Fc结合性蛋白质、该蛋白质的制造方法和使用了该蛋白质的抗体吸附剂、以及使用了该吸...的制作方法
Fc结合性蛋白质、该蛋白质的制造方法和使用了该蛋白质的抗体吸附剂、以及使用了该吸 ...的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及对免疫球蛋白具有亲和性的Fc结合性蛋白质、使用了该蛋白质的抗体 吸附剂、W及使用了该吸附剂的抗体的纯化方法和识别方法。更详细而言，本发明设及对 热、酸的稳定性高于野生型的化结合性蛋白质、该蛋白质的制造方法W及将该蛋白质固定 化于不溶性载体而得到的抗体吸附剂。特别是，本发明设及能够特异地吸附抗体中具有糖 链的抗体的吸附剂、W及使用了该吸附剂的、具有糖链的抗体的纯化方法W及识别糖链有 无附加于抗体的方法。
【背景技术】
[0002] 化受体是与免疫球蛋白分子的化区域结合的一组分子。各个分子通过属于免疫球 蛋白超家族的识别结构域，利用Fc受体上的识别结构域识别单一或相同组的免疫球蛋白同 种型。由此决定免疫应答中何种辅助细胞起作用。Fc受体可进一步分类成几种亚型，有IgG (免疫球蛋白G)的受体即化丫受体、与I巧的化区域结合的Fee受体、与IgA的化区域结合的 Fca受体等。另外，各受体更详细地分类，Fc 丫受体有Fc 丫 RI、Fc 丫 RIIa、Fc 丫 Rllb和Fc 丫 RlllaJc 丫 Rinb 的存在被报导（非专利文献 l:Takai.T. Jpn.J.Clin. Immunol. ,28,318- 326,2005)〇
[0003] Fc 丫受体中Jc 丫 Rllla存在于自然杀伤细胞(NK细胞）、巨隧细胞等细胞表面，是 人免疫机构中参与十分重要的ADCC(抗体依赖性细胞损伤)活性的重要的受体。有报导称， 该Fc 丫 Rllla与人IgG的亲和性为表示结合强度的结合常数化A)为107M-1W下(非专利文献 2 :J. Galon 等，Eur.J. Immunol.，27,1928-1932,1997)。人 Fc 丫 Rllla 的氨基酸序列（序列号 1)被UniP;rot(Accession number :P08637)等公共数据库发布。另外，对于人Fc 丫 Rllla的结 构上的功能结构域、用于贯穿细胞膜的信号肤序列、细胞膜贯穿区域的位置，也同样被发 布。图1表示人化丫 Rllla的结构示意图。需要说明的是，图1中的氨基酸号对应于序列号1中 记载的氨基酸号。即，序列号1中的第1位的甲硫氨酸(Met)至第16位的丙氨酸(Ala)为止为 信号序列（S);第17位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酷胺(Gin)为止为细胞外区域化C); 第209位的鄉氨酸(Val)至第229位的鄉氨酸(化1)为止为细胞膜贯穿区域(TM)W及第230位 的赖氨酸化ys)至第254位的赖氨酸化ys)为止为细胞内区域(C)。需要说明的是，已知化丫 Rllla与IgGl至IgG4的人IgG亚类中特别是IgGl和IgG3强结合、而与IgG2和IgG4的结合弱。
[0004] 另一方面，近年来，利用单克隆抗体所具有的特异性的药物(抗体药物）的开发有 所进展。已知，报导了在抗体药物中所使用的人IgG中，根据化区域的第297位的天冬酷胺残 基上附加的N型糖链的差异，ADCC(抗体依赖性细胞损伤)活性变化，特别是用去除了作为糖 链的一种的岩藻糖的抗体，ADCC活性提高（非专利文献3: Shinkawa. T.，J. Biol. Chem.，278， 3466-3473,2003)。即，抗体药物中，抗体所具有的糖链结构具有重要的意义。然而，抗体药 物通常是使用W动物细胞作为宿主的基因重组技术而制造的，难W控制在宿主内附加于抗 体的糖链。另外，对制造的抗体的糖链进行分析需要很多时间和劳力。
[0005] 现有技术文献
[0006] 非专利文献
[0007] 非专利文献l:Takai.T. Jpn.J.Clin. Immunol.，28,318-326,2005 [000引 非专利文献2: J.Galon等，Eur. J. Immunol.，27，1928-1932，1997
[0009] 非专利文献3:aii址awa.T. J.Biol.Chem.，278，：M66-3473,2003
【发明内容】
[0010] 发明要解决的问题
[0011] 本发明的第一课题在于提供特别是对热、酸的稳定性提高了的Fc结合性蛋白质、 该蛋白质的制造方法、W及使用了该蛋白质的抗体吸附剂。进而，本发明的第二课题在于提 供能够识别对于抗体有无附加糖链的方法W及该方法中使用的材料。
[00。] 用于解决问题的方案
[0013] 本发明人等为了解决上述第一课题进行了深入研究的结果发现，确定了人Fc 丫 Rllla中的设及稳定性提高的氨基酸残基，并且将该氨基酸残基置换为其他的氨基酸残基 的突变体具有对热、酸优异的稳定性，至此完成了本发明。
[0014] 本发明人等为了解决上述的第二课题进行了深入研究的结果发现，通过使用将 IgG受体(化丫受体)之一的Fc 丫 Rllla固定化于不溶性载体而得到的吸附剂，能够识别有无 糖链附加于抗体，至此完成了本发明。
[0015] 旨P，本发明包含W下的(A)至(Z)中所述的方式：
[0016] (A)-种Fc结合性蛋白质，其包含序列号1中记载的氨基酸序列中由第17位至第 192位为止的氨基酸残基，并且该第17位至第192位为止的氨基酸残基中产生W下的（1)至 (40)中至少任一种氨基酸置换；
[0017] (1)序列号1的第18位的甲硫氨酸置换为精氨酸
[0018] (2)序列号1的第27位的鄉氨酸置换为谷氨酸
[0019] (3)序列号1的第29位的苯丙氨酸置换为亮氨酸或丝氨酸
[0020] (4)序列号1的第30位的亮氨酸置换为谷氨酷胺
[0021] (5)序列号1的第35位的酪氨酸置换为天冬氨酸、甘氨酸、赖氨酸、亮氨酸、天冬酷 胺、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、组氨酸的任一者
[0022] (6)序列号1的第46位的赖氨酸置换为异亮氨酸或苏氨酸
[0023] (7)序列号1的第48位的谷氨酷胺置换为组氨酸或亮氨酸
[0024] (8)序列号1的第50位的丙氨酸置换为组氨酸
[0025] (9)序列号1的第51位的酪氨酸置换为天冬氨酸或组氨酸
[0026] (10)序列号1的第54位的谷氨酸置换为天冬氨酸或甘氨酸
[0027] (11)序列号1的第56位的天冬酷胺置换为苏氨酸
[0028] (12)序列号1的第59位的谷氨酷胺置换为精氨酸
[0029] (13)序列号1的第61位的苯丙氨酸置换为酪氨酸
[0030] (14)序列号1的第64位的谷氨酸置换为天冬氨酸
[0031] (15)序列号1的第65位的丝氨酸置换为精氨酸
[0032] (16)序列号1的第71位的丙氨酸置换为天冬氨酸
[0033] (17)序列号1的第75位的苯丙氨酸置换为亮氨酸、丝氨酸、酪氨酸的任一者
[0034] (18)序列号1的第77位的天冬氨酸置换为天冬酷胺
[0035] (19)序列号1的第78位的丙氨酸置换为丝氨酸
[0036] (20)序列号1的第82位的天冬氨酸置换为谷氨酸或鄉氨酸
[0037] (21)序列号1的第90位的谷氨酷胺置换为精氨酸
[0038] (22)序列号1的第92位的天冬酷胺置换为丝氨酸
[0039] (23)序列号1的第93位的亮氨酸置换为精氨酸或甲硫氨酸
[0040] (24)序列号1的第95位的苏氨酸置换为丙氨酸或丝氨酸
[0041] (25)序列号1的第110位的亮氨酸置换为谷氨酷胺
[0042] (26)序列号1的第115位的精氨酸置换为谷氨酷胺
[0043] (27)序列号1的第116位的色氨酸置换为亮氨酸
[0044] (28)序列号1的第118位的苯丙氨酸置换为酪氨酸
[0045] (29)序列号1的第119位的赖氨酸置换为谷氨酸
[0046] (30)序列号1的第120位的谷氨酸置换为鄉氨酸
[0047] (31)序列号1的第121位的谷氨酸置换为天冬氨酸或甘氨酸
[0048] (32)序列号1的第151位的苯丙氨酸置换为丝氨酸或酪氨酸
[0049] (33)序列号1的第155位的丝氨酸置换为苏氨酸
[0050] (34)序列号1的第163位的苏氨酸置换为丝氨酸
[0051] (35)序列号1的第167位的丝氨酸置换为甘氨酸
[0052] (36)序列号1的第169位的丝氨酸置换为甘氨酸
[0053] (37)序列号1的第171位的苯丙氨酸置换为酪氨酸
[0054] (38)序列号1的第180位的天冬酷胺置换为赖氨酸、丝氨酸、异亮氨酸的任一者
[0055] (39)序列号1的第185位的苏氨酸置换为丝氨酸
[0056] (40)序列号1的第192位的谷氨酷胺置换为赖氨酸。
[0057] (B)根据(A)所述的Fc结合性蛋白质，其中，包含序列号1中记载的氨基酸序列中第 17位至第192位为止的氨基酸残基，并且该第17位至第192位为止的氨基酸残基中至少序列 号1的第35位的酪氨酸置换为天冬氨酸、甘氨酸、赖氨酸、亮氨酸、天冬酷胺、脯氨酸、丝氨 酸、苏氨酸、组氨酸的任一者。
[005引（C)根据(B)所述的Fc结合性蛋白质，其中，包含序列号1中记载的氨基酸序列中第 17位至第192位为止的氨基酸残基，并且该第17位至第192位为止的氨基酸残基中至少序列 号1的第35位的酪氨酸置换为天冬酷胺或脯氨酸。
[0059] (D)根据(C)所述的化结合性蛋白质，其包含序列号27、序列号31、序列号33、序列 号37、序列号41、序列号43、序列号47、序列号49的任一者中记载的氨基酸序列中由第33位 至第208位为止的氨基酸残基。
[0060] 化)根据(D)所述的化结合性蛋白质，其包含序列号27、序列号31、序列号33、序列 号37、序列号41、序列号43、序列号47、序列号49的任一者中记载的氨基酸序列。
[0061] (F)根据(A)至（C)的任一项所述的Fc结合性蛋白质，进一步产生W下的（41)至 (44)中至少任一个氨基酸置换；
[0062] (41)序列号1的第66位的亮氨酸置换为组氨酸或精氨酸
[0063] (42)序列号1的第147位的甘氨酸置换为天冬氨酸
[0064] (43)序列号1的第158位的酪氨酸置换为组氨酸
[0065] (44)序列号1的第176位的鄉氨酸置换为苯丙氨酸
[0066] (G)-种吸附剂，其是将(A)至(F)的任一项所述的化结合性蛋白质固定化于不溶 性载体而得到的。
[0067] 化)一种抗体的纯化方法，其使用了 (G)所述的吸附剂。
[0068] (I)-种识别方法，使用(G)所述的吸附剂分离抗体，从而识别抗体所具有的糖链 结构的差异。
[0069] (J) -种抗体，其是用化)所述的纯化方法得到的。
[0070] 化)一种糖链的分离方法，其使用了 (G)所述的吸附剂。
[0071] (L) -种糖链，其是用化)所述的分离方法得到的。
[0072] (M)-种多聚核巧酸，其编码(A)至(F)的任一项所述的化结合性蛋白质。
[0073] (N)-种表达载体，其包含(M)所述的多聚核巧酸。
[0074] (0)-种转化体，其是W(N)所述的表达载体转化宿主而得到的。
[0075] (P)根据(0)所述的转化体，其中，宿主为大肠杆菌。
[0076] (Q)-种化结合性蛋白质的制造方法，通过对(0)或(P)所述的转化体进行培养而 使Fc结合性蛋白质表达，从该培养物中回收表达的Fc结合性蛋白质。
[0077] (R) -种具有糖链的抗体的吸附剂，其是将人Fc 丫 Rllla固定化于不溶性载体而得 到的。
[007引（S)根据(R)所述的吸附剂，其中，人化丫 Rllla为包含序列号1中记载的氨基酸序 列中至少第17位的甘氨酸至第192位的谷氨酷胺为止的氨基酸残基的多肤。
[0079] (T)根据(R)所述的吸附剂，其中，人化丫 Rllla为包含序列号1中记载的氨基酸序 列中至少第17位的甘氨酸至第192位的谷氨酷胺为止的氨基酸残基，并且前述氨基酸残基 中的一个W上被其他的氨基酸残基置换、插入、或缺失了前述氨基酸残基中的一个W上的 多肤。
[0080] (U)根据(T)所述的吸附剂，其中，人化丫 Rllla为包含序列号1中记载的氨基酸序 列中至少第17位的甘氨酸至第192位的谷氨酷胺为止的氨基酸残基并且该第17位至第192 位为止的氨基酸残基中产生了 W下（i)至(iv)中至少任一种氨基酸置换的多肤。
[0081] (i)序列号1的第66位的亮氨酸置换为组氨酸或精氨酸
[0082] (ii)序列号1的第147位的甘氨酸置换为天冬氨酸
[0083] (iii)序列号1的第158位的酪氨酸置换为组氨酸
[0084] (iv)序列号1的第176位的鄉氨酸置换为苯丙氨酸
[0085] (V)-种具有糖链的抗体的纯化方法，其包括:将包含具有糖链的抗体的溶液添加 至(R)至化)的任一项所述的吸附剂中并使具有糖链的抗体吸附于该吸附剂的工序;和、使 用洗脱液将吸附于前述吸附剂的具有糖链的抗体洗脱的工序。
[0086] (W)-种抗体，其是用(V)所述的纯化方法得到的。
[0087] (X)-种识别方法，使用(R)至(U)的任一项所述的吸附剂来识别有无糖链附加于 抗体。
[0088] (Υ)-种糖链的分离方法，其使用了 (R)至化)的任一项所述的吸附剂。
[0089] (Z)-种糖链，其是用(Y)所述的分离方法得到的。
[0090] W下，对本发明详细地进行说明。
[0091] 本发明的Fc结合性蛋白质是具有与抗体的Fc区域的结合性的蛋白质，是包含含有 序列号1中记载的氨基酸序列的人Fc 丫 Rllla的细胞外区域(图1的EC的区域)中至少第17位 的甘氨酸至第192位的谷氨酷胺为止的氨基酸残基的蛋白质，是该第17位至第192位为止的 氨基酸残基中的特定位点产生了氨基酸置换的蛋白质。因此，本发明的化结合性蛋白质可 W包含位于细胞外区域的N末端侧的信号肤区域（图1的S)的全部或者一部分，也可W包含 位于细胞外区域的C末端侧的细胞膜贯穿区域（图1的TM)和细胞外区域（图1的C)的全部或 者一部分。前述特定位点中的氨基酸置换具体而言，是指序列号1中记载的氨基酸序列中下 述至少任一种置换:MetlSArg(该标记表示序列号1的第18位的甲硫氨酸置换为精氨酸，W 下相同）、Val27Glu、Phe29Leu、F*he29Se;r、Leu30Gln、Tyr35Asp、Tyr35Gly、Tyr35Lys、 Tyr35Leu、Tyr35Asn、Tyr35Pro、Tyr35Ser、Tyr35Thr、Tyr35His、Lys46Ile、Lys46Thr、 Gln48His、Gln48Leu、Ala50His、Tyr51Asp、Tyr51His、Glu54Asp、Glu54Gly、Asn56Thr、 Gln59Arg、Phe61Tyr、Glu64Asp、Ser65Arg、Ala71Asp、Phe75Leu、Phe75Ser、Phe75Tyr、 Asp77Asn、Ala78Se;r、Asp82Glu、Asp82Val、Gln90Arg、Asn92Se;r、Leu93Arg、Leu93Met、 Thr95Ala、Thr95Ser、LeullOGln、Argl15Gln、Trpl16Leu、Phell8Tyr、Lysl19Glu、 Glul20Val、Glul21Asp、Glul21Gly、Phel51Ser、Phel51Tyr、Serl55Thr、Thrl63Ser、 Se;rl67Gly、Se;rl69Gly、Phel71Ty;r、Asnl80Lys 'AsnlSOSer'AsnISOIle'ThrlSSSer、 61]11921^73。其中，产生了7的5439、了7扣5617、了7的化73、了7'351^611、了7'3543]1、了7'35口1'〇、 了7^556'、了7扣5化'、了7^5化3、6111121617中任一置换时，热稳定性提高，因而优选。另外， 已知野生型人Fc 丫 Rllla中有产生了Leu66His、Leu66Arg、Glyl47Asp、Tyrl58His或 Vall76化e的置换的突变体，但除了前述特定位点中的氨基酸置换W外，也可W含有运些氨 基酸置换。
[0092] 需要说明的是，通过进行氨基酸置换来制备本发明的化结合性蛋白质时，对于特 定位点的氨基酸残基，只要具有抗体结合活性，也可W置换为前述的氨基酸W外的氨基酸。 作为其一例，可列举出保守的置换即两氨基酸的物理性质和化学性质或者其一类似的氨基 酸间进行置换。对于本领域技术人员来说已知的是，保守的置换不限定于化结合性蛋白质， 通常在产生置换的蛋白质与没有产生置换的蛋白质之间维持了蛋白质的功能。作为保守的 置换的一例，可列举出甘氨酸与丙氨酸之间、天冬氨酸与谷氨酸之间、丝氨酸与脯氨酸之 间、或者谷氨酸与丙氨酸之间产生的置换（蛋白质的结构和功能，MEDICAL SCIENCES INTERNATIONA^LTD. ,9,2005)。
[0093] 本发明的化结合性蛋白质中，对于置换的氨基酸的个数没有特别的限制。作为一 例，可列举出W下的（a)至化)所示的Fc结合性蛋白质。运些Fc结合性蛋白质从对热和酸的 稳定性提高的观点出而优选。（a)包含序列号1中记载的氨基酸序列中第17位至第192位为 止的氨基酸残基，并且该第17位至第192位为止的氨基酸残基中产生Val27Glu和Tyr35Asn 的氨基酸置换的化结合性蛋白质(包含序列号27中记载的氨基酸序列中第33位至第208位 为止的氨基酸序列的Fc结合性蛋白质）。化)包含序列号1中记载的氨基酸序列中第17位至 第192位为止的氨基酸残基，并且该第17位至第192位为止的氨基酸残基中产生化127G1U、 Tyr35Asn和化e7化eu的氨基酸置换的Fc结合性蛋白质(包含序列号31中记载的氨基酸序列 中第33位至第208位为止的氨基酸序列的化结合性蛋白质）。山)包含序列号1中记载的氨基 酸序列中第17位至第192位为止的氨基酸残基，并且该第17位至第192位为止的氨基酸残基 中产生Val27Glu、Tyr35Asn、化e7化eu和Glul21Gly的氨基酸置换的化结合性蛋白质（包含 序列号33中记载的氨基酸序列中第33位至第208位为止的氨基酸序列的化结合性蛋白质）。 (d)包含序列号1中记载的氨基酸序列中第17位至第192位为止的氨基酸残基，并且该第17 位至第192位为止的氨基酸残基中产生了 ￥曰1276111、了7'354311、？}167化611、43119256'和 Glul21Gly的氨基酸置换的化结合性蛋白质(包含序列号37中记载的氨基酸序列中第33位 至第208位为止的氨基酸序列的Fc结合性蛋白质）。（6)包含序列号1中记载的氨基酸序列中 第17位至第192位为止的氨基酸残基，并且该第17位至第192位为止的氨基酸残基中产生 化127Glu、Tyr35Asn、Glu54Asp、Phe75Leu和Glul21Gly的氨基酸置换的Fc结合性蛋白质（包 含序列号41中记载的氨基酸序列中第33位至第208位为止的氨基酸序列的Fc结合性蛋白 质）。（門包含序列号1中记载的氨基酸序列中第17位至第192位为止的氨基酸残基，并且该 第17位至第192位为止的氨基酸残基中产生Val27Glu、Tyr35Asn、Glu54Asp、Phe75Leu、 Asn92Ser和Glul21Gly的氨基酸置换的化结合性蛋白质（包含序列号43中记载的氨基酸序 列中第33位至第208位为止的氨基酸序列的化结合性蛋白质）。（旨)包含序列号1中记载的氨 基酸序列中第17位至第192位为止的氨基酸残基，并且该第17位至第192位为止的氨基酸残 基中产生 ￥曰1276111、了7切54311、611154439、？}16751^611、6111120化1和6111121617的氨基酸置换 的Fc结合性蛋白质（包含序列号47中记载的氨基酸序列中第33位至第208位为止的氨基酸 序列的化结合性蛋白质）。化饱含序列号1中记载的氨基酸序列中第17位至第192位为止的 氨基酸残基，并且该第17位至第192位为止的氨基酸残基中产生Val27Glu、Tyr35Asn、 611154439、？}16751^611、43119256'、6111120￥日1和6111121617的氨基酸置换的。。结合性蛋白质 (包含序列号49中记载的氨基酸序列中第33位至第208位为止的氨基酸序列的化结合 性蛋 白质）。
[0094]本发明的吸附剂中作为配体使用的、人Fc 丫 Rllla的氨基酸序列（序列号1)被 化iP;rot(Accession number :P08637)等公共数据库所公开。另外，对于人化丫 Rllla的结构 上的功能结构域、用于贯穿细胞膜的信号肤序列、细胞膜贯穿区域的位置，也同样被发布。 图1表示人化丫 Rllla的结构示意图。需要说明的是，图1中的氨基酸号对应于序列号1中记 载的氨基酸号。即，序列号1中的第1位的甲硫氨酸(Met)至第16位的丙氨酸(Ala)为止为信 号序列（S);第17位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酷胺(Gin)为止为细胞外区域化C);第 209位的鄉氨酸(Val)至第229位的鄉氨酸(化1)为止为细胞膜贯穿区域(TM)W及第230位的 赖氨酸化ys)至第254位的赖氨酸化ys)为止为细胞内区域(C)。需要说明的是，本发明的吸 附剂中作为配体而使用的人化丫 Rllla并不一定需要使用人化丫 Rllla的全长(序列号1)， 只要是至少包含序列号1中记载的氨基酸序列中的第17位的甘氨酸至第192位的谷氨酷胺 为止的氨基酸残基的多肤即可。进而，包含序列号1中记载的氨基酸序列中的至少第17位的 甘氨酸至第192位的谷氨酷胺为止的氨基酸残基并且前述氨基酸残基中的一个W上被其他 的氨基酸残基置换、插入、或缺失了前述氨基酸残基中的一个W上的多肤，也包括在作为本 发明的吸附剂的且作为配体使用的人化丫 Rllla中。另外，已知天然型人化丫 Rllla中有第 66位的亮氨酸化eu)置换成组氨酸化is)或精氨酸(Arg)、第147位的甘氨酸(Gly)置换成天 冬氨酸(Asp)、第158位的酪氨酸(Tyr)置换成组氨酸化is)、或者第176位的鄉氨酸(Val)置 换成苯丙氨酸(Phe)的突变体，产生了至少任一个运些氨基酸置换的多肤也包括于作为本 发明的吸附剂的配体而使用的人Fc 丫 Rllla中。
[00%]本发明的化结合性蛋白质或作为吸附剂的配体的人化丫 Rllla也可W在其N末端 侧或C末端侧进一步附加在从杂质存在下的溶液中分离时有用的寡肤。作为前述寡肤，可列 举出多聚组氨酸、多聚赖氨酸、多聚精氨酸、多聚谷氨酸、多聚天冬氨酸等。另外，也可W将 在本发明的Fc结合性蛋白质或作为吸附剂的配体的人Fc 丫 Rllla固定化于色谱法用的支持 体等固相时有用的、包含半脫氨酸的寡肤附加于本发明的化结合性蛋白质或作为吸附剂的 配体的人Fc 丫 Rllla的N末端侧或C末端侧。对于Fc结合性蛋白质或作为吸附剂的配体的人 化丫 Rllla的N末端侧或C末端侧所附加的寡肤的长度，只要不有损作为本发明的化结合性 蛋白质或吸附剂的配体即人Fc 丫 Rllla的IgG结合性、稳定性，则没有特别的限制。可W在使 前述寡肤附加于本发明的化结合性蛋白质或作为吸附剂的配体的人化丫 Rllla时，制备编 码前述寡肤的多聚核巧酸之后，使用本领域技术人员公知的方法基因工程地附加在Fc结合 性蛋白质或人Fc 丫 Rllla的N末端侧或C末端侧，也可W使化学地合成的前述寡肤化学地结 合并附加于本发明的Fc结合性蛋白质或人Fc 丫 Rllla的N末端侧或C末端侧。进而，也可W在 本发明的化结合性蛋白质或吸附剂的配体即人化丫 Rllla的N末端侧附加用于促进在宿主 中的有效表达的信号肤。宿主为大肠杆菌的情况下的前述信号肤的例子，可例示出：PelB、 DsbA、Ma化(UniProt NO.P0AEX9中记载的氨基酸序列中第1位至第26位为止的区域）、Tod 等运样的使蛋白质分泌于周质的信号肤（日本特开2011-097898号公报）。
[0096] 作为本发明的多聚核巧酸的制备方法的一例，可例示出：（1)由本发明的化结合性 蛋白质或吸附剂的配体即人Fc 丫 Rllla的氨基酸序列转换成核巧酸序列，人工地合成包含 该核巧酸序列的多聚核巧酸的方法；（II)直接人工地制备包含Fc结合性蛋白质或人化丫 Rllla的整体或部分序列的多聚核巧酸，或者由化结合性蛋白质或人Fc 丫 Rllla的cDNA等使 用PCR法运样的DNA扩增法来制备包含Fc结合性蛋白质或人化丫 Rllla的整体或部分序列的 多聚核巧酸，用适当的方法将制备的该多聚核巧酸进行连接的方法。前述（I)的方法中，由 氨基酸序列转换成核巧酸序列时，优选考虑转化的宿主中的密码子的使用频率而进行变 换。作为一例，宿主为大肠杆菌化schericMa coli)的情况下，精氨酸(Arg)中的AGA/AGG/ CGG/CGA、异亮氨酸（11 e)中的ΑΤΑ、亮氨酸化eu)中的CTA、甘氨酸（G1 y)中的GGA、脯氨酸 (Pro)中的CCC由于分别使用频率少（由于是所谓的罕用密码子）、所W避开运些密码子而进 行更换即可。密码子的使用频率的解析也可W利用公共数据库（例如，Kazusa DM Research Insti1:ute的主页中的Codon Usage Da1:abase等）。
[0097] 对本发明的多聚核巧酸导入突变的情况下，可W使用易错聚合酶链反应(error- prone PCR)法。对于易错PCR法中的反应条件，只要是对编码人化丫 RI(或者化结合性蛋白 质）的多聚核巧酸导入所希望的突变的条件，则没有特别的限定;例如，将作为底物的4种脱 氧核巧酸(dATP/dTTP/dCTP/dGTP)的浓度设为不均匀、W0.01至1 OmM(优选为0.1至ImM)的 浓度向PCR反应液中添加 MnCl2而进行PCR，由此能够向多聚核巧酸中导入突变。另外，作为 易错PCR法W外的突变导入方法，可列举出如下方法:使包含人Fc 丫 RI的整体或部分序列的 多聚核巧酸与作为突变原的试剂接触?作用，或照射紫外线，从而向多聚核巧酸导入突变 来制备。作为该方法中作为突变原而使用的试剂，可W使用径基胺、N-甲基-Ν'-硝基-N-亚 硝基脈、亚硝酸、亚硫酸、阱等本领域技术人员通常使用的突变原性试剂。
[0098] 使用本发明的多聚核巧酸来转化宿主的情况下，可W使用本发明的多聚核巧酸其 自身，更优选使用在表达载体(例如，原核细胞、真核细胞的转化中通常使用的隧菌体、粘 粒、质粒等）的适当的位置插入本发明的多聚核巧酸的表达载体。需要说明的是，该表达载 体只要是能够在转化的宿主内稳定地存在并复制的物质则没有特别的限制，W大肠杆菌作 为宿主的情况下，可例示出：pET质粒载体、pUC质粒载体、pTrc质粒载体、pCDF质粒载体、 地BR质粒载体。另外，前述适当的位置是指不破坏设及表达载体的复制功能、所希望的抗生 素标记物、传递性的区域的位置。向前述表达载体中插入本发明的多聚核巧酸时，优选W与 表达所需要的启动子运样的功能性多聚核巧酸连接的状态插入。作为该启动子的例子，在 宿主为大肠杆菌的情况下，可列举出trp启动子、tac启动子、trc启动子、lac启动子、T7启动 子、recA启动子、Ipp启动子、进而λ隧菌体的APL启动子、λΡΚ启动子等。
[0099] 为了使用通过前述方法制备的插入了本发明的多聚核巧酸的表达载体下，作 为本发明的表达载体)来转化宿主，可W用本领域技术人员通常使用的方法进行。例如，作 为宿主选择属于Escherichia属的微生物(大肠杆菌JM109株、大肠杆菌化21 (DE3)株、大肠 杆菌W3110株等）的情况下，可W通过公知的文献(例如,Molecular Cloning,Cold Spring 化rbor Laboratory，256,1992)中记载的方法等进行转化。对于用前述的方法转化而得到 的转化体可W用适当的方法进行筛选，从而得到能够表达本发明的化结合性蛋白质的转化 体下，作为本发明的转化体）。需要说明的是，对于使本发明的化结合性蛋白质或吸附剂 的配体即人Fc 丫 RIIla表达的宿主，没有特别的限制;作为一例，可列举出：动物细胞(CH0细 胞、肥K细胞、Hela细胞、COS细胞等）、酵母（Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris、 Hansenula polymorpha、Schizosaccharomyces japonicus、Schizosaccharomyces octospo;rus、Schizosaccha;romycespombe等）、昆虫细胞（Sf9、Sf21等）、大肠杆菌（JM109 株、BL21 (DE3)株、W3110株等）、枯草杆菌。需要说明的是，使用动物细胞、大肠杆菌作为宿主 时，从生产率的方面出发而优选，进而优选使用大肠杆菌作为宿主。
[0100] 为了由本发明的转化体制备本发明的表达载体，从培养本发明的转化体而得到的 培养物中使用碱提取法或QIApr邱Spin Miniprep kit(QIAGEN制）等市售的提取试剂盒进 行制备即可。对本发明的转化体进行培养，由得到的培养物对本发明的化结合性蛋白质进 行回收，由此能够制造本发明的化结合性蛋白质。需要说明的是，本说明书中，培养物除了 指所培养的本发明的转化体的细胞自身W外，也包括培养中所使用的培养基。本发明的蛋 白质制造方法中所使用的转化体只要用适合于对象宿主培养的培养基进行培养即可，宿主 为大肠杆菌的情况下，作为优选的培养基的一例，可列举出添加了必要的营养源的LB (Luria-Bedani)培养基。需要说明的是，为了通过本发明载体有无导入来选择地使本发明 的转化体增殖，优选向培养基中添加对应于该载体所包含的药剂耐性基因的药剂而进行培 养。例如，该载体包含卡那霉素耐性基因的情况下，可W向培养基中添加卡那霉素。另外，培 养基中除了碳、氮和无机盐供给源之外，也可W添加适当的营养源，也可W根据需要含有选 自由谷脫甘肤、半脫氨酸、半脫胺、琉基乙酸盐和二硫苏糖醇组成的组的一种W上还原剂。 进而，也可W添加甘氨酸运样的促进由前述转化体向培养液分泌蛋白质的试剂;具体而言， 宿主为大肠杆菌的情况下，优选对培养基添加2% (w/v)W下的甘氨酸。宿主为大肠杆菌的 情况下，培养溫度通常为l〇°C至40°C、优选为20°C至37°C、更优选为25°C左右，根据表达的 蛋白质的特性进行选择即可。宿主为大肠杆菌的情况下，培养基的抑为抑6.8至抑7.4,优选 为PH7.0左右。另外，本发明的载体中含有诱导性的启动子的情况下，优选在本发明的化结 合性蛋白质能够良好表达的条件下实施诱导。作为诱导剂，可例示出IPTG (i S opr opy 1 -β-D- thiogalactopyranoside，异丙基-β-D-硫代半乳糖巧）。宿主为大肠杆菌的情况下，测定培 养液的浊度(600皿处的吸光度），成为约0.5至1.0时，添加适当量的IPTG之后，继续进行培 养，由此能够诱导化结合性蛋白质的表达。IPTG的添加浓度可W从0.005至l.OmM的范围适 宜选择，但优选为0.01至〇.5mM的范围。与IPTG诱导相关的各种条件按照该技术领域中公知 的条件进行即可。
[0101] 为了从培养本发明的转化体而得到的培养物中回收本发明的Fc结合性蛋白质，可 W采用适合于本发明的转化体中的本发明的化结合性蛋白质的表达形态的方法，从该培养 物中进行分离/纯化，从而回收本发明的化结合性蛋白质。例如，在培养上清中表达的情况 下，通过离屯、分离操作分离菌体，从得到的培养上清中纯化本发明的Fc结合性蛋白质即可。 另外，在细胞内（包括周质)表达的情况下，通过离屯、分离操作收集菌体之后，通过添加酶处 理剂、表面活性剂等而将菌体破碎，提取本发明的化结合性蛋白质之后进行纯化即可。为了 对本发明的化结合性蛋白质进行纯化，使用该技术领域中公知的方法即可，作为一例，可列 举出使用了液相色谱法的分离/纯化。液相色谱法中有离子交换色谱法、疏水性相互作用色 谱法、凝胶过滤色谱法、亲和色谱法等，通过组合运些色谱法进行纯化操作，从而能够高纯 度地制备本发明的化结合性蛋白质。作为测定得到的本发明的化结合性蛋白质的对IgG的 结合活性的方法，使用例如化zyme-Linked ImmunoSorbent Assay(W下，记为HJSA)法、表 面等离子共振法等测定对于IgG的结合活性。结合活性的测定中使用的IgG优选为人IgG，特 别优选为人IgGl、人IgG3。
[0102] 通过使本发明的化结合性蛋白质或人Fc 丫 Rllla与不溶性载体结合，能够制造本 发明的吸附剂。对于前述不溶性载体，没有特别的限定，可例示出：W琼脂糖、海藻酸盐 (alginate)、角叉菜胶、几下质、纤维素、糊精、葡聚糖、淀粉运样的多糖作为原料的载体；W 聚乙締醇、聚甲基丙締酸醋、聚（甲基丙締酸2-径基乙基醋）、聚氨醋运样的合成高分子作为 原料的载体；W二氧化娃等的陶瓷作为原料的载体。其中，优选W多糖作为原料的载体、W 合成高分子作为原料的载体作为不溶性载体。作为前述优选的载体的一例，可列举出： T0Y0PEA化(TOSOH C0RP0RATION制）等导入了径基的聚甲基丙締酸醋凝胶、Sephar0Se (GE Healthcare制）等琼脂糖凝胶、Cel luf ine (JNC Corporation.制）等纤维素凝胶。对于不溶 性载体的形状，没有特别的限定，可W是粒状物或非粒状物、多孔性或非多孔性的任一者。
[0103] 为了将化结合性蛋白质或人化丫 Rllla固定化于不溶性载体，对不溶性载体赋予 N-径基班巧酷亚胺(NHS)活性化醋基、环氧基、簇基、马来酷亚胺基、面代乙酷基、Ξ氣代乙 烧横酷基(Tresyl)、甲酯基面代乙酷胺等活性基团，通过该活性基团使人化结合性蛋白质 与不溶性载体共价结合而进行固定化即可。赋予了活性基团的载体可W直接使用市售的载 体;也可W在适当的反应条件下向载体表面导入活性基团而制备。作为赋予了活性基团的 市售的载体，可例示出：T0Y0PEA化 AF-Epoxy-650M、T0Y0PEARL AF-Tresyl-650M(均为 TOSOH CORPORATION制）、HiTrap NHS-activated HP Columns、NHS-activated S邱harose 4Fast Flow、Epoxy-activated Sepharose 6B(均为GE Healthcare审ij)、SulfoLink Coupling Resin(Thermo Scientific制）。
[0104] 另一方面，作为向载体表面导入活性基团的方法，可例示出：使存在于载体表面的 径基、环氧基、簇基、氨基等与具有2个W上活性部位的化合物的一者反应的方法。作为该化 合物的一例中，作为对载体表面的径基、氨基导入环氧基的化合物，可例示出：环氧氯丙烷、 乙二醇二缩水甘油基酸、下二醇缩水甘油基酸、己二醇二缩水甘油基酸。通过前述化合物对 载体表面导入环氧基之后，作为向载体表面导入簇基的化合物，可例示出：2-琉基乙酸、3- 琉基丙酸、4-琉基下酸、6-琉基下酸、甘氨酸、3-氨基丙酸、4-氨基下酸、6-氨基己酸。
[0105] 作为向载体表面存在的径基、环氧基、簇基、氨基导入马来酷亚胺基的化合物，可 例示出：Ν-(ε-马来酷亚胺己酸)酷阱、Ν-(ε-马来酷亚胺丙酸)酷阱、4-[4-N-马来酷亚胺苯 基]乙酸酷阱、2-氨基马来酷亚胺、3-氨基马来酷亚胺、4-氨基马来酷亚胺、6-氨基马来酷亚 胺、1-(4-氨基苯基)马来酷亚胺、1-(3-氨基苯基)马来酷亚胺、4-(马来酷亚胺)苯基异氯酸 醋、2-马来酷亚胺乙酸、3-马来酷亚胺丙酸、4-马来酷亚胺下酸、6-马来酷亚胺己酸、（N- [曰一马来酷亚胺乙酷氧基]班巧酷亚胺醋）、（马来酷亚胺间苯甲酯)N-径基班巧酷亚胺醋、 (班巧酷亚胺基-4-[马来酷亚胺甲基]环己烧-1-幾基-[6-氨基己酸])、（班巧酷亚胺基-4- [马来酷亚胺甲基]环己烧-1-簇酸）、（马来酷亚胺对苯甲酯)N-径基班巧酷亚胺醋、（马来酷 亚胺间苯甲酯)N-径基班巧酷亚胺醋。
[0106] 作为向载体表面存在的径基、氨基导入面代乙酷基的化合物，可例示出：氯代乙 酸、漠代乙酸、舰代乙酸、氯代乙酷氯、漠代乙酷氯、漠代乙酷漠、氯代乙酸酢、漠代乙酸酢、 舰代乙酸酢、2-(舰代乙酷胺）乙酸-N-径基班巧酷亚胺醋、3-(漠代乙酷胺)丙酸-N-径基班 巧酷亚胺醋、4-(舰代乙酷基)氨基苯甲酸-N-径基班巧酷亚胺醋。需要说明的是，还可例示 出使载体表面存在的径基、氨基与ω -締基烷基缩水甘油基酸反应之后，用面化剂将ω -締 基部位面化而进行活性化的方法。作为ω-締基烷基缩水甘油基酸，可例示出締丙基缩水甘 油基酸、3-下締基缩水甘油基酸、4-戊締基缩水甘油基酸;作为面化剂，可例示出Ν-氯代班 巧酷亚胺、Ν-漠代班巧酷亚胺、Ν-舰代班巧酷亚胺。
[0107] 作为向载体表面导入活性基团的方法的其他的例，有如下方法:对于载体表面存 在的簇基使用缩合剂和添加剂导入活性化基团的方法。作为缩合剂，可例示出1-乙基-3- (3-二甲基氨基丙基)碳二酷亚胺巧DC)、二环己基碳二酷亚胺、幾基二咪挫。另外，作为添加 剂，可例示出N-径基班巧酷亚胺(畑S)、4-硝基苯酪、1-径基苯并Ξ挫。
[0108] 作为将本发明的化结合性蛋白质或人化丫 Rllla固定化于不溶性载体时所使用的 缓冲液，可例示出：乙酸缓冲液、憐酸缓冲液、Μ E S ( 2 -吗嘟乙横酸；2- 1〇巧11〇1;[]1〇61:11曰]163111化]1；[03。1(1)缓冲液、肥阳5(2-[4-(2-径乙基）-1-赃嗦基]乙横酸；2- [4-(2-Hy化oxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonicacid)缓冲液、T;ris缓冲液、棚酸 缓冲液。对于固定化时的反应溫度，在考虑到活性基团的反应性、本发明的化结合性蛋白质 或人化丫 Rllla的稳定性的基础上，在5°C至50°C为止的溫度范围中适宜设定即可，优选为 10°C至35°C的范围。
[0109] 使用将本发明的化结合性蛋白质或人化丫 Rllla固定化于不溶性载体而得到的本 发明的吸附剂，为了对具有糖链的抗体进行纯化，例如，通过使用累等送液手段向填充了本 发明的吸附剂的柱添加包含具有糖链的抗体的缓冲液，使具有糖链的抗体特异地吸附于本 发明的吸附剂之后，向柱添加适当的洗脱液，从而洗脱具有糖链的抗体即可。需要说明的 是，能够用本发明的吸附剂纯化的具有糖链的抗体是与Fc结合性蛋白质或Fc 丫 Rllla等的 化受体具有亲和性的、至少包含具有糖链的抗体的Fc区域的抗体即可。作为一例，可列举 出：通常作为用于抗体药物的抗体所使用的嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、它们的氨基酸 置换体。另外，双特异性抗体(Bispecific antibody)、具有糖链的抗体的化区域与其他蛋 白质的融合抗体、具有糖链的抗体的Fc区域与药物的复合体(ADC)等人工地改变了结构的 抗体，也可W用本发明的吸附剂进行纯化。另外，向柱添加包含具有糖链的抗体的缓冲液之 前，使用适当的缓冲液对柱进行平衡化时，能够将具有糖链的抗体更高纯度地纯化，因而优 选。作为缓冲液，可例示出憐酸缓冲液等将无机盐作为成分的缓冲液，缓冲液的抑为pH3至 10,优选为抑5至8。
[0110] 为了将本发明的吸附剂所吸附的具有糖链的抗体洗脱，弱化具有糖链的抗体与配 体(本发明的Fc结合性蛋白质或人Fc 丫 Rllla)的相互作用即可，具体而言，可例示出由缓冲 液带来的pH变化、抗衡肤(counter peptide)、溫度变化、盐浓度变化。作为用于将本发明的 吸附剂所吸附的、具有糖链的抗体洗脱的洗脱液的具体例，可列举出：比使具有糖链的抗体 吸附于本发明的吸附剂时所使用的溶液更偏酸性侧的缓冲液。作为缓冲液的种类，可例示 出在酸性侧具有缓冲能力的巧樣酸缓冲液、甘氨酸盐酸缓冲液、乙酸缓冲液。对于缓冲液的 pH，可W在不有损抗体所具有的功能的范围设定即可，优选PH2.5至6.0,更优选PH3.0至 5.0,进而优选抑3.3至4.0。
[0111] 需要说明的是，从包含具有糖链的抗体的溶液中，使用本发明的吸附剂对前述抗 体进行纯化时，由于前述抗体所具有的糖链结构的差异，抗体的洗脱位置(洗脱级分)不同。 因此，通过使用本发明的吸附剂对抗体进行分离，能够识别抗体所具有的糖链结构的差异。 对于能够识别的糖链的结构，没有特别的限定，作为一例，可列举出：WCH0细胞运样的来自 动物的细胞或W毕赤酵母、酿酒酵母(Saccharomyces)运样的酵母为宿主使抗体表达时附 加的糖链;人抗体所具有的糖链；用化学合成法附加于抗体的糖链。另外，本发明的吸附剂 可W基于抗体所具有的糖链结构的差异进行分离，所W也可利用于糖链其自身的分离。
[0112] 需要说明的是，前面已提到了能够通过本发明的吸附剂识别抗体的糖链结构的差 异，作为该吸附剂所使用的配体蛋白质，使用了Fc 丫 RII la W外的Fc受体（Fc 丫 RI、Fc 丫 RIIa、Fc 丫 RHb、Fc 丫 RIHb、Fc化)的情况下，也能够同样地识别糖链结构的差异。
[0…]发明的效果
[0114] 本发明的化结合性蛋白质是将人化丫 Rllla的细胞外区域中的特定位点的氨基酸 残基置换为其他的氨基酸残基的蛋白质。本发明的化结合性蛋白质与野生型人化丫 Rllla 相比较，对于热和酸的稳定性提高了。因此，本发明的Fc结合性蛋白质作为用于分离免疫球 蛋白的吸附剂的配体是有 用的。
[0115] 另外，本发明是设及将人Fc 丫 Rllla固定化于不溶性载体而得到的吸附剂的发明； 前述吸附剂特异地吸附抗体中的具有糖链的抗体，因此能够简便地识别糖链有无附加于抗 体，运样的识别到目前为止是困难的。另外，通过使用本发明的吸附剂能够特异地纯化具有 糖链的抗体，因此能够有效率地制造具有糖链的抗体。
【附图说明】
[0116] 图1是人化丫 Rllla的示意图。图中的数字表示序列号1中记载的氨基酸序列的号。 图中的S表示信号序列;EC表示细胞外区域;TM表示细胞膜贯穿区域;C表示细胞内区域。
[0117] 图2是表示对置换了 1个氨基酸的化结合性蛋白质的抗体结合活性进行了评价的 结果的图。图中的野生型表示没有氨基酸置换的Fc结合性蛋白质。
[0118] 图3是表示对置换了 1个氨基酸的化结合性蛋白质的热稳定性进行了评价的结果 的图。图中的野生型表示没有氨基酸置换的Fc结合性蛋白质。
[0119] 图4是表示使用了FcR5a固定化凝胶的抗体的洗脱的色谱图。图中的Fr表示回收的 级分的位置。
[0120] 图5是表示附加于抗体的糖链结构的列表的图。图中的N1至N8对应于表10的N1至 N8; Ml和M2对应于表11的Ml和M2。
[0121] 图6是表示使用了化R5a固定化凝胶的抗体纯化的结果的图（SDS-PAGE)。分别地， (A)表示人IgGl的纯化结果；（B)表示人IgG3的纯化结果。
[0122] 图7是具有糖链的人IgGl (有糖链的人IgGl)与去除了糖链的人IgGl (去除糖链的 人IgGl)利用SDS-PAGE比较了分子量的图。图中的泳道（1)是具有糖链的人IgGl;泳道(2)是 去除了糖链的人IgGl。
[0123] 图8是将具有糖链的人IgGl和去除了糖链的人IgGl与人Fc 丫 RlllaW及蛋白A的结 合性进行了比较的图。(A)是人FcyRIIIa的结果；（B)是蛋白A的结果。
[0124] 图9是对于具有糖链的人IgGl和去除了糖链的人IgGl用本发明的吸附剂进行了分 离的结果。（1)是具有糖链的人IgGl的结果；（2)是去除了糖链的人IgGl的结果。
【具体实施方式】
[0125] 实施例
[0126] W下，为了对本发明进一步详细地进行说明示出了实施例，本发明并不限定于实 施例。
[0127] 实施例1化结合性蛋白质或人化丫 RIIla表达载体的制备
[012引（1)基于从序列号1中记载的人化丫 Rllla氨基酸序列中的第17位的甘氨酸(Gly) 至第192位的谷氨酷胺(Gin)为止的氨基酸序列，使用DNAworks法(Nucleic Acids Res.， 30，e43,2002)，设计将密码子由人型转换成大肠杆菌型的核巧酸序列。将设计的核巧酸序 列示于序列号2。
[0129] (2)为了制备包含序列号2中记载的序列的多聚核巧酸，合成包含序列号3至20中 记载的序列的寡核巧酸，使用前述寡核巧酸，进行下述所示的二阶段PCR。
[0130] (2-1)第一阶段的PCR:制备表1所示的组成的反应液，对该反应液在98°C下进行5 分钟热处理之后，在98°C下进行10秒的第1步骤、在62°C下进行5秒的第2步骤、在72°C下进 行90秒的第3步骤，将运3步骤作为1个循环的反应重复进行10个循环，合成多聚核巧酸，将 其作为化化1。需要说明的是，表1中的DNA混合物是指将具有序列号3至20中记载的序列的 18种寡核巧酸分别采集一定量进行混合而成的溶液。
[0131] [表 1]
[0132]
[0133] (2-2)第二阶段的PCR: W(2-l)中合成的FcRpl作为模板、将具有序列号21(5'- TAGCCATGGGCATGCGTACCGAAGATCTGCCGAAAGC-3'）和序列号 22(5'- CCCAAGCTTAATGATGATGATGATGATGGCCCCCTTGGGTAATGGTAATATTCACGGTCTCGCTGC-3'）中记载 的序列的寡核巧酸作为PCR引物进行实施。具体而言，制备表2所示组成的反应液，对该反应 液在98°C下进行5分钟热处理之后，在98°C下进行10秒的第1步骤、在62°C下进行5秒的第2 步骤、在72°C下进行1.5分钟的第3步骤，将运3个步骤作为1个循环的反应重复进行30循环 来头施。
[0134] [表 2]
[0135] _
[0136] ~(3)对(2)中得到的多聚核巧酸进行纯化，用限制酶Ncol和化ndin进行消化之后/ 与预先用限制酶化〇1和化ndin进行了消化的表达载体祀TMa化（日本特开2011-206046号 公报)连接，使用该连接产物转化大肠杆菌化21株(呢3)。
[0137] (4)对得到的转化体用包含50yg/mL的卡那霉素的LB培养基进行培养之后，使用 QIAprep Spin Miniprep kit(QIAGEN制），提取表达载体祀T-eFcR。
[0138] (5)在(4)中制备的表达载体祀T-eFcR中的编码人化丫 Rllla的多聚核巧酸及其周 边的区域中，基于链终止法而使用Big Dye Terminator Cycle Sequencing ready Reaction kit(The;rmo Fisher Scientific Inc.制）供于循环测序反应，利用全自动DNA sequencer ABI Prism 3700 DNA analyzer(Thermo Fisher Scientific Inc.制闲核巧 酸序列进行解析。需要说明的是，进行该解析时，使用具有序列号2 3 ( 5 ' - TAATACGACTCACTATAGGG-3 '）或序列号24 (5 ' -TATGCTAGTTATTGCTCAG-3 '）中记载的序列的寡 核巧酸作为测序用引物。
[0139] 分别地，将表达载体pET-eFcR表达的多肤的氨基酸序列示于序列号25中；将编码 该多肤的多聚核巧酸的序列示于序列号26中。需要说明的是，序列号25中，第1位的甲硫氨 酸(Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为Ma化信号肤;第27位的赖氨酸化ys)至第32位的甲 硫氨酸(Met)为止为连接子序列;第33位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酷胺(Gin)为止为 人化丫 Rllla的细胞外区域(序列号1的第17位至第192位为止的区域）；第209位至第210位 为止的甘氨酸(Gly)为连接子序列;第211位至第216位的组氨酸化is)为标签序列。
[0140] 实施例2向化结合性蛋白质导入突变W及基因文库的制备
[0141] 对于实施例1中制备的化结合性蛋白质表达载体祀R-eFcR中的编码化结合性蛋白 质的多聚核巧酸部分，通过易错PCR随机地实施突变导入。
[0142] (1)作为模板使用实施例1中制备的祀T-eFcR进行易错PCR。易错PCR如下进行:在 制备表3所示的组成的反应液之后，将该反应液在95°C下进行2分钟热处理、在95°C下进行 30秒的第1步骤、在60°C下进行30秒的第2步骤、在72°C下进行90秒的第3步骤，将运3步骤作 为1个循环的反应进行35循环，最后在72°C下进行7分钟热处理。通过前述易错PCR对编码化 结合性蛋白质的多聚核巧酸良好地导入突变，其平均突变导入率为1.26%。
[0143] [表 3]
[0144]
[0145] ~(2)对（1)中得到的PCR产物进行纯化之后，用限制酶Ncol和化ndlll进行消化，与' 预先用相同限制酶消化了的表达载体祀TMalE(日本特开2011-206046号公报)连接。
[0146] (3)连接反应结束之后，通过电穿孔法将反应液导入至大肠杆菌化2UDE3)株，用 包含50yg/mL的卡那霉素的LB平板培养基进行培养(37°C下18小时）之后，将形成于平板上 的菌落作为随机突变体基因文库。
[0147] 实施例3热稳定化Fc结合性蛋白质的筛选
[0148] (1)将实施例2中制备的随机突变体基因文库(转化体)接种于包含50yg/mL的卡那 霉素的2YT液体培养基(蛋白腺16g/L、酵母提取物lOg/L、氯化钢5g/L)200化，使用96孔深孔 平板在30°C下振荡培养一晚。
[0149] (2)培养之后，将扣L的培养液继续植入50化L的包含0.05mM的IPTG(isopropyl-f3- D-thiogalactopyranoside，异丙基-β-D-硫代半乳糖巧）、0.3%的甘氨酸和50yg/mL的卡那 霉素的2YT液体培养基中，使用96孔深孔平板，进一步在20°C下振荡培养一晚。
[0150] (3)培养之后，将通过离屯、操作得到的培养上清用包含150mM的氯化钢的20mM的 Tris盐酸缓冲液(PH7.4)稀释2倍。对于稀释后的溶液，在45°C下进行10分钟热处理。
[0151] (4)对于（3)的进行了热处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性、W及（3)的没 有进行热处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性，分别用下述所示的ELISA法进行测定， 将进行了热处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性除W没有进行热处理时的Fc结合性 蛋白质的抗体结合活性，从而计算出残留活性。
[0152] (4-1)将作为人抗体的丫-球蛋白制剂（The 化emo-Sero-Therapeutic Research Insti化te制）W化g/孔固定化(4°C下18小时)于96孔微孔平板的孔，固定化结束后，利用包 含2%(w/v)的SKIM MILK(抓公司制)和150mM的氯化钢的20mM的Tris盐酸缓冲液(PH7.4)进 行封闭(blocking)。
[0153] (4-2)用洗涂缓冲液(包含0.05%[w/v]的Tween 20、150mM的化Cl的20mM Tris- HCl缓冲液(pH7.4))进行洗涂之后，添加评价抗体结合活性的包含化结合性蛋白质的溶液， 使Fc结合性蛋白质与固定化Y-球蛋白反应(30°C下1小时）。
[0154] (4-3)反应结束后，用前述洗涂缓冲液进行洗涂，Κ?(Κ)μLν孔添加稀释至l(K)ng/mL 的Anti-6His抗体(Bethyl Laboratories公司制）。
[0155] (4-4)30°C下使之反应1小时，用前述洗涂缓冲液进行洗涂之后，W50化/孔添加 TMB化roxidase Substrate化化公司制）。通过W50化/孔添加1M的憐酸来停止显色，用酶 标仪(Tecan Japan制）测定450nm的吸光度。
[0156] (5)用(4)的方法对约2700株的转化体进行评价，从中选择表达与野生型（没有氨 基酸置换)Fc结合性蛋白质相比较热稳定性提高了的Fc结合性蛋白质的转化体。对于前述 选择的转化体进行培养，使用QIAprep Spin Miniprep kit(QIAGEN制）制备表达载体。
[0157] (6)对于得到的表达载体中所插入的编码化结合性蛋白质的多聚核巧酸区域的序 列，通过与实施例1(5)的记载同样的方法解析核巧酸序列，从而确定氨基酸的突变位点。
[0158] (5)中选择的转化体表达的化结合性蛋白质的、相对于野生型（没有氨基酸置换） 化结合性蛋白质的氨基酸置换位点W及热处理后的残留活性（％ )总结示于表4中。包含序 列号1中记载的氨基酸序列中的第17位的甘氨酸至第192位的谷氨酷胺为止的氨基酸残基 并且该第17位至第192位为止的氨基酸残基中产生MetlSArg(该标记表示序列号1的第18位 的甲硫氨酸置换为精氨酸，W下同样）、Val27Glu、Phe29LeuJhe29Ser、Leu30Gln、 Tyr35Asn、Tyr35Asp、Tyr35Ser、Tyr35His、Lys46Ile、Lys46Thr、Gln48His、Gln48Leu、 Ala50His、Tyr51Asp、Tyr51His、Glu54Asp、Glu54Gly、Asn56Thr、Gln59Arg、Phe61Tyr、 Glu64Asp、Ser65Arg、Ala71Asp、Phe75Leu、Phe75Ser、Phe75Tyr、Asp77Asn、Ala78Ser、 Asp82Glu、Asp82Val、Gln90Arg、Asn92Ser、Leu93Arg、Leu93Met、Thr95Ala、T'hr95Ser、 Leull0Gln、Argll5Gln、Trpll6LeuJhell8Tyr、Lysll9Glu、Glul20Val、Glul21Asp、 Glul21Gly、Phel51SerJhel51Tyr、Serl55Thr、Thrl63Ser、Serl67Gly、Serl69Gly、 Phel71Tyr、Asnl80Lys、Asnl80Ser、Asnl80Ile、Thrl85Ser、Glnl9 化 ys 的至少任一种氨基酸 置换的Fc结合性蛋白质与野生型的Fc结合性蛋白质相比较，可W说热稳定性提高了。
[0159] [表 4]
[0160]
[0161]将表4所示的进行了氨基酸置换的Fc结合性蛋白质中残留活性最高的产生了 化127G1U和Tyr35Asn的氨基酸置换的化结合性蛋白质命名为FcR2,将包含编码化R2的多聚 核巧酸的表达载体命名为祀T-FCR2。将化R2的氨基酸序列示于序列号27,将编码化R2的多 聚核巧酸的序列示于序列号28。需要说明的是，序列号27中，第1位的甲硫氨酸(Met)至第26 位的丙氨酸(Ala)为止为Ma化信号肤;第27位的赖氨酸化ys)至第32位的甲硫氨酸(Met)为 止为连接子序列；第33位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酷胺(Gin)为止为化R2的氨基酸 序列（相当于序列号1的第17位至第192位为止的区域）、第209位至第210位为止的甘氨酸 (Gly)为连接子序列；第211位至第216位的组氨酸化is)为标签序列。另外，序列号27中，分 别地、化127G1U的谷氨酸存在于第43位、Tyr35Asn的天冬酷胺存在于第51位的位点。
[0162] 实施例4氨基酸置换化结合性蛋白质的制备
[0163] 通过累积实施例3中判明的、与Fc结合性蛋白质的热稳定性提高相关的氨基酸置 换，谋求进一步的稳定性提高。置换氨基酸的累积主要使用PCR进行，制备W下(a)至(g)所 示的巧中Fc结合性蛋白质。
[0164] (a)对于化R2进一步进行了化e7化eu的氨基酸置换的化R3
[01化](b)对于化R2进一步进行了化e7化eu和Glul21Gly的氨基酸置换的化R4
[0166] (C)对于化34进一步进行了 Asn92Se;r的氨基酸置换的化尺5曰
[0167] (d)对于化R4进一步进行了 Glu54Asp的氨基酸置换的化R5b [016引 （e)对于化R5a进一步进行了 Glu54Asp的氨基酸置换的化R6a
[0169] (f)对于化R加进一步进行了 Glul2(Wal的氨基酸置换的化R6b
[0170] (g)对于化R&i进一步进行了 Glul2(Wal的氨基酸置换的化R7
[0171] W下，对于各化结合性蛋白质的制备方法详细地进行了说明。
[0172] (a)FcR3从实施例3中已经明确的、设及热稳定性提高的氨基酸置换中选择 Val27Glu、Tyr35Asn和化e7化eu，从而制备野生型的化结合性蛋白质中累积了运些置换的 FcR3。具体而言，对于编码FcR2的多聚核巧酸进行产生Phe75Leu的突变导入，从而制备 FcR3〇
[0173] (a-l)W实施例3中取得的祀T-FcR2为模板实施PCR。该PCR中的引物使用具有序列 号24和序列号29(5 ' -AGCCAGGCGAGCAGCTACCTTAT TGATGCG-3 '）中记载的序列的寡核巧酸。 PCR如下进行：制备表5所示组成的反应液之后，对该反应液在98°C下进行5分钟热处理，98 °C下进行10秒的第1步骤、55°C下进行5秒的第2步骤、72°C下进行1分钟的第3步骤，将运3步 骤作为1个循环的反应进行30循环，最后在72°C下进行7分钟热处理。将扩增的PCR产物供于 琼脂糖凝胶电泳，从该凝胶中使用QIAquick Gel Extraction kit(QIAGEN制)进行纯化。将 纯化的PCR产物作为m3F。
[0174] 敵]
[0175]
[0176] (a-2)将实施例3中取得的pET-FcR2作为模板、将具有序列号23和序列号30(5'- CCACCGTCGCCGCATCAATAAGGTAGCTGC-3 '）中记载的序列的寡核巧酸作为PCR引物，除此W外， 与(曰-1)同样地进行。将纯化的PCR产物作为m3R。
[0177] (a-3)将(a-1)和(a-2)中得到的巧巾PCR产物(m3F、m3R)混合，制备表6所示组成的 反应液。进行如下PCR:对该反应液在98°C下进行5分钟热处理之后，98°C下进行10秒的第1 步骤、55°C下进行5秒的第2步骤、72°C下进行1分钟的第3步骤，将运3步骤作为1个循环的反 应进行5循环，从而得到连接了 m3F和m3R的PCR产物m化。
[017 引[表 6]
[0179]
[0180] (a-4)将(a-3)中得到的PCR产物m化作为模板，将具有序列号23和序列号24中记载 的序列的寡核巧酸作为PCR引物，进行PCRdPCR如下进行：制备表7所示组成的反应液之后， 对该反应液在98°C下进行5分钟热处理，在98°C下进行10秒的第1步骤、在55°C下进行5秒的 第2步骤、在72°C下进行1分钟的第3步骤，将运3步骤作为1个循环的反应进行30循环。由此 制备编码对FcR2导入了 1位点氨基酸置换的FcR3的多聚核巧酸。
[0181] [表 7]
[0182] _
[0183] ~(a-5)对(a-4)中得到的多聚核巧酸进行纯化之后，用限制酶Ncol和化ndlll进行' 消化，与预先用限制酶Ncol和化ndlll进行了消化的表达载体pETMalE(日本特开2011- 206046号公报)连接，使用其转化大肠杆菌E.coli BL2UDE3)株。
[0184] (a-6)对得到的转化体用添加了 5(nyg/mL卡那霉素的LB培养基进行培养。通过从 回收的菌体(转化体）中提取质粒，从而得到包含编码化R3的多聚核巧酸的质粒祀T-FCR3， 所述FcR3是对野生型Fc结合性蛋白质进行了 3位点氨基酸置换的多肤。
[0185] (a-7)按照与实施例1(5)同样的方法进行祀T-FCR3的核巧酸序列的解析。
[0186] 将附加了信号序列和聚组氨酸标签的化R3的氨基酸序列示于序列号31、将编码前 述化R3的多聚核巧酸的序列示于序列号32。需要说明的是，序列号31中，第1位的甲硫氨酸 (Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为Ma化信号肤;第27位的赖氨酸化ys)至第32位的甲硫 氨酸(Met)为止为连接子序列；第33位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酷胺(Gin)为止为 FcR3的氨基酸序列(相当于序列号1的第17位至第192位为止的区域）、第209位至第210位为 止的甘氨酸(Gly)为连接子序列;第211位至第216位的组氨酸化is)为标签序列。另外，序列 号31中，分别地、Val27Glu的谷氨酸存在于第43位、Tyr35Asn的天冬酷胺存在于第51位、 化e7化eu的亮氨酸存在于第91位的位点。
[0187] (b)FcR4从实施例3中已经明确的、设及Fc结合性蛋白质的稳定性提高的氨基酸置 换中选择化127Glu、Tyr35Asn、化e7化eu和Glul21Gly，从而制备野生型的化结合性蛋白质 中累积了运些置换的化R4。具体而言，通过对编码化R2的多聚核巧酸进行产生化e7化eu和 Glul21Gly的突变导入来制备FcR4。
[018引（b-1)用与(a-1)同样的方法得到PCR产物m3F。另外，将实施例3中取得的、表达包 含Ala71Asp、Phe75Leu和Glul21Gly的氨基酸置换的Fc结合性蛋白质（表4)的质粒作为模 板，将具有序列号24和序列号29中记载的序列的寡核巧酸作为PCR引物，按照与(a-1)同样 的方法进行PCR，从而得到PCR产物m4R。
[0189] (b-2)将由（b-1)得到的巧帕CR产物(m3F、m4R)进行混合之后，按照与(a-3)同样的 方法进行PCR，将m3F和m4R连接。将得到的PCR产物作为m4p。
[0190] (b-3)将(b-2)中得到的PCR产物m4p作为模板、将具有序列号23和序列号24中记载 的序列的寡核巧酸作为PCR引物，按照与(a-4)同样的方法进行PCR。由此制备编码化R4的多 聚核巧酸。
[0191] (b-4)对(b-3)中 得到的多聚核巧酸进行纯化之后，用限制酶Ncol和化ndlll进行 消化，与预先用限制酶Ncol和化ndlll进行了消化的表达载体pETMalE(日本特开2011- 206046号公报)连接，使用其转化大肠杆菌E.coli BL2UDE3)株。
[0192] (b-5)对得到的转化体用添加了 50yg/mL卡那霉素的LB培养基进行培养。通过从回 收的菌体(转化体）中提取质粒，从而得到包含编码FcR4的多聚核巧酸的质粒祀T-FCR4,所 述FcR4是对野生型Fc结合性蛋白质进行了 4位点氨基酸置换的多肤。
[0193] (b-6)按照与实施例1 (5)同样的方法进行祀T-FCR4的核巧酸序列的解析。
[0194] 将附加了信号序列和聚组氨酸标签的化R4的氨基酸序列示于序列号33、将编码前 述化R4的多聚核巧酸的序列示于序列号34。需要说明的是，序列号33中，第1位的甲硫氨酸 (Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为Ma化信号肤;第27位的赖氨酸化ys)至第32位的甲硫 氨酸(Met)为止为连接子序列；第33位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酷胺(Gin)为止为 化R4的氨基酸序列（相当于序列号1的第17位至第192位为止的区域）、第209位至第210位为 止的甘氨酸(Gly)为连接子序列;第211位至第216位的组氨酸化is)为标签序列。另外，序列 号33中，分别地、Val27Glu的谷氨酸存在于第43位、Tyr35Asn的天冬酷胺存在于第51位、 化e7化eu的亮氨酸存在于第91位、Glul21Gly的甘氨酸存在于第137位的位点。
[01M] (c)FcR5a从实施例3中已经明确的、设及化结合性蛋白质的稳定性提高的氨基酸 置换中选择化127Glu、Tyr35Asn、陆e7化eu、Asn92Ser和Glul21Gly，从而制备野生型的化结 合性蛋白质中累积了运些置换的化R5a。具体而言，对于编码(b)中制备的化R4的多聚核巧 酸进行产生Asn92Ser的突变导入，从而制备化R5a。
[0196] (。-1)将（6)中制备的961'斗。1?4作为模板、将具有序列号22和序列号35(5'- GAATATCGTTGCCAGACCAGCCTGAGCACC-3 '）中记载的序列的寡核巧酸作为PCR引物，除此W外， 按照与(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为m5aF。
[0197] (。-2)将（6)中制备的961'-。。1?4作为模板、将具有序列号21和序列号36(5'- GATCGCTCAGGGTGCTCAGGCTGGTCTGGC-3 '）中记载的序列的寡核巧酸作为PCR引物，除此之外， 按照与(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为m5aR。
[019引 （C-3)将（C-1)和（C-2)得到的巧帕CR产物(mSaF'mSaR)混合之后，用与（a- 3)同样 的方法进行PCR，将m5aF和m5aR连接。将得到的PCR产物作为m5ap。
[0199] (C-4)将(C-3)中得到的PCR产物m5ap作为模板、将具有序列号21和序列号22中记 载的序列的寡核巧酸作为PCR引物，按照与(a-4)同样的方法进行PCR。由此制备编码化R5a 的多聚核巧酸。
[0200] (C-5)对(C-4)中得到的多聚核巧酸进行纯化之后，用限制酶Ncol和化ndlll进行 消化，与预先用限制酶Ncol和化ndlll进行了消化的表达载体pETMalE(日本特开2011- 206046号公报)连接，使用其转化大肠杆菌E.coli BL2UDE3)株。
[0201] (C-6)对得到的转化体用添加了 50yg/mL卡那霉素的LB培养基进行培养。通过从回 收的菌体(转化体）中提取质粒，从而得到包含编码化R5a的多聚核巧酸的质粒祀T斗cR5a， 所述FcR5a是对野生型Fc结合性蛋白质进行了 5位点氨基酸置换的多肤。
[0202] (C-7)按照与实施例1 (5)同样的方法进行祀T-FcR5a的核巧酸序列的解析。
[0203] 将附加了信号序列和聚组氨酸标签的化Rf5a的氨基酸序列示于序列号37、将编码 前述化R5a的多聚核巧酸的序列示于序列号38。需要说明的是，序列号37中，第1位的甲硫氨 酸(Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为Ma化信号肤;第27位的赖氨酸化ys)至第32位的甲 硫氨酸(Met)为止为连接子序列;第33位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酷胺(Gin)为止为 FcR5a的氨基酸序列（相当于序列号1的第17位至第192位为止的区域）、第209位至第210位 为止的甘氨酸(Gly)为连接子序列;第211位至第216位的组氨酸化is)为标签序列。另外，序 列号37中，分别地、Val27Glu的谷氨酸存在于第43位、Tyr35Asn的天冬酷胺存在于第51位、 化e7化eu的亮氨酸存在于第91位、Asn92Ser的丝氨酸存在于第108位、Glul21Gly的甘氨酸 存在于第137位的位点。
[0204] (d)FcR化从实施例3中已经明确的、设及化结合性蛋白质的稳定性提高的氨基酸 置换中选择化1276111、了7切54311、611154439、？}16751^611和6111121617，从而制备野生型的化结 合性蛋白质中累积了运些置换的化R5b。具体而言，对于编码(b)中制备的化R4的多聚核巧 酸进行产生Glu54Asp的突变导入，从而制备化R5b。
[0205] ((1-1)将（6)中制备的961'-。。1?4作为模板，将具有序列号22和序列号39(5'- CAGGGCGCGTATAGCCCGGATGATAACAGC-3 '）中记载的序列的寡核巧酸作为PCR引物，除此之外， 按照与(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为邮bF。
[0206] ((1-2)将（6)中制备的961'-。。1?4作为模板、将具有序列号21和序列号40(5'- CACTGGGTGCTGTTATCATCCGGGCTATAC-3 '）中记载的序列的寡核巧酸作为PCR引物，除此之外， 按照与(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为邮bR。
[0207] (d-3)将(d-1)和（d-2)中得到的巧帕CR产物(m5bF、m加 R)混合之后，用与（a-3)同 样的方法进行PCR，将m5bF和m5bR连接。将得到的PCR产物作为邮bp。
[020引（d-4)将(d-3)中得到的PCR产物m5bp作为模板、将具有序列号21和序列号22中记 载的序列的寡核巧酸作为PCR引物，按照与(a-4)同样的方法进行PCR。由此制备编码化R5b 的多聚核巧酸。
[0209] (d-5)对(d-4)中得到的多聚核巧酸进行纯化之后，用限制酶Ncol和化ndlll进行 消化，与预先用限制酶Ncol和化ndlll进行了消化的表达载体pETMalE(日本特开2011- 206046号公报)连接，使用其转化大肠杆菌E.coli BL2UDE3)株。
[0210] (d-6)对得到的转化体用添加了 50yg/mL卡那霉素的LB培养基进行培养。通过从回 收的菌体(转化体）中提取质粒，从而得到包含编码化R5b的多聚核巧酸的质粒祀T斗cR5b， 所述FcR5b是对野生型Fc结合性蛋白质进行了 5位点氨基酸置换的多肤。
[0211] (d-7)按照与实施例1 (5)同样的方法进行祀T-FcR化的核巧酸序列的解析。
[0212] 将附加了信号序列和聚组氨酸标签的化R加的氨基酸序列示于序列号41、将编码 前述化R5b的多聚核巧酸的序列示于序列号42。需要说明的是，序列号41中，第1位的甲硫氨 酸(Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为Ma化信号肤;第27位的赖氨酸化ys)至第32位的甲 硫氨酸(Met)为止为连接子序列;第33位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酷胺(Gin)为止为 FcR加的氨基酸序列（相当于序列号1的第17位至第192位为止的区域）、第209位至第210位 为止的甘氨酸(Gly)为连接子序列;第211位至第216位的组氨酸化is)为标签序列。另外，序 列号41中，分别地、Val27Glu的谷氨酸存在于第43位、Tyr35Asn的天冬酷胺存在于第51位、 Glu54Asp的天冬氨酸存在于第70位、Phe75Leu的亮氨酸存在于第91位、Glul21Gly的甘氨酸 存在于第137位的位点。
[0213] (e)FcR6a从实施例3中已经明确的、设及化结合性蛋白质的稳定性提高的氨基酸 置换中选择 乂日1276111、了7扣54311、611154439、？}16751^611、43119256'和6111121617，从而制备野 生型的化结合性蛋白质中累积了运些置换的FcR6a。具体而言，对于编码(C)中制备化R5a的 多聚核巧酸进行产生Glu54Asp的突变导入，从而制备FcR6a。
[0214] (e-1)将(C)中制备的祀T斗cR5a作为模板、将具有序列号22和序列号39中记载的 序列的寡核巧酸作为PCR引物，除此之外，按照与(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产 物作为m6aF。
[0215] (e-2)将(b)中制备的祀T-FcR4作为模板、将具有序列号21和序列号40中记载的序 列的寡核巧酸作为PCR引物，除此之外，按照与(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物 作为m6aR。
[0216] (e-3)将(e-1)和（e-2)中得到的巧tPCR产物(m6aF、m6aR)混合之后，用与(a-3)同 样的方法进行PCR，将m6aF和m6aR连接。将得到的PCR产物作为m6ap。
[0217] (e-4)将(e-3)中得到的PCR产物m6ap作为模板、将具有序列号21和序列号22中记 载的序列的寡核巧酸作为PCR引物，按照与(a-4)同样的方法进行PCR。由此制备编码化R6a 的多聚核巧酸。
[0218] (e-5)对(e-4)中得到的多聚核巧酸进行纯化之后，用限制酶Ncol和化ndlll进行 消化，与预先用限制酶Ncol和化ndlll进行了消化的表达载体pETMalE(日本特开2011- 206046号公报)连接，使用其转化大肠杆菌E.coli BL2UDE3)株。
[0219] (e-6)对得到的转化体用添加了 50yg/mL卡那霉素的LB培养基进行培养。通过从回 收的菌体(转化体）中提取质粒，从而得到包含编码化Rfe的多聚核巧酸的质粒祀T斗cR6a， 所述FcR6a是对野生型Fc结合性蛋白质进行了 6位点氨基酸置换的多肤。
[0220] (e-7)按照与实施例1 (5)同样的方法进行祀T-FcR6a的核巧酸序列的解析。
[0221] 将附加了信号序列和聚组氨酸标签的化R6a的氨基酸序列示于序列号43、将编码 前述化R6a的多聚核巧酸的序列示于序列号44。需要说明的是，序列号43中，第1位的甲硫氨 酸(Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为Ma化信号肤;第27位的赖氨酸化ys)至第32位的甲 硫氨酸(Met)为止为连接子序列;第33位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酷胺(Gin)为止为 FcR6a的氨基酸序列（相当于序列号1的第17位至第192位为止的区域）、第209位至第210位 为止的甘氨酸(Gly)为连接子序列;第211位至第216位的组氨酸化is)为标签序列。另外，序 列号43中，分别地、Val27Glu的谷氨酸存在于第43位、Tyr35Asn的天冬酷胺存在于第51位、 Glu54Asp的天冬氨酸存在于第70位、Phe75Leu的亮氨酸存在于第91位、Asn92Ser的丝氨酸 存在于第108位、Glul21Gly的甘氨酸存在于第137位的位点。
[0222] (f)FcR6b从实施例3中已经明确的设及Fc结合性蛋白质的稳定性提高的氨基酸置 换中选择化 1276111、了7切54311、611154439、？}16751^611、6111120￥日1和6111121617，从而制备野生 型的化结合性蛋白质中累积了运些置换的FcR6b。具体而言，对于编码(d)中制备的化R5b的 多聚核巧酸进行产生Glul2(Wal的突变导入，从而制备FcR6b。
[0223] 作-1)将（(1)中制备的961'斗。1?56作为模板、将具有序列号22和序列号45(5'- GTGTTCAAAGTGGGGGATCCGATTCATCTG-3 '）中记载的序列的寡核巧酸作为PCR引物，除此之外， 按照与(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为邮bF。
[0224] (f-2)将（d)中制备的pET-FcR5b作为模板、将具有序列号21和序列号46(5'- AATCGGATCCCCCACTTTGAACACCCACCG-3 '）中记载的序列的寡核巧酸作为PCR引物，除此之外， 按照与(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为邮bR。
[0225] (f-3)将(f-1)和（f-2)中得到的巧帕CR产物(m6bF、m化R)混合之后，用与（a-3)同 样的方法进行PCR，将邮bF和m6bR连接。将得到的PCR产物作为邮bp。
[0226] (f-4)将(f-3)中得到的PCR产物m6bp作为模板、将具有序列号21和序列号22中记 载的序列的寡核巧酸作为PCR引物，除此之外，按照与(a-4)同样的方法进行PCR。由此制备 编码FcR6b的多聚核巧酸。
[0227] (f-5)对(f-4)中得到的多聚核巧酸进行纯化之后，用限制酶Ncol和化ndlll进行 消化，与预先用限制酶Ncol和化ndlll进行了消化的表达载体pETMalE(日本特开2011- 206046号公报)连接，使用其转化大肠杆菌E.coli BL2UDE3)株。
[0228] (f-6)对得到的转化体用添加了 50yg/mL卡那霉素的LB培养基进行培养。通过从回 收的菌体(转化体）中提取质粒，从而得到包含编码化R6b的多聚核巧酸的质粒祀T斗cR6b， 所述FcR6b是对野生型Fc结合性蛋白质进行了 6位点氨基酸置换的多肤。
[0229] (f-7)按照与实施例1 (5)同样的方法进行祀T-FcR化的核巧酸序列的解析。
[0230] 将附加了信号序列和聚组氨酸标签的化R6b的氨基酸序列示于序列号47、将编码 前述化R6b的多聚核巧酸的序列示于序列号48。需要说明的是，序列号47中，第1位的甲硫氨 酸(Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为Ma化信号肤;第27位的赖氨酸化ys)至第32位的甲 硫氨酸(Met)为止为连接子序列;第33位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酷胺(Gin)为止为 FcR化的氨基酸序列（相当于序列号1的第17位至第192位为止的区域）、第209位至第210位 为止的甘氨酸(Gly)为连接子序列;第211位至第216位的组氨酸化is)为标签序列。另外，序 列号47中，分别地Val27Glu的谷氨酸存在于第43位、Tyr35Asn的天冬酷胺存在于第51位、 Glu54Asp的天冬氨酸存在于第70位、Phe75Leu的亮氨酸存在于第91位、Glul2(Wal的鄉氨酸 存在于第136位、Glul21Gly的甘氨酸存在于第137位的位点。
[0231] (g)FcR7从实施例3中已经明确的、设及Fc结合性蛋白质的稳定性提高的氨基酸置 换中选择 Val27Glu、Tyr35Asn、Glu54Asp、Phe75Leu、Asn92Ser、Glul20VaWPGlul21GlyJA 而制备野生型的Fc结合性蛋白质中累积了运些置换的化R7。具体而言，对于编码(e)中制备 的FcR&i的多聚核巧酸进行产生Glul2(Wal的突变导入，从而制备FcR7。
[0232] (g-1)将(e)中制备的祀T-FcR6a作为模板、将具有序列号22和序列号45中记载的 序列的寡核巧酸作为PCR引物，除此W外，按照与(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产 物作为m7F。
[02削 （g-2)将(e)中制备的祀T-FcR6a作为模板、将具有序列号21和序列号46中记载的 序列的寡核巧酸作为PCR引物，除此W外，按照与(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产 物作为m7R。
[0234] (g-3)将(g-1)和(g-2)中得到的巧帕CR产物(m7F、m7R)混合之后，用与(a-3)同样 的方法进行PCR，将m7F和m7R连接。将得到的PCR产物作为m7p。
[02对 （g-4)将(g-3)中得到的PCR产物m7p作为模板、将具有序列号21和序列号22中记载 的序列的寡核巧酸作为PCR引物，除此之外，进行与(a-4)同样的PCR。由此制备编码化R7的 多聚核巧酸。
[0236] (g-5)对(g-4)中得到的多聚核巧酸进行纯化之后，用限制酶Ncol和化ndlll进行 消化，与预先用限制酶Ncol和化ndlll进行了消化的表达载体pETMalE(日本特开2011- 206046号公报)连接，使用其转化大肠杆菌E.coli BL2UDE3)株。
[0237] (g-6)对得到的转化体用添加了 50yg/mL卡那霉素的LB培养基进行培养。通过从回 收的菌体(转化体）中提取质粒，从而得到包含编码FcR7的多聚核巧酸的质粒祀T-FCR7，所 述FcR7是对野生型Fc结合性蛋白质进行了 7位点氨基酸置换的多肤。
[0238] (g-7)按照与实施例1 (5)同样的方法进行祀T-FCR7的核巧酸序列的解析。
[0239] 将附加了信号序列和聚组氨酸标签的化R7的氨基酸序列示于序列号49、将编码前 述化R7的多聚核巧酸的序列示于序列号50。需要说明的是，序列号49中，第1位的甲硫氨酸 (Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为Ma化信号肤;第27位的赖氨酸化ys)至第32位的甲硫 氨酸(Met)为止为连接子序列；第33位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酷胺(Gin)为止为 FcR7的氨基酸序列(相当于序列号1的第17位至第192位为止的区域）、第209位至第210位为 止的甘氨酸(Gly)为连接子序列;第211位至第216位的组氨酸化is)为标签序列。另外，序列 号49中，分别地、Val27Glu的谷氨酸存在于第43位、Tyr35Asn的天冬酷胺存在于第51位、 Glu54Asp的天冬氨酸存在于第70位、Phe75Leu的亮氨酸存在于第91位、Asn92Ser的丝氨酸 存在于第108位、Glul20Val的鄉氨酸存在于第136位、Glul21Gly的甘氨酸存在于第137位的 位点。
[0240] 实施例5改良化结合性蛋白质的热稳定性评价
[0241] (1)将表达实施例1中制备的野生型Fc结合性蛋白质、实施例3中选择的突变型化 结合性蛋白质（FcR2)和实施例4中制备的突变型的Fc结合性蛋白质（FcR3、FcR4、FcR5a、 Fc貼6^〇1?6曰^〇1?613^〇1?7)的转化体分别接种于包含504旨/1^卡那霉素的31^的2￥1'液体培 养基中，在37°C进行一晚好氧地振荡培养，由此进行前培养。
[0242] (2)向添加了 50yg/mL卡那霉素的20mL的2YT液体培养基（蛋白腺16g/L、酵母提取 物lOg/L、氯化钢5g/L)中接种前培养液2(K)yL，37°C下好氧地进行振荡培养。
[0243] (3)在培养开始1.5小时之后，将培养溫度变更为20°C，进行30分钟振荡培养。之 后，W终浓度成为0.0 lmM的方式添加 IPTG，接着在20°C下进行一晚好氧地振荡培养。
[0244] (4)培养结束后，通过离屯、分离进行集菌，使用BugBuster Protein exhaction kit (TAKARABIO INC.制)制备蛋白质提取液。
[0245] (5)使用实施例3(4)中记载的化ISA法测定(4)中制备的蛋白质提取液中的野生型 Fc结合性蛋白质和突变型的化结合性蛋白质的抗体结合活性。此时，使用市售的Fc 丫 Rllla 的细胞外区域(R&D Systems公司：4325-FC-050)制备标准曲线，进行浓度测定。
[0246] (6似各蛋白质的浓度成为扣g/mL的方式用包含150mM氯化钢的20mM的化is缓冲 液(pH7.4)进行稀释。对其进行等量分份，对一者使用热循环仪化ppendo计Japan制）在45 °C下进行10分钟加热处理;对另一者不进行热处理。通过实施例3(4)中记载的化ISA法测定 前述热处理之后、或非热处理的蛋白质的抗体结合活性，将进行了热处理后的抗体结合活 性除W没有进行热处理时的抗体结合活性，由此计算出残留活性。
[0247] 将结果示于表8。此次评价的突变型的化结合性蛋白质（FcR2、FcR3、FcR4JcR5a、 尸。尺56少。1?6曰、化1?613少。1?7)与野生型。(3结合性蛋白质相比较，残留活性变高，确认该突变型 的Fc结合性蛋白质的热稳定性提高。
[024引[表8] [0249]
[0250] 实施例6改良化结合性蛋白质的酸稳定性评价
[0251] (1)按照与实施例5(1)至(5)同样的方法制备改良化结合性蛋白质。
[0252] (2)W各蛋白质的浓度成为30yg/mL的方式用包含150mM氯化钢的20mM的化is缓冲 液(pH7.4)进行稀释。将稀释的各Fc结合性蛋白质60化和0.1M的甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.0) 120化混合，在30°C下静置2小时。
[0253] (3)利用实施例3(4)中记载的化ISA法，对利用甘氨酸盐酸缓冲液(PH3.0)进行酸 处理后的蛋白质的抗体结合活性、和没有进行前述酸处理时的蛋白质的抗体结合活性进行 测定。之后，将进行了酸处理后的抗体结合活性除W没有进行酸处理时的抗体结合活性，由 此计算出残留活性。
[0254] 将结果示于表9。此次评价的突变型的化结合性蛋白质（FcR2、FcR3、FcR4JcR5a、 尸。尺56少。1?6曰、化1?613少。1?7)与野生型。(3结合性蛋白质相比较，残留活性变高，确认该突变型 的Fc结合性蛋白质的酸稳定性提高。
[ο 巧 5][表 9]
[Ο 巧 6]
[0257] 实施例7进行了 1位点氨基酸置换的Fc结合性蛋白质的制备
[0258] 对于实施例3中已经明确的、设及化结合性蛋白质的稳定性提高的氨基酸置换中 的序列号1的第27位的鄉氨酸(Val)、第35位的酪氨酸(Tyr)和第121位的谷氨酸(Glu)置换 成其他氨基酸的Fc结合性蛋白质，分别用下述的方法进行制备。
[0259] (A)将序列号1的第27位的鄉氨酸(化1)置换成其他氨基酸的化结合性蛋白质的制 备
[0260] (A-1)将实施例1中制备的pET-eFcR作为模板、将具有序列号24和序列号51 (5 ' - CTGCCGAAAGCGNNKGTGTTTCTGGAACCG-3 '）中记载的序列的寡核巧酸作为PCR引物，除此之外， 按照与实施例4(a-l)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为27pF。
[0261] (A-2)将实施例1中制备的pET-eFcR作为模板、将具有序列号23和序列号52(5'- TTCCAGAAACACMNNCGCTTTCGGCAGATC-3 '）中记载的序列的寡核巧酸作为PCR引物，除此之外， 按照与实施例4(a-l)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为27pR。
[0262] (A-3)将(A-1)和(A-2)中得到的巧帕CR产物(27pF、27pR)进行混合之后，按照与实 施例4(a-3)同样的方法进行PCR，将27pF和27pR连接。将得到的PCR产物作为27p。
[02创 （A-4)将(A-3)中得到的PCR产物27p作为模板、将具有序列号23和序列号24中记载 的序列的寡核巧酸作为PCR引物，按照与实施例4(a-4)同样的方法进行PCR。由此，制备编码 将序列号1的第27位的鄉氨酸置换成任意氨基酸的Fc结合性蛋白质的多聚核巧酸。
[0264] (A-5)对(A-4)中得到的多聚核巧酸进行纯化之后，用限制酶Ncol和化ndlll进行 消化，与预先用限制酶Ncol和化ndlll进行了消化的表达载体pETMalE(日本特开2011- 206046号公报)连接，使用其转化大肠杆菌E.coli BL2UDE3)株。
[0265] (A-6)对得到的转化体用添加了50yg/mL卡那霉素的LB培养基进行培养。由回收的 菌体(转化体)提取质粒，按照与实施例1(5)同样的方法进行核巧酸序列解析。
[0%6]结果，得到编码产生了 Val27Gly(V27G)、Val27Lys(V27K)、Val27Thr(V27T)、 化127Ala(V27A)、化127T巧(V27W)或化127Arg(V27R)的氨基酸置换的Fc结合性蛋白质的多 聚核巧酸。
[0267] (B)将序列号1的第35位酪氨酸(Tyr)置换成其他氨基酸的化结合性蛋白质的制备
[0268] (B-1)将实施例1中制备的pET-eFcR作为模板、将具有序列号24和序列号53(5'- AACCGCAGTGGNNKCGCGTGCTGGAGAAAG-3 '）中记载的序列的寡核巧酸作为PCR引物，除此之外， 按照与实施例4(a-l)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为35pF。
[0269] (B-2)将实施例1中制备的pET-eFcR作为模板、将具有序列号23和序列号54(5'- AGCACGCGMNNCCACTGCGGTTCCAGAAAC-3 '）中记载的序列的寡核巧酸作为PCR引物，除此之外， 按照与实施例4(a-l)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为35pR。
[0270] (B-3)将(B-1)和(B-2)中得到的巧帕CR产物(35pF、35pR)进行混合之后，按照与实 施例4(a-3)同样的方法进行PCR，将35pF和35pR连接。将得到的PCR产物作为35p。
[0271] (B-4)将(B-3)中得到的PCR产物35p作为模板、将具有序列号23和序列号24中记载 的序列的寡核巧酸作为PCR引物，按照与实施例4(a-4)同样的方法进行PCR。由此，制备编码 将序列号1的第35位的酪氨酸置换成任意氨基酸的Fc结合性蛋白质的多聚核巧酸。
[0272] (B-5)对(B-4)中得到的多聚核巧酸进行纯化之后，用限制酶Ncol和化ndlll进行 消化，与预先用限制酶Ncol和化ndlll进行了消化的表达载体pETMalE(日本特开2011- 206046号公报)连接，使用其转化大肠杆菌E.coli BL2UDE3)株。
[0273] (B-6)对得到的转化体用添加了50yg/mL卡那霉素的LB培养基进行培养。由回收的 菌体(转化体)提取质粒，按照与实施例1(5)同样的方法进行核巧酸序列解析。
[0274] 结果，得到编码产生了Tyr35Cys(Y35C)、Tyr35Asp(Y35D)、Tyr35Phe(Y35F)、 Tyr35Gly(Y35G)、Tyr35Lys(Y35K)、Tyr3化eu(Y35L)、Tyr35Asn(Y35N)、Tyr35Pro(Y35P)、 Tyr35Arg(Y35R)、Tyr35Ser(Y35S) 'TyrfST'虹（Y35T)、Tyr35化 1 (Y35V)或Tyr35T巧（Y35W)的 氨基酸置换的Fc结合性蛋白质的多聚核巧酸。
[0275] (C)将序列号1的第121位的谷氨酸(Glu)置换成其他氨基酸的化结合性蛋白质的 制备
[0276] (C-1)将实施例1中制备的pET-eFcR作为模板、将具有序列号24和序列号55(5'- GTGTTCAAAGAGNNKGATCCGATTCATCTG-3 '）中记载的序列的寡核巧酸作为PCR引物，除此之外， 按照与实施例4(a-l)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为mpF。
[0277] (C-2)将实施例1中制备的pET-eFcR作为模板、将具有序列号23和序列号56(5'- AATCGGATCMNNCTCTTTGAACACCCACCG-3 '）中记载的序列的寡核巧酸作为PCR引物，除此之外， 按照与实施例4的(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为mpR。
[027引（C-3)将(C-1)和(C-2)中得到的巧tPCR产物（12 IpF、121pR)进行混合之后，按照与 实施例4(a-3)同样的方法进行PCR，将mpF和mpR连接。将得到的PCR产物作为121ρ。
[0279] (C-4)将(C-3)中得到的PCR产物121ρ作为模板、将具有序列号23和序列号24中记 载的序列的寡核巧酸作为PCR引物，进行与实施例4(a-4)同样的PCR。由此，制备编码序列号 1的第121位的谷氨酸置换成任意的氨基酸的Fc结合性蛋白质的多聚核巧酸。
[0280] (C-5)对(C-4)中得到的多聚核巧酸进行纯化之后，用限制酶NcoI和化ndllI进行 消化，与预先用限制酶化01和化nd IΠ 消化的表达载体祀TMa化（日本特开2011 -206046号公 报)连接，使用其转化大肠杆菌E.coli BL2UDE3)株。
[0281] (C-6)对得到的转化体用添加了50yg/mL卡那霉素的LB培养基进行培养。由回收的 菌体(转化体)提取质粒，按照与实施例1(5)同样的方法进行核巧酸序列解析。
[0282] 结果，得到编码产生了Glul21Lys 化121K)、Glul21Pr〇ai21P)、Glul21Arg 化 121R)、Glul21Gly 化 121G)、Glul21His 化 121H)或 GI11I2I 化 KE121V)氨基酸置换的 Fc 结合 性蛋白质的多聚核巧酸。
[0283] 实施例8进行了 1个氨基酸置换的化结合性蛋白质的抗体结合活性评价
[0284] (1)对于表达实施例1中制备的野生型Fc结合性蛋白质和实施例7中制备的进行了 1个位点氨基酸置换的化结合性蛋白质的转化体，按照与实施例3(1)和(2)同样的方法分别 进行培养，使野生型Fc结合性蛋白质W及进行了 1个氨基酸置换的Fc结合性蛋白质表达。
[0285] (2)对于表达的进行了 1个氨基酸置换的Fc结合性蛋白质，按照与实施例3(4)中记 载的化ISA法检查与抗体的结合活性。
[0286] 将结果示于图2。通过将序列号1的第27位的鄉氨酸置换成甘氨酸(V27G)、赖氨酸 (V27K)、苏氨酸(V27T)、丙氨酸(V27A)、精氨酸(V27R)，与野生型Fc结合性蛋白质相比较，抗 体结合活性提高，另一方面，序列号1的第27位的化1置换成色氨酸(V27W)时，与野生型化结 合性蛋白质相比较，抗体结合活性降低。
[0287] 通过将序列号1的第35位的酪氨酸置换成天冬氨酸(Y35D)、苯丙氨酸(Y35F)、甘氨 酸(Y35G)、赖氨酸(Y35K)、亮氨酸(Y35L)、天冬酷胺(Y35N)、脯氨酸(Y35P)、丝氨酸(Y35S)、 苏氨酸(Y35T)、鄉氨酸(Y35V)、色氨酸(Y35W)置换，与野生型化结合性蛋白质相比较，抗体 结合活性提高。其中，Y35D、Y35G、Y35K、Y3化、Y35N、Y35P、Y35S、Y35T、Y35W与野生型化结合 性蛋白质相比较，抗体结合活性大幅地提高。另一方面，将序列号1的第35位的酪氨酸置换 成半脫氨酸(Y35C)、精氨酸(Y35R)的情况下，为与野生型化结合性蛋白质几乎同等的抗体 结合活性。
[0288] 通过将序列号1的第121位的谷氨酸置换成赖氨酸化12化）、精氨酸化121R)、甘氨 酸化121G)、组氨酸化121H)，与野生型Fc结合性蛋白质相比较，抗体结合活性提高。其中， E121G与野生型化结合性蛋白质相比较，抗体结合活性大幅地提高。另一方面，将序列号1的 第121位的谷氨酸置换成鄉氨酸化121V)的情况下，是与野生型Fc结合性蛋白质几乎同等的 抗体结合活性;置换成脯氨酸化121P)的情况下，与野生型Fc结合性蛋白质相比较，抗体结 合活性降低。
[0289] 实施例9进行了 1个氨基酸置换化结合性蛋白质的热稳定性评价
[0290] 为了对实施例8中评价的进行了 1个氨基酸置换的化结合性蛋白质的热稳定性进 行比较，按照与实施例3(3)同样的方法进行热处理(45°C、10分钟），计算出残留活性。
[0291] 将结果示于图3。将序列号1的第35位的酪氨酸分别置换为天冬氨酸(Y35D)、甘氨 酸(Y35G)、赖氨酸(Y35K)、亮氨酸(Y35L)、天冬酷胺(Y35N)、脯氨酸(Y35P)、丝氨酸(Y35S)、 苏氨酸（Y35T)的Fc结合性蛋白质，W及将序列号1的第121位的谷氨酸置换成甘氨酸 化121G)的化结合性蛋白质，与野生型化结合性蛋白质相比较热稳定性大幅地提高。其中， Y35N、Y35P与野生型Fc结合性蛋白质相比较，热稳定性大幅地提高。
[0292] 实施例10 FcR5a的大量制备
[0293] (1)将实施例4(c)中制备的表达FcR5a的转化体接种至加入至化的Ξ角瓶的包含 50yg/mL卡那霉素的400mL的2YT液体培养基(蛋白腺16g/L、酵母提取物lOg/L、氯化钢5g/L) 中，在37°C下好氧地振荡培养一晚，从而进行前培养。
[0294] (2)向包含葡萄糖lOg/L、酵母提取物20g/L、憐酸Ξ钢十二水合物3g/L、憐酸氨二 钢十二水合物9g/L、氯化锭Ig/L和硫酸卡那霉素50mg/L的液体培养基1.化中接种（1)的培 养液180mL，使用化发酵罐（Biott Corporation制）进行主培养。设定溫度30°C、pH6.9至 7.1、通气量1VVM、溶解氧浓度30 %饱和浓度的条件，开始主培养。为了控制抑，分别地，作为 酸使用50%憐酸、作为碱使用14%氨水，溶解氧的控制通过使揽拌速度变化来进行控制，揽 拌转速设定为下限5(Κ)巧m、上限lOOOrpm。培养开始后，在葡萄糖浓度变得不能测定的时点， 一边通过溶解氧(DO)进行控制一边加入流加培养基(葡萄糖248.9g/L、酵母提取物83.3g/ L、硫酸儀屯水合物7.2g/L)。
[0295] (3)作为菌体量的目标，600nm的吸光度(0D600nm)到达约150时，将培养溫度下降 至25°C，确认到达设定溫度之后，添加 IPTGW使终浓度成为0.5mM，接着在25°C下继续培养。
[0296] (4)在培养开始约48小时后停止培养，对培养液在4°C下进行8000巧m、20分钟的离 屯、分离，由此回收菌体。
[0297] (5)将(4)中回收的菌体的一部分用包含150mM氯化钢的20mM的Tris盐酸缓冲液 (抑7.4)W成为5mL/lg(菌体）的方式悬浊，使用超声波发生装置（Insoneta201M(商品名）、 久保田商事制），在4°C下W约10分钟、约150W的功率对菌体进行破碎。对于菌体破碎液，在4 °C下进行2次20分钟、lOOOOrpm的离屯、分离，回收上清。
[0298] (6)对(5)中得到的破碎液W终浓度成为20mM的方式添加咪挫之后，施加于预先用 包含150mM的氯化钢和20mM咪挫的20mM的Tris盐酸缓冲液（PH7.4)平衡化的填充了 Ni S邱harose 6Fast Flow(GE Healthcare制）50血的XK 26/20柱（GE Healthcare制）。用平衡 化中使用的缓冲液进行洗涂之后，使用包含150mM氯化钢和0.5M咪挫的20mM的化iS盐酸缓 冲液(PH7.4)洗脱 FcR5a。
[0299] (7)将(6)中得到的洗脱液施加于预先用包含150mM氯化钢的20mM的化is盐酸缓冲 液（PH7.4)平衡化的填充了 IgG琼脂糖凝胶（GE Healthcare制）30mL的HR 16/10柱（GE 化althcare制）。用平衡化中使用的缓冲液进行洗涂之后，用0.1M的甘氨酸盐酸缓冲液 (pH3.0)洗脱FcR5a。需要说明的是，洗脱液通过加入洗脱液量的1/4量1M化is盐酸缓冲液 (抑7.0)而使抑恢复至中性附近。
[0300] 实施例11 FcR5a固定化凝胶的制备
[0301 ] (1)对实施例 10制备的FcRf5a 使用超滤膜(Mill ipore Corporation制：Ami con 叫化al5)进行浓缩?缓冲液交换，用包含150mM氯化钢的20mM的化is盐酸缓冲液(pH7.4)浓 缩至8.37mg/mL的浓度。
[0302] (2)使作为载体的亲水性乙締基聚合物(TOSOH CORPORATION制：T0Y0PEA化）的径 基与1，6-己二醇二缩水甘油基酸反应来制备环氧基T0Y0PEA化凝胶。
[0303] (3)准备5根（2)中制备的加入了环氧基TOY0PEA化凝胶100化的吸附柱（SPiη column;Bi〇-Rad Laboratories, Inc.制），用包含0.5Μ氯化钢的0.1 M的棚酸缓冲液(ρΗ9.0) 〇.5mL洗涂3次。
[0304] (4)将（1)中制备的FcR5a溶液0.3mL与包含0.5M氯化钢的0.1M的棚酸缓冲液 (抑9.0)0.45mL混合，将混合溶液分别添加至（3)中记载的填充了凝胶的吸附柱，35°C下振 荡3小时。
[0305] (5)对向凝胶中加入的化貼a溶液与包含0.5M氯化钢的0.1M的棚酸缓冲液的混合 溶液进行回收之后，用0.1M的甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.0)0.2mL洗涂3次。之后，通过用包含 150mM氯化钢的20mMTris盐酸缓冲液(pH7.4)0.5mL洗涂3次使抑恢复至中性附近，从而制备 FcR5a固定化凝胶0.5mL。
[0306] 对于(5)中回收的溶液W及洗涂液中所包含的蛋白质浓度进行测定，计算出固定 化于凝胶的化貼曰的量，从而计算出固定化率，添加的化貼a的33.7 %固定化于凝胶。
[0307] 实施例12用化貼a固定化凝胶的抗体分离
[0308] (1)将实施例11中制备的化贴a固定化凝胶0.5mL填充于皿16/5柱(GE Healthcare 制），与AKTAprime plus(GE Healthcare制）相连接。之后，用包含150mM氯化钢的SOmMTris 盐酸缓冲液(pH7.4)进行平衡化。
[0309 ] (2)使包含150mM氯化钢的20mM的Tr i S盐酸缓冲液(pH7.4) W 0.1血的流速流动，用 包含150mM氯化钢的SOmMTris盐酸缓冲液(pH7.4)施加制备成Img/mL的人IgGl(Sigma公司 制：15154-1MG)溶液0.5mL，使人IgG 1吸附于化R5a固定化凝胶。之后，通过流过20mM乙酸缓 冲液(P册.0)进行平衡化，利用20mM的甘氨酸盐酸缓冲液(PH3.0)带来的抑梯度对吸附的人 IgGl进行洗脱。洗脱的人IgGl每0.5mL回收级分。
[0310] 将人IgGl的洗脱模式和回收的级分示于图4中。回收的洗脱级分中，将级分13 (化13)和级分14(Frl4)混合而成的物质称为级分A(FrA);将级分16(Frl6)和级分17(化17) 混合而成的物质称为级分B(化B)。
[0311] 实施例13分离抗体的糖链结构解析
[0312 ] (1)对实施例12中使用的纯化前的人I gG 1和洗脱级分(化A、FrB)利用100°C、10分 钟的热处理进行变性之后，用糖酷胺酶A/胃蛋白酶和链霉蛋白酶依次进行处理，经过利用 凝胶过滤法的纯化操作，取得糖链级分。
[0313] (2)将（1)中得到的糖链用蒸发器进行浓缩?干燥之后，在乙酸溶剂下使2-氨基化 晚、接着使二甲胺棚烧依次作用而制成巧光标记化糖链，利用凝胶过滤法进行纯化。
[0314] (3)对于（2)中得到的巧光标记化糖链用阴离子交换柱（TSKgel DEAE-5PW、Φ 7.5mm X 7.5cm: TOSOH CORPORATION制)分离成中性糖链级分和单唾液酸巧化糖链级分。
[0315] (4)对于(3)中得到的中性糖链级分和单唾液酸巧化糖链级分使用0DS柱分离成各 个糖链。通过MALDI-T0F-MS分析得到分离的糖链的分子量信息之后，对照0DS柱色谱的保留 时间（retention time)，匹配糖链结构。
[0316] 将中性糖链的组成比示于表10中，将单唾液酸巧化糖链的组成比示于表11中。另 夕h将匹配的糖链结构(N1至N8W及Ml至M2)示于图5。由表10所示的结果可知，具有糖链结 构N2和N7的抗体在纯化前W及在FrB中被检测出，但没有从FrA中被检测到。即，具有前述2 种糖链结构（图5的N2和N7)的抗体在作为早洗脱级分的FrA中没有被检测出，而在作为迟洗 脱级分的FrB中被检测出，因此表明与具有其他糖链结构的抗体相比较，与FcR5a固定化凝 胶强结合。由W上的结果可知，作为本发明的吸附剂的一形式的FcR5a固定化凝胶能够根据 抗体所具有的糖链结构的差异而分离出抗体。
[0引7][表 10]
[0321] 实施例14用化Rf5a固定化凝胶的抗体纯化
[0322] 使用实施例11中制备的化貼a固定化凝胶进行人IgGl和人IgG3的纯化。
[0；3Z3] (1)用与实施例11同样的方法制备化R5a固定化凝胶0.2血。将制备的化R5a固定化 凝胶O.lmL填充于吸附柱。
[0324] (2)将（1)中制备的填充了FcR5a固定化凝胶的柱用包含150mM氯化钢的20mM的 Tris盐酸缓冲液(pH7.4)0.5mL洗涂3次。
[0325] (3)对作为动物细胞用培养基的DMEM/F12培养基（Thermo Fisher Scientific Inc.制）中添加了 10%胎牛血清(FCS)的培养基，添加人IgGl(Sigma-Al化ich Co丄LC.制： I5154-1M G)或人IgG3(Sigma-Al化ich Co丄LC.制：I4639-1MG)W成为0.3mg/mL，从而制备 模拟培养液。
[0326] (4)对(2)中洗涂的柱加入(3)中制备的模拟培养液0.4mL，25°C下进行2小时振荡。
[0327] (5)去除模拟培养液，用包含150mM氯化钢的20mM的Tr i S盐酸缓冲液(pH7.4) 0.5mL 洗涂4次之后，用5(Κ)化的0.1 M的甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.0)进行洗脱，每1(Κ)化回收级分。
[0328] (6)对模拟培养液、洗脱级分分别添加2 X样品缓冲液(包含2 (w/v) %十二烷基硫 酸钢、6(>八）％0-琉基乙醇、1〇(>八）％甘油和〇.〇〇5(￥八）％漠酪蓝的5〇11^的化13盐酸缓冲 液（PH6.8))进行加热处理。之后，对处理的样品用使用了 5至20%梯度SDS-PAGE用凝胶 (ATT0 Corporation.制）的电泳进行分离。需要说明的是，作为比较，对于模拟培养液中添 加的人IgGl和人IgG3(浓度:0.2mg/mU也进行同样的处理，用SDS-PAGE进行分析。
[0329] 将包含人IgGl或人IgG3的洗脱级分的利用SDS-PAGE的分析结果示于图6。对添加 了人IgGl的模拟培养液进行纯化而得到的包含人IgGl的洗脱级分，显示出与模拟培养液中 所添加的人IgGl同样的位置，并且看不到模拟培养液中所看到的白蛋白的条带，所W能够 确认对人IgGl进行了高纯度地纯化（图6的(A))。另外，对添加了人IgG3的模拟培养液进行 纯化而得到的包含人IgG3的洗脱级分，显示出与模拟培养液中所添加的人IgG3同样的位 置，并且看不到模拟培养液中所看到的白蛋白的条带，所W能够确认对人IgG3进行了高纯 度地纯化（图6的(B))。由运些结果可知，作为本发明吸附剂的一形式的FcR5a固定化凝胶能 够从动物细胞用的培养液中纯化人IgGl和人IgG3。
[0330] 实施例15去除了糖链的人IgGl的制备
[0331] 用W下所示的方法进行从人IgGl中N型糖链的去除。
[0332] (1)W人IgGUFitzgerald公司制：31-AI17)的浓度成为3mg/mL的方式用包含 150mM氯化钢的20mM的Tris盐酸缓冲液(pH7.4)进行稀释。
[0333] (2)向（1)的稀释液100化中加入1M的Tris盐酸缓冲液（ρΗ8.6)100^，加入N- glycosidase F巧00mU/yL(TAKARABI0 INC.制:4450) 10化之后，在37°C下静置24小时，从而 去除IgGl的N型糖链。
[0334] (3)对预先用包含150mM氯化钢的20mMTris盐酸缓冲液(PH7.4)平衡化的填充了 Toyopearl AF-rProtein A-650F(T0S0H CORPORATION制：22803) 100化的开放柱（Bio-Rad Laboratories, Inc.制）施加（2)的处理液。
[0335] (4)用50化L的包含150mM氯化钢的20mM化is盐酸缓冲液(PH7.4)洗涂3次之后，用 100化的0.1M甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.0)洗脱7次，由此对去除了N型糖链的人IgGlm下，简 单地称为去除了糖链的人IgGl)进行纯化。需要说明的是，对该洗脱液通过加入洗脱液的1/ 4量的1M的化is盐酸缓冲液(P册.0)进行中和。
[0336] (5)对于(4)中得到的去除了糖链的人IgGl溶液添加等量的样品缓冲液(包含2(w/ V) %十二烷基硫酸钢、6(w/v) %β-琉基乙醇、10(w/v) %甘油和0.005(w/v) %漠酪蓝的50mM 的Tris盐酸缓冲液(P册.8))进行加热处理，对去除了糖链的人IgGl进行还原处理。
[0337] (6)利用使用了5至20%梯度SDS-PAGE用凝胶(ATT0 Corporation.制）的电泳对人 IgGl进行分离。需要说明的是，作为比较，对于没有进行糖链处理的人IgGUW下，称为有糖 链的人I gG 1)水溶液(浓度:0.5mg/mL)也进行与（5)的记载同样的还原处理，用SDS-PAGE进 行分离。
[0338] 将结果示于图7。通过SDS-PAGE能够确认的是，由于去除了糖链的人IgGl的重链被 去除了N型糖链，因此与有糖链的人IgGl的重链相比较，变为低分子量的（参照图7的泳道 (2))。即，可W确认，用本实施例的方法能够制备去除了N型糖链的人IgGl。
[0339] 实施例16人化丫 Rllla的大量制备
[0340] (1)将能够表达实施例1中得到的人Fc 丫 Rllla的转化体接种于加入至化的Ξ角瓶 中的包含50yg/mL卡那霉素的400mL的2YT液体培养基（蛋白腺16g/L、酵母提取物lOg/L、氯 化钢5g/L)，在37°C下好氧地振荡培养一晚，由此进行前培养。
[0%1] (2)向包含葡萄糖lOg/L、酵母提取物20g/L、憐酸Ξ钢十二水合物3g/L、憐酸氨二 钢十二水合物9g/L、氯化锭Ig/L和硫酸卡那霉素50mg/L的液体培养基1.化中接种（1)的培 养液180mL，使用化发酵罐进行主培养。设定溫度30°C、pH6.9至7.1、通气量1VVM、溶解氧浓 度30%饱和浓度的条件，开始主培养。为了控制抑，分别地，作为酸使用50%憐酸、作为碱使 用14%氨水，溶解氧的控制通过使揽拌速度变化来进行控制，揽拌转速设定为下限50化pm、 上限lOOOrpm。培养开始后，在葡萄糖浓度变得不能测定的时点，一边通过溶解氧(DO)进行 控制一边加入流加培养基(葡萄糖248.9g/L、酵母提取物83.3g/L、硫酸儀屯水合物7.2g/ Do
[CX342] (3)作为菌体量的目标，600nm的吸光度(0D600nm)到达约150时，将培养溫度下降 至25°C，确认到达设定溫度之后，添加 IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖巧使终浓度成为 0.5mM，接着在25°C下继续培养。
[0343] (4)在培养开始约48小时后停止培养，对培养液进行8000巧m、20分钟的离屯、分离， 由此回收菌体。
[0344] (5)将(4)中回收的菌体用包含150mM氯化钢的20mM的化i S盐酸缓冲液(pH7.4似 成为5mL/lg(菌体)的方式悬浊，使用超声波发生装置(Insoneta201M(商品名）、久保田商事 制），在4°C下W约10分钟、约150W的功率对菌体进行破碎。对于菌体破碎液，在4°C下进行2 次20分钟、10000巧m的离屯、分离，回收上清。
[0345] (6)对(5)中得到的破碎液W终浓度成为20mM的方式添加咪挫之后，施加于预先用 包含150mM的氯化钢和20mM咪挫的20mM的Tris盐酸缓冲液（PH7.4)平衡化的填充了 Ni Sepharose 6化31 Flow(GE Healthcare制）50mL的XK 26/20柱（GE Healthcare制）。
[0346] (7)用平衡化中使用的缓冲液进行洗涂之后，使用包含150mM氯化钢和0.5M咪挫的 20mM的化is盐酸缓冲液(pH7.4)洗脱人Fc 丫 Rllla。
[0347] (8)将(7)中得到的洗脱液施加于预先用包含150mM氯化钢的20mM的化is盐酸缓冲 液（PH7.4)平衡化的填充了 IgG琼脂糖凝胶（GE Healthcare制）10mL的HR 16/10柱（GE 化althcare制）。用平衡化中使用的缓冲液进行洗涂之后，用0.1M的甘氨酸盐酸缓冲液 (抑3.0)洗脱人化丫 RIIla。需要说明的是，洗脱液通过加入洗脱液量的1/4量1M化iS盐酸 缓冲液(P册.0)而使pH恢复至中性附近。
[0%引实施例17对人化丫 Rllla的抗体的结合性测定
[0349] (1)对实施例16中制备的人Fc 丫 Rllla用憐酸缓冲液(包含137mM的化CK8.1M的 Na2HP04、2.68mM的KC巧日1.47mM的K出Κ)4的pH7.4的缓冲液)进行透析来进行缓冲液交换，由 280nm的吸光度测定人Fc 丫 Rllla的浓度。
[0350] (2)将（1)中测定了浓度的人化丫 Rllla用20mM的乙酸缓冲液(P册.5)稀释至lOyg/ mL之后，使用胺偶联试剂盒(GE化althcare制）固定化于传感器忍片（Sensor化ip)CM5(GE Healthcare制），使用Biacore T-100(GE Healthcare制）对人化 丫 RIIla固定化量进行测 定。结果，人。(3丫1?111曰的固定化量为488.2抓（1抓=1口邑/1111112)。另外，对于蛋白4。1'〇16齡￥曰 Co.，Ltd.制）也同样地，用20mM的乙酸缓冲液（PH5.5)稀释至lOyg/mL，固定化于CM5(GE Healthcare制）。用Biacore T-100测定固定化量的结果，固定化量为290.0RU。
[0351] (3)将具有糖链的人IgGlW及实施例15中制备的去除了糖链的人IgGl用皿S-EP (+ )(包含lOmM的皿PES、150mM的化C1、3mM的抓TA和0.005(v/v) % 的SuWactant P20(GE Hea 1 thcar e制）的抑7.4的溶液）稀释至12祉g/血、6化g/mL、3化g/血、1化g/mL、祉g/mL、化g/ mL、2μ邑/mL、1μ邑/mL。
[0352] (4) (2)中制备的蛋白质固定化忍片中，人Fc 丫 RIIla固定化忍片的情况下，使化g/ mL至12祉g/mL的具有糖链的人IgGl或去除了糖链的人IgGl W流速30化/分钟流动;蛋白A固 定化忍片的情况下，使lyg/mL至16yg/mL的具有糖链的人IgGl或去除了糖链的人IgGlW流 速30化/分钟流动，使人IgGl与固定化于忍片的蛋白质结合之后，用Biacore T-100W接触 时间210秒、解离时间400秒的条件进行测定，从而测定人IgGl与固定化于忍片的蛋白质的 结合性。
[0353]将测定结果示于图8。可知，人Fc 丫 Rllla对于具有糖链的人IgGl具有结合性，而对 于去除了糖链的人IgGl则非常难W结合(参照图8(A))。即，由该结果可知，人化yRIIIa识 别由糖链对于抗体的附加导致的差异。另一方面，可知蛋白A无论糖链的有/无而对人IgGl 具有同样的结合性(参照图8(B))。
[0354]实施例18人Fc 丫 Rllla固定化凝胶的制备
[03巧](1)对实施例16中制备的人化丫 Rllla使用超滤膜(Millipore Corporation制： Amicon叫化al5)进行浓缩?缓冲液交换，用包含150mM氯化钢的20mM的化is盐酸缓冲液 (pH7.4)浓缩至2.6mg/mL的浓度为止。 惦56] (2)使作为载体的亲水性乙締基聚合物(TOSOH CORPORATION制：T0Y0PEA化）的径 基与1，6-己二醇二缩水甘油基酸反应来制备环氧基T0Y0PEA化凝胶。
[Ο%7] (3)将（2)中制备的环氧基T0Y0PEARL凝胶70化加入至吸附柱（Bio-Rad Laboratories，Inc .)，用包含0.5M氯化钢的0.1M的棚酸缓冲液(pH9.0)0.5mL洗涂3次。
[0358] (4)将（1)中制备的人化丫 Rllla溶液0.4mL与包含0.5M氯化钢的0.1M的棚酸缓冲 液(pH9.0)0.6mL混合，将该混合溶液添加至(2)的凝胶中，35°C下进行3小时振荡。
[0359] (5)将(4)中制备的凝胶用0.1M的甘氨酸盐酸缓冲液(P册.0)0.2mL洗涂3次之后， 用包含150mM氯化钢的20mM的Tri S盐酸缓冲液(pH7.4)0.5血洗涂3次，由此使抑恢复至中性 附近，从而制备人化丫 RIIIa固定化凝胶0.2mL。
[0360] (6)对向（2)的凝胶中所添加的溶液和洗涂液中所包含的蛋白质浓度进行测定，计 算出固定化于凝胶的人化丫 Rllla量，从而计算固定化率，结果添加的人化丫 Rllla的84% 被固定化于凝胶。
[0361] 实施例19使用了人化丫 Rllla固定化凝胶的抗体分离
[0362] (1)将实施例18中制备的人Fc 丫 Rllla固定化凝胶填充于HR16/5柱（GE Healthcare制），将该柱与液相色谱法装置AKTAp;rime(GE Healthcare制）连接。
[0363] (2)对（1)中制备的柱用包含150mM氯化钢的20mM的化iS盐酸缓冲液(pH7.4)进行 平衡化，W流速0.1 mL/min添加0.1 mL人IgGl (Fitzgerald公司制：31-AI17)或实施例2中制 备的去除了糖链的人IgGl(溶液浓度均为Img/mL)。用平衡化中所使用的缓冲液进行洗涂之 后，用0.1M的甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.5)进行洗脱。
[0364] 将结果示于图9。可W确认，尽管流过了等量的IgGl,去除了糖链的人IgGl(参照图 9的（2))与具有糖链的人IgGl(参照图9的（1))相比较，没有吸附于凝胶而通过的抗体量多。 另外，具有糖链的人IgGl中添加了0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液(pH3.5)时，抗体被洗脱了（参照 图9的（1))，而去除了糖链的人IgGl几乎没有吸附于凝胶，所W抗体没有被洗脱(参照图9的 (2))。即，将人Fc 丫 Rllla固定化于不溶性载体而得到的吸附剂具有能够特异地吸附具有糖 链的抗体的性能，通过利用该性能能够识别糖链有无附加于抗体。
[0365] 产业上的可利用性
[0366] 本发明的吸附剂特异地吸附具有糖链的抗体，因此能够高纯度地分离.纯化具有 糖链的抗体。因此，本发明的吸附剂可应用于抗体药物制造和品质管理。
【主权项】
1. 一种Fc结合性蛋白质，其包含序列号1中记载的氨基酸序列中第17位至第192位为止 的氨基酸残基，并且该第17位至第192位为止的氨基酸残基中产生以下的（1)至(40)中至少 任一种氨基酸置换； (1) 序列号1的第18位的甲硫氨酸置换为精氨酸 (2) 序列号1的第27位的缬氨酸置换为谷氨酸 (3) 序列号1的第29位的苯丙氨酸置换为亮氨酸或丝氨酸 (4) 序列号1的第30位的亮氨酸置换为谷氨酰胺 (5) 序列号1的第35位的酪氨酸置换为天冬氨酸、甘氨酸、赖氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、脯 氨酸、丝氨酸、苏氨酸、组氨酸的任一者 (6) 序列号1的第46位的赖氨酸置换为异亮氨酸或苏氨酸 (7) 序列号1的第48位的谷氨酰胺置换为组氨酸或亮氨酸 (8) 序列号1的第50位的丙氨酸置换为组氨酸 (9) 序列号1的第51位的酪氨酸置换为天冬氨酸或组氨酸 (10) 序列号1的第54位的谷氨酸置换为天冬氨酸或甘氨酸 (11) 序列号1的第56位的天冬酰胺置换为苏氨酸 (12) 序列号1的第59位的谷氨酰胺置换为精氨酸 (13) 序列号1的第61位的苯丙氨酸置换为酪氨酸 (14) 序列号1的第64位的谷氨酸置换为天冬氨酸 (15) 序列号1的第65位的丝氨酸置换为精氨酸 (16) 序列号1的第71位的丙氨酸置换为天冬氨酸 (17) 序列号1的第75位的苯丙氨酸置换为亮氨酸、丝氨酸、酪氨酸的任一者 (18) 序列号1的第77位的天冬氨酸置换为天冬酰胺 (19) 序列号1的第78位的丙氨酸置换为丝氨酸 (20) 序列号1的第82位的天冬氨酸置换为谷氨酸或缬氨酸 (21) 序列号1的第90位的谷氨酰胺置换为精氨酸 (22) 序列号1的第92位的天冬酰胺置换为丝氨酸 (23) 序列号1的第93位的亮氨酸置换为精氨酸或甲硫氨酸 (24) 序列号1的第95位的苏氨酸置换为丙氨酸或丝氨酸 (25) 序列号1的第110位的亮氨酸置换为谷氨酰胺 (26) 序列号1的第115位的精氨酸置换为谷氨酰胺 (27) 序列号1的第116位的色氨酸置换为亮氨酸 (28) 序列号1的第118位的苯丙氨酸置换为酪氨酸 (29) 序列号1的第119位的赖氨酸置换为谷氨酸 (30) 序列号1的第120位的谷氨酸置换为缬氨酸 (31) 序列号1的第121位的谷氨酸置换为天冬氨酸或甘氨酸 (32) 序列号1的第151位的苯丙氨酸置换为丝氨酸或酪氨酸 (33) 序列号1的第155位的丝氨酸置换为苏氨酸 (34) 序列号1的第163位的苏氨酸置换为丝氨酸 (35) 序列号1的第167位的丝氨酸置换为甘氨酸 (36) 序列号1的第169位的丝氨酸置换为甘氨酸 (37) 序列号1的第171位的苯丙氨酸置换为酪氨酸 (38) 序列号1的第180位的天冬酰胺置换为赖氨酸、丝氨酸、异亮氨酸的任一者 (39) 序列号1的第185位的苏氨酸置换为丝氨酸 (40) 序列号1的第192位的谷氨酰胺置换为赖氨酸。2. 根据权利要求1所述的Fc结合性蛋白质，其中，包含序列号1中记载的氨基酸序列中 第17位至第192位为止的氨基酸残基，并且该第17位至第192位为止的氨基酸残基中至少序 列号1的第35位的酪氨酸置换为天冬氨酸、甘氨酸、赖氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、丝氨 酸、苏氨酸、组氨酸的任一者。3. 根据权利要求2所述的Fc结合性蛋白质，其中，包含序列号1中记载的氨基酸序列中 第17位至第192位为止的氨基酸残基，并且该第17位至第192位为止的氨基酸残基中至少序 列号1的第35位的酪氨酸置换为天冬酰胺或脯氨酸。4. 根据权利要求3所述的Fc结合性蛋白质，其中，包含序列号1中记载的氨基酸序列中 第17位至第192位为止的氨基酸残基，并且分别地、该第17位至第192位为止的氨基酸残基 中至少第27位的缬氨酸置换为谷氨酸、第35位的酪氨酸置换为天冬酰胺。5. 根据权利要求4所述的Fc结合性蛋白质，其包含序列号27、序列号31、序列号33、序列 号37、序列号41、序列号43、序列号47、序列号49的任一者中记载的氨基酸序列中第33位至 第208位为止的氨基酸残基。6. 根据权利要求5所述的Fc结合性蛋白质，其包含序列号27、序列号31、序列号33、序列 号37、序列号41、序列号43、序列号47、序列号49的任一者中记载的氨基酸序列。7. 根据权利要求1至6的任一项所述的Fc结合性蛋白质，进一步产生以下的(41)至(44) 中至少任一个氨基酸置换；（41)序列号1的第66位的亮氨酸置换为组氨酸或精氨酸，（42)序 列号1的第147位的甘氨酸置换为天冬氨酸，（43)序列号1的第158位的酪氨酸置换为组氨 酸，（44)序列号1的第176位的缬氨酸置换为苯丙氨酸。8. -种吸附剂，其是将权利要求1至7的任一项所述的Fc结合性蛋白质固定化于不溶性 载体而得到的。9. 一种抗体的纯化方法，其使用了权利要求8所述的吸附剂。10. -种具有糖链的抗体的纯化方法，其包括： 将包含具有糖链的抗体的溶液添加至权利要求8所述的吸附剂中并使该具有糖链的抗 体吸附于该吸附剂的工序;和 使用洗脱液将吸附于所述吸附剂的具有糖链的抗体洗脱的工序。11. 一种识别方法，其通过使用权利要求8所述的吸附剂分离抗体，从而识别抗体所具 有的糖链结构的差异。12. -种抗体，其是用权利要求9或10所述的纯化方法得到的。13. -种糖链的分离方法，其使用了权利要求8所述的吸附剂。14. 一种糖链，其是用权利要求13所述的分离方法得到的。15. -种多聚核苷酸，其编码权利要求1至7的任一项所述的Fc结合性蛋白质。16. -种表达载体，其包含权利要求15所述的多聚核苷酸。17. -种转化体，其是以权利要求16所述的表达载体转化宿主而得到的。18. 根据权利要求17所述的转化体，其中，宿主为大肠杆菌。19. 一种Fc结合性蛋白质的制造方法，通过对权利要求17或18所述的转化体进行培养 而使Fc结合性蛋白质表达，从培养物中回收表达的Fc结合性蛋白质。
【专利摘要】本发明第一课题在于提供Fc结合性蛋白质的稳定性、特别是对于热、酸的稳定性提高了的Fc结合性蛋白质、该蛋白质的制造方法、以及使用了该蛋白质的抗体吸附剂。进而，第二课题在于提供能够识别对于抗体有无附加糖链的方法以及该方法中使用的材料。通过介由将人FcγRIIIa中的、细胞外区域中特定位点的氨基酸残基置换为其他特定的氨基酸而对于热、酸的稳定性提高了的Fc结合性蛋白质、该蛋白质的制造方法以及使用了该蛋白质的抗体吸附剂，解决了第一课题。进而，通过使用将人FcγRIIIa固定化于不溶性载体而得到的、能够特异地吸附具有糖链的抗体的吸附剂，解决了第二课题。
【IPC分类】C07K1/22, C12P21/02, C12N1/21, C12N15/09, C07K14/735
【公开号】CN105555801
【申请号】CN201480051782
【发明人】朝冈義晴, 田中亨, 井出辉彦
【申请人】东曹株式会社
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2014年9月18日
【公告号】EP3048112A1
【技术领域】
[0001] 本发明设及对免疫球蛋白具有亲和性的Fc结合性蛋白质、使用了该蛋白质的抗体 吸附剂、W及使用了该吸附剂的抗体的纯化方法和识别方法。更详细而言，本发明设及对 热、酸的稳定性高于野生型的化结合性蛋白质、该蛋白质的制造方法W及将该蛋白质固定 化于不溶性载体而得到的抗体吸附剂。特别是，本发明设及能够特异地吸附抗体中具有糖 链的抗体的吸附剂、W及使用了该吸附剂的、具有糖链的抗体的纯化方法W及识别糖链有 无附加于抗体的方法。
【背景技术】
[0002] 化受体是与免疫球蛋白分子的化区域结合的一组分子。各个分子通过属于免疫球 蛋白超家族的识别结构域，利用Fc受体上的识别结构域识别单一或相同组的免疫球蛋白同 种型。由此决定免疫应答中何种辅助细胞起作用。Fc受体可进一步分类成几种亚型，有IgG (免疫球蛋白G)的受体即化丫受体、与I巧的化区域结合的Fee受体、与IgA的化区域结合的 Fca受体等。另外，各受体更详细地分类，Fc 丫受体有Fc 丫 RI、Fc 丫 RIIa、Fc 丫 Rllb和Fc 丫 RlllaJc 丫 Rinb 的存在被报导（非专利文献 l:Takai.T. Jpn.J.Clin. Immunol. ,28,318- 326,2005)〇
[0003] Fc 丫受体中Jc 丫 Rllla存在于自然杀伤细胞(NK细胞）、巨隧细胞等细胞表面，是 人免疫机构中参与十分重要的ADCC(抗体依赖性细胞损伤)活性的重要的受体。有报导称， 该Fc 丫 Rllla与人IgG的亲和性为表示结合强度的结合常数化A)为107M-1W下(非专利文献 2 :J. Galon 等，Eur.J. Immunol.，27,1928-1932,1997)。人 Fc 丫 Rllla 的氨基酸序列（序列号 1)被UniP;rot(Accession number :P08637)等公共数据库发布。另外，对于人Fc 丫 Rllla的结 构上的功能结构域、用于贯穿细胞膜的信号肤序列、细胞膜贯穿区域的位置，也同样被发 布。图1表示人化丫 Rllla的结构示意图。需要说明的是，图1中的氨基酸号对应于序列号1中 记载的氨基酸号。即，序列号1中的第1位的甲硫氨酸(Met)至第16位的丙氨酸(Ala)为止为 信号序列（S);第17位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酷胺(Gin)为止为细胞外区域化C); 第209位的鄉氨酸(Val)至第229位的鄉氨酸(化1)为止为细胞膜贯穿区域(TM)W及第230位 的赖氨酸化ys)至第254位的赖氨酸化ys)为止为细胞内区域(C)。需要说明的是，已知化丫 Rllla与IgGl至IgG4的人IgG亚类中特别是IgGl和IgG3强结合、而与IgG2和IgG4的结合弱。
[0004] 另一方面，近年来，利用单克隆抗体所具有的特异性的药物(抗体药物）的开发有 所进展。已知，报导了在抗体药物中所使用的人IgG中，根据化区域的第297位的天冬酷胺残 基上附加的N型糖链的差异，ADCC(抗体依赖性细胞损伤)活性变化，特别是用去除了作为糖 链的一种的岩藻糖的抗体，ADCC活性提高（非专利文献3: Shinkawa. T.，J. Biol. Chem.，278， 3466-3473,2003)。即，抗体药物中，抗体所具有的糖链结构具有重要的意义。然而，抗体药 物通常是使用W动物细胞作为宿主的基因重组技术而制造的，难W控制在宿主内附加于抗 体的糖链。另外，对制造的抗体的糖链进行分析需要很多时间和劳力。
[0005] 现有技术文献
[0006] 非专利文献
[0007] 非专利文献l:Takai.T. Jpn.J.Clin. Immunol.，28,318-326,2005 [000引 非专利文献2: J.Galon等，Eur. J. Immunol.，27，1928-1932，1997
[0009] 非专利文献3:aii址awa.T. J.Biol.Chem.，278，：M66-3473,2003
【发明内容】
[0010] 发明要解决的问题
[0011] 本发明的第一课题在于提供特别是对热、酸的稳定性提高了的Fc结合性蛋白质、 该蛋白质的制造方法、W及使用了该蛋白质的抗体吸附剂。进而，本发明的第二课题在于提 供能够识别对于抗体有无附加糖链的方法W及该方法中使用的材料。
[00。] 用于解决问题的方案
[0013] 本发明人等为了解决上述第一课题进行了深入研究的结果发现，确定了人Fc 丫 Rllla中的设及稳定性提高的氨基酸残基，并且将该氨基酸残基置换为其他的氨基酸残基 的突变体具有对热、酸优异的稳定性，至此完成了本发明。
[0014] 本发明人等为了解决上述的第二课题进行了深入研究的结果发现，通过使用将 IgG受体(化丫受体)之一的Fc 丫 Rllla固定化于不溶性载体而得到的吸附剂，能够识别有无 糖链附加于抗体，至此完成了本发明。
[0015] 旨P，本发明包含W下的(A)至(Z)中所述的方式：
[0016] (A)-种Fc结合性蛋白质，其包含序列号1中记载的氨基酸序列中由第17位至第 192位为止的氨基酸残基，并且该第17位至第192位为止的氨基酸残基中产生W下的（1)至 (40)中至少任一种氨基酸置换；
[0017] (1)序列号1的第18位的甲硫氨酸置换为精氨酸
[0018] (2)序列号1的第27位的鄉氨酸置换为谷氨酸
[0019] (3)序列号1的第29位的苯丙氨酸置换为亮氨酸或丝氨酸
[0020] (4)序列号1的第30位的亮氨酸置换为谷氨酷胺
[0021] (5)序列号1的第35位的酪氨酸置换为天冬氨酸、甘氨酸、赖氨酸、亮氨酸、天冬酷 胺、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、组氨酸的任一者
[0022] (6)序列号1的第46位的赖氨酸置换为异亮氨酸或苏氨酸
[0023] (7)序列号1的第48位的谷氨酷胺置换为组氨酸或亮氨酸
[0024] (8)序列号1的第50位的丙氨酸置换为组氨酸
[0025] (9)序列号1的第51位的酪氨酸置换为天冬氨酸或组氨酸
[0026] (10)序列号1的第54位的谷氨酸置换为天冬氨酸或甘氨酸
[0027] (11)序列号1的第56位的天冬酷胺置换为苏氨酸
[0028] (12)序列号1的第59位的谷氨酷胺置换为精氨酸
[0029] (13)序列号1的第61位的苯丙氨酸置换为酪氨酸
[0030] (14)序列号1的第64位的谷氨酸置换为天冬氨酸
[0031] (15)序列号1的第65位的丝氨酸置换为精氨酸
[0032] (16)序列号1的第71位的丙氨酸置换为天冬氨酸
[0033] (17)序列号1的第75位的苯丙氨酸置换为亮氨酸、丝氨酸、酪氨酸的任一者
[0034] (18)序列号1的第77位的天冬氨酸置换为天冬酷胺
[0035] (19)序列号1的第78位的丙氨酸置换为丝氨酸
[0036] (20)序列号1的第82位的天冬氨酸置换为谷氨酸或鄉氨酸
[0037] (21)序列号1的第90位的谷氨酷胺置换为精氨酸
[0038] (22)序列号1的第92位的天冬酷胺置换为丝氨酸
[0039] (23)序列号1的第93位的亮氨酸置换为精氨酸或甲硫氨酸
[0040] (24)序列号1的第95位的苏氨酸置换为丙氨酸或丝氨酸
[0041] (25)序列号1的第110位的亮氨酸置换为谷氨酷胺
[0042] (26)序列号1的第115位的精氨酸置换为谷氨酷胺
[0043] (27)序列号1的第116位的色氨酸置换为亮氨酸
[0044] (28)序列号1的第118位的苯丙氨酸置换为酪氨酸
[0045] (29)序列号1的第119位的赖氨酸置换为谷氨酸
[0046] (30)序列号1的第120位的谷氨酸置换为鄉氨酸
[0047] (31)序列号1的第121位的谷氨酸置换为天冬氨酸或甘氨酸
[0048] (32)序列号1的第151位的苯丙氨酸置换为丝氨酸或酪氨酸
[0049] (33)序列号1的第155位的丝氨酸置换为苏氨酸
[0050] (34)序列号1的第163位的苏氨酸置换为丝氨酸
[0051] (35)序列号1的第167位的丝氨酸置换为甘氨酸
[0052] (36)序列号1的第169位的丝氨酸置换为甘氨酸
[0053] (37)序列号1的第171位的苯丙氨酸置换为酪氨酸
[0054] (38)序列号1的第180位的天冬酷胺置换为赖氨酸、丝氨酸、异亮氨酸的任一者
[0055] (39)序列号1的第185位的苏氨酸置换为丝氨酸
[0056] (40)序列号1的第192位的谷氨酷胺置换为赖氨酸。
[0057] (B)根据(A)所述的Fc结合性蛋白质，其中，包含序列号1中记载的氨基酸序列中第 17位至第192位为止的氨基酸残基，并且该第17位至第192位为止的氨基酸残基中至少序列 号1的第35位的酪氨酸置换为天冬氨酸、甘氨酸、赖氨酸、亮氨酸、天冬酷胺、脯氨酸、丝氨 酸、苏氨酸、组氨酸的任一者。
[005引（C)根据(B)所述的Fc结合性蛋白质，其中，包含序列号1中记载的氨基酸序列中第 17位至第192位为止的氨基酸残基，并且该第17位至第192位为止的氨基酸残基中至少序列 号1的第35位的酪氨酸置换为天冬酷胺或脯氨酸。
[0059] (D)根据(C)所述的化结合性蛋白质，其包含序列号27、序列号31、序列号33、序列 号37、序列号41、序列号43、序列号47、序列号49的任一者中记载的氨基酸序列中由第33位 至第208位为止的氨基酸残基。
[0060] 化)根据(D)所述的化结合性蛋白质，其包含序列号27、序列号31、序列号33、序列 号37、序列号41、序列号43、序列号47、序列号49的任一者中记载的氨基酸序列。
[0061] (F)根据(A)至（C)的任一项所述的Fc结合性蛋白质，进一步产生W下的（41)至 (44)中至少任一个氨基酸置换；
[0062] (41)序列号1的第66位的亮氨酸置换为组氨酸或精氨酸
[0063] (42)序列号1的第147位的甘氨酸置换为天冬氨酸
[0064] (43)序列号1的第158位的酪氨酸置换为组氨酸
[0065] (44)序列号1的第176位的鄉氨酸置换为苯丙氨酸
[0066] (G)-种吸附剂，其是将(A)至(F)的任一项所述的化结合性蛋白质固定化于不溶 性载体而得到的。
[0067] 化)一种抗体的纯化方法，其使用了 (G)所述的吸附剂。
[0068] (I)-种识别方法，使用(G)所述的吸附剂分离抗体，从而识别抗体所具有的糖链 结构的差异。
[0069] (J) -种抗体，其是用化)所述的纯化方法得到的。
[0070] 化)一种糖链的分离方法，其使用了 (G)所述的吸附剂。
[0071] (L) -种糖链，其是用化)所述的分离方法得到的。
[0072] (M)-种多聚核巧酸，其编码(A)至(F)的任一项所述的化结合性蛋白质。
[0073] (N)-种表达载体，其包含(M)所述的多聚核巧酸。
[0074] (0)-种转化体，其是W(N)所述的表达载体转化宿主而得到的。
[0075] (P)根据(0)所述的转化体，其中，宿主为大肠杆菌。
[0076] (Q)-种化结合性蛋白质的制造方法，通过对(0)或(P)所述的转化体进行培养而 使Fc结合性蛋白质表达，从该培养物中回收表达的Fc结合性蛋白质。
[0077] (R) -种具有糖链的抗体的吸附剂，其是将人Fc 丫 Rllla固定化于不溶性载体而得 到的。
[007引（S)根据(R)所述的吸附剂，其中，人化丫 Rllla为包含序列号1中记载的氨基酸序 列中至少第17位的甘氨酸至第192位的谷氨酷胺为止的氨基酸残基的多肤。
[0079] (T)根据(R)所述的吸附剂，其中，人化丫 Rllla为包含序列号1中记载的氨基酸序 列中至少第17位的甘氨酸至第192位的谷氨酷胺为止的氨基酸残基，并且前述氨基酸残基 中的一个W上被其他的氨基酸残基置换、插入、或缺失了前述氨基酸残基中的一个W上的 多肤。
[0080] (U)根据(T)所述的吸附剂，其中，人化丫 Rllla为包含序列号1中记载的氨基酸序 列中至少第17位的甘氨酸至第192位的谷氨酷胺为止的氨基酸残基并且该第17位至第192 位为止的氨基酸残基中产生了 W下（i)至(iv)中至少任一种氨基酸置换的多肤。
[0081] (i)序列号1的第66位的亮氨酸置换为组氨酸或精氨酸
[0082] (ii)序列号1的第147位的甘氨酸置换为天冬氨酸
[0083] (iii)序列号1的第158位的酪氨酸置换为组氨酸
[0084] (iv)序列号1的第176位的鄉氨酸置换为苯丙氨酸
[0085] (V)-种具有糖链的抗体的纯化方法，其包括:将包含具有糖链的抗体的溶液添加 至(R)至化)的任一项所述的吸附剂中并使具有糖链的抗体吸附于该吸附剂的工序;和、使 用洗脱液将吸附于前述吸附剂的具有糖链的抗体洗脱的工序。
[0086] (W)-种抗体，其是用(V)所述的纯化方法得到的。
[0087] (X)-种识别方法，使用(R)至(U)的任一项所述的吸附剂来识别有无糖链附加于 抗体。
[0088] (Υ)-种糖链的分离方法，其使用了 (R)至化)的任一项所述的吸附剂。
[0089] (Z)-种糖链，其是用(Y)所述的分离方法得到的。
[0090] W下，对本发明详细地进行说明。
[0091] 本发明的Fc结合性蛋白质是具有与抗体的Fc区域的结合性的蛋白质，是包含含有 序列号1中记载的氨基酸序列的人Fc 丫 Rllla的细胞外区域(图1的EC的区域)中至少第17位 的甘氨酸至第192位的谷氨酷胺为止的氨基酸残基的蛋白质，是该第17位至第192位为止的 氨基酸残基中的特定位点产生了氨基酸置换的蛋白质。因此，本发明的化结合性蛋白质可 W包含位于细胞外区域的N末端侧的信号肤区域（图1的S)的全部或者一部分，也可W包含 位于细胞外区域的C末端侧的细胞膜贯穿区域（图1的TM)和细胞外区域（图1的C)的全部或 者一部分。前述特定位点中的氨基酸置换具体而言，是指序列号1中记载的氨基酸序列中下 述至少任一种置换:MetlSArg(该标记表示序列号1的第18位的甲硫氨酸置换为精氨酸，W 下相同）、Val27Glu、Phe29Leu、F*he29Se;r、Leu30Gln、Tyr35Asp、Tyr35Gly、Tyr35Lys、 Tyr35Leu、Tyr35Asn、Tyr35Pro、Tyr35Ser、Tyr35Thr、Tyr35His、Lys46Ile、Lys46Thr、 Gln48His、Gln48Leu、Ala50His、Tyr51Asp、Tyr51His、Glu54Asp、Glu54Gly、Asn56Thr、 Gln59Arg、Phe61Tyr、Glu64Asp、Ser65Arg、Ala71Asp、Phe75Leu、Phe75Ser、Phe75Tyr、 Asp77Asn、Ala78Se;r、Asp82Glu、Asp82Val、Gln90Arg、Asn92Se;r、Leu93Arg、Leu93Met、 Thr95Ala、Thr95Ser、LeullOGln、Argl15Gln、Trpl16Leu、Phell8Tyr、Lysl19Glu、 Glul20Val、Glul21Asp、Glul21Gly、Phel51Ser、Phel51Tyr、Serl55Thr、Thrl63Ser、 Se;rl67Gly、Se;rl69Gly、Phel71Ty;r、Asnl80Lys 'AsnlSOSer'AsnISOIle'ThrlSSSer、 61]11921^73。其中，产生了7的5439、了7扣5617、了7的化73、了7'351^611、了7'3543]1、了7'35口1'〇、 了7^556'、了7扣5化'、了7^5化3、6111121617中任一置换时，热稳定性提高，因而优选。另外， 已知野生型人Fc 丫 Rllla中有产生了Leu66His、Leu66Arg、Glyl47Asp、Tyrl58His或 Vall76化e的置换的突变体，但除了前述特定位点中的氨基酸置换W外，也可W含有运些氨 基酸置换。
[0092] 需要说明的是，通过进行氨基酸置换来制备本发明的化结合性蛋白质时，对于特 定位点的氨基酸残基，只要具有抗体结合活性，也可W置换为前述的氨基酸W外的氨基酸。 作为其一例，可列举出保守的置换即两氨基酸的物理性质和化学性质或者其一类似的氨基 酸间进行置换。对于本领域技术人员来说已知的是，保守的置换不限定于化结合性蛋白质， 通常在产生置换的蛋白质与没有产生置换的蛋白质之间维持了蛋白质的功能。作为保守的 置换的一例，可列举出甘氨酸与丙氨酸之间、天冬氨酸与谷氨酸之间、丝氨酸与脯氨酸之 间、或者谷氨酸与丙氨酸之间产生的置换（蛋白质的结构和功能，MEDICAL SCIENCES INTERNATIONA^LTD. ,9,2005)。
[0093] 本发明的化结合性蛋白质中，对于置换的氨基酸的个数没有特别的限制。作为一 例，可列举出W下的（a)至化)所示的Fc结合性蛋白质。运些Fc结合性蛋白质从对热和酸的 稳定性提高的观点出而优选。（a)包含序列号1中记载的氨基酸序列中第17位至第192位为 止的氨基酸残基，并且该第17位至第192位为止的氨基酸残基中产生Val27Glu和Tyr35Asn 的氨基酸置换的化结合性蛋白质(包含序列号27中记载的氨基酸序列中第33位至第208位 为止的氨基酸序列的Fc结合性蛋白质）。化)包含序列号1中记载的氨基酸序列中第17位至 第192位为止的氨基酸残基，并且该第17位至第192位为止的氨基酸残基中产生化127G1U、 Tyr35Asn和化e7化eu的氨基酸置换的Fc结合性蛋白质(包含序列号31中记载的氨基酸序列 中第33位至第208位为止的氨基酸序列的化结合性蛋白质）。山)包含序列号1中记载的氨基 酸序列中第17位至第192位为止的氨基酸残基，并且该第17位至第192位为止的氨基酸残基 中产生Val27Glu、Tyr35Asn、化e7化eu和Glul21Gly的氨基酸置换的化结合性蛋白质（包含 序列号33中记载的氨基酸序列中第33位至第208位为止的氨基酸序列的化结合性蛋白质）。 (d)包含序列号1中记载的氨基酸序列中第17位至第192位为止的氨基酸残基，并且该第17 位至第192位为止的氨基酸残基中产生了 ￥曰1276111、了7'354311、？}167化611、43119256'和 Glul21Gly的氨基酸置换的化结合性蛋白质(包含序列号37中记载的氨基酸序列中第33位 至第208位为止的氨基酸序列的Fc结合性蛋白质）。（6)包含序列号1中记载的氨基酸序列中 第17位至第192位为止的氨基酸残基，并且该第17位至第192位为止的氨基酸残基中产生 化127Glu、Tyr35Asn、Glu54Asp、Phe75Leu和Glul21Gly的氨基酸置换的Fc结合性蛋白质（包 含序列号41中记载的氨基酸序列中第33位至第208位为止的氨基酸序列的Fc结合性蛋白 质）。（門包含序列号1中记载的氨基酸序列中第17位至第192位为止的氨基酸残基，并且该 第17位至第192位为止的氨基酸残基中产生Val27Glu、Tyr35Asn、Glu54Asp、Phe75Leu、 Asn92Ser和Glul21Gly的氨基酸置换的化结合性蛋白质（包含序列号43中记载的氨基酸序 列中第33位至第208位为止的氨基酸序列的化结合性蛋白质）。（旨)包含序列号1中记载的氨 基酸序列中第17位至第192位为止的氨基酸残基，并且该第17位至第192位为止的氨基酸残 基中产生 ￥曰1276111、了7切54311、611154439、？}16751^611、6111120化1和6111121617的氨基酸置换 的Fc结合性蛋白质（包含序列号47中记载的氨基酸序列中第33位至第208位为止的氨基酸 序列的化结合性蛋白质）。化饱含序列号1中记载的氨基酸序列中第17位至第192位为止的 氨基酸残基，并且该第17位至第192位为止的氨基酸残基中产生Val27Glu、Tyr35Asn、 611154439、？}16751^611、43119256'、6111120￥日1和6111121617的氨基酸置换的。。结合性蛋白质 (包含序列号49中记载的氨基酸序列中第33位至第208位为止的氨基酸序列的化结合 性蛋 白质）。
[0094]本发明的吸附剂中作为配体使用的、人Fc 丫 Rllla的氨基酸序列（序列号1)被 化iP;rot(Accession number :P08637)等公共数据库所公开。另外，对于人化丫 Rllla的结构 上的功能结构域、用于贯穿细胞膜的信号肤序列、细胞膜贯穿区域的位置，也同样被发布。 图1表示人化丫 Rllla的结构示意图。需要说明的是，图1中的氨基酸号对应于序列号1中记 载的氨基酸号。即，序列号1中的第1位的甲硫氨酸(Met)至第16位的丙氨酸(Ala)为止为信 号序列（S);第17位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酷胺(Gin)为止为细胞外区域化C);第 209位的鄉氨酸(Val)至第229位的鄉氨酸(化1)为止为细胞膜贯穿区域(TM)W及第230位的 赖氨酸化ys)至第254位的赖氨酸化ys)为止为细胞内区域(C)。需要说明的是，本发明的吸 附剂中作为配体而使用的人化丫 Rllla并不一定需要使用人化丫 Rllla的全长(序列号1)， 只要是至少包含序列号1中记载的氨基酸序列中的第17位的甘氨酸至第192位的谷氨酷胺 为止的氨基酸残基的多肤即可。进而，包含序列号1中记载的氨基酸序列中的至少第17位的 甘氨酸至第192位的谷氨酷胺为止的氨基酸残基并且前述氨基酸残基中的一个W上被其他 的氨基酸残基置换、插入、或缺失了前述氨基酸残基中的一个W上的多肤，也包括在作为本 发明的吸附剂的且作为配体使用的人化丫 Rllla中。另外，已知天然型人化丫 Rllla中有第 66位的亮氨酸化eu)置换成组氨酸化is)或精氨酸(Arg)、第147位的甘氨酸(Gly)置换成天 冬氨酸(Asp)、第158位的酪氨酸(Tyr)置换成组氨酸化is)、或者第176位的鄉氨酸(Val)置 换成苯丙氨酸(Phe)的突变体，产生了至少任一个运些氨基酸置换的多肤也包括于作为本 发明的吸附剂的配体而使用的人Fc 丫 Rllla中。
[00%]本发明的化结合性蛋白质或作为吸附剂的配体的人化丫 Rllla也可W在其N末端 侧或C末端侧进一步附加在从杂质存在下的溶液中分离时有用的寡肤。作为前述寡肤，可列 举出多聚组氨酸、多聚赖氨酸、多聚精氨酸、多聚谷氨酸、多聚天冬氨酸等。另外，也可W将 在本发明的Fc结合性蛋白质或作为吸附剂的配体的人Fc 丫 Rllla固定化于色谱法用的支持 体等固相时有用的、包含半脫氨酸的寡肤附加于本发明的化结合性蛋白质或作为吸附剂的 配体的人Fc 丫 Rllla的N末端侧或C末端侧。对于Fc结合性蛋白质或作为吸附剂的配体的人 化丫 Rllla的N末端侧或C末端侧所附加的寡肤的长度，只要不有损作为本发明的化结合性 蛋白质或吸附剂的配体即人Fc 丫 Rllla的IgG结合性、稳定性，则没有特别的限制。可W在使 前述寡肤附加于本发明的化结合性蛋白质或作为吸附剂的配体的人化丫 Rllla时，制备编 码前述寡肤的多聚核巧酸之后，使用本领域技术人员公知的方法基因工程地附加在Fc结合 性蛋白质或人Fc 丫 Rllla的N末端侧或C末端侧，也可W使化学地合成的前述寡肤化学地结 合并附加于本发明的Fc结合性蛋白质或人Fc 丫 Rllla的N末端侧或C末端侧。进而，也可W在 本发明的化结合性蛋白质或吸附剂的配体即人化丫 Rllla的N末端侧附加用于促进在宿主 中的有效表达的信号肤。宿主为大肠杆菌的情况下的前述信号肤的例子，可例示出：PelB、 DsbA、Ma化(UniProt NO.P0AEX9中记载的氨基酸序列中第1位至第26位为止的区域）、Tod 等运样的使蛋白质分泌于周质的信号肤（日本特开2011-097898号公报）。
[0096] 作为本发明的多聚核巧酸的制备方法的一例，可例示出：（1)由本发明的化结合性 蛋白质或吸附剂的配体即人Fc 丫 Rllla的氨基酸序列转换成核巧酸序列，人工地合成包含 该核巧酸序列的多聚核巧酸的方法；（II)直接人工地制备包含Fc结合性蛋白质或人化丫 Rllla的整体或部分序列的多聚核巧酸，或者由化结合性蛋白质或人Fc 丫 Rllla的cDNA等使 用PCR法运样的DNA扩增法来制备包含Fc结合性蛋白质或人化丫 Rllla的整体或部分序列的 多聚核巧酸，用适当的方法将制备的该多聚核巧酸进行连接的方法。前述（I)的方法中，由 氨基酸序列转换成核巧酸序列时，优选考虑转化的宿主中的密码子的使用频率而进行变 换。作为一例，宿主为大肠杆菌化schericMa coli)的情况下，精氨酸(Arg)中的AGA/AGG/ CGG/CGA、异亮氨酸（11 e)中的ΑΤΑ、亮氨酸化eu)中的CTA、甘氨酸（G1 y)中的GGA、脯氨酸 (Pro)中的CCC由于分别使用频率少（由于是所谓的罕用密码子）、所W避开运些密码子而进 行更换即可。密码子的使用频率的解析也可W利用公共数据库（例如，Kazusa DM Research Insti1:ute的主页中的Codon Usage Da1:abase等）。
[0097] 对本发明的多聚核巧酸导入突变的情况下，可W使用易错聚合酶链反应(error- prone PCR)法。对于易错PCR法中的反应条件，只要是对编码人化丫 RI(或者化结合性蛋白 质）的多聚核巧酸导入所希望的突变的条件，则没有特别的限定;例如，将作为底物的4种脱 氧核巧酸(dATP/dTTP/dCTP/dGTP)的浓度设为不均匀、W0.01至1 OmM(优选为0.1至ImM)的 浓度向PCR反应液中添加 MnCl2而进行PCR，由此能够向多聚核巧酸中导入突变。另外，作为 易错PCR法W外的突变导入方法，可列举出如下方法:使包含人Fc 丫 RI的整体或部分序列的 多聚核巧酸与作为突变原的试剂接触?作用，或照射紫外线，从而向多聚核巧酸导入突变 来制备。作为该方法中作为突变原而使用的试剂，可W使用径基胺、N-甲基-Ν'-硝基-N-亚 硝基脈、亚硝酸、亚硫酸、阱等本领域技术人员通常使用的突变原性试剂。
[0098] 使用本发明的多聚核巧酸来转化宿主的情况下，可W使用本发明的多聚核巧酸其 自身，更优选使用在表达载体(例如，原核细胞、真核细胞的转化中通常使用的隧菌体、粘 粒、质粒等）的适当的位置插入本发明的多聚核巧酸的表达载体。需要说明的是，该表达载 体只要是能够在转化的宿主内稳定地存在并复制的物质则没有特别的限制，W大肠杆菌作 为宿主的情况下，可例示出：pET质粒载体、pUC质粒载体、pTrc质粒载体、pCDF质粒载体、 地BR质粒载体。另外，前述适当的位置是指不破坏设及表达载体的复制功能、所希望的抗生 素标记物、传递性的区域的位置。向前述表达载体中插入本发明的多聚核巧酸时，优选W与 表达所需要的启动子运样的功能性多聚核巧酸连接的状态插入。作为该启动子的例子，在 宿主为大肠杆菌的情况下，可列举出trp启动子、tac启动子、trc启动子、lac启动子、T7启动 子、recA启动子、Ipp启动子、进而λ隧菌体的APL启动子、λΡΚ启动子等。
[0099] 为了使用通过前述方法制备的插入了本发明的多聚核巧酸的表达载体下，作 为本发明的表达载体)来转化宿主，可W用本领域技术人员通常使用的方法进行。例如，作 为宿主选择属于Escherichia属的微生物(大肠杆菌JM109株、大肠杆菌化21 (DE3)株、大肠 杆菌W3110株等）的情况下，可W通过公知的文献(例如,Molecular Cloning,Cold Spring 化rbor Laboratory，256,1992)中记载的方法等进行转化。对于用前述的方法转化而得到 的转化体可W用适当的方法进行筛选，从而得到能够表达本发明的化结合性蛋白质的转化 体下，作为本发明的转化体）。需要说明的是，对于使本发明的化结合性蛋白质或吸附剂 的配体即人Fc 丫 RIIla表达的宿主，没有特别的限制;作为一例，可列举出：动物细胞(CH0细 胞、肥K细胞、Hela细胞、COS细胞等）、酵母（Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris、 Hansenula polymorpha、Schizosaccharomyces japonicus、Schizosaccharomyces octospo;rus、Schizosaccha;romycespombe等）、昆虫细胞（Sf9、Sf21等）、大肠杆菌（JM109 株、BL21 (DE3)株、W3110株等）、枯草杆菌。需要说明的是，使用动物细胞、大肠杆菌作为宿主 时，从生产率的方面出发而优选，进而优选使用大肠杆菌作为宿主。
[0100] 为了由本发明的转化体制备本发明的表达载体，从培养本发明的转化体而得到的 培养物中使用碱提取法或QIApr邱Spin Miniprep kit(QIAGEN制）等市售的提取试剂盒进 行制备即可。对本发明的转化体进行培养，由得到的培养物对本发明的化结合性蛋白质进 行回收，由此能够制造本发明的化结合性蛋白质。需要说明的是，本说明书中，培养物除了 指所培养的本发明的转化体的细胞自身W外，也包括培养中所使用的培养基。本发明的蛋 白质制造方法中所使用的转化体只要用适合于对象宿主培养的培养基进行培养即可，宿主 为大肠杆菌的情况下，作为优选的培养基的一例，可列举出添加了必要的营养源的LB (Luria-Bedani)培养基。需要说明的是，为了通过本发明载体有无导入来选择地使本发明 的转化体增殖，优选向培养基中添加对应于该载体所包含的药剂耐性基因的药剂而进行培 养。例如，该载体包含卡那霉素耐性基因的情况下，可W向培养基中添加卡那霉素。另外，培 养基中除了碳、氮和无机盐供给源之外，也可W添加适当的营养源，也可W根据需要含有选 自由谷脫甘肤、半脫氨酸、半脫胺、琉基乙酸盐和二硫苏糖醇组成的组的一种W上还原剂。 进而，也可W添加甘氨酸运样的促进由前述转化体向培养液分泌蛋白质的试剂;具体而言， 宿主为大肠杆菌的情况下，优选对培养基添加2% (w/v)W下的甘氨酸。宿主为大肠杆菌的 情况下，培养溫度通常为l〇°C至40°C、优选为20°C至37°C、更优选为25°C左右，根据表达的 蛋白质的特性进行选择即可。宿主为大肠杆菌的情况下，培养基的抑为抑6.8至抑7.4,优选 为PH7.0左右。另外，本发明的载体中含有诱导性的启动子的情况下，优选在本发明的化结 合性蛋白质能够良好表达的条件下实施诱导。作为诱导剂，可例示出IPTG (i S opr opy 1 -β-D- thiogalactopyranoside，异丙基-β-D-硫代半乳糖巧）。宿主为大肠杆菌的情况下，测定培 养液的浊度(600皿处的吸光度），成为约0.5至1.0时，添加适当量的IPTG之后，继续进行培 养，由此能够诱导化结合性蛋白质的表达。IPTG的添加浓度可W从0.005至l.OmM的范围适 宜选择，但优选为0.01至〇.5mM的范围。与IPTG诱导相关的各种条件按照该技术领域中公知 的条件进行即可。
[0101] 为了从培养本发明的转化体而得到的培养物中回收本发明的Fc结合性蛋白质，可 W采用适合于本发明的转化体中的本发明的化结合性蛋白质的表达形态的方法，从该培养 物中进行分离/纯化，从而回收本发明的化结合性蛋白质。例如，在培养上清中表达的情况 下，通过离屯、分离操作分离菌体，从得到的培养上清中纯化本发明的Fc结合性蛋白质即可。 另外，在细胞内（包括周质)表达的情况下，通过离屯、分离操作收集菌体之后，通过添加酶处 理剂、表面活性剂等而将菌体破碎，提取本发明的化结合性蛋白质之后进行纯化即可。为了 对本发明的化结合性蛋白质进行纯化，使用该技术领域中公知的方法即可，作为一例，可列 举出使用了液相色谱法的分离/纯化。液相色谱法中有离子交换色谱法、疏水性相互作用色 谱法、凝胶过滤色谱法、亲和色谱法等，通过组合运些色谱法进行纯化操作，从而能够高纯 度地制备本发明的化结合性蛋白质。作为测定得到的本发明的化结合性蛋白质的对IgG的 结合活性的方法，使用例如化zyme-Linked ImmunoSorbent Assay(W下，记为HJSA)法、表 面等离子共振法等测定对于IgG的结合活性。结合活性的测定中使用的IgG优选为人IgG，特 别优选为人IgGl、人IgG3。
[0102] 通过使本发明的化结合性蛋白质或人Fc 丫 Rllla与不溶性载体结合，能够制造本 发明的吸附剂。对于前述不溶性载体，没有特别的限定，可例示出：W琼脂糖、海藻酸盐 (alginate)、角叉菜胶、几下质、纤维素、糊精、葡聚糖、淀粉运样的多糖作为原料的载体；W 聚乙締醇、聚甲基丙締酸醋、聚（甲基丙締酸2-径基乙基醋）、聚氨醋运样的合成高分子作为 原料的载体；W二氧化娃等的陶瓷作为原料的载体。其中，优选W多糖作为原料的载体、W 合成高分子作为原料的载体作为不溶性载体。作为前述优选的载体的一例，可列举出： T0Y0PEA化(TOSOH C0RP0RATION制）等导入了径基的聚甲基丙締酸醋凝胶、Sephar0Se (GE Healthcare制）等琼脂糖凝胶、Cel luf ine (JNC Corporation.制）等纤维素凝胶。对于不溶 性载体的形状，没有特别的限定，可W是粒状物或非粒状物、多孔性或非多孔性的任一者。
[0103] 为了将化结合性蛋白质或人化丫 Rllla固定化于不溶性载体，对不溶性载体赋予 N-径基班巧酷亚胺(NHS)活性化醋基、环氧基、簇基、马来酷亚胺基、面代乙酷基、Ξ氣代乙 烧横酷基(Tresyl)、甲酯基面代乙酷胺等活性基团，通过该活性基团使人化结合性蛋白质 与不溶性载体共价结合而进行固定化即可。赋予了活性基团的载体可W直接使用市售的载 体;也可W在适当的反应条件下向载体表面导入活性基团而制备。作为赋予了活性基团的 市售的载体，可例示出：T0Y0PEA化 AF-Epoxy-650M、T0Y0PEARL AF-Tresyl-650M(均为 TOSOH CORPORATION制）、HiTrap NHS-activated HP Columns、NHS-activated S邱harose 4Fast Flow、Epoxy-activated Sepharose 6B(均为GE Healthcare审ij)、SulfoLink Coupling Resin(Thermo Scientific制）。
[0104] 另一方面，作为向载体表面导入活性基团的方法，可例示出：使存在于载体表面的 径基、环氧基、簇基、氨基等与具有2个W上活性部位的化合物的一者反应的方法。作为该化 合物的一例中，作为对载体表面的径基、氨基导入环氧基的化合物，可例示出：环氧氯丙烷、 乙二醇二缩水甘油基酸、下二醇缩水甘油基酸、己二醇二缩水甘油基酸。通过前述化合物对 载体表面导入环氧基之后，作为向载体表面导入簇基的化合物，可例示出：2-琉基乙酸、3- 琉基丙酸、4-琉基下酸、6-琉基下酸、甘氨酸、3-氨基丙酸、4-氨基下酸、6-氨基己酸。
[0105] 作为向载体表面存在的径基、环氧基、簇基、氨基导入马来酷亚胺基的化合物，可 例示出：Ν-(ε-马来酷亚胺己酸)酷阱、Ν-(ε-马来酷亚胺丙酸)酷阱、4-[4-N-马来酷亚胺苯 基]乙酸酷阱、2-氨基马来酷亚胺、3-氨基马来酷亚胺、4-氨基马来酷亚胺、6-氨基马来酷亚 胺、1-(4-氨基苯基)马来酷亚胺、1-(3-氨基苯基)马来酷亚胺、4-(马来酷亚胺)苯基异氯酸 醋、2-马来酷亚胺乙酸、3-马来酷亚胺丙酸、4-马来酷亚胺下酸、6-马来酷亚胺己酸、（N- [曰一马来酷亚胺乙酷氧基]班巧酷亚胺醋）、（马来酷亚胺间苯甲酯)N-径基班巧酷亚胺醋、 (班巧酷亚胺基-4-[马来酷亚胺甲基]环己烧-1-幾基-[6-氨基己酸])、（班巧酷亚胺基-4- [马来酷亚胺甲基]环己烧-1-簇酸）、（马来酷亚胺对苯甲酯)N-径基班巧酷亚胺醋、（马来酷 亚胺间苯甲酯)N-径基班巧酷亚胺醋。
[0106] 作为向载体表面存在的径基、氨基导入面代乙酷基的化合物，可例示出：氯代乙 酸、漠代乙酸、舰代乙酸、氯代乙酷氯、漠代乙酷氯、漠代乙酷漠、氯代乙酸酢、漠代乙酸酢、 舰代乙酸酢、2-(舰代乙酷胺）乙酸-N-径基班巧酷亚胺醋、3-(漠代乙酷胺)丙酸-N-径基班 巧酷亚胺醋、4-(舰代乙酷基)氨基苯甲酸-N-径基班巧酷亚胺醋。需要说明的是，还可例示 出使载体表面存在的径基、氨基与ω -締基烷基缩水甘油基酸反应之后，用面化剂将ω -締 基部位面化而进行活性化的方法。作为ω-締基烷基缩水甘油基酸，可例示出締丙基缩水甘 油基酸、3-下締基缩水甘油基酸、4-戊締基缩水甘油基酸;作为面化剂，可例示出Ν-氯代班 巧酷亚胺、Ν-漠代班巧酷亚胺、Ν-舰代班巧酷亚胺。
[0107] 作为向载体表面导入活性基团的方法的其他的例，有如下方法:对于载体表面存 在的簇基使用缩合剂和添加剂导入活性化基团的方法。作为缩合剂，可例示出1-乙基-3- (3-二甲基氨基丙基)碳二酷亚胺巧DC)、二环己基碳二酷亚胺、幾基二咪挫。另外，作为添加 剂，可例示出N-径基班巧酷亚胺(畑S)、4-硝基苯酪、1-径基苯并Ξ挫。
[0108] 作为将本发明的化结合性蛋白质或人化丫 Rllla固定化于不溶性载体时所使用的 缓冲液，可例示出：乙酸缓冲液、憐酸缓冲液、Μ E S ( 2 -吗嘟乙横酸；2- 1〇巧11〇1;[]1〇61:11曰]163111化]1；[03。1(1)缓冲液、肥阳5(2-[4-(2-径乙基）-1-赃嗦基]乙横酸；2- [4-(2-Hy化oxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonicacid)缓冲液、T;ris缓冲液、棚酸 缓冲液。对于固定化时的反应溫度，在考虑到活性基团的反应性、本发明的化结合性蛋白质 或人化丫 Rllla的稳定性的基础上，在5°C至50°C为止的溫度范围中适宜设定即可，优选为 10°C至35°C的范围。
[0109] 使用将本发明的化结合性蛋白质或人化丫 Rllla固定化于不溶性载体而得到的本 发明的吸附剂，为了对具有糖链的抗体进行纯化，例如，通过使用累等送液手段向填充了本 发明的吸附剂的柱添加包含具有糖链的抗体的缓冲液，使具有糖链的抗体特异地吸附于本 发明的吸附剂之后，向柱添加适当的洗脱液，从而洗脱具有糖链的抗体即可。需要说明的 是，能够用本发明的吸附剂纯化的具有糖链的抗体是与Fc结合性蛋白质或Fc 丫 Rllla等的 化受体具有亲和性的、至少包含具有糖链的抗体的Fc区域的抗体即可。作为一例，可列举 出：通常作为用于抗体药物的抗体所使用的嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、它们的氨基酸 置换体。另外，双特异性抗体(Bispecific antibody)、具有糖链的抗体的化区域与其他蛋 白质的融合抗体、具有糖链的抗体的Fc区域与药物的复合体(ADC)等人工地改变了结构的 抗体，也可W用本发明的吸附剂进行纯化。另外，向柱添加包含具有糖链的抗体的缓冲液之 前，使用适当的缓冲液对柱进行平衡化时，能够将具有糖链的抗体更高纯度地纯化，因而优 选。作为缓冲液，可例示出憐酸缓冲液等将无机盐作为成分的缓冲液，缓冲液的抑为pH3至 10,优选为抑5至8。
[0110] 为了将本发明的吸附剂所吸附的具有糖链的抗体洗脱，弱化具有糖链的抗体与配 体(本发明的Fc结合性蛋白质或人Fc 丫 Rllla)的相互作用即可，具体而言，可例示出由缓冲 液带来的pH变化、抗衡肤(counter peptide)、溫度变化、盐浓度变化。作为用于将本发明的 吸附剂所吸附的、具有糖链的抗体洗脱的洗脱液的具体例，可列举出：比使具有糖链的抗体 吸附于本发明的吸附剂时所使用的溶液更偏酸性侧的缓冲液。作为缓冲液的种类，可例示 出在酸性侧具有缓冲能力的巧樣酸缓冲液、甘氨酸盐酸缓冲液、乙酸缓冲液。对于缓冲液的 pH，可W在不有损抗体所具有的功能的范围设定即可，优选PH2.5至6.0,更优选PH3.0至 5.0,进而优选抑3.3至4.0。
[0111] 需要说明的是，从包含具有糖链的抗体的溶液中，使用本发明的吸附剂对前述抗 体进行纯化时，由于前述抗体所具有的糖链结构的差异，抗体的洗脱位置(洗脱级分)不同。 因此，通过使用本发明的吸附剂对抗体进行分离，能够识别抗体所具有的糖链结构的差异。 对于能够识别的糖链的结构，没有特别的限定，作为一例，可列举出：WCH0细胞运样的来自 动物的细胞或W毕赤酵母、酿酒酵母(Saccharomyces)运样的酵母为宿主使抗体表达时附 加的糖链;人抗体所具有的糖链；用化学合成法附加于抗体的糖链。另外，本发明的吸附剂 可W基于抗体所具有的糖链结构的差异进行分离，所W也可利用于糖链其自身的分离。
[0112] 需要说明的是，前面已提到了能够通过本发明的吸附剂识别抗体的糖链结构的差 异，作为该吸附剂所使用的配体蛋白质，使用了Fc 丫 RII la W外的Fc受体（Fc 丫 RI、Fc 丫 RIIa、Fc 丫 RHb、Fc 丫 RIHb、Fc化)的情况下，也能够同样地识别糖链结构的差异。
[0…]发明的效果
[0114] 本发明的化结合性蛋白质是将人化丫 Rllla的细胞外区域中的特定位点的氨基酸 残基置换为其他的氨基酸残基的蛋白质。本发明的化结合性蛋白质与野生型人化丫 Rllla 相比较，对于热和酸的稳定性提高了。因此，本发明的Fc结合性蛋白质作为用于分离免疫球 蛋白的吸附剂的配体是有 用的。
[0115] 另外，本发明是设及将人Fc 丫 Rllla固定化于不溶性载体而得到的吸附剂的发明； 前述吸附剂特异地吸附抗体中的具有糖链的抗体，因此能够简便地识别糖链有无附加于抗 体，运样的识别到目前为止是困难的。另外，通过使用本发明的吸附剂能够特异地纯化具有 糖链的抗体，因此能够有效率地制造具有糖链的抗体。
【附图说明】
[0116] 图1是人化丫 Rllla的示意图。图中的数字表示序列号1中记载的氨基酸序列的号。 图中的S表示信号序列;EC表示细胞外区域;TM表示细胞膜贯穿区域;C表示细胞内区域。
[0117] 图2是表示对置换了 1个氨基酸的化结合性蛋白质的抗体结合活性进行了评价的 结果的图。图中的野生型表示没有氨基酸置换的Fc结合性蛋白质。
[0118] 图3是表示对置换了 1个氨基酸的化结合性蛋白质的热稳定性进行了评价的结果 的图。图中的野生型表示没有氨基酸置换的Fc结合性蛋白质。
[0119] 图4是表示使用了FcR5a固定化凝胶的抗体的洗脱的色谱图。图中的Fr表示回收的 级分的位置。
[0120] 图5是表示附加于抗体的糖链结构的列表的图。图中的N1至N8对应于表10的N1至 N8; Ml和M2对应于表11的Ml和M2。
[0121] 图6是表示使用了化R5a固定化凝胶的抗体纯化的结果的图（SDS-PAGE)。分别地， (A)表示人IgGl的纯化结果；（B)表示人IgG3的纯化结果。
[0122] 图7是具有糖链的人IgGl (有糖链的人IgGl)与去除了糖链的人IgGl (去除糖链的 人IgGl)利用SDS-PAGE比较了分子量的图。图中的泳道（1)是具有糖链的人IgGl;泳道(2)是 去除了糖链的人IgGl。
[0123] 图8是将具有糖链的人IgGl和去除了糖链的人IgGl与人Fc 丫 RlllaW及蛋白A的结 合性进行了比较的图。(A)是人FcyRIIIa的结果；（B)是蛋白A的结果。
[0124] 图9是对于具有糖链的人IgGl和去除了糖链的人IgGl用本发明的吸附剂进行了分 离的结果。（1)是具有糖链的人IgGl的结果；（2)是去除了糖链的人IgGl的结果。
【具体实施方式】
[0125] 实施例
[0126] W下，为了对本发明进一步详细地进行说明示出了实施例，本发明并不限定于实 施例。
[0127] 实施例1化结合性蛋白质或人化丫 RIIla表达载体的制备
[012引（1)基于从序列号1中记载的人化丫 Rllla氨基酸序列中的第17位的甘氨酸(Gly) 至第192位的谷氨酷胺(Gin)为止的氨基酸序列，使用DNAworks法(Nucleic Acids Res.， 30，e43,2002)，设计将密码子由人型转换成大肠杆菌型的核巧酸序列。将设计的核巧酸序 列示于序列号2。
[0129] (2)为了制备包含序列号2中记载的序列的多聚核巧酸，合成包含序列号3至20中 记载的序列的寡核巧酸，使用前述寡核巧酸，进行下述所示的二阶段PCR。
[0130] (2-1)第一阶段的PCR:制备表1所示的组成的反应液，对该反应液在98°C下进行5 分钟热处理之后，在98°C下进行10秒的第1步骤、在62°C下进行5秒的第2步骤、在72°C下进 行90秒的第3步骤，将运3步骤作为1个循环的反应重复进行10个循环，合成多聚核巧酸，将 其作为化化1。需要说明的是，表1中的DNA混合物是指将具有序列号3至20中记载的序列的 18种寡核巧酸分别采集一定量进行混合而成的溶液。
[0131] [表 1]
[0132]
[0133] (2-2)第二阶段的PCR: W(2-l)中合成的FcRpl作为模板、将具有序列号21(5'- TAGCCATGGGCATGCGTACCGAAGATCTGCCGAAAGC-3'）和序列号 22(5'- CCCAAGCTTAATGATGATGATGATGATGGCCCCCTTGGGTAATGGTAATATTCACGGTCTCGCTGC-3'）中记载 的序列的寡核巧酸作为PCR引物进行实施。具体而言，制备表2所示组成的反应液，对该反应 液在98°C下进行5分钟热处理之后，在98°C下进行10秒的第1步骤、在62°C下进行5秒的第2 步骤、在72°C下进行1.5分钟的第3步骤，将运3个步骤作为1个循环的反应重复进行30循环 来头施。
[0134] [表 2]
[0135] _
[0136] ~(3)对(2)中得到的多聚核巧酸进行纯化，用限制酶Ncol和化ndin进行消化之后/ 与预先用限制酶化〇1和化ndin进行了消化的表达载体祀TMa化（日本特开2011-206046号 公报)连接，使用该连接产物转化大肠杆菌化21株(呢3)。
[0137] (4)对得到的转化体用包含50yg/mL的卡那霉素的LB培养基进行培养之后，使用 QIAprep Spin Miniprep kit(QIAGEN制），提取表达载体祀T-eFcR。
[0138] (5)在(4)中制备的表达载体祀T-eFcR中的编码人化丫 Rllla的多聚核巧酸及其周 边的区域中，基于链终止法而使用Big Dye Terminator Cycle Sequencing ready Reaction kit(The;rmo Fisher Scientific Inc.制）供于循环测序反应，利用全自动DNA sequencer ABI Prism 3700 DNA analyzer(Thermo Fisher Scientific Inc.制闲核巧 酸序列进行解析。需要说明的是，进行该解析时，使用具有序列号2 3 ( 5 ' - TAATACGACTCACTATAGGG-3 '）或序列号24 (5 ' -TATGCTAGTTATTGCTCAG-3 '）中记载的序列的寡 核巧酸作为测序用引物。
[0139] 分别地，将表达载体pET-eFcR表达的多肤的氨基酸序列示于序列号25中；将编码 该多肤的多聚核巧酸的序列示于序列号26中。需要说明的是，序列号25中，第1位的甲硫氨 酸(Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为Ma化信号肤;第27位的赖氨酸化ys)至第32位的甲 硫氨酸(Met)为止为连接子序列;第33位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酷胺(Gin)为止为 人化丫 Rllla的细胞外区域(序列号1的第17位至第192位为止的区域）；第209位至第210位 为止的甘氨酸(Gly)为连接子序列;第211位至第216位的组氨酸化is)为标签序列。
[0140] 实施例2向化结合性蛋白质导入突变W及基因文库的制备
[0141] 对于实施例1中制备的化结合性蛋白质表达载体祀R-eFcR中的编码化结合性蛋白 质的多聚核巧酸部分，通过易错PCR随机地实施突变导入。
[0142] (1)作为模板使用实施例1中制备的祀T-eFcR进行易错PCR。易错PCR如下进行:在 制备表3所示的组成的反应液之后，将该反应液在95°C下进行2分钟热处理、在95°C下进行 30秒的第1步骤、在60°C下进行30秒的第2步骤、在72°C下进行90秒的第3步骤，将运3步骤作 为1个循环的反应进行35循环，最后在72°C下进行7分钟热处理。通过前述易错PCR对编码化 结合性蛋白质的多聚核巧酸良好地导入突变，其平均突变导入率为1.26%。
[0143] [表 3]
[0144]
[0145] ~(2)对（1)中得到的PCR产物进行纯化之后，用限制酶Ncol和化ndlll进行消化，与' 预先用相同限制酶消化了的表达载体祀TMalE(日本特开2011-206046号公报)连接。
[0146] (3)连接反应结束之后，通过电穿孔法将反应液导入至大肠杆菌化2UDE3)株，用 包含50yg/mL的卡那霉素的LB平板培养基进行培养(37°C下18小时）之后，将形成于平板上 的菌落作为随机突变体基因文库。
[0147] 实施例3热稳定化Fc结合性蛋白质的筛选
[0148] (1)将实施例2中制备的随机突变体基因文库(转化体)接种于包含50yg/mL的卡那 霉素的2YT液体培养基(蛋白腺16g/L、酵母提取物lOg/L、氯化钢5g/L)200化，使用96孔深孔 平板在30°C下振荡培养一晚。
[0149] (2)培养之后，将扣L的培养液继续植入50化L的包含0.05mM的IPTG(isopropyl-f3- D-thiogalactopyranoside，异丙基-β-D-硫代半乳糖巧）、0.3%的甘氨酸和50yg/mL的卡那 霉素的2YT液体培养基中，使用96孔深孔平板，进一步在20°C下振荡培养一晚。
[0150] (3)培养之后，将通过离屯、操作得到的培养上清用包含150mM的氯化钢的20mM的 Tris盐酸缓冲液(PH7.4)稀释2倍。对于稀释后的溶液，在45°C下进行10分钟热处理。
[0151] (4)对于（3)的进行了热处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性、W及（3)的没 有进行热处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性，分别用下述所示的ELISA法进行测定， 将进行了热处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性除W没有进行热处理时的Fc结合性 蛋白质的抗体结合活性，从而计算出残留活性。
[0152] (4-1)将作为人抗体的丫-球蛋白制剂（The 化emo-Sero-Therapeutic Research Insti化te制）W化g/孔固定化(4°C下18小时)于96孔微孔平板的孔，固定化结束后，利用包 含2%(w/v)的SKIM MILK(抓公司制)和150mM的氯化钢的20mM的Tris盐酸缓冲液(PH7.4)进 行封闭(blocking)。
[0153] (4-2)用洗涂缓冲液(包含0.05%[w/v]的Tween 20、150mM的化Cl的20mM Tris- HCl缓冲液(pH7.4))进行洗涂之后，添加评价抗体结合活性的包含化结合性蛋白质的溶液， 使Fc结合性蛋白质与固定化Y-球蛋白反应(30°C下1小时）。
[0154] (4-3)反应结束后，用前述洗涂缓冲液进行洗涂，Κ?(Κ)μLν孔添加稀释至l(K)ng/mL 的Anti-6His抗体(Bethyl Laboratories公司制）。
[0155] (4-4)30°C下使之反应1小时，用前述洗涂缓冲液进行洗涂之后，W50化/孔添加 TMB化roxidase Substrate化化公司制）。通过W50化/孔添加1M的憐酸来停止显色，用酶 标仪(Tecan Japan制）测定450nm的吸光度。
[0156] (5)用(4)的方法对约2700株的转化体进行评价，从中选择表达与野生型（没有氨 基酸置换)Fc结合性蛋白质相比较热稳定性提高了的Fc结合性蛋白质的转化体。对于前述 选择的转化体进行培养，使用QIAprep Spin Miniprep kit(QIAGEN制）制备表达载体。
[0157] (6)对于得到的表达载体中所插入的编码化结合性蛋白质的多聚核巧酸区域的序 列，通过与实施例1(5)的记载同样的方法解析核巧酸序列，从而确定氨基酸的突变位点。
[0158] (5)中选择的转化体表达的化结合性蛋白质的、相对于野生型（没有氨基酸置换） 化结合性蛋白质的氨基酸置换位点W及热处理后的残留活性（％ )总结示于表4中。包含序 列号1中记载的氨基酸序列中的第17位的甘氨酸至第192位的谷氨酷胺为止的氨基酸残基 并且该第17位至第192位为止的氨基酸残基中产生MetlSArg(该标记表示序列号1的第18位 的甲硫氨酸置换为精氨酸，W下同样）、Val27Glu、Phe29LeuJhe29Ser、Leu30Gln、 Tyr35Asn、Tyr35Asp、Tyr35Ser、Tyr35His、Lys46Ile、Lys46Thr、Gln48His、Gln48Leu、 Ala50His、Tyr51Asp、Tyr51His、Glu54Asp、Glu54Gly、Asn56Thr、Gln59Arg、Phe61Tyr、 Glu64Asp、Ser65Arg、Ala71Asp、Phe75Leu、Phe75Ser、Phe75Tyr、Asp77Asn、Ala78Ser、 Asp82Glu、Asp82Val、Gln90Arg、Asn92Ser、Leu93Arg、Leu93Met、Thr95Ala、T'hr95Ser、 Leull0Gln、Argll5Gln、Trpll6LeuJhell8Tyr、Lysll9Glu、Glul20Val、Glul21Asp、 Glul21Gly、Phel51SerJhel51Tyr、Serl55Thr、Thrl63Ser、Serl67Gly、Serl69Gly、 Phel71Tyr、Asnl80Lys、Asnl80Ser、Asnl80Ile、Thrl85Ser、Glnl9 化 ys 的至少任一种氨基酸 置换的Fc结合性蛋白质与野生型的Fc结合性蛋白质相比较，可W说热稳定性提高了。
[0159] [表 4]
[0160]
[0161]将表4所示的进行了氨基酸置换的Fc结合性蛋白质中残留活性最高的产生了 化127G1U和Tyr35Asn的氨基酸置换的化结合性蛋白质命名为FcR2,将包含编码化R2的多聚 核巧酸的表达载体命名为祀T-FCR2。将化R2的氨基酸序列示于序列号27,将编码化R2的多 聚核巧酸的序列示于序列号28。需要说明的是，序列号27中，第1位的甲硫氨酸(Met)至第26 位的丙氨酸(Ala)为止为Ma化信号肤;第27位的赖氨酸化ys)至第32位的甲硫氨酸(Met)为 止为连接子序列；第33位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酷胺(Gin)为止为化R2的氨基酸 序列（相当于序列号1的第17位至第192位为止的区域）、第209位至第210位为止的甘氨酸 (Gly)为连接子序列；第211位至第216位的组氨酸化is)为标签序列。另外，序列号27中，分 别地、化127G1U的谷氨酸存在于第43位、Tyr35Asn的天冬酷胺存在于第51位的位点。
[0162] 实施例4氨基酸置换化结合性蛋白质的制备
[0163] 通过累积实施例3中判明的、与Fc结合性蛋白质的热稳定性提高相关的氨基酸置 换，谋求进一步的稳定性提高。置换氨基酸的累积主要使用PCR进行，制备W下(a)至(g)所 示的巧中Fc结合性蛋白质。
[0164] (a)对于化R2进一步进行了化e7化eu的氨基酸置换的化R3
[01化](b)对于化R2进一步进行了化e7化eu和Glul21Gly的氨基酸置换的化R4
[0166] (C)对于化34进一步进行了 Asn92Se;r的氨基酸置换的化尺5曰
[0167] (d)对于化R4进一步进行了 Glu54Asp的氨基酸置换的化R5b [016引 （e)对于化R5a进一步进行了 Glu54Asp的氨基酸置换的化R6a
[0169] (f)对于化R加进一步进行了 Glul2(Wal的氨基酸置换的化R6b
[0170] (g)对于化R&i进一步进行了 Glul2(Wal的氨基酸置换的化R7
[0171] W下，对于各化结合性蛋白质的制备方法详细地进行了说明。
[0172] (a)FcR3从实施例3中已经明确的、设及热稳定性提高的氨基酸置换中选择 Val27Glu、Tyr35Asn和化e7化eu，从而制备野生型的化结合性蛋白质中累积了运些置换的 FcR3。具体而言，对于编码FcR2的多聚核巧酸进行产生Phe75Leu的突变导入，从而制备 FcR3〇
[0173] (a-l)W实施例3中取得的祀T-FcR2为模板实施PCR。该PCR中的引物使用具有序列 号24和序列号29(5 ' -AGCCAGGCGAGCAGCTACCTTAT TGATGCG-3 '）中记载的序列的寡核巧酸。 PCR如下进行：制备表5所示组成的反应液之后，对该反应液在98°C下进行5分钟热处理，98 °C下进行10秒的第1步骤、55°C下进行5秒的第2步骤、72°C下进行1分钟的第3步骤，将运3步 骤作为1个循环的反应进行30循环，最后在72°C下进行7分钟热处理。将扩增的PCR产物供于 琼脂糖凝胶电泳，从该凝胶中使用QIAquick Gel Extraction kit(QIAGEN制)进行纯化。将 纯化的PCR产物作为m3F。
[0174] 敵]
[0175]
[0176] (a-2)将实施例3中取得的pET-FcR2作为模板、将具有序列号23和序列号30(5'- CCACCGTCGCCGCATCAATAAGGTAGCTGC-3 '）中记载的序列的寡核巧酸作为PCR引物，除此W外， 与(曰-1)同样地进行。将纯化的PCR产物作为m3R。
[0177] (a-3)将(a-1)和(a-2)中得到的巧巾PCR产物(m3F、m3R)混合，制备表6所示组成的 反应液。进行如下PCR:对该反应液在98°C下进行5分钟热处理之后，98°C下进行10秒的第1 步骤、55°C下进行5秒的第2步骤、72°C下进行1分钟的第3步骤，将运3步骤作为1个循环的反 应进行5循环，从而得到连接了 m3F和m3R的PCR产物m化。
[017 引[表 6]
[0179]
[0180] (a-4)将(a-3)中得到的PCR产物m化作为模板，将具有序列号23和序列号24中记载 的序列的寡核巧酸作为PCR引物，进行PCRdPCR如下进行：制备表7所示组成的反应液之后， 对该反应液在98°C下进行5分钟热处理，在98°C下进行10秒的第1步骤、在55°C下进行5秒的 第2步骤、在72°C下进行1分钟的第3步骤，将运3步骤作为1个循环的反应进行30循环。由此 制备编码对FcR2导入了 1位点氨基酸置换的FcR3的多聚核巧酸。
[0181] [表 7]
[0182] _
[0183] ~(a-5)对(a-4)中得到的多聚核巧酸进行纯化之后，用限制酶Ncol和化ndlll进行' 消化，与预先用限制酶Ncol和化ndlll进行了消化的表达载体pETMalE(日本特开2011- 206046号公报)连接，使用其转化大肠杆菌E.coli BL2UDE3)株。
[0184] (a-6)对得到的转化体用添加了 5(nyg/mL卡那霉素的LB培养基进行培养。通过从 回收的菌体(转化体）中提取质粒，从而得到包含编码化R3的多聚核巧酸的质粒祀T-FCR3， 所述FcR3是对野生型Fc结合性蛋白质进行了 3位点氨基酸置换的多肤。
[0185] (a-7)按照与实施例1(5)同样的方法进行祀T-FCR3的核巧酸序列的解析。
[0186] 将附加了信号序列和聚组氨酸标签的化R3的氨基酸序列示于序列号31、将编码前 述化R3的多聚核巧酸的序列示于序列号32。需要说明的是，序列号31中，第1位的甲硫氨酸 (Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为Ma化信号肤;第27位的赖氨酸化ys)至第32位的甲硫 氨酸(Met)为止为连接子序列；第33位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酷胺(Gin)为止为 FcR3的氨基酸序列(相当于序列号1的第17位至第192位为止的区域）、第209位至第210位为 止的甘氨酸(Gly)为连接子序列;第211位至第216位的组氨酸化is)为标签序列。另外，序列 号31中，分别地、Val27Glu的谷氨酸存在于第43位、Tyr35Asn的天冬酷胺存在于第51位、 化e7化eu的亮氨酸存在于第91位的位点。
[0187] (b)FcR4从实施例3中已经明确的、设及Fc结合性蛋白质的稳定性提高的氨基酸置 换中选择化127Glu、Tyr35Asn、化e7化eu和Glul21Gly，从而制备野生型的化结合性蛋白质 中累积了运些置换的化R4。具体而言，通过对编码化R2的多聚核巧酸进行产生化e7化eu和 Glul21Gly的突变导入来制备FcR4。
[018引（b-1)用与(a-1)同样的方法得到PCR产物m3F。另外，将实施例3中取得的、表达包 含Ala71Asp、Phe75Leu和Glul21Gly的氨基酸置换的Fc结合性蛋白质（表4)的质粒作为模 板，将具有序列号24和序列号29中记载的序列的寡核巧酸作为PCR引物，按照与(a-1)同样 的方法进行PCR，从而得到PCR产物m4R。
[0189] (b-2)将由（b-1)得到的巧帕CR产物(m3F、m4R)进行混合之后，按照与(a-3)同样的 方法进行PCR，将m3F和m4R连接。将得到的PCR产物作为m4p。
[0190] (b-3)将(b-2)中得到的PCR产物m4p作为模板、将具有序列号23和序列号24中记载 的序列的寡核巧酸作为PCR引物，按照与(a-4)同样的方法进行PCR。由此制备编码化R4的多 聚核巧酸。
[0191] (b-4)对(b-3)中 得到的多聚核巧酸进行纯化之后，用限制酶Ncol和化ndlll进行 消化，与预先用限制酶Ncol和化ndlll进行了消化的表达载体pETMalE(日本特开2011- 206046号公报)连接，使用其转化大肠杆菌E.coli BL2UDE3)株。
[0192] (b-5)对得到的转化体用添加了 50yg/mL卡那霉素的LB培养基进行培养。通过从回 收的菌体(转化体）中提取质粒，从而得到包含编码FcR4的多聚核巧酸的质粒祀T-FCR4,所 述FcR4是对野生型Fc结合性蛋白质进行了 4位点氨基酸置换的多肤。
[0193] (b-6)按照与实施例1 (5)同样的方法进行祀T-FCR4的核巧酸序列的解析。
[0194] 将附加了信号序列和聚组氨酸标签的化R4的氨基酸序列示于序列号33、将编码前 述化R4的多聚核巧酸的序列示于序列号34。需要说明的是，序列号33中，第1位的甲硫氨酸 (Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为Ma化信号肤;第27位的赖氨酸化ys)至第32位的甲硫 氨酸(Met)为止为连接子序列；第33位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酷胺(Gin)为止为 化R4的氨基酸序列（相当于序列号1的第17位至第192位为止的区域）、第209位至第210位为 止的甘氨酸(Gly)为连接子序列;第211位至第216位的组氨酸化is)为标签序列。另外，序列 号33中，分别地、Val27Glu的谷氨酸存在于第43位、Tyr35Asn的天冬酷胺存在于第51位、 化e7化eu的亮氨酸存在于第91位、Glul21Gly的甘氨酸存在于第137位的位点。
[01M] (c)FcR5a从实施例3中已经明确的、设及化结合性蛋白质的稳定性提高的氨基酸 置换中选择化127Glu、Tyr35Asn、陆e7化eu、Asn92Ser和Glul21Gly，从而制备野生型的化结 合性蛋白质中累积了运些置换的化R5a。具体而言，对于编码(b)中制备的化R4的多聚核巧 酸进行产生Asn92Ser的突变导入，从而制备化R5a。
[0196] (。-1)将（6)中制备的961'斗。1?4作为模板、将具有序列号22和序列号35(5'- GAATATCGTTGCCAGACCAGCCTGAGCACC-3 '）中记载的序列的寡核巧酸作为PCR引物，除此W外， 按照与(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为m5aF。
[0197] (。-2)将（6)中制备的961'-。。1?4作为模板、将具有序列号21和序列号36(5'- GATCGCTCAGGGTGCTCAGGCTGGTCTGGC-3 '）中记载的序列的寡核巧酸作为PCR引物，除此之外， 按照与(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为m5aR。
[019引 （C-3)将（C-1)和（C-2)得到的巧帕CR产物(mSaF'mSaR)混合之后，用与（a- 3)同样 的方法进行PCR，将m5aF和m5aR连接。将得到的PCR产物作为m5ap。
[0199] (C-4)将(C-3)中得到的PCR产物m5ap作为模板、将具有序列号21和序列号22中记 载的序列的寡核巧酸作为PCR引物，按照与(a-4)同样的方法进行PCR。由此制备编码化R5a 的多聚核巧酸。
[0200] (C-5)对(C-4)中得到的多聚核巧酸进行纯化之后，用限制酶Ncol和化ndlll进行 消化，与预先用限制酶Ncol和化ndlll进行了消化的表达载体pETMalE(日本特开2011- 206046号公报)连接，使用其转化大肠杆菌E.coli BL2UDE3)株。
[0201] (C-6)对得到的转化体用添加了 50yg/mL卡那霉素的LB培养基进行培养。通过从回 收的菌体(转化体）中提取质粒，从而得到包含编码化R5a的多聚核巧酸的质粒祀T斗cR5a， 所述FcR5a是对野生型Fc结合性蛋白质进行了 5位点氨基酸置换的多肤。
[0202] (C-7)按照与实施例1 (5)同样的方法进行祀T-FcR5a的核巧酸序列的解析。
[0203] 将附加了信号序列和聚组氨酸标签的化Rf5a的氨基酸序列示于序列号37、将编码 前述化R5a的多聚核巧酸的序列示于序列号38。需要说明的是，序列号37中，第1位的甲硫氨 酸(Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为Ma化信号肤;第27位的赖氨酸化ys)至第32位的甲 硫氨酸(Met)为止为连接子序列;第33位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酷胺(Gin)为止为 FcR5a的氨基酸序列（相当于序列号1的第17位至第192位为止的区域）、第209位至第210位 为止的甘氨酸(Gly)为连接子序列;第211位至第216位的组氨酸化is)为标签序列。另外，序 列号37中，分别地、Val27Glu的谷氨酸存在于第43位、Tyr35Asn的天冬酷胺存在于第51位、 化e7化eu的亮氨酸存在于第91位、Asn92Ser的丝氨酸存在于第108位、Glul21Gly的甘氨酸 存在于第137位的位点。
[0204] (d)FcR化从实施例3中已经明确的、设及化结合性蛋白质的稳定性提高的氨基酸 置换中选择化1276111、了7切54311、611154439、？}16751^611和6111121617，从而制备野生型的化结 合性蛋白质中累积了运些置换的化R5b。具体而言，对于编码(b)中制备的化R4的多聚核巧 酸进行产生Glu54Asp的突变导入，从而制备化R5b。
[0205] ((1-1)将（6)中制备的961'-。。1?4作为模板，将具有序列号22和序列号39(5'- CAGGGCGCGTATAGCCCGGATGATAACAGC-3 '）中记载的序列的寡核巧酸作为PCR引物，除此之外， 按照与(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为邮bF。
[0206] ((1-2)将（6)中制备的961'-。。1?4作为模板、将具有序列号21和序列号40(5'- CACTGGGTGCTGTTATCATCCGGGCTATAC-3 '）中记载的序列的寡核巧酸作为PCR引物，除此之外， 按照与(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为邮bR。
[0207] (d-3)将(d-1)和（d-2)中得到的巧帕CR产物(m5bF、m加 R)混合之后，用与（a-3)同 样的方法进行PCR，将m5bF和m5bR连接。将得到的PCR产物作为邮bp。
[020引（d-4)将(d-3)中得到的PCR产物m5bp作为模板、将具有序列号21和序列号22中记 载的序列的寡核巧酸作为PCR引物，按照与(a-4)同样的方法进行PCR。由此制备编码化R5b 的多聚核巧酸。
[0209] (d-5)对(d-4)中得到的多聚核巧酸进行纯化之后，用限制酶Ncol和化ndlll进行 消化，与预先用限制酶Ncol和化ndlll进行了消化的表达载体pETMalE(日本特开2011- 206046号公报)连接，使用其转化大肠杆菌E.coli BL2UDE3)株。
[0210] (d-6)对得到的转化体用添加了 50yg/mL卡那霉素的LB培养基进行培养。通过从回 收的菌体(转化体）中提取质粒，从而得到包含编码化R5b的多聚核巧酸的质粒祀T斗cR5b， 所述FcR5b是对野生型Fc结合性蛋白质进行了 5位点氨基酸置换的多肤。
[0211] (d-7)按照与实施例1 (5)同样的方法进行祀T-FcR化的核巧酸序列的解析。
[0212] 将附加了信号序列和聚组氨酸标签的化R加的氨基酸序列示于序列号41、将编码 前述化R5b的多聚核巧酸的序列示于序列号42。需要说明的是，序列号41中，第1位的甲硫氨 酸(Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为Ma化信号肤;第27位的赖氨酸化ys)至第32位的甲 硫氨酸(Met)为止为连接子序列;第33位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酷胺(Gin)为止为 FcR加的氨基酸序列（相当于序列号1的第17位至第192位为止的区域）、第209位至第210位 为止的甘氨酸(Gly)为连接子序列;第211位至第216位的组氨酸化is)为标签序列。另外，序 列号41中，分别地、Val27Glu的谷氨酸存在于第43位、Tyr35Asn的天冬酷胺存在于第51位、 Glu54Asp的天冬氨酸存在于第70位、Phe75Leu的亮氨酸存在于第91位、Glul21Gly的甘氨酸 存在于第137位的位点。
[0213] (e)FcR6a从实施例3中已经明确的、设及化结合性蛋白质的稳定性提高的氨基酸 置换中选择 乂日1276111、了7扣54311、611154439、？}16751^611、43119256'和6111121617，从而制备野 生型的化结合性蛋白质中累积了运些置换的FcR6a。具体而言，对于编码(C)中制备化R5a的 多聚核巧酸进行产生Glu54Asp的突变导入，从而制备FcR6a。
[0214] (e-1)将(C)中制备的祀T斗cR5a作为模板、将具有序列号22和序列号39中记载的 序列的寡核巧酸作为PCR引物，除此之外，按照与(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产 物作为m6aF。
[0215] (e-2)将(b)中制备的祀T-FcR4作为模板、将具有序列号21和序列号40中记载的序 列的寡核巧酸作为PCR引物，除此之外，按照与(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物 作为m6aR。
[0216] (e-3)将(e-1)和（e-2)中得到的巧tPCR产物(m6aF、m6aR)混合之后，用与(a-3)同 样的方法进行PCR，将m6aF和m6aR连接。将得到的PCR产物作为m6ap。
[0217] (e-4)将(e-3)中得到的PCR产物m6ap作为模板、将具有序列号21和序列号22中记 载的序列的寡核巧酸作为PCR引物，按照与(a-4)同样的方法进行PCR。由此制备编码化R6a 的多聚核巧酸。
[0218] (e-5)对(e-4)中得到的多聚核巧酸进行纯化之后，用限制酶Ncol和化ndlll进行 消化，与预先用限制酶Ncol和化ndlll进行了消化的表达载体pETMalE(日本特开2011- 206046号公报)连接，使用其转化大肠杆菌E.coli BL2UDE3)株。
[0219] (e-6)对得到的转化体用添加了 50yg/mL卡那霉素的LB培养基进行培养。通过从回 收的菌体(转化体）中提取质粒，从而得到包含编码化Rfe的多聚核巧酸的质粒祀T斗cR6a， 所述FcR6a是对野生型Fc结合性蛋白质进行了 6位点氨基酸置换的多肤。
[0220] (e-7)按照与实施例1 (5)同样的方法进行祀T-FcR6a的核巧酸序列的解析。
[0221] 将附加了信号序列和聚组氨酸标签的化R6a的氨基酸序列示于序列号43、将编码 前述化R6a的多聚核巧酸的序列示于序列号44。需要说明的是，序列号43中，第1位的甲硫氨 酸(Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为Ma化信号肤;第27位的赖氨酸化ys)至第32位的甲 硫氨酸(Met)为止为连接子序列;第33位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酷胺(Gin)为止为 FcR6a的氨基酸序列（相当于序列号1的第17位至第192位为止的区域）、第209位至第210位 为止的甘氨酸(Gly)为连接子序列;第211位至第216位的组氨酸化is)为标签序列。另外，序 列号43中，分别地、Val27Glu的谷氨酸存在于第43位、Tyr35Asn的天冬酷胺存在于第51位、 Glu54Asp的天冬氨酸存在于第70位、Phe75Leu的亮氨酸存在于第91位、Asn92Ser的丝氨酸 存在于第108位、Glul21Gly的甘氨酸存在于第137位的位点。
[0222] (f)FcR6b从实施例3中已经明确的设及Fc结合性蛋白质的稳定性提高的氨基酸置 换中选择化 1276111、了7切54311、611154439、？}16751^611、6111120￥日1和6111121617，从而制备野生 型的化结合性蛋白质中累积了运些置换的FcR6b。具体而言，对于编码(d)中制备的化R5b的 多聚核巧酸进行产生Glul2(Wal的突变导入，从而制备FcR6b。
[0223] 作-1)将（(1)中制备的961'斗。1?56作为模板、将具有序列号22和序列号45(5'- GTGTTCAAAGTGGGGGATCCGATTCATCTG-3 '）中记载的序列的寡核巧酸作为PCR引物，除此之外， 按照与(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为邮bF。
[0224] (f-2)将（d)中制备的pET-FcR5b作为模板、将具有序列号21和序列号46(5'- AATCGGATCCCCCACTTTGAACACCCACCG-3 '）中记载的序列的寡核巧酸作为PCR引物，除此之外， 按照与(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为邮bR。
[0225] (f-3)将(f-1)和（f-2)中得到的巧帕CR产物(m6bF、m化R)混合之后，用与（a-3)同 样的方法进行PCR，将邮bF和m6bR连接。将得到的PCR产物作为邮bp。
[0226] (f-4)将(f-3)中得到的PCR产物m6bp作为模板、将具有序列号21和序列号22中记 载的序列的寡核巧酸作为PCR引物，除此之外，按照与(a-4)同样的方法进行PCR。由此制备 编码FcR6b的多聚核巧酸。
[0227] (f-5)对(f-4)中得到的多聚核巧酸进行纯化之后，用限制酶Ncol和化ndlll进行 消化，与预先用限制酶Ncol和化ndlll进行了消化的表达载体pETMalE(日本特开2011- 206046号公报)连接，使用其转化大肠杆菌E.coli BL2UDE3)株。
[0228] (f-6)对得到的转化体用添加了 50yg/mL卡那霉素的LB培养基进行培养。通过从回 收的菌体(转化体）中提取质粒，从而得到包含编码化R6b的多聚核巧酸的质粒祀T斗cR6b， 所述FcR6b是对野生型Fc结合性蛋白质进行了 6位点氨基酸置换的多肤。
[0229] (f-7)按照与实施例1 (5)同样的方法进行祀T-FcR化的核巧酸序列的解析。
[0230] 将附加了信号序列和聚组氨酸标签的化R6b的氨基酸序列示于序列号47、将编码 前述化R6b的多聚核巧酸的序列示于序列号48。需要说明的是，序列号47中，第1位的甲硫氨 酸(Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为Ma化信号肤;第27位的赖氨酸化ys)至第32位的甲 硫氨酸(Met)为止为连接子序列;第33位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酷胺(Gin)为止为 FcR化的氨基酸序列（相当于序列号1的第17位至第192位为止的区域）、第209位至第210位 为止的甘氨酸(Gly)为连接子序列;第211位至第216位的组氨酸化is)为标签序列。另外，序 列号47中，分别地Val27Glu的谷氨酸存在于第43位、Tyr35Asn的天冬酷胺存在于第51位、 Glu54Asp的天冬氨酸存在于第70位、Phe75Leu的亮氨酸存在于第91位、Glul2(Wal的鄉氨酸 存在于第136位、Glul21Gly的甘氨酸存在于第137位的位点。
[0231] (g)FcR7从实施例3中已经明确的、设及Fc结合性蛋白质的稳定性提高的氨基酸置 换中选择 Val27Glu、Tyr35Asn、Glu54Asp、Phe75Leu、Asn92Ser、Glul20VaWPGlul21GlyJA 而制备野生型的Fc结合性蛋白质中累积了运些置换的化R7。具体而言，对于编码(e)中制备 的FcR&i的多聚核巧酸进行产生Glul2(Wal的突变导入，从而制备FcR7。
[0232] (g-1)将(e)中制备的祀T-FcR6a作为模板、将具有序列号22和序列号45中记载的 序列的寡核巧酸作为PCR引物，除此W外，按照与(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产 物作为m7F。
[02削 （g-2)将(e)中制备的祀T-FcR6a作为模板、将具有序列号21和序列号46中记载的 序列的寡核巧酸作为PCR引物，除此W外，按照与(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产 物作为m7R。
[0234] (g-3)将(g-1)和(g-2)中得到的巧帕CR产物(m7F、m7R)混合之后，用与(a-3)同样 的方法进行PCR，将m7F和m7R连接。将得到的PCR产物作为m7p。
[02对 （g-4)将(g-3)中得到的PCR产物m7p作为模板、将具有序列号21和序列号22中记载 的序列的寡核巧酸作为PCR引物，除此之外，进行与(a-4)同样的PCR。由此制备编码化R7的 多聚核巧酸。
[0236] (g-5)对(g-4)中得到的多聚核巧酸进行纯化之后，用限制酶Ncol和化ndlll进行 消化，与预先用限制酶Ncol和化ndlll进行了消化的表达载体pETMalE(日本特开2011- 206046号公报)连接，使用其转化大肠杆菌E.coli BL2UDE3)株。
[0237] (g-6)对得到的转化体用添加了 50yg/mL卡那霉素的LB培养基进行培养。通过从回 收的菌体(转化体）中提取质粒，从而得到包含编码FcR7的多聚核巧酸的质粒祀T-FCR7，所 述FcR7是对野生型Fc结合性蛋白质进行了 7位点氨基酸置换的多肤。
[0238] (g-7)按照与实施例1 (5)同样的方法进行祀T-FCR7的核巧酸序列的解析。
[0239] 将附加了信号序列和聚组氨酸标签的化R7的氨基酸序列示于序列号49、将编码前 述化R7的多聚核巧酸的序列示于序列号50。需要说明的是，序列号49中，第1位的甲硫氨酸 (Met)至第26位的丙氨酸(Ala)为止为Ma化信号肤;第27位的赖氨酸化ys)至第32位的甲硫 氨酸(Met)为止为连接子序列；第33位的甘氨酸(Gly)至第208位的谷氨酷胺(Gin)为止为 FcR7的氨基酸序列(相当于序列号1的第17位至第192位为止的区域）、第209位至第210位为 止的甘氨酸(Gly)为连接子序列;第211位至第216位的组氨酸化is)为标签序列。另外，序列 号49中，分别地、Val27Glu的谷氨酸存在于第43位、Tyr35Asn的天冬酷胺存在于第51位、 Glu54Asp的天冬氨酸存在于第70位、Phe75Leu的亮氨酸存在于第91位、Asn92Ser的丝氨酸 存在于第108位、Glul20Val的鄉氨酸存在于第136位、Glul21Gly的甘氨酸存在于第137位的 位点。
[0240] 实施例5改良化结合性蛋白质的热稳定性评价
[0241] (1)将表达实施例1中制备的野生型Fc结合性蛋白质、实施例3中选择的突变型化 结合性蛋白质（FcR2)和实施例4中制备的突变型的Fc结合性蛋白质（FcR3、FcR4、FcR5a、 Fc貼6^〇1?6曰^〇1?613^〇1?7)的转化体分别接种于包含504旨/1^卡那霉素的31^的2￥1'液体培 养基中，在37°C进行一晚好氧地振荡培养，由此进行前培养。
[0242] (2)向添加了 50yg/mL卡那霉素的20mL的2YT液体培养基（蛋白腺16g/L、酵母提取 物lOg/L、氯化钢5g/L)中接种前培养液2(K)yL，37°C下好氧地进行振荡培养。
[0243] (3)在培养开始1.5小时之后，将培养溫度变更为20°C，进行30分钟振荡培养。之 后，W终浓度成为0.0 lmM的方式添加 IPTG，接着在20°C下进行一晚好氧地振荡培养。
[0244] (4)培养结束后，通过离屯、分离进行集菌，使用BugBuster Protein exhaction kit (TAKARABIO INC.制)制备蛋白质提取液。
[0245] (5)使用实施例3(4)中记载的化ISA法测定(4)中制备的蛋白质提取液中的野生型 Fc结合性蛋白质和突变型的化结合性蛋白质的抗体结合活性。此时，使用市售的Fc 丫 Rllla 的细胞外区域(R&D Systems公司：4325-FC-050)制备标准曲线，进行浓度测定。
[0246] (6似各蛋白质的浓度成为扣g/mL的方式用包含150mM氯化钢的20mM的化is缓冲 液(pH7.4)进行稀释。对其进行等量分份，对一者使用热循环仪化ppendo计Japan制）在45 °C下进行10分钟加热处理;对另一者不进行热处理。通过实施例3(4)中记载的化ISA法测定 前述热处理之后、或非热处理的蛋白质的抗体结合活性，将进行了热处理后的抗体结合活 性除W没有进行热处理时的抗体结合活性，由此计算出残留活性。
[0247] 将结果示于表8。此次评价的突变型的化结合性蛋白质（FcR2、FcR3、FcR4JcR5a、 尸。尺56少。1?6曰、化1?613少。1?7)与野生型。(3结合性蛋白质相比较，残留活性变高，确认该突变型 的Fc结合性蛋白质的热稳定性提高。
[024引[表8] [0249]
[0250] 实施例6改良化结合性蛋白质的酸稳定性评价
[0251] (1)按照与实施例5(1)至(5)同样的方法制备改良化结合性蛋白质。
[0252] (2)W各蛋白质的浓度成为30yg/mL的方式用包含150mM氯化钢的20mM的化is缓冲 液(pH7.4)进行稀释。将稀释的各Fc结合性蛋白质60化和0.1M的甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.0) 120化混合，在30°C下静置2小时。
[0253] (3)利用实施例3(4)中记载的化ISA法，对利用甘氨酸盐酸缓冲液(PH3.0)进行酸 处理后的蛋白质的抗体结合活性、和没有进行前述酸处理时的蛋白质的抗体结合活性进行 测定。之后，将进行了酸处理后的抗体结合活性除W没有进行酸处理时的抗体结合活性，由 此计算出残留活性。
[0254] 将结果示于表9。此次评价的突变型的化结合性蛋白质（FcR2、FcR3、FcR4JcR5a、 尸。尺56少。1?6曰、化1?613少。1?7)与野生型。(3结合性蛋白质相比较，残留活性变高，确认该突变型 的Fc结合性蛋白质的酸稳定性提高。
[ο 巧 5][表 9]
[Ο 巧 6]
[0257] 实施例7进行了 1位点氨基酸置换的Fc结合性蛋白质的制备
[0258] 对于实施例3中已经明确的、设及化结合性蛋白质的稳定性提高的氨基酸置换中 的序列号1的第27位的鄉氨酸(Val)、第35位的酪氨酸(Tyr)和第121位的谷氨酸(Glu)置换 成其他氨基酸的Fc结合性蛋白质，分别用下述的方法进行制备。
[0259] (A)将序列号1的第27位的鄉氨酸(化1)置换成其他氨基酸的化结合性蛋白质的制 备
[0260] (A-1)将实施例1中制备的pET-eFcR作为模板、将具有序列号24和序列号51 (5 ' - CTGCCGAAAGCGNNKGTGTTTCTGGAACCG-3 '）中记载的序列的寡核巧酸作为PCR引物，除此之外， 按照与实施例4(a-l)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为27pF。
[0261] (A-2)将实施例1中制备的pET-eFcR作为模板、将具有序列号23和序列号52(5'- TTCCAGAAACACMNNCGCTTTCGGCAGATC-3 '）中记载的序列的寡核巧酸作为PCR引物，除此之外， 按照与实施例4(a-l)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为27pR。
[0262] (A-3)将(A-1)和(A-2)中得到的巧帕CR产物(27pF、27pR)进行混合之后，按照与实 施例4(a-3)同样的方法进行PCR，将27pF和27pR连接。将得到的PCR产物作为27p。
[02创 （A-4)将(A-3)中得到的PCR产物27p作为模板、将具有序列号23和序列号24中记载 的序列的寡核巧酸作为PCR引物，按照与实施例4(a-4)同样的方法进行PCR。由此，制备编码 将序列号1的第27位的鄉氨酸置换成任意氨基酸的Fc结合性蛋白质的多聚核巧酸。
[0264] (A-5)对(A-4)中得到的多聚核巧酸进行纯化之后，用限制酶Ncol和化ndlll进行 消化，与预先用限制酶Ncol和化ndlll进行了消化的表达载体pETMalE(日本特开2011- 206046号公报)连接，使用其转化大肠杆菌E.coli BL2UDE3)株。
[0265] (A-6)对得到的转化体用添加了50yg/mL卡那霉素的LB培养基进行培养。由回收的 菌体(转化体)提取质粒，按照与实施例1(5)同样的方法进行核巧酸序列解析。
[0%6]结果，得到编码产生了 Val27Gly(V27G)、Val27Lys(V27K)、Val27Thr(V27T)、 化127Ala(V27A)、化127T巧(V27W)或化127Arg(V27R)的氨基酸置换的Fc结合性蛋白质的多 聚核巧酸。
[0267] (B)将序列号1的第35位酪氨酸(Tyr)置换成其他氨基酸的化结合性蛋白质的制备
[0268] (B-1)将实施例1中制备的pET-eFcR作为模板、将具有序列号24和序列号53(5'- AACCGCAGTGGNNKCGCGTGCTGGAGAAAG-3 '）中记载的序列的寡核巧酸作为PCR引物，除此之外， 按照与实施例4(a-l)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为35pF。
[0269] (B-2)将实施例1中制备的pET-eFcR作为模板、将具有序列号23和序列号54(5'- AGCACGCGMNNCCACTGCGGTTCCAGAAAC-3 '）中记载的序列的寡核巧酸作为PCR引物，除此之外， 按照与实施例4(a-l)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为35pR。
[0270] (B-3)将(B-1)和(B-2)中得到的巧帕CR产物(35pF、35pR)进行混合之后，按照与实 施例4(a-3)同样的方法进行PCR，将35pF和35pR连接。将得到的PCR产物作为35p。
[0271] (B-4)将(B-3)中得到的PCR产物35p作为模板、将具有序列号23和序列号24中记载 的序列的寡核巧酸作为PCR引物，按照与实施例4(a-4)同样的方法进行PCR。由此，制备编码 将序列号1的第35位的酪氨酸置换成任意氨基酸的Fc结合性蛋白质的多聚核巧酸。
[0272] (B-5)对(B-4)中得到的多聚核巧酸进行纯化之后，用限制酶Ncol和化ndlll进行 消化，与预先用限制酶Ncol和化ndlll进行了消化的表达载体pETMalE(日本特开2011- 206046号公报)连接，使用其转化大肠杆菌E.coli BL2UDE3)株。
[0273] (B-6)对得到的转化体用添加了50yg/mL卡那霉素的LB培养基进行培养。由回收的 菌体(转化体)提取质粒，按照与实施例1(5)同样的方法进行核巧酸序列解析。
[0274] 结果，得到编码产生了Tyr35Cys(Y35C)、Tyr35Asp(Y35D)、Tyr35Phe(Y35F)、 Tyr35Gly(Y35G)、Tyr35Lys(Y35K)、Tyr3化eu(Y35L)、Tyr35Asn(Y35N)、Tyr35Pro(Y35P)、 Tyr35Arg(Y35R)、Tyr35Ser(Y35S) 'TyrfST'虹（Y35T)、Tyr35化 1 (Y35V)或Tyr35T巧（Y35W)的 氨基酸置换的Fc结合性蛋白质的多聚核巧酸。
[0275] (C)将序列号1的第121位的谷氨酸(Glu)置换成其他氨基酸的化结合性蛋白质的 制备
[0276] (C-1)将实施例1中制备的pET-eFcR作为模板、将具有序列号24和序列号55(5'- GTGTTCAAAGAGNNKGATCCGATTCATCTG-3 '）中记载的序列的寡核巧酸作为PCR引物，除此之外， 按照与实施例4(a-l)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为mpF。
[0277] (C-2)将实施例1中制备的pET-eFcR作为模板、将具有序列号23和序列号56(5'- AATCGGATCMNNCTCTTTGAACACCCACCG-3 '）中记载的序列的寡核巧酸作为PCR引物，除此之外， 按照与实施例4的(a-1)同样的方法进行PCR。将纯化的PCR产物作为mpR。
[027引（C-3)将(C-1)和(C-2)中得到的巧tPCR产物（12 IpF、121pR)进行混合之后，按照与 实施例4(a-3)同样的方法进行PCR，将mpF和mpR连接。将得到的PCR产物作为121ρ。
[0279] (C-4)将(C-3)中得到的PCR产物121ρ作为模板、将具有序列号23和序列号24中记 载的序列的寡核巧酸作为PCR引物，进行与实施例4(a-4)同样的PCR。由此，制备编码序列号 1的第121位的谷氨酸置换成任意的氨基酸的Fc结合性蛋白质的多聚核巧酸。
[0280] (C-5)对(C-4)中得到的多聚核巧酸进行纯化之后，用限制酶NcoI和化ndllI进行 消化，与预先用限制酶化01和化nd IΠ 消化的表达载体祀TMa化（日本特开2011 -206046号公 报)连接，使用其转化大肠杆菌E.coli BL2UDE3)株。
[0281] (C-6)对得到的转化体用添加了50yg/mL卡那霉素的LB培养基进行培养。由回收的 菌体(转化体)提取质粒，按照与实施例1(5)同样的方法进行核巧酸序列解析。
[0282] 结果，得到编码产生了Glul21Lys 化121K)、Glul21Pr〇ai21P)、Glul21Arg 化 121R)、Glul21Gly 化 121G)、Glul21His 化 121H)或 GI11I2I 化 KE121V)氨基酸置换的 Fc 结合 性蛋白质的多聚核巧酸。
[0283] 实施例8进行了 1个氨基酸置换的化结合性蛋白质的抗体结合活性评价
[0284] (1)对于表达实施例1中制备的野生型Fc结合性蛋白质和实施例7中制备的进行了 1个位点氨基酸置换的化结合性蛋白质的转化体，按照与实施例3(1)和(2)同样的方法分别 进行培养，使野生型Fc结合性蛋白质W及进行了 1个氨基酸置换的Fc结合性蛋白质表达。
[0285] (2)对于表达的进行了 1个氨基酸置换的Fc结合性蛋白质，按照与实施例3(4)中记 载的化ISA法检查与抗体的结合活性。
[0286] 将结果示于图2。通过将序列号1的第27位的鄉氨酸置换成甘氨酸(V27G)、赖氨酸 (V27K)、苏氨酸(V27T)、丙氨酸(V27A)、精氨酸(V27R)，与野生型Fc结合性蛋白质相比较，抗 体结合活性提高，另一方面，序列号1的第27位的化1置换成色氨酸(V27W)时，与野生型化结 合性蛋白质相比较，抗体结合活性降低。
[0287] 通过将序列号1的第35位的酪氨酸置换成天冬氨酸(Y35D)、苯丙氨酸(Y35F)、甘氨 酸(Y35G)、赖氨酸(Y35K)、亮氨酸(Y35L)、天冬酷胺(Y35N)、脯氨酸(Y35P)、丝氨酸(Y35S)、 苏氨酸(Y35T)、鄉氨酸(Y35V)、色氨酸(Y35W)置换，与野生型化结合性蛋白质相比较，抗体 结合活性提高。其中，Y35D、Y35G、Y35K、Y3化、Y35N、Y35P、Y35S、Y35T、Y35W与野生型化结合 性蛋白质相比较，抗体结合活性大幅地提高。另一方面，将序列号1的第35位的酪氨酸置换 成半脫氨酸(Y35C)、精氨酸(Y35R)的情况下，为与野生型化结合性蛋白质几乎同等的抗体 结合活性。
[0288] 通过将序列号1的第121位的谷氨酸置换成赖氨酸化12化）、精氨酸化121R)、甘氨 酸化121G)、组氨酸化121H)，与野生型Fc结合性蛋白质相比较，抗体结合活性提高。其中， E121G与野生型化结合性蛋白质相比较，抗体结合活性大幅地提高。另一方面，将序列号1的 第121位的谷氨酸置换成鄉氨酸化121V)的情况下，是与野生型Fc结合性蛋白质几乎同等的 抗体结合活性;置换成脯氨酸化121P)的情况下，与野生型Fc结合性蛋白质相比较，抗体结 合活性降低。
[0289] 实施例9进行了 1个氨基酸置换化结合性蛋白质的热稳定性评价
[0290] 为了对实施例8中评价的进行了 1个氨基酸置换的化结合性蛋白质的热稳定性进 行比较，按照与实施例3(3)同样的方法进行热处理(45°C、10分钟），计算出残留活性。
[0291] 将结果示于图3。将序列号1的第35位的酪氨酸分别置换为天冬氨酸(Y35D)、甘氨 酸(Y35G)、赖氨酸(Y35K)、亮氨酸(Y35L)、天冬酷胺(Y35N)、脯氨酸(Y35P)、丝氨酸(Y35S)、 苏氨酸（Y35T)的Fc结合性蛋白质，W及将序列号1的第121位的谷氨酸置换成甘氨酸 化121G)的化结合性蛋白质，与野生型化结合性蛋白质相比较热稳定性大幅地提高。其中， Y35N、Y35P与野生型Fc结合性蛋白质相比较，热稳定性大幅地提高。
[0292] 实施例10 FcR5a的大量制备
[0293] (1)将实施例4(c)中制备的表达FcR5a的转化体接种至加入至化的Ξ角瓶的包含 50yg/mL卡那霉素的400mL的2YT液体培养基(蛋白腺16g/L、酵母提取物lOg/L、氯化钢5g/L) 中，在37°C下好氧地振荡培养一晚，从而进行前培养。
[0294] (2)向包含葡萄糖lOg/L、酵母提取物20g/L、憐酸Ξ钢十二水合物3g/L、憐酸氨二 钢十二水合物9g/L、氯化锭Ig/L和硫酸卡那霉素50mg/L的液体培养基1.化中接种（1)的培 养液180mL，使用化发酵罐（Biott Corporation制）进行主培养。设定溫度30°C、pH6.9至 7.1、通气量1VVM、溶解氧浓度30 %饱和浓度的条件，开始主培养。为了控制抑，分别地，作为 酸使用50%憐酸、作为碱使用14%氨水，溶解氧的控制通过使揽拌速度变化来进行控制，揽 拌转速设定为下限5(Κ)巧m、上限lOOOrpm。培养开始后，在葡萄糖浓度变得不能测定的时点， 一边通过溶解氧(DO)进行控制一边加入流加培养基(葡萄糖248.9g/L、酵母提取物83.3g/ L、硫酸儀屯水合物7.2g/L)。
[0295] (3)作为菌体量的目标，600nm的吸光度(0D600nm)到达约150时，将培养溫度下降 至25°C，确认到达设定溫度之后，添加 IPTGW使终浓度成为0.5mM，接着在25°C下继续培养。
[0296] (4)在培养开始约48小时后停止培养，对培养液在4°C下进行8000巧m、20分钟的离 屯、分离，由此回收菌体。
[0297] (5)将(4)中回收的菌体的一部分用包含150mM氯化钢的20mM的Tris盐酸缓冲液 (抑7.4)W成为5mL/lg(菌体）的方式悬浊，使用超声波发生装置（Insoneta201M(商品名）、 久保田商事制），在4°C下W约10分钟、约150W的功率对菌体进行破碎。对于菌体破碎液，在4 °C下进行2次20分钟、lOOOOrpm的离屯、分离，回收上清。
[0298] (6)对(5)中得到的破碎液W终浓度成为20mM的方式添加咪挫之后，施加于预先用 包含150mM的氯化钢和20mM咪挫的20mM的Tris盐酸缓冲液（PH7.4)平衡化的填充了 Ni S邱harose 6Fast Flow(GE Healthcare制）50血的XK 26/20柱（GE Healthcare制）。用平衡 化中使用的缓冲液进行洗涂之后，使用包含150mM氯化钢和0.5M咪挫的20mM的化iS盐酸缓 冲液(PH7.4)洗脱 FcR5a。
[0299] (7)将(6)中得到的洗脱液施加于预先用包含150mM氯化钢的20mM的化is盐酸缓冲 液（PH7.4)平衡化的填充了 IgG琼脂糖凝胶（GE Healthcare制）30mL的HR 16/10柱（GE 化althcare制）。用平衡化中使用的缓冲液进行洗涂之后，用0.1M的甘氨酸盐酸缓冲液 (pH3.0)洗脱FcR5a。需要说明的是，洗脱液通过加入洗脱液量的1/4量1M化is盐酸缓冲液 (抑7.0)而使抑恢复至中性附近。
[0300] 实施例11 FcR5a固定化凝胶的制备
[0301 ] (1)对实施例 10制备的FcRf5a 使用超滤膜(Mill ipore Corporation制：Ami con 叫化al5)进行浓缩?缓冲液交换，用包含150mM氯化钢的20mM的化is盐酸缓冲液(pH7.4)浓 缩至8.37mg/mL的浓度。
[0302] (2)使作为载体的亲水性乙締基聚合物(TOSOH CORPORATION制：T0Y0PEA化）的径 基与1，6-己二醇二缩水甘油基酸反应来制备环氧基T0Y0PEA化凝胶。
[0303] (3)准备5根（2)中制备的加入了环氧基TOY0PEA化凝胶100化的吸附柱（SPiη column;Bi〇-Rad Laboratories, Inc.制），用包含0.5Μ氯化钢的0.1 M的棚酸缓冲液(ρΗ9.0) 〇.5mL洗涂3次。
[0304] (4)将（1)中制备的FcR5a溶液0.3mL与包含0.5M氯化钢的0.1M的棚酸缓冲液 (抑9.0)0.45mL混合，将混合溶液分别添加至（3)中记载的填充了凝胶的吸附柱，35°C下振 荡3小时。
[0305] (5)对向凝胶中加入的化貼a溶液与包含0.5M氯化钢的0.1M的棚酸缓冲液的混合 溶液进行回收之后，用0.1M的甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.0)0.2mL洗涂3次。之后，通过用包含 150mM氯化钢的20mMTris盐酸缓冲液(pH7.4)0.5mL洗涂3次使抑恢复至中性附近，从而制备 FcR5a固定化凝胶0.5mL。
[0306] 对于(5)中回收的溶液W及洗涂液中所包含的蛋白质浓度进行测定，计算出固定 化于凝胶的化貼曰的量，从而计算出固定化率，添加的化貼a的33.7 %固定化于凝胶。
[0307] 实施例12用化貼a固定化凝胶的抗体分离
[0308] (1)将实施例11中制备的化贴a固定化凝胶0.5mL填充于皿16/5柱(GE Healthcare 制），与AKTAprime plus(GE Healthcare制）相连接。之后，用包含150mM氯化钢的SOmMTris 盐酸缓冲液(pH7.4)进行平衡化。
[0309 ] (2)使包含150mM氯化钢的20mM的Tr i S盐酸缓冲液(pH7.4) W 0.1血的流速流动，用 包含150mM氯化钢的SOmMTris盐酸缓冲液(pH7.4)施加制备成Img/mL的人IgGl(Sigma公司 制：15154-1MG)溶液0.5mL，使人IgG 1吸附于化R5a固定化凝胶。之后，通过流过20mM乙酸缓 冲液(P册.0)进行平衡化，利用20mM的甘氨酸盐酸缓冲液(PH3.0)带来的抑梯度对吸附的人 IgGl进行洗脱。洗脱的人IgGl每0.5mL回收级分。
[0310] 将人IgGl的洗脱模式和回收的级分示于图4中。回收的洗脱级分中，将级分13 (化13)和级分14(Frl4)混合而成的物质称为级分A(FrA);将级分16(Frl6)和级分17(化17) 混合而成的物质称为级分B(化B)。
[0311] 实施例13分离抗体的糖链结构解析
[0312 ] (1)对实施例12中使用的纯化前的人I gG 1和洗脱级分(化A、FrB)利用100°C、10分 钟的热处理进行变性之后，用糖酷胺酶A/胃蛋白酶和链霉蛋白酶依次进行处理，经过利用 凝胶过滤法的纯化操作，取得糖链级分。
[0313] (2)将（1)中得到的糖链用蒸发器进行浓缩?干燥之后，在乙酸溶剂下使2-氨基化 晚、接着使二甲胺棚烧依次作用而制成巧光标记化糖链，利用凝胶过滤法进行纯化。
[0314] (3)对于（2)中得到的巧光标记化糖链用阴离子交换柱（TSKgel DEAE-5PW、Φ 7.5mm X 7.5cm: TOSOH CORPORATION制)分离成中性糖链级分和单唾液酸巧化糖链级分。
[0315] (4)对于(3)中得到的中性糖链级分和单唾液酸巧化糖链级分使用0DS柱分离成各 个糖链。通过MALDI-T0F-MS分析得到分离的糖链的分子量信息之后，对照0DS柱色谱的保留 时间（retention time)，匹配糖链结构。
[0316] 将中性糖链的组成比示于表10中，将单唾液酸巧化糖链的组成比示于表11中。另 夕h将匹配的糖链结构(N1至N8W及Ml至M2)示于图5。由表10所示的结果可知，具有糖链结 构N2和N7的抗体在纯化前W及在FrB中被检测出，但没有从FrA中被检测到。即，具有前述2 种糖链结构（图5的N2和N7)的抗体在作为早洗脱级分的FrA中没有被检测出，而在作为迟洗 脱级分的FrB中被检测出，因此表明与具有其他糖链结构的抗体相比较，与FcR5a固定化凝 胶强结合。由W上的结果可知，作为本发明的吸附剂的一形式的FcR5a固定化凝胶能够根据 抗体所具有的糖链结构的差异而分离出抗体。
[0引7][表 10]
[0321] 实施例14用化Rf5a固定化凝胶的抗体纯化
[0322] 使用实施例11中制备的化貼a固定化凝胶进行人IgGl和人IgG3的纯化。
[0；3Z3] (1)用与实施例11同样的方法制备化R5a固定化凝胶0.2血。将制备的化R5a固定化 凝胶O.lmL填充于吸附柱。
[0324] (2)将（1)中制备的填充了FcR5a固定化凝胶的柱用包含150mM氯化钢的20mM的 Tris盐酸缓冲液(pH7.4)0.5mL洗涂3次。
[0325] (3)对作为动物细胞用培养基的DMEM/F12培养基（Thermo Fisher Scientific Inc.制）中添加了 10%胎牛血清(FCS)的培养基，添加人IgGl(Sigma-Al化ich Co丄LC.制： I5154-1M G)或人IgG3(Sigma-Al化ich Co丄LC.制：I4639-1MG)W成为0.3mg/mL，从而制备 模拟培养液。
[0326] (4)对(2)中洗涂的柱加入(3)中制备的模拟培养液0.4mL，25°C下进行2小时振荡。
[0327] (5)去除模拟培养液，用包含150mM氯化钢的20mM的Tr i S盐酸缓冲液(pH7.4) 0.5mL 洗涂4次之后，用5(Κ)化的0.1 M的甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.0)进行洗脱，每1(Κ)化回收级分。
[0328] (6)对模拟培养液、洗脱级分分别添加2 X样品缓冲液(包含2 (w/v) %十二烷基硫 酸钢、6(>八）％0-琉基乙醇、1〇(>八）％甘油和〇.〇〇5(￥八）％漠酪蓝的5〇11^的化13盐酸缓冲 液（PH6.8))进行加热处理。之后，对处理的样品用使用了 5至20%梯度SDS-PAGE用凝胶 (ATT0 Corporation.制）的电泳进行分离。需要说明的是，作为比较，对于模拟培养液中添 加的人IgGl和人IgG3(浓度:0.2mg/mU也进行同样的处理，用SDS-PAGE进行分析。
[0329] 将包含人IgGl或人IgG3的洗脱级分的利用SDS-PAGE的分析结果示于图6。对添加 了人IgGl的模拟培养液进行纯化而得到的包含人IgGl的洗脱级分，显示出与模拟培养液中 所添加的人IgGl同样的位置，并且看不到模拟培养液中所看到的白蛋白的条带，所W能够 确认对人IgGl进行了高纯度地纯化（图6的(A))。另外，对添加了人IgG3的模拟培养液进行 纯化而得到的包含人IgG3的洗脱级分，显示出与模拟培养液中所添加的人IgG3同样的位 置，并且看不到模拟培养液中所看到的白蛋白的条带，所W能够确认对人IgG3进行了高纯 度地纯化（图6的(B))。由运些结果可知，作为本发明吸附剂的一形式的FcR5a固定化凝胶能 够从动物细胞用的培养液中纯化人IgGl和人IgG3。
[0330] 实施例15去除了糖链的人IgGl的制备
[0331] 用W下所示的方法进行从人IgGl中N型糖链的去除。
[0332] (1)W人IgGUFitzgerald公司制：31-AI17)的浓度成为3mg/mL的方式用包含 150mM氯化钢的20mM的Tris盐酸缓冲液(pH7.4)进行稀释。
[0333] (2)向（1)的稀释液100化中加入1M的Tris盐酸缓冲液（ρΗ8.6)100^，加入N- glycosidase F巧00mU/yL(TAKARABI0 INC.制:4450) 10化之后，在37°C下静置24小时，从而 去除IgGl的N型糖链。
[0334] (3)对预先用包含150mM氯化钢的20mMTris盐酸缓冲液(PH7.4)平衡化的填充了 Toyopearl AF-rProtein A-650F(T0S0H CORPORATION制：22803) 100化的开放柱（Bio-Rad Laboratories, Inc.制）施加（2)的处理液。
[0335] (4)用50化L的包含150mM氯化钢的20mM化is盐酸缓冲液(PH7.4)洗涂3次之后，用 100化的0.1M甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.0)洗脱7次，由此对去除了N型糖链的人IgGlm下，简 单地称为去除了糖链的人IgGl)进行纯化。需要说明的是，对该洗脱液通过加入洗脱液的1/ 4量的1M的化is盐酸缓冲液(P册.0)进行中和。
[0336] (5)对于(4)中得到的去除了糖链的人IgGl溶液添加等量的样品缓冲液(包含2(w/ V) %十二烷基硫酸钢、6(w/v) %β-琉基乙醇、10(w/v) %甘油和0.005(w/v) %漠酪蓝的50mM 的Tris盐酸缓冲液(P册.8))进行加热处理，对去除了糖链的人IgGl进行还原处理。
[0337] (6)利用使用了5至20%梯度SDS-PAGE用凝胶(ATT0 Corporation.制）的电泳对人 IgGl进行分离。需要说明的是，作为比较，对于没有进行糖链处理的人IgGUW下，称为有糖 链的人I gG 1)水溶液(浓度:0.5mg/mL)也进行与（5)的记载同样的还原处理，用SDS-PAGE进 行分离。
[0338] 将结果示于图7。通过SDS-PAGE能够确认的是，由于去除了糖链的人IgGl的重链被 去除了N型糖链，因此与有糖链的人IgGl的重链相比较，变为低分子量的（参照图7的泳道 (2))。即，可W确认，用本实施例的方法能够制备去除了N型糖链的人IgGl。
[0339] 实施例16人化丫 Rllla的大量制备
[0340] (1)将能够表达实施例1中得到的人Fc 丫 Rllla的转化体接种于加入至化的Ξ角瓶 中的包含50yg/mL卡那霉素的400mL的2YT液体培养基（蛋白腺16g/L、酵母提取物lOg/L、氯 化钢5g/L)，在37°C下好氧地振荡培养一晚，由此进行前培养。
[0%1] (2)向包含葡萄糖lOg/L、酵母提取物20g/L、憐酸Ξ钢十二水合物3g/L、憐酸氨二 钢十二水合物9g/L、氯化锭Ig/L和硫酸卡那霉素50mg/L的液体培养基1.化中接种（1)的培 养液180mL，使用化发酵罐进行主培养。设定溫度30°C、pH6.9至7.1、通气量1VVM、溶解氧浓 度30%饱和浓度的条件，开始主培养。为了控制抑，分别地，作为酸使用50%憐酸、作为碱使 用14%氨水，溶解氧的控制通过使揽拌速度变化来进行控制，揽拌转速设定为下限50化pm、 上限lOOOrpm。培养开始后，在葡萄糖浓度变得不能测定的时点，一边通过溶解氧(DO)进行 控制一边加入流加培养基(葡萄糖248.9g/L、酵母提取物83.3g/L、硫酸儀屯水合物7.2g/ Do
[CX342] (3)作为菌体量的目标，600nm的吸光度(0D600nm)到达约150时，将培养溫度下降 至25°C，确认到达设定溫度之后，添加 IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖巧使终浓度成为 0.5mM，接着在25°C下继续培养。
[0343] (4)在培养开始约48小时后停止培养，对培养液进行8000巧m、20分钟的离屯、分离， 由此回收菌体。
[0344] (5)将(4)中回收的菌体用包含150mM氯化钢的20mM的化i S盐酸缓冲液(pH7.4似 成为5mL/lg(菌体)的方式悬浊，使用超声波发生装置(Insoneta201M(商品名）、久保田商事 制），在4°C下W约10分钟、约150W的功率对菌体进行破碎。对于菌体破碎液，在4°C下进行2 次20分钟、10000巧m的离屯、分离，回收上清。
[0345] (6)对(5)中得到的破碎液W终浓度成为20mM的方式添加咪挫之后，施加于预先用 包含150mM的氯化钢和20mM咪挫的20mM的Tris盐酸缓冲液（PH7.4)平衡化的填充了 Ni Sepharose 6化31 Flow(GE Healthcare制）50mL的XK 26/20柱（GE Healthcare制）。
[0346] (7)用平衡化中使用的缓冲液进行洗涂之后，使用包含150mM氯化钢和0.5M咪挫的 20mM的化is盐酸缓冲液(pH7.4)洗脱人Fc 丫 Rllla。
[0347] (8)将(7)中得到的洗脱液施加于预先用包含150mM氯化钢的20mM的化is盐酸缓冲 液（PH7.4)平衡化的填充了 IgG琼脂糖凝胶（GE Healthcare制）10mL的HR 16/10柱（GE 化althcare制）。用平衡化中使用的缓冲液进行洗涂之后，用0.1M的甘氨酸盐酸缓冲液 (抑3.0)洗脱人化丫 RIIla。需要说明的是，洗脱液通过加入洗脱液量的1/4量1M化iS盐酸 缓冲液(P册.0)而使pH恢复至中性附近。
[0%引实施例17对人化丫 Rllla的抗体的结合性测定
[0349] (1)对实施例16中制备的人Fc 丫 Rllla用憐酸缓冲液(包含137mM的化CK8.1M的 Na2HP04、2.68mM的KC巧日1.47mM的K出Κ)4的pH7.4的缓冲液)进行透析来进行缓冲液交换，由 280nm的吸光度测定人Fc 丫 Rllla的浓度。
[0350] (2)将（1)中测定了浓度的人化丫 Rllla用20mM的乙酸缓冲液(P册.5)稀释至lOyg/ mL之后，使用胺偶联试剂盒(GE化althcare制）固定化于传感器忍片（Sensor化ip)CM5(GE Healthcare制），使用Biacore T-100(GE Healthcare制）对人化 丫 RIIla固定化量进行测 定。结果，人。(3丫1?111曰的固定化量为488.2抓（1抓=1口邑/1111112)。另外，对于蛋白4。1'〇16齡￥曰 Co.，Ltd.制）也同样地，用20mM的乙酸缓冲液（PH5.5)稀释至lOyg/mL，固定化于CM5(GE Healthcare制）。用Biacore T-100测定固定化量的结果，固定化量为290.0RU。
[0351] (3)将具有糖链的人IgGlW及实施例15中制备的去除了糖链的人IgGl用皿S-EP (+ )(包含lOmM的皿PES、150mM的化C1、3mM的抓TA和0.005(v/v) % 的SuWactant P20(GE Hea 1 thcar e制）的抑7.4的溶液）稀释至12祉g/血、6化g/mL、3化g/血、1化g/mL、祉g/mL、化g/ mL、2μ邑/mL、1μ邑/mL。
[0352] (4) (2)中制备的蛋白质固定化忍片中，人Fc 丫 RIIla固定化忍片的情况下，使化g/ mL至12祉g/mL的具有糖链的人IgGl或去除了糖链的人IgGl W流速30化/分钟流动;蛋白A固 定化忍片的情况下，使lyg/mL至16yg/mL的具有糖链的人IgGl或去除了糖链的人IgGlW流 速30化/分钟流动，使人IgGl与固定化于忍片的蛋白质结合之后，用Biacore T-100W接触 时间210秒、解离时间400秒的条件进行测定，从而测定人IgGl与固定化于忍片的蛋白质的 结合性。
[0353]将测定结果示于图8。可知，人Fc 丫 Rllla对于具有糖链的人IgGl具有结合性，而对 于去除了糖链的人IgGl则非常难W结合(参照图8(A))。即，由该结果可知，人化yRIIIa识 别由糖链对于抗体的附加导致的差异。另一方面，可知蛋白A无论糖链的有/无而对人IgGl 具有同样的结合性(参照图8(B))。
[0354]实施例18人Fc 丫 Rllla固定化凝胶的制备
[03巧](1)对实施例16中制备的人化丫 Rllla使用超滤膜(Millipore Corporation制： Amicon叫化al5)进行浓缩?缓冲液交换，用包含150mM氯化钢的20mM的化is盐酸缓冲液 (pH7.4)浓缩至2.6mg/mL的浓度为止。 惦56] (2)使作为载体的亲水性乙締基聚合物(TOSOH CORPORATION制：T0Y0PEA化）的径 基与1，6-己二醇二缩水甘油基酸反应来制备环氧基T0Y0PEA化凝胶。
[Ο%7] (3)将（2)中制备的环氧基T0Y0PEARL凝胶70化加入至吸附柱（Bio-Rad Laboratories，Inc .)，用包含0.5M氯化钢的0.1M的棚酸缓冲液(pH9.0)0.5mL洗涂3次。
[0358] (4)将（1)中制备的人化丫 Rllla溶液0.4mL与包含0.5M氯化钢的0.1M的棚酸缓冲 液(pH9.0)0.6mL混合，将该混合溶液添加至(2)的凝胶中，35°C下进行3小时振荡。
[0359] (5)将(4)中制备的凝胶用0.1M的甘氨酸盐酸缓冲液(P册.0)0.2mL洗涂3次之后， 用包含150mM氯化钢的20mM的Tri S盐酸缓冲液(pH7.4)0.5血洗涂3次，由此使抑恢复至中性 附近，从而制备人化丫 RIIIa固定化凝胶0.2mL。
[0360] (6)对向（2)的凝胶中所添加的溶液和洗涂液中所包含的蛋白质浓度进行测定，计 算出固定化于凝胶的人化丫 Rllla量，从而计算固定化率，结果添加的人化丫 Rllla的84% 被固定化于凝胶。
[0361] 实施例19使用了人化丫 Rllla固定化凝胶的抗体分离
[0362] (1)将实施例18中制备的人Fc 丫 Rllla固定化凝胶填充于HR16/5柱（GE Healthcare制），将该柱与液相色谱法装置AKTAp;rime(GE Healthcare制）连接。
[0363] (2)对（1)中制备的柱用包含150mM氯化钢的20mM的化iS盐酸缓冲液(pH7.4)进行 平衡化，W流速0.1 mL/min添加0.1 mL人IgGl (Fitzgerald公司制：31-AI17)或实施例2中制 备的去除了糖链的人IgGl(溶液浓度均为Img/mL)。用平衡化中所使用的缓冲液进行洗涂之 后，用0.1M的甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.5)进行洗脱。
[0364] 将结果示于图9。可W确认，尽管流过了等量的IgGl,去除了糖链的人IgGl(参照图 9的（2))与具有糖链的人IgGl(参照图9的（1))相比较，没有吸附于凝胶而通过的抗体量多。 另外，具有糖链的人IgGl中添加了0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液(pH3.5)时，抗体被洗脱了（参照 图9的（1))，而去除了糖链的人IgGl几乎没有吸附于凝胶，所W抗体没有被洗脱(参照图9的 (2))。即，将人Fc 丫 Rllla固定化于不溶性载体而得到的吸附剂具有能够特异地吸附具有糖 链的抗体的性能，通过利用该性能能够识别糖链有无附加于抗体。
[0365] 产业上的可利用性
[0366] 本发明的吸附剂特异地吸附具有糖链的抗体，因此能够高纯度地分离.纯化具有 糖链的抗体。因此，本发明的吸附剂可应用于抗体药物制造和品质管理。
【主权项】
1. 一种Fc结合性蛋白质，其包含序列号1中记载的氨基酸序列中第17位至第192位为止 的氨基酸残基，并且该第17位至第192位为止的氨基酸残基中产生以下的（1)至(40)中至少 任一种氨基酸置换； (1) 序列号1的第18位的甲硫氨酸置换为精氨酸 (2) 序列号1的第27位的缬氨酸置换为谷氨酸 (3) 序列号1的第29位的苯丙氨酸置换为亮氨酸或丝氨酸 (4) 序列号1的第30位的亮氨酸置换为谷氨酰胺 (5) 序列号1的第35位的酪氨酸置换为天冬氨酸、甘氨酸、赖氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、脯 氨酸、丝氨酸、苏氨酸、组氨酸的任一者 (6) 序列号1的第46位的赖氨酸置换为异亮氨酸或苏氨酸 (7) 序列号1的第48位的谷氨酰胺置换为组氨酸或亮氨酸 (8) 序列号1的第50位的丙氨酸置换为组氨酸 (9) 序列号1的第51位的酪氨酸置换为天冬氨酸或组氨酸 (10) 序列号1的第54位的谷氨酸置换为天冬氨酸或甘氨酸 (11) 序列号1的第56位的天冬酰胺置换为苏氨酸 (12) 序列号1的第59位的谷氨酰胺置换为精氨酸 (13) 序列号1的第61位的苯丙氨酸置换为酪氨酸 (14) 序列号1的第64位的谷氨酸置换为天冬氨酸 (15) 序列号1的第65位的丝氨酸置换为精氨酸 (16) 序列号1的第71位的丙氨酸置换为天冬氨酸 (17) 序列号1的第75位的苯丙氨酸置换为亮氨酸、丝氨酸、酪氨酸的任一者 (18) 序列号1的第77位的天冬氨酸置换为天冬酰胺 (19) 序列号1的第78位的丙氨酸置换为丝氨酸 (20) 序列号1的第82位的天冬氨酸置换为谷氨酸或缬氨酸 (21) 序列号1的第90位的谷氨酰胺置换为精氨酸 (22) 序列号1的第92位的天冬酰胺置换为丝氨酸 (23) 序列号1的第93位的亮氨酸置换为精氨酸或甲硫氨酸 (24) 序列号1的第95位的苏氨酸置换为丙氨酸或丝氨酸 (25) 序列号1的第110位的亮氨酸置换为谷氨酰胺 (26) 序列号1的第115位的精氨酸置换为谷氨酰胺 (27) 序列号1的第116位的色氨酸置换为亮氨酸 (28) 序列号1的第118位的苯丙氨酸置换为酪氨酸 (29) 序列号1的第119位的赖氨酸置换为谷氨酸 (30) 序列号1的第120位的谷氨酸置换为缬氨酸 (31) 序列号1的第121位的谷氨酸置换为天冬氨酸或甘氨酸 (32) 序列号1的第151位的苯丙氨酸置换为丝氨酸或酪氨酸 (33) 序列号1的第155位的丝氨酸置换为苏氨酸 (34) 序列号1的第163位的苏氨酸置换为丝氨酸 (35) 序列号1的第167位的丝氨酸置换为甘氨酸 (36) 序列号1的第169位的丝氨酸置换为甘氨酸 (37) 序列号1的第171位的苯丙氨酸置换为酪氨酸 (38) 序列号1的第180位的天冬酰胺置换为赖氨酸、丝氨酸、异亮氨酸的任一者 (39) 序列号1的第185位的苏氨酸置换为丝氨酸 (40) 序列号1的第192位的谷氨酰胺置换为赖氨酸。2. 根据权利要求1所述的Fc结合性蛋白质，其中，包含序列号1中记载的氨基酸序列中 第17位至第192位为止的氨基酸残基，并且该第17位至第192位为止的氨基酸残基中至少序 列号1的第35位的酪氨酸置换为天冬氨酸、甘氨酸、赖氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、丝氨 酸、苏氨酸、组氨酸的任一者。3. 根据权利要求2所述的Fc结合性蛋白质，其中，包含序列号1中记载的氨基酸序列中 第17位至第192位为止的氨基酸残基，并且该第17位至第192位为止的氨基酸残基中至少序 列号1的第35位的酪氨酸置换为天冬酰胺或脯氨酸。4. 根据权利要求3所述的Fc结合性蛋白质，其中，包含序列号1中记载的氨基酸序列中 第17位至第192位为止的氨基酸残基，并且分别地、该第17位至第192位为止的氨基酸残基 中至少第27位的缬氨酸置换为谷氨酸、第35位的酪氨酸置换为天冬酰胺。5. 根据权利要求4所述的Fc结合性蛋白质，其包含序列号27、序列号31、序列号33、序列 号37、序列号41、序列号43、序列号47、序列号49的任一者中记载的氨基酸序列中第33位至 第208位为止的氨基酸残基。6. 根据权利要求5所述的Fc结合性蛋白质，其包含序列号27、序列号31、序列号33、序列 号37、序列号41、序列号43、序列号47、序列号49的任一者中记载的氨基酸序列。7. 根据权利要求1至6的任一项所述的Fc结合性蛋白质，进一步产生以下的(41)至(44) 中至少任一个氨基酸置换；（41)序列号1的第66位的亮氨酸置换为组氨酸或精氨酸，（42)序 列号1的第147位的甘氨酸置换为天冬氨酸，（43)序列号1的第158位的酪氨酸置换为组氨 酸，（44)序列号1的第176位的缬氨酸置换为苯丙氨酸。8. -种吸附剂，其是将权利要求1至7的任一项所述的Fc结合性蛋白质固定化于不溶性 载体而得到的。9. 一种抗体的纯化方法，其使用了权利要求8所述的吸附剂。10. -种具有糖链的抗体的纯化方法，其包括： 将包含具有糖链的抗体的溶液添加至权利要求8所述的吸附剂中并使该具有糖链的抗 体吸附于该吸附剂的工序;和 使用洗脱液将吸附于所述吸附剂的具有糖链的抗体洗脱的工序。11. 一种识别方法，其通过使用权利要求8所述的吸附剂分离抗体，从而识别抗体所具 有的糖链结构的差异。12. -种抗体，其是用权利要求9或10所述的纯化方法得到的。13. -种糖链的分离方法，其使用了权利要求8所述的吸附剂。14. 一种糖链，其是用权利要求13所述的分离方法得到的。15. -种多聚核苷酸，其编码权利要求1至7的任一项所述的Fc结合性蛋白质。16. -种表达载体，其包含权利要求15所述的多聚核苷酸。17. -种转化体，其是以权利要求16所述的表达载体转化宿主而得到的。18. 根据权利要求17所述的转化体，其中，宿主为大肠杆菌。19. 一种Fc结合性蛋白质的制造方法，通过对权利要求17或18所述的转化体进行培养 而使Fc结合性蛋白质表达，从培养物中回收表达的Fc结合性蛋白质。
【专利摘要】本发明第一课题在于提供Fc结合性蛋白质的稳定性、特别是对于热、酸的稳定性提高了的Fc结合性蛋白质、该蛋白质的制造方法、以及使用了该蛋白质的抗体吸附剂。进而，第二课题在于提供能够识别对于抗体有无附加糖链的方法以及该方法中使用的材料。通过介由将人FcγRIIIa中的、细胞外区域中特定位点的氨基酸残基置换为其他特定的氨基酸而对于热、酸的稳定性提高了的Fc结合性蛋白质、该蛋白质的制造方法以及使用了该蛋白质的抗体吸附剂，解决了第一课题。进而，通过使用将人FcγRIIIa固定化于不溶性载体而得到的、能够特异地吸附具有糖链的抗体的吸附剂，解决了第二课题。
【IPC分类】C07K1/22, C12P21/02, C12N1/21, C12N15/09, C07K14/735
【公开号】CN105555801
【申请号】CN201480051782
【发明人】朝冈義晴, 田中亨, 井出辉彦
【申请人】东曹株式会社
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2014年9月18日
【公告号】EP3048112A1
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