQ ID NO: 8化阳RYQ化SPV)所 示的序列至少80%同一性的序列。
[0025] 根据本发明的一些实施方案，经分离的肤是肉豆違酷化的(myristoylated)。
[0026] 根据本发明的一些实施方案，免疫病症是自身免疫病症。
[0027 ]根据本发明的一些实施方案，炎性疾病是结肠炎。
[0028]根据本发明的一些实施方案，所述肤用于在治疗炎性病症或免疫病症中使用。
[0029] 根据本发明的一些实施方案，异源物质选自多肤、核酸、小分子和碳水化合物。
[0030] 根据本发明的一些实施方案，异源物质是多肤。
[0031 ]根据本发明的一些实施方案，异源物质是药剂。
[0032] 根据本发明的一些实施方案，药剂是治疗剂，化妆剂或诊断剂。
[0033] 根据本发明的一些实施方案，组合物通过接头与可检测部分连接。
[0034] 根据本发明的一些实施方案，接头包含肤键。
[0035] 根据本发明的一些实施方案，接头包含非肤键。
[0036] 根据本发明的一些实施方案，物质组合物通过接头与亲和部分连接。
[0037 ]根据本发明的一些实施方案，亲和部分选自抗体，受体配体和碳水化合物。
[0038] 根据本发明的一些实施方案，构建体进一步包含用于调节多核巧酸表达的顺式调 节元件。
[0039] 根据本发明的一些实施方案，经分离的多核巧酸转录地融合至编码目的异源多肤 序列的核酸序列中。
[0040] 根据本发明的一些实施方案，分离的细胞是真核细胞。
[0041 ]根据本发明的一些实施方案，真核细胞是酵母细胞。
[0042] 根据本发明的一些实施方案，所述物质是内源物质。
[0043] 根据本发明的一些实施方案，所述物质是外源物质。
[0044] 根据本发明的一些实施方案，所述方法进一步包括在引入之前、伴随引入或在引 入之后对宿主细胞施用外源物质。
[004引根据本发明的一些实施方案，宿主细胞是分裂细胞。
[0046 ]根据本发明的一些实施方案，宿主细胞是非分裂细胞。
[0047] 根据本发明的一些实施方案，所述物质选自多肤、核酸、小分子和碳水化合物。
[0048] 根据本发明的一些实施方案，所述物质是核酸。
[0049] 根据本发明的一些实施方案，通过选自下述的方法将核酸被引入至宿主细胞中： 显微注射，电穿孔，憐酸巧共沉淀，DEAE葡聚糖引入，脂质体介导的引入，病毒介导的引入， 裸DNA注射，和生物射弹轰击。
[0050] 根据本发明的一些实施方案，祀向在体内有效。
[0051] 根据本发明的一些实施方案，祀向在先体外后体内有效。
[0052] 根据本发明的一些实施方案，祀向在体外有效。
[0053] 根据本发明的一些实施方案，宿主细胞是真核细胞。
[0054] 根据本发明的一些实施方案，真核细胞是酵母细胞。
[0055] 除非另有限定，本文中使用的所有技术和/或科学术语具有如本发明所属的本领 域的普通技术人员通常理解的相同含义。虽然与本发明描述的那些类似或等同的方法和材 料可W用于实践或测试本发明的实施方案，但本文在下文描述了示例性的方法和/或材料。 W防冲突，本专利说明书，包括定义，将进行控制。另外，材料、方法W及实施例仅用做示例 性的，并且不意在必须是限制性的。
[0056] 附图简述 仅W例子的方式，本文描述了本发明的一些实施方案。通过参考附图细节，强调了显示 的运些细节仅是示例性的，用于说明本发明的实施方案。在运点上，【附图说明】对本领域技术 人员如何实施本发明来说是显而易见的。
[0057] 在附图中： 图1A-B阐明了在HeLa细胞中JNK1/2和ρ38α/β与Imp3、7和9相互作用。（A) Co - IP研 究。HeLa细胞在血清饥饿（0.1% FBS，16小时）下生长至70%汇合，随后用茵香霉素（Anis; 0.扣g/ ml, 15分钟）和TPA (250 nM，15分钟）刺激，或者不进行处理(NT)。随后将细胞提取 物与抗1服1、1服2、938〇、93地抗体或兔1旨6(作为阴性对照)进行(：〇-1?实验。使用具有指示 的抗Imp抗体的蛋白免疫印迹检测相互作用的Imp。如指示的（底部小图），Iped MAPK的量 通过抗JNKl、JNK2、p38α、p38β抗体进行检测，IgG作为对照。印迹使用NBT/BCIP或ECL显 色。箭头指示了相互作用的Imp。（B)使用化A研究。胎La细胞在血清饥饿（0.1% FBS，16小 时）下长至70%汇合，并随后用茵香霉素（Anis)刺激，或者不进行处理(NT)。将细胞固定，且 根据生产厂商的说明书进行化A测定，其如指示的使用了抗Imp抗体连同抗JNK (上部小 图）或抗p38(下部小图）。使用DAPI检测细胞核，且使用巧光显微镜观察载玻片。信号强度定 量使用ImageJ分析工具（显示的数据代表平均数+ S. E. p<0.0001 (经处理的相对于对照)执 行。 -
[005引图2A-C阐明了Imp3、7和9是JNK和p38转位和诱导转录所需的。（A)Imp3、7、9的Si RNA，而不是Imp5的Si RNA，抑制经刺激的JNK和p38的核转位。化La细胞在盖玻片上生长至 30%聚集。根据生产商说明书使用化armafeCt将指示的Imp的Si RNA和公司提供的Si对照的 (si Scr，阴性对照)转染至细胞中。转染48小时后，细胞是血清饥饿的，随后如指示的用茵 香霉素（0.5μg/ml，15分钟）刺激，或不处理(NT)。随后固定细胞，使用指示的（左侧）抗 MPK抗体染色，并用巧光显微镜观察。（B)在刺激之前和刺激后JNKs/p38s核定位的定量。 显示的数据代表平均数+ S.EJmp3相对于Imp7/Imp9 (*)的显著性为p<0.0003。刺激的 1111口3/7/9相对于5沈的显著性为9<0.00001。（0111193、7、9的511?酷抑制1服3/9383的下 游转录因子祀的活化。根据厂商说明手册使用化armafect方法使用指示的Imp的si RNA和 生产厂商提供的si对照（si Scr，阴性对照）转染化La细胞。转染48小时后，细胞是血清饥 饿的，且随后W指示的时间用茵香霉素(0.5μg/ml，15分钟）刺激，或不处理(NT)。使用抗 口]1^、口16尸24、口4了尸2、指示的11]1口和微管蛋白抗体对细胞提取物进行蛋白质印迹分析。
[0059] 图3A-B阐明了 JNK1/2和ρ38α/β与Imp7或Imp9,但不与Imp3直接相互作用。（A) JNK1/2和ρ38α/β与Imp3/7/9的体外相互作用。由IPW如下制备纯化的Imp3/7/9的:HeLa 细胞生长至70%汇合，血清饥饿，且随后用茵香霉素（Anis，0.5 pg/ml，15分钟）、TPA (250 nM，15分钟）刺激，或不处理（NT)。随后从细胞提取物中获得Imp3/7/9,充分洗涂（使用 RIPA缓冲液洗涂两次，使用0.5M LiCl洗涂一次）。根据材料和方法中所述的从细菌中制备 指示的GST-MAPK。为了检测缔合作用，将50化g的各GST-MAPK与20 μ1在PBS中得指示的经 IP的Imp溫育（4°C下振荡2小时）。随后用含有150 ml NaCl的洗涂缓冲液洗涂小珠，且使 用具有指示的抗体的蛋白质印迹分析检测相互作用的MAPKe(B)Imp3不是Imp7/9与JNK1/2 和ρ38α/β的相互作用所需的。根据厂商说明书，使用Imp3的Si RNA处理化La细胞。转染48 小时后，细胞是血清饥饿的，随后使用茵香霉素 (Anis 0.5 pg/ml)或TPA (TPA 250 ng) 刺激，或不处理（NT)。随后细胞提取物与抗Imp7或Imp9进行Co-IP,使用指示的抗体W蛋 白质印迹检测相互作用的MAPK。通过指示的抗体检测经IP的Imp的量。
[0060] 图4A-B阐明了衍生自ρ38α的第21位-第33位氨基酸的肉豆違酷化肤抑制刺激-依 赖的核转位和JNKl/2和ρ38α与Imp7的相互作用。（A)所述肤抑制JNKl/2和ρ38α/β的刺 激-依赖的核转位。HeLa细胞在载玻片上生长至70%汇合，血清饥饿(0.1% FBS，16小时），并 随后与抑制肤（肤，lOyM)或乱序肤（scrambled peptide) (Scr肤，lOyM)溫育，细胞随后 用茵香霉素（Anis，0.5 pg/ml)处理或不处理(NT)。将细胞固定，并如指示的抗JNKUJNK2、 ρ38α或ρ38β抗体染色，且WDAPI检测细胞核。使用巧光显微镜观察载玻片。（B)所述肤抑 制JNK1/2和ρ38α/β与Imp7的相互作用。HeLa细胞生长至70%汇合，血清饥饿(0.1% FBS，16 小时），并随后与抑制肤（肤，1化Μ)、乱序肤（Scr肤，1化Μ)或DMS0溫育，之后用茵香霉素 (Anis，0.5 μg/ml)处理或模拟对照(NT)。随后将细胞提取物与抗JNKl、JNK2、p38a、p38i^jt 体进行Co-IP。使用指示的抗Imp抗体通过蛋白质印迹检测相互作用的Imp7。经IP的MAPK的 量如指示的通过抗JNKl、JNK2、p38a和ρ38β进行检测。
[0061 ]图 5A-D阐明了 Imp3W憐-依赖(phospho-dependent)的方式与Imp7/9-MAPK 二聚 体的相互作用。（A)使用PLA检测异源二聚化的Imp3/7/9"HeLa细胞在载玻片上生长至70% 汇合，血清饥饿，并用茵香霉素（Anis，0.5μg/ml 15分钟)刺激。其后，将细胞固定，并进 行PLA，使用图上部标示的抗体。使用DAPI检测细胞核，并使用巧光显微镜观察载玻片。（B) 使用ImageJ分析工具对信号强度进行定量。显示的数据代表了平均数± S.E。经刺激的相对 于NT的显著性为p<0.0005e(C)通过CoIP检测Imp3/7/9相互作用。使用茵香霉素 （Anis 0.5 μg/ml)或TPA (250 nM)将血清-饥饿的HeLa细胞(0.1% FBS，16小时）处理15分钟。随 后将细胞提取物与右侧指示的抗体进行Co-IP。左侧指示的抗体和NBT/BCIP或E化使 CoIPs和经IP的Imp (底部小图）的印迹显色。（D)Imp3对Imp7/9的相互作用依赖于Imp3 的憐酸化作用。通过IPW如下制备纯化的Imp3:化La细胞生长至70%汇合，血清饥饿，并随后 用TPA (250 nM，15分钟）刺激或不进行处理（NT)。随后，Imp3从细胞提取物中经IP的， 并充分洗涂(使用RIPA缓冲液洗涂两次，使用0.5M LiCl洗涂一次）。随后，纯化的蛋白质与 小牛小肠憐酸酶溫育(CIP，1小时，37°C)或不进行处理。将50化g指示的重组Imp与经IP的 Imp3溫育（2小时，4°C下振荡）。随后用含有150 mM化C1的洗涂缓冲液洗涂小珠，并使用具 有指示的抗体的蛋白质印迹分析检测相互作用的Imp。
[0062] 图6A-B阐明了在刺激后p38和JNK与Imp3/7或Imp3/9的二聚体形成复合体。 (A)凝胶过滤研究显示在刺激后Imp3/7/9的MW移动。HeLa细胞是血清饥饿的，并随后用茵 香霉素（Anis，0.5 μg/ml，15分钟）和TPA (250 nM，15分钟)刺激，或不处理(NT)。将细 胞提取物(各处理20 mg)加载于16/60 superdex 200大小的柱上(速率1ml/分钟），并收集 1ml级分。随后使用具有左侧指示的抗Imp3/7/9抗体的蛋白质印迹分析级分。（B) CoIP证 实了JNK和p38与Imp二聚体在约280 W)a峰处而不是在约120 W)a峰处的的缔合。来源于未 处理的Anis或TPA刺激的柱的代表约280 kDa和约120 W)a峰(级分号9和22)的级分与指 示的（右侧)抗体进行CoIP。使用具有指示的（左侧)抗体的蛋白质印迹分析检测相互作用的 蛋白质。
[0063]图7A-B阐明了 JNK1/2和ρ38α/β独立于他们的活化憐酸化作用而转位至细胞核 中。（Α) JNK1/2和ρ38α/β的核转位。HeLa细胞生长至70%汇合，血清饥饿(0.1% FBS，16小 时），并随后在指示的时间点用茵香霉素(Anis，0.5 μg/ml)和TPA (250 nM)刺激，或不处 理（NT)。将细胞固定，用指示的抗JNKl、JNK2、p38a或ρ38β抗体染色，并使用DAPI检测细胞 核。使用巧光显微镜(〇171119113 8乂51，义40放大率)观察载玻片。（8)内源1服1/^2和938〇/0的 核转位独立于他们的憐酸化作用。HeLa细胞生长至70%汇合，血清饥饿，并随后用茵香霉素 (0.5 pg/ml)或TPA (250 nM)刺激指示的时间。产生细胞提取物，并与指示的抗体进行蛋 白质印迹分析。使用NBT/BCIP或E化将印迹显色。
[0064] 图8A-B阐明了在MCF10A和皿2细胞中JNK1/2和ρ38α/β转位至细胞核中。（A， Β)在MCF10A和皿2细胞中JNK1/2和ρ38α/β的核转位。（Α)皿2和（Β) MCF10A细胞在 载玻片上生长至70%汇合，血清饥饿，并用茵香霉素(Anis，0.5 μg/ml)或ΤΡΑ (250 ηΜ，只 对皿2)刺激。将细胞固定，使用图中上部标示的抗JNK和ρ38抗体染色。使用DAPI检测细胞 核，并使用巧光显微镜（Olympus ΒΧ51，χ40放大率)观察载玻片。
[0065] 图9阐明了 1服1/^2和口38〇/0使用不依赖^5机制转位至细胞核中。在^5-同源区内 的突变不影响JNK1/2和ρ38α/β的核穿梭。HeLa细胞生长至70%汇合，使用抓1(1-6。？（讯*- JNK1)、JNK2-GFP (wt-JNK2)、p38a-GFP (wt-p38a)或p380-GFP (wt-p380) W及他们的突 变体（APA或EPE)进行转染。转染16小时后，细胞是血清饥饿的、经固定的，使用巧光显微镜 (Olympus BX5l，x40 放大率)观察。
[0066] 图10A-B阐明了内源的和过表达的JNK1/2和ρ38α/β与Imp3、7和9的CoIPd(A) 进行Co-IP筛选在MCF7细胞中W检测输入蛋白与JNK1/2和ρ38α/β相互作用。MCF7细胞在 载玻片上生长至70%汇合，血清饥饿，并随后用茵香霉素 (Anis 0.5 μg/ml，15分钟）或ΤΡΑ (250 nM，15分钟）刺激，或不处理（NT)。细胞提取物随后与抗JNKl、JNK2、p38a或ρ38β抗 体，和兔IgG(作为阴性对照）(对照)进行Co-IP。使用具有指示的Imp或ΜΑΡΚ抗体的蛋白质 印迹检测相互作用的Imp或经IP的MAPK。（B)化La细胞中过表达的MAPK的相互作用。使用 JNK2-GFP (wt-JNK2)、p38地-GFP (wt-p3她）或GFP单独转染HeLa细胞。细胞是血清饥饿 的，并且随后使用茵香霉素 (Anis 0.5 μg/ml，15分钟），TPA (250 nM，15分钟)处理。随后 将细胞提取物与抗GFP抗体进行CoIP。使用具有指示的（左侧)抗体的蛋白质印迹分析检测 相互作用的Imp和负载的提取物。使用NBT/BCIP或E化与所述印迹显色。箭头指示了相互作 用的Imp。
[0067] 图11阐明了敲除Imp3/9不影响E服底物cMyc的憐酸化作用。Imp3、9的Si RNA不 抑制邸K1/2的下游转录因子祀的活化。使用化armafect根据制造商说明书，使用指示的Imp 的si RNA和厂商提供的si对照（si Scr，阴性对照）转染化La细胞。转染48小时后，细胞是 血清饥饿的，并随后在指示的时间点用茵香霉素 (Anis 0.5 pg/ml)刺激或不刺激(NT)。使 细胞提取物进行具有指示的抗体的蛋白质印迹分析，印迹与NBT/BCIP或E化显色。
[0068] 图12A-B阐明了应答刺激的Imp3/7/9的转位。HeLa (A)或皿2 (B)细胞在载玻 片上生长至70%汇合，血清饥饿，并随后用茵香霉素 （Anis 0.5μg/ml 15分钟）刺激或不处 理（NT)。将细胞固定，并使用指示的抗体染色。使用DAPI检测细胞核，并且使用巧光显微镜 观测(Olympus BX51，x40放大率)载玻片。
[0069] 图13阐明了Ran是JNK1/2和ρ38α/β核转位所需的。Ran的siRNA抑制刺激-依赖的 JNKl/^2和p38α/β的核转位。HeLa细胞在盖玻片上生长至30%汇合。随后使用化armafect根据 制造商说明书，将SiRNA Ran和公司提供的si对照（si Scr，阴性对照)转染至细胞。转染 48小时后，细胞是血清饥饿的，随后如指示的用茵香霉素(0.5μg/ml，15分钟）刺激，或不处 理（NT)。随后固定细胞，使用指示的抗MAPK抗体染色，并使用巧光显微镜观察（Olympus 8乂51，义40放大率）。
[0070]图14A-C阐明了ρ38αα与输入蛋白7相互作用的位点的鉴定 。（A)示意图代表p38 α的截短突变。（B)p38α的N末端缺失突变抑制其核转位。构建p38α-GFPΔC(40a.a)或 ΔΝ (20或30a.a)末端缺失突变，并转染至化La细胞。转染16小时后，细胞是血清饥饿的， 使用茵香霉素(0.5μg/ml，15分钟）刺激，或不处理(NT)。固定细胞，用DAPI检测细胞核，使 用巧光显微镜(Olympus BX51，x40放大率)观测载玻片。（C) ρ38α的N末端缺失突变抑制 其与Imp7/9的相互作用。构建p38a-GFP的Ν末端连续缺失突变，转染16小时后，细胞是血清 饥饿的，使用茵香霉素（〇.5μg/ml，15分钟）刺激，或不处理(NT)。随后使细胞提取物与抗 GFP抗体进行CoIP。相互作用的Imp7和负载的提取物用使用指示的抗体(左侧）的蛋白质印 迹分析检测。印迹使用NBT/BCIP或E化显色。箭头指示了相互作用的Imp。
[00川图15A-B阐明了JNK (图15A)和p38 (图15B) MAPK在刺激后形成复合体。HeLa细 胞是血清饥饿的，之后用茵香霉素(Anis，0.5 μg/ml，15分钟），TPA (250 nM，15分钟）刺 激或不处理（NT)。将细胞提取物负载于16/60 superdex 200大小柱(速率1ml/分钟），并 收集1ml级分。随后分析各级分，如指示的使用具有抗JNK/P38抗体的蛋白质印迹进行分 析。印迹与NBT/BCIP或E化显色。
[0072]图16阐明了肉豆違酷化肤的胞内分布和稳定性。HeLa细胞在盖玻片上生长至70% 汇合，血清饥饿(0.1% FBS，16小时），并在指示的时间用N -末端共辆肉豆寇酸、C-末端共辆 生物素的肤处理。用3% PFA固定细胞，并使用抗生物素蛋白-FITC染色，并进行DAPI。使用 巧光显微镜（x40放大率)观察肤。
[007引图17A-C阐明了在结肠炎模型中抑制肤作为潜在治疗剂的用途。21只雄性巧7BL小 鼠用肤（15mg/Ki 10)，乱序肤（15mg/Ki 10)或DMS0 (2%)处理(每48小时静脉注射）。使用DSS (饮用水中1.25%)诱导结肠炎，并在诱导7天后处死小鼠。使用内窥镜成像评估结肠炎，并使 用结肠中病灶的数目和小鼠体重进行评分。
[0074] 图18A-B阐明了肉豆違酷化肤阻断p38与输入蛋白7的相互作用。(A)肉豆違酷化肤 是经修饰的（将3个残基置换为丙氨酸）]?7'-胖61?￥9化5?￥6564-569 10肋：9;17'- K阳RYQNLSPVAAAA -SEQ ID NO: 10。（B) HeLa细胞与经修饰的肤预解育（2小时），随后用 茵香霉素刺激(Anis，0.5 pg/ml，15分钟），或不处理。随后将细胞提取物与抗ρ38α进行 CoIP。通过具有指示的抗体的蛋白质印迹法检测相互作用的Imp7或经IP的ρ38。
[0075] 图19A-C阐明了肉豆違酷化肤抑制ρ38的刺激依赖的核转位。HeLa细胞在载玻片上 生长至70%汇合，血清饥饿，并与新肤（NP)、肤或乱序肤预解育，并随后用茵香霉素刺激 (Anis 0.5μg/ml 15分钟），或不处理(NT)。固定细胞，并使用指示的抗体染色。用DAPI检测 细胞核，并使用旋转盘共焦显微镜（spinning disc confocal microscope )(Zeiss，x100 放大率)观察载玻片。
[0076] 图20A-C阐明了肉豆違酷化肤抑制JNK的刺激依赖的核转位。HeLa细胞在载玻片 上生长至70%汇合，血清饥饿，并与新肤（NP)、肤或乱序肤预解育，并随后用茵香霉素刺激 (Anis 0.5μg/ml 15分钟），或不处理(NT)。固定细胞并使用指示的抗体染色。使用DAPI检测 细胞核，并使用旋转盘共焦显微镜(Zeiss,xlOO放大率)观察载玻片。
[OOW]图21阐明了肉豆違酷化肤不影响MAPK的刺激依赖活化作用。HeLa细胞在载玻片上 生长至70%汇合，血清饥饿，并与新肤（NP)、肤或乱序肤预解育，并随后用茵香霉素 （Anis 0.化g/ml)、TPA (250 nM)刺激，或不处理(NT)。产生细胞提取物，并使细胞提取物进行具 有指示的抗体的蛋白免疫印迹分析。
[誦]本发明实施方案描述 本发明的一些实施方案设及可W用于防止蛋白质核转位的肤，所述蛋白质天然地W与 Imp7缔合的方式转位至细胞核中。所述肤可W用于治疗炎症和免疫相关疾病。进一步的，所 述肤可W用于促进当连接细胞核时蛋白质和其他化合物转移至细胞核。
[0079] 根据附图和附加的描述可W更好地理解根据本发明的核转移信号的原理和操作。
[0080] 在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，应当理解本发明不将其应用限于下 文的描述或实施例给出的示例。本发明可W包含其他的实施方案，或W不同的方式进行或 执行。并且，应当理解本文使用措辞和术语是用于描述性目的，并且不应当被认为是限制性 的。
[0081 ] JNK和p38是促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的成员。哺乳动物中，存在Ξ种JNK 同种型(JNK1-3)和四种p38同种型(ρ38α-δ)，其调控多个细胞过程，其主要包括应激反应。
[0082] 本发明人研究了JNK1/2和ρ38α/β的刺激核转位，并发现在应激和促有丝分裂刺 激后全部四种均迅速转位至细胞核中。本发明人获得的实验结果表明JNK1/2和ρ38α/β各 自通过不依赖活化的机制从其细胞质错定上释放。其允许活化的或不活化的ΜΑΡΚ与Imp7或 Imp9结合，然后结合到Imp3。随后Imp3/lmp7或Imp3/Imp9二聚体护送连接的MAPK至核膜， 在核膜初保留了 Imp3，而Imp7/9进一步穿过核孔。很可能MAPK/lmp复合体随后通过GTP-Ran 解离，所述GTP-Ran在细胞核中使MPK游离。
[0083] 本发明人接着试图鉴定JNK和p38中介导与Imp7和Imp9相互作用的位点，并且显示 了位于ρ38α的第20位-第30位残基中的重要序列（图14A-C)。
[0084] 当减少执行本发明时，本发明人合成了基于ρ38α的第21位-第34位残基序列的14 个氨基酸肉豆違酷化的肤，并且显示当其在刺激前应用于化La细胞时，其阻止了核转位（图 4A)，W及测试的MAPK的Imp7/9的相互作用（图4B)。
[0085] 因为本发明的肤能够特异地抑制JNK1/2和P38 α/β的核活性，而不调节其细胞质 活动，运些肤可W用于在细胞中抑制JNK1/2和Ρ38 α/β的核活动(例如，细胞调亡活性，炎症 活性），而不损害其他的JNK1/2和Ρ38 α/β相关的细胞质活性。因此，本发明的该方面的肤 可W用作炎症和细胞调亡相关疾病的治疗剂，而没有其他JNK1/2和Ρ38 α/β的抑制剂的副 作用。
[0086] 因此，根据本发明的一个方面，在此提供了经分离的肤，其包含与SEQ ID NO: 1所 示的序列至少80%同源的氨基酸序列，所述经分离的肤包含核祀向活性，所述肤不多于20个 氨基酸。
[0087] 根据另一个实施方案，所述肤包含与SEQ ID NO: 2所示的序列至少80%同源的氨 基酸序列，其包含核祀向活性，且不多于20个氨基酸。
[0088] 根据另一个实施方案，所述肤包含与SEQ ID NO: 3所示的序列至少80%同源的氨 基酸序列，其包含核祀向活性，且不多于20个氨基酸。
[0089] 根据另一个实施方案，所述肤包含与SEQ ID NO: 4所示的序列至少80%同源的氨 基酸序列，其包含核祀向活性，且不多于20个氨基酸。
[0090] 根据另一个实施方案，所述肤包含与SEQ ID NO: 5所示的序列至少80%同源的氨 基酸序列，其包含核祀向活性，且不多于20个氨基酸。
[0091] 根据另一个实施方案，所述肤包含与SEQ ID NO: 6所示的序列至少80%同源的氨 基酸序列，其包含核祀向活性，且不多于20个氨基酸。
[0092] 根据另一个实施方案，所述肤包含与SEQ ID NO: 7所示的序列至少80%同源的氨 基酸序列，其包含核祀向活性，且不多于20个氨基酸。
[0093] 根据另一个实施方案，所述肤包含与SEQ ID NO: 8所示的序列至少80%同源的氨 基酸序列，其包含核祀向活性，且不多于20个氨基酸。
[0094] 因此，根据本发明的一方面，在此提供了经分离的肤，其包含与SEQ ID NO: 1所示 的序列至少80%同源的氨基酸序列，所述经分离的肤能够防止经分离的肤能够防止Ρ38α核 转位，所述肤不多于20个氨基酸。
[0095] 根据另一个实施方案，所述肤包含与SEQ ID NO: 2所示的序列至少80%同源的氨 基酸序列，其能够防止所述经分离的肤能够防止Ρ38α核转位，所述肤不多于20个氨基酸。
[0096] 根据另一个实施方案，所述肤包含与SEQ ID NO: 3所示的序列至少80%同源的氨 基酸序列，其能够防止所述经分离的肤能够防止Ρ38α核转位，所述肤不多于20个氨基酸。
[0097] 根据另一个实施方案，所述肤包含与SEQ ID NO: 4所示的序列至少80%同源的氨 基酸序列，其能够防止所述经分离的肤能够防止Ρ38α核转位，所述肤不多于20个氨基酸。
[0098] 根据另一个实施方案，所述肤包含与SEQ ID NO: 5所示的序列至少80%同源的氨 基酸序列，其能够防止所述经分离的肤能够防止Ρ38α核转位，所述肤不多于20个氨基酸。
[0099] 根据另一个实施方案，所述肤包含与SEQ ID NO: 6所示的序列至少80%同源的氨 基酸序列，其能够防止所述经分离的肤能够防止Ρ38α核转位，所述肤不多于20个氨基酸。
[0100] 根据另一个实施方案，所述肤包含与SEQ ID NO: 7所示的序列至少80%同源的氨 基酸序列，其能够防止所述经分离的肤能够防止Ρ38α核转位，所述肤不多于20个氨基酸。
[0101] 根据另一个实施方案，所述肤包含与SEQ ID NO: 8所示的序列至少80%同源的氨 基酸序列，其能够防止所述经分离的肤能够防止Ρ38α核转位，所述肤不多于20个氨基酸。
[0102] 如提及的，根据本发明的该方面的肤优选地不多于20个氨基酸。
[0103] 根据一个特别的实施方案，肤长度为19个氨基酸。
[0104] 根据一个特别的实施方案，肤长度为18个氨基酸。
[0105] 根据一个特别的实施方案，肤长度为17个氨基酸。
[0106] 根据一个特别的实施方案，肤长度为16个氨基酸。
[0107] 根据一个特别的实施方案，肤长度为15个氨基酸。
[0108] 根据一个特别的实施方案，肤长度为14个氨基酸。
[0109] 根据一个特别的实施方案，肤长度为13个氨基酸。
[0110] 根据一个特别的实施方案，肤长度为12个氨基酸。
[0111] 根据一个特别的实施方案，肤长度为11个氨基酸。
[0112] 根据一个特别的实施方案，肤长度为10个氨基酸。
[0113] 更优选地本发明的肤的氨基酸序列与SEQ ID NOs: 1、2、3、4、5、6、7或8的同源性 为81%、更优选地为82%、更优选地为83%、更优选地为84%、更优选地为85%、更优选地为86%、 更优选地为87%、更优选地为88%、更优选地为89%、更优选地为90%、更优选地为91%、更优选 地为92%、更优选地为93%、更优选地为94%、更优选地为95%、更优选地为96%、更优选地为 97%、更优选地为98%、更优选地为99%、最优选地为100%。
[0114] 根据一个实施方案，本发明的肤具有与SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7或8所示序列 同一的氨基酸序列。
[0115] 根据还另一个实施方案，本发明的肤由SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7或8所示的氨 基酸序列组成。
[0116] 样品多肤与参考多肤的同源性或同一性百分比，例如本发明的核祀向肤与具有 SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7或8所示的氨基酸序列的多肤的同源性或同一性的百分比，可 W通过多种方法中任一的进行确定。优选地，多肤之间的同源性或同一性百分比使用NCBI 的标准蛋白质-蛋白质BLAST[blastp]软件来确定。
[0117] 本发明人预期本文公开的肤的氨基酸序列可W被保守地或非保守地取代。
[0118] 本文使用的术语"保守取代"，指的是将存在于肤中天然序列的氨基酸替换为天然 的或非天然存在的氨基酸或具有相似空间特性的模拟肤。当将天然氨基酸的侧链替换为极 性的或疏水的，保守取代应当使用天然存在的氨基酸、非天然存在的氨基酸或模拟肤部分 (其也是极性或疏水的）（另外其具有如置换的氨基酸的侧链的相同的空间特性）。
[0119] 天然存在的氨基酸通常根据他们的特性进行分组，由天然存在的氨基酸的保守取 代可W容易地根据牢记的事实来确定，根据本发明的带电荷的氨基酸被空间相似的不带电 荷的氨基酸取代被认为是保守取代。
[0120] 对于产生非天然存在的氨基酸的保守取代，还可能使用本领域熟知的氨基酸类似 物(合成氨基酸）。天然存在的氨基酸的模拟肤在技术人员已知的文献中详细记载。
[0121] 当进行保守取代时，取代的氨基酸在侧链上应当具有与原氨基酸相同或相似的官 能团。
[0122] 本文使用的短语"非保守取代"指的是将亲本序列中存在的氨基酸取代为另一个 天然或非天然存在的氨基酸，其具有不同的电化学和/或空间特性。因此，取代的氨基酸的 侧链可W显著地比被取代的天然氨基酸的侧链更大(或更小)和/或可W具有与被取代的氨 基酸显著不同电子特性的官能团。运类的非保守取代的例子包括将苯丙氨酸或环己基甲基 甘氨酸取代为丙氨酸、将异亮氨酸取代为甘氨酸，或将-NH-CH[(-CH2)5-C00H]-C0-取代为 天冬氨酸。落入本发明范围内的那些非保守取代是那些仍构成具有抗细菌特性的肤的那些 取代。
[0123] 本文使用的短语"核祀向活性"指的是肤增加其核:细胞质定位比率，或其连接的 剂至少10%、更优选地至少20%和甚至更优选地至少30%、50%、80%或更多的能力。
[0124] 核祀向活性可W通过直接或间接方法检测：当使用巧光染料(标记试剂盒是商业 上可W获得的，例如从Pierce或Molecular Probes)标记核祀向肤时，可W通过巧光或共聚 焦激光扫描显微镜的直接观察。如果所述核祀向肤使用电子密度材料如胶体金标记，核祀 向活性还可W通过电子显微镜来评价（〇live;r，Methods Mol. Biol. 115 (1999)，341- 345) 。
[0125] 可W理解如果核祀向肤与异源剂(例如多核巧酸)连接，则可W通过观察异源剂的 位置来检测活性。
[0126] 如果连接的分子(例如核酸)在细胞核内发挥功能，可间接方式评价核祀向活 性。该功能可W是，例如，由连接的核酸编码的基因的表达，其包括运样的基因表达的结果， 其可W在其他细胞分子或过程中发挥。
[0127] 本文使用的术语"肤"或"多肤"指的是天然或合成氨基酸的聚合物，其包括天然肤 (降解产物，综合地合成多肤或者重组多肤)和模拟肤(通常地，综合地合成肤），W及类肤和 半肤，其是多肤的类似物，其可W具有，例如，使所述肤在体内甚至更稳定或更能够穿透细 胞的修饰。因此，本发明预期了例如对肤的肉豆違酷化。优选地肉豆違酷化发生在N末端残 基。肉豆違酷化是不可逆的蛋白质脂化修饰，其中衍生自肉豆違酸的肉豆違酷基团通过酷 胺键共价连接至N-末端残基的α-氨基上。通过本发明预期肉豆違酷化的肤的例子包括SEQ ID NO: 9-16。
[0128] 运样的修饰包括，但不限于N末端修饰、C末端修饰、多肤键修饰，其包括，但不限于 CH2-NH、CH2-S、CH2-S=0、0=C-NH、CH2-0、CH2-CH2、S=C-NH、CH=CH 或 CF=CH、主链修饰和残疾 修饰。制备模拟肤化合物的方法是本领域熟知的，并且在例如如ant;Uative Drug Design， C.A. Ramsden Gd.，Qiapter 17.2，F. Qioplin 化rgamon Press (1992)中说明，其在此W 充分引用并入本文。下文中提供该方面的进一步细节。
[0129] 可W取代多肤中的多肤键(-C0-NH-)，例如，通过N-甲基化键(-N(C册)-C0-)、醋键 (-C(R化-C-0-0-C(R)-N-)、酬基亚甲基键(-C0-CH2-)、α-氮杂键(-NH-N(R)-C0-)，其中R是 任何烷基、例如，甲基胺基（-CH2-NH-)、径基乙締键(-CH(0H)-CH2-)、硫代酷胺键（-CS- 畑-)、締双键(-CH=CH-)、酷胺键(retro amide bond) (-NH-C0-)、多肤衍生物（-N(R)-CH2- C0-)，其中R是"正常"侧链，天然存在于C原子上。
[0130] 运些修饰可W发生在多肤链的任何键上，并甚至同时在若干处(2-3)发生。
[0131] 天然芳香族氨基酸，Trp，、Tyr和Phe可W被取代为合成的非天然氨基酸例如，苯 基甘氨酸，TIC，糞基丙氨酸(Nol)，Phe的环甲基化衍生物，Phe或0-甲基-Tyr的面化衍生 物。
[0132] 除了上文所述，本发明的多肤还可W包括一个或多个经修饰的氨基酸或一个或多 个非氨基酸单体(例如，脂肪酸，复合碳水化合物等）。
[0133] 本文说明书和下文权利要求部分使用的术语"氨基酸"应理解为包括20个天然存 在的氨基酸;那些氨基酸在体内经常进行翻译后修饰，包括，例如，径脯氨酸、憐酸丝氨酸和 憐酸苏氨酸;和其他的不常见的氨基酸，其包括但不限于，2 -氨基已二酸、径基赖氨酸、异 锁链赖氨酸、正鄉氨酸、正亮氨酸和鸟氨酸。此外，术语"氨基酸"包括D -和L -氨基酸(立体 异构体)两者。
[0134] 表1和表2在下文列出了本发明可W使用的天然存在的氨基酸(表1)和非保守的或 经修饰的氨基酸(表2)。
[0135] 表 1
[0137] 本发明的肤可W包括在细胞中调节其分泌的前导序列。示例性的前导序列可W包 括TAT前导序列。
[0138] 本发明的肤的N和C末端可W通过官能团保护。合适的官能团在Green和Wilts的" Protecting Groups in Organic Synthesis"，John Wiley 和 Sons，Chapters 5 和7， 1991中描述，其教导在此通过引用并入本文。优选的保护基团是能够促进连接于其上的化 合物运输至细胞中的那些，例如，通过减少化合物的亲水性和增加其亲油性。
[0139] 运些部分可W在体内在细胞内通过水解或酶促裂开。径基保护基团包括醋、碳酸 盐和氨基甲酸醋保护基团。胺保护基包括烷氧基和芳氧基幾基，如上所述用于N末端保护基 团。簇酸保护基包括脂肪族的、苄基的和芳基醋，如上所述用于C末端保护基团。在一个实施 方案中，本发明的肤的一个或多个谷氨酸或天冬氨酸残基侧链的簇酸基团是受保护的，其 优选使用甲基，乙基，苄基或取代的苯甲基醋。
[0140] N末端保护基团的例子包括酷基（-C0-R1)和烷氧基幾基或芳氧基幾基，其中R1 是脂肪族的、取代的脂肪族的、苄基、取代的苄基，芳香族的或取代的芳香族基团。酷基的特 定例子包括乙酷基，（乙基)-C0-、正丙基-C0-、异丙基-C0-、正下基-C0-、仲下基-C0-、叔下 基-C0-、己基、十二烧酷、十六烧酷、肉豆違酷、硬脂酷、油酷基苯基-C0 -、取代的苯基-C0 -、苄基-C0-和(取代的苄基）-C0 -。烷氧基幾基和芳氧基幾基的例子包括CH3-0-C0 -、 (乙基)-〇-CO -、正丙基-0-C0 -、异丙基〇-C〇-、正下基-〇-C〇-、仲下基-〇-C〇-、叔下基- 0-C0-、苯基0-C0-、取代苯基0-C0-和苄基0-C0-、（取代苄基)-0-C0-。金刚烧、糞、tuluen、联 苯、肉桂酷、硝基苯甲酯，甲苯酷、慷酷、苯甲酯基、环己烧降茨烧、Z-己酸。为了促进N酷化， 在分子的N-末端可W存在1-4个甘氨酸残基。
[0141] 化合物的C末端的簇基可W被保护，例如，通过酷胺（即C末端径基替换为-NH 2，- NHR2和-NR2R3)或醋（即C末端的径基替换为-0R2)dR2和R3是独立的脂肪族、取代的脂肪 族、苄基、取代的苄基、芳基或取代的芳基。此外，与氮原子一起，与来自约0-2个另外的杂原 子如氮，氧或硫一起R2和R3可W形成C4到C8的杂环。合适的杂环的例子包括赃晚基，化咯烧 基、吗嘟基、硫代吗嘟基或赃嗦基。C末端保护基团的例子包括-N肥、-NHC册、-N (C册）2、-NH (乙基）、-N(乙基2、-N(甲基）（乙基）、-NH(苄基）、-N(Cl-C4烷基）（苄基）、-NH(苯基）、-N (C1-C4烷基）（苯基）、-〇CH3、-〇-(乙基）、-〇-(正丙基）、-〇-(正下基）、-〇-(异-丙基）、-〇- (仲下基）、-0-(叔下基）、-0-苄基和-0-苯基。
[0142] 本发明的肤还可W包含非氨基酸部分，例如，连接于肤上的疏水部分（各种线性 的、枝化的、环状的、多环的或杂环碳氨化合物和碳氨化合物衍生物）；各种保护基团，特别 是线性的化合物，其连接于化合物的末端W减少降解。化合物中存在的化学(非氨基酸)基 团可W为了改善各种生理特性;减少降解或清除;减少各种细胞累的排斥、改善免疫原性活 性、改善各种施用模式(如各种序列的连接，所述连接允许穿过各种屏障、内脏等）；增加特 异性、提高亲合性、减少毒性等而包括。
[0143] 根据本发明的一个实施方案，本发明的肤连接于持续释放增强剂。示例性的持续 释放增强剂包括，但不限于透明质酸(HA)、藻酸(AA)、聚径乙基异下締酸(Poly-肥MA)、聚乙 二醇(PEG)、甘醇二甲酸和聚异丙締酷胺。
[0144] 本发明的肤的氨基酸序列元件与其他非氨基酸试剂的连接可W通过共价连接、通 过非共价进行，例如，通过复合至疏水聚合物，其可W降解或裂解，产生能够持续释放的化 合物;通过在脂质体或胶粒上捕获肤的氨基酸部分来产生本发明的最终肤。连接可W通过 在另一个元件(脂质体，胶粒）中捕获氨基酸序列或在聚合物中渗入氨基酸序列从而产生本 发明的最终肤。
[0145] 本发明的化合物可W是线性的或环状的（成环作用可W改善稳定性）。成环作用可 W通过本领域已知的任何方法发生。当化合物主要由氨基酸构成时，成环作用可W通过N- 至C-末端，、N末端至侧链和N末端至主链、C末端至侧链、C末端至主链、侧链至主链和侧链至 侧链，W及主链至主链来成环。肤的成环作用也可W通过肤中包含的非氨基酸有机部分来 发生。
[0146] 本发明的肤可W是生物化学合成的，例如通过使用标准固相技术。运些方法包括 专一固相合成、部分固相合成方法、片段冷凝、经典溶液合成。当肤相对短（即10 kDa)和/或 不能通过重组技术生产（即，不通过核酸序列编码）时优选使用运些方法，并因此设及不同 的化学作用。
[0147] 固相多肤合成程序是本领域熟知的，并通过John Morrow Stewart和化nis Dillaha Young,Solid Phase Polypeptide Syntheses (2nd Ed.,Pierce Chemical Company，1984)进一步描述。
[0148] 合成肤可W通过制备的高效液相层析[Creighton Τ. (1983) Proteins, structures and molecular principles. WH Freeman and Co. N.Y.]纯 化，并且可通过 氨基酸测序来证实其组合物。
[0149] 重组体技术也可W用于生产本发明的肤和/或多肤。当肤连接于异源蛋白质（即融 合蛋白质）时，运些技术可W是优选的，因为重组技术更适合用于生产相对长的多肤(例如， 长于20个氨基酸）和对其大量生产。运样的重组技术在Bitter等人，（1987) Methods in Enzymol. 153:516-544，Sl:udie;r等人（1990) Methods in Enzymol. 185:6〇-89，&risson 等（1984)化Uire 310:511-514，Takamatsu等人（1987) EMBO J. 6:307-311，Coruzzi等人 (1984) EMBO J. 3:1671-1680 和化ogli等人，（1984) Science 224:838-843，Gurley等 人（1986) Mol. Cell. Biol. 6:559-565和 Weissbach & Weissbach，1988，Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，NY，Section ν?ΙΙ,ρρ 421-463中描述。在下 文中提供异源蛋白质的例子。
[0150] 为生产本发明的肤和/或多肤，其使用重组技术，将本发明的编码核祀向肤的多核 巧酸连接至核酸表达载体，所述载体包含位于顺式调节序列（例如，启动子序列)转录控制 下的多核巧酸序列，所述顺式调节序列适合在宿主细胞中指导本发明的多肤的组成的、组 织特异性的或可诱导的转录。
[0151] 短语"经分离的多核巧酸"指的是单链或双链核酸序列，其是经分离的，并且WRNA 序列形式、互补多核巧酸序列（cDNA)形式、基因组多核巧酸序列形式和/或复合多核巧酸 序列(例如，W上的组合)形式提供。
[0152] 本文使用的短语"互补多核巧酸序列"指的是一种序列，其使用反转录酶或任何其 他RNA依赖的DNA聚合酶由信使RNA反转录产生。运样的序列可W随后在体内或体外使用DNA 依赖的DNA聚合酶扩增。
[0153] 本文使用的短语"基因组多核巧酸序列"指的是衍生自（分离)染色体的序列，并因 此其代表染色体的连续部分。
[0154] 本文使用的短语"复合多核巧酸序列"指的是一种序列，其至少部分是互补的，并 至少部分是基因组。复合序列可W包括一些编码本发明的多肤所需的外显子序列，W及渗 入其间的内含子序列。内含子序列可W是任何来源，包括其他基因，通常包括保守的剪接信 号序列。运样的内含子序列可W进一步包括顺式作用表达调控元件。
[0155] 如上文提及的，本发明的多核巧酸序列插入至表达载体中（即，核酸构建体）W能 够表达重组肤。本发明的表达载体可W包括另外的序列，所述序列使得该载体适合在原核 生物、真核生物或优选在两者中（例如，穿梭载体)复制和整合。通常的克隆载体含有转录和 翻译起始序列（例如，启动子、增强子)和转录和翻译终止子(例如，多腺巧酸化信号）。可w 理解表达载体还可W包含编码其他多肤的多核巧酸序列，所述多肤转录地连接至本发明的 核祀向肤。运样的多肤在下文中进一步描述。
[0156] 多种原核或真核细胞可W用作宿主表达系统W表达本发明的肤。运些包括，但不 限于，微生物，使用例如具有含有多肤编码序列的重组隧菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达 载体转化的细菌;使用含有多肤编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母;使用包含多肤 编码序列的重组病毒表达载体(例如，花挪菜花叶病毒，CaMV;烟草花叶病毒，TMV)感染或使 用重组质粒表达载体，例如Ti质粒转化的植物细胞系统。
[0157] 可W理解本发明的多核巧酸还可W在受试者中直接表达（即，体内基因治疗)或可 W在体外在细胞系统中表达（自体的或非自体的），并随后施用于受试者。基因治疗技术在 下文中进一步描述。
[0158] 除了含有转录和翻译插入编码序列(编码所述多肤)所需的元件外，本发明的表达 构建体还可W包括经工程改造的序列，W优化表达的肤的稳定性、生产、纯化、产量或活性。
[0159] 可W使用多种方法将本发明的表达载体引入宿主细胞系统。运些方法通常在 Sambrook等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Springs Harbor Laboratory,New York (1989,1992)，Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology , John Wiley and Sons ,Baltimore ,Md . (1989),Chang 等人，Somatic Gene Therapy，CRC Press，Ann Arbor'Mich. (1995)，Vega 等人，Gene Targeting，CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995)，Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses,Butte;rwo;rths，Boston Mass. (1988)和Gi化oa 等人[Biotechniques 4 (6): 504-512,1986]中描述，并且包括，例如，稳定或瞬时转染、脂质转染、电穿孔和用重 组病毒载体感染。另外，正负选择法参见美国专利号5，464，764和5，487，992。
[0160] 在有效条件下培养转化的细胞，所述条件允许重组多肤大量表达。有效的条件包 括，但不限于，允许蛋白质生产的有效培养基、生物反应器、溫度、pH和氧条件。有效培养基 指的是可W培养生产本发明的重组多肤的任何培养基。运样的培养基通常包括含有可吸收 的碳源、氮源和憐酸源，和合适的盐类、矿物质、金属和其他营养物，如维生素的水溶液。本 发明的细胞可W在常规的发酵生物反应器、摇瓶、试管、微量滴定盘和陪替氏平皿中培养。 培养可W在适于重组细胞的溫度、pH和氧含量条件下进行。运样的培养条件在本领域技术 人员的知识中。
[0161] 依赖于生产所需的载体和宿主系统，本发明的生成肤和/或多肤可W保留在重组 细胞中、分泌至发酵介质中、分泌至两个细胞膜的间隙中，例如大肠杆菌(E. coin的周质 间隙;或保留在细胞或病毒膜的外表面上。
[0162] 随培养预定的时间，对重组肤和/或多肤进行回收。
[0163] 本文使用的短语"回收重组多肤"指的是收集含有多肤的全部发酵培养基，且不需 要暗示另外的分离或纯化步骤。
[0164] 因此，本发明的肤和/或多肤可W使用多种标准蛋白质纯化技术进行纯化，例如， 但不限于亲和层析、离子交换层析、过滤、电泳、疏水相互作用层析、凝胶过滤层析、反相层 析、伴刀豆球蛋白A层析、层析聚焦和差异溶解作用。
[0165] 为了促进回收，表达的编码序列可W经工程改造 W编码本发明的肤，并融合可切 割部分。可w设计运样的融合蛋白质而使得多肤可w容易地通过亲和层析分离;例如，通过 固定在对可切割部分特异的柱上。当切割位点在多肤和可切割部分之间进行工程改造时， 多肤可W用能够特异性地在该位置切割融合蛋白质的合适的酶或剂处理后从层析柱释放 (例如，参见 Booth 等人，Immunol. Lett. 19:65-70 (1988);和Gardella 等人，J. Biol. Chem. 265:15854-15859 (1990))。
[0166] 本发明的肤和/或多肤优选W"基本纯净的"形式回收。
[0167] 本文使用的短语"基本纯净的"指的是允许在本文描述的应用中使蛋白质可W有 效发挥作用的纯度。
[0168] 除了在宿主细胞中合成，本发明的肤和/或多肤还可W使用体外表达系统合成。运 些方法是本领域熟知的，并且系统的各组分是商业上可W获得的。
[0169] 如上文提及的，还可W直接对受试者使用本发明的多核巧酸，其中所述多核巧酸 在祀细胞翻译，即基因治疗。
[0170] 本文使用的基因治疗指的是将目的遗传物质（例如DNA或RNA)转移至宿主W治疗 或防止遗传性或后天性疾病或病症或表现型。目的遗传物质编码期望在体内产生的产物 (例如蛋白质、多肤、肤、功能RNA、反义）。例如，目的遗传物质可W编码治疗价值的激素、受 体、酶、多肤或肤。综述一般参见"Gene Therapy" (Advanced in Pharmacology 40， Academic Press,1997)的文本。
[0171] 已经发展了基因治疗的两种基本方法：（1)先体外后体内的和(2)在体内的基因治 疗。将先体外后体内的基因治疗细胞中从患者体内移除，并在体外培养治疗。通常，通过合 适的基因送递载体/方法(转染、转导、同源重组等)和按需要的表达系统，将功能置换基因 引入细胞中，并随后将经修饰的细胞在培养基中增殖，然后返回宿主/患者。运些遗传重植 细胞在原位置已经显示了表达转染的遗传物质。细胞可W是受试者自体的或非自体的细 胞。因为当施用给身体时，非自体细胞可W诱导免疫反应，已经开发了几种方法来降低对非 自体细胞排斥的可能性。运些方法包括在移植前抑制接受者免疫系统或将非自体细胞封装 入免疫隔离的半透膜内。
[0172] 体内基因治疗中，祀细胞不是从受试者中取出，而是将遗传物质转移至接受者机 体原位的细胞中（在接受者体内）。在一个可选的实施方案中，如果宿主基因是有缺陷的，贝U 基因可W在原位修复（Culver, 1998.(抗体stract) Antisense DNA & RNA based therapeutics,February 1998，Coronado，CA)。
[0173] 运些遗传改变的细胞已经显示在原位表达转染的遗传物质。
[0174] 为了给予特异性，优选地使用于表达本发明的肤和/或多肤的核酸构建体包含细 胞特异性启动子序列元件，例如癌症特异性启动子(例如生存素启动子-化en等人，Cancer Gene Therapy,2004'Volume 11'Number 11，Pages 740-747)。
[0175] 对于基因治疗，核酸通常通过与病毒剂转染引入到细胞中。运是由于他们的感染 特性可W获得更高的效率。此外，病毒是非常特异性的，并通常在特定细胞类型中感染和繁 殖。因此，他们的天然特异性可W用于在体内或在组织内或细胞混合培养物内祀向载体至 特定细胞类型。病毒载体还可W用特异性受体或配体修饰W通过受体介导的事件改变祀向 特异性。
[0176] 另外，重组病毒载体可用于体内表达期望的核酸，因为他们提供了例如横向感染 和祀向特异性的优点。横向感染是例如反转录病毒等的生存周期中固有的，并且是一种单 个受感染细胞生产许多出芽和感染相邻细胞的后代病毒颗粒的过程。结果是大区域迅速感 染，其中大多数都不是由原始病毒粒子感染的。该情况与垂直型感染相反，垂直型感染中传 染物的传播仅通过子代后代。还可W生产没有能力横向传播的病毒载体。如果所需的目的 是将特异性基因仅引入局部数量的祀细胞，可W使用该特征。
[0177] 本发明的核祀向肤可W用来在宿主细胞中调节内源性和外源性多肤的核转位，其 包括分裂的（例如细胞系）和非分裂的细胞(例如初级细胞)和真核细胞例如哺乳动物细胞 和酵母细胞中。
[0178] 例如，本发明人已经显示本发明的核祀向肤自发地表现并与内源信号竞争，所述 内源信号例如那些包含在C-化η N末端激酶(JNK1/2)和p38促分裂原活化蛋白激酶α/e (P38 α/β)中。运导致了所述内源信号的核转位的下调。
[0179] 因为本发明的肤能够特异地抑制JNK1/2和Ρ38 α/β的细胞核内活性而不调节他 们的细胞质内活性，运些肤可W用于在细胞中抑制JNKl/^2和Ρ38 〇/0的核活性(例如，细胞 调亡活性，炎症活性），而不损害其他的JNK1/2和Ρ38 α/β相关的细胞质活性。因此，本发明 的该方面的肤可W提供针对炎症和细胞调亡相关疾病的治疗剂，而不具有其他JNK1/2和 Ρ38 α/β抑制剂的副作用。
[0180] 因此，根据本发明的另一个方面，在此提供了在受试者中治疗炎性病症或免疫病 症症的方法，所述方法包括对受试者施用治疗有效量的经分离的肤，从而治疗炎性疾病或 免疫疾病。
[0181] 本文使用的，术语"受试者"指的是哺乳动物受试者，优选地是人。
[0182] 许多设及炎症应答的疾病和症状，可W通过上述的方法来治疗。运些疾病和症状 在下文中进行总结。
[0183] 炎性疾病-包括，但不限于，慢性炎性疾病和急性炎性疾病。
[0184] 超敏反应相关炎性疾病 超敏反应的例子包括，但不限于，I型超敏反应、Π 型超敏反应，III型超敏反应，IV型超 敏反应、速发型超敏反应、抗体介导超敏反应、免疫复合体介导超敏反应、Τ淋己细胞介导的 超敏反应和DTH。
[018引I型或速发型超敏反应，例如哮喘。
[0186] II型超敏反应包括，但不限于，类风湿性疾病、类风湿自身免疫疾病、类风湿性关 节炎化renn V等人，Histol Histopathol 2000 Jul;15 (3):791)、脊椎炎、强直脊椎炎 (Jan Voswinkel等人，Adhritis Res 2001; 3 (3): 189)、系统性疾病、系统性自身免疫 疾病、系统性红斑狼疮化rikson J.等人，Immunol Res 1998; 17 (1-2) :49)、硬化症、系统 性硬化（Renaudineau Y.等人，Clin Dia即 Lab Immunol. 1999 Ma;r;6 (2):156);化an ΟΤ.等人，Immunol Rev 1999 Jun;169:107)、腺疾病、腺自身免疫疾病、膜腺自身免疫疾 病、糖尿病、I型糖尿病（Zimmet P. Diabetes Res Clin Pract 1996 0ct;34 S叫pi: S125)、甲状腺病、自发性自身免疫甲状腺病、格雷夫斯氏病（Orgiazzi J. Endocrinol Metab Clin North Am 2000化n;29 (2):339),甲状腺炎自发的自身免疫甲状腺炎 (化aky-Mullen Η. and 化 S，J Immunol 2000 Dec 15; 165 (12):7262),桥本氏甲状腺 炎(ToyodaN.等人，NipponRinshol999 Aug;57(8):1810)、粘液水肿、自发粘液性水肿 (]?113皿曰1'.化口口〇11化邮}1〇.1999 411邑;57 (8):1759)、自身免疫再生疾病、卵巢疾病、卵 巢自身免疫(Garza KM.等人，J Reprod Immunol 1998 Feb;37 (2) :87)、自身免疫抗精液 不育（Diekman AB.等人，Am J Reprod Immunol. 2000 Mar; 43 (3):1:34)、重复性流产 (Tincani A.等人，Lupus 1998;7 Suppl 2:S107-9)、神经变性的疾病、神经疾病、神经自 身免疫疾病、多发性硬化（Cross AH.等人，J 化uroimmunol 2001 Jan 1;112 (1-2):1)、 阿尔茨海默氏病（Oron L.等人，J Neural Transm S叫pi. 1997;49:77)、重症肌无力 (Infante AJ. And Kraig E，Int Rev Immunol 1999;18 (1-2):83)、原动神经病 化ornberg AJ. J Clin Neurosci. 2000 May;7 (3):191)、急性感染性多发性神经炎，神 经病和自身免疫神经病化usunoki S. Am J Med Sci. 2000 Apr;319 (4):234)、重症肌无 力疾病、Lambe;rt-Eaton类重症肌无力综合征（Takamori Μ. Am J Med Sci. 2000 Ap;r;319 (4) :204)、附肿瘤性神经病疾病、小脑的萎缩、附肿瘤性小脑的萎缩、非附肿瘤性僵硬人综 合症、小脑的萎缩、渐进小脑萎缩脑炎、Rasmussen's脑炎、肌萎缩性侧索硬化、Sydeham舞 蹈病、Gilles de la Tourette综合症、多内分泌腺疾病、自身免疫多内分泌腺疾病 (Antoine JC. and Honnorat J. Rev 化urol (Paris) 2000 Jan; 156 (1):23);神经病、 免疫异常神经病（Nobile-Orazio E.等人，Electroence地alogr Clin Neurophysiol Suppl 1999;50:419);神经性肌强直、获得性神经性肌强直、关节弯曲多重凹陷（Vincent A.等人，Ann N Y Acad Sci. 1998 May 13;841:482)、屯、血管疾病、屯、血管自身免疫疾病、 动脉粥样硬化（Matsuura E.等人，Lupus. 1998;7 Suppl 2:S135)、屯、肌梗死（Vaarala 0. L叫us. 1998;7 Suppl 2:S132)、血栓（Tincani A.等人，L叫us 1998;7 S叫pi 2: S107-9)、肉芽肿病、眶坏死性肉芽肿病、动脉炎、Takayasu氏动脉炎和川崎综合症 (Praprotnik S.等人，Wien Klin Wochenschr 2000 Aug 25; 112 (15-16) :660);抗凝血 因子自身免疫病(Xacroix-Desmazes S.等人，Semin Thromb Hemost.2000;26 (2):157): 血管炎，引起坏死的小型血管炎、显微多血管炎、化urg和Strauss综合症、肾小球性肾炎、少 免疫的焦点的坏死血管球性肾炎肾小球肾炎、新月形的血管球性肾炎（Noel LH. Ann Med Interne (Paris). 2000 May; 151 (3):178):抗憐脂综合症（Flamholz R.等人，J Clin Apheresis 1999; 14 (4) :171);屯、力衰竭、类兴奋剂β-肾上腺素能受体抗体屯、脏衰竭 Wallukat G.等人，Am J Cardiol. 1999 化η 17;83 (12Α):75Η)、血小板减少性紫齋 (Moccia F. Ann Ital Med Int. 1999 Apr-Jun;14 (2):114);溶血性贫血、自身免疫性 溶血性贫血化fremov DG.等人，Leuk Lymphoma 1998化n;28 (3-4):285)、胃肠疾病、胃 肠道自身免疫疾病、肠疾病、慢性炎症肠道病（Garcia Herola A.等人，Gastroenterol 胎patol. 2000 Jan;23 (1):16)、脂泻病化andau YE. and Shoenfeld Υ. Harefuah 2000 Jan 16; 138 (2) :122)、肌肉系统自身免疫疾病、肌炎、自身免疫肌炎、Sjogren ' s综 合症(Feist E.等人，Int Arch Alle巧y Immunol 2000 S邱；123 (1):92);平滑肌自身免 疫病（Zauli D.等人，Biomed Pharmaco化er 1999 化n;53 (5-6):234)、肝脏疾病、肝自身 免疫疾病、自身免疫肝炎(Manns MP. J胎patol 2000 Aug;33 (2):326)和夏科氏肝硬变 (Strassburg CP.等人，Eur J Gastroenterol Hepatol. 1999 Jun; 11 (6) :595)。
[0187] IV型或Τ细胞介导的超敏反应，包括但不限于，类风湿性疾病、类风湿性关节炎 (TischR，McDevitt册.Proc化tlAcadSciUSA 1994 Janl8;91 (2):437)、系统性 疾病、全身自身免疫疾病、系统性红斑狼疮(Datta SK.，Lupus 1998;7 (9):591),腺疾病、 腺自身免疫疾病、膜腺疾病、膜腺自身免疫疾病、1型糖尿病(Castano L. and Eisenbadh GS. Ann. Rev. Immunol. 8:647);甲状腺病、自身免疫甲状腺病、格雷夫斯氏病（Sakata S.等人，Mol Cell Endocrinol 1993 Mar ;92 (1):77);卵巢疾病（Garza KM.等人，J Reprod Immunol 1998 Feb; 37 (2) :87)，前列腺炎、自身免疫前列腺炎(Alexander RB.等 人，Urology 1997 Dec;50 (6) :893)、多腺综合症、自身免疫多腺综合症、I型自身免疫多腺 综合症化ara T.等人，Blood. 1991 Mar 1; 77巧）：1127)、神经疾病、自身免疫神经疾病、 多发性硬化、神经炎、视神经炎（Soderstrom M.等人，J Neurol Neu;rosu;rg Psychiatry 1994 May;57 (5) :544)、重症肌无力（Oshima Μ.等人，Eur J Immunol 1990 Dec;20 (12):2563)、全身肌强直综合征化iemstra HS.等人，Proc 化tl Acad Sci U S A 2001 Mar 27;98 (7):3988)、屯、血管疾病、Chagas'病的屯、脏自身免疫（Cunha-Neto E.等人，J Clin Invest 1996 Oct 15; 98 (8) :1709)、自身免疫性血小板减少性紫齋（Semple JW. 等人，Bloodl996 Mayl5;87α0):4245)、抗辅助性T细胞自身免疫（CaporossiAP.等 人，Viral Immunol 1998; 11 (1) :9)、溶血性贫血（Sallah S.等人，Ann 胎matol 1997 1曰。74 (3):139)、肝脏疾病、肝自身免疫疾病、肝炎、慢性活动型肝炎巧^11(3〇4.等人， Clin Immunol Immunopathol 1990 Mar; 54 (3): 382)、胆汁性肝硬变、夏科氏肝硬变 (Jones DE. Clin Sci (Colch) 1996 Νον;91 (5):551)、肾病、肾自身免疫疾病、肾炎、间 质性肾炎化ellyCJ.JAmSocNe地roll990 Aug;l(2):140)、结缔组织疾病、耳病、自 身免疫结缔组织疾病、自身免疫耳疾病（Yoo TJ.等人，Cell Immunol 1994 Aug; 157 α):249)、内耳疾病（GloddekB.等人，AnnNYAcadScil997 Dec29;830:266)、皮肤 病、皮肤的疾病、真皮的疾病、大瘤的皮肤病、寻常天瘤疮、大瘤的天瘤疮样的和落叶状天瘤 疮。
[0188] 迟发型超敏反应的例子包括，但不局限于，接触性皮炎和药疹。
[0189] T淋己细胞介导的超敏反应的例子包括，但不局限于，辅助T细胞和细胞毒性T淋己 细胞。
[0190] 辅助T细胞介导的超敏反应例子包括，但不局限于，Thl淋己细胞介导的超敏反应 和Th2淋己细胞介导的超敏反应。
[0191] 自身免疫疾病 包括，但不限于屯、血管疾病、类风湿疾病、腺疾病、胃肠疾病、皮肤疾病、肝脏疾病、神经 疾病、肌肉疾病、肾疾病、生殖有关疾病、结缔组织疾病和系统性疾病。
[0192] 自身免疫屯、血管疾病例子包括，但不限于动脉粥样硬化（Matsimra E.等人， Lupus. 1998;7 Suppl 2:S135)、屯、肌梗死（化arala 0. Lupus. 1998;7 Suppl 2:S132)， 血栓（Tincani A.等人，Lupus 1998;7 Suppl 2:S107-9)、眶坏死性肉芽肿病、 Takayasu 氏动脉炎、川崎综合症（Praprotnik S.等人，Wien Klin Wochenschr 2000 Aug 25;112 (15-16) :660)、抗凝血因子自身免疫病化 acroix-Desmazes S.等人，Semin Thromb Hemost. 2000; 26 (2) :157)、引起坏死小型脉管血管炎，微观的多脉管炎、化urg和Strauss 综合症、少免疫的焦点的坏死和新月形肾小球肾炎（Noel LH. Ann Med Interne (Paris). 2000 May; 151 (3) :178)、抗憐脂综合症化lamholz R.等人，J Clin Apheresis 1"9;14 (4):m)、抗体诱导屯、力衰竭(Wall址at G.等人，Am J Cardiol. I"9 Jun I7; 83 (12A):75H)、血小板减少性紫齋(Moccia F. Ann Ital Med Int. 1999 Apr-化n;14 (2):114; Semple JW.等人，Blood 1996 May 15;87 (10):4245),自身免疫性溶血性贫血 化fremov DG.等人，Leuk Lymphoma 1998 Jan;28 (3-4) :285; Sallah S.等人，Ann 胎111日1〇1 1997]\&1。74 (3):139)、化日邑日3氏疾病中的屯、脏自身免疫（加血日-化1〇6.等 人，J Clin Invest 1996 Oct 15;98 (8):1709)和抗辅助Τ细胞自身免疫（Caporossi AP. 等人，Viral Immunol 1998; 11 (1):9)。
[0193] 自身免疫类风湿性的疾病例子包括，但不限于类风湿性关节炎化renn V.等人， Histol Histopathol 2000 Jul;15 (3):791; Tisch R，McDevitt 册.Proc 化tl Acad Sci units S A 1994 Jan 18;91 (2):437)和强直性脊柱炎（Jan Voswinkel 等人， Art虹itis Res 2001; 3 (3): 189)。
[0194] 自身免疫腺疾病例子包括，但不限于膜腺疾病、I型糖尿病、甲状腺疾病、Graves ' 病甲状腺炎、自发的自身免疫甲状腺炎、桥本氏甲状腺炎、自发粘液性水肿、卵巢的自身免 疫、自身免疫抗精液不育，自身免疫前列腺炎和I型自身免疫多腺综合症疾病、但不限于膜 腺的、1 型糖尿病自身免疫疾病（Castano L. and Eisenbarth GS. Ann. Rev. Immunol. 8:647; Zimmet P. Diabetes Res Clin Pract 1996 Oct; 34 Suppl:S125)、自身免疫甲状 腺病，Graves '病（0;rgiazzi J. Endocrinol Metab Clin North Am 2000 Jun; 29 (2): 339; Sakata S.等人，Mol Cell Endocrinol 1993 Mar;92 (1):77)、自发的自身免疫甲 状腺炎（化al巧-Mullen Η. and 化 S，J Immunol 2000 Dec 15; 165 (12) :7262)、桥本氏 甲状腺炎（ToyodaN.等人，Ni卵onRinshol999 Aug;57(8):1810)、自发粘液性水肿 (Mitsuma Τ. Nippon Rinsho. 1999 Aug;57 (8):1759)、卵巢的自身免疫（Garza KM.等 人，JR巧rodImmunoll998 Feb;37 (2):87)、自身免疫抗精液不育化iekmanAB.等人， Am J Reprod Immunol. 2000 Mar ;43 (3):1:34)、自身免疫前列腺炎（Alexander RB.等 人，Urology 1997 Dec;50 (6):893)和I型自身免疫多腺综合症化ara Τ.等人，Blood. 1991 Mar 1;77 (5):1127)〇
[0195] 自身免疫胃肠疾病例子包括，但不限于，慢性的炎症性的肠疾病(Garcia Herola A.等人，Gastroenterol Hepatol. 2000 Jan;23 (1):16)、脂泻病化andau YE. and Shoenfeld Y.化refu址2000 Jan 16;138 (2):122)、结肠炎回肠炎和克罗恩氏病。
[0196] 根据本发明的一个特定实施方案，所述疾病为结肠炎。
[0197] 自身免疫皮肤的疾病例子包括，但不限于，自身免疫大瘤皮肤病，例如，但不限于， 寻常天瘤疮、大瘤性类天瘤疮和落叶状天瘤疮。
[0198] 自身免疫肝脏疾病例子包括，但不限于，肝炎、自身免疫慢性活动型肝炎（化anco A.等人，Clin Immunol Immunopathol 1990 Ma;r;54 (3) :382)、夏科氏肝硬变(Jones DE. Clin Sci (Colch) 1996 Νον;91 (5) :551; Strassburg CP.等人，Eur J Gastroenterol Hepatol. 1999 化n;ll (6):595)和自身免疫肝炎（Manns MP. J Hepatol 2000 Aug;33 (2):326)0
[0199] 自身免疫神经疾病例子包括，但不限于，多发性硬化（Cross AH.等人，J 化111'〇;[1]111111]1〇1 2001 化]11;112(1-2):1)、阿尔茨海默氏病（01'〇]11^.等人，]"化11抑1 Transm S叩pi. 1997;49:77)、，重症肌无力（Infante AJ. And Kraig E，Int Rev Immunol 1999; 18 (1-2) :83; Oshima M.等人，Eur J Immunol 1990 Dec;20 (12): 2563)、神经病、原动力神经病化ornberg AJ. J Clin Neurosci. 2000 May;7 (3):191); 急性感染性多发性神经炎和自身免疫神经病化usunoki S. Am J Med Sci. 2000 Apr; 319 (4):234)、肌无力、Lambe;rt-Eaton类重症肌无力综合征(Takamo;riM.AmJMedSci. 2000 Apr;319 (4):204):类瘤神经疾病、小脑的萎缩、类瘤小脑萎缩和全身肌强直综合征 化iemstraHS.等人，Proc化tlAcadSciunitsSA 2001 Mar27;98 (7):3988);非类 瘤全身肌强直综合征、渐进的小脑萎缩、脑炎、Rasmussen氏脑炎、肌萎缩性侧索硬化、 Sydeham舞蹈病、Gilies de la Tourette综合症和自身免疫多内分泌腺疾病(Antoine JC. and Honnorat J. Rev Neurol (Paris) 2000 Jan; 156 (1):23);免疫异常神经病 (Nobile-Orazio E.等人，Electroenc邱halogr Clin Neurophysiol Suppl 1999 ; 50: 419);获得性神经性肌强直，关节弯曲多重的congenita(Vincent A.等人，Ann N Y Acad Sci. 1998 May 13;841:482)、神经炎、视神经炎（Soderstrom M.等人，J Neurol Neu;rosu;rg Psychiatry 1994 May; 57 (5):544)和神经变性疾病。
[0200] 自身免疫肌肉疾病例子包括，但不限于，肌炎、自身免疫肌炎和主要的Sjogren氏 综合症（Feist E.等人，Int Arch Allergy Immunol 2000 S邱；123 (1):92)和平滑肌自 身免疫病（Zauli D.等人，Biomed Pharmacother 1999 Jun;53 (5-6):234)。
[0201] 自身免疫肾疾病例子包括，但不限于，肾炎和自身免疫间质性肾炎化elly CJ. J Am Soc Nep虹〇1 1990 Aug;l (2):140)。
[0202] 生殖相关自身免疫疾病例子包括，但不限于，重复性流产（Tincani A.等人， Lupus 1998;7 Suppl 2:S107-9)。
[0203] 自身免疫结缔组织疾病例子包括，但不限于，自身免疫耳病（Yoo TJ.等人，Cell Immunol 1994 Aug; 157 (1):249)和内耳自身免疫疾病(Gloddek B.等人，Ann N Υ Acad Sci 1997 Dec 29;830:266)〇
[0204] 自身免疫系统性疾病例子包括，但不限于，系统性红斑狼疮化rikson J.等人， Immunol Res 1998; 17 (1-2):49)和系统性硬化（Renaudineau Y.等人，Clin Dia即 Lab Immunol. 1999 Ma;r;6 (2):156); Qian ΟΤ.等人，Immunol Rev 1999 Jun;169:107)。
[020引传染性疾病 传染性疾病的例子包括，但不限于，慢性的传染病、亚急性的传染病、急性的传染病、病 毒性疾病、细菌性疾病、原生动物性疾病、寄生虫病、真菌病、支原体疾病和航病毒疾病。
[0206] 移植排斥疾病 移植排斥相关疾病的例子包括，但不限于，移植排斥、慢性移植排斥、亚急性移植排斥、 过急性移植排斥、急性移植排斥和移植物抗宿主疾病。
[0207] 过敏性疾病 过敏性疾病例子包括，但不限于，哮喘、蜂疹、等麻疹、花粉过敏、灰尘蛾过敏、毒液过 敏、化妆品过敏、乳液过敏、化学品过敏、药物过敏、昆虫叮咬敏症、动物毛发皮屑过敏、带刺 植物敏症、毒常春藤过敏和食物过敏。
[020引 癌症 癌症例子包括，但不限于，癌、淋己瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。癌症疾病的特别的但 不限制的例子:骨髓性白血病如慢性粒性白血病、伴随成熟的急性髓性白血病、急性早幼粒 细胞性白血病、伴随嗜碱性白细胞提高的急性非淋己细胞白血病、急性单核细胞性白血病、 伴随嗜曙红细胞增多白血病急性髓单核细胞白血病；恶性淋己瘤，如Birkitt ' S非 化dgkin ' s;淋己细胞白血病，如急性的成淋己细胞白血病。慢性淋己细胞性白血病;骨 髓及外骨髓增殖的疾病、如实性肿瘤良性的脑膜瘤、诞腺混合瘤、结肠腺瘤;腺癌、如小细胞 肺癌、肾、子宫、前列腺、膀脫、卵巢、结肠、肉瘤、脂肉瘤、粘液样的、滑膜肉瘤、横纹肌肉瘤 (肺泡的）、外骨骼粘液样软骨肉瘤、尤因氏肉瘤;其他的包括双丸状的和卵巢的无性细胞 瘤、成视网膜细胞瘤、维耳姆斯瘤、成神经细胞瘤、恶性黑色素瘤、间皮瘤、乳房、皮肤、前列 腺和卵巢。
[0209] 本发明还预期阻止多肤的核转位，所述多肤内源性地包含本发明确定的信号肤， 通过使用敲入策略等将本发明确定的序列进行突变。
[0210] 另一种调整内源性多肤核转位的方法是通过蛋白质/蛋白质相互作用。因此，例 如，核祀向肤与抗体连接，可W被引入细胞中。抗体识别并结合其祀多肤使得祀多肤间接地 连接于核祀向肤。
[0211] 可W理解，如调整内源多肤的转位功能，本发明的肤可W通过接头连接到异源物 质上，从而作为载体运输异源物质至细胞核中。可W理解本发明的核祀向肤还可W在细胞 中而不是在体外连接至异源物质。因此异源物质可W在核祀向肤施用之前，伴随施用或施 用之后施用至细胞。
[0212] 异源物质可W是祀向细胞核期望的任何材料，例如，药剂如治疗剂、诊断剂或化妆 剂。因此，根据本发明的该方面，异源物质可W是多肤、多核巧酸、脂质、碳水化合物、激素、 类固醇、小化学品，病毒和其任何组合等。
[0213] 根据本发明该方面的一个实施方案，异源物质是多肤。多肤可W是，例如，永生化 蛋白质（例如、SV40大T抗原和端粒酶）、抗细胞调亡蛋白质（例如，突变p53和Bel. sub. xL)、 抗体、致癌基因（例如，ras、myc、HPV E6/E7和腺病毒Ela)、细胞周期调节蛋白（例如，细胞周 期素和细胞周期素依赖蛋白激酶）、或酶(例如，绿色巧光蛋白质、0-半乳糖巧酶和氯霉素乙 酷转移酶）。
[0214] 根据本发明的该方面的另一个实施方案，异源物质是核酸。该核酸可W是，例如， RNA、DNA或cDNA。核酸的序列可W是编码或非编码序列（例如，反义寡核巧酸）。
[0215] 将核酸安全和有效转移进入细胞的能力是生物技术中的一项基本目标。当前的合 成递送系统虽然安全，但是相对低效的。有效基因递送的一个主要障碍是将遗传物质祀向 至细胞核。在目前的基因递送方法中，DNA通过扩散从细胞质向细胞核移动，运是较慢的过 程，在此过程中遗传物质暴露于降解的细胞质环境中。已经实现了通过渗入核祀向肤上调 核酸核转位的效率，参见，例如Zanta等人，PNAS，Vol. 96，Issue l，91-96January 5， 1999; Subramanian'A.等人，（1999) Nat. Biotechnol. 17:873-877。
[0216] 因此本发明人预想本发明的核祀向肤将增加各种转染方案的效率，其包括但不限 于显微注射、电穿孔、憐酸巧共沉淀、DEAE右旋糖酢引入、脂质体介导的引入、病毒介导引 入、裸DNA注射和生物射弹轰击。
[0217] 根据本发明的该方面的还另一个实施方案，异源物质是病毒。病毒可W是全病毒 或含有病毒核酸的病毒核屯、（即，包装的病毒核酸，但没有病毒包膜）。可W被运输的病毒和 病毒核屯、的例子包括，但不限于，乳头状瘤病毒、腺病毒、杆状病毒、反转录病毒核屯、、和 Semliki病毒核屯、。
[0218] 根据本发明的该方面的还另一个实施方案，异源物质是小分子。所述小分子可W 是，例如，放射性核素、巧光标记物或染料。
[0219] 根据本发明的该方面的另一个实施方案，异源物质是药物递送系统，、例如，磁性 颗粒、二氧化娃珠、PLGA、纳米球或微球、壳聚糖等。
[0220] 根据本发明的该方面的还另一个实施方案，异源物质是亲合部分，例如抗体、受体 配位体或碳水化合物。当期望使用核祀向肤祀向具体细胞类型时，亲和部分与本发明的核 祀向肤之间的连接是特别有益的。根据本发明的该方面可W使用的抗体的例子包括但不限 于肿瘤抗体、抗CD20抗体和抗IL 2Ra抗体。示例性的受体包括，但不限于叶酸受体和EGF受 体。根据本发明的该方面可W使用的示例性的碳水化合物为凝集素。
[0221] 根据本发明的该方面的还另一个实施方案，异源物质是可检测部分。
[0222] 可检测部分可W是直接可检测的，通常通过发出其具体波长的福射(例如巧光剂、 憐光剂或化学发光剂）。可选地，可检测部分可W非直接可检测的。例如，可检测剂部分是酶 促反应的底物，其能够产生可检测的产物。
[0223] 可W理解本发明的核祀向肤可W直接和/或间接地与不止一个异源物质连接。
[0224] 异源物质可W通过本领域已知的并适合用于特别的异源物质的任何方法与本发 明的核祀向肤连接。因此例如，如果异源的物质是多肤，接头可W包含肤键或取代肤键，如 上文所述的。如果该异源物质是小分子，接头可W包含非肤键。
[0225] 连接方法的例子包括，但不限于，化学交联法、遗传融合和桥接。
[0226] 化学交联法：同源双功能交联接头或异源双功能交联接头可W用于交联本发明的 核祀向肤与异源物质。在核祀向肤运输该异源物质通过细胞膜后，同源双功能或异源双功 能交联接头可W可切割的促进核祀向肤从异源的物质上分离。同源双功能交联接头有至少 两个同一的反应基团。使用的同双功能交联剂可W导致自共辆，分子内的交联和/或聚合。 同双功能交联接头主要是伯胺反应(例如，亚氨酸醋、N-班巧酷醋、异硫氯酸醋、簇酸类和 横酷氯)或琉基反应(例如，2-二硫基化晚、3-硝基-2-二硫基化晚顺下締二酷亚胺、乙締讽、 芳基面、二硝基氣苯、有机隶制剂、对氯隶苯甲酸、双马来酷亚胺正己烧、1,5-二氣-2,4- 二硝基苯、和1,4-二（3'-( 2'-二硫代化晚)-丙酷胺基)下烧）。同双功能亚氨酸醋例子包 括，但不限于二甲基己二亚酷胺、二甲基辛二亚酷胺和二硫代双丙亚胺。同双功能NHS醋的 例子包括，但不限于，二班巧酷亚胺戊二酸、双班巧酷辛二酸、二(班巧酷亚讽)辛二酸、二硫 基二(班巧酷丙酸盐)和双班巧酷酒石酸。
[0227] 异双功能交联接头拥有两个或更多个不同的反应基团，其允许与特定的基团连续 共辆，因此将不期望的聚合或自共辆最小化。一些异双功能交联接头在一个末端进行胺反 应，在另一末端进行琉基反应。运样的交联剂的例子包括，但不限于班巧酷亚胺4-(N-马来 酷亚胺基甲基）环己烧--簇酸醋、m-马来酷亚胺基苯甲基-N-径基班巧酷亚胺醋、班巧酷 4-( P-马来酷亚胺基苯基)-下酸醋、双马来酷亚胺基己烧和N-( g-马来酷亚胺基下酷氧） 班巧酷亚胺醋。
[0228] 同双功能和异双功能交联反应可W在添加连接同双功能或异双功能交联剂至核 祀向肤之后停止。可W通过本领域熟知的方法将核祀向肤与同双功能或异双功能交联剂纯 化，且用作添加异源物质的原料。运样的连接同双功能或异双功能交联剂的纯化的核祀向 肤可等分试样储存在，例如-20 °C，并随后解冻。一旦解冻，可W通过完成交联反应添 加异源物质。
[0229] 基因融合:基因融合可W通过连接核祀向肤的框内编码序列与多肤异源物质的编 码序列连接产生。本领域中存在很多将编码序列连接在一起的方法。示例性的方法包括，但 不限于，聚合酶链式反应（PCR)、拼接PCR和限制性核酸内切酶消化和连接。优选地，核祀向 肤的阅读框和异源物质在框架内并转录地融合。
[0230] 核祀向肤和多肤异源物质之间可W包括蛋白酶切割位点。运样的蛋白酶切割位点 的例子包括，但不限于Xa因子和烟草蚀纹病毒（TEV)蛋白酶。
[0231] 桥联分子:可W使用成对的桥联分子使核祀向肤和异源物质复合。运样的成对的 例子包括，但不限于，（a)抗生蛋白链菌素和生物素、（b)谷脫甘肤和谷脫甘肤-S-转移酶 和（C)聚组氨酸和亲和层析剂(例如，四次氮基Ξ乙酸（NTA)或亚氨基二乙酸（IDA))，其 通过离子如Ni+2相互作用。核祀向肤可W连接到成对的任一成员上，且异源物质连接到另一 个桥联分子。例如，如果核祀向肤连接在谷脫甘肤-S-转移酶上，随后负载物连接到谷脫甘 肤。可选地，核祀向肤可W连接到抗生蛋白链菌素，且异源物质可W连接到生物素。核祀向 肤与抗生蛋白链菌素可W通过本领域已知的用于连接肤和桥分子的任意方法进行连接。运 样的方法例子包括，但不限于，化学交联或遗传融合。异源物质随后通过本领域已知的生物 素化小分子、蛋白质或核酸的任意方法，例如化学交联与生物素连接。核祀向肤/异源物质 复合物可W通过将核祀向肤-抗生蛋白链菌素与生物素化的异源的物质接触形成。
[0232] 核祀向肤和异源物质可W在核祀向肤或异源物质的任意位置化学地或使用成对 桥联分子复合，只要保证核祀向肤或异源物质的功能性不被破坏。例如，交联剂将与位于氨 基末端或簇基末端(对于蛋白质）、位于5'端或3'端的(对于核酸)或位于整个分子的合适 的官能团反应。
[0233] 本领域技术人员将能够确定核祀向肤/异源的物质复合物的各部分是否保留了生 物活性。如果核祀向肤能够将连接的异源物质转位至细胞核，则核祀向肤保留了其生物学 活性。转运活性可W通过，例如，添加核祀向肤/异源物质复合物至细胞并测定细胞W确定 异源物质是否被递送至细胞核中，其使用本领域已知的方法来测定，例如，免疫组织化学染 色。异源物质可W分析其活性，使用适于此类型异源物质的方法(例如，对于酶进行酶活性 测定，对于癌基因蛋白质进行转化分析，对于抗细胞调亡蛋白质进行抗细胞调亡测定，对于 永生化蛋白质进行永生化测定）。运些测定都是本领域熟知的，并描述于Sambrook等人， 1989 and Ausubel 等人，1989中。
[0234] 如果核祀向肤和多肤异源物质是基因操作连接的，该多肤负载部分可W复合至核 祀向肤的氨基的末端或核祀向肤的簇基末端。优选地，多肤负载部分复合至核祀向肤的N末 玉山 乂而。
[0235] 本发明的核祀向肤可W直接施用于细胞本身或作为药物组合物的一部分，所述药 物组合物与药物可接受载体混合。
[0236] 本文使用的"药物组合物"指的是本文描述的一种或多种活性成分与其他化学组 分如生理学合适的载体和赋形剂的制剂。药物组合物的目的是促进化合物对生物体的施 用。
[0237] 本文的术语"活性成分"指的是本发明的核祀向肤，其单独地或与异源试剂连接； 或是编码所述肤的多核巧酸，其用于产生生物学效应。
[0238] 在下文中，短语"生理学可接受载体"和"药物可接受载体"可W互换使用，指的是 不会对生物造成显著刺激的载体或稀释剂，也不会使施用的化合物生物活性和性能丧失。 佐剂也包括在运些短语范围内。一种药物可接受载体中的成分例子可W是例如聚乙二醇 (PEG),具有有机介质的和水介质两者的广范围的溶解度的生物相容的聚合物（Mutter等 人(1979)。
[0239] 本文的术语"赋形剂"指的是添加到药物组合物中W进一步促进活性成分的施用 的惰性物质。赋形剂的例子，但不限于，包括碳酸巧、憐酸巧、各种的糖和各类淀粉、纤维素 衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
[0240] 药物配制和施用的技术可W在"Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co.，Easton，PA，latest edition中找到，其在此通过引用并入本文。
[0241] 合适的施用途径可W，例如，包括口服、直肠、引入粘液质、经鼻的、肠的或肠胃外 的递送，包括肌肉、皮下和髓内注射W及銷内、直接屯喧内、静脉内、腹膜内、子宫内，或眼内 注射。
[0242] 可选地，可W在局部而不是全身施用该制剂，例如，通过直接在患者身体的特定区 域注射制剂。
[0243] 重组载体可多种方法施用。例如，如果使用的载体包含细胞特异性启动子，施 用的方法可W利用其祀向特异性并因此不需要在疾病位置局部施用。
[0244] 本发明的药物组合物可W通过本领域熟知的制造方法来制备，例如，通过常规的 混合、溶解、粒化、糖衣丸制造、研磨、乳化、包封、包埋或冻干处理。
[024引根据本发明使用的药物组合物可W使用传统的方法配制，其使用一种或多种生理 学可接受载体，其包括可药物地使用的赋形剂和辅剂，其促进活性成分进入制剂的过程。合 适的制剂取决于选择的施用途径。
[0246] 对于注射，本发明的活性成分可W配制在水溶液中，优选地是生理学相容的缓冲 液如化nk氏溶液、林格氏液或生理盐水缓冲液。对于转化粘液质施用，在制剂中使用合适对 屏障渗透的渗透剂。运样的渗透剂通常是本领域已知的。
[0247] 对于口服施用，该化合物可W容易地通过将活性化合物与本领域熟知的药物可接 受载体组合配制。运些载体能够使本发明的化合物配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊剂、液 体、凝胶、糖浆、膏剂、悬浮液等，用于由患者口服摄取。用于口服的药物制剂可W使用固体 赋形剂制备，如果需要，任选地研磨形成的混合物，并在添加合适的辅剂之后加工成颗粒混 合物，W获得片剂或糖衣丸的核。具体地，合适的赋形剂是，填料例如糖，其包括乳糖、薦糖、 甘露糖醇或山梨糖醇;纤维素制剂例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃馨淀粉、明胶、 黄巧胶、甲基纤维素、径基丙基甲基纤维素、簇甲基纤维素钢;和/或生理地可接受的聚合物 如聚乙締化咯烧酬（PVP)。如果期望， 可W添加崩解剂，例如交联的聚乙締基化咯烧酬、琼 脂或藻酸或其盐类例如海藻酸钢。
[0248] 糖衣丸具有合适的包衣。为了该目的，可W使用浓缩糖溶液，其可W任选地含有阿 拉伯树胶、滑石、聚乙締基化咯烧酬、聚簇乙締凝胶、聚乙二醇、二氧化铁、漆溶液和合适的 有机溶剂或溶剂混合物。可W在片剂或糖衣丸包衣添加着色剂或色素，用于鉴定或表征活 性化合物剂量的不同组合。
[0249] 可W 口服使用的药物组合物包括明胶制的推合胶囊(push-fit capsule) W及明 胶和增塑剂(如甘油或山梨糖醇）制备的软的，密封的胶囊。推合胶囊可W包含活性成分混 合有填料如乳糖、粘合剂如淀粉、润滑剂如滑石或硬脂酸儀和任选地，稳定剂。软胶囊中，活 性成分可W溶解或悬浮在合适的液体中，如脂肪油类、液体石蜡或液体聚乙二醇。此外，可 W添加稳定剂。口服施用的全部配方都应该是适合所选施用途径的剂量。
[0250] 对于口腔施用，组合物可W是W传统方法配制的片剂或锭剂形式。
[0251] 对于经鼻施用，根据本发明的活性成分方便地W来自压缩包的喷雾剂形式或使用 合适推进器的气雾剂递送，例如，二氯二氣甲烧、Ξ氯氣甲烧、二氯-四氣乙締或二氧化碳。 在加压气溶胶的情况中，剂量单位可W通过提供阀W递送计量的量确定。例如，在分配器中 使用的明胶制成的胶囊和盒，可W配制为含有化合物和合适的粉末基质如乳糖或淀粉的粉 末混合物。
[0252] 本文描述的制剂可W配制用于肠胃外施用，例如，通过快速浓注或连续输注。注射 制剂可W是单位剂型存在，例如，W安飯或在任选添加防腐剂的多剂量容器中。组合物可W 是在油或水媒介中的悬浮液、溶液或乳剂，并可W含有配方剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散 剂。
[0253] 肠胃外施用的药物组合物包括W水溶形式的活性剂的水溶液。另外地，活性成分 的悬浮液可W作为合适的油基或水基注射悬浮液配制。合适的亲脂性的溶剂或媒介物包括 脂肪油如芝麻油或合成脂肪酸醋例如油酸乙醋、Ξ酸甘油醋或脂质体。水注射悬浮液可W 含有增加悬浮液粘性的物质，如簇甲基纤维素钢盐、山梨糖醇或葡聚糖。可选地，悬浮液也 可W含有合适的稳定剂或提高活性成分可溶性的试剂，其允许高高浓度溶液的制备。
[0254] 可选地，在使用前活性成分可W是粉末形式，用于与合适的媒介物，例如无菌的、 无热原的水基溶液构建。
[0255] 本发明的制剂还可W配制成直肠施用组合物，如栓剂或灌肠制剂，使用例如常规 的栓剂基础例如可可脂或其他的甘油醋。
[0256] 本发明背景下适合使用的药物组合物包括其中W实现意图目的有效量含有的活 性成分的组合物。更具体地，治疗有效量意指对防止、减轻或改善病症或延长受治疗的受试 者的生存的活性成分的量。
[0257] 确定治疗有效剂量在本领域技术人员能力之内。
[0258] 对于本发明的方法中使用的任何制剂，治疗有效量或剂量可W首先根据体外测定 评估。例如，剂量可W在动物模型中配制，且运样的信息可W用于更准确地确定可用于人的 剂量。
[0259] 本文描述的活性成分的毒性和治疗功效可W通过体外、细胞培养物中或实验动物 中进行标准药物程序来确定。从运些体外和细胞培养测定和动物研究中获得的数据可用于 配制在人中使用的剂量范围。剂量可W根据使用的剂型和施用途径而变化。精确的配方，施 用途径和剂量可W由医生根据患者状况选择。[参见，Fingl，等人，（ 1975) "The Pharmacological Basis of Ther曰peutics"，Ch. 1 p.l]。
[0260] 取决于受治疗的状况的严重性和应答，可WW单剂量或多剂量施用，治疗过程持 续数天至数周或直到实现治愈或实现疾病状态的降低。
[0261] 施用的组合物的量，当然将取决于受治疗的对象、痛苦严重性、施用方式、处方医 生的判断等。
[0262] 可W理解本发明的多肤和多核巧酸可W与其他的活性剂一起提供给个体，W实现 相比分别使用各自剂治疗改善的治疗效果。在运样的治疗中，量度(例如，补充剂的剂量和 选择)可W与组合治疗相关的不良副作用。
[0263] 还可W制备将包括本发明的制剂配制于适合的药物载体中的组合物，将其放置在 合适的容器中，并标记用于治疗指示的状况。
[0264] 如果期望，本发明的组合物，可W存在于包装或分配装置中，例如FDA批准的试剂 盒，其可W包含一个或多个含有活性成分的单位剂型。包装可W例如，包含金属或塑料薄 膜，如薄膜包装。包装或分配装置可W附有施用说明。包装或分配装置可W还包含一个连接 于容器上的政府部口管理该药物的生产、使用或销售的注意事项，该注意事项反映了政府 批准该组合物或人或兽医的施用形式。运样的注意事项，例如，可W通过U.S. Food and Drug A血inistration批准标记用于处方药或插入批准的产品。
[0265] 本文使用的，术语"约"指的是± 10 %。
[0266] 术语"包含"、"包括""具有"W及他们的结合意思是"包括但不限于"。
[0267] 术语"由……组成"指的是"包含并且限于……"。
[0268] 术语"基本上由…组成"指的是组合物、方法或结构可W包含另外的成分、步骤和/ 或部分，但是仅当运些另外的组分、步骤和/或部分不实际改变要求保护的组合物、方法或 结构的基本的或新型的特征时。
[0269] 本文使用的，术语"方法"指的是完成给定目标的手段、方法、技术和步骤，其包括， 但不限于，那些化学、药理、生物、生物化学和医学领域技术人员已知的方式，方法，技术和 步骤，或很容易从已知的方式、方法、技术和步骤中发展出的那些方法。
[0270] 本文使用的，术语"治疗"包括终止、基本抑制、减缓或逆转状况的进程，基本改善 症状临床症状或表现症状，或基本上防止出现临床或表现症状。
[0271] 可W理解本发明的特征，为了清楚地说明，在各个实施方案的范围中进行了描述， 可W在单个实施方案联用中也进行了提供。反之，本发明的各种特征，为了简洁，在单个实 施方案的范围内进行了描述，也可W分别地或任意再组合或W任何本发明其他的实施方案 中所描述的内容中提供。各种实施方案的范围内特定特征的描述不应认为是那些实施方案 的基本特征，除非在没有那些要素时该实施方案无法进行。
[0272] 在前文进行描述，并在下文的权利要求部分进行了要求的本发明的各种实施方案 和方面在W下实施例中发现了实验支持。 实施例
[0273] 给出了针对W下的实施例的参考，其与上文描述一同W非限制性的方式阐明了本 发明的一些实施方案。
[0274] 通常地，本文使用的命名法和本发明使用的实验室程序包括分子、生物化学、微生 物学和重组dm技术。运些技术在文献中得到了详细解释。参见，例如，"Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook 等人，（1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel'R. M.，ed. (1994); Ausubel 等人，" Current Protocols in Molecular Biology"，John Wiley and Sons ,Baltimore , Maryland (1989); Perbal，"A Practical Guide to Molecular Cloning"John Wiley & Sons ,New York (1988) ; Watson 等人，"Recombinant DNA"，Scientif ic American Books，New York; Birren 等人(eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series"，Vols. 1-4,Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York (1998);美国专 利号4,666,828; 4,683,202; 4,801，531; 5,192,659 和 5,272,057所示的方法；"Cell Biology: A Laboratory Handbook"，Volumes I-III Cellis,J. E.，ed. (1994);" Culture of Animal Cells-A Manual of Basic Technique" by Freshney，Wiley-Liss， N. Y. (1994),Third Edition; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E.，ed. (1994); Stites 等人（eds)/'Basic and Clinical Immunology" (8th Edition),Appleton & Lange，Norwalk，CT (1994); Mishell and Shiigi (eds)，" Selected Methods in Cellular Immunology"，！. H. Freeman and Co.，New York (1980);可W得到的免疫学测定在专利和科学文献中进行了深入描述，参见，例如美国专 利号3,791，932; 3,839，153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879， 262; 3,901，654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996，：345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879， 219; 5,011，771 和 5,281，521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait,M. J.，ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames'B. D.，和Higgins S. J.'eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames，B. D.，和Higgins S. J.，eds. (1984);" Animal Cell Culture" Freshney,R. I.，ed. (1986) ; "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press，（1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal， B. ,(1984)和"Methods in E；nz;ymology" Vol. l-317，Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications"，Academic Press , San Diego,CA (1990); Marshak 等人，"Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratoiy Course Manual" CSHL Press (1996);所有的运些文献在此通过全文引入并 入本文。其他的常规参考在本文档中也有提供。运些操作过程相信是本领域熟知的，并为读 者便利而提供。本文包含的所有信息通过引用并入本文。
[02巧]材料与方法 DNA 构建体与突变：将GFP-JNKl/2、p38a/e克隆至pEGFP-Cl(Clontech，Mountain View，CA)。从HeLa细胞中扩增JNK1/2 和 ρ38α/β序列，JNK2 和ρ38β侧翼为EcoRI / BamHI， 且JNKl和ρ38α侧翼为趾ol / BamHI酶切位点。JNKl/2和ρ38α/β的点突变通过定点突变执 行。将GST-JNKl/2、p38a/e克隆至PGEX-2T载体（GE healthcare，Buckin曲amshire，UK)，侧 翼为Spel / Notl限制性位点。使用特异性引物执行GFP- ρ38α的N和C末端的缺失突变，W 构建Δ7 / Δ20 / Δ30Ν末端缺失突变或Δ40的C末端缺失突变。将输入蛋白3、7和9克隆 至pEGFP-C。使用特异性引物将输入蛋白7和9从化La细胞cDNA中扩增，输入蛋白7侧翼为 BamHI / Sail限制位点，输入蛋白9侧翼为Xhol / Sail限制位点。输入蛋白3从 Forchheimer库质粒集合中获得，并使用侧翼为化〇1 / EcoRI限制位点的特异性引物扩增。 [0276] 细胞培养和转染：化La和MC巧细胞在使用有2 mM k谷氨酷胺，1 % Pen / Strep 和10 %胎牛血清（FBS)补充的Du化ecco氏改良Eagle氏培养基（DMEM)中培养。皿2细胞在 添加氨化可的松（0.5 mg / ml)和膜岛素（lOyg/ ml)的相同培养基中培养。MCF10A细胞 在添加5%马血清、EGF (200 ng /ml)、氨化可的松(0.5 mg /ml)、霍乱菌毒素（100 ng / ml)、膜岛素（10μg/ml)、2 mMk谷氨酷胺、1% pen / strep和 10% FBS的DMEM F-12培养基中 培养。所有细胞均在37°C、95%空气湿度和5%C02环境中维持。HeLa细胞用聚乙締亚胺（ Sigma)进行转染。siRNA用 Dharmafect ( Thermo Fisher Scientific,CO,USA)进行转染。 [0277]免疫巧光显微术:将细胞在3%仲甲醒的PBS溶液中固定（20分钟，23 °C)，并在含2 %牛血清白蛋白（BSA)的PBS中溫育（15分钟，23 随后用Triton X-100 ( PBS中浓度 为0.1 %，5分钟，23 "C)透化。随后将固定的细胞与初级抗体溫育（60分钟，23 °C)，用 PBS洗涂Ξ次，与罗丹明-共辆二级抗体和DAPI溫育（60分钟，23 °C)。通过巧光显微镜（ Olympus BX51，x40放大率)观测载玻片。并使用化otoshop ( Adobe,CA，USA)进行原始数据 图像的背景校正、对比度调节。
[027引免疫共沉淀反应:HeLa细胞生长至分汇合，血清-饥饿（0.1% FBS，16小时），并随 后用其他药物刺激或处理。细胞抽提物按照如前所述的方法产生，并与预先连接有特异性 抗体（1小时，23 °C)的A / G-琼脂糖珠子（Santa Cruz Biotechnology)共同溫育2小时（ 4 "C，震荡）。用冰冷的洗涂缓冲液洗涂结合的A / G珠子Ξ次。经IP的珠子随后使用1.5X样 品缓冲液重悬并煮沸;使用具有指示的抗体的蛋白质印迹分析分解蛋白质。
[0279] 邻近连接现憶（PLA):使用Duolink PLA试齐Ij盒(Olink Bioscience)根据生产商 的方案分析蛋白质-蛋白质相互作用。简言之，使细胞如描述的生长、固定和透化处理。随后 将样品与针对两种受检测的蛋白质的初级抗体进行溫育（60分钟，23 °〇、洗涂（0.01 Μ Tris肥1 pH 7.4,0.15 Μ化α和0.05%吐溫20)，并随后使用特异性探针溫育(60分钟，37 °C)，然后使用DAPI染色W观察细胞核，并使用缓冲液Β : 0.2 Μ Tris HC1 pH 7.5,0.1 Μ 化Cl洗涂。通过巧光显微镜（Olympus ΒΧ51，χ40放大率)可观测到作为区别的巧光点的信 号。使用化otoshop ( Adobe)和ImageJ执行原始数据图像的背景校正、对比度调节和巧光 信号的定量。
[0280] 体外相互作用：化La细胞长至分汇合，血清-饥饿（0.1 % FBS，16小时），并随后 使用其他药物或刺激处理。将细胞提取物如描述的生产，并与预先与特异性抗体连接（1 小时，23 "C)的A / G-琼脂糖小珠溫育2小时（4 °C)。将结合的A / G小珠随后使用RIP A 缓冲液洗涂一次，然后使用0.5M LiCl洗涂两次，并使用缓冲液A.洗涂两次。结合的A / G小 珠随后在含有0.01 % BSA的缓冲液A中重悬并等分。GST标记蛋白质与小珠溫育2小时（4 °C)，随后在1.5 X样品缓冲液中洗涂并重悬，并煮沸。
[0281] 凝胶过滤：使化La细胞血清饥饿（如上文），随后用茵香霉素（Anis，0.5yg/ ml, 15分钟）和ΤΡΑ (250 nM，15分钟)刺激或不处理(NT)。细胞提取物(各个处理25 mg)负载 于16 /60 superdex 200大小的柱(流速1ml /分钟），并收集1ml级分。使用具有合适抗体的 蛋白质印迹分析级分。
[0282] 统计学分析:数据用平均数+ S.E表达。统计学评估使用泛函分析和Student t检 验(双尾)检测对照和实验结果之间的差异。P < 0.05的值被认为是统计学显著的。
[0283] 实施例1 JNK和p38使用不依赖NTS机制转位至细胞核中 在寻找不依赖NLS的穿梭蛋白质中，本发明人查找了 JNK1 / 2和ρ38α/β的亚细胞定位。 使用具有特异性抗体(Ab)的免疫染色发现，与Ε服1 / 2相似，JNK1 / 2和ρ38α/β主要定位 于静止细胞的细胞质中（图7Α和图8Α-Β)。使用应激或促有丝分裂刺激物(分别地茵香霉素 和ΤΡΑ)处理细胞，在所有四种ΜΑΡΚ同种型中观察到了快速而强劲的核转位，在他们的转位 动力学中仅有较小的差异。有趣地，该转位与JNK1 / 2和ρ38α/β活化憐酸化作用无关（图 7B)，指示运四种ΜΑΡΚ的转位机制与E服1/2的不同。此外，JNK或p38蛋白质均不包含NTS,并 且仅有两种，JNK2和ρ38β，在相同的激酶区域含有可憐酸化序列（T-P-S)。然而，JNK1 / 2 和ρ38α/β与Ε服1 / 2之间显著的序列和构型相似性可W表明前者在他们的激酶插入域仍 使用NTS样序列用于转位。为了排除运种可能性，本发明人在所有的四个ΜΑΡΚ中将JNK1或 口38〇中的憐酸化的^5比对残基突变为均突变为41曰或6111残基。与6服1/^2不同，运些突变的 过表达导致与WT蛋白质相似的分布（图9)，指示JNK1/ 2和ρ38α/β不仅在从错蛋白质上释放 不同，而且他们的转位机制也不同。
[0284] 实施例2 刺激后JNK1/2和ρ38α/β与Imp3、7和9的相互作用 缺乏E服1/2样NTS，W及标准的或任何非典型的化S，和JNK1 / 2和ρ38α/β不能与Impa 或Impb直接或间接相互作用，促使寻找他们转位作用的实际机制。因为β-样Imp(下文表3) 已经设及信号蛋白质的刺激转位，假设运些Imp中的一种或多种设及到所述过程。为了检验 运一假设，使用免疫共沉淀反应（CoIP)筛选检测他们中的任一是否与JNK1 / 2和ρ38α/β 相互作用。除了在运些测试细胞中Imp的表达，没有在静止化La细胞中检测到显著的Imp/ ΜΑΡΚ相互作用（图1A)。然而，在受刺激化La细胞的提取物中，JNK1 / 2和ρ38α/β的IP展示了 所有四个ΜΑΡΚ与Imps 3、7和9的相互作用的多个程度。重要地，筛选和其他IP实验证明在组 分间的缔合或相互作用的时间上仅有小的差异，表明他们之间的相似调节模式。
[0285] 表 3 Ιπφβ-样蛋白质列表
[0286] 表3的参考 1. Chook，Y.M. & Suel，K.E. Nuclearimport by karyopherin-betas: recognition and inhibition. Biochim Biophys Acta 1813,1593-1606 (2011). 2. Waldmann，I.，Walde，S. & Kehlenbach，民.H. Nuclearimport of c-Jun is mediated by multiple transport receptors. J Biol Qiem 282,27685-27692 (2007). 3. Wu，F.，Wang，P.，Young，L.C.，Lai，民.& Li，L. Proteome-wide identification of novel binding partners to the oncogenic fusion gene protein?NPM-ALK?using tandem affinity purification and mass spectrometry. Am J Pathol 174?361-370 (2009). 4. Zakaryan，民.P. & Gehring，H. Identification and characterization of the nuclear localization/retention signal in the EWS proto-oncoprotein. J Mol Biol 363,27-38 (2006). 5 . Miyauchi，Y.等人Importin 4 is responsible for 1 igand-independent nuclear translocation of vitamin D receptor. J Biol Chem 280,40901-40908 (2005). 6. Chachami，G.，Paraskeva，E.，Georgatsou，E.，Bonanou，S. & Simos，G. Bacterially produced human HIF-lalpha is competent for heterodimerization and specific DNA-binding. Biochem Biophys Res Commun 331,464-470 (2005). 7. Heese，K.等人 Characterizing the new transcription regulator protein p60TRP. J Cell Biochem 91,1030-1042 (2004). 8. Chuderland，D.，Konson，A. & Seger，民.Identification and characterization of a general nuclear translocation signal in signaling proteins. Mol Cell 31， 850-861 (2008). 9. Lorenzen，J . A.等人 Nuclearimport of activated D-E 民 K by DIM-7 , animportin family member encoded by the gene moleskin. Development 128,1403- 1414 (2001). 10. Yao，X.，Chen，X.，Cottonham，C. & Xu，L. Preferential utilization ofImp7/8 in nuclearimport of Smads. J Biol Qiem 283,22867-22874 (2008). 11. Chen，J.，Liu，M.Y.，Parish，C.民.，Chong，B.H. & Khachigian，L. Nuclearimport of early growth response-1 involvesImportin-7 and the novel nuclear localization signal serine-proline-serine. Int J Biochem Cell Biol 43,905-912 (2011). 12. Freedman,N.D. & Yamamoto，K.民.Importin 7 andimporti n alpha/importin beta are nuclearimport receptors for the glucocorticoid receptor. Mol Biol Cell 15,2276-2286 (2004). 13. Lubert，E.J.狂 Sarge，K.D. Interaction between protein phosphatase 2A and members of theimportin beta superfamily. Biochem Biophys Res Commun 303， 908-913 (2003). 14. Lai，M.C.，Kuo，H.W.，Chang，W.C. & Tarn，W.Y. A novel splicing regulator shares a nuclearimport pathway with S民 proteins. Embo J 22,1359-1369 (2003). 15. Tao，T.，Lan，J.，Lukacs，G.L.，Hache，民.J. & Kaplan,F.Importin 13 regulates nuclearimport of the glucocorticoid receptor in airway epithelial cells. American journal of respiratory cell and molecular biology 35,668-680 (2006)〇
[0287] 为了验证这些相互作用，在MC巧细胞中重复CoIP实验，并在HeLa细胞中检测表达 的MAPK与Imp的相互作用。两个实验均证实Imp3/7/9的IP不仅对内源HeLa蛋白质是特异的 (图10A-B)。另外，执行邻近连接测定（PLA)，其是蛋白质-蛋白质相互作用研究的不依赖 CoIP的工具。类似于CoIP的结果，在测试的Imp和MPK之间没有检测到显著的基本相互作用 (图1B)。然而，茵香霉素或TPA刺激引起JNK1 / 2或ρ38α/目与Imps 3 / 7 / 9之间的相互作 用的显著增加。如预计的Imps的穿梭作用，相互作用主要在细胞质和核周区域发现。这些结 果表明Imp 3 / 7 / 9与MAPK的刺激的相互作用首先发生在细胞质中，输入蛋白在穿梭时 或在转位之后立即从MAPK脱离。
[0288] 实施例3 Imp3、7和9是JNK1/2或ρ38α/目转位至细胞核所需的 为了进一步证实Imp3/7/9在JNK1 / 2或ρ38α/目的核转位中的作用，使用他们的Si-RNA 执行敲除实验。将Imp5敲除。且将不相关的Si-RNA作为对照。四种测试Imp的Si-RNA的相应 Imp量在48小时内减少超过85% (图2A-C)。这些敲除在静止细胞中没有影响内源JNK1 / 2 或ρ38α/β的胞质定位。然而，敲除Imp3/7/9,而不是Imp5或Si-对照，显著调整了测试的ΜΑΡΚ 的受刺激的核穿梭。敲除Imps抑制了约80%细胞的转位作用，而Imp?和Imp9的Si-RNA仅抑制 了~60%的转位作用。为了进一步研究敲除Imp3/7/9对JNK1 / 2或ρ38α/β转位作用的影响， 本发明人检验了核JNK / ρ38底物C-化η、ATF-2和MEF2A的憐酸化作用。重要地，全部Ξ种 Si-RNA显著抑制了运些转录因子的刺激-诱导的憐酸化作用，虽然Imp3的Si-RNA的效果比 Imp7 / 9的效果略高（图2C)。在任何其他的蛋白质的检验中没有发现Si-RNAs对ER畔己C- Myc (图11)的效果或其他的非祀效果。因此，其显示Ξ种Imp对JNK1 / 2和ρ38α/β的转位作 用是重要的，虽然Imp3的作用可W更一般。
[0289] 为了参与转位过程，可W不同于Imp α/β，在刺激下Imps 3 / 7 / 9改变他们的定 位。的确，发现（图12A-B)对HeLa和HB2细胞的刺激引起Imp3/7/9从细胞质到核周区 (Imp3)，或进入细胞核（Imp? / 9Μπφβ定位完全不受刺激影响。运些结果表明所有Ξ个 Imp对JNK1 / 2或ρ38α/β的核转位来说都是重要的，其可W通过交换，或可W通过转位复合 物的形成来发挥作用。最后，如依赖b-类似Imp在Ran活性中预期的，使用Ran的Si-RNA，发 现JNK和p38的转位确实是Ran-依赖的（图13)。运些观测暗示β-样Imp在应激-和促有丝分裂 的-诱导过程中的作用，表明他们在细胞刺激下可W调节转录。
[0290] 实施例4 通过特异性N-末端序列，JNK1/2和ρ38α/β与Imp?或Imp9相互作用 为了获得对MAPK-Imp相互作用的更好的了解，本发明人研究了GST-p38a/e和GST- JNK1 / 2与从不受刺激或受刺激的化La细胞的提取物中的Imp的体外相互作用。虽然预期 MAPK与来自受刺激的细胞的Imp7 / 9相互作用，但是没有检测到与Imp3的体外相互作用 (图3A)。此外，CoIP实验展示Imp 3对于JNK和p38与Imp? / 9的相互作用不是必须的（图3B 相对于图1)。运些结果表明JNK和p38仅与Imp7或Imp9直接相互作用，并且该相互作用不需 要Imp3。
[0291] 本发明人接下来对JNK和p38上介导与Imp7和Imp9相互作用的位点进行确定。为了 该目的，将靠近ρ38α激酶结构域的C和N末端区域的各区域缺失，并且检测运些缺失对其在 亚细胞定位和激酶的输入蛋白相互作用中的影响（图14A-C)。Ν和C末端结构域两者的缺失 都会导致ρ38α的胞质定位，然而，仅有Ν末端缺失（ΑΑ 1-30)防止了刺激性转位和Imp? / 9 相互作用，指示了该区域对转位的重要性。为了定位转位所需的正合序列，发明人进一步细 分了 N-末端，通过缺失激酶首先的7个或20个残基。重要地，运两个另外的突变没有影响转 位或与Imp? / 9的结合，显著表明重要的序列位于ρ38α的第20位-第30位残基。
[0292] 为了进一步研究ΜΑΡΚ的核转位中确定区域的作用，本发明人合成了一条基于ρ38α 的21-34残基序列肤序列：Myr-阳RYQ化SPVGSGA-SEQ ID NO : 16)的14个氨基酸的肉豆違 酷化的肤。因为该区域在p38bW及JNK1和JNK2中相似，假设其应当与所有四个ΜΑΡΚ和Imp? / 9的相互作用相竞争，并从而影响他们的核转位。的确，当该肤在刺激前应用于HeLa细胞 时，其阻止了检验的MPK的核转位（图4A)和Imp? / 9相互作用（图4B)。因此，运些结果清楚 地证实JNK / p38同种型中氨基末端调节核转位的重要性，并且表明该肤可W用于研究转 位的作用和其临床参与。
[0293] 实施例5 Imp7/9-JNK/p38复合物与憐酸化Imp3相互作用 ΜΑΡΚ与Imp3/7/9在细胞中的相互作用（图1A-B)提出了一个问题，即每个输入蛋白在核 转位过程的作用是什么。事实是Imp3的SiRNA比Imp7 / 9的siRNA具有更高的效果（图2A- C)，Imp3不与JNK1 / 2或ρ38α/β在体外直接相互作用（图3A)，且Imp3不是MAPK与Imp? / 9 的相互作用所需的（图3B)，导致产生运样一种假设，MAPKs结合至Imp7或Imp9，随后Imp3加 入二聚体使其进行核转位。
[0294]为了验证该假设，并确立内源Imp3/7/9之间的复合物形成，本发明人通过PLA监控 运些可能的相互作用。在静止化La细胞中没有检测到任何测试输入蛋白之间的相互作用 (图5A，B)。然而，在刺激后会发生显著改变，其诱导了 Imp3和Imp7或Imp9之间的相互作用， 但Imp7和Imp9之间没有。运些结果随后通过受刺激的化La细胞提取物的CoIP实验进行了 确认。有趣地，来自未受刺激或刺激细胞的重组Imp7和Imp9与Imp3的体外相互作用（图加） 证明在刺激后Imp3被修饰，使得其可W发生相互作用。使用碱性憐酸酶（CIP)处理细胞提 取物减少了相互作用，显著指示Imp3与Imp? / 9的相互作用需要Imp3的憐酸化。
[029引实施例6 MAPK-Imp相互作用的凝胶过滤分析 为了进一步验证该机制，执行凝胶过滤W将未结合的蛋白质从更高MW的复合物分离。 的确，来自静止细胞的Imp3/7/9显示了他们预期的单体MW (Imp3:约90 W)a;Imp7 / 9:约 120 kDa;图5A)Jmp3也显示了约160 kDa的峰，其可W代表蛋白质的同源或异源二聚体/Ξ 聚体。有趣的是，在另一个220-400 W)a (指定为约280 kDa)的峰发现了少量的所有Ξ种未 受刺激的Imp(图6A)。相对宽的约280峰可W对应于Imps的二聚体，或包含Imps的二聚体与 其他的30-80 W)a蛋白质（例如MAPKs)的异源Ξ聚体，或Imps与任意高MW蛋白质（100-200 kDa)的复合物。重要的是，来自刺激细胞提取物的各种峰的Imps的相对量都发生了显著的 改变。因此，较低峰的Imps3 / 7 / 9的量显著减少，而较高的那些对相应升高。平行地， 在刺激后JNK和p38从约40 kDa的尖峰变成了很宽的峰（图15A-B)。
[0296] 为了确定Imp和MAPK的较高丽峰是由（至少部分地)MAPK和Imp的二聚体之间的相 互作用形成，执行了CoIP实验。正期望的，在约120 W)a峰没有发现组分之间的结合（图6B); 在Imp3的较高的歷峰（约160 kDa)也是该情况。在另一方面，来自刺激的、280 kDa峰的 Imp3/7/9免疫共沉淀JNK和p38蛋白质。另外，Imp3于Imp7和Imp9两者CoIP，而在Imp7和Imp9 之间没有发现相互作用。还在较高MV部分中观察到Imp7和Imp9之间缺少相互作用，清楚地 指出在刺激后没有形成Imp3/7/9S聚体。在不同的刺激下没有观测到MAPK^mp结合亲合性 上可区分的刺激，指示了二聚体与MAPK的剩余活性。运些结果进一步支持了该观点：在刺激 后Imp3与Imp7/MA服或Imp9/MAPK二聚体相互作用，并且异源Ξ聚体是合适转位至核中所需 的。
[0297] 实施例7 肉豆違酷化肤治疗结肠炎的用途 材料和方法 细胞培养和转染：将化La细胞培养于补充有2 ml k谷氨酷胺、1% Pen/S化ep和10% 胎牛血清(FBS)的Du化ecco氏改良化gle氏培养基中。
[0298] 免疫巧光显微术:将细胞在3%仲甲醒的PBS溶液中固定（20分钟，23 并在含2 %牛血清白蛋白（BSA)的PBS中溫育（15分钟，23 随后用Triton X-100 ( PBS中浓度 为0.1 %，5分钟，23 η〇透化。将固定细胞与初级抗体（60分钟，23 °C)，用PBS洗涂Ξ次， 与罗丹明-共辆二级抗体和DAPI溫育（60分钟，23 °C)。之后用巧光显微镜（Olympus BX51，x40放大率)观察载玻片。使用化otoshop ( Adobe，CA，USA)执行原始数据图像的背景 校正和对比度调节。
[0299] DNA 构建体和突变。将 GFP-JNKl/2、p38a/e 克隆至祀 GFP-C1 (Clontech，Mountain View，CA)。从HeLa细胞cDNA中扩增JNK1/2 和ρ38α/β序列，并对JNK2和ρ38β由EcoRI / BamHI作为侧翼，对JNK1和ρ38α由趾〇1 / BamHI作为侧翼。JNK1/2和ρ38α/β的点突变通过 定位诱变执行。将GST-JNKl/2、p38a/e克隆至PGEX-2T载体中（GE healthcare, Buckin曲amshire，UK)并由翼Spel / Notl限制位点作为侧翼。GFP- ρ38α的N或C末端缺失 突变使用特异性引物来构建Α7 / Δ20 / Δ30 Ν-末端缺失突变或Δ40 C-缺失突变。将 输入蛋白3、7、9克隆至祀GFP-C。使用特异性引物从化La细胞cDNA中扩增输入蛋白7和9，其 使用对输入蛋白7引由BamHI / Sail作为侧翼的特异性引物、对输入蛋白9由趾〇1 / Sail 作为侧翼的特异性引物。从Fore化eimer库质粒保存站获得输入蛋白3,使用由趾〇1 / EcoRI作为侧翼的特异性引物进行扩增。
[0300] 肉豆違酷化肤：肉豆違酷化肤是特异性设计的（口6口^(162.0，￥4，1]54)。肤序列： KPERYQ化SPVGSGA - SEQ ID NO: 9 (ρ38α的第21 位-第：34位残基）和 KPERYQNLSPVAAAA (沈Q ID NO: 10)。
[0301 ] CoIP:产生细胞提取物并与预连接特异性抗体(1小时，23°C)的A/G-琼脂糖小珠 溫育2小时(4T，震荡）。洗涂结合的A/G小珠、重悬（1.5X样品缓冲液）、煮沸，并进行蛋白免 疫印迹。
[030引邻近连接分析（化A):根据生产商的方案使用Duolink PLA试剂盒（Olink Bioscience)检测蛋白质-蛋白质相互作用。简言之，使细胞如前文描述的生长、固定和透 化。随后将样品与针对两种受检验的蛋白质的初级抗体溫育（60分钟，23 °C)、洗涂（ 0.01 Μ Tris HC1 pH 7.4,0.15 Μ化C1和0.05%吐溫20)，并随后与特异性探针溫育（60 分钟，37 °C)，然后使用DAPI染色W使得细胞核显像，并进行洗涂（0.2 Μ Tris HC1 pH 7.5,0.15 Μ化Cl)。信号通过巧光显微镜（Olympus BX51，x40放大率)观察到清楚的巧光 点。使用化otoshop和ImageJ执行原始数据图像的背景校正、对比度调节和巧光信号定量。
[0303] 体外相互作用测定：细胞提取物如上文所述的方法生产，与预先与特异性抗体连 接（1小时23 °C)的A / G-琼脂糖小珠溫育2小时（4 °〇。结合的A / G小珠随后用RIPA 缓冲液洗涂一次，然后用0.5M LiCl洗涂两次，用缓冲液A.洗涂两次。使用含有0.01 % BSA 的缓冲液A重悬结合的A / G小珠并等分。GST标记的蛋白质与小珠溫育2小时（4 "C，振 荡），随后在1.5 X样品缓冲液中洗涂并重悬，并煮沸。
[0304] 体外憐酸化测定:HeLa细胞长至分汇合，血清饥饿(0.1% FBS，16小时），随后用刺 激物或其他药物处理。如上文所述的方法生产细胞提取物，并与预先与特异性抗体连接（1 小时23 °C)的A / G-琼脂糖小珠溫育2小时（4句。结合的A / G小珠随后用RIPA缓冲 液洗涂一次，然后用0.5M LiCl洗涂两次，用缓冲液A.洗涂两次。源自刺激细胞的结合的A / G小珠样品随后与小牛小肠憐酸酶（37°C，1小时，肥B，ΜΑ，USA)溫育，随后洗涂。随后样品 在含有0.01 % BSA的缓冲液A中重悬。等分-GST标记蛋白质与小珠溫育2小时（4 °C，2小 时），随后洗涂并重悬于样品缓冲液中，煮沸。
[0305] 亚细胞分级：{ TC"细胞分级"\1 2}。亚细胞分级按照如下执行，将收获的细胞重 悬于200 μ1含有0.1% Nonidet P-40的缓冲液Η中。将裂解产物如上文用力混合并立即离 屯、，W产生含有细胞质级分的上层清液。通过下列步骤提取核蛋白质:在20化1提取缓冲液 中重悬细胞核团块，在冰上放置5分钟，短暂超声处理(2巧秒，40W，4°C)，用力混合并离屯、。 使用Coomassie蛋白质测定试剂(Pierce)确定蛋白质浓度。对细胞质和核级分两者均进行 蛋白质印迹。
[0306] 凝胶过滤：使化La细胞血清饥饿（如上），并随后用茵香霉素（Anis，0.5yg/ ml, 15分钟)和ΤΡΑ (250 nM，15分钟)刺激或不处理(NT)。细胞提取物(各处理25 mg)置于16/ 60 superdex200大小的柱中（流速1ml /分钟），收集1ml级分。使用具有合适抗体的蛋白质 印迹法对级分进行分析。
[0307] 统计学分析:数据用平均数+ S.E来表示。统计学评估用泛函分析和Student's t 检验(双尾)来检测对照和实验结果之间的差异。P < 0.05的值被认为是统计学显著的。
[0308] 体内实验:将21只雄性C57BL小鼠称重，随后注射（I.V)肤（15 mg/千克）、乱序肤 (15mg/Kilo)或DMS0 (2%)。注射24小时后将小鼠的饮用水换为含有DSS ( 1.25%)的水、 肤、乱序肤或DMS0每48小时注射。在替换饮用水7天后将小鼠处死，并使用内窥镜和小鼠体 重来评价结肠炎。
[0309] 结果 本发明人检验了使用FITC-共辆的肉豆違酷化肤的肉豆違酷化肤的胞内分布和稳定 性，并发现肤有效地穿透细胞，并甚至在24小时后还留在细胞质中（图16)。接着我们证明了 肤在DSS-诱导结肠炎模式中的潜在治疗利用。使用肤治疗的小鼠证明相比于使用对照肤治 疗的小鼠，减轻了DSS-诱导结肠炎(展示了平均体重损失和结肠中病灶的数目（图17A-C))。 然而该肤与熟知的激酶结构域1( 一种保守的蛋白质结构域)部分重合。为了克服该问题，发 明人通过使用Ala残基取代该区域而对肤进行了修饰(图18A-B)。他们接着证明该新设计的 肤抑制p38与Imp7的相互作用，并防止了 JNK和p38 MAPK的刺激-诱导的核转位，而不影响 MPK的刺激-依赖的激酶活性(图19-21)。
[0310] 虽然发明已经连同其特定的实施方案进行了描述，对于本领域技术人员很多代 替、修改和变化是显而易见的。因此，意在将所有运样的代替、修改和变化包含在在附带的 权利要求的精神和范围内。
[0311] 该说明书中的所有出版物、专利和专利申请都在W其整体通过引用并入说明书， W相同的程度好像各个出版物、专利或专利申请是具体地和分别地指示在此通过引用并入 本文。另外，该申请中的任何参考的应用和鉴定不应当被解释为承认的，运样的参考可作为 本发明的现有技术获得。在运一程度上，先前使用的部分不应当被解释为必要限制性的。
【主权项】
1. 一种经分离的肽，其包含与SEQ ID NO: 1 (PERYQNLSPV)所示的序列至少80%同源的 氨基酸序列，所述经分离的肽包含核靶向活性，所述肽不超过20个氨基酸。2. -种经分离的肽，其包含与SEQ ID NO: 1 (PERYQNLSPV)所示的序列至少80%同源的 氨基酸序列，所述经分离的肽能够防止Ρ38α核转位，所述肽不超过20个氨基酸。3. 权利要求1或2的经分离的肽，其包含与SEQ ID NO: 8 (KPERYQNLSPV)所示的序列至 少80%同源的序列。4. 权利要求1或2的经分离的肽，其包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO :8所示的序列。5. 权利要求1或2的经分离的肽，其中所述氨基酸中至少一个是合成氨基酸。6. 权利要求1或2的经分离的肽，其中所述氨基酸中至少一个是D型立体异构体。7. 权利要求1或2的经分离的肽，其中所述氨基酸中至少一个是L型立体异构体。8. 权利要求1或2的经分离的肽，其中异源物质通过接头连接至所述氨基酸序列上。9. 权利要求1或2的经分离的肽，其包含选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO: 2 (PERYQNLSPVG)、SEQ ID NO: 3 (PERYQNLSPVGS)、SEQ ID NO: 4 (PERYQNLSPVGSG)和SEQ ID NO: 5 (PERYQNLSPVGSGA)、SEQ ID NO: 6 (KPERYQNLSPVGSGA)和SEQ ID NO: 7 (KPERYQNLSPVAAAA)〇10. 权利要求1-3中任一项的经分离的肽，其是肉豆蔻酰化的。11. 在受试者中治疗炎性病症或免疫病症的方法，所述方法包括对受试者施用治疗有 效量的权利要求1-10中任一项所述的经分离的肽，从而治疗所述炎性疾病或免疫疾病。12. 权利要求11的方法，其中所述免疫病症是自身免疫病症。13. 权利要求11的方法，其中所述炎性疾病是结肠炎。14. 权利要求1-10中任一项的肽，其用于在治疗炎性病症或免疫病症中使用。15. -种物质组合物，其包含权利要求1-10中任一项的经分离的肽和通过接头连接至 所述氨基酸序列的异源物质。16. 权利要求15的物质组合物，其中所述异源物质选自多肽、核酸、小分子和碳水化合 物。17. 权利要求15的物质组合物，其中所述异源物质是多肽。18. 权利要求15的物质组合物，其中所述异源物质是药剂。19. 权利要求18的物质组合物，其中所述药剂是治疗剂、化妆剂或诊断剂。20. 权利要求15的物质组合物，其通过接头连接至可检测部分。21. 权利要求15的物质组合物，其中所述接头包含肽键。22. 权利要求15的物质组合物，其中所述接头包含非肽键。23. 权利要求15的物质组合物，其通过接头连接至亲和部分。24. 权利要求23的物质组合物，其中所述亲和部分选自抗体、受体配体和碳水化合物。25. -种经分离的多核苷酸，其包含编码权利要求1-9中任何的肽的核酸序列。26. -种核酸构建体，其包含权利要求25的经分离的多核苷酸。27. 权利要求26的核酸构建体，其进一步包含用于调节多核苷酸表达的顺式调节元件。28. 权利要求26的核酸构建体，其中所述经分离的多核苷酸转录地融合至编码目的异 源多肽序列的核酸序列中。29. -种经分离的细胞，其包含权利要求26的核酸构建体。30. 权利要求29的经分离的细胞，其是真核的。31. 权利要求30的经分离的细胞，其中所述真核细胞是酵母细胞。32. -种将物质靶向至宿主细胞的细胞核的方法，所述方法包括将物质引入至宿主细 胞中，所述物质连接于权利要求1-10的肽上。33. -种将物质靶向至宿主细胞的细胞核的方法，所述方法包括将权利要求1-10中任 一项的肽引入至宿主细胞，将所述肽连接至能够结合所述物质的亲和部分。34. 权利要求33的方法，其中所述物质是内源物质。35. 权利要求33的方法，其中所述物质是外源物质。36. 权利要求35的方法，其进一步包括在所述引入之前、伴随所述引入或在所述引入之 后对所述宿主细胞施用所述外源物质。37. 权利要求32或33的方法，其中所述宿主细胞是分裂细胞。38. 权利要求32或33的方法，其中所述宿主细胞是非分裂细胞。39. 权利要求32或33的方法，其中所述物质选自多肽、核酸、小分子或碳水化合物。40. 权利要求32或33的方法，其中所述物质是核酸。41. 权利要求40的方法，其中所述核酸通过选自下述的方法引入至所述宿主细胞中：显 微注射、电穿孔、磷酸钙共沉淀、DEAE葡聚糖引入、脂质体介导的引入、病毒介导的引入、裸 DNA注射和生物射弹轰击。42. 权利要求32或33的方法，其中所述靶向在体内有效。43. 权利要求32或33的方法，其中所述靶向在先体外后体内有效。44. 权利要求32或33的方法，其中所述靶向在体外有效。45. 权利要求32的方法，其中所述宿主细胞是真核细胞。46. 权利要求45的方法，其中所述真核细胞是酵母细胞。47. -种药物组合物，其包含权利要求1-9中任一项所述的肽，作为活性剂，和药物可接 受载体。
【专利摘要】公开了一种经分离的肽，所述肽包含与SEQ？ID？NO：1（PERYQNLSPV）所示的序列至少80%同源的氨基酸序列，所述经分离的肽包含核靶向活性，所述肽长度不超过20个氨基酸。
【IPC分类】C07K7/06, A61K38/10, A61P37/00, C07K7/08, A61K38/08
【公开号】CN105555796
【申请号】CN201480036061
【发明人】R.塞格, E.泽霍赖
【申请人】耶达研究及发展有限公司
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2014年4月24日
【公告号】EP2989119A1, US20160052967, WO2014174520A1, WO2014174520A8
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