用于鉴定布罗莫结构域抑制化合物的融合蛋白和方法
用于鉴定布罗莫结构域抑制化合物的融合蛋白和方法
【专利说明】用于鉴定布罗莫结构域抑制化合物的融合蛋白和方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本专利申请要求2013年3月15日提交的美国申请系列第61/798,644号和2013年11 月11日提交的美国申请系列第61/902,690号的优先权的权益，所述申请通过引用并入本 文。
[000引背景
[0004] 染色质是DNA与蛋白质的复杂组合。其在真核细胞的细胞核内被发现并且被分为 异染色质(凝聚的）和常染色质（展开的）形式。组蛋白是染色质的主要蛋白质组分，用作DNA 围其缠绕的线轴。染色质的功能是将DNA包装成更小的体积W容纳进细胞，增强DNAW使得 能够进行有丝分裂和减数分裂，W及用作控制表达和DNA复制的机构。染色质结构由一系列 对组蛋白尤其是组蛋白H3和H4的翻译后修饰（最常见地在延伸至核屯、核小体结构外部的 "组蛋白尾"内）控制。组蛋白尾易于释放出来参与蛋白质间相互作用，并且也是最易受到翻 译后修饰的组蛋白的部分。运些修饰包括乙酷化、甲基化、憐酸化、泛素化、SUMO化。运些表 观遗传标志物通过特殊酶书写和删除，所述酶将标签置于组蛋白尾内的特定残基上，从而 形成表观遗传密码，所述密码随后由细胞解释W允许染色质结构的基因特异性调控，并从 而允许转录。
[0005] 在所有种类的蛋白质中，组蛋白是其中最易于受到翻译后修饰的。组蛋白修饰是 动态的，因为它们可响应于特定刺激而被添加或除去，并且运些修饰指导染色质的结构变 化和基因转录的变化。不同种类的酶，即组蛋白乙酷基转移酶(HAT)和组蛋白脱乙酷基酶 化DAC)，使特定的组蛋白赖氨酸残基乙酷化或去乙酷化(Str化1 K.，Genes Dev.，1989，12， 5,599-606)〇
[0006] 组蛋白的共价修饰是基因表达的基本控制机制，和在真核细胞中起作用的主要表 观遗传机制之一化ouzarides,Cell ,128,693-705(2007))。因为不同的转录状态确定基本 细胞过程，诸如细胞类型规范、谱系定型、细胞活化和细胞死亡，所W它们的异常调控是一 系列疾病的核屯、（Medzhi to V等，Nat. Rev . Immunol. ,9,692-703(2009); Porte la等， Nat.Biotech. ,28,1057-1068(2010))。基因表达的表观遗传控制的基本组成部分是具有结 合于此类修饰的专口基序的蛋白质对组蛋白修饰的解释。其中，布罗莫结构域已演化来结 合于乙酷化组蛋白并且通过运样做，他们代表了染色质结构与基因转录之间的根本联系 (Fi 11 ipakoppou 1OS等，Ce 11，149，214-231 (2012))。
[0007] 布罗莫结构域，其长度约为110个氨基酸，在大量染色质结合蛋白中均有发现，并 且已在约70种人蛋白质中被鉴定，通常与其它蛋白质基序相邻(Jea皿ougin F.等，Trends Biochem.Sci. ,1997,22,5,151-153;和 Tamkun J.W.等，Cell ,1992,7,3,561-572)。布罗莫 结构域与经修饰的组蛋白之间的相互作用可W是染色质结构变化和基因调控背后的重要 机制。含布罗莫结构域的蛋白质已牵设疾病过程包括癌症、炎症和病毒复制。参见，例如， Prinjha等，Trends 陆arm.Sci. ,33(3): 146-153(2012)和Muller等，Expert Rev. ,13(29): 1-20(2011年9月）。
[0008] 细胞类型特异性和适当的组织功能性需要最终受它们的环境影响的不同转录程 序的严格控制。对该转录稳态的改变与许多疾病状态直接相关，最特别地是癌症、免疫炎 症、神经性障碍和代谢疾病。布罗莫结构域存在于用于控制独特的疾病相关转录途径的关 键染色质修饰复合物内。运通过含有布罗莫结构域的蛋白质中的突变与癌症W及免疫及神 经功能障碍相关的观察得W突显。因此，跨家族的布罗莫结构域的选择性抑制为作为人功 能障碍的新型治疗剂创造各种机会。
[0009] 存在对癌症、免疫性病症和其它布罗莫结构域相关疾病的治疗的需要。运样，需要 用于鉴定为布罗莫结构域抑制化合物的化合物的方法。
[0010] 本文中引用的所有参考资料，包括专利申请和出版物通过引用整体并入。
[00川概述
[0012] 本文中提供了包含至少一个染色质结合模块和至少一个报告模块的融合蛋白和 其使用方法。本发明的一个方面是包含至少一个染色质结合模块和至少一个报告模块的融 合蛋白，其中多个融合蛋白能够再定位和/或形成斑。
[0013] 在任何融合蛋白的某些实施方案中，融合蛋白包含含有至少一个染色质结合模块 的第一染色质结合多肤，其中所述第一染色质结合多肤的染色质结合模块的至少一个已被 缺失、被第二染色质结合多肤的至少一个染色质结合模块取代和/或替代。在某些实施方案 中，融合蛋白包含含有至少一个染色质结合模块的第一染色质结合多肤，其中所述第一染 色质结合多肤的染色质结合模块的至少一个已被第二染色质结合多肤的至少一个布罗莫 结构域模块替代。
[0014] 在任何融合蛋白的某些实施方案中，融合蛋白包含1、2、3、4、5和/或6个染色质结 合模块中的约任一个。
[0015] 在任何融合蛋白的某些实施方案中，所述报告模块是巧光报告模块。在某些实施 方案中，所述报告模块包括EGFP、TurboGFP、dsRed2、dsRed-Express2或ZsGreen。
[0016] 在任何融合蛋白的某些实施方案中，所述融合蛋白包含核定位信号(NLS)。在某些 实施方案中，所述化S是SV40大T-抗原化S或核浆素的化S。
[0017] 在任何融合蛋白的某些实施方案中，所述染色质结合模块位于报告模块的5'。在 任何融合蛋白的某些实施方案中，所述染色质结合模块位于报告模块的3'。
[0018] 在任何融合蛋白的某些实施方案中，所述染色质结合模块是布罗莫结构域模块， P皿指模块、染色质域模块、MBT结构域模块、tudor结构域模块、PWWP结构域模块、A孤结构域 模块、Zf-CW结构域模块、错蛋白重复模块或WD40模块。在某些实施方案中，所述染色质结合 模块是布罗莫结构域模块。
[0019] 在任何融合蛋白的某些实施方案中，所述至少一个布罗莫结构域模块包含BRG1、 PCAF/KAT2B、BAZ2B、B畑1、B畑8、BRFP1、BRFP3、BRG1、CBP/CREBBP、PCAF/KAT2B、TRIM24和/或 ZMYND8的任一个的至少一个布罗莫结构域。在某些实施方案中，所述至少一个布罗莫结构 域模块包含B畑2、B畑3、B畑4、BRD9、B畑T和/或BRG1的任一个的至少一个布罗莫结构域。在 某些实施方案中，所述至少一个布罗莫结构域模块包含81?61、81?^1八60?2、？〔4。和/或了八尸1 的任一个的至少一个布罗莫结构域。在某些实施方案中，所述至少一个布罗莫结构域模块 包含BRD4和/或BRD9的至少一个布罗莫结构域。
[0020] 在任何融合蛋白的某些实施方案中，所述布罗莫结构域多肤包含BRGUPCAF/ ZMYND8的任一个或包含至少一个布罗莫结构域模块的其片段的氨基酸序列。在某些实施方 案中，布罗莫结构域多肤包含BRD2、B畑3、BRD4、B畑9、BRDT和/或服G1的任一个或包含至少 一个布罗莫结构域模块的其片段的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述布罗莫结构域多 肤包含81?61、81?^1^60?2、？〔4。和/或了4。1的任一个或包含至少一个布罗莫结构域模块的 其片段的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述布罗莫结构域多肤包含服D4和/或服D9或包 含至少一个布罗莫结构域模块的其片段的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述布罗莫结 构域多肤包含全长布罗莫结构域多肤。
[0021] 在任何融合蛋白的某些实施方案中，融合蛋白能够多聚化。在某些实施方案中，融 合蛋白能够形成二聚体、Ξ聚体或四聚体。在某些实施方案中，融合蛋白能够形成二聚体。 在某些实施方案中，融合蛋白能够形成四聚体。
[0022] 本发明的一个方面是编码本文所述融合蛋白的核酸序列（例如，DNA或RNA)。本发 明的一个方面是包含所述核酸序列的表达盒。本发明的一个方面是包含所述表达盒的细 胞。
[0023] 本发明的一个方面是包含本文所述融合蛋白的细胞。
[0024] 在某些实施方案中，所述细胞是C册-KUC0S-7、肥K293、肥K293T、肥K293FT、HeLa、 MDCK或U20S细胞。在某些实施方案中，所述细胞是COS-7、化La或U20S细胞。
[0025] 本发明的一个方面是用于确定测试化合物是否是布罗莫结构域抑制化合物的方 法，所述方法包括(a)将包含含有至少一个染色质结合模块和至少一个报告模块的融合蛋 白的本文所述细胞与所述测试化合物接触和(b)确定所述测试化合物是否诱导融合蛋白的 再定位和/或增加融合蛋白斑的形成，其中融合蛋白的再定位和/或斑的形成的增加表明所 述测试化合物是布罗莫结构域抑制化合物。
[0026] 本发明的一个方面是包含本文所述融合蛋白、核酸、表达盒或细胞的试剂盒。
[0027] 附图简述
[0028] 图1描绘本发明的某些融合蛋白。
[0029] 图2描绘显示当报告模块包含可形成多聚体(例如，二聚体或四聚体）的蛋白质时 融合蛋白响应于抑制剂而形成点/斑。
[0030] 图3描绘ZsGreen-BRD4融合蛋白（A)和在两个布罗莫结构域模块中具有阻止与染 色质结合的点突变的ZsGreen-BRD4融合蛋白（B)的定位。突变型ZsGreeen-BRD4融合蛋白即 使在抑制剂不存在的情况下亦被定位至细胞核中的点/斑块中（图3B)，而野生型融合蛋白 在相同条件下显示弥散定位(图3A)。
[0031] 图4描绘显示抑制化合物阻止布罗莫结构域结合染色质（其利用化echst 33342来 进行染色）的其它结果。
[0032] 图5描绘显示融合蛋白再定位的快速动力学的结果。可通过随后斑形成来实时监 测抑制剂的作用。
[0033] 图6描绘显示再定位和斑形成是可用于测定细胞环境中抑制剂的效力的可滴定表 型的结果。
[0034] 图7呈现关于响应于抑制剂的斑形成的可能机制的一个非限制性模型。
[003引图8A-B描绘在B畑2、BRD3、BRD4和B畑T布罗莫结构域抑制化合物JQ1不存在(A)和 存在(B)的情况下ZsGreen-BRD2融合蛋白的定位。JQ1处理导致ZsGreen-BRD2融合蛋白与染 色质的相互作用的破坏和点/斑的形成。
[0036] 图9A-B描绘在JQ1不存在(A)和存在(B)的情况下ZsGreen-BRD3融合蛋白的定位。 JQ1处理导致ZsGreen-B畑捕虫合蛋白与染色质的相互作用的破坏和点/斑的形成。
[0037] 图10A-B描绘在服D9布罗莫结构域抑制化合物抓i-B和抓i-C不存在(A)和存在(B) 的情况下BRD9-ZsGreen融合蛋白的定位。抑制剂处理导致BRD9-ZsGreen融合蛋白与染色质 的相互作用的破坏和点/斑的形成。
[0038] 图11A-B描绘BRD9-ZsGreen融合蛋白（A)和在布罗莫结构域模块中具有阻止与染 色质结合的点突变(N216Y)的BRD9-ZsGreen融合蛋白（B)的定位。缺少对染色质的结合亲和 力的突变型BRD9-ZsGreen即使在染色质抑制化合物不存在的情况下亦形成巧光点。
[0039] 图12A-D描绘使用DMSO(A)和BRD9布罗莫结构域抑制化合物BDi-D(B)的BRD9- mVenus融合蛋白的定位，和在布罗莫结构域模块中具有阻止与使用DMSO(D)处理的染色质 (C)的结合的点突变(N216Y)的突变型BRD9-mVenus的定位。布罗莫结构域抑制化合物和布 罗莫结构域突变都不导致巧光点/斑的形成。
[0040] 图13A-C描绘在CECR2布罗莫结构域抑制化合物BDi-E不存在(A)和存在(B)的情况 下化S-CECR2.BD-ZsGreen融合蛋白的定位。BDi-E处理导致当不结合于染色质时化S- CECR2.抓-ZsGreen斑的形成。
[0041] 图14描绘显示其它检测方法(其包括生物化学法诸如使用分级分离和免疫印迹） 的结果。
[0042] 图15A-B描绘在TAF1布罗莫结构域抑制化合物BDi-F不存在(A)和存在(B)的情况 下化S-TAF1. BD1. BD2-ZsGreen的定位。结果显示抑制剂破坏融合蛋白与染色质的结合，并 且融合蛋白在从染色质释放后形成斑。
[0043] 图16描绘在两个布罗莫结构域内都具有阻止对染色质结合的点突变的突变型 化S-TAF1.抓1.抓2-ZsGreen蛋白的定位(A)。结果显示即使在抑制化合物不存在的情况下 突变型融合蛋白亦形成斑(B)。
[0044] 图17A-B描绘在BAZ^布罗莫结构域抑制化合物BDi-G不存在(A)和存在(B)的情况 下BAZ2B-B畑9-ZsGreen融合蛋白（其中B畑9布罗莫结构域模块已被842沈的布罗莫结构域 模块替代的B畑9布罗莫结构域多肤）的定位。抓i-G处理导致BAZ2B-B畑9-ZsGreen融合蛋白 与染色质的相互作用的破坏和点/斑的形成。
[0045] 图18描绘在PCAF布罗莫结构域抑制化合物BDi-H不存在(A)和存在(B)的情况下， PCAF-BRD9-ZsGreen融合蛋白（其中BRD9布罗莫结构域模块已被PCAF的布罗莫结构域模块 取代的BRD9布罗莫结构域多肤）的定位。抓i-H处理导致PCAF-BRD9-ZsGreen融合蛋白与染 色质的相互作用的破坏和点/斑的形成。
[0046] 详述
[0047]本发明的某些方面设及包含至少一个染色质结合模块和至少一个报告模块的融 合蛋白，其中多个融合蛋白能够形成斑。运些融合蛋白可用于确定测试化合物是否是染色 质抑制化合物。本发明的某些实施方案提供利用所述融合蛋白确定测试化合物是否是染色 质抑制化合物的测定。虽然不必是本发明的限制，但据信在未处理状态下，融合蛋白通过染 色质结合模块与染色质之间的相作用结合染色质。例如，布罗莫结构域模块结合于乙酷化 染色质。当所述染色质结合模块结合位点被抑制剂阻断时，所述融合蛋白与染色质解离并 形成斑。细胞祀标衔接测定可用于监测w剂量依赖性方式进行的斑的形成。细胞核中的斑 可使用例如巧光检测，通过高容量显微镜来可视化和定量，W测定测试化合物作染色质抑 制化合物的效力。
[004引一般技术
[0049] 本发明的实践，除非另有说明，否则将使用分子生物学（包括重组技术）、微生物 学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述技术在本领域普通技术人员的能力范 围内。此类技术在文献中被全面解释，诸如"Molecular Cloning:A LaboratoiT Manual"， 第二版（Sambrook等，1989); "Oligonucleotide Synthesis" (Μ. J. Gait,编辑，1984); "Animal Cell Culture"(R. I.Freshney，编车茸，1987);"Methods in Enzymology" (Academic Press,Inc.);"Current Protocols in Molecular Biology"(F.M.Ausubel等， 编辑，1987,和定期更新）；''PCR:The Polymerase 畑 ain Reaction", (Mullis 等，编辑， 1994);"A Practical Guide to Mole州lar Cloning"(Perbal Bernard V.,1988)。
[0050] 可使用本领域中已知的标准技术产生本发明中使用或描述的寡核巧酸、多核巧 酸、肤、多肤和小分子。
[0051 ] 定义
[0052] 如本文中所用，术语"染色质结合模块"是指与染色质相互作用的染色质结合多肤 的区域和/或结构域的序列。染色质结合模块可包括，但不限于，下列结构域的至少一个： A孤、错蛋白重复序列、布罗莫结构域、染色质域、MBT、P皿指、PWWP、化dor、WD40或Zf-CW(也， 见Miyong化η等人Cell Research(2011)21:564-578,其在此通过引用整体并入）。
[0053] 如本文中所用，术语"染色质结合多肤"是指天然序列染色质结合多肤、天然序列 多肤的多肤变体和多肤变体(其在本文中被进一步定义）。本文所述染色质结合多肤可W是 从多种来源，诸如人组织类型或从另一种来源分离的，或通过重组或合成方法制备的染色 质结合肤。"天然序列染色质结合多肤"包括具有与来源于自然的对应染色质结合多肤相同 的氨基酸序列的多肤。染色质结合多肤包含至少一个染色质结合模块。
[0054] "染色质结合多肤变体"或其变型，意指如本文中定义的，与本文中公开的任何天 然序列染色质结合多肤序列具有至少约80%氨基酸序列同一性的染色质结合多肤，通常地 具有活性的染色质结合多肤。此类染色质结合多肤变体包括，例如，其中在天然氨基酸序列 的N末端或C末端上添加或缺少一个或多个氨基酸残基的染色质结合多肤。一般地，染色质 结合多肤变体将与天然序列染色质结合多肤序列具有至少约80%氨基酸序列同一性，可选 地至少约81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%或99%氨基酸序列同一性。一般地，染色质结合变体多肤的长 度为至少约10个氨基酸，可选地长度为至少约20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、 130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、 320、330、：340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、 510、520、530、540、550、560、570、580、590、600个氨基酸或更多氨基酸。任选地，染色质结合 变体多肤相较于天然染色质结合多肤序列将具有不超过一个保守氨基酸的取代，可选地相 较于天然染色质结合多肤序列将具有不超过2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸的取代。
[0055] 术语"布罗莫结构域模块"是指与染色质相互作用的布罗莫结构域多肤的布罗莫 结构域的序列。在某些实施方案中，所述布罗莫结构域模块包含全长布罗莫结构域。关于布 罗莫结构域结构和功能的一般综述，见，例如，Fi 1 ippakopou 1 οs等，Ce 11 149,214-231 (2012)，其在此通过引用整体并入。
[0056] 如本文中所用，术语"布罗莫结构域多肤"是指天然序列染色质结合多肤，天然序 列多肤的多肤变体和多肤变体(其在本文中被进一步定义）。本文所述的布罗莫结构域多肤 可W是从多种来源，诸如从人组织类型或从另一种来源分离的，或通过重组或合成方法制 备的布罗莫结构域多肤。"天然序列布罗莫结构域多肤"包括具有与来源于天然的对应布罗 莫结构域多肤相同的氨基酸序列的多肤。布罗莫结构域多肤包含至少一个布罗莫结构域模 块。
[0057] "布罗莫结构域多肤变体"或其变型意指如本文中定义的，与本文中公开的天然序 列布罗莫结构域多肤序列具有至少约80%氨基酸序列同一性的布罗莫结构域多肤，通常地 具有活性的布罗莫结构域多肤。此类布罗莫结构域多肤变体包括，例如，其中在天然氨基酸 序列的N或C末端上添加或缺失一个或多个氨基酸残基的布罗莫结构域多肤。一般地，布罗 莫结构域多肤变体将与天然序列染色质结合多肤序列具有至少约80%氨基酸序列同一性， 可选地至少约 81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%或99%氨基酸序列同一性。一般地，布罗莫结构域变体多肤的 长度为至少约10个氨基酸，可选地长度为至少约20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、 130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、 320、330、：340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、 510、520、530、540、550、560、570、580、590、600个氨基酸或更多氨基酸。任选地，布罗莫结构 域变体多肤将具有相较于天然布罗莫结构域多肤序列不超过一个保守氨基酸取代，可选地 相较于天然布罗莫结构域多肤序列不超过2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸取代。
[0058] 术语"报告模块"是指允许检测融合蛋白响应于阻止染色质结合模块的染色质结 合的化合物而发生的定位或分子性质的变化的氨基酸序列。例如，报告模块在在'结合'与 '末结合'状态之间引入了可测量的性质差异。例如，间接巧光法可用于使用针对TAG的抗体 检测TAG-BM-RM[ BM:结合模块，RM:报告模块]。
[0059] 术语"核酸"是指由含有糖、憐酸和为嚷岭或喀晚的碱基的单体(核巧酸)构成的脱 氧核糖核巧酸或核糖核巧酸和其聚合物，呈单链或双链形式。除非明确地受到限制，否则术 语涵盖含有天然核巧酸的已知类似物的核酸，所述核酸具有与参照核酸相似的结合性质并 且W与天然存在核巧酸相似的方式被代谢。除非另有说明，否则特定核酸序列还涵盖其保 守修饰变体(例如，简并密码子取代)和互补序列，W及明确地指出的序列。具体地，简并密 码子取代可通过产生其中一个或多个选定的（或所有)密码子的第Ξ位置被混合碱基和/或 脱氧肌巧残基取代的序列来实现。
[0060] 术语"核巧酸序列"是指可W是单链或双链的，任选地含有能够渗入DNA或RNA聚合 物的合成的、非天然的或改变的核巧酸碱基的DNA或RNA的聚合物。术语"核酸"、"核酸分子" 或"多核巧酸"可互换使用。
[0061] "分离的"多核巧酸是已与其天然环境的组分分离的多核巧酸。在一些实施方案 中，将抗体纯化至大于95 %或99 %的纯度，如通过例如电泳（例如，SDS-PAGE、等电聚焦 (IEF)、毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)测定的。关于用于多肤纯度的评估 的方法的综述，见，例如，Flatman等，J. Qiromatogr. B 848:79-87( 2007)。
[0062] "分离的"核酸是指已与其天然环境的组分分开的核酸分子。分离的核酸包括通常 含有核酸分子的细胞中包含的核酸分子，但所述核酸分子存在于染色体外，或存在于与其 天然染色体位置不同的染色体位置中。
[0063] 相对于参照多肤序列的"氨基酸序列同一性百分比（％ )"被定义为在比对序列和 引入缺口（必要时）W获得最大序列同一性百分比，并且不考虑任何保守取代作为序列同一 性的部分后，候选序列中与参照多肤序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。为 了测定氨基酸序列同一性百分比的比对可在本领域普通技术人员的能力范围内的各 种不同的方法来实现，例如，使用公共可获得的计算机软件诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或 Megal i gn (DNASTAR)软件来实现。本领域普通技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包 括在待比较的序列的全长范围内实现最大比对所需的任何算法。然而，为了本文中的目的， 使用序列比较计算机程序ALIGN-2来产生氨基酸序列同一性百分比值。ALIGN-2序列比较计 算机程序由Genentech，Inc.编写，并且源代码已与用户文档一起提交给美国版权局， Washington D. C .，20559，将所述源代码在美国版权局W美国版权登记号TX呪10087注册。 ALIGN-2程序是可从Genentech,Inc. ,Sou1:h San Rrancisco,California公共获得的，或可 从源代码编译而来。应当编译ALIGN-2程序W用于UNIX操作系统，包括数字UNIX V4.0D。所 有序列比较参数由ALIGN-2程序设置并且不变。
[0064] 在其中ALIGN-2用于氨基酸序列比较的情况下，如下计算给定的氨基酸序列A对、 与或针对给定的氨基酸序列B的氨基酸序列同一性百分比（运可选地可被表述为给定的氨 基酸序列A具有或包含对、与或针对给定的氨基酸序列B的某一氨基酸序列同一性百分比）： [006引 100X 分数 X/Y
[0066] 其中X为在A与B的该程序的比对中被序列比对程序ALIGN-2评分为相同的匹配的 氨基酸残基的数目，并且其中Y为B中的氨基酸残基总数。应理解，当氨基酸序列A的长度不 等于氨基酸序列B的长度时，A对B的氨基酸序列同一性百分比不等于B对A的氨基酸序列同 一性百分比。除非另外明确地说明，否则本文中使用的所有氨基酸序列同一性百分比值如 刚好前一段中所述使用ALIGN-2计算机程序获得。
[0067] 术语"大体同一性"，在肤的背景中，表示肤包含与参照序列在指定的比较窗中具 有至少 70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、 84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%，或94%或甚至95%、96%、97%、 98%或99%序列同一性的序列。在某些实施方案中，使用化edleman和Wunsch的同源性比对 算法(Needleman和Wunsch，JMB，48，443 (1970))来进行最佳比对。两个多肤序列大体上相同 的指示是一个多肤与针对第二肤产生的抗体具有免疫反应性。因此，例如当两个肤差异仅 在于保守取代时，肤与第二肤大体上相同。因此，本发明的某些实施方案提供与本文所述核 酸分子大体上相同的核酸分子。
[0068] 如本文中所用，术语"载体"是指能够增殖与其连接的另一个核酸的核酸分子。术 语包括作为自我复制核酸结构的载体W及被整合进其已被引入其中的宿主细胞的基因组 的载体。某些载体能够指导可操作地连接于它们的核酸的表达。此类载体在本文中被称为" 表达载体"。
[0069] "可操作地连接的"是指使得序列之一的功能通过另一个序列来实现的核酸序列 在单个核酸片段上的结合。例如，如果两个序列被运样放置W使得调控DNA序列实现编码 DM序列的表达(例如，编码序列或功能RNA处于启动子的转录控制下），则调控DM序列被认 为是"可操作地连接于"编码RNA或多肤的DNA序列或"与所述DNA连接的"。编码序列可W W 有义或反义方向可操作地连接于调控序列。当核酸被置于与另一个核酸序列的功能关系 时，该核酸是"可操作地连接的"。通常地，"可操作地连接的"意指待连接的DNA序列是连续 的。然而，增强子不必是连续的。连接通过在方便的限制性位点上连接来实现。如果此类位 点不存在，则按照常规实践来使用合成寡核巧酸连接物或接头。另外，可在表达载体中将多 个拷贝的编码酶的核酸连接在一起。运样的多个核酸可通过接头分隔。
[0070]"表达"是指内源基因或转基因在细胞中的转录和/或翻译。例如，在反义构建体的 情况下，表达可指仅反义DNA的转录。另外，表达是指有义(mRNA)或功能性RNA的转录和稳定 积累。表达还可指蛋白质的产生。
[00川如本文中所用，"表达盒"意指能够指导特定核巧酸序列在适当的宿主细胞中的表 达，包含可操作地连接于目标核巧酸序列（该序列可操作地连接于终止信号）的启动子的 DNA序列。其通常还包含进行核巧酸序列的正确翻译所需的序列。包含目标核巧酸序列的表 达盒可W是嵌合的，意指至少一个其组分相对于至少一个其的其它组分是异源的。表达盒 还可W是天然存在的但W用于异源表达的重组形式获得的表达盒。此类表达盒将包含连接 于目标核巧酸序列的转录起始区。可为此种表达盒提供多个限制性位点来用于插入目标基 因，W使其处于调控区的转录调控下。表达盒可另外地含有可选择的标记基因。
[0072] 术语"宿主细胞"、"宿主细胞系"和"宿主细胞培养物"可互换使用并且指已向其中 引入了外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括"转化体"和"转化细胞"，其包 括原代转化细胞和来源于其而不考虑传代次数的后代。后代可能在核酸含量方面与亲代细 胞不完全相同，但可含有突变。本文中包括具有与针对其筛选或选择初始转化细胞的功能 或生物活性相同的功能或生物活性的突变型后代。
[0073] 如本文中所用，术语"可测量的亲和力"和"可测量地抑制"是指（i )包含布罗莫结 构域抑制剂或其组合物和此类布罗莫结构域的样本与（ii)在所述化合物或其组合物不存 在的情况下，包含此类布罗莫结构域的等量样本之间的布罗莫结构域的活性的可测量降 低。
[0074] 如本文中所用，短语"大体上相似的"是指两个数值(通常一个与分子相关并且另 一个与参照/比较分子相关)的充分高的程度的相似性，运使得本领域普通技术人员可认为 所述两个值之间的差异在通过所述值(例如，Kd值)测量的生物特征的背景中不具有统计显 著性。所述两个值之间的差异作为参照/比较值的函数可W例如小于约20%，小于约10% 和/或小于约5%。短语"大体上正常的"是指与参照(例如，正常参照)大体上相似。
[0075] 短语"大体上不同的"是指两个数值(通常一个与分子相关并且另一个与参照/比 较分子相关)之间的充分高的程度的差异，运使得本领域普通技术人员可认为所述两个值 之间的差异在由所述值(例如，Kd值)测量的生物特征的背景中具有统计显著性。所述两个 值之间的差异作为参照/比较分子的值的函数可W例如大于约10%，大于约20%，大于经 30%，大于约40 %和/或大于约50 %。
[0076] "相关"或"使相关"意指W任何方式将第一分析或方案的性能和/或结果与第二分 析或方案的性能和/或结果相比较。例如，可在进行第二方案时使用第一分析或方案的结果 和/或可使用第一分析或方案的结果来确定是否应当进行第二分析或方案。对于多核巧酸 分析或方案的实施方案，可使用多核巧酸表达分析或方案的结果来确定是否应当进行特定 的治疗方案。
[oow]"个体"或"受试者"是哺乳动物。哺乳动物包括，但不限于，家养动物(例如，牛、绵 羊、猫、狗和马）、灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物诸如猴）、兔和晒齿类动物(例如， 小鼠和大鼠）。在某些实施方案中，所述个体或受试者是人。
[0078] 如本文中所用，"治疗（treatment)"(和其语法变型诸如"治疗（treat)"或"治疗 (treating)")是指试图改变待治疗的个体的自然过程的临床干预，并且可预防性进行或在 临床病变过程中进行。想要的治疗效果包括，但不限于，预防疾病的发生或复发，缓解症状， 减少疾病的任何直接或间接病理学后果，防止转移，减缓疾病进展速度，改善或缓和疾病状 态，W及缓解或改善预后。在一些实施方案中，本发明的抗体用于延迟疾病的发展或减缓疾 病的进展。
[0079] 术语"药物制剂"是指呈诸如允许其中包含的活性成分的生物活性发挥效果的形 式，并且不含对于将对其施用所述制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外组分的制剂。
[0080] "药学上可接受的载体"是指药物组合物中除活性成分外的成分，其对于受试者是 无毒的。药学上可接受的载体包括，但不限于，缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
[0081] 除非在本文中另有说明，否则本文数值范围的引用仅旨在用作单独提及落在该范 围内的每一个单独的值的速记方法，并且每个单独的值被并入本说明书中，就如同其在本 文中被单独引用一样。
[0082] 如本领域普通技术人员所理解的，本文中的"约"值或参数包括(且描述)指向该值 或参数本身的实施方案。例如，提及"约X"的描述包括"X"的描述。
[0083] 除非另有说明或 与上下文明显矛盾，否则术语"一个"和"一种及"该"和类似术 语在描述本发明的实施例的上下文的使用"应被解释为涵盖单数和复数。除非另有说明，否 则术语"包括"，"具有"、"包含"和"含有"将被解释为开放式术语（即，意思是"包括，但不限 于"）。应当理解，本文描述的本发明的方面和实施方案包括"由方面和实施方案组成"和/或 "基本上由方面和实施方案组成"。
[0084] 筛选方法和融合蛋白
[0085] 本文中提供筛选化合物W鉴定调节包含布罗莫结构域模块的多肤的那些化合物 方法和用于所述方法的组合物。具体地，本文中提供包含至少一个染色质结合模块和至少 一个报告模块的融合蛋白，和使用包含至少一个染色质结合模块和至少一个报告模块的融 合蛋白筛选化合物的方法。
[0086] 本文中提供包含至少一个染色质结合模块和至少一个报告模块的融合蛋白，其中 多个融合蛋白能够形成斑。
[0087] 在一个方面，本文中提供用于确定测试化合物是否是布罗莫结构域抑制化合物的 方法，其包括(a)将本文所述的包含含有至少一个染色质结合模块和至少一个报告模块的 融合蛋白的细胞与测试化合物接触，和(b)确定所述测试化合物是否改变融合蛋的分布模 式和/或增加融合蛋白斑的形成，其中分布模式的变化和/或斑形成的增加表示所述测试化 合物是布罗莫结构域抑制化合物。在一些实施方案中，所述染色质结合模块是布罗莫结构 域模块。
[0088] 在一些方面，本文中提供鉴定能够特异性结合染色质结合模块并且抑制其与染色 质的相互作用的化合物的方法，所述方法包括(a)将包含所述融合蛋白（其中所述融合蛋白 包含至少一个染色质结合模块和至少一个报告模块)的细胞与测试化合物接触，（b)测定在 所述测试化合物存在和不存在的情况下报告信号在包含所述融合蛋白的细胞中的分布，其 中在所述测试化合物存在的情况下相较于所述测试化合物不存在的情况下的报告信号斑 的增加指示，所述测试化合物是能够特异性结合染色质结合模块并且抑制其与染色质的相 互作用的化合物。在一些实施方案中，所述染色质结合模块是布罗莫结构域模块。
[0089] 在一些实施方案中，所述融合蛋白包含1、2、3、4、5或6个染色质结合模块的任一 种。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含约一个染色质结合模块。在一些实施方案中，所 述融合蛋白包含两个染色质结合模块。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含至少一个来 自第一染色质结合多肤的染色质结合模块和至少一个来自第二染色质结合多肤的染色质 结合模块。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含一个来自第一染色质结合多肤的染色质 结合模块和一个来自第二染色质结合多肤的染色质结合模块。
[0090] 在任何所述方法和融合蛋白的一些实施方案中，至少一个染色质结合模块(例如， 布罗莫结构域模块)存在于其内源和/或天然背景中。在一些实施方案中，在内源背景中，所 述融合蛋白包含天然染色质结合多肤或含有至少一个染色质结合模块和至少一个报告模 块的天然染色质结合多肤的片段的氨基酸序列。例如，在内源背景中，所述融合蛋白包含天 然布罗莫结构域多肤例如BRG1的氨基酸序列，所述天然布罗莫结构域多肤包含至少一个布 罗莫结构域和至少一个报告构建体。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含染色质结合多 肤的全长序列。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含含有染色质结合模块的染色质结合 多肤的片段。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含至少约50 %、60 %、70 %、80 %和90 %的 染色质结合多肤并且包括染色质结合模块。在一些实施方案中，所述染色质结合模块是布 罗莫结构域模块。在一些实施方案中，所述染色质结合多肤是布罗莫结构域多肤。
[0091] 在任何所述方法和融合蛋白的一些实施方案中，至少一个染色质结合模块(例如， 布罗莫结构域模块)存在于外源和/或非天然背景中。外源和/或非天然背景中的染色质结 合模块(例如，布罗莫结构域模块)包括，但不限于（i)染色质结合多肤中的相较于天然染色 质结合多肤的不同氨基酸位置/背景中的染色质结合模块，（ii)第二染色质结合多肤的背 景中的第一染色质结合多肤的染色质结合模块，和/或（iii)无关多肤(例如，非染色质结合 多肤)背景中的染色质结合模块。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含染色质结合多肤中 的相较于天然染色质结合多肤的不同氨基酸位置/背景中的至少一个染色质结合模块，和 染色质结合多肤中的相较于天然染色质结合多肤的相同或相似氨基酸位置/背景中的至少 一个染色质结合模块。在一些实施方案中，所述染色质结合模块是布罗莫结构域模块。在一 些实施方案中，所述染色质结合多肤是布罗莫结构域多肤。
[0092] 在任何所述方法和融合蛋白的某些实施方案中，所述融合蛋白包含第一染色质结 合多肤，其中所述第一染色质结合多肤的一个或多个染色质结合模块已被第二染色质结合 多肤的至少一个染色质结合模块取代和/或替代。例如，实施例7提供包含巧光蛋白和人 BRD9编码DNA序列的融合蛋白的本发明的某些实施方案，其中所述布罗莫结构域编码序列 被人BAZ2B或人PCAF/KAT2B的布罗莫结构域序列替代。
[0093] 在任何所述方法和融合蛋白的一些实施方案中，所述融合蛋白包含具有多个染色 质结合模块的染色质结合多肤，其中染色质结合模块对染色质具有充足的亲和力。在某些 情况下，天然蛋白质可包含多个染色质结合模块，并且一个模块的抑制不从染色质释放融 合蛋白。在另一方面，某些染色质结合模块，当独自地表达为小模块时，可W不充分地结合 于染色质。在运些情况下，具有来自另一个染色质结合多肤的主链的嵌合蛋白可用于解决 运些问题。为了评估染色质结合多肤是否适合再定位/斑形成测定，可将突变引入染色质结 合模块的结合口袋W破坏结合亲和力。如果突变型融合蛋白仍然可结合染色质并且相较于 野生型融合蛋白不显示不同的分布模式，则所述染色质结合多肤可能不能用于本专利中描 述的方法。该类型的结果表明除目标染色质结合模块外的区域也可促成对于染色质的亲和 力。为了解决该问题，可使用拥有不具有对于染色质的亲和力的主链的嵌合染色质结合多 肤来建立测定。
[0094] 在任何所述方法和融合蛋白的一些实施方案中，所述融合蛋白包含第一染色质结 合多肤，其中一个或多个染色质结合模块已被复制和/或重复。在其它实施方案中，所述融 合蛋白包含第一染色质结合多肤，其中至少一个染色质结合模块来自第二染色质结合多 肤。在任何所述方法和融合蛋白的一些实施方案中，所述染色质结合模块是布罗莫结构域 模块。在一些实施方案中，所述染色质结合多肤是布罗莫结构域多肤。
[0095] 在任何所述方法和融合蛋白的一些实施方案中，所述染色质结合模块是布罗莫结 构域模块、P皿指模块、染色质域模块、MBT结构域模块、tudor结构域模块、PWWP结构域模块、 A孤结构域模块、Zf-CW结构域模块、错蛋白重复模块和/或WD40模块。
[0096] 在任何所述方法和融合蛋白的一些实施方案中，所述染色质结合模块是布罗莫结 构域模块。在一些实施方案中，所述布罗莫结构域模块是特征在于保守折叠的氨基酸序列， 所述保守折叠包含通过具有可变长度的环区域(ZA和BC环)连接的一个左手束的4个α螺旋 (妃、日4、日8、日(：）。在一些实施方案中，所述布罗莫结构域模块包含赖氨酸残基化日(3)结合位 点的组蛋白ε-Ν-乙酷化。在一些实施方案中，所述布罗莫结构域通过中屯、深疏水腔识别 Kac，其中其通过氨键错定于天冬酷胺残基。在一些实施方案中，所述至少一个布罗莫结构 域模块包含W下的任何一个的至少一个布罗莫结构域:A甜1L、ATAD2、BAZ1A、BAZ1B、BAZ2A、 BAZ2B、B畑1、B畑2、B畑3、B畑4、B畑7、B畑8、B畑9、B畑T、BRPF1、BRPF3、BRWD3、CECR2、CREBBP、 EP300、FALZ、GCN化2、KIAA1240、L0C93：M9、M化、PB、PCAF、PHIP、P服CBP1、SMARCA2、SMARCA4、 SP100、SP110、SP140、TAFl、TAFlL、TIFla、TRIM28、TRIM33、TRIM66、WDR9、ZMYNDll和/或 MLL4。在一些实施方案中，所述布罗莫结构域模块包含表1中的蛋白质的至少一个布罗莫结 构域。在一些实施方案中，所述布罗莫结构域模块包含表1中被定义为化iProt SEQ ID的布 罗莫结构域的序列(所述化iPort序列，包括规范序列，是如在2013年11月1日访问的序列， 并且在此通过引用整体并入）。在某些实施方案中，所述至少一个布罗莫结构域模块包含 BRG1、PCAF/KAT2B、BAZ2B、BW1、BW8、BRFP1、BRFP3、BRG1、CBP/CREBBP、PCAF/KAT2B、TRIM24 和/或ZMYND8的任一个的至少一个布罗莫结构域。在某些实施方案中，所述至少一个布罗莫 结构域模块包含服D2、B畑3、B畑4、B畑9、B畑T和BRG1的任一个的至少一个布罗莫结构域。在 某些实施方案中，至少一个布罗莫结构域模块包含8361、81?^1八60?2、？〔4。和/或了4。1的任 一个的至少一个布罗莫结构域。在某些实施方案中，至少一个布罗莫结构域模块包含BRD4 和/或BRD9的布罗莫结构域。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含1、2、3、4、5或6个布罗莫 结构域模块的大致任一种。
[0097] 表1布罗莫结构域多肤和布罗莫结构域模块
[009引
[0099]
[0100]
[0101]
[0102] 在任何所述方法和融合蛋白的一些实施方案中，所述染色质结合多肤是布罗莫结 构域多肤。在一些实施方案中，所述布罗莫结构域多肤(天然地和/或内源地)包含含有氨基 酸序列的布罗莫结构域模块，所述氨基酸序列的特征在于保守折叠，所述保守折叠包含通 过具有可变长度的环区域(ZA和BC环)连接的一左手束的4个α螺旋(妃、〇4、〇8、此）。在一些 实施方案中，布罗莫结构域多肤的布罗莫结构域模块包含赖氨酸残基化ac)结合位点的组 蛋白ε-Ν-乙酷化。在一些实施方案中，所述布罗莫结构域多肤的布罗莫结构域模块通过中 屯、深疏水腔识别Kac，其中其通过氨键错定于天冬酷胺残基。在一些实施方案中，所述布罗 莫结构域多肤包含表1中的至少一个布罗莫结构域多肤。在一些实施方案中，所述布罗莫结 构域多肤包含表1中鉴定为化iProt SEQ ID(所述化iPort序列，包括规范序列，是如2013年 11月1日访问的序列，并由此通过引用整体并入）的序列。在任何融合蛋白的某些实施方案 中，所述布罗莫结构域多肤包含服G1、PCAF/KAT2B、BAZ2B、服D1、BRD8、BRFP1、BRFP3、BRG1、 CBP/CREBBP、PCAF/KAT2B、TRIM24和/或ZMYND8的任一个或包含至少一个布罗莫结构域模块 的其片段的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述布罗莫结构域多肤包含BRD2、BRD3、BRD4、 BRD9、BRDT和/或BRG1的任一个或包含至少一个布罗莫结构域模块的其片段的氨基酸序列。 在某些实施方案中，布罗莫结构域多肤包含8361、81?^1八60?2、？〔4。和/或了4。1的任一个或 包含至少一个布罗莫结构域模块的其片段的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述布罗莫 结构域多肤包含BRD4和/或BRD9或包含至少一个布罗莫结构域模块的其片段的氨基酸序 列。在某些实施方案中，所述布罗莫结构域多肤包含全长布罗莫结构域多肤。在一些实施方 案中，所述融合蛋白包含含有布罗莫结构域模块的布罗莫结构域多肤的片段。在一些实施 方案中，所述融合蛋白包含至少约50、60、70、80和90%的布罗莫结构域多肤并且包括布罗 莫结构域模块。
[0103] 本文所述融合蛋白包含报告模块。报告模块在本领域中是已知的，并且包括但不 限于β-半乳糖巧酶（lacZ)、氯霉素乙酷转移酶(猫）、β-葡糖醒酸酶(GUS)、巧光蛋白和/或巧 光素酶。在本文所述任何融合蛋白和方法的一些实施方案中，报告模块是能够和/或装配成 多聚体的报告蛋白Γ多聚报告蛋白"）。在一些实施方案中，多聚报告蛋白是必需二聚蛋白。 在一些实施方案中，多聚报告蛋白是必需Ξ聚蛋白。在一些实施方案中，多聚报告蛋白是必 需四聚蛋白。在一些实施方案中，多聚报告蛋白能够形成和/或形成蛋白质聚集体。在一些 实施方案中，多聚报告蛋白能够形成和/或形成蛋白质寡聚体。在某些实施方案中，报告模 块包括巧光报告模块。巧光报告模块包括巧光蛋白（见，例如，Olenych等，（2006). Cell Biol.21.5.1-21.5.34;化than等，Journal of Cell Science 120,4247-4260(2007);Day 等，Chem. Soc. Rev.，2009，38，2887-2921)。在一些实施方案中，所述巧光报告模块包含表2 中所述的蛋白质的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述巧光报告模块包含EGFP、 1\11'13〇6。？、(131?6(12、(131?6(1-6邱'6332和/或236的6]1的任一个的氨基酸序列。
[0104] 表2巧光报告模块
[0105]
[0106]
[0107] 在本文所述任何融合蛋白和方法的一些实施方案中，所述融合蛋白包含核定位信 号(化S)。在一些实施方案中，所述化S包括染色质结合多肤的化S。在一些实施方案中，所述 化S包括布罗莫结构域多肤的化S。在某些实施方案中，所述化S是SV40大T抗原化S或核浆素 的化S。
[0108] 所述报告模块可W是融合蛋白内的任何位置，其允许检测并不明显地干扰(例如， 不干扰)染色质结合模块与染色质的相互作用。在本文所述任何融合蛋白和方法的一些实 施方案中，所述染色质结合模块位于报告模块的5'。在本文所述任何融合蛋白和方法的一 些实施方案中，所述染色质结合模块位于报告模块的3'。
[0109] 在本文所述任何融合蛋白和方法的一些实施方案中，所述融合蛋白能够多聚化。 在某些实施方案中，所述融合蛋白能够形成二聚体、Ξ聚体或四聚体。在某些实施方案中， 所述融合蛋白能够形成二聚体。在某些实施方案中，所述融合蛋白能够形成四聚体。在一些 实施方案中，所述融合蛋白能够形成蛋白质聚集体。在一些实施方案中，所述融合蛋白能够 寡聚化。
[0110] 通过例如报告模块中的蛋白质的多聚化，多个融合蛋白可结合形成斑。随后可检 测所述斑。在某些实施方案中，所述报告模块包括巧光报告模块。
[0111] 在本文所述任何融合蛋白和方法的一些实施方案中，斑和/或点的形成通过比较 对照或参照样本中的融合蛋白的定位来测定。在一些实施方案中，融合蛋白在对照或参照 样本中的定位是在染色质结合模块抑制化合物不存在的情况下融合蛋白在细胞中的定位。 在一些实施方案中，用染色质结合模块抑制化合物处理细胞和/或染色质结合模块抑制化 合物的存在将导致细胞中的斑数目相较于未处理的细胞和/或染色质结合模块抑制化合物 不存在的情况的大于约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的任一个的增 加。斑和/或点的尺寸和形状可取决于染色质结合模块而变化。
[0112] 本发明的融合蛋白能够形成斑，所述斑可使用本领域中已知的方法来检测和测 量。在一些实施方案中，斑的形成表示所述融合蛋白已与染色质解离并且形成斑和/或点。 检测与染色质的分离和蛋白质的核定位的方法在本领域中是已知的。在一些实施方案中， 所述检测方法是直接检测。在一些实施方案中，所述检测方法是利用巧光标记的针对作为 融合蛋白的部分的报告模块或工程化蛋白质表位标签的抗体的间接检测。利用巧光显微镜 检查测定融合蛋白的定位。在一些实施方案中，检测方法是根据分子尺寸的生物化学分级 分离，随后利用针对融合蛋白、作为融合蛋白的部分的报告模块或工程化蛋白质表位标签 的抗体的蛋白质免疫印迹。
[0113] 在某些实施方案中，所述染色质结合模块不包含染色质相互作用转录阻遏物的恶 性脑肿瘤(MBT)家族的成员。在某些实施方案中，所述染色质结合模块不包含全长L3MB化3。 在某些实施方案中，所述染色质结合模块不包含L3MBTL3的3个MBT结构域。在某些实施方案 中，所述报告模块不 包含GFP。
[0114] 本文中还提供通过本文所述方法鉴定的染色质结合模块抑制化合物。在一些实施 方案中，所述染色质结合模块抑制化合物是小分子抑制剂。在一些实施方案中，所述染色质 结合模块抑制化合物是布罗莫结构域模块抑制化合物。
[0115] 染色质结合模块和染色质结合多肤的多肤变体
[0116] 染色质结合模块和染色质结合多肤的变体用于本文所述方法和用于本文所述融 合蛋白。多肤的保守取代优选的取代"的标题示于表3中。如果此类取代导致生物活性的 变化，则可引入在表3中命名为"示例性取代"或如在下文中参考氨基酸种类进一步描述的 更加显著的变化，并筛选产物。
[0117] 表3 [011引
[0119] 通过选择取代来实现多肤的生物性质的显著修改，所述取代在它们对维持如下方 面的作用上显著不同：（a)取代的区域例如，如折叠片或螺旋构象中的多肤主链的结构，（b) 分子在祀位点上的电荷或疏水性或(C)侧链的体积。非保守取代将使运些种类之一的成员 必须与另一个种类交换。可按照共同的侧链性质将氨基酸分类：
[0120] (1)疏水性:正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、I le;
[0121] (2)中性亲水性：〔73、56'、1'虹、4311、61111;
[0122] (3)酸性:43口、6111;
[0123] (4)碱性:His、Lys、Arg;
[0124] (5)影响链取向的残基:Gly、Pro;
[012 引（6)芳香族:T;rp、Ty;r、Phe;
[0126] (7)大的疏水性：正亮氨酸、Met、化l、Leu、Ile。
[0127] 在其它实施方案中，本发明的多肤可包含一个或多个非天然存在或经修饰的氨基 酸。"非天然存在的氨基酸残基"是指除上文所列的那些天然存在的氨基酸残基外的残基， 其能够共价结合多肤链中的相邻氨基酸残基。非天然氨基酸包括，但不限于高赖氨酸、高精 氨酸，高丝氨酸，铃兰氨酸，2-氨基己二酸，3-氨基己二酸，β-丙氨酸，氨基丙酸，2-氨基下 酸，4-氨基下酸，6-氨基己酸，2-氨基庚酸，2氨基异下酸，3-氨基异下酸，2-氨基庚二酸，叔 下基甘氨酸，2，4-二氨基异下酸，锁链素，2，2 二氨基庚二酸，2，3-二氨基丙酸，Ν-乙基甘 氨酸，Ν-乙基天冬酷胺、高脯氨酸，径基赖氨酸，别-?基赖氨酸，3-径基脯氨酸，4-径基脯氨 酸，异锁链素，别-异亮氨酸，N-甲基丙氨酸，N-甲基甘氨酸，N-甲基异亮氨酸，N-甲基戊基甘 氨酸，N-甲基鄉氨酸，糞胺，正鄉氨酸，正亮氨酸，鸟氨酸，瓜氨酸，戊基甘氨酸，赃晚酸和硫 代脯氨酸。经修饰的氨基酸包括天然和非天然氨基酸，其可被可逆或不可逆地化学阻断，或 在它们的N-末端氨基或它们的侧链基团上被修饰，如例如，N-甲基化D和L氨基酸，被化学修 饰成另一种官能团的侧链官能团。例如，经修饰的氨基酸包括甲硫氨酸亚讽；甲硫氨酸讽； 天冬氨酸-(0-甲基醋）、天冬氨酸的经修饰的氨基酸;N-乙甘氨酸、甘氨酸的经修饰的氨基 酸;或丙氨酸甲酯胺和丙氨酸的经修饰的氨基酸。另外的非天然和经修饰的氨基酸W及将 它们渗入蛋白质和肤的方法在本领域中是已知的（见，例如，Sandberg等，（1998 ) J.Med.Qiem.41:2481-91;Xie和Schultz(2005) Qirr.Opin.Qiem.Biol.9:548-554;Hodgson 和Sanderson(2004) Qiem.Soc.Rev.33:422-430)。
[0128] 包含染色质结合模块的多肤的变体还可基于本领域已知的信息来制备，而不显著 影响染色质结合模块的活性。例如，包含染色质结合模块的多肤和/或染色质结合模块变体 可使包含染色质结合模块的多肤和/或染色质结合模块中的至少一个氨基酸残基被不同残 基替代。
[0129] 产生此类取代变体的方便方法包括隧菌体展示。随后筛选隧菌体展示的变体的如 本文中公开的它们的生物活性(例如，结合亲和力）。为了鉴定用于修饰的包含染色质结合 模块的多肤和/或染色质结合模块的候选区域，可进行丙氨酸扫描诱变来鉴定显著有助于 染色质结合的高变区残基。一旦产生此类变体，就将使变体的小组经历如本文所述的筛选， 并且在一个或多个相关测定中具有优良性质的抗体可被选择用于其它开发。
[0130 ]本文所述方法中使用的核酸、表达盒、载体和细胞
[0131] 本文提供编码本文所述融合蛋白的核酸和包含含有本文中所述融合蛋白的核酸 的表达盒、载体。本文提供分离的和/或大体上纯化的融合蛋白和编码本文所述的融合蛋白 的核酸(例如，DNA或RNA)。还提供了包含编码本文所述融合蛋白的核酸的载体和表达盒。
[0132] 编码包含本文所述染色质结合模块的多肤和/或染色质结合模块的多核巧酸序列 可使用标准合成和/或重组技术来获得。可从适当的来源细胞分离所需的多核巧酸序列，并 对其进行测序。包含染色质结合模块的多肤和/或染色质结合模块的来源细胞可包括包含 染色质结合模块的多肤和/或染色质结合模块生成细胞诸如杂交瘤细胞。或者，多核巧酸可 使用核巧酸合成仪或PCR技术来合成。一旦获得，就可将编码包含布罗莫结构域和/或布罗 莫结构域的多肤的序列插入能够在宿主细胞中复制和表达异源多核巧酸的重组载体。在本 领域中可获得和已知的许多载体可用于本发明的目的。适当的载体的选择将主要取决于待 插入载体中的核酸的大小和待用所述载体转化的具体宿主细胞。每一个载体含有不同的组 分，运取决于其功能(异源多核巧酸的扩增或表达，或运两方面及其与其所存在的特定 宿主细胞的相容性。载体组分通常包括，但不限于:复制起始点（特别地当将载体插入原核 细胞时）、选择标记基因、启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源核酸插入物和转录 终止序列。
[0133] 编码包含染色质结合模块的多肤和/或染色质结合模块的氨基酸序列变体的核酸 分子通过本领域中已知的多种方法来制备。运些方法包括，但不限于，从天然来源的分离 (在天然存在的氨基酸序列变体的情况下)或通过包含染色质结合模块的多肤和/或染色质 结合模块的较早制备的变体或非变体形式的寡核巧酸介导的（或定点）诱变、PCR诱变W及 表达盒诱变进行的制备。
[0134] 在某些实施方案中，本发明提供含有包含可操作地连接于祀序列的启动子的表达 盒的载体。如本文中所用，"表达盒"意指能够指导特定核巧酸序列在适当的宿主细胞中的 表达的核酸序列，其包括可操作地连接于目标核巧酸序列(所述目标核巧酸序列可操作地 连接于终止信号）的启动子。编码区通常编码目标功能性RNA，例如RNAi分子。包括目标核巧 酸序列的表达盒可W是嵌合的。可使用标准技术，诸如Samb;rook和Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring 化rbor，NY( 2001)中描述的那些技术将核酸工程化至载体中。
[0135] -般地，将含有来源于与宿主细胞相容的种类的复制子和控制序列的质粒载体与 运些宿主结合使用。所述载体通常具有复制位点，并且制备能够提供转化细胞的表型选择 的标记序列。另外，含有与宿主微生物相容的复制子和控制序列的隧菌体载体可用作与运 些宿主结合的转化载体。
[0136] 根据具体情况的需要可将组成型或诱导型启动子用于本发明，运可由本领域普通 技术人员来确定。众多由多种潜在宿主细胞识别的启动子是公知的。可通过从来源DNA经由 限制性内切酶消化除去启动子和将分离的启动子序列插入选定的载体来将选定的启动子 可操作地连接于编码本文所述多肤的顺反子DNA。天然启动子序列和许多异源启动子可用 于指导本文所述融合蛋白的扩增和/或表达。然而，异源启动子是优选的，因为它们相较于 天然祀多肤启动子通常允许表达的祀基因的更大转录和更高产率。
[0137] 在一些实施方案中，重组载体内的每一个顺反子包含分泌信号序列组分和/或指 导表达的多肤穿过膜的转运的核定位信号。一般地，所述信号序列可W是载体的组分，或其 可W是被插入载体的祀多肤DNA的部分。被选择用于本发明的目的信号序列应当是被宿主 细胞识别和加工(即被信号肤酶切割）的信号序列。
[0138] 本文还提供包含含有包含本文所述融合蛋白的核酸的表达盒和/或载体的细胞。 本文提供包含本文所述融合蛋白的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是真核细胞。在一些 实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。在某些实施方案中，所述细胞是CH0-KUC0S-7、 皿K293、皿K293T、皿K293FT、胎La、MDCK和/或U20S细胞。在某些实施方案中，所述细胞是 C0S-7、HeLa 和/或 U20S细胞。
[0139] 用上述表达载体转化或转染或通过用上述表达载体包装的病毒转导宿主细胞，并 将所述宿主细胞在经改良适合用于诱导启动子的常规营养培养基中培养，随后选择转化 体，或扩增编码所需序列的基因。转染是指表达载体被宿主细胞吸收而无论任何编码序列 是否实际上被表达。当该载体的操作的任何指征在细胞内产生时，成功的转染通常被识别。
[0140] 如果将诱导型启动子用于表达载体，则在适合于启动子激活的条件下诱导蛋白质 表达。可根据所使用的的载体构建体使用多种其它诱导物，运在本领域中是已知的。还可W W适当的浓度包含除了碳、氮和无机憐酸盐来源W外的任何必需补充剂，所述补充剂单独 地或作为与另一种补充剂或介质诸如复合氮源的混合物引入。任选地所述培养基可含有选 自由W下组成的组的一种或多种还原剂:谷脫巧肤、半脫氨酸、脫胺、硫胶质、二硫下四醇和 二硫苏糖醇。
[0141] 可从培养物除去细胞，随后过滤并浓缩培养上清液W进一步纯化产生的蛋白质。 可使用公知的方法诸如如下方法进一步分离和鉴定表达的多肤:在免疫亲和柱或离子交换 柱上的分级分离；乙醇沉淀；反相HPLC;在娃±上或在阳离子交换树脂诸如DEAE上的层析； 聚焦层析;SDS-PAGE;硫酸锭沉淀;使用例如S邱hadex G-75的凝胶过滤;疏水亲和树脂、使 用固定在基质上的适当的抗原的配体亲和力W及蛋白质印迹测定。
[0142] 治疗性/预防性方法和/或用途
[0143] 通过本文所述任何方法鉴定的染色质结合模块抑制化合物可用于治疗性方法。
[0144] 在一个方面，提供了用作药剂的染色质结合模块抑制化合物。在其它方面，提供了 用于治疗癌症的方法的染色质结合模块抑制化合物。在某些实施方案中，本发明提供了用 于治疗个体的方法的染色质结合模块抑制化合物，所述方法包括向所述个体施用有效的染 色质结合模块抑制化合物W治疗癌症。在某些实施方案中，提供了用于治疗方法的染色质 结合模块抑制化合物。在某些实施方案中，提供了用于治疗患有癌症的个体的方法的染色 质结合模块抑制化合物，所述方法包括向所述个体施用有效量的所述染色质结合模块抑制 化合物。在一个此类实施方案中，所述方法还包括向所述个体施用有效量的至少一种另外 的治疗剂，例如，如下文中描述的。在其它实施方案中，本发明提供了用于治疗癌症的染色 质结合模块抑制化合物。在某些实施方案中，本发明提供了用于治疗个体的癌症的方法的 染色质结合模块抑制化合物，所述方法包括向所述个体施用有效量的所述染色质结合模块 抑制化合物来治疗癌症。在其它实施方案中，本发明提供了用于治疗癌症的染色质结合模 块抑制化合物。在某些实施方案中，本发明提供了用于抑制个体的细胞增殖的方法的染色 质结合模块抑制化合物，所述方法包括向所述个体施用有效量的所述染色质结合模块抑制 化合物W抑制细胞增殖。在一些实施方案中，染色质结合模块抑制化合物是布罗莫结构域 模块抑制化合物。根据任何上述实施方案的"个体"优选是人。
[0145] 在其它方面，本文中提供了例如用于任何上述治疗性方法的包含任何染色质结合 模块抑制化合物的药物制剂。在一个实施方案中，药物制剂包含任何染色质结合模块抑制 化合物和药学上可接受的载体。药学上可接受的载体在所使用的剂量和浓度下对受者通常 是无毒的，并且包括，但不限于:缓冲剂诸如憐酸盐、巧樣酸盐和其它有机酸;抗氧化剂，包 括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化锭;氯化六甲双胺;苯扎氯 锭;节索氯锭;苯酪、下基或节醇;对径苯甲酸烷基醋诸如对径基苯甲酸甲醋或对径基苯甲 酸丙醋;儿茶酪；间苯二酪;环己醇;3-戊醇;和间甲酪）；低分子量(小于约10个残基）多肤； 蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物诸如聚乙締化咯烧酬;氨基酸 诸如甘氨酸、谷氨酷胺、天冬酷胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸;单糖、二糖和其它碳水化合物， 包括葡萄糖、甘露糖或糊精;馨合剂，诸如抓TA;糖，诸如薦糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇;形 成盐的抗衡离子诸如钢;金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物）；和/或非离子表面活性剂诸 如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性药学上可接受的载体进一步包括间质药物分散剂，诸如可 溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白（sHASEGP)，例如，人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如 rHuPH20(UYLENEX?,Baxter International, Inc.)。某些示例性sHA沈GP和使用方法， 包括riluPH20，描述于美国专利公布第2005/0260186和2006/0104968号中。在一个方面，将 sHASEGP与一种或多种另外的葡糖氨基聚糖酶类诸如软骨素酶组合。
[0146] 在一些实施方案中，药物制剂包含染色质结合模块抑制化合物和至少一种另外的 治疗剂，例如，如下文中所述的。
[0147] 所述染色质结合模块抑制化合物可单独地用于疗法或与其它试剂组合地用于疗 法。例如，可将染色质结合模块抑制化合物与至少一种另外的治疗剂共施用。
[0148] 上述此类联合治疗包括组合施用（其中将两种或更多种治疗剂包含在相同或单独 的制剂中），和分开施用，在该情况下，本文所述染色质结合模块抑制化合物的施用可在另 外的治疗剂施用之前，与之同时和/或之后进行。
[0149] 本文所述染色质结合模块抑制化合物(和任何另外的治疗剂)可通过任何合适的 方法，包括胃肠外、肺内和鼻内施用，并且，如果希望用于局部治疗，可通过病灶内施用、局 部施用或眼内施用化合物。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。给药 可W通过任何合适的途径，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射，运部分取决于所述施用 是短暂的还是慢性的。本文涵盖各种给药方案，包括但不限于在不同时间点上的单一或多 次施用、推注施用和脉冲输注。
[0150] 布罗莫结构域介导的病症的实例包括癌症，包括但不限于，听神经瘤、急性白血 病、急性淋己细胞白血病、急性髓细胞白血病(单核细胞、成髓细胞、腺癌、血管肉瘤、星形细 胞瘤、粒单核细胞和早幼粒细胞瘤）、急性T细胞白血病、基底细胞癌、胆管癌、膀脫癌、脑癌、 乳腺癌、支气管癌、宫颈癌、软骨肉瘤、脊索瘤、绒毛膜癌、慢性白血病、慢性淋己细胞白血 病、慢性髓细胞(粒细胞）白血病、慢性髓细胞性白血病、结肠癌、结直肠癌、烦咽管瘤、囊腺 癌、弥漫性大B细胞淋己瘤、异型增生变化(发育异常和化生）、胚胎癌、子宫内膜癌、内皮肉 瘤、室管膜瘤、上皮癌、红白血病、食道癌、雌激素受体阳性乳腺癌、原发性血小板增多症、尤 因氏瘤、纤维肉瘤、滤泡性淋己瘤、生殖细胞睾丸癌、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、神经胶质 肉瘤、重链病、成血管细胞瘤、肝癌、肝细胞癌、激素不敏感性前列腺癌、平滑肌肉瘤、白血 病、脂肪肉瘤、肺癌、淋己管内皮肉瘤、淋己管肉瘤、成淋己细胞性白血病、淋己瘤(何杰金氏 和非何杰金氏）、膀脫、乳腺、结肠、肺、卵巢、膜腺、前列腺、皮肤和子宫的恶性肿瘤和过度增 生性病症、T细胞或B细胞起源的淋己样细胞恶性肿瘤、白血病、淋己瘤、髓样癌、髓母细胞 瘤、黑素瘤、脑膜瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、骨髓性白血病、骨髓瘤、粘液肉瘤、神经母细胞 瘤、NUT中线癌(NMC)、非小细胞肺癌、少突神经胶质瘤、口腔癌、成骨性肉瘤、卵巢癌、膜腺 癌、乳头状腺癌、乳头状癌、松果体瘤、真性红细胞增多症、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、视 网膜母细胞瘤、横纹肌肉 瘤、肉瘤、皮脂腺癌、精原细胞瘤、皮肤癌、小细胞肺癌、实体瘤(癌 和肉瘤）、小细胞肺癌、胃癌、鱗状细胞癌、滑膜瘤、汗腺癌、甲状腺癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋 白血症、睾丸肿瘤、子宫癌和肾母细胞瘤。
[0151] 在任何所述方法的某些实施方案中，所述癌症是肺癌、乳腺癌、膜腺癌、结直肠癌 和/或黑素瘤。在某些实施方案中，所述癌症是肺癌。在某些实施方案中，所述肺癌是NS化C。 在某些实施方案中，所述癌症是乳腺癌。在某些实施方案中，所述癌症是黑素瘤。
[0152] 制品/试剂盒
[0153] 本文还提供了含有用于鉴定染色质结合模块抑制化合物的材料的制品，其包含本 文所述的融合蛋白、核酸、表达盒、载体和/或细胞。所述制品包含容器和容器上或与容器结 合的标签或包装说明书。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、静脉内溶液袋等。可从多 种材料诸如玻璃或塑料形成容器。所述容器装有为其本身的组合物或与另一种有效鉴定染 色质结合模块抑制化合物的组合物组合的组合物。
[0154] 标签或包装说明书指示所述组合物用于鉴定染色质结合模块抑制化合物。此外， 所述制品可包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本文所述的融合蛋 白、核酸、表达盒、载体和/或细胞;和(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含 另外的试剂。本发明的该实施方案中的制品还可包含指示组合物可用于鉴定染色质结合模 块抑制组合物的包装说明书。
[0155] 包括下列实施例来说明本发明的优选实施方案。本领域普通技术人员应当理解， 下列实施例中公开的技术代表由本发明人发现的在本发明的实践中运行良好的技术，因此 可W被认为构成了用于其实践的优选方式。然而，根据本公开内容，本领域普通技术人员应 当理解，可在不背离本发明的精神和范围的情况下，许多变化可在公开的特定实施方案中 进行并且仍然获得相似或类似结果。 实施例
[0156] W下是融合蛋白和使用本发明的融合蛋白的方法的实施例。应理解，鉴于本文中 提供的一般描述，可实践各种其它实施方案。
[0157] 实施例1
[0158] 为了了解FP标记的含布罗莫结构域的蛋白质上的巧光标签(FP)在被布罗莫结构 域抑制化合物从染色质释放后在细胞核中的定位变化，FP-BRD4的某些融合构型导致细胞 核中FP标记的蛋白质的抑制剂依赖性再定位和斑形成。
[0159] 方法
[0160] 将巧光蛋白（FP)标签（dsRed2、dsRed-E邱ress2、EGFP、Emerald GFP、m畑er巧、 m0range2、TurboGFP或ZsGreen)在框内克隆在慢病毒载体中的人BRD4编码DNA序列（短的 B畑4同种型的氨基酸残基1 -719;NCBI NP_055114.1)的上游，所述载体在人EF1启动子的控 制下表达Tet-化3G转录因子。在诱导型启动子TRE3G启动子的下游的FP-BRD4蛋白的表达 可用多西环素诱导。利用运些表达质粒构建体产生的慢病毒用于感染U20S骨肉瘤细胞 (八了撕，肌8-96)^在154旨/1111杀稻攝素选择下建立稳定的细胞。将稳定的细胞涂板在伽11。? Lab-Tek? II培养腔室载玻片W用于共聚焦显微镜检查或涂板在96孔板中W用于高容量显 微镜检查。用化g/ml多西环素处理细胞16小时，随后在成像前与DMS0或BRD4抑制剂解育2-4 小时。将Zeiss LSM510倒置共聚焦显微镜或具有加热台的LSM780共聚焦显微镜用于检查FP 标记的服D4蛋白的定位。利用Zeiss ZEN软件分析获得的图像。对于高容量显微镜，用4%甲 醒固定化合物处理的细胞15分钟，随后用PBS缓冲液洗涂2次。在ImageXpress Micro (Mole州lar Devices)上获取图像，并利用MetaXpre游?(Molecular Devices)分析所述 图像。
[0161] 结果
[0162] 产生稳定地携带利用不同巧光蛋白（FP)标记的诱导型BRD4的U20S细胞系。N末端 FP标签包括dsRed2、dsRed-E邱ress2、EGFP、血erald GFP、m化erry、m0range2、TurboGFP或 ZsGreen(图1) dFP-B畑4表达由多西环素诱导，并且利用媒介物(DMSO)或服D4布罗莫结构域 抑制剂JQ1处理细胞4小时，随后利用共聚焦显微镜进行活细胞成像。JQ1 (CAS#126524-70- 4)是抑制BRD2、BRD3、BRD4和BRDT的布罗莫结构域的化合物。当用DMS0处理时，FP标记的 BRD4蛋白结合于染色质并且弥散地分布在细胞核中（图2)。有趣地，JQ1处理导致EGFP- B畑4、ZsGreen-B畑4、dsRed-Express2、dsRed2-B畑4 和 TurboGFP-B畑4的蛋白质再定位和巧 光点/斑的形成。然而JQ1对m0range2-B畑4、m化er巧-B畑4和Emerald-GFP-B畑4的B畑4布 罗莫结构域的抑制不改变FP标记的蛋白质在细胞核中的定位。运些发现显示，当用具有形 成多聚体(例如，二聚体或四聚体)的倾向的巧光蛋白标记BRD4时，巧光BRD4融合蛋白响应 于布罗莫结构域抑制剂而聚集并且形成点/斑。重要的是，不能结合染色质，从而模拟布罗 莫结构域抑制剂的作用的在两个布罗莫结构域中具有点突变的突变型ZsGreen-BRD4蛋白， 即使在布罗莫结构域抑制剂不存在的情况下，亦被定位至细胞核中的点/斑（图3B)。野生型 BRD4融合蛋白在相同条件下显示弥散定位(图3A)。为了进一步分析布罗莫结构域抑制化合 物对布罗莫结构域与染色质的结合的阻止作用，利用DNA结合染料化echst 33342标记染色 质。如图4中所示，存在ZsGreen-BRD4蛋白与染色质的显著共定位。在另一方面，利用布罗莫 结构域抑制化合物抓i-A的处理导致ZsGreen-B畑4的巧光点，并且那些点与染色质不重叠 (图4)。综上所述，运些结果表明，当布罗莫结构域的结合活性被布罗莫结构域抑制化合物 抑制或通过布罗莫结构域内的点突变消除时，FP-BRD4蛋白再定位W形成点/斑。
[0163] 为了研究点/斑形成的动力学，利用DMS0或化合物BDi-A(BRD4的布罗莫结构域抑 制剂)处理表达ZsGreen-B畑4的稳定细胞5分钟、10分钟、15分钟、30分钟或60分钟，随后进 行固定和共聚焦显微镜检查。在10分钟的时间点上观察到ZsGreen-BRD4蛋白的再定位，并 且点/斑形成到30分钟时变得十分明显（图5)。运些结果显示ZsGreen-BRD4再定位的快速动 力学，并且可通过显微镜检查在巧光斑形成后实时监测布罗莫结构域抑制剂的作用。
[0164] 为了定量BRD4抑制剂对ZsGreen-BRD4再定位的作用，将稳定的细胞接种在96孔板 中，并与多西环素解育W诱导ZsGreen-BRD4的表达。利用不同浓度的JQ1处理细胞4小时，随 后固定。随后利用高容量显微镜获取图像，并利用MetaXpress分析图像W测定每细胞巧光 点的数目。在GraphPad Prism中分析推导数据W计算ECsq值。如所预期的，在较高JQ1浓度下 观察到更多ZsGreen-B畑4点，所述点在更较低JQ1浓度下逐渐减少。JQl(CAS#1268524-70- 4)的计算的ECso在该BRD4再定位测定（称为'点测定'）中为93nM(图6)。运些结果显示再定 位/点形成是可滴定的表型并且可用于测定布罗莫结构域抑制剂在细胞背景中的效力。
[016引讨论
[0166] 布罗莫结构域蛋白与染色质相互作用并且具有结合具有各种翻译后修饰的组蛋 白尾的能力。一个潜在的但非限制性模型描绘于图7中。如本文中所示，BRD4布罗莫结构域 抑制化合物和服D4的布罗莫结构域中的突变导致服D4蛋白从染色质的释放。当用具有形成 多聚体（例如，二聚体或四聚体）的能力的FP标记BRD4时，FP标签的亲和力促进FP标记的 BRD4聚集，并在细胞核中形成点/斑。此外，如本文中所示，利用单体FP(m0ragne2和 m化erry)标记的BRD4不显示抑制剂依赖性点/斑形成（图2)。另外，消除结合能力的BRD4布 罗莫结构域的突变即使在BRD4布罗莫结构域抑制剂不存在的情况下亦导致'点'表型（图 3)。响应于抑制剂的ZsGreen-BRD4再定位、聚集和点/焦点形成归因于布罗莫结构域结合亲 和力的抑制。FP标签在本系统中用于多个目的，包括促进标记的布罗莫结构域蛋白的聚集 和斑形成和用作检测方法。
[0167] 实施例2
[0168] 将含全长ZsGreen和BRD2的融合蛋白在细胞中表达W分析响应BRD2布罗莫结构域 抑制化合物的定位变化。
[0169] 方法
[0170] 将巧光蛋白（ZsGreen)在框内克隆在慢病毒载体中的人BRD2编码DNA序列（NP_ 001106653.1)的上游，所述载体在人EF1启动子的控制下表达Tet-化3G转录因子。在诱导 型TRE3G启动子下游的ZsGreen-BRD2编码区的表达可用多西环素诱导。利用运些表达质粒 构建体产生的慢病毒用于感染U20S骨肉瘤细胞(ATCC，HTB-96)W在15μg/ml杀稻溫素选择 下建立稳定的细胞。将稳定的细胞置于Nunc? Lab-Tek? II培养腔室载玻片上W进行共聚 焦显微镜观察。用化g/ml多西环素处理细胞16小时，随后在成像之前与DMSO或BRD2抑制剂 解育4小时。将Zeiss LSM510倒置共聚焦显微镜或具有加热台的LSM780共聚焦显微镜用于 检查FP标记的BRD2的亚细胞核定位。利用ZeiSS ZEN软件分析获得的图像。
[0171] 结果和讨论
[0172] 通过慢病毒感染和杀稻攝素选择产生稳定地携带可诱导的N-末端ZsGreen标记的 全长BRD2的U20S细胞系（图8A)。为了测试在被布罗莫结构域抑制剂从染色质释放后 ZsGreen-B畑2蛋白是否形成点/斑，用多西环素诱导稳定的U20S/ZsGreen-BRD2细胞，然后 用媒介物(DMS0)或ΙΟμΜ的布罗莫结构域抑制剂JQ1 (CAS#126524-70-4)处理细胞4小时，随 后利用共聚焦显微镜进行活细胞成像。JQ1处理导致ZsGreen-BRD2蛋白在细胞核中的再定 位和点/斑形成（图8B)。该抑制剂依赖性斑形成表型与在形成二聚体或多聚体的融合于FP 标签的BRD4的情况下观察到的聚集表型相似(图2)。
[017引实施例3
[0174]将含全长ZsGreen和BRD3的融合蛋白在细胞中表达W分析响应于BRD3布罗莫结构 域抑制化合物的定位变化。
[0Π 引方法
[0176]将巧光蛋白（ZsGreen)在框内克隆在慢病毒载体中的人BRD3编码DNA序列（NP_ 031397.1)的上游，所述载体在人EF1启动子的控制下表达Tet-化3G转录因子。在诱导型 TRE3G启动子下游的ZsGreen-BRD3编码区的表达可用多西环素诱导。利用运些表达质粒构 建体产生的慢病毒用于感染U20S骨肉瘤细胞(ATCC，HTB-96) W在15μg/ml杀稻溫素选择下 建立稳定的细胞。将稳定的细胞置于Nunc? Lab-Tek? II培养腔室载玻片上W进行共聚焦 显微镜观察。用化g/ml多西环素处理细胞16小时，随后在成像之前与DMS0或BRD3抑制剂解 育4小时。将Zeiss LSM510倒置共聚焦显微镜或具有加热台的LSM780共聚焦显微镜用于检 查FP标记的BRD3的亚细胞核定位。利用ZeiSS ZEN软件分析获得的图像。
[0Π7]结果和讨论
[0178] 通过慢病毒感染和杀稻攝素选择产生稳定地携带可诱导的N-末端ZsGreen标记的 全长BRD3的U20S细胞系（图9A)。为了测试在被布罗莫结构域抑制剂从染色质释放后 ZsGreen-B畑3蛋白是否形成点/斑，用多西环素处理稳定的U20S/ZsGreen-BRD3细胞，然后 将细胞与媒介物(DMS0)或lOpM的布罗莫结构域抑制剂JQl(CAS#1268524-70-4)解育4小时， 随后进行活细胞成像。与利用ZsGreen-BRD2和ZsGreen-BRD4产生的发现相似，ZsGreen- BRD3蛋白响应于BRD3布罗莫结构域抑制化合物JQ1而形成巧光点/斑（图9B)。
[0179] 实施例4
[0180] 设计和进行本实施例中的实验来建立测定抑制BRD9布罗莫结构域的化合物的细 胞作用的方法。使含有全长BRD9和巧光蛋白的融合蛋白在细胞中表达W分析由布罗莫结构 域抑制剂引起的定位变化的斑形成。
[0181] 方法
[0182] 将巧光蛋白（ZsGreen或mVenus)在框内克隆在慢病毒载体中的人BRD9编码DNA序 列（NCBI NP_076413.3)的下游，所述载体在人EFl启动子的控制下表达Tet-On 3G转录因 子。位于诱导型TRE3G启动子下游的B畑9-ZsGreen和B畑9-ZsGreen编码区的表达可用多西 环素诱导。利用运些表达质粒构建体产生的慢病毒用于感染U20S骨肉瘤细胞(ATCC，HTB- 96)W在15μg/ml杀稻溫素选择下建立稳定的细胞。将稳定的细胞置于Nunc? Lab-Tek? II 培养腔室载玻片上W进行共聚焦显微镜观察。用化g/ml多西环素处理细胞16小时，随后在 成像之前与DMS0或BRD9抑制剂(BDi-B、BDi-C和抓i-D)解育4小时。将Zeiss LSM510倒置共 聚焦显微镜或具有加热台的LSM780共聚焦显微镜用于检查FP标记的BRD9的在细胞核中的 定位。利用Zeiss ZEN软件分析获得的图像。
[0183] 结果和讨论
[0184] 通过慢病毒感染和杀稻攝素选择产生稳定地携带具有C末端ZsGreen标签的可诱 导的全长BRD9的U20S细胞系（图10A)。为了进一步研究布罗莫结构域抑制对BRD9-ZsGreen 定位的作用，利用多西环素诱导巧光融合蛋白的表达，并利用媒介物(DMS0)或ΙΟμΜ的BRD9 布罗莫结构域抑制剂(化合物BDi-C或BDi-D)处理细胞4小时，随后利用共聚焦显微镜进行 活细胞成像。BRD9-ZsGreen的定位响应于两种BRD9抑制剂而从弥散分布变成巧光点/斑（图 10B)。运些结果表明B畑9-ZsGreen被B畑9布罗莫结构域抑制剂从染色质置换，随后形成巧 光点/斑。此外，当点突变(N216Y)被引入BRD9的布罗莫结构域中W消除其结合活性时（图 11A)，缺乏针对染色质的结合亲和力的突变型服D9-ZsGreen即使在染色体质抑制化合物不 存在的情况下亦形成巧光点（图11B)。综上所述，该布罗莫结构域突变型蛋白的'点'表型也 表明，利用化合物处理产生的野生型B畑9-ZsGreen的'点'表型归因于服D9布罗莫结构域的 功能性破坏。
[018引为了研究FP标签对'点/斑'表型的贡献，将BRD9融合于单体FP(mVenus)，所述 mVenus不促进蛋白质聚集（图12A)。如所预期的，使用DMS0或BRD9抑制剂(化合物BDi-D)不 存在明显的BRD9-mVenus的定位差异，并且巧光信号均匀分布在细胞核中（图12B)。产生 mVenus-标记的BRD9的布罗莫结构域突变型等位基因（N216Y)来进一步确认利用布罗莫结 构域抑制剂的发现（图12C)。与突变型BRD9-ZsGreen相反（图11B)，突变型BRD9-mVenus弥散 地位于细胞核中，尽管其不能结合染色质（图12D)。运些结果再次表明，巧光蛋白对标记的 布罗莫结构域蛋白的定位的作用。ZsGreen蛋白具有形成四聚体的能力，然而mVenus W单体 蛋白质存在。当FP标签具有寡聚化的倾向时，被抑制剂从染色质释放的标记的布罗莫结构 域蛋白可聚集，并且形成巧光点/斑。如果标签不能够形成寡聚物(例如，mVenus),则标记的 罗莫结构域蛋白保持弥散分布，即使它们不结合于染色质。注意，染色质在大多数细胞中的 分布是弥散的（图4)并且显微镜检查不具有区分结合与未结合状态的BRD9-mVenus的弥散 定位的分辨率。
[0186] 实施例5
[0187] 研究在含布罗莫结构域蛋白的其它区域不存在的情况下，布罗莫结构域模块与报 告模块(此处为巧光蛋白标签)一起用于建立测定法并测定细胞中的抑制剂活性的用途。 [018引方法
[0189] 将3个拷贝的核定位序列(DPKKK服VKSEQ ID N0:1)融合于CECR2布罗莫结构域编 码DNA序列(NCBI NP_113601.2的氨基酸残基424-538)的N末端，后跟ZsGreen编码序列。将 该融合表达构建体克隆进慢病毒载体，所述载体在人EF1启动子的控制下表达Tet-化3G转 录因子。受诱导型TRE3G启动子控制的化S-CECR2.抓-ZsGreen的表达用多西环素来诱导。将 利用运些表达质粒构建体产生的慢病毒用于感染U20S骨肉瘤细胞(ATCC，HTB-96) W在15μ g/ml杀稻攝素选择下建立稳定的细胞。将稳定的细胞涂板在6孔或96孔板中W进行显微镜 分析。用化g/ml多西环素处理细胞16小时，随后与DMSO或CECR2抑制剂解育4小时，随后用 4% 甲醒固定。将Nikon倒置巧光显微镜化clipse TS100)或ImageXpress Mic;ro(Molecular Devices)用于检查化S-CECR2.抓-ZsGreen在细胞核中的定位。
[0190] 从上述慢病毒载体扩增融合蛋白的编码序列，并将其连接进入基于pET的细菌表 达载体。表达缺乏CECR2融合物的亲代ZsGreen蛋白的载体购自Clontech。将每一种载体转 化进入化-21pLysS Rosetta细胞化MD Millipore)，并且通过在簇节西林上涂板选择单个 菌落。使培养物在LB肉汤中生长，并通过添加 IPTG(在A600 = 0.4-0.6时）诱导蛋白质的表 达。在2.5小时的表达后收获细胞，并将其在-80°C胆存过夜。将细胞重悬浮于50mM化iS，pH 7.5,300mM化Cl，lmM抓ΤΑ和ImM DTT中，并通过超声处理进行裂解。通过裂解物的离屯、和 过滤除去细胞碎片，随后将其用于尺寸排阻柱（SEC-3000;Phenomenex)。利用在线检测器 (FP-2020P1US;化SCO)检测绿色巧光蛋白。
[0191] 结果和讨论
[0192] 通过慢病毒感染和杀稻攝素选择产生稳定地携带可诱导的化S-CECR2.BD- ZsGreen的U20S细胞系（图13A)。融合蛋白弥散地位于细胞核中，并且在CECR2布罗莫结构域 抑制剂不存在的情况下显示均匀分布。与CECR2抑制剂(化合物抓i-E)的解育导致ZsGreen 标记的蛋白的巧光点/斑形成（图13B)。运表明CECR2.BD与染色质的结合被抑制剂抑制，并 且释放至核质中。游离化S-CECR2.抓-ZsGreen融合蛋白随后聚集并形成巧光点（斑）。
[0193] 将化S-CECR2.抓-ZsGreen融合物在大肠杆菌化.CO1 i)细菌中表达W与缺乏CECR2 融合的ZsGreen比较。裂解细胞，并使裂解物经历凝胶过滤（尺寸柱）和巧光检测W使 ZsGreen蛋白可视化。CECR2融合蛋白被洗脱在空隙体积级分中，运表明是大的蛋白质复合 物(〉700kD)。如所预期的，缺乏CECR2融合的ZsGreen蛋白形成四聚体和二聚体但无种类在 空隙体积中洗脱（图14)。运些结果与我们的模型（巧光点含有大的蛋白质聚集体)一致（图 7)。
[0194] 实施例6
[0195] 为了探索使用串联布罗莫结构域模块(但不一定是含布罗莫结构域蛋白的其它区 域)与标签(例如，巧光蛋白标签)建立测定抑制剂在细胞中的活性的测定法的概念，进行下 列实验。
[0196] 方法
[0197] 将3个拷贝的核定位序列(DPKKK服VKSEQ ID N0:1)融合于TAF1的2个串联布罗莫 结构域(NCBI NP_004597.2的氨基酸残基1406-1640)的编码DNA序列的N末端，后跟ZsGreen 编码序列。将Q5"定点诱变试剂盒(New England Bi化abs)用于产生布罗莫结构域突变型 等位基因，其中位置1481和1604上的天冬酷胺残基被突变成酪氨酸。将野生型和突变型融 合表达构建体克隆进慢病毒载体，所述载体在人EF1启动子的控制下表达Tet-化3G转录因 子。受诱导型TRE3G启动子控制的化S-TAFl.BD-ZsGreen的表达用多西环素来诱导。将利用 运些表达质粒构建体产生的慢病毒用于感染U20S骨肉瘤细胞(ATCC，HTB-96)W在15μg/ml 杀稻攝素选择下建立稳定的细胞。将稳定的细胞涂板在6孔或96孔板中W进行显微镜分析。 用2μg/ml多西环素处理细胞16小时，随后与DMSO或CECR2抑制剂解育4小时，随后用4%甲醒 固定。将Zeiss LSM510倒置共聚焦显微镜或具有加热台的LSM780共聚焦显微镜用于检查细 胞核中的巧光蛋白的定位。利用Zeiss ZEN软件分析获得的图像。
[0198] 结果和讨论
[0199] 将稳定地携带可诱导的化S-TAFl.BDl.BD2-ZsGreen的U20S细胞（图15A)与多西环 素解育W诱导巧光蛋白的表达，随后利用媒介物(DMS0)或TAF1布罗莫结构域抑制剂处理4 小时。ZsGreen标记的TAF1布罗莫结构域弥散地分布在媒介物对照的细胞核中，表明融合蛋 白结合于染色质。在另一方面，标记的蛋白质在TAF1布罗莫结构域抑制化合物(BDi-F)存在 的情况下再定位和形成巧光点/斑（图15B)。运些结果显示，布罗莫结构域抑制剂破坏FP标 记的布罗莫结构域蛋白与染色质的结合，并且FP标记的布罗莫结构域蛋白在被从染色质释 放后，形成巧光点/斑。此外，当将消除布罗莫结构域结合能力的点突变引入NLS- TAFl.BDl.BD2-ZsGreen的两个TAF1布罗莫结构域(图16A)和将所得的慢病毒构建体用于建 立稳定的U20S细胞后，所述布罗莫结构域突变型蛋白即使在布罗莫结构域抑制化合物不存 在的情况下亦形成巧光点/斑（图16B)。因此，含有两个布罗莫结构域模块的FP融合蛋白响 应于布罗莫结构域抑制化合物而形成巧光点/斑，并且该类型的工程化细胞系统可用于测 定潜在布罗莫结构域抑制化合物的细胞内活性。
[0200] 实施例7
[0201] 设计和进行本实施例中的实验来确定使用含全长布罗莫结构域的蛋白质的主链 开发用于另一个布罗莫结构域的巧光再定位/点形成测定(通过用嵌合布罗莫结构域模块 替代所述全长布罗莫结构域的布罗莫结构域模块)的可行性。
[0202] 方法
[0203] 将巧光蛋白（ZsGreen)在框内克隆在人B畑9编码DNA序列(NCBI NP_076413.3)的 下游，其中所述布罗莫结构域编码序列（氨基酸残基114-253)被人BAZ2B(NCBI NP_ 038478.2;氨基酸残基2039-2166)或人PCAF/KAT2B(NCBI NP 003875.3;氨基酸残基696- 820)的布罗莫结构域序列替代。将嵌合BAZ2B-B畑9-ZsGreen或PCAF-B畑9-ZsGreen融合序 列克隆进慢病毒载体，所述载体在人EF1启动子的控制下表达Tet-化3G转录因子。位于诱 导型TRE3G启动子下游的ZsGreen标记的嵌合蛋白的表达可用多西环素诱导。利用运些表达 质粒构建体产生的慢病毒用于感染U20S骨肉瘤细胞(ATCC，HTB-96)W在15μg/ml杀稻溫素 选择下建立稳定的细胞。将稳定的细胞涂板于Nunc? Lab-Tek? II培养腔室载玻片上W进 行共聚焦显微镜观察。用化g/ml多西环素处理细胞16小时W诱导嵌合巧光蛋白。在成像之 前将表达BAZ2B-B畑9-ZsGreen的细胞与DMS0或BAZ^抑制剂解育4小时。将表达PCAF-B畑9- ZsGreen的细胞与DMS0或PCA巧Φ制剂解育16小时，随后成像。具有加热台的Zeiss LSM510倒 置共聚焦显微镜或ImgaeXpress Mic;ro(Molecular Devices)用于检查ZsGreen标记的嵌合 蛋白的定位。利用Zeiss ZEN软件分析获得的图像。
[0204] 结果和讨论
[0205] 为了探索使用BRD9-ZsGreen再定位测定(实施例4中描述的）建立用于其它布罗莫 结构域的测定系统的可能性，产生嵌合BRD9-ZsGreen表达构建体（称为BAZ2B-BRD9- ZsGreen)，其中BRD9布罗莫结构域被BAZ2B的布罗莫结构域替代。将稳定地携带可诱导的 BAZ2B-BRD9-ZsGreen的U20S细胞与多西环素解育（图17A)，W诱导巧光蛋白的表达，随后用 媒介物(DMSO)或布罗莫结构域抑制化合物进行处理。位于布罗莫结构域上游离的服D9的核 定位序列将ZsGreen标记的嵌合蛋白带至细胞核。该嵌合蛋白的分布散布在媒介物对照的 细胞核中。在另一方面，用BAZ2B布罗莫结构域抑制化合物(BDi-G)处理改变嵌合蛋白的定 位W形成巧光点/斑（图17B)。运些结果显示BAZ^抑制剂破坏BAZ2B-B畑9-ZsGreen蛋白与 染色质之间的相互作用，随后因 ZsGreen标签的聚集性质而引起巧光点/斑形成。
[0206] 类似地，将B畑9-ZsGreen主链用于产生PCAF布罗莫结构域嵌合构建体（图18A)来 确定是否可针对PCAF布罗莫结构域建立细胞测定来分析PCAF布罗莫结构域抑制化合物。将 U20S/PCAF-B畑9-ZsGreen细胞与多西环环素解育过夜，W诱导ZsGreen标记的嵌合蛋白表 达，随后进行媒介物（DMS0)或PCA巧Φ制化合物（抓i-H)处理。PCAF-BRD9-ZsGreen蛋白在 DMS0存在的情况下弥散地分布在细胞核中，而PCAF布罗莫结构域抑制剂导致蛋白质再定位 和点/斑形成（图18B)。该结果与在布罗莫结构域抑制化合物存在的情况下ZsGreen标记的 布罗莫结构域蛋白再定位和形成点/斑一致，所述布罗莫结构域抑制化合物抑制布罗莫结 构域模块的结合活性。综上所述，本实施例中的实验数据证明FP标记的含有来自另一种蛋 白的替代布罗莫结构域的嵌合型含布罗莫结构域蛋白响应于布罗莫结构域抑制化合物并 且能够形成巧光点/斑。
【主权项】
1. 一种融合蛋白，其包含至少一个染色质结合模块和至少一个报告模块，其中多个融 合蛋白能够形成斑。2. 根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含含有至少一个染色质结合 模块的第一染色质结合多肽，其中所述第一染色质结合多肽的染色质结合模块的至少一个 已被缺失、被第二染色质结合多肽的至少一个染色质结合模块取代和/或替代。3. 根据权利要求1-2中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含含有至少一个 染色质结合模块的第一染色质结合多肽，其中所述第一染色质结合多肽的染色质结合模块 的至少一个已被第二染色质结合多肽的至少一个布罗莫结构域模块替代。4. 根据权利要求1-3中任一项所述的融合蛋白，其中所述至少一个报告模块包括至少 一个焚光报告模块。5. 根据权利要求4所述的融合蛋白，其中所述至少一个报告模块包括EGFP、TurboGFP、 dsRed2、dsRed_Express2i^ZsGreen〇6. 根据权利要求1-5中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含核定位信号 (NLS)〇7. 根据权利要求6所述的融合蛋白，其中所述NLS是SV40大T-抗原NLS或核浆素的NLS。8. 根据权利要求1-7中任一项所述的融合蛋白，其中所述至少一个染色质结合模块位 于所述报告模块的5'。9. 根据权利要求1-7中任一项所述的融合蛋白，其中所述至少一个染色质结合模块位 于所述报告模块的3'。10. 根据权利要求1-9中任一项所述的融合蛋白，其中所述至少一个染色质结合模块是 布罗莫结构域模块、PHD指模块、染色质域模块、MBT结构域模块、tudor结构域模块、PWWP结 构域模块、ADD结构域模块、Zf-CW结构域模块、锚蛋白重复模块或WD40模块。11. 根据权利要求10所述的融合蛋白，其中所述至少一个染色质结合模块是布罗莫结 构域模块。12. 根据权利要求11所述的融合蛋白，其中所述至少一个布罗莫结构域模块包含BRG1、 PCAF/KAT2B、BAZ2B、BRD1、BRD8、BRFP1、BRFP3、BRG1、CBP/CREBBP、PCAF/KAT2B、TRIM24和/或 ZMYND8的任一个的至少一个布罗莫结构域。13. 根据权利要求11所述的融合蛋白，其中所述至少一个布罗莫结构域模块包含BRD2、 8^)3、8^)4、81^9、81^1'和/或81?1的任一个的至少一个布罗莫结构域。14. 根据权利要求11所述的融合蛋白，其中所述至少一个布罗莫结构域模块包含BRG1、 BRPF1、CECR2、PCAF和/或TAF1的任一个的至少一个布罗莫结构域。15. 根据权利要求11所述的融合蛋白，其中所述至少一个布罗莫结构域模块包含BRD4 和/或BRD9的至少一个布罗莫结构域。16. 根据权利要求11-15中任一项所述的融合蛋白，其中所述布罗莫结构域多肽包含 BRG1、PCAF/KAT2B、BAZ2B、BRD1、BRD8、BRFP1、BRFP3、BRG1、CBP/CREBBP、PCAF/KAT2B、TRIM24 和/或ZMYND8的任一个或包含至少一个布罗莫结构域模块的其片段的氨基酸序列。17. 根据权利要求11-15中任一项所述的融合蛋白，其中所述布罗莫结构域多肽包含 8^)2、81?3、81^4、81^9、81^1'和/或81?1的任一个或包含至少一个布罗莫结构域模块的其片 段的氨基酸序列。18. 根据权利要求11-15中任一项所述的融合蛋白，其中所述布罗莫结构域多肽包含 BRG1、BRPF1、CECR2、PCAF和/或TAF1的任一个或包含至少一个布罗莫结构域模块的其片段 的氨基酸序列。19. 根据权利要求11-15中任一项所述的融合蛋白，其中所述布罗莫结构域多肽包含 BRD4和/或BRD9或包含至少一个布罗莫结构域模块的其片段的氨基酸序列。20. 根据权利要求16-19中任一项所述的融合蛋白，其中所述布罗莫结构域多肽包含全 长布罗莫结构域多肽。21. 根据权利要求1-20中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白能够多聚化。22. 根据权利要求1-21中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白能够形成二聚体、 三聚体或四聚体。23. 根据权利要求22所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白能够形成二聚体。24. 根据权利要求22所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白能够形成四聚体。25. -种核酸序列，其编码权利要求1-24中任一项所述的融合蛋白。26. -种表达盒，其包含权利要求25所述的核酸序列。27. -种细胞，其包含权利要求1-24中任一项所述的融合蛋白。28. 根据权利要求 27 所述的细胞，其为 CH0-K1、C0S-7、HEK293、HEK293T、HEK293FT、 HeLa、MDCK 或 U20S 细胞。29. 根据权利要求28所述的细胞，其为COS-7、HeLa或U20S细胞。30. -种用于确定测试化合物是否是布罗莫结构域抑制化合物的方法，所述方法包括 (a)将权利要求27-29中任一项所述的细胞与所述测试化合物接触，和(b)确定所述测试化 合物是否改变融合蛋白的定位和/或增加融合蛋白斑的形成，其中定位的改变和/或斑形成 的增加表明所述测试化合物是布罗莫结构域抑制化合物。31. -种试剂盒，其包含权利要求1-29中任一项所述的融合蛋白、核酸序列、表达盒或 细胞。
【专利摘要】本发明涉及包含至少一个染色质结合模块和至少一个报告模块的融合蛋白，其中多个融合蛋白能够形成斑；和用于鉴定布罗莫结构域抑制化合物的相关方法。
【IPC分类】C07K14/47
【公开号】CN105555798
【申请号】CN201480026171
【发明人】黄宏仁, 罗伯特·J·西姆斯三世, S·F·贝洛
【申请人】星座制药股份有限公司
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2014年3月14日
【公告号】CA2903547A1, EP2970414A1, US20160002306, WO2014144303A1
【专利说明】用于鉴定布罗莫结构域抑制化合物的融合蛋白和方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本专利申请要求2013年3月15日提交的美国申请系列第61/798,644号和2013年11 月11日提交的美国申请系列第61/902,690号的优先权的权益，所述申请通过引用并入本 文。
[000引背景
[0004] 染色质是DNA与蛋白质的复杂组合。其在真核细胞的细胞核内被发现并且被分为 异染色质(凝聚的）和常染色质（展开的）形式。组蛋白是染色质的主要蛋白质组分，用作DNA 围其缠绕的线轴。染色质的功能是将DNA包装成更小的体积W容纳进细胞，增强DNAW使得 能够进行有丝分裂和减数分裂，W及用作控制表达和DNA复制的机构。染色质结构由一系列 对组蛋白尤其是组蛋白H3和H4的翻译后修饰（最常见地在延伸至核屯、核小体结构外部的 "组蛋白尾"内）控制。组蛋白尾易于释放出来参与蛋白质间相互作用，并且也是最易受到翻 译后修饰的组蛋白的部分。运些修饰包括乙酷化、甲基化、憐酸化、泛素化、SUMO化。运些表 观遗传标志物通过特殊酶书写和删除，所述酶将标签置于组蛋白尾内的特定残基上，从而 形成表观遗传密码，所述密码随后由细胞解释W允许染色质结构的基因特异性调控，并从 而允许转录。
[0005] 在所有种类的蛋白质中，组蛋白是其中最易于受到翻译后修饰的。组蛋白修饰是 动态的，因为它们可响应于特定刺激而被添加或除去，并且运些修饰指导染色质的结构变 化和基因转录的变化。不同种类的酶，即组蛋白乙酷基转移酶(HAT)和组蛋白脱乙酷基酶 化DAC)，使特定的组蛋白赖氨酸残基乙酷化或去乙酷化(Str化1 K.，Genes Dev.，1989，12， 5,599-606)〇
[0006] 组蛋白的共价修饰是基因表达的基本控制机制，和在真核细胞中起作用的主要表 观遗传机制之一化ouzarides,Cell ,128,693-705(2007))。因为不同的转录状态确定基本 细胞过程，诸如细胞类型规范、谱系定型、细胞活化和细胞死亡，所W它们的异常调控是一 系列疾病的核屯、（Medzhi to V等，Nat. Rev . Immunol. ,9,692-703(2009); Porte la等， Nat.Biotech. ,28,1057-1068(2010))。基因表达的表观遗传控制的基本组成部分是具有结 合于此类修饰的专口基序的蛋白质对组蛋白修饰的解释。其中，布罗莫结构域已演化来结 合于乙酷化组蛋白并且通过运样做，他们代表了染色质结构与基因转录之间的根本联系 (Fi 11 ipakoppou 1OS等，Ce 11，149，214-231 (2012))。
[0007] 布罗莫结构域，其长度约为110个氨基酸，在大量染色质结合蛋白中均有发现，并 且已在约70种人蛋白质中被鉴定，通常与其它蛋白质基序相邻(Jea皿ougin F.等，Trends Biochem.Sci. ,1997,22,5,151-153;和 Tamkun J.W.等，Cell ,1992,7,3,561-572)。布罗莫 结构域与经修饰的组蛋白之间的相互作用可W是染色质结构变化和基因调控背后的重要 机制。含布罗莫结构域的蛋白质已牵设疾病过程包括癌症、炎症和病毒复制。参见，例如， Prinjha等，Trends 陆arm.Sci. ,33(3): 146-153(2012)和Muller等，Expert Rev. ,13(29): 1-20(2011年9月）。
[0008] 细胞类型特异性和适当的组织功能性需要最终受它们的环境影响的不同转录程 序的严格控制。对该转录稳态的改变与许多疾病状态直接相关，最特别地是癌症、免疫炎 症、神经性障碍和代谢疾病。布罗莫结构域存在于用于控制独特的疾病相关转录途径的关 键染色质修饰复合物内。运通过含有布罗莫结构域的蛋白质中的突变与癌症W及免疫及神 经功能障碍相关的观察得W突显。因此，跨家族的布罗莫结构域的选择性抑制为作为人功 能障碍的新型治疗剂创造各种机会。
[0009] 存在对癌症、免疫性病症和其它布罗莫结构域相关疾病的治疗的需要。运样，需要 用于鉴定为布罗莫结构域抑制化合物的化合物的方法。
[0010] 本文中引用的所有参考资料，包括专利申请和出版物通过引用整体并入。
[00川概述
[0012] 本文中提供了包含至少一个染色质结合模块和至少一个报告模块的融合蛋白和 其使用方法。本发明的一个方面是包含至少一个染色质结合模块和至少一个报告模块的融 合蛋白，其中多个融合蛋白能够再定位和/或形成斑。
[0013] 在任何融合蛋白的某些实施方案中，融合蛋白包含含有至少一个染色质结合模块 的第一染色质结合多肤，其中所述第一染色质结合多肤的染色质结合模块的至少一个已被 缺失、被第二染色质结合多肤的至少一个染色质结合模块取代和/或替代。在某些实施方案 中，融合蛋白包含含有至少一个染色质结合模块的第一染色质结合多肤，其中所述第一染 色质结合多肤的染色质结合模块的至少一个已被第二染色质结合多肤的至少一个布罗莫 结构域模块替代。
[0014] 在任何融合蛋白的某些实施方案中，融合蛋白包含1、2、3、4、5和/或6个染色质结 合模块中的约任一个。
[0015] 在任何融合蛋白的某些实施方案中，所述报告模块是巧光报告模块。在某些实施 方案中，所述报告模块包括EGFP、TurboGFP、dsRed2、dsRed-Express2或ZsGreen。
[0016] 在任何融合蛋白的某些实施方案中，所述融合蛋白包含核定位信号(NLS)。在某些 实施方案中，所述化S是SV40大T-抗原化S或核浆素的化S。
[0017] 在任何融合蛋白的某些实施方案中，所述染色质结合模块位于报告模块的5'。在 任何融合蛋白的某些实施方案中，所述染色质结合模块位于报告模块的3'。
[0018] 在任何融合蛋白的某些实施方案中，所述染色质结合模块是布罗莫结构域模块， P皿指模块、染色质域模块、MBT结构域模块、tudor结构域模块、PWWP结构域模块、A孤结构域 模块、Zf-CW结构域模块、错蛋白重复模块或WD40模块。在某些实施方案中，所述染色质结合 模块是布罗莫结构域模块。
[0019] 在任何融合蛋白的某些实施方案中，所述至少一个布罗莫结构域模块包含BRG1、 PCAF/KAT2B、BAZ2B、B畑1、B畑8、BRFP1、BRFP3、BRG1、CBP/CREBBP、PCAF/KAT2B、TRIM24和/或 ZMYND8的任一个的至少一个布罗莫结构域。在某些实施方案中，所述至少一个布罗莫结构 域模块包含B畑2、B畑3、B畑4、BRD9、B畑T和/或BRG1的任一个的至少一个布罗莫结构域。在 某些实施方案中，所述至少一个布罗莫结构域模块包含81?61、81?^1八60?2、？〔4。和/或了八尸1 的任一个的至少一个布罗莫结构域。在某些实施方案中，所述至少一个布罗莫结构域模块 包含BRD4和/或BRD9的至少一个布罗莫结构域。
[0020] 在任何融合蛋白的某些实施方案中，所述布罗莫结构域多肤包含BRGUPCAF/ ZMYND8的任一个或包含至少一个布罗莫结构域模块的其片段的氨基酸序列。在某些实施方 案中，布罗莫结构域多肤包含BRD2、B畑3、BRD4、B畑9、BRDT和/或服G1的任一个或包含至少 一个布罗莫结构域模块的其片段的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述布罗莫结构域多 肤包含81?61、81?^1^60?2、？〔4。和/或了4。1的任一个或包含至少一个布罗莫结构域模块的 其片段的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述布罗莫结构域多肤包含服D4和/或服D9或包 含至少一个布罗莫结构域模块的其片段的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述布罗莫结 构域多肤包含全长布罗莫结构域多肤。
[0021] 在任何融合蛋白的某些实施方案中，融合蛋白能够多聚化。在某些实施方案中，融 合蛋白能够形成二聚体、Ξ聚体或四聚体。在某些实施方案中，融合蛋白能够形成二聚体。 在某些实施方案中，融合蛋白能够形成四聚体。
[0022] 本发明的一个方面是编码本文所述融合蛋白的核酸序列（例如，DNA或RNA)。本发 明的一个方面是包含所述核酸序列的表达盒。本发明的一个方面是包含所述表达盒的细 胞。
[0023] 本发明的一个方面是包含本文所述融合蛋白的细胞。
[0024] 在某些实施方案中，所述细胞是C册-KUC0S-7、肥K293、肥K293T、肥K293FT、HeLa、 MDCK或U20S细胞。在某些实施方案中，所述细胞是COS-7、化La或U20S细胞。
[0025] 本发明的一个方面是用于确定测试化合物是否是布罗莫结构域抑制化合物的方 法，所述方法包括(a)将包含含有至少一个染色质结合模块和至少一个报告模块的融合蛋 白的本文所述细胞与所述测试化合物接触和(b)确定所述测试化合物是否诱导融合蛋白的 再定位和/或增加融合蛋白斑的形成，其中融合蛋白的再定位和/或斑的形成的增加表明所 述测试化合物是布罗莫结构域抑制化合物。
[0026] 本发明的一个方面是包含本文所述融合蛋白、核酸、表达盒或细胞的试剂盒。
[0027] 附图简述
[0028] 图1描绘本发明的某些融合蛋白。
[0029] 图2描绘显示当报告模块包含可形成多聚体(例如，二聚体或四聚体）的蛋白质时 融合蛋白响应于抑制剂而形成点/斑。
[0030] 图3描绘ZsGreen-BRD4融合蛋白（A)和在两个布罗莫结构域模块中具有阻止与染 色质结合的点突变的ZsGreen-BRD4融合蛋白（B)的定位。突变型ZsGreeen-BRD4融合蛋白即 使在抑制剂不存在的情况下亦被定位至细胞核中的点/斑块中（图3B)，而野生型融合蛋白 在相同条件下显示弥散定位(图3A)。
[0031] 图4描绘显示抑制化合物阻止布罗莫结构域结合染色质（其利用化echst 33342来 进行染色）的其它结果。
[0032] 图5描绘显示融合蛋白再定位的快速动力学的结果。可通过随后斑形成来实时监 测抑制剂的作用。
[0033] 图6描绘显示再定位和斑形成是可用于测定细胞环境中抑制剂的效力的可滴定表 型的结果。
[0034] 图7呈现关于响应于抑制剂的斑形成的可能机制的一个非限制性模型。
[003引图8A-B描绘在B畑2、BRD3、BRD4和B畑T布罗莫结构域抑制化合物JQ1不存在(A)和 存在(B)的情况下ZsGreen-BRD2融合蛋白的定位。JQ1处理导致ZsGreen-BRD2融合蛋白与染 色质的相互作用的破坏和点/斑的形成。
[0036] 图9A-B描绘在JQ1不存在(A)和存在(B)的情况下ZsGreen-BRD3融合蛋白的定位。 JQ1处理导致ZsGreen-B畑捕虫合蛋白与染色质的相互作用的破坏和点/斑的形成。
[0037] 图10A-B描绘在服D9布罗莫结构域抑制化合物抓i-B和抓i-C不存在(A)和存在(B) 的情况下BRD9-ZsGreen融合蛋白的定位。抑制剂处理导致BRD9-ZsGreen融合蛋白与染色质 的相互作用的破坏和点/斑的形成。
[0038] 图11A-B描绘BRD9-ZsGreen融合蛋白（A)和在布罗莫结构域模块中具有阻止与染 色质结合的点突变(N216Y)的BRD9-ZsGreen融合蛋白（B)的定位。缺少对染色质的结合亲和 力的突变型BRD9-ZsGreen即使在染色质抑制化合物不存在的情况下亦形成巧光点。
[0039] 图12A-D描绘使用DMSO(A)和BRD9布罗莫结构域抑制化合物BDi-D(B)的BRD9- mVenus融合蛋白的定位，和在布罗莫结构域模块中具有阻止与使用DMSO(D)处理的染色质 (C)的结合的点突变(N216Y)的突变型BRD9-mVenus的定位。布罗莫结构域抑制化合物和布 罗莫结构域突变都不导致巧光点/斑的形成。
[0040] 图13A-C描绘在CECR2布罗莫结构域抑制化合物BDi-E不存在(A)和存在(B)的情况 下化S-CECR2.BD-ZsGreen融合蛋白的定位。BDi-E处理导致当不结合于染色质时化S- CECR2.抓-ZsGreen斑的形成。
[0041] 图14描绘显示其它检测方法(其包括生物化学法诸如使用分级分离和免疫印迹） 的结果。
[0042] 图15A-B描绘在TAF1布罗莫结构域抑制化合物BDi-F不存在(A)和存在(B)的情况 下化S-TAF1. BD1. BD2-ZsGreen的定位。结果显示抑制剂破坏融合蛋白与染色质的结合，并 且融合蛋白在从染色质释放后形成斑。
[0043] 图16描绘在两个布罗莫结构域内都具有阻止对染色质结合的点突变的突变型 化S-TAF1.抓1.抓2-ZsGreen蛋白的定位(A)。结果显示即使在抑制化合物不存在的情况下 突变型融合蛋白亦形成斑(B)。
[0044] 图17A-B描绘在BAZ^布罗莫结构域抑制化合物BDi-G不存在(A)和存在(B)的情况 下BAZ2B-B畑9-ZsGreen融合蛋白（其中B畑9布罗莫结构域模块已被842沈的布罗莫结构域 模块替代的B畑9布罗莫结构域多肤）的定位。抓i-G处理导致BAZ2B-B畑9-ZsGreen融合蛋白 与染色质的相互作用的破坏和点/斑的形成。
[0045] 图18描绘在PCAF布罗莫结构域抑制化合物BDi-H不存在(A)和存在(B)的情况下， PCAF-BRD9-ZsGreen融合蛋白（其中BRD9布罗莫结构域模块已被PCAF的布罗莫结构域模块 取代的BRD9布罗莫结构域多肤）的定位。抓i-H处理导致PCAF-BRD9-ZsGreen融合蛋白与染 色质的相互作用的破坏和点/斑的形成。
[0046] 详述
[0047]本发明的某些方面设及包含至少一个染色质结合模块和至少一个报告模块的融 合蛋白，其中多个融合蛋白能够形成斑。运些融合蛋白可用于确定测试化合物是否是染色 质抑制化合物。本发明的某些实施方案提供利用所述融合蛋白确定测试化合物是否是染色 质抑制化合物的测定。虽然不必是本发明的限制，但据信在未处理状态下，融合蛋白通过染 色质结合模块与染色质之间的相作用结合染色质。例如，布罗莫结构域模块结合于乙酷化 染色质。当所述染色质结合模块结合位点被抑制剂阻断时，所述融合蛋白与染色质解离并 形成斑。细胞祀标衔接测定可用于监测w剂量依赖性方式进行的斑的形成。细胞核中的斑 可使用例如巧光检测，通过高容量显微镜来可视化和定量，W测定测试化合物作染色质抑 制化合物的效力。
[004引一般技术
[0049] 本发明的实践，除非另有说明，否则将使用分子生物学（包括重组技术）、微生物 学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述技术在本领域普通技术人员的能力范 围内。此类技术在文献中被全面解释，诸如"Molecular Cloning:A LaboratoiT Manual"， 第二版（Sambrook等，1989); "Oligonucleotide Synthesis" (Μ. J. Gait,编辑，1984); "Animal Cell Culture"(R. I.Freshney，编车茸，1987);"Methods in Enzymology" (Academic Press,Inc.);"Current Protocols in Molecular Biology"(F.M.Ausubel等， 编辑，1987,和定期更新）；''PCR:The Polymerase 畑 ain Reaction", (Mullis 等，编辑， 1994);"A Practical Guide to Mole州lar Cloning"(Perbal Bernard V.,1988)。
[0050] 可使用本领域中已知的标准技术产生本发明中使用或描述的寡核巧酸、多核巧 酸、肤、多肤和小分子。
[0051 ] 定义
[0052] 如本文中所用，术语"染色质结合模块"是指与染色质相互作用的染色质结合多肤 的区域和/或结构域的序列。染色质结合模块可包括，但不限于，下列结构域的至少一个： A孤、错蛋白重复序列、布罗莫结构域、染色质域、MBT、P皿指、PWWP、化dor、WD40或Zf-CW(也， 见Miyong化η等人Cell Research(2011)21:564-578,其在此通过引用整体并入）。
[0053] 如本文中所用，术语"染色质结合多肤"是指天然序列染色质结合多肤、天然序列 多肤的多肤变体和多肤变体(其在本文中被进一步定义）。本文所述染色质结合多肤可W是 从多种来源，诸如人组织类型或从另一种来源分离的，或通过重组或合成方法制备的染色 质结合肤。"天然序列染色质结合多肤"包括具有与来源于自然的对应染色质结合多肤相同 的氨基酸序列的多肤。染色质结合多肤包含至少一个染色质结合模块。
[0054] "染色质结合多肤变体"或其变型，意指如本文中定义的，与本文中公开的任何天 然序列染色质结合多肤序列具有至少约80%氨基酸序列同一性的染色质结合多肤，通常地 具有活性的染色质结合多肤。此类染色质结合多肤变体包括，例如，其中在天然氨基酸序列 的N末端或C末端上添加或缺少一个或多个氨基酸残基的染色质结合多肤。一般地，染色质 结合多肤变体将与天然序列染色质结合多肤序列具有至少约80%氨基酸序列同一性，可选 地至少约81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%或99%氨基酸序列同一性。一般地，染色质结合变体多肤的长 度为至少约10个氨基酸，可选地长度为至少约20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、 130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、 320、330、：340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、 510、520、530、540、550、560、570、580、590、600个氨基酸或更多氨基酸。任选地，染色质结合 变体多肤相较于天然染色质结合多肤序列将具有不超过一个保守氨基酸的取代，可选地相 较于天然染色质结合多肤序列将具有不超过2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸的取代。
[0055] 术语"布罗莫结构域模块"是指与染色质相互作用的布罗莫结构域多肤的布罗莫 结构域的序列。在某些实施方案中，所述布罗莫结构域模块包含全长布罗莫结构域。关于布 罗莫结构域结构和功能的一般综述，见，例如，Fi 1 ippakopou 1 οs等，Ce 11 149,214-231 (2012)，其在此通过引用整体并入。
[0056] 如本文中所用，术语"布罗莫结构域多肤"是指天然序列染色质结合多肤，天然序 列多肤的多肤变体和多肤变体(其在本文中被进一步定义）。本文所述的布罗莫结构域多肤 可W是从多种来源，诸如从人组织类型或从另一种来源分离的，或通过重组或合成方法制 备的布罗莫结构域多肤。"天然序列布罗莫结构域多肤"包括具有与来源于天然的对应布罗 莫结构域多肤相同的氨基酸序列的多肤。布罗莫结构域多肤包含至少一个布罗莫结构域模 块。
[0057] "布罗莫结构域多肤变体"或其变型意指如本文中定义的，与本文中公开的天然序 列布罗莫结构域多肤序列具有至少约80%氨基酸序列同一性的布罗莫结构域多肤，通常地 具有活性的布罗莫结构域多肤。此类布罗莫结构域多肤变体包括，例如，其中在天然氨基酸 序列的N或C末端上添加或缺失一个或多个氨基酸残基的布罗莫结构域多肤。一般地，布罗 莫结构域多肤变体将与天然序列染色质结合多肤序列具有至少约80%氨基酸序列同一性， 可选地至少约 81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%或99%氨基酸序列同一性。一般地，布罗莫结构域变体多肤的 长度为至少约10个氨基酸，可选地长度为至少约20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、 130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、 320、330、：340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、 510、520、530、540、550、560、570、580、590、600个氨基酸或更多氨基酸。任选地，布罗莫结构 域变体多肤将具有相较于天然布罗莫结构域多肤序列不超过一个保守氨基酸取代，可选地 相较于天然布罗莫结构域多肤序列不超过2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸取代。
[0058] 术语"报告模块"是指允许检测融合蛋白响应于阻止染色质结合模块的染色质结 合的化合物而发生的定位或分子性质的变化的氨基酸序列。例如，报告模块在在'结合'与 '末结合'状态之间引入了可测量的性质差异。例如，间接巧光法可用于使用针对TAG的抗体 检测TAG-BM-RM[ BM:结合模块，RM:报告模块]。
[0059] 术语"核酸"是指由含有糖、憐酸和为嚷岭或喀晚的碱基的单体(核巧酸)构成的脱 氧核糖核巧酸或核糖核巧酸和其聚合物，呈单链或双链形式。除非明确地受到限制，否则术 语涵盖含有天然核巧酸的已知类似物的核酸，所述核酸具有与参照核酸相似的结合性质并 且W与天然存在核巧酸相似的方式被代谢。除非另有说明，否则特定核酸序列还涵盖其保 守修饰变体(例如，简并密码子取代)和互补序列，W及明确地指出的序列。具体地，简并密 码子取代可通过产生其中一个或多个选定的（或所有)密码子的第Ξ位置被混合碱基和/或 脱氧肌巧残基取代的序列来实现。
[0060] 术语"核巧酸序列"是指可W是单链或双链的，任选地含有能够渗入DNA或RNA聚合 物的合成的、非天然的或改变的核巧酸碱基的DNA或RNA的聚合物。术语"核酸"、"核酸分子" 或"多核巧酸"可互换使用。
[0061] "分离的"多核巧酸是已与其天然环境的组分分离的多核巧酸。在一些实施方案 中，将抗体纯化至大于95 %或99 %的纯度，如通过例如电泳（例如，SDS-PAGE、等电聚焦 (IEF)、毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)测定的。关于用于多肤纯度的评估 的方法的综述，见，例如，Flatman等，J. Qiromatogr. B 848:79-87( 2007)。
[0062] "分离的"核酸是指已与其天然环境的组分分开的核酸分子。分离的核酸包括通常 含有核酸分子的细胞中包含的核酸分子，但所述核酸分子存在于染色体外，或存在于与其 天然染色体位置不同的染色体位置中。
[0063] 相对于参照多肤序列的"氨基酸序列同一性百分比（％ )"被定义为在比对序列和 引入缺口（必要时）W获得最大序列同一性百分比，并且不考虑任何保守取代作为序列同一 性的部分后，候选序列中与参照多肤序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。为 了测定氨基酸序列同一性百分比的比对可在本领域普通技术人员的能力范围内的各 种不同的方法来实现，例如，使用公共可获得的计算机软件诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或 Megal i gn (DNASTAR)软件来实现。本领域普通技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包 括在待比较的序列的全长范围内实现最大比对所需的任何算法。然而，为了本文中的目的， 使用序列比较计算机程序ALIGN-2来产生氨基酸序列同一性百分比值。ALIGN-2序列比较计 算机程序由Genentech，Inc.编写，并且源代码已与用户文档一起提交给美国版权局， Washington D. C .，20559，将所述源代码在美国版权局W美国版权登记号TX呪10087注册。 ALIGN-2程序是可从Genentech,Inc. ,Sou1:h San Rrancisco,California公共获得的，或可 从源代码编译而来。应当编译ALIGN-2程序W用于UNIX操作系统，包括数字UNIX V4.0D。所 有序列比较参数由ALIGN-2程序设置并且不变。
[0064] 在其中ALIGN-2用于氨基酸序列比较的情况下，如下计算给定的氨基酸序列A对、 与或针对给定的氨基酸序列B的氨基酸序列同一性百分比（运可选地可被表述为给定的氨 基酸序列A具有或包含对、与或针对给定的氨基酸序列B的某一氨基酸序列同一性百分比）： [006引 100X 分数 X/Y
[0066] 其中X为在A与B的该程序的比对中被序列比对程序ALIGN-2评分为相同的匹配的 氨基酸残基的数目，并且其中Y为B中的氨基酸残基总数。应理解，当氨基酸序列A的长度不 等于氨基酸序列B的长度时，A对B的氨基酸序列同一性百分比不等于B对A的氨基酸序列同 一性百分比。除非另外明确地说明，否则本文中使用的所有氨基酸序列同一性百分比值如 刚好前一段中所述使用ALIGN-2计算机程序获得。
[0067] 术语"大体同一性"，在肤的背景中，表示肤包含与参照序列在指定的比较窗中具 有至少 70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、 84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%，或94%或甚至95%、96%、97%、 98%或99%序列同一性的序列。在某些实施方案中，使用化edleman和Wunsch的同源性比对 算法(Needleman和Wunsch，JMB，48，443 (1970))来进行最佳比对。两个多肤序列大体上相同 的指示是一个多肤与针对第二肤产生的抗体具有免疫反应性。因此，例如当两个肤差异仅 在于保守取代时，肤与第二肤大体上相同。因此，本发明的某些实施方案提供与本文所述核 酸分子大体上相同的核酸分子。
[0068] 如本文中所用，术语"载体"是指能够增殖与其连接的另一个核酸的核酸分子。术 语包括作为自我复制核酸结构的载体W及被整合进其已被引入其中的宿主细胞的基因组 的载体。某些载体能够指导可操作地连接于它们的核酸的表达。此类载体在本文中被称为" 表达载体"。
[0069] "可操作地连接的"是指使得序列之一的功能通过另一个序列来实现的核酸序列 在单个核酸片段上的结合。例如，如果两个序列被运样放置W使得调控DNA序列实现编码 DM序列的表达(例如，编码序列或功能RNA处于启动子的转录控制下），则调控DM序列被认 为是"可操作地连接于"编码RNA或多肤的DNA序列或"与所述DNA连接的"。编码序列可W W 有义或反义方向可操作地连接于调控序列。当核酸被置于与另一个核酸序列的功能关系 时，该核酸是"可操作地连接的"。通常地，"可操作地连接的"意指待连接的DNA序列是连续 的。然而，增强子不必是连续的。连接通过在方便的限制性位点上连接来实现。如果此类位 点不存在，则按照常规实践来使用合成寡核巧酸连接物或接头。另外，可在表达载体中将多 个拷贝的编码酶的核酸连接在一起。运样的多个核酸可通过接头分隔。
[0070]"表达"是指内源基因或转基因在细胞中的转录和/或翻译。例如，在反义构建体的 情况下，表达可指仅反义DNA的转录。另外，表达是指有义(mRNA)或功能性RNA的转录和稳定 积累。表达还可指蛋白质的产生。
[00川如本文中所用，"表达盒"意指能够指导特定核巧酸序列在适当的宿主细胞中的表 达，包含可操作地连接于目标核巧酸序列（该序列可操作地连接于终止信号）的启动子的 DNA序列。其通常还包含进行核巧酸序列的正确翻译所需的序列。包含目标核巧酸序列的表 达盒可W是嵌合的，意指至少一个其组分相对于至少一个其的其它组分是异源的。表达盒 还可W是天然存在的但W用于异源表达的重组形式获得的表达盒。此类表达盒将包含连接 于目标核巧酸序列的转录起始区。可为此种表达盒提供多个限制性位点来用于插入目标基 因，W使其处于调控区的转录调控下。表达盒可另外地含有可选择的标记基因。
[0072] 术语"宿主细胞"、"宿主细胞系"和"宿主细胞培养物"可互换使用并且指已向其中 引入了外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括"转化体"和"转化细胞"，其包 括原代转化细胞和来源于其而不考虑传代次数的后代。后代可能在核酸含量方面与亲代细 胞不完全相同，但可含有突变。本文中包括具有与针对其筛选或选择初始转化细胞的功能 或生物活性相同的功能或生物活性的突变型后代。
[0073] 如本文中所用，术语"可测量的亲和力"和"可测量地抑制"是指（i )包含布罗莫结 构域抑制剂或其组合物和此类布罗莫结构域的样本与（ii)在所述化合物或其组合物不存 在的情况下，包含此类布罗莫结构域的等量样本之间的布罗莫结构域的活性的可测量降 低。
[0074] 如本文中所用，短语"大体上相似的"是指两个数值(通常一个与分子相关并且另 一个与参照/比较分子相关)的充分高的程度的相似性，运使得本领域普通技术人员可认为 所述两个值之间的差异在通过所述值(例如，Kd值)测量的生物特征的背景中不具有统计显 著性。所述两个值之间的差异作为参照/比较值的函数可W例如小于约20%，小于约10% 和/或小于约5%。短语"大体上正常的"是指与参照(例如，正常参照)大体上相似。
[0075] 短语"大体上不同的"是指两个数值(通常一个与分子相关并且另一个与参照/比 较分子相关)之间的充分高的程度的差异，运使得本领域普通技术人员可认为所述两个值 之间的差异在由所述值(例如，Kd值)测量的生物特征的背景中具有统计显著性。所述两个 值之间的差异作为参照/比较分子的值的函数可W例如大于约10%，大于约20%，大于经 30%，大于约40 %和/或大于约50 %。
[0076] "相关"或"使相关"意指W任何方式将第一分析或方案的性能和/或结果与第二分 析或方案的性能和/或结果相比较。例如，可在进行第二方案时使用第一分析或方案的结果 和/或可使用第一分析或方案的结果来确定是否应当进行第二分析或方案。对于多核巧酸 分析或方案的实施方案，可使用多核巧酸表达分析或方案的结果来确定是否应当进行特定 的治疗方案。
[oow]"个体"或"受试者"是哺乳动物。哺乳动物包括，但不限于，家养动物(例如，牛、绵 羊、猫、狗和马）、灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物诸如猴）、兔和晒齿类动物(例如， 小鼠和大鼠）。在某些实施方案中，所述个体或受试者是人。
[0078] 如本文中所用，"治疗（treatment)"(和其语法变型诸如"治疗（treat)"或"治疗 (treating)")是指试图改变待治疗的个体的自然过程的临床干预，并且可预防性进行或在 临床病变过程中进行。想要的治疗效果包括，但不限于，预防疾病的发生或复发，缓解症状， 减少疾病的任何直接或间接病理学后果，防止转移，减缓疾病进展速度，改善或缓和疾病状 态，W及缓解或改善预后。在一些实施方案中，本发明的抗体用于延迟疾病的发展或减缓疾 病的进展。
[0079] 术语"药物制剂"是指呈诸如允许其中包含的活性成分的生物活性发挥效果的形 式，并且不含对于将对其施用所述制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外组分的制剂。
[0080] "药学上可接受的载体"是指药物组合物中除活性成分外的成分，其对于受试者是 无毒的。药学上可接受的载体包括，但不限于，缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
[0081] 除非在本文中另有说明，否则本文数值范围的引用仅旨在用作单独提及落在该范 围内的每一个单独的值的速记方法，并且每个单独的值被并入本说明书中，就如同其在本 文中被单独引用一样。
[0082] 如本领域普通技术人员所理解的，本文中的"约"值或参数包括(且描述)指向该值 或参数本身的实施方案。例如，提及"约X"的描述包括"X"的描述。
[0083] 除非另有说明或 与上下文明显矛盾，否则术语"一个"和"一种及"该"和类似术 语在描述本发明的实施例的上下文的使用"应被解释为涵盖单数和复数。除非另有说明，否 则术语"包括"，"具有"、"包含"和"含有"将被解释为开放式术语（即，意思是"包括，但不限 于"）。应当理解，本文描述的本发明的方面和实施方案包括"由方面和实施方案组成"和/或 "基本上由方面和实施方案组成"。
[0084] 筛选方法和融合蛋白
[0085] 本文中提供筛选化合物W鉴定调节包含布罗莫结构域模块的多肤的那些化合物 方法和用于所述方法的组合物。具体地，本文中提供包含至少一个染色质结合模块和至少 一个报告模块的融合蛋白，和使用包含至少一个染色质结合模块和至少一个报告模块的融 合蛋白筛选化合物的方法。
[0086] 本文中提供包含至少一个染色质结合模块和至少一个报告模块的融合蛋白，其中 多个融合蛋白能够形成斑。
[0087] 在一个方面，本文中提供用于确定测试化合物是否是布罗莫结构域抑制化合物的 方法，其包括(a)将本文所述的包含含有至少一个染色质结合模块和至少一个报告模块的 融合蛋白的细胞与测试化合物接触，和(b)确定所述测试化合物是否改变融合蛋的分布模 式和/或增加融合蛋白斑的形成，其中分布模式的变化和/或斑形成的增加表示所述测试化 合物是布罗莫结构域抑制化合物。在一些实施方案中，所述染色质结合模块是布罗莫结构 域模块。
[0088] 在一些方面，本文中提供鉴定能够特异性结合染色质结合模块并且抑制其与染色 质的相互作用的化合物的方法，所述方法包括(a)将包含所述融合蛋白（其中所述融合蛋白 包含至少一个染色质结合模块和至少一个报告模块)的细胞与测试化合物接触，（b)测定在 所述测试化合物存在和不存在的情况下报告信号在包含所述融合蛋白的细胞中的分布，其 中在所述测试化合物存在的情况下相较于所述测试化合物不存在的情况下的报告信号斑 的增加指示，所述测试化合物是能够特异性结合染色质结合模块并且抑制其与染色质的相 互作用的化合物。在一些实施方案中，所述染色质结合模块是布罗莫结构域模块。
[0089] 在一些实施方案中，所述融合蛋白包含1、2、3、4、5或6个染色质结合模块的任一 种。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含约一个染色质结合模块。在一些实施方案中，所 述融合蛋白包含两个染色质结合模块。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含至少一个来 自第一染色质结合多肤的染色质结合模块和至少一个来自第二染色质结合多肤的染色质 结合模块。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含一个来自第一染色质结合多肤的染色质 结合模块和一个来自第二染色质结合多肤的染色质结合模块。
[0090] 在任何所述方法和融合蛋白的一些实施方案中，至少一个染色质结合模块(例如， 布罗莫结构域模块)存在于其内源和/或天然背景中。在一些实施方案中，在内源背景中，所 述融合蛋白包含天然染色质结合多肤或含有至少一个染色质结合模块和至少一个报告模 块的天然染色质结合多肤的片段的氨基酸序列。例如，在内源背景中，所述融合蛋白包含天 然布罗莫结构域多肤例如BRG1的氨基酸序列，所述天然布罗莫结构域多肤包含至少一个布 罗莫结构域和至少一个报告构建体。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含染色质结合多 肤的全长序列。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含含有染色质结合模块的染色质结合 多肤的片段。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含至少约50 %、60 %、70 %、80 %和90 %的 染色质结合多肤并且包括染色质结合模块。在一些实施方案中，所述染色质结合模块是布 罗莫结构域模块。在一些实施方案中，所述染色质结合多肤是布罗莫结构域多肤。
[0091] 在任何所述方法和融合蛋白的一些实施方案中，至少一个染色质结合模块(例如， 布罗莫结构域模块)存在于外源和/或非天然背景中。外源和/或非天然背景中的染色质结 合模块(例如，布罗莫结构域模块)包括，但不限于（i)染色质结合多肤中的相较于天然染色 质结合多肤的不同氨基酸位置/背景中的染色质结合模块，（ii)第二染色质结合多肤的背 景中的第一染色质结合多肤的染色质结合模块，和/或（iii)无关多肤(例如，非染色质结合 多肤)背景中的染色质结合模块。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含染色质结合多肤中 的相较于天然染色质结合多肤的不同氨基酸位置/背景中的至少一个染色质结合模块，和 染色质结合多肤中的相较于天然染色质结合多肤的相同或相似氨基酸位置/背景中的至少 一个染色质结合模块。在一些实施方案中，所述染色质结合模块是布罗莫结构域模块。在一 些实施方案中，所述染色质结合多肤是布罗莫结构域多肤。
[0092] 在任何所述方法和融合蛋白的某些实施方案中，所述融合蛋白包含第一染色质结 合多肤，其中所述第一染色质结合多肤的一个或多个染色质结合模块已被第二染色质结合 多肤的至少一个染色质结合模块取代和/或替代。例如，实施例7提供包含巧光蛋白和人 BRD9编码DNA序列的融合蛋白的本发明的某些实施方案，其中所述布罗莫结构域编码序列 被人BAZ2B或人PCAF/KAT2B的布罗莫结构域序列替代。
[0093] 在任何所述方法和融合蛋白的一些实施方案中，所述融合蛋白包含具有多个染色 质结合模块的染色质结合多肤，其中染色质结合模块对染色质具有充足的亲和力。在某些 情况下，天然蛋白质可包含多个染色质结合模块，并且一个模块的抑制不从染色质释放融 合蛋白。在另一方面，某些染色质结合模块，当独自地表达为小模块时，可W不充分地结合 于染色质。在运些情况下，具有来自另一个染色质结合多肤的主链的嵌合蛋白可用于解决 运些问题。为了评估染色质结合多肤是否适合再定位/斑形成测定，可将突变引入染色质结 合模块的结合口袋W破坏结合亲和力。如果突变型融合蛋白仍然可结合染色质并且相较于 野生型融合蛋白不显示不同的分布模式，则所述染色质结合多肤可能不能用于本专利中描 述的方法。该类型的结果表明除目标染色质结合模块外的区域也可促成对于染色质的亲和 力。为了解决该问题，可使用拥有不具有对于染色质的亲和力的主链的嵌合染色质结合多 肤来建立测定。
[0094] 在任何所述方法和融合蛋白的一些实施方案中，所述融合蛋白包含第一染色质结 合多肤，其中一个或多个染色质结合模块已被复制和/或重复。在其它实施方案中，所述融 合蛋白包含第一染色质结合多肤，其中至少一个染色质结合模块来自第二染色质结合多 肤。在任何所述方法和融合蛋白的一些实施方案中，所述染色质结合模块是布罗莫结构域 模块。在一些实施方案中，所述染色质结合多肤是布罗莫结构域多肤。
[0095] 在任何所述方法和融合蛋白的一些实施方案中，所述染色质结合模块是布罗莫结 构域模块、P皿指模块、染色质域模块、MBT结构域模块、tudor结构域模块、PWWP结构域模块、 A孤结构域模块、Zf-CW结构域模块、错蛋白重复模块和/或WD40模块。
[0096] 在任何所述方法和融合蛋白的一些实施方案中，所述染色质结合模块是布罗莫结 构域模块。在一些实施方案中，所述布罗莫结构域模块是特征在于保守折叠的氨基酸序列， 所述保守折叠包含通过具有可变长度的环区域(ZA和BC环)连接的一个左手束的4个α螺旋 (妃、日4、日8、日(：）。在一些实施方案中，所述布罗莫结构域模块包含赖氨酸残基化日(3)结合位 点的组蛋白ε-Ν-乙酷化。在一些实施方案中，所述布罗莫结构域通过中屯、深疏水腔识别 Kac，其中其通过氨键错定于天冬酷胺残基。在一些实施方案中，所述至少一个布罗莫结构 域模块包含W下的任何一个的至少一个布罗莫结构域:A甜1L、ATAD2、BAZ1A、BAZ1B、BAZ2A、 BAZ2B、B畑1、B畑2、B畑3、B畑4、B畑7、B畑8、B畑9、B畑T、BRPF1、BRPF3、BRWD3、CECR2、CREBBP、 EP300、FALZ、GCN化2、KIAA1240、L0C93：M9、M化、PB、PCAF、PHIP、P服CBP1、SMARCA2、SMARCA4、 SP100、SP110、SP140、TAFl、TAFlL、TIFla、TRIM28、TRIM33、TRIM66、WDR9、ZMYNDll和/或 MLL4。在一些实施方案中，所述布罗莫结构域模块包含表1中的蛋白质的至少一个布罗莫结 构域。在一些实施方案中，所述布罗莫结构域模块包含表1中被定义为化iProt SEQ ID的布 罗莫结构域的序列(所述化iPort序列，包括规范序列，是如在2013年11月1日访问的序列， 并且在此通过引用整体并入）。在某些实施方案中，所述至少一个布罗莫结构域模块包含 BRG1、PCAF/KAT2B、BAZ2B、BW1、BW8、BRFP1、BRFP3、BRG1、CBP/CREBBP、PCAF/KAT2B、TRIM24 和/或ZMYND8的任一个的至少一个布罗莫结构域。在某些实施方案中，所述至少一个布罗莫 结构域模块包含服D2、B畑3、B畑4、B畑9、B畑T和BRG1的任一个的至少一个布罗莫结构域。在 某些实施方案中，至少一个布罗莫结构域模块包含8361、81?^1八60?2、？〔4。和/或了4。1的任 一个的至少一个布罗莫结构域。在某些实施方案中，至少一个布罗莫结构域模块包含BRD4 和/或BRD9的布罗莫结构域。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含1、2、3、4、5或6个布罗莫 结构域模块的大致任一种。
[0097] 表1布罗莫结构域多肤和布罗莫结构域模块
[009引
[0099]
[0100]
[0101]
[0102] 在任何所述方法和融合蛋白的一些实施方案中，所述染色质结合多肤是布罗莫结 构域多肤。在一些实施方案中，所述布罗莫结构域多肤(天然地和/或内源地)包含含有氨基 酸序列的布罗莫结构域模块，所述氨基酸序列的特征在于保守折叠，所述保守折叠包含通 过具有可变长度的环区域(ZA和BC环)连接的一左手束的4个α螺旋(妃、〇4、〇8、此）。在一些 实施方案中，布罗莫结构域多肤的布罗莫结构域模块包含赖氨酸残基化ac)结合位点的组 蛋白ε-Ν-乙酷化。在一些实施方案中，所述布罗莫结构域多肤的布罗莫结构域模块通过中 屯、深疏水腔识别Kac，其中其通过氨键错定于天冬酷胺残基。在一些实施方案中，所述布罗 莫结构域多肤包含表1中的至少一个布罗莫结构域多肤。在一些实施方案中，所述布罗莫结 构域多肤包含表1中鉴定为化iProt SEQ ID(所述化iPort序列，包括规范序列，是如2013年 11月1日访问的序列，并由此通过引用整体并入）的序列。在任何融合蛋白的某些实施方案 中，所述布罗莫结构域多肤包含服G1、PCAF/KAT2B、BAZ2B、服D1、BRD8、BRFP1、BRFP3、BRG1、 CBP/CREBBP、PCAF/KAT2B、TRIM24和/或ZMYND8的任一个或包含至少一个布罗莫结构域模块 的其片段的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述布罗莫结构域多肤包含BRD2、BRD3、BRD4、 BRD9、BRDT和/或BRG1的任一个或包含至少一个布罗莫结构域模块的其片段的氨基酸序列。 在某些实施方案中，布罗莫结构域多肤包含8361、81?^1八60?2、？〔4。和/或了4。1的任一个或 包含至少一个布罗莫结构域模块的其片段的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述布罗莫 结构域多肤包含BRD4和/或BRD9或包含至少一个布罗莫结构域模块的其片段的氨基酸序 列。在某些实施方案中，所述布罗莫结构域多肤包含全长布罗莫结构域多肤。在一些实施方 案中，所述融合蛋白包含含有布罗莫结构域模块的布罗莫结构域多肤的片段。在一些实施 方案中，所述融合蛋白包含至少约50、60、70、80和90%的布罗莫结构域多肤并且包括布罗 莫结构域模块。
[0103] 本文所述融合蛋白包含报告模块。报告模块在本领域中是已知的，并且包括但不 限于β-半乳糖巧酶（lacZ)、氯霉素乙酷转移酶(猫）、β-葡糖醒酸酶(GUS)、巧光蛋白和/或巧 光素酶。在本文所述任何融合蛋白和方法的一些实施方案中，报告模块是能够和/或装配成 多聚体的报告蛋白Γ多聚报告蛋白"）。在一些实施方案中，多聚报告蛋白是必需二聚蛋白。 在一些实施方案中，多聚报告蛋白是必需Ξ聚蛋白。在一些实施方案中，多聚报告蛋白是必 需四聚蛋白。在一些实施方案中，多聚报告蛋白能够形成和/或形成蛋白质聚集体。在一些 实施方案中，多聚报告蛋白能够形成和/或形成蛋白质寡聚体。在某些实施方案中，报告模 块包括巧光报告模块。巧光报告模块包括巧光蛋白（见，例如，Olenych等，（2006). Cell Biol.21.5.1-21.5.34;化than等，Journal of Cell Science 120,4247-4260(2007);Day 等，Chem. Soc. Rev.，2009，38，2887-2921)。在一些实施方案中，所述巧光报告模块包含表2 中所述的蛋白质的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述巧光报告模块包含EGFP、 1\11'13〇6。？、(131?6(12、(131?6(1-6邱'6332和/或236的6]1的任一个的氨基酸序列。
[0104] 表2巧光报告模块
[0105]
[0106]
[0107] 在本文所述任何融合蛋白和方法的一些实施方案中，所述融合蛋白包含核定位信 号(化S)。在一些实施方案中，所述化S包括染色质结合多肤的化S。在一些实施方案中，所述 化S包括布罗莫结构域多肤的化S。在某些实施方案中，所述化S是SV40大T抗原化S或核浆素 的化S。
[0108] 所述报告模块可W是融合蛋白内的任何位置，其允许检测并不明显地干扰(例如， 不干扰)染色质结合模块与染色质的相互作用。在本文所述任何融合蛋白和方法的一些实 施方案中，所述染色质结合模块位于报告模块的5'。在本文所述任何融合蛋白和方法的一 些实施方案中，所述染色质结合模块位于报告模块的3'。
[0109] 在本文所述任何融合蛋白和方法的一些实施方案中，所述融合蛋白能够多聚化。 在某些实施方案中，所述融合蛋白能够形成二聚体、Ξ聚体或四聚体。在某些实施方案中， 所述融合蛋白能够形成二聚体。在某些实施方案中，所述融合蛋白能够形成四聚体。在一些 实施方案中，所述融合蛋白能够形成蛋白质聚集体。在一些实施方案中，所述融合蛋白能够 寡聚化。
[0110] 通过例如报告模块中的蛋白质的多聚化，多个融合蛋白可结合形成斑。随后可检 测所述斑。在某些实施方案中，所述报告模块包括巧光报告模块。
[0111] 在本文所述任何融合蛋白和方法的一些实施方案中，斑和/或点的形成通过比较 对照或参照样本中的融合蛋白的定位来测定。在一些实施方案中，融合蛋白在对照或参照 样本中的定位是在染色质结合模块抑制化合物不存在的情况下融合蛋白在细胞中的定位。 在一些实施方案中，用染色质结合模块抑制化合物处理细胞和/或染色质结合模块抑制化 合物的存在将导致细胞中的斑数目相较于未处理的细胞和/或染色质结合模块抑制化合物 不存在的情况的大于约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的任一个的增 加。斑和/或点的尺寸和形状可取决于染色质结合模块而变化。
[0112] 本发明的融合蛋白能够形成斑，所述斑可使用本领域中已知的方法来检测和测 量。在一些实施方案中，斑的形成表示所述融合蛋白已与染色质解离并且形成斑和/或点。 检测与染色质的分离和蛋白质的核定位的方法在本领域中是已知的。在一些实施方案中， 所述检测方法是直接检测。在一些实施方案中，所述检测方法是利用巧光标记的针对作为 融合蛋白的部分的报告模块或工程化蛋白质表位标签的抗体的间接检测。利用巧光显微镜 检查测定融合蛋白的定位。在一些实施方案中，检测方法是根据分子尺寸的生物化学分级 分离，随后利用针对融合蛋白、作为融合蛋白的部分的报告模块或工程化蛋白质表位标签 的抗体的蛋白质免疫印迹。
[0113] 在某些实施方案中，所述染色质结合模块不包含染色质相互作用转录阻遏物的恶 性脑肿瘤(MBT)家族的成员。在某些实施方案中，所述染色质结合模块不包含全长L3MB化3。 在某些实施方案中，所述染色质结合模块不包含L3MBTL3的3个MBT结构域。在某些实施方案 中，所述报告模块不 包含GFP。
[0114] 本文中还提供通过本文所述方法鉴定的染色质结合模块抑制化合物。在一些实施 方案中，所述染色质结合模块抑制化合物是小分子抑制剂。在一些实施方案中，所述染色质 结合模块抑制化合物是布罗莫结构域模块抑制化合物。
[0115] 染色质结合模块和染色质结合多肤的多肤变体
[0116] 染色质结合模块和染色质结合多肤的变体用于本文所述方法和用于本文所述融 合蛋白。多肤的保守取代优选的取代"的标题示于表3中。如果此类取代导致生物活性的 变化，则可引入在表3中命名为"示例性取代"或如在下文中参考氨基酸种类进一步描述的 更加显著的变化，并筛选产物。
[0117] 表3 [011引
[0119] 通过选择取代来实现多肤的生物性质的显著修改，所述取代在它们对维持如下方 面的作用上显著不同：（a)取代的区域例如，如折叠片或螺旋构象中的多肤主链的结构，（b) 分子在祀位点上的电荷或疏水性或(C)侧链的体积。非保守取代将使运些种类之一的成员 必须与另一个种类交换。可按照共同的侧链性质将氨基酸分类：
[0120] (1)疏水性:正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、I le;
[0121] (2)中性亲水性：〔73、56'、1'虹、4311、61111;
[0122] (3)酸性:43口、6111;
[0123] (4)碱性:His、Lys、Arg;
[0124] (5)影响链取向的残基:Gly、Pro;
[012 引（6)芳香族:T;rp、Ty;r、Phe;
[0126] (7)大的疏水性：正亮氨酸、Met、化l、Leu、Ile。
[0127] 在其它实施方案中，本发明的多肤可包含一个或多个非天然存在或经修饰的氨基 酸。"非天然存在的氨基酸残基"是指除上文所列的那些天然存在的氨基酸残基外的残基， 其能够共价结合多肤链中的相邻氨基酸残基。非天然氨基酸包括，但不限于高赖氨酸、高精 氨酸，高丝氨酸，铃兰氨酸，2-氨基己二酸，3-氨基己二酸，β-丙氨酸，氨基丙酸，2-氨基下 酸，4-氨基下酸，6-氨基己酸，2-氨基庚酸，2氨基异下酸，3-氨基异下酸，2-氨基庚二酸，叔 下基甘氨酸，2，4-二氨基异下酸，锁链素，2，2 二氨基庚二酸，2，3-二氨基丙酸，Ν-乙基甘 氨酸，Ν-乙基天冬酷胺、高脯氨酸，径基赖氨酸，别-?基赖氨酸，3-径基脯氨酸，4-径基脯氨 酸，异锁链素，别-异亮氨酸，N-甲基丙氨酸，N-甲基甘氨酸，N-甲基异亮氨酸，N-甲基戊基甘 氨酸，N-甲基鄉氨酸，糞胺，正鄉氨酸，正亮氨酸，鸟氨酸，瓜氨酸，戊基甘氨酸，赃晚酸和硫 代脯氨酸。经修饰的氨基酸包括天然和非天然氨基酸，其可被可逆或不可逆地化学阻断，或 在它们的N-末端氨基或它们的侧链基团上被修饰，如例如，N-甲基化D和L氨基酸，被化学修 饰成另一种官能团的侧链官能团。例如，经修饰的氨基酸包括甲硫氨酸亚讽；甲硫氨酸讽； 天冬氨酸-(0-甲基醋）、天冬氨酸的经修饰的氨基酸;N-乙甘氨酸、甘氨酸的经修饰的氨基 酸;或丙氨酸甲酯胺和丙氨酸的经修饰的氨基酸。另外的非天然和经修饰的氨基酸W及将 它们渗入蛋白质和肤的方法在本领域中是已知的（见，例如，Sandberg等，（1998 ) J.Med.Qiem.41:2481-91;Xie和Schultz(2005) Qirr.Opin.Qiem.Biol.9:548-554;Hodgson 和Sanderson(2004) Qiem.Soc.Rev.33:422-430)。
[0128] 包含染色质结合模块的多肤的变体还可基于本领域已知的信息来制备，而不显著 影响染色质结合模块的活性。例如，包含染色质结合模块的多肤和/或染色质结合模块变体 可使包含染色质结合模块的多肤和/或染色质结合模块中的至少一个氨基酸残基被不同残 基替代。
[0129] 产生此类取代变体的方便方法包括隧菌体展示。随后筛选隧菌体展示的变体的如 本文中公开的它们的生物活性(例如，结合亲和力）。为了鉴定用于修饰的包含染色质结合 模块的多肤和/或染色质结合模块的候选区域，可进行丙氨酸扫描诱变来鉴定显著有助于 染色质结合的高变区残基。一旦产生此类变体，就将使变体的小组经历如本文所述的筛选， 并且在一个或多个相关测定中具有优良性质的抗体可被选择用于其它开发。
[0130 ]本文所述方法中使用的核酸、表达盒、载体和细胞
[0131] 本文提供编码本文所述融合蛋白的核酸和包含含有本文中所述融合蛋白的核酸 的表达盒、载体。本文提供分离的和/或大体上纯化的融合蛋白和编码本文所述的融合蛋白 的核酸(例如，DNA或RNA)。还提供了包含编码本文所述融合蛋白的核酸的载体和表达盒。
[0132] 编码包含本文所述染色质结合模块的多肤和/或染色质结合模块的多核巧酸序列 可使用标准合成和/或重组技术来获得。可从适当的来源细胞分离所需的多核巧酸序列，并 对其进行测序。包含染色质结合模块的多肤和/或染色质结合模块的来源细胞可包括包含 染色质结合模块的多肤和/或染色质结合模块生成细胞诸如杂交瘤细胞。或者，多核巧酸可 使用核巧酸合成仪或PCR技术来合成。一旦获得，就可将编码包含布罗莫结构域和/或布罗 莫结构域的多肤的序列插入能够在宿主细胞中复制和表达异源多核巧酸的重组载体。在本 领域中可获得和已知的许多载体可用于本发明的目的。适当的载体的选择将主要取决于待 插入载体中的核酸的大小和待用所述载体转化的具体宿主细胞。每一个载体含有不同的组 分，运取决于其功能(异源多核巧酸的扩增或表达，或运两方面及其与其所存在的特定 宿主细胞的相容性。载体组分通常包括，但不限于:复制起始点（特别地当将载体插入原核 细胞时）、选择标记基因、启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源核酸插入物和转录 终止序列。
[0133] 编码包含染色质结合模块的多肤和/或染色质结合模块的氨基酸序列变体的核酸 分子通过本领域中已知的多种方法来制备。运些方法包括，但不限于，从天然来源的分离 (在天然存在的氨基酸序列变体的情况下)或通过包含染色质结合模块的多肤和/或染色质 结合模块的较早制备的变体或非变体形式的寡核巧酸介导的（或定点）诱变、PCR诱变W及 表达盒诱变进行的制备。
[0134] 在某些实施方案中，本发明提供含有包含可操作地连接于祀序列的启动子的表达 盒的载体。如本文中所用，"表达盒"意指能够指导特定核巧酸序列在适当的宿主细胞中的 表达的核酸序列，其包括可操作地连接于目标核巧酸序列(所述目标核巧酸序列可操作地 连接于终止信号）的启动子。编码区通常编码目标功能性RNA，例如RNAi分子。包括目标核巧 酸序列的表达盒可W是嵌合的。可使用标准技术，诸如Samb;rook和Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring 化rbor，NY( 2001)中描述的那些技术将核酸工程化至载体中。
[0135] -般地，将含有来源于与宿主细胞相容的种类的复制子和控制序列的质粒载体与 运些宿主结合使用。所述载体通常具有复制位点，并且制备能够提供转化细胞的表型选择 的标记序列。另外，含有与宿主微生物相容的复制子和控制序列的隧菌体载体可用作与运 些宿主结合的转化载体。
[0136] 根据具体情况的需要可将组成型或诱导型启动子用于本发明，运可由本领域普通 技术人员来确定。众多由多种潜在宿主细胞识别的启动子是公知的。可通过从来源DNA经由 限制性内切酶消化除去启动子和将分离的启动子序列插入选定的载体来将选定的启动子 可操作地连接于编码本文所述多肤的顺反子DNA。天然启动子序列和许多异源启动子可用 于指导本文所述融合蛋白的扩增和/或表达。然而，异源启动子是优选的，因为它们相较于 天然祀多肤启动子通常允许表达的祀基因的更大转录和更高产率。
[0137] 在一些实施方案中，重组载体内的每一个顺反子包含分泌信号序列组分和/或指 导表达的多肤穿过膜的转运的核定位信号。一般地，所述信号序列可W是载体的组分，或其 可W是被插入载体的祀多肤DNA的部分。被选择用于本发明的目的信号序列应当是被宿主 细胞识别和加工(即被信号肤酶切割）的信号序列。
[0138] 本文还提供包含含有包含本文所述融合蛋白的核酸的表达盒和/或载体的细胞。 本文提供包含本文所述融合蛋白的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是真核细胞。在一些 实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。在某些实施方案中，所述细胞是CH0-KUC0S-7、 皿K293、皿K293T、皿K293FT、胎La、MDCK和/或U20S细胞。在某些实施方案中，所述细胞是 C0S-7、HeLa 和/或 U20S细胞。
[0139] 用上述表达载体转化或转染或通过用上述表达载体包装的病毒转导宿主细胞，并 将所述宿主细胞在经改良适合用于诱导启动子的常规营养培养基中培养，随后选择转化 体，或扩增编码所需序列的基因。转染是指表达载体被宿主细胞吸收而无论任何编码序列 是否实际上被表达。当该载体的操作的任何指征在细胞内产生时，成功的转染通常被识别。
[0140] 如果将诱导型启动子用于表达载体，则在适合于启动子激活的条件下诱导蛋白质 表达。可根据所使用的的载体构建体使用多种其它诱导物，运在本领域中是已知的。还可W W适当的浓度包含除了碳、氮和无机憐酸盐来源W外的任何必需补充剂，所述补充剂单独 地或作为与另一种补充剂或介质诸如复合氮源的混合物引入。任选地所述培养基可含有选 自由W下组成的组的一种或多种还原剂:谷脫巧肤、半脫氨酸、脫胺、硫胶质、二硫下四醇和 二硫苏糖醇。
[0141] 可从培养物除去细胞，随后过滤并浓缩培养上清液W进一步纯化产生的蛋白质。 可使用公知的方法诸如如下方法进一步分离和鉴定表达的多肤:在免疫亲和柱或离子交换 柱上的分级分离；乙醇沉淀；反相HPLC;在娃±上或在阳离子交换树脂诸如DEAE上的层析； 聚焦层析;SDS-PAGE;硫酸锭沉淀;使用例如S邱hadex G-75的凝胶过滤;疏水亲和树脂、使 用固定在基质上的适当的抗原的配体亲和力W及蛋白质印迹测定。
[0142] 治疗性/预防性方法和/或用途
[0143] 通过本文所述任何方法鉴定的染色质结合模块抑制化合物可用于治疗性方法。
[0144] 在一个方面，提供了用作药剂的染色质结合模块抑制化合物。在其它方面，提供了 用于治疗癌症的方法的染色质结合模块抑制化合物。在某些实施方案中，本发明提供了用 于治疗个体的方法的染色质结合模块抑制化合物，所述方法包括向所述个体施用有效的染 色质结合模块抑制化合物W治疗癌症。在某些实施方案中，提供了用于治疗方法的染色质 结合模块抑制化合物。在某些实施方案中，提供了用于治疗患有癌症的个体的方法的染色 质结合模块抑制化合物，所述方法包括向所述个体施用有效量的所述染色质结合模块抑制 化合物。在一个此类实施方案中，所述方法还包括向所述个体施用有效量的至少一种另外 的治疗剂，例如，如下文中描述的。在其它实施方案中，本发明提供了用于治疗癌症的染色 质结合模块抑制化合物。在某些实施方案中，本发明提供了用于治疗个体的癌症的方法的 染色质结合模块抑制化合物，所述方法包括向所述个体施用有效量的所述染色质结合模块 抑制化合物来治疗癌症。在其它实施方案中，本发明提供了用于治疗癌症的染色质结合模 块抑制化合物。在某些实施方案中，本发明提供了用于抑制个体的细胞增殖的方法的染色 质结合模块抑制化合物，所述方法包括向所述个体施用有效量的所述染色质结合模块抑制 化合物W抑制细胞增殖。在一些实施方案中，染色质结合模块抑制化合物是布罗莫结构域 模块抑制化合物。根据任何上述实施方案的"个体"优选是人。
[0145] 在其它方面，本文中提供了例如用于任何上述治疗性方法的包含任何染色质结合 模块抑制化合物的药物制剂。在一个实施方案中，药物制剂包含任何染色质结合模块抑制 化合物和药学上可接受的载体。药学上可接受的载体在所使用的剂量和浓度下对受者通常 是无毒的，并且包括，但不限于:缓冲剂诸如憐酸盐、巧樣酸盐和其它有机酸;抗氧化剂，包 括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化锭;氯化六甲双胺;苯扎氯 锭;节索氯锭;苯酪、下基或节醇;对径苯甲酸烷基醋诸如对径基苯甲酸甲醋或对径基苯甲 酸丙醋;儿茶酪；间苯二酪;环己醇;3-戊醇;和间甲酪）；低分子量(小于约10个残基）多肤； 蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物诸如聚乙締化咯烧酬;氨基酸 诸如甘氨酸、谷氨酷胺、天冬酷胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸;单糖、二糖和其它碳水化合物， 包括葡萄糖、甘露糖或糊精;馨合剂，诸如抓TA;糖，诸如薦糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇;形 成盐的抗衡离子诸如钢;金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物）；和/或非离子表面活性剂诸 如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性药学上可接受的载体进一步包括间质药物分散剂，诸如可 溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白（sHASEGP)，例如，人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如 rHuPH20(UYLENEX?,Baxter International, Inc.)。某些示例性sHA沈GP和使用方法， 包括riluPH20，描述于美国专利公布第2005/0260186和2006/0104968号中。在一个方面，将 sHASEGP与一种或多种另外的葡糖氨基聚糖酶类诸如软骨素酶组合。
[0146] 在一些实施方案中，药物制剂包含染色质结合模块抑制化合物和至少一种另外的 治疗剂，例如，如下文中所述的。
[0147] 所述染色质结合模块抑制化合物可单独地用于疗法或与其它试剂组合地用于疗 法。例如，可将染色质结合模块抑制化合物与至少一种另外的治疗剂共施用。
[0148] 上述此类联合治疗包括组合施用（其中将两种或更多种治疗剂包含在相同或单独 的制剂中），和分开施用，在该情况下，本文所述染色质结合模块抑制化合物的施用可在另 外的治疗剂施用之前，与之同时和/或之后进行。
[0149] 本文所述染色质结合模块抑制化合物(和任何另外的治疗剂)可通过任何合适的 方法，包括胃肠外、肺内和鼻内施用，并且，如果希望用于局部治疗，可通过病灶内施用、局 部施用或眼内施用化合物。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。给药 可W通过任何合适的途径，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射，运部分取决于所述施用 是短暂的还是慢性的。本文涵盖各种给药方案，包括但不限于在不同时间点上的单一或多 次施用、推注施用和脉冲输注。
[0150] 布罗莫结构域介导的病症的实例包括癌症，包括但不限于，听神经瘤、急性白血 病、急性淋己细胞白血病、急性髓细胞白血病(单核细胞、成髓细胞、腺癌、血管肉瘤、星形细 胞瘤、粒单核细胞和早幼粒细胞瘤）、急性T细胞白血病、基底细胞癌、胆管癌、膀脫癌、脑癌、 乳腺癌、支气管癌、宫颈癌、软骨肉瘤、脊索瘤、绒毛膜癌、慢性白血病、慢性淋己细胞白血 病、慢性髓细胞(粒细胞）白血病、慢性髓细胞性白血病、结肠癌、结直肠癌、烦咽管瘤、囊腺 癌、弥漫性大B细胞淋己瘤、异型增生变化(发育异常和化生）、胚胎癌、子宫内膜癌、内皮肉 瘤、室管膜瘤、上皮癌、红白血病、食道癌、雌激素受体阳性乳腺癌、原发性血小板增多症、尤 因氏瘤、纤维肉瘤、滤泡性淋己瘤、生殖细胞睾丸癌、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、神经胶质 肉瘤、重链病、成血管细胞瘤、肝癌、肝细胞癌、激素不敏感性前列腺癌、平滑肌肉瘤、白血 病、脂肪肉瘤、肺癌、淋己管内皮肉瘤、淋己管肉瘤、成淋己细胞性白血病、淋己瘤(何杰金氏 和非何杰金氏）、膀脫、乳腺、结肠、肺、卵巢、膜腺、前列腺、皮肤和子宫的恶性肿瘤和过度增 生性病症、T细胞或B细胞起源的淋己样细胞恶性肿瘤、白血病、淋己瘤、髓样癌、髓母细胞 瘤、黑素瘤、脑膜瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、骨髓性白血病、骨髓瘤、粘液肉瘤、神经母细胞 瘤、NUT中线癌(NMC)、非小细胞肺癌、少突神经胶质瘤、口腔癌、成骨性肉瘤、卵巢癌、膜腺 癌、乳头状腺癌、乳头状癌、松果体瘤、真性红细胞增多症、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、视 网膜母细胞瘤、横纹肌肉 瘤、肉瘤、皮脂腺癌、精原细胞瘤、皮肤癌、小细胞肺癌、实体瘤(癌 和肉瘤）、小细胞肺癌、胃癌、鱗状细胞癌、滑膜瘤、汗腺癌、甲状腺癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋 白血症、睾丸肿瘤、子宫癌和肾母细胞瘤。
[0151] 在任何所述方法的某些实施方案中，所述癌症是肺癌、乳腺癌、膜腺癌、结直肠癌 和/或黑素瘤。在某些实施方案中，所述癌症是肺癌。在某些实施方案中，所述肺癌是NS化C。 在某些实施方案中，所述癌症是乳腺癌。在某些实施方案中，所述癌症是黑素瘤。
[0152] 制品/试剂盒
[0153] 本文还提供了含有用于鉴定染色质结合模块抑制化合物的材料的制品，其包含本 文所述的融合蛋白、核酸、表达盒、载体和/或细胞。所述制品包含容器和容器上或与容器结 合的标签或包装说明书。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、静脉内溶液袋等。可从多 种材料诸如玻璃或塑料形成容器。所述容器装有为其本身的组合物或与另一种有效鉴定染 色质结合模块抑制化合物的组合物组合的组合物。
[0154] 标签或包装说明书指示所述组合物用于鉴定染色质结合模块抑制化合物。此外， 所述制品可包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本文所述的融合蛋 白、核酸、表达盒、载体和/或细胞;和(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含 另外的试剂。本发明的该实施方案中的制品还可包含指示组合物可用于鉴定染色质结合模 块抑制组合物的包装说明书。
[0155] 包括下列实施例来说明本发明的优选实施方案。本领域普通技术人员应当理解， 下列实施例中公开的技术代表由本发明人发现的在本发明的实践中运行良好的技术，因此 可W被认为构成了用于其实践的优选方式。然而，根据本公开内容，本领域普通技术人员应 当理解，可在不背离本发明的精神和范围的情况下，许多变化可在公开的特定实施方案中 进行并且仍然获得相似或类似结果。 实施例
[0156] W下是融合蛋白和使用本发明的融合蛋白的方法的实施例。应理解，鉴于本文中 提供的一般描述，可实践各种其它实施方案。
[0157] 实施例1
[0158] 为了了解FP标记的含布罗莫结构域的蛋白质上的巧光标签(FP)在被布罗莫结构 域抑制化合物从染色质释放后在细胞核中的定位变化，FP-BRD4的某些融合构型导致细胞 核中FP标记的蛋白质的抑制剂依赖性再定位和斑形成。
[0159] 方法
[0160] 将巧光蛋白（FP)标签（dsRed2、dsRed-E邱ress2、EGFP、Emerald GFP、m畑er巧、 m0range2、TurboGFP或ZsGreen)在框内克隆在慢病毒载体中的人BRD4编码DNA序列（短的 B畑4同种型的氨基酸残基1 -719;NCBI NP_055114.1)的上游，所述载体在人EF1启动子的控 制下表达Tet-化3G转录因子。在诱导型启动子TRE3G启动子的下游的FP-BRD4蛋白的表达 可用多西环素诱导。利用运些表达质粒构建体产生的慢病毒用于感染U20S骨肉瘤细胞 (八了撕，肌8-96)^在154旨/1111杀稻攝素选择下建立稳定的细胞。将稳定的细胞涂板在伽11。? Lab-Tek? II培养腔室载玻片W用于共聚焦显微镜检查或涂板在96孔板中W用于高容量显 微镜检查。用化g/ml多西环素处理细胞16小时，随后在成像前与DMS0或BRD4抑制剂解育2-4 小时。将Zeiss LSM510倒置共聚焦显微镜或具有加热台的LSM780共聚焦显微镜用于检查FP 标记的服D4蛋白的定位。利用Zeiss ZEN软件分析获得的图像。对于高容量显微镜，用4%甲 醒固定化合物处理的细胞15分钟，随后用PBS缓冲液洗涂2次。在ImageXpress Micro (Mole州lar Devices)上获取图像，并利用MetaXpre游?(Molecular Devices)分析所述 图像。
[0161] 结果
[0162] 产生稳定地携带利用不同巧光蛋白（FP)标记的诱导型BRD4的U20S细胞系。N末端 FP标签包括dsRed2、dsRed-E邱ress2、EGFP、血erald GFP、m化erry、m0range2、TurboGFP或 ZsGreen(图1) dFP-B畑4表达由多西环素诱导，并且利用媒介物(DMSO)或服D4布罗莫结构域 抑制剂JQ1处理细胞4小时，随后利用共聚焦显微镜进行活细胞成像。JQ1 (CAS#126524-70- 4)是抑制BRD2、BRD3、BRD4和BRDT的布罗莫结构域的化合物。当用DMS0处理时，FP标记的 BRD4蛋白结合于染色质并且弥散地分布在细胞核中（图2)。有趣地，JQ1处理导致EGFP- B畑4、ZsGreen-B畑4、dsRed-Express2、dsRed2-B畑4 和 TurboGFP-B畑4的蛋白质再定位和巧 光点/斑的形成。然而JQ1对m0range2-B畑4、m化er巧-B畑4和Emerald-GFP-B畑4的B畑4布 罗莫结构域的抑制不改变FP标记的蛋白质在细胞核中的定位。运些发现显示，当用具有形 成多聚体(例如，二聚体或四聚体)的倾向的巧光蛋白标记BRD4时，巧光BRD4融合蛋白响应 于布罗莫结构域抑制剂而聚集并且形成点/斑。重要的是，不能结合染色质，从而模拟布罗 莫结构域抑制剂的作用的在两个布罗莫结构域中具有点突变的突变型ZsGreen-BRD4蛋白， 即使在布罗莫结构域抑制剂不存在的情况下，亦被定位至细胞核中的点/斑（图3B)。野生型 BRD4融合蛋白在相同条件下显示弥散定位(图3A)。为了进一步分析布罗莫结构域抑制化合 物对布罗莫结构域与染色质的结合的阻止作用，利用DNA结合染料化echst 33342标记染色 质。如图4中所示，存在ZsGreen-BRD4蛋白与染色质的显著共定位。在另一方面，利用布罗莫 结构域抑制化合物抓i-A的处理导致ZsGreen-B畑4的巧光点，并且那些点与染色质不重叠 (图4)。综上所述，运些结果表明，当布罗莫结构域的结合活性被布罗莫结构域抑制化合物 抑制或通过布罗莫结构域内的点突变消除时，FP-BRD4蛋白再定位W形成点/斑。
[0163] 为了研究点/斑形成的动力学，利用DMS0或化合物BDi-A(BRD4的布罗莫结构域抑 制剂)处理表达ZsGreen-B畑4的稳定细胞5分钟、10分钟、15分钟、30分钟或60分钟，随后进 行固定和共聚焦显微镜检查。在10分钟的时间点上观察到ZsGreen-BRD4蛋白的再定位，并 且点/斑形成到30分钟时变得十分明显（图5)。运些结果显示ZsGreen-BRD4再定位的快速动 力学，并且可通过显微镜检查在巧光斑形成后实时监测布罗莫结构域抑制剂的作用。
[0164] 为了定量BRD4抑制剂对ZsGreen-BRD4再定位的作用，将稳定的细胞接种在96孔板 中，并与多西环素解育W诱导ZsGreen-BRD4的表达。利用不同浓度的JQ1处理细胞4小时，随 后固定。随后利用高容量显微镜获取图像，并利用MetaXpress分析图像W测定每细胞巧光 点的数目。在GraphPad Prism中分析推导数据W计算ECsq值。如所预期的，在较高JQ1浓度下 观察到更多ZsGreen-B畑4点，所述点在更较低JQ1浓度下逐渐减少。JQl(CAS#1268524-70- 4)的计算的ECso在该BRD4再定位测定（称为'点测定'）中为93nM(图6)。运些结果显示再定 位/点形成是可滴定的表型并且可用于测定布罗莫结构域抑制剂在细胞背景中的效力。
[016引讨论
[0166] 布罗莫结构域蛋白与染色质相互作用并且具有结合具有各种翻译后修饰的组蛋 白尾的能力。一个潜在的但非限制性模型描绘于图7中。如本文中所示，BRD4布罗莫结构域 抑制化合物和服D4的布罗莫结构域中的突变导致服D4蛋白从染色质的释放。当用具有形成 多聚体（例如，二聚体或四聚体）的能力的FP标记BRD4时，FP标签的亲和力促进FP标记的 BRD4聚集，并在细胞核中形成点/斑。此外，如本文中所示，利用单体FP(m0ragne2和 m化erry)标记的BRD4不显示抑制剂依赖性点/斑形成（图2)。另外，消除结合能力的BRD4布 罗莫结构域的突变即使在BRD4布罗莫结构域抑制剂不存在的情况下亦导致'点'表型（图 3)。响应于抑制剂的ZsGreen-BRD4再定位、聚集和点/焦点形成归因于布罗莫结构域结合亲 和力的抑制。FP标签在本系统中用于多个目的，包括促进标记的布罗莫结构域蛋白的聚集 和斑形成和用作检测方法。
[0167] 实施例2
[0168] 将含全长ZsGreen和BRD2的融合蛋白在细胞中表达W分析响应BRD2布罗莫结构域 抑制化合物的定位变化。
[0169] 方法
[0170] 将巧光蛋白（ZsGreen)在框内克隆在慢病毒载体中的人BRD2编码DNA序列（NP_ 001106653.1)的上游，所述载体在人EF1启动子的控制下表达Tet-化3G转录因子。在诱导 型TRE3G启动子下游的ZsGreen-BRD2编码区的表达可用多西环素诱导。利用运些表达质粒 构建体产生的慢病毒用于感染U20S骨肉瘤细胞(ATCC，HTB-96)W在15μg/ml杀稻溫素选择 下建立稳定的细胞。将稳定的细胞置于Nunc? Lab-Tek? II培养腔室载玻片上W进行共聚 焦显微镜观察。用化g/ml多西环素处理细胞16小时，随后在成像之前与DMSO或BRD2抑制剂 解育4小时。将Zeiss LSM510倒置共聚焦显微镜或具有加热台的LSM780共聚焦显微镜用于 检查FP标记的BRD2的亚细胞核定位。利用ZeiSS ZEN软件分析获得的图像。
[0171] 结果和讨论
[0172] 通过慢病毒感染和杀稻攝素选择产生稳定地携带可诱导的N-末端ZsGreen标记的 全长BRD2的U20S细胞系（图8A)。为了测试在被布罗莫结构域抑制剂从染色质释放后 ZsGreen-B畑2蛋白是否形成点/斑，用多西环素诱导稳定的U20S/ZsGreen-BRD2细胞，然后 用媒介物(DMS0)或ΙΟμΜ的布罗莫结构域抑制剂JQ1 (CAS#126524-70-4)处理细胞4小时，随 后利用共聚焦显微镜进行活细胞成像。JQ1处理导致ZsGreen-BRD2蛋白在细胞核中的再定 位和点/斑形成（图8B)。该抑制剂依赖性斑形成表型与在形成二聚体或多聚体的融合于FP 标签的BRD4的情况下观察到的聚集表型相似(图2)。
[017引实施例3
[0174]将含全长ZsGreen和BRD3的融合蛋白在细胞中表达W分析响应于BRD3布罗莫结构 域抑制化合物的定位变化。
[0Π 引方法
[0176]将巧光蛋白（ZsGreen)在框内克隆在慢病毒载体中的人BRD3编码DNA序列（NP_ 031397.1)的上游，所述载体在人EF1启动子的控制下表达Tet-化3G转录因子。在诱导型 TRE3G启动子下游的ZsGreen-BRD3编码区的表达可用多西环素诱导。利用运些表达质粒构 建体产生的慢病毒用于感染U20S骨肉瘤细胞(ATCC，HTB-96) W在15μg/ml杀稻溫素选择下 建立稳定的细胞。将稳定的细胞置于Nunc? Lab-Tek? II培养腔室载玻片上W进行共聚焦 显微镜观察。用化g/ml多西环素处理细胞16小时，随后在成像之前与DMS0或BRD3抑制剂解 育4小时。将Zeiss LSM510倒置共聚焦显微镜或具有加热台的LSM780共聚焦显微镜用于检 查FP标记的BRD3的亚细胞核定位。利用ZeiSS ZEN软件分析获得的图像。
[0Π7]结果和讨论
[0178] 通过慢病毒感染和杀稻攝素选择产生稳定地携带可诱导的N-末端ZsGreen标记的 全长BRD3的U20S细胞系（图9A)。为了测试在被布罗莫结构域抑制剂从染色质释放后 ZsGreen-B畑3蛋白是否形成点/斑，用多西环素处理稳定的U20S/ZsGreen-BRD3细胞，然后 将细胞与媒介物(DMS0)或lOpM的布罗莫结构域抑制剂JQl(CAS#1268524-70-4)解育4小时， 随后进行活细胞成像。与利用ZsGreen-BRD2和ZsGreen-BRD4产生的发现相似，ZsGreen- BRD3蛋白响应于BRD3布罗莫结构域抑制化合物JQ1而形成巧光点/斑（图9B)。
[0179] 实施例4
[0180] 设计和进行本实施例中的实验来建立测定抑制BRD9布罗莫结构域的化合物的细 胞作用的方法。使含有全长BRD9和巧光蛋白的融合蛋白在细胞中表达W分析由布罗莫结构 域抑制剂引起的定位变化的斑形成。
[0181] 方法
[0182] 将巧光蛋白（ZsGreen或mVenus)在框内克隆在慢病毒载体中的人BRD9编码DNA序 列（NCBI NP_076413.3)的下游，所述载体在人EFl启动子的控制下表达Tet-On 3G转录因 子。位于诱导型TRE3G启动子下游的B畑9-ZsGreen和B畑9-ZsGreen编码区的表达可用多西 环素诱导。利用运些表达质粒构建体产生的慢病毒用于感染U20S骨肉瘤细胞(ATCC，HTB- 96)W在15μg/ml杀稻溫素选择下建立稳定的细胞。将稳定的细胞置于Nunc? Lab-Tek? II 培养腔室载玻片上W进行共聚焦显微镜观察。用化g/ml多西环素处理细胞16小时，随后在 成像之前与DMS0或BRD9抑制剂(BDi-B、BDi-C和抓i-D)解育4小时。将Zeiss LSM510倒置共 聚焦显微镜或具有加热台的LSM780共聚焦显微镜用于检查FP标记的BRD9的在细胞核中的 定位。利用Zeiss ZEN软件分析获得的图像。
[0183] 结果和讨论
[0184] 通过慢病毒感染和杀稻攝素选择产生稳定地携带具有C末端ZsGreen标签的可诱 导的全长BRD9的U20S细胞系（图10A)。为了进一步研究布罗莫结构域抑制对BRD9-ZsGreen 定位的作用，利用多西环素诱导巧光融合蛋白的表达，并利用媒介物(DMS0)或ΙΟμΜ的BRD9 布罗莫结构域抑制剂(化合物BDi-C或BDi-D)处理细胞4小时，随后利用共聚焦显微镜进行 活细胞成像。BRD9-ZsGreen的定位响应于两种BRD9抑制剂而从弥散分布变成巧光点/斑（图 10B)。运些结果表明B畑9-ZsGreen被B畑9布罗莫结构域抑制剂从染色质置换，随后形成巧 光点/斑。此外，当点突变(N216Y)被引入BRD9的布罗莫结构域中W消除其结合活性时（图 11A)，缺乏针对染色质的结合亲和力的突变型服D9-ZsGreen即使在染色体质抑制化合物不 存在的情况下亦形成巧光点（图11B)。综上所述，该布罗莫结构域突变型蛋白的'点'表型也 表明，利用化合物处理产生的野生型B畑9-ZsGreen的'点'表型归因于服D9布罗莫结构域的 功能性破坏。
[018引为了研究FP标签对'点/斑'表型的贡献，将BRD9融合于单体FP(mVenus)，所述 mVenus不促进蛋白质聚集（图12A)。如所预期的，使用DMS0或BRD9抑制剂(化合物BDi-D)不 存在明显的BRD9-mVenus的定位差异，并且巧光信号均匀分布在细胞核中（图12B)。产生 mVenus-标记的BRD9的布罗莫结构域突变型等位基因（N216Y)来进一步确认利用布罗莫结 构域抑制剂的发现（图12C)。与突变型BRD9-ZsGreen相反（图11B)，突变型BRD9-mVenus弥散 地位于细胞核中，尽管其不能结合染色质（图12D)。运些结果再次表明，巧光蛋白对标记的 布罗莫结构域蛋白的定位的作用。ZsGreen蛋白具有形成四聚体的能力，然而mVenus W单体 蛋白质存在。当FP标签具有寡聚化的倾向时，被抑制剂从染色质释放的标记的布罗莫结构 域蛋白可聚集，并且形成巧光点/斑。如果标签不能够形成寡聚物(例如，mVenus),则标记的 罗莫结构域蛋白保持弥散分布，即使它们不结合于染色质。注意，染色质在大多数细胞中的 分布是弥散的（图4)并且显微镜检查不具有区分结合与未结合状态的BRD9-mVenus的弥散 定位的分辨率。
[0186] 实施例5
[0187] 研究在含布罗莫结构域蛋白的其它区域不存在的情况下，布罗莫结构域模块与报 告模块(此处为巧光蛋白标签)一起用于建立测定法并测定细胞中的抑制剂活性的用途。 [018引方法
[0189] 将3个拷贝的核定位序列(DPKKK服VKSEQ ID N0:1)融合于CECR2布罗莫结构域编 码DNA序列(NCBI NP_113601.2的氨基酸残基424-538)的N末端，后跟ZsGreen编码序列。将 该融合表达构建体克隆进慢病毒载体，所述载体在人EF1启动子的控制下表达Tet-化3G转 录因子。受诱导型TRE3G启动子控制的化S-CECR2.抓-ZsGreen的表达用多西环素来诱导。将 利用运些表达质粒构建体产生的慢病毒用于感染U20S骨肉瘤细胞(ATCC，HTB-96) W在15μ g/ml杀稻攝素选择下建立稳定的细胞。将稳定的细胞涂板在6孔或96孔板中W进行显微镜 分析。用化g/ml多西环素处理细胞16小时，随后与DMSO或CECR2抑制剂解育4小时，随后用 4% 甲醒固定。将Nikon倒置巧光显微镜化clipse TS100)或ImageXpress Mic;ro(Molecular Devices)用于检查化S-CECR2.抓-ZsGreen在细胞核中的定位。
[0190] 从上述慢病毒载体扩增融合蛋白的编码序列，并将其连接进入基于pET的细菌表 达载体。表达缺乏CECR2融合物的亲代ZsGreen蛋白的载体购自Clontech。将每一种载体转 化进入化-21pLysS Rosetta细胞化MD Millipore)，并且通过在簇节西林上涂板选择单个 菌落。使培养物在LB肉汤中生长，并通过添加 IPTG(在A600 = 0.4-0.6时）诱导蛋白质的表 达。在2.5小时的表达后收获细胞，并将其在-80°C胆存过夜。将细胞重悬浮于50mM化iS，pH 7.5,300mM化Cl，lmM抓ΤΑ和ImM DTT中，并通过超声处理进行裂解。通过裂解物的离屯、和 过滤除去细胞碎片，随后将其用于尺寸排阻柱（SEC-3000;Phenomenex)。利用在线检测器 (FP-2020P1US;化SCO)检测绿色巧光蛋白。
[0191] 结果和讨论
[0192] 通过慢病毒感染和杀稻攝素选择产生稳定地携带可诱导的化S-CECR2.BD- ZsGreen的U20S细胞系（图13A)。融合蛋白弥散地位于细胞核中，并且在CECR2布罗莫结构域 抑制剂不存在的情况下显示均匀分布。与CECR2抑制剂(化合物抓i-E)的解育导致ZsGreen 标记的蛋白的巧光点/斑形成（图13B)。运表明CECR2.BD与染色质的结合被抑制剂抑制，并 且释放至核质中。游离化S-CECR2.抓-ZsGreen融合蛋白随后聚集并形成巧光点（斑）。
[0193] 将化S-CECR2.抓-ZsGreen融合物在大肠杆菌化.CO1 i)细菌中表达W与缺乏CECR2 融合的ZsGreen比较。裂解细胞，并使裂解物经历凝胶过滤（尺寸柱）和巧光检测W使 ZsGreen蛋白可视化。CECR2融合蛋白被洗脱在空隙体积级分中，运表明是大的蛋白质复合 物(〉700kD)。如所预期的，缺乏CECR2融合的ZsGreen蛋白形成四聚体和二聚体但无种类在 空隙体积中洗脱（图14)。运些结果与我们的模型（巧光点含有大的蛋白质聚集体)一致（图 7)。
[0194] 实施例6
[0195] 为了探索使用串联布罗莫结构域模块(但不一定是含布罗莫结构域蛋白的其它区 域)与标签(例如，巧光蛋白标签)建立测定抑制剂在细胞中的活性的测定法的概念，进行下 列实验。
[0196] 方法
[0197] 将3个拷贝的核定位序列(DPKKK服VKSEQ ID N0:1)融合于TAF1的2个串联布罗莫 结构域(NCBI NP_004597.2的氨基酸残基1406-1640)的编码DNA序列的N末端，后跟ZsGreen 编码序列。将Q5"定点诱变试剂盒(New England Bi化abs)用于产生布罗莫结构域突变型 等位基因，其中位置1481和1604上的天冬酷胺残基被突变成酪氨酸。将野生型和突变型融 合表达构建体克隆进慢病毒载体，所述载体在人EF1启动子的控制下表达Tet-化3G转录因 子。受诱导型TRE3G启动子控制的化S-TAFl.BD-ZsGreen的表达用多西环素来诱导。将利用 运些表达质粒构建体产生的慢病毒用于感染U20S骨肉瘤细胞(ATCC，HTB-96)W在15μg/ml 杀稻攝素选择下建立稳定的细胞。将稳定的细胞涂板在6孔或96孔板中W进行显微镜分析。 用2μg/ml多西环素处理细胞16小时，随后与DMSO或CECR2抑制剂解育4小时，随后用4%甲醒 固定。将Zeiss LSM510倒置共聚焦显微镜或具有加热台的LSM780共聚焦显微镜用于检查细 胞核中的巧光蛋白的定位。利用Zeiss ZEN软件分析获得的图像。
[0198] 结果和讨论
[0199] 将稳定地携带可诱导的化S-TAFl.BDl.BD2-ZsGreen的U20S细胞（图15A)与多西环 素解育W诱导巧光蛋白的表达，随后利用媒介物(DMS0)或TAF1布罗莫结构域抑制剂处理4 小时。ZsGreen标记的TAF1布罗莫结构域弥散地分布在媒介物对照的细胞核中，表明融合蛋 白结合于染色质。在另一方面，标记的蛋白质在TAF1布罗莫结构域抑制化合物(BDi-F)存在 的情况下再定位和形成巧光点/斑（图15B)。运些结果显示，布罗莫结构域抑制剂破坏FP标 记的布罗莫结构域蛋白与染色质的结合，并且FP标记的布罗莫结构域蛋白在被从染色质释 放后，形成巧光点/斑。此外，当将消除布罗莫结构域结合能力的点突变引入NLS- TAFl.BDl.BD2-ZsGreen的两个TAF1布罗莫结构域(图16A)和将所得的慢病毒构建体用于建 立稳定的U20S细胞后，所述布罗莫结构域突变型蛋白即使在布罗莫结构域抑制化合物不存 在的情况下亦形成巧光点/斑（图16B)。因此，含有两个布罗莫结构域模块的FP融合蛋白响 应于布罗莫结构域抑制化合物而形成巧光点/斑，并且该类型的工程化细胞系统可用于测 定潜在布罗莫结构域抑制化合物的细胞内活性。
[0200] 实施例7
[0201] 设计和进行本实施例中的实验来确定使用含全长布罗莫结构域的蛋白质的主链 开发用于另一个布罗莫结构域的巧光再定位/点形成测定(通过用嵌合布罗莫结构域模块 替代所述全长布罗莫结构域的布罗莫结构域模块)的可行性。
[0202] 方法
[0203] 将巧光蛋白（ZsGreen)在框内克隆在人B畑9编码DNA序列(NCBI NP_076413.3)的 下游，其中所述布罗莫结构域编码序列（氨基酸残基114-253)被人BAZ2B(NCBI NP_ 038478.2;氨基酸残基2039-2166)或人PCAF/KAT2B(NCBI NP 003875.3;氨基酸残基696- 820)的布罗莫结构域序列替代。将嵌合BAZ2B-B畑9-ZsGreen或PCAF-B畑9-ZsGreen融合序 列克隆进慢病毒载体，所述载体在人EF1启动子的控制下表达Tet-化3G转录因子。位于诱 导型TRE3G启动子下游的ZsGreen标记的嵌合蛋白的表达可用多西环素诱导。利用运些表达 质粒构建体产生的慢病毒用于感染U20S骨肉瘤细胞(ATCC，HTB-96)W在15μg/ml杀稻溫素 选择下建立稳定的细胞。将稳定的细胞涂板于Nunc? Lab-Tek? II培养腔室载玻片上W进 行共聚焦显微镜观察。用化g/ml多西环素处理细胞16小时W诱导嵌合巧光蛋白。在成像之 前将表达BAZ2B-B畑9-ZsGreen的细胞与DMS0或BAZ^抑制剂解育4小时。将表达PCAF-B畑9- ZsGreen的细胞与DMS0或PCA巧Φ制剂解育16小时，随后成像。具有加热台的Zeiss LSM510倒 置共聚焦显微镜或ImgaeXpress Mic;ro(Molecular Devices)用于检查ZsGreen标记的嵌合 蛋白的定位。利用Zeiss ZEN软件分析获得的图像。
[0204] 结果和讨论
[0205] 为了探索使用BRD9-ZsGreen再定位测定(实施例4中描述的）建立用于其它布罗莫 结构域的测定系统的可能性，产生嵌合BRD9-ZsGreen表达构建体（称为BAZ2B-BRD9- ZsGreen)，其中BRD9布罗莫结构域被BAZ2B的布罗莫结构域替代。将稳定地携带可诱导的 BAZ2B-BRD9-ZsGreen的U20S细胞与多西环素解育（图17A)，W诱导巧光蛋白的表达，随后用 媒介物(DMSO)或布罗莫结构域抑制化合物进行处理。位于布罗莫结构域上游离的服D9的核 定位序列将ZsGreen标记的嵌合蛋白带至细胞核。该嵌合蛋白的分布散布在媒介物对照的 细胞核中。在另一方面，用BAZ2B布罗莫结构域抑制化合物(BDi-G)处理改变嵌合蛋白的定 位W形成巧光点/斑（图17B)。运些结果显示BAZ^抑制剂破坏BAZ2B-B畑9-ZsGreen蛋白与 染色质之间的相互作用，随后因 ZsGreen标签的聚集性质而引起巧光点/斑形成。
[0206] 类似地，将B畑9-ZsGreen主链用于产生PCAF布罗莫结构域嵌合构建体（图18A)来 确定是否可针对PCAF布罗莫结构域建立细胞测定来分析PCAF布罗莫结构域抑制化合物。将 U20S/PCAF-B畑9-ZsGreen细胞与多西环环素解育过夜，W诱导ZsGreen标记的嵌合蛋白表 达，随后进行媒介物（DMS0)或PCA巧Φ制化合物（抓i-H)处理。PCAF-BRD9-ZsGreen蛋白在 DMS0存在的情况下弥散地分布在细胞核中，而PCAF布罗莫结构域抑制剂导致蛋白质再定位 和点/斑形成（图18B)。该结果与在布罗莫结构域抑制化合物存在的情况下ZsGreen标记的 布罗莫结构域蛋白再定位和形成点/斑一致，所述布罗莫结构域抑制化合物抑制布罗莫结 构域模块的结合活性。综上所述，本实施例中的实验数据证明FP标记的含有来自另一种蛋 白的替代布罗莫结构域的嵌合型含布罗莫结构域蛋白响应于布罗莫结构域抑制化合物并 且能够形成巧光点/斑。
【主权项】
1. 一种融合蛋白，其包含至少一个染色质结合模块和至少一个报告模块，其中多个融 合蛋白能够形成斑。2. 根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含含有至少一个染色质结合 模块的第一染色质结合多肽，其中所述第一染色质结合多肽的染色质结合模块的至少一个 已被缺失、被第二染色质结合多肽的至少一个染色质结合模块取代和/或替代。3. 根据权利要求1-2中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含含有至少一个 染色质结合模块的第一染色质结合多肽，其中所述第一染色质结合多肽的染色质结合模块 的至少一个已被第二染色质结合多肽的至少一个布罗莫结构域模块替代。4. 根据权利要求1-3中任一项所述的融合蛋白，其中所述至少一个报告模块包括至少 一个焚光报告模块。5. 根据权利要求4所述的融合蛋白，其中所述至少一个报告模块包括EGFP、TurboGFP、 dsRed2、dsRed_Express2i^ZsGreen〇6. 根据权利要求1-5中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含核定位信号 (NLS)〇7. 根据权利要求6所述的融合蛋白，其中所述NLS是SV40大T-抗原NLS或核浆素的NLS。8. 根据权利要求1-7中任一项所述的融合蛋白，其中所述至少一个染色质结合模块位 于所述报告模块的5'。9. 根据权利要求1-7中任一项所述的融合蛋白，其中所述至少一个染色质结合模块位 于所述报告模块的3'。10. 根据权利要求1-9中任一项所述的融合蛋白，其中所述至少一个染色质结合模块是 布罗莫结构域模块、PHD指模块、染色质域模块、MBT结构域模块、tudor结构域模块、PWWP结 构域模块、ADD结构域模块、Zf-CW结构域模块、锚蛋白重复模块或WD40模块。11. 根据权利要求10所述的融合蛋白，其中所述至少一个染色质结合模块是布罗莫结 构域模块。12. 根据权利要求11所述的融合蛋白，其中所述至少一个布罗莫结构域模块包含BRG1、 PCAF/KAT2B、BAZ2B、BRD1、BRD8、BRFP1、BRFP3、BRG1、CBP/CREBBP、PCAF/KAT2B、TRIM24和/或 ZMYND8的任一个的至少一个布罗莫结构域。13. 根据权利要求11所述的融合蛋白，其中所述至少一个布罗莫结构域模块包含BRD2、 8^)3、8^)4、81^9、81^1'和/或81?1的任一个的至少一个布罗莫结构域。14. 根据权利要求11所述的融合蛋白，其中所述至少一个布罗莫结构域模块包含BRG1、 BRPF1、CECR2、PCAF和/或TAF1的任一个的至少一个布罗莫结构域。15. 根据权利要求11所述的融合蛋白，其中所述至少一个布罗莫结构域模块包含BRD4 和/或BRD9的至少一个布罗莫结构域。16. 根据权利要求11-15中任一项所述的融合蛋白，其中所述布罗莫结构域多肽包含 BRG1、PCAF/KAT2B、BAZ2B、BRD1、BRD8、BRFP1、BRFP3、BRG1、CBP/CREBBP、PCAF/KAT2B、TRIM24 和/或ZMYND8的任一个或包含至少一个布罗莫结构域模块的其片段的氨基酸序列。17. 根据权利要求11-15中任一项所述的融合蛋白，其中所述布罗莫结构域多肽包含 8^)2、81?3、81^4、81^9、81^1'和/或81?1的任一个或包含至少一个布罗莫结构域模块的其片 段的氨基酸序列。18. 根据权利要求11-15中任一项所述的融合蛋白，其中所述布罗莫结构域多肽包含 BRG1、BRPF1、CECR2、PCAF和/或TAF1的任一个或包含至少一个布罗莫结构域模块的其片段 的氨基酸序列。19. 根据权利要求11-15中任一项所述的融合蛋白，其中所述布罗莫结构域多肽包含 BRD4和/或BRD9或包含至少一个布罗莫结构域模块的其片段的氨基酸序列。20. 根据权利要求16-19中任一项所述的融合蛋白，其中所述布罗莫结构域多肽包含全 长布罗莫结构域多肽。21. 根据权利要求1-20中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白能够多聚化。22. 根据权利要求1-21中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白能够形成二聚体、 三聚体或四聚体。23. 根据权利要求22所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白能够形成二聚体。24. 根据权利要求22所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白能够形成四聚体。25. -种核酸序列，其编码权利要求1-24中任一项所述的融合蛋白。26. -种表达盒，其包含权利要求25所述的核酸序列。27. -种细胞，其包含权利要求1-24中任一项所述的融合蛋白。28. 根据权利要求 27 所述的细胞，其为 CH0-K1、C0S-7、HEK293、HEK293T、HEK293FT、 HeLa、MDCK 或 U20S 细胞。29. 根据权利要求28所述的细胞，其为COS-7、HeLa或U20S细胞。30. -种用于确定测试化合物是否是布罗莫结构域抑制化合物的方法，所述方法包括 (a)将权利要求27-29中任一项所述的细胞与所述测试化合物接触，和(b)确定所述测试化 合物是否改变融合蛋白的定位和/或增加融合蛋白斑的形成，其中定位的改变和/或斑形成 的增加表明所述测试化合物是布罗莫结构域抑制化合物。31. -种试剂盒，其包含权利要求1-29中任一项所述的融合蛋白、核酸序列、表达盒或 细胞。
【专利摘要】本发明涉及包含至少一个染色质结合模块和至少一个报告模块的融合蛋白，其中多个融合蛋白能够形成斑；和用于鉴定布罗莫结构域抑制化合物的相关方法。
【IPC分类】C07K14/47
【公开号】CN105555798
【申请号】CN201480026171
【发明人】黄宏仁, 罗伯特·J·西姆斯三世, S·F·贝洛
【申请人】星座制药股份有限公司
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2014年3月14日
【公告号】CA2903547A1, EP2970414A1, US20160002306, WO2014144303A1
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