医用或兽医用装置的表面修饰的制作方法
医用或兽医用装置的表面修饰的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及包含共价固定化且交联的琼脂糖涂层的医用或兽医用装置、其生产方 法和交联的琼脂糖涂层。
【背景技术】
[0002] 腹膜透析(peritoneal dialysis，PD)是用于患有严重肾病之患者的有效的居家 化ome-based)透析处理形式，并且其已在许多国家中用作血液透析的显著更低成本的替代 方案。然而，与导管相关的并发症可危害PD的成功，所述导管通常由娃酬制成。生物污着 (biofoulingKW蛋白质吸附和细胞黏附的形式)和微生物(细菌和真菌）附着到高度疏水 的娃酬表面上可导致网膜包裹(omental wrapping)和感染，运分别是PD流出失败的首要原 因和PD患者死亡的第二常见原因。此外，当与血液接触时，血小板黏附和活化诱导的血栓形 成可导致PD导管的腔内阻塞。可W认为PD导管是PD患者的"生命线"，并且导管相关的并发 症是广泛PD使用的首要障碍。自从在20世纪60年代中期引入了坦克霍夫导管(Tenckhoff catheter)，对新PD导管设计的开发尚未在降低感染和提高PD患者的生存率方面显示出令 人信服的改进。1因此，近些年来，对导管表面进行修饰W改进其防污着(antifouling)、抗 菌和血液相容性化emocompatible)特性已经吸引了越来越多的关注。2
[0003] 另一种类型的导管，中央静脉导管(通常由聚氨醋或娃酬制成)在临床上广泛用于 施用药物、抽取血液样品和血液透析处理。在运些留置导管的内部或外部上可容易地发生 微生物定殖，并且由使用此类血管接入装置导致的导管相关的血流感染（catheter- associated bloodstream infect ion, CABSI) 仍然是主要的临床问题， 对患者发病率 、死亡 率和医疗保健成本有不利影响。在使用留置导尿管(通常由尿娃酬制成）时出现类似的情 况，导尿管是医院和疗养院设施中的标准医用装置。导管相关的尿路感染（catheter- associated urinaiT tract infection, CAUTI) 是世界范围内最常见的医院获得性感染 化ospital-acquired infection)。因此，抑制微生物定殖的导管表面修饰将高度地有利于 抗击 CABSI 和 CAUTI。
[0004] 通过共价键合拴系功能性聚合物涂层为修饰导管表面性质提供了有效途径。合成 的亲水聚合物聚（乙二醇KPEG)及其衍生物是最广泛使用的防污着和抗菌材料。然而，PEG 受困于一些限制：PEG涂覆的表面由于其与蛋白质相互作用而不能将蛋白质吸附降低到非 常低的水平，并且它们在氧气和过渡金属离子的存在下易于氧化降解，运在体内限制了其 长期防污着和抗菌性能。已经广泛研究了另一些合成聚合物(例如聚（丙締酷胺）、聚(横基 甜菜碱甲基丙締酸醋）、3'4聚(簇基甜菜碱甲基丙締酸醋）和聚(拟肤））用作防污着涂层。天 然聚合物(与其来自石油化学制品的合成对应物相比）提供了有吸引力的替代。壳聚糖及其 衍生物是用于抗菌涂层的最广泛使用的天然聚合物，但是其防污着性能由于其与蛋白质的 强相互作用而受限。5已经报道常用的抗凝剂肝素化eparin，皿P)提供在体内和体外均可降 低感染的抗菌涂层。6然而，皿P的抗菌作用仍是有争议的。一些研究报道皿P不显著降低金 黄色葡萄球菌(S.aureus)的生物膜形成并且甚至可刺激该过程。7'8此外，已发现蛋白质降 解酶(例如链霉蛋白酶和α-膜凝乳蛋白酶)的固定化降低表面上的蛋白质吸附。9'w
[0005] 琼脂糖(agarose, AG)是中性的多糖，其来自琼脂。作为食品及药物管理局（Food and Drug Admiηi S化at ion，FDA)批准的成分，AG广泛地用于生物医学应用的多个领域，例 如神经再生、药物和基因递送W及牙印模(dental impression),原因是其生物相容性、稳 定性和惰性。在较早的报道中，膜或水凝胶形式的AG显示出对奇异变形杆菌（Proteus mirabilis)细菌黏附11和海洋污着(marine fouling)"的抵抗。
[0006] 目前，为了长期改善生物材料(例如娃酬、聚氨醋和铁)所缺乏的防污着、抗菌/抗 真菌和血液相容性特性，用共价固定化的天然聚合物涂层对其进行表面修饰。
【发明内容】
[0007] 根据本发明的第一方面，提供了医用或兽医用装置，所述装置在其表面的至少一 部分上包含共价固定化且交联的琼脂糖涂层。
[0008] 在本发明的一个优选实施方案中，所述涂层在生物材料表面(例如娃酬、聚氨醋或 铁表面)上提供，所述生物材料表面理想地为医用级生物材料表面。
[0009] 除了在金属表面，在生物材料表面修饰中频繁遇到的问题是疏水性恢复 化yho曲obic recove巧），运是由于生物材料聚合物的高柔性和低玻璃化转变溫度所造成 的疏水性生物材料链段和涂层聚合物的重定向和迁移引起的。
[0010] 因此，本文中提及的固定化且交联的涂层是防止聚合物材料的疏水性恢复和/或 相对于现有涂层来说稳定或具有改进的稳定性的涂层。因此，在本工作中，琼脂糖涂层被交 联W防止疏水性恢复并改善其稳定性。
[0011] 更优选地，所述涂层在所述装置与患者接触的至少一部分上提供。
[0012] 在本发明的另一个优选的实施方案中，通过引入W下对琼脂糖进行修饰W促进琼 脂糖涂层的共价固定化和交联:丙締酸醋、甲基丙締酸醋、（甲基)丙締酷胺、硅烷、硫醇、叠 氮化物、烘、乙締基化晚或乙締基咪挫基团或者运些基团的衍生物，例如但不限于：丙締酸 酢、甲基丙締酷氯、N-径乙基（甲基)丙締酷胺、1-2-簇乙基-4-乙締基化晚輪漠化物和1-径 乙基-3-乙締基咪挫11'漠化物W及本领域技术人员已知的其他衍生物。在一个实施方案 中，如此修饰的琼脂糖(例如丙締酸化的琼脂糖)用于所述涂层。
[0013] 作为替代或补充，所述涂层还包含肝素和理想地经修饰的肝素。最优选地，肝素用 W下进行修饰W使其被共价并入到交联的AG涂层中：甲基丙締酸醋、丙締酸醋、（甲基)丙締 酷胺、硅烷、硫醇、叠氮化物、烘、乙締基化晚或乙締基咪挫基团或者运些基团的衍生物，例 如但不限于丙締酸酢、甲基丙締酷氯、N-径乙基（甲基）丙締酷胺、1-2-簇乙基-4-乙締基化 晚備漠化物和1-径乙基-3-乙締基咪挫II漠化物W及本领域技术人员已知的其他衍生物。
[0014] 因此，理想地，用丙締酸醋基团（例如甲基丙締酸醋基团）修饰的皿P共价并入到交 联的AG层W进一步改进装置的血液相容性。
[0015] 更优选地，所述涂层为1至ΙΟμηι厚并且最优选为2、3、4或化m厚，如本文中所证明 的，2皿的涂层有效地实现期望的生物学特性，所W涂层理想地为2皿或约2皿。
[0016]更优选地，交联的琼脂糖涂层中肝素的量为1至15yg/cm2,最理想地为1、2、3、4或5 yg/cm2，更理想地为 1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、 2.5、2.6、2.7、2.8或2.化g/cm2,并且更优选2.化g/cm2。我们发现，如果固定化的肝素为2.化 g/cm2或约2.化g/cm2,则涂层(特别是琼脂糖组分)的蛋白质排斥特性得W保留。此外，如果 固定化肝素的表面浓度限制到为2.化g/cm2或约2.化g/cm2或更少，则琼脂糖和肝素的抗菌 效力将与单独琼脂糖没有显著差异。
[0017] 我们发现，当共价地固定化在医用级生物材料表面(例如，例如但不限于导管表面 (例如导尿管、腹膜透析导管或中央静脉导管）上提供的娃酬表面)上时，琼脂糖及还理 想地肝素)具有改善的抗菌、抗真菌、防污着和血液相容性特性。出人意料地，我们发现，与 原始(pristine)娃酬上的那些相比，在根据本发明的经琼脂糖修饰的表面上的革兰氏阴性 菌和革兰氏阳性菌二者的黏附和生物膜形成分别降低了 98%和>99%。无论下表面是否由 娃酬、聚氨醋或铁制成，均获得运些结果。经琼脂糖修饰的表面还抑制真菌生物膜的发生。 优选1、2、3、4或扣m厚的交联琼脂糖涂层，更理想地优选约2WI1厚的涂层，因为其在溶菌酶溶 液中老化30天之后并且还在高压灭菌之后是稳定的并且保持其抗微生物效力。此外，我们 发现，交联的琼脂糖涂层可有效地抵抗非特异性蛋白质吸附W及成纤维细胞和血小板黏 附。有利地，在涂层中共固定化(co-immobilization)约2.化g/cm2的肝素通过抑制血小板 活化、延长血浆复巧时间（plasma recalcification time,PRT)和降低溶血的程度进一步 改善了血液相容性，同时保持了涂层的防污着效力。
[0018] 根据本发明的第二方面，提供了用于制造医用或兽医用装置的方法，所述装置在 其表面的至少一部分上具有共价固定化且交联的琼脂糖涂层，所述方法包括：
[0019] i.使所述装置的表面氧化；
[0020] ii .将所述经氧化的表面暴露于经修饰的琼脂糖；W及
[0021 ] iii .使所述表面固化(curing)。
[0022] 在本发明的一个优选方法中，通过添加 W下对所述琼脂糖进行修饰:丙締酸醋、甲 基丙締酸醋、（甲基)丙締酷胺、硅烷、硫醇、叠氮化物、烘、乙締基化晚或乙締基咪挫基团、或 者本领域人员公知的运些基团的衍生物。
[0023] 在本发明的另一个优选方法中，氧化所述表面包括将所述表面暴露于氧等离子体 (oxygen plasma)或臭氧。作为替代或补充，使用利用气体(例如氣、氨、氮或氨)进行的等离 子体处理、然后暴露于空气来氧化所述表面。再次，所述表面可W使用电晕放电处理 (corona discharge treatment)或丫照射来氧化所述表面。
[0024] 在本发明的另一个优选方法中，将所述经氧化的表面暴露于经修饰的琼脂糖包 括:使用水溶液(例如丙締酸化琼脂糖的水溶液，通常但不排他地为5wt. % )并且理想地还 将该溶液涂覆在所述生物材料的表面上，理想地使用旋涂法(spin-coating procedure)或 通过将生物材料浸入溶液中。
[0025] 在本发明的另一个优选方法中，所述固化使用紫外(ultra violet,UV)光或加热 进行。理想地，固化在脱气环境中进行。在使用UV来固化表面的情况下，UV的量决定了固化 的量，并且我们发现，随UV照射时间延长(例如从15分钟至120分钟），经固定化的琼脂糖的 接枝密度提高。
[0026] 在本发明的另一个优选方法中，还将所述经氧化的表面暴露于经修饰的肝素。理 想地，使用丙締酸化琼脂糖和甲基丙締酸化肝素溶液的混合物。优选地，丙締酸化AG和/或 甲基丙締酸化肥P在溶液中的浓度为1至5wt%，理想地5wt. %。
[0027] 优选地，涂层中甲基丙締酸化肝素的量为约2.化g/cm2。根据本发明的另一方面， 提供了导管，所述导管在其表面的至少一部分上具有共价固定化且交联的琼脂糖涂层。
[0028] 根据本发明的另一方面，提供了导管，所述导管在其表面的至少一部分上具有共 价固定化且交联的琼脂糖和肝素涂层。
[0029] 在本发明的该方面中，所述肝素的浓度为约2.化g/cm2。
[0030] 在前述方面的任一项中，所述导管是腹膜透析导管或中央静脉导管或导尿管。
[0031] 根据本发明的另一方面，提供了适于防止细菌或真菌感染的医用或兽医用装置， 其包括如本文中所述的在其表面的至少一部分上具有共价固定化且交联的琼脂糖涂层的 医用装置。
[0032] 根据本发明的又一个方面，提供了适于防止网膜包裹的医用或兽医用装置，其包 括如本文中所述的在其表面的至少一部分上具有共价固定化且交联的琼脂糖涂层的医用 装置。
[0033] 根据本发明的另一方面，提供了如本文中所述的交联的琼脂糖涂层，其用于W共 价固定化的方式施加至医用或兽医用装置表面的至少一部分，来防止生物污着、细菌或真 菌感染。
[0034] 在本发明的所附权利要求书中和前述说明书中，除非上下文中因为语言表达或必 须暗示而另有说明，否则词语"包含"或变化形式例如"包括"或"含有"W包容性含义使用， 即列出所陈述特征的存在，但在本发明的各实施方案中不排除存在或添加另外的特征。
[0035] 在本说明书中引用的所有参考文献(包括任何专利或专利申请)通过引用并入本 文。不 承认任何参考文献构成现有技术。此外，不承认任何现有技术构成本领域公知常识的 一部分。
[0036] 本发明的各方面的优选特征可W结合任何其他方面进行描述。
[0037] 通过W下实施例，本发明的另一些特征将变得明显。一般而言，本发明延伸至本说 明书(包括所附权利要求书和附图）中所公开的特征中任意的新颖的一个特征或任意的新 颖的特征组合。因此，结合本发明的一个具体方面、实施方案或实施例描述的特征、整数、特 性、化合物或化学部分应理解为可应用于本文中所述的任何其他方面、实施方案或实施例， 除非与其不相容。
[0038] 此外，除非另有说明，本文中所公开的任何特征可被用于相同或相似目的的替代 特征所替换。
[0039] 本申请的整个说明书和权利要求书中，除非上下文中另有说明，否则没有数量词 修饰的名词表示一个/种或更多个/种。特别地，说明书中没有数量词修饰的名词应理解为 表示一个/种或更多个/种，除非上下文中另有说明。
[0040] 本申请的整个说明书和权利要求书中，琼脂糖表示为AG，并且肝素表示为肥P。
[0041] 现在通过举例且仅具体参考W下来描述本发明的一个实施方案，其中：
[00创主附图
[0043] 图1示意性地举例说明了娃酬表面的修饰，通过氧等离子体或臭氧处理在娃酬表 面上产生过氧化物和径基过氧化物，W充当用于随后AG聚合物链之固定化的错定位点（步 骤(1))，W及UV或加热诱导的丙締酸化AG和甲基丙締酸化肥P的固定化和交联(步骤(2))。
[0044] 图 2，（ a，a '）娃酬-g-AG4、（ b，b '）娃酬-g-HEP和（C，C '）娃酬-g-AG-HEP 1 膜的宽 扫描(widescan)和S化忍能级谱（core-level spectra)。插图示出对应膜的N Is忍能级 谱。在交联AG接枝的娃酬膜、娃酬-g-AG4的宽扫描谱中Si化和Si 2s信号的强度（图2(a)) 与原始娃酬膜的信号强度（图Sl(a))相比显著降低，表明AG成功地接枝到娃酬膜上。
[0045] 图3，（a)娃酬-g-AG4和(b)娃酬-g-AG-肥P1膜截面的FESEM图像。标尺条为1皿。
[0046] 图4,在暴露于金黄色葡萄球菌的PBS混悬液（108个细胞/mL)4个小时后，（a)原始 娃酬、（b)娃酬-g-AG4、k)娃酬-g-AG-HEP 1和(d)娃酬-g-HEP膜表面的SEM图像。标尺条为10 μηι。
[0047] 图5,在含有107个细菌细胞/mL的生长培养基中解育48小时后，（a-c)金黄色葡萄 球菌和(d-f)大肠杆菌化.coli)生物膜在(a，d)原始的、（b，e)娃酬-g-AG4和(c，f)娃酬-g- AG-肥P1膜上的沈Μ图像。标尺条为10皿。
[0048] 图6,在含有107个细菌细胞/mL的生长培养基中解育48小时后，通过涂布平板法 (spread plate method)确定在原始的和经修饰的膜表面上每cm2黏附的(a)金黄色葡萄球 菌和(b)大肠杆菌细胞的定量计数。*与原始娃酬相比的显著性差异(P<0.05)。#与各个所 制备的膜相比的显著性差异(P<〇.05)。
[0049] 图7,在含有107个细菌细胞/mL的生长培养基中解育48小时后，（a)原始铁锥、（b) AG修饰的铁锥、（C)AG-皿P修饰的铁锥、（d)原始聚氨醋膜、（e)AG修饰的聚氨醋膜和(f )AG- 肥P修饰的聚氨醋膜上大肠杆菌生物膜的沈Μ图像。标尺条为lOwii。
[0050] 图8，用1. Omg/mL的纯蛋白质溶液处理膜4小时后，在原始娃酬、娃酬-g-AG4、娃酬- g-AG-肥P1和娃酬-g-HEP膜上的BSA和FBG吸附。*与原始娃酬相比的显著性差异（P< 0.05)。
[0051] 图9,用3T3成纤维细胞(2X105个细胞/mL)解育24小时后，（a)原始娃酬、（b)娃酬- g-AG4、（c)娃酬-g-AG-皿Pl和(d)娃酬-g-皿P膜表面的光学显微术图像。标尺条为100皿。 (e)使用MTT测定定量分析每cm2膜表面黏附的3T3成纤维细胞。*与原始娃酬相比的显著性 差异(P<0.05)。
[0052] 图10,用富血小板血浆(platelet-rich plasma)解育1小时后，（a)原始娃酬、（b) 娃酬-g-AG4、（ C)娃酬-g-AG-皿P1和(d)娃酬-g-肥P膜表面的沈Μ图像。（a-d)及其插图中的 标尺条分别为10皿和扣m"(e)相对于原始娃酬表面，经修饰的娃酬表面上的血小板黏附。* 与原始娃酬相比的显著性差异(P<〇.05)。
[0化3 ] 图11，在原始娃酬、娃酬-g-AG4、娃酬-g-AG-肥P1和娃酬-g-肥P膜表面上的(a) PRT 和(b)溶血程度。*与原始娃酬相比的显著性差异(P<0.05)。
[0054] 补充附图
[0055] 图S1，原始娃酬膜的XPS(a)宽扫描和(a'）S化忍能级谱。（曰'）的插图示出原始娃 酬的N Is忍能级谱。
[0056] 图S2，UV诱导的接枝时间对娃酬-g-AG膜上黏附的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌细 胞之数目的影响。在暴露于各细菌的PBS混悬液（108个细胞/mU4小时后，使用涂布平板法 定量膜表面上黏附的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌细胞的数目。
[0057] 图S3,固定化肝素的浓度对娃酬-g-AG-皿P膜上黏附的金黄色葡萄球菌之数目的 影响。在暴露于金黄色葡萄球菌的PBS混悬液（108个细胞/mL)4小时后，使用涂布平板法定 量膜表面上黏附的金黄色葡萄球菌细胞的数目。
[0058] 图S4,在含有107个细菌细胞/mL的生长培养基中解育48小时后，通过涂布平板法 确定在每cm2原始娃酬表面和经琼脂糖修饰的（有或没有肝素)膜表面上黏附之铜绿假单胞 菌(P.aeruginosa)细胞的定量计数。*与原始娃酬相比的显著性差异(P<0.05)。
[0059] 图S5,在含有107个真菌细胞/mL的生长培养基中解育24小时后，（a)原始娃酬和 (b)娃酬-g-AG4膜上光滑念珠菌(C.glabrata)生物膜的沈Μ图像。标尺条为10皿。
[0060] 图S6，w(a)8小时和(b)18小时的加热时间制备的AG接枝的PD导管段之截面的SEM 图像。（a)和(b)中的标尺条分别为2WI1和扣m"(c)在含有107个细菌细胞/mL的生长培养基中 解育48小时后，通过涂布平板法确定在每cm2原始PD导管段表面和经修饰的PD导管段表面 上黏附之大肠杆菌细胞的定量计数。*与原始PD导管相比的显著性差异(P<0.05)。
[0061] 图S7,在含有107个细菌细胞/mL的生长培养基中解育48小时后，通过涂布平板法 确定在每cm2原始导尿管段表面和经修饰的导尿管段表面上黏附之大肠杆菌细胞的定量计 数。*与原始导尿管相比的显著性差异(P<〇.05)。
[0062] 图S8,在含有107个细菌细胞/mL的生长培养基中解育48小时后，通过涂布平板法 确定在每cm2原始PD导管段表面和经修饰的PD导管段表面上黏附之大肠杆菌细胞的定量计 数。*与原始PD导管相比的显著性差异(P<0.05)。
[0063] 图S9，用1. Omg/mL的FBG蛋白溶液预处理4小时后，（a，C)原始的和（b，d)娃酬-g- AG4膜上的(a, b)金黄色葡萄球菌黏附和(c，d)金黄色葡萄球菌生物膜的沈Μ图像。标尺条为 ΙΟμπ?ο
[0064] 图S10,原始娃酬、娃酬-g-AG4、娃酬-g-AG-HEPl和娃酬-g-HEP膜对3Τ3成纤维细胞 之生存力的影响。生存力表示为相对于由对照(没有任何膜存在下解育的3T3成纤维细胞） 所获得之结果的百分比。
[0065] 图S11，当（通常但不排他地）由娃酬制成的医用或兽医用装置通过与固定化且交 联的琼脂糖涂层相同的涂层(特别地但不排他地，通过添加肝素进一步修饰的涂层)修饰时 实现的有利作用的图解展示。
[0066] 表1通过确定的表面组成和经聚合物修饰之娃酬膜的水接触角。
[0067] 2.实验部分 [006引 2.1材料
[0069] 医用级娃酬膜购自Bioplexus Inc. (Ventura，CA，USA)。所有娃酬如inton?腹膜透 析（PD)导管均购自 Tyco International Ltd. (Princeton，NJ，USA)。铁（Ti)锥购自 Goodfellow Inc. (Huntingdon，!?)。聚氨酯膜贝勾自Central Polymer Engineering Supply (Singapore)。所有的娃酬.Bardex潑Foley导尿管均购自C.R.Bard Inc. (Murray Hill， NJ，USA)。琼脂糖（AG)购自Bio-Rad Laboratories化ercules，CA，USA)。肝素钢化EP)和3- [4，5-二甲基-嚷挫-2-基]-2，5-二苯基漠化四氮挫備漠化物(MTT)购自Alfa Aesar Co . (Ward Hill, MA，USA)。丙締酷氯(97%)、甲基丙締酸酢(94%)、牛血清白蛋白（BSA)、牛血浆 纤维蛋白原(FBG)和所使用的所有溶剂(分析级）购自Sigma-Al化ich( St丄ouiS，M0，USA)。 大肠杆菌化scherichia coli，ATCC D册α)、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, ATCC 25923)、光滑念珠菌（Candida glabra化，ATCC CBS138)、和3T3小鼠成纤维细胞购自 American Type Culture Collection(Manassas，VA，USA)。铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA01)贝勾自National Collection of Industrial Food and Marine Bacte;ria(NCIMB，Bucksbu;rn，Aberdeen,Scotland)。使用文献中所描述的程序类似制备丙 締酸化的AG。"简而言之，在100°C下将l.Og AG溶解在25血的N，N-二甲基乙酷胺(DMAC)中。 在AG完全溶解后，将溶液在冰水浴中冷却至0°C。然后，将2.5mL DMAC中的0.125mL丙締酷氯 在揽拌下逐滴添加到AG溶液中。允许反应在0°C进行1小时，在25°C另外进行4小时。丙締酸 化的AG产物在过量体积的丙酬中沉淀并用丙酬彻底清洗，随后在减压下干燥。使用与文献 中所述类似的方法制备甲基丙締酸化的肥Pc/4将200mg皿P溶解在lOmL双蒸水中。然后，将 10化甲基丙締酸酢添加到溶液中，使用4M化0田容液将该溶液的抑调整至8.5。将溶液在揽 拌下在0°C反应过夜。在过量体积的冷乙醇中沉淀甲基丙締酸化的肥P产物，随后使用透析 管（分子量截断值为1000，Spect;rum Laboratories Inc.，Rancho Dominguez,CA，USA)相对 于水进行透析，持续72小时。透析后，将甲基丙締酸化肥P溶液冷冻干燥。
[0070] 2.2制备琼脂糖^6)、肝素化6?)和46-肥?接枝的膜和导管
[0071] 为了制备交联AG接枝的娃酬膜(娃酬-g-AG)，将医用级娃酬膜切成2X2cm2的块并 在异丙醇、乙醇和双蒸水中超声清洁，每个步骤持续10分钟。使洁净的娃酬膜在Anatech SP100等离子体系统中经受氧等离子体5分钟。然后将经氧等离子体处理的膜暴露于大气另 外10分钟W促进在经等离子体处理的表面上形成过氧化物基团。运些过氧化物基团充当活 性位点W起始随后的UV诱导的固定化和交联反应，从而将丙締酸化AG接枝到经氧化的表面 上。将20化L丙締酸化AG水溶液(5wt. % )滴到经等离子体处理的娃酬膜表面上，所述膜放置 在SCS P6206旋涂仪上。WlOOOrpm的速度进行旋涂，持续60秒。然后对膜的另一面重复该过 程。将具有经旋涂之丙締酸化AG的娃酬膜放置在Pyrex玻璃管中并用氣气脱气30分钟。将玻 璃管密封并用UV光在Riko旋转光化学反应器(Model畑400-10W)中照射15、30、60和120分 钟W分别获得Silicone-g-AGl、娃酬-g-AG2、娃酬-g-AG3和娃酬-g-AG4膜(表1)。照射后，将 娃酬-g-AG膜用60°C的双蒸水彻底清洗24小时W除去物理吸附的 丙締酸化AG。类似地，分别 使用甲基丙締酸化的皿P溶液和具有如表1中所示之不同比例的丙締酸化AG和甲基丙締酸 化皿P溶液的混合物制备经皿P修饰的娃酬膜(娃酬-g-皿P)和经AG-皿P修饰的娃酬膜(娃 酬-g-AG-皿P)。类似地，使用未经修饰的AG溶液制备未交联AG涂覆的娃酬膜(娃酬-C-AG)。 溶液中丙締酸化AG、甲基丙締酸化肥P和未修饰AG的浓度固定在5wt. %。
[0072] 用于经交联AG接枝的Ti锥和AG-皿P接枝的Ti锥W及聚氨醋膜的制备方法与用于 AG接枝之娃酬膜的那些类似。将Ti锥切割成1 X 1cm2的块，然后依次在Kroll试剂(4.0%HF、 7.2%HN03、88.8%水）、二氯甲烧、丙酬和水中超声清洁，每一步持续10分钟，然后用AG或 AG-皿P接枝，而将聚氨醋膜切成2 X 2cm2的块并在乙醇和水中超声清洁，每一步持续10分 钟。之后，采用如上所述的旋涂和UV照射。
[0073] 为了制备AG和AG-皿P接枝的娃酬导管，将PD导管切成6cm的段并如上所述用异丙 醇、乙醇和水进行清洗。为了活化导管段的腔外表面和腔内表面二者，使用臭氧替代氧等离 子体。在用氧-臭氧气体混合物（由Azcozon臭氧发生器(Model VMUS-4PSE)产生，氧流入速 率为60L/小时，臭氧产生速率为约3.6g/小时)预处理20分钟之后，将经臭氧处理的导管段 引入含有如上所述各试剂(5wt.%的AG或AG-HEP)的Pyrex玻璃管中并用氣气脱气30分钟。 将玻璃管密封，在油浴中加热至70°C，然后在70°C维持8小时。反应后，将AG或AG-HEP修饰的 导管段用双蒸水在60°C清洗24小时。类似地，通过臭氧预处理、暴露于各试剂和UV照射，用 AG和AG-HEP接枝导尿管段（1cm长）。
[0074] 通过向含有10血丙締酸化AG水溶液(5wt. %)的Pyrex管添加5mg 4,4'-偶氮双(4- 氯基戊酸)来制备交联AG水凝胶(没有娃酬膜）。用氣气吹扫30分钟后，将烧瓶密封并在Riko 旋转光化学反应器中用UV光照射120分钟。照射后，用乙醇和双蒸水在60°C清洗交联AG水凝 胶24小时，随后冷冻干燥。类似地，使用丙締酸化AG和甲基丙締酸化肥P溶液的混合物(丙締 酸化AG:甲基丙締酸化皿P = 9:l(w/w))制备交联AG-皿P水凝胶。通过W下制备未交联的AG 凝胶，将未经修饰的AG溶液加热至120°C并冷却至25°C，随后冷冻干燥。
[0075] 2.3微生物黏附和生物膜形成测定
[0076] 在生长培养基中过夜培养细菌(膜蛋白酶大豆肉汤用于金黄色葡萄球菌，营养肉 汤用于大肠杆菌，并且溶原性肉汤用于铜绿假单胞菌）。然后将含有细菌的生长肉汤W2， 70化pm离屯、10分钟W除去上清。用PBS(抑7.4)清洗细菌细胞并W108个细胞/mL的浓度重悬 在PBS中，如从540nm的光密度(0D)所估计的（540nm处的0D为0.1等同于基于平板涂布计数 的约108个细胞/mL)。在37°C，将1 X 1cm2大小的原始娃酬膜和经修饰的娃酬膜放置在24孔板 中并用ImL细菌混悬液覆盖4小时。在细菌黏附过程之后，将膜用PBS清洗Ξ次W除去未黏附 的细菌。为了定量黏附的细菌，如文献所述进行涂布平板法。1S简而言之，将具有黏附细菌的 膜放到2mL PBS中并超声处理7分钟，随后满旋30秒W将细菌细胞释放到PBS中。将细菌混悬 液连续稀释并铺到琼脂平板上。培养过夜后，通过对琼脂平板上的菌落数目进行计数来定 量活细菌细胞的数目。为了扫描电子显微术（scanning electron microscopy,沈M)观察， 将膜上黏附的细菌用PBS中3vol. %戊二醒在4°C固定过夜。在用25%、50%、75%和100%乙 醇连续脱水(每次10分钟)后，将膜在减压下干燥，涂覆销，并在沈Μ下观察。为了评估原始娃 酬和经修饰娃酬上黏附细菌的生存力，用组合染料化IVE/DEAD Ba化ight细菌生存力试剂 盒)对膜进行染色并在配备100W Hg灯的Leica DMLM显微镜下观察。
[0077] 为了评估金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌的生物膜形成，将过夜细菌 培养肉汤用其相应的生长培养基稀释到1〇7个细胞/mL的浓度。在37°C，将原始的和经修饰 的基材（IX 1cm2膜或1cm导管段)放置在24孔板中并用ImL细菌混悬液覆盖48小时W允许生 物膜生长。生物膜生长阶段之后，用PBS将基材清洗Ξ次。在沈Μ下观察膜，使用如上所述的 涂布平板法定量膜和导管段(腔内表面和腔外表面二者)上生物膜细菌细胞的数目。
[0078] 为了评估光滑念珠菌的生物膜形成，将过夜真菌培养肉汤稀释到107个细胞/mL的 浓度。在37°C，将原始的和经修饰的基材（IX 1cm2膜)放置在24孔板中并用ImL真菌混悬液 覆盖。1.5小时之后，将真菌混悬液除去并用PBS清洗基材两次。然后在基材上添加 ImL的新 鲜培养基，在37°C保持24小时W允许真菌生物膜生长。在生物膜生长阶段之后，将基材用 PBS中的3vol. %戊二醒固定并经历用25%、50%、75%和100%乙醇连续脱水并在沈Μ下观 察。
[00巧]2.4稳定性测试
[0080]通过使膜在37°C在溶菌酶水溶液（1化g/mU中老化30天来评估娃酬膜上AG和AG- 皿P接枝层的稳定性。选择溶菌酶浓度来模拟人血清中的浓度。在老化阶段之后，如上所述 进行膜上细菌生物膜形成的评估W测试涂层的稳定性。处于比较的目的，还进行了溶菌酶 溶液中所制备的AG和AG-肥P水凝胶(没有娃酬膜）的降解。1 OOmg的干AG和AG-皿P水凝胶在 37°C在lOmL溶菌酶溶液（1化g/mL)中老化30天。老化阶段之后，使用透析管(分子量截断值 为3500，Spect;rum Laboratories Inc.，Rancho Dominguez,CA，USA)相对于水对水凝胶进 行透析，持续72小时，随后冷冻干燥。重量损失(wei曲t loss)的程度如下计算：
[0081 ] WL=(WB-WA)/WBX100% (1)
[0082] 其中WB和WA分别是老化之前和之后的水凝胶重量。
[0083] 通过在两块生肉（猪肉）之间牵拉导管段研究摩擦力下经修饰的PD导管的稳定性。 将肉固定在长度为5cm的两个PMMA平板之间。将6cm长的经修饰导管段从一侧插入到两块肉 之间并从另一侧拉出。将运一过程重复5次。在摩擦测试之后，将导管段切成1cm长并如上所 述在导管段上进行细菌生物膜形成的测定W测试接枝层的稳定性。还对6cm经修饰导管段 进行弯曲测试，其中该段向上和向下弯曲成圆15次。在弯曲测试之后，将导管的中间3cm(经 受最高的弯曲应力）切成1cm长的Ξ段，然后在运些段上进行细菌生物膜形成的测定。
[0084] 2.5蛋白质吸附
[0085] 首先将2 X 2cm2大小的原始娃酬膜和经修饰娃酬膜在CPBS(巧樣酸盐-憐酸盐缓冲 盐水、PBS和0.01M巧樣酸钢，pH 7.4)中平衡1小时，然后在37°C浸入纯BSA或FBG蛋白质溶液 (CPBS中的1. Omg/mL)中4小时。在该蛋白质吸附阶段之后，分别用CPBS和双蒸水清洗膜两 次。使用与文献中所述类似的方法，采用修改的染料相互作用法使用Bio-Rad蛋白质染色试 剂(Catalog No.500-0006)确定吸附在膜上之蛋白质的量。1S简而言之，将不同已知浓度的 蛋白质溶液(〇.4mL)添加到lOmL的5倍稀释的胆藏染料溶液。10分钟后，W50(K)rpm离屯、15分 钟，然后使用在465nm的蛋白质-染料溶液之上清液的吸光度来获得标准校准曲线。为了定 量吸附到膜上的蛋白质，将膜放到lOmL的染料溶液中。浸入3小时后，移出膜。将剩余的溶液 离屯、并在465nm测量上清液的吸光度。由标准校准曲线计算吸附到膜上之蛋白质的量。
[00化]2.6细胞毒性测定
[0087]使用标准MTT测定研究经修饰娃酬膜的细胞毒性。使用补充有10%胎牛血清、ImM k谷氨酷胺、lOOIU/mL青霉素的DMEM培养3T3成纤维细胞。将含有密度为104个细胞/mL之 DMEM 3T3成纤维细胞的ImL培养基放置到24孔板的各个孔中。然后将板在95%空气和5% C〇2的潮湿气氛中于37°C解育24小时。用新鲜培养基替换培养基之后，将IX 1cm2大小的膜轻 轻的放在孔中的细胞层上。使用不含膜的完全生长培养基进行对照试验(无毒对照）。在37 °〇另外解育24小时后，除去每个孔中的培养基和膜。然后向每个孔添加9(Κ)化的培养基和 100化的ΜΤΤ溶液(PBS中5mg/mL)。解育4小时后，除去ΜΤΤ溶液和培养基并添力日ImL二甲基亚 讽（DMS0) W溶解甲歷结晶（formazan ciTstal)。然后在BI0-TEK微孔板读取仪（Model 化werwave XS)上测量570皿处的吸光度。结果表示为相对于在对照试验中所获得之吸光度 的百分比。
[008引2.7细胞黏附
[0089] 将1 X 1cm2大小的原始娃酬膜和经修饰的娃酬膜放置在24孔板中。添加含有密度 为2 X105个细胞/mL之3T3成纤维细胞的ImL培养基并解育24小时。在解育阶段之后，用培养 基润洗膜Ξ次W除去未黏附细胞。使用Leica DMLM显微镜查看具有黏附细胞的膜表面。为 了对黏附的3T3成纤维细胞进行定量，将具有黏附细胞的膜放置在24孔板中并进行MTT测 定。通过W下来建立标准校准曲线:在24孔板中接种已知数目的3T3成纤维细胞并于37°C解 育4小时，随后进行Μ?Τ测定。由标准校准曲线计算黏附到膜上的3T3成纤维细胞之数目。
[0090] 2.8血小板黏附
[0091 ]将从健康兔收集的新鲜血液立即与3.8wt%巧樣酸钢溶液W9:1 (v/v)的比例混 合。通过将血液在8°CW700rpm离屯、10分钟获得富血小板血浆（Platelet-rich plasma, PRP)。用PBS W1:1 (v/v)的比例稀释PRP，并将ο. 1血经稀释PRP引入到1 X 1 cm2的娃酬膜表面 上。在37°C解育1小时后，将膜用PBS清洗Ξ次。然后将黏附血小板用PBS溶液中的3vol%戊 二醒在4°C固定过夜。在用10%、25%、50%、75%、90%和100%乙醇连续脱水(每次10分钟） 后，将膜在减压下干燥，涂覆销，并在serf观察。通过在相同放大倍数（X2,000)通过代表 性沈Μ图像计数的黏附血小板总数定量膜上血小板的数目。U从经修饰的膜获得的结果相对 于从原始娃酬获得的结果进行归一化。
[0092] 2.9血浆复巧时间。脚）
[0093] 如上所述制备与3.8wt %巧樣酸钢溶液混合的来自健康兔的新鲜血液。通过将血 液在8°CW3,000rpm离屯、20分钟获得贫血小板血浆（platelet poor plasma，PPP)，并将 O.lmL的PP巧I入到2X2cm2娃酬膜的表面上。所述膜在37°C解育10分钟后，向娃酬膜上的 PPP添加0.1 mL 37°C的0.025M CaCb水溶液。监测PPP溶液的凝结，通过将用娃酬涂覆的不 诱钢丝钩手动浸入到溶液中W检测纤维蛋白丝(fibrin thread)。在第一次出现丝样纤维 蛋白时记录PRT。
[0094] 2.10溶血测试
[00巧]将1 X 1cm2大小的娃酬膜和lOmL的PB巧I入到BIOLOGIX"'离屯、管中。管在37°C 解育1小时后，添加0.2mL的经稀释兔血液(8mL血液与10血的PBS混合)并将管在37°C再解育 1小时。使用PBS和双蒸水分别作为阴性对照和阳性对照。然后将管Wl，5(K)rpm离屯、10分钟 并用HITACHI分光光度计(Model U-2800)在545nm处测量上清液的吸光度。如下计算溶血率 (hemolysis rate,HR)：
[0096] HR=(AS-AN)/(AP-AN) (2)
[0097] 其中AS、AN和AP分别是含有膜、阴性对照和阳性对照之溶液的上清液的吸光度。 [009引 2.11表征
[0099] 由于导管的弯曲表面(curved surface)，无法在其表面上容易地对黏附的细菌细 胞实施表征方法，例如X射线光电子能谱法(X-ray photoelectron spectroscopy，XPS)和 接触角测量W及SEM观察。因此，选择平的医用级娃酬片作为模型表面，在修饰后，进行涂层 表征的研究。在具有单色A1 ΚαΧ射线源（1486.71eV光子）的AXI S叫traDLD光谱仪化ratos Anal}ftical Ltd.，UK)上通过XPS分析娃酬膜的表面化学组成。通过SEM(J"E0L，Model 560化V)观察娃酬膜表面，并分别通过场发射扫描电子显微镜术(FESEM，JE0L，Model JSM- 6700)和沈Μ观察膜和导管的截面。使用双面碳胶带(double-sided carbon tape)将样品固 定在SEM金属粧(metal stub)上并瓣射涂覆薄的销层W增强图像的对比度和质量，然后用 SEM和FESEM进行观察。使用如先前所述的甲苯胺蓝方法对经修饰膜上固定化肝素浓度进行 定量。"在室溫，在Rame-化rt伸缩式测角仪（Rame-化；rt telescopic goniometer，Model 100-00-(230))中使用：3化水滴通过液滴法(sessile drop method)测量不同表面的静态接 触角。对于每个样品，在表面的不同区域进行Ξ次测量，并且每次用一式Ξ份的样品进行至 少Ξ次独立的测试。
[0100] 2.12统计学分析
[0101] 结果报告为平均值±标准差（SD)并使用单因素方差分析(AN0VA)和化k巧事后检 验在统计学上进行评估。接受P<〇.05为统计学显著。
[0102] 3.结果和讨论
[0103] 3.1表面表征
[0104] 在图1中图示举例说明了在娃酬表面上共价接枝和交联AG和AG-HEP聚合物的过 程。通过氧等离子体或臭氧处理在娃酬表面上产生的过氧化物或径基过氧化物充当错定位 点，用于后续聚合物链的固定化。1嘴图帥示出了AG、肥巧日AG-肥P接枝的娃酬膜的XPS宽扫 描、S化忍能级谱和N Is忍能级谱。在娃酬-g-AG4膜的宽扫描谱中Si化和Si 2s信号的强 度（图2(a))与原始娃酬膜（图Sl(a))的信号强度相比显著降低，表明成功地将AG接枝到娃 酬膜上。如所预期的，在娃酬-g-AG4的S化忍能级谱和N Is忍能级谱中没有可辨别的硫和 氮信号(分别为图2(a'）及其插图），因为运些元素不存在于娃酬或丙締酸化AG聚合物中。如 表1所示，通过XPS确定原始的娃酬和聚合物修饰之娃酬的表面元素组成。娃酬-g-AG4膜的 [Si]/[C]比例为约0.08:1并且远低于原始娃酬的比例(0.52:1)。可^从[51]/[口比例定量 地评估AG接枝的程度，因为Si仅存在于娃酬中并且不存在于丙締酸化AG中。如表1所示，随 着UV照射时间从15分钟延长至120分钟，娃酬-g-AGl、娃酬-g-AG2、娃酬-g-AG3和娃酬-g- AG4膜的[Si]/[C]比例降低，表明固定化AG之接枝密度提高。
[0105] 对于娃酬-g-皿P膜，120分钟的UV诱导甲基丙締酸化皿P接枝后，在S化忍能级谱 和N Is忍能级谱（分别为图2(b'）及其插图）中存在硫和氮信号。此外，娃酬-g-HEP膜的 [Si]/[C]比例降低至0.14:1，运也确认了娃酬膜上肥P的成功接枝。如通过甲苯胺蓝法确定 的，固定化肥P的表面浓度为12. lyg/cm2娃酬-g-肥P膜。
[0106] 对于娃酬-g-AG-皿P1膜，在S 2p忍能级谱和N Is忍能级谱中可辨别硫和氮信号 (分别为图2(c'）及其插图）。娃酬-g-AG-HEPl膜的[Si]/[C]比例降低至0.10:1。图3示出了 经AG和AG-HEP修饰膜之截面的FESEM图像。可W清楚地观察到娃酬-g-A(M上接枝的AG层（图 3 (a)中的上层）的厚度和娃酬-g-AG-肥P1上AG-HEP层（图3 (b)的上层）的厚度为约2皿，确认 AG和AG-皿P成功地接枝到娃酬表面上。接枝的AG层的厚度可通过改变UV照射时间而不同。 当UV照射时间降低至60分钟和15分钟，接枝AG层的厚度分别降低至0.祉m和0.3μπι。随着反 应溶液中甲基丙締酸化肥Ρ的进料比（feed ratio)的提高，固定化皿Ρ的表面浓度提高（与 表1中娃酬-g-AG-皿P1和娃酬-g-AG-皿P2的固定化皿P浓度相比），运也被表1中运些膜的
[S]/[C]和[N]/[C]比例提高所确认。
[0107] 原始的娃酬和聚合物修饰娃酬之水接触角的改变也提供了娃酬膜表面已经被成 功修饰的支持证据。如表1所示，原始娃酬膜是疏水的，水接触角为107°。用AG、肥P和AG-HEP 接枝后，经修饰之娃酬膜变成亲水的，具有低得多的水接触角。此外，可W观察到，经AG修饰 之娃酬膜的接触角随UV反应时间的延长而提高，表明固定化AG的接枝密度提高，运与运些 膜的表面[Si]/[C]比例所掲示的结果一致(表1)。
[0108] 3.2微生物黏附和生物膜形成测定
[0109] 形成对细菌黏附的表面抗性是防止细菌感染的关键步骤。在黏附到表面上后，细 菌将在生长培养基的存在下增殖并形成生物膜。生物膜继而保护细菌不受宿主天然防御系 统W及抗生素的影响。对于植入的装置(例如PD导管），插入后的前几个小时被认为是重要 的时期，其中所引入的病原体仍然处于静止阶段，并且宿主免疫系统可主动地中和入侵的 病原体。使用模型细菌(革兰氏阳性金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性大肠杆菌)评价经聚合物 修饰之娃酬膜降低细菌黏附的效力，因为它们是引起PD相关感染的最常见物种。图4示出原 始娃酬膜和经修饰之娃酬膜上黏附的金黄色葡萄球菌细胞的沈Μ图像。在PBS中解育4小时 后，在原始娃酬上观察到大量的金黄色葡萄球菌（图4(a))。在用AG、AG-皿P和皿P对娃酬膜 的表面进行修饰之后，黏附的金黄色葡萄球菌的数目显著降低（图4(b-d))。公知的是，微生 物因为疏水相互作用偏好附着至疏水性表面。W因此，经AG、AG-HEP和肥P修饰之娃酬抑制金 黄色葡萄球菌黏附的能力可归因于表面亲水性的改进，运是由亲水性聚合物的接枝导致 的。因此，AG和肥P聚合物是抗黏附的，但并非杀菌的。经AG修饰之娃酬的抗黏附特性强烈依 赖于固化定AG层的接枝密度，运与UV诱导的接枝时间相关（图S2)。抑制金黄色葡萄球菌和 大肠杆菌黏附的效力随着UV照射时间的延长而提高。120分钟的UV诱导接枝后，所得的娃 酬-g-AG4分别将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌黏附降低约98%和约99%。
[0110] 肥P在降低金黄色葡萄球菌黏附方面不如AG有效(比较图4(d)与图4(b))。因此，在 经AG-肥P修饰之娃酬上接枝大量的肥巧尋导致黏附的细菌数目提高。如果固定化皿P之表面 浓度被限制到2.化g/cm2或更低，则娃酬-g-AG-肥P的抗菌效力将没有与娃酬-g-A(M的抗菌 效力显著不同（比较图S3中具有不同表面浓度之皿P的娃酬-g-AG-皿P膜上黏附的细菌数 目）。
[0111] 细菌和真菌生物膜是PD透析中腹膜炎和其他PD导管相关感染的主要原因。类似 地，在中央静脉导管和导尿管上的生物膜形成分别提高了 CABSI和CAUTI的风险。在本工作 中，在含有1〇7个细菌细胞/mL的生长培养基中解育48小时后评估经聚合物修饰的娃酬膜在 抑制细菌生物膜形成中的效力。图5示出在原始娃酬表面和经修饰娃酬表面上细菌生物膜 的沈Μ图像。从图5(a)和5(d)可W看出，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌二者在原始娃酬膜上都 容易形成厚的生物膜。在娃酬表面上接枝AG之后，观察到细菌生物膜显著降低。在娃酬-g- AG4膜和娃酬-g-AG-肥P1膜(分别为图5(b)和5(c))上没有明显的金黄色葡萄球菌生物膜， 但存在一些细菌集群(cluster)。娃酬-g-AG4膜和娃酬-g-AG-皿P1膜在防止大肠杆菌生物 膜形成方面甚至更有效，仅可观察到几个单独的细菌细胞(分别为图5(e)和5(f))。运些结 果表明，与大肠杆菌生物膜相比，更难W防止在娃酬表面上形成金黄色葡萄球菌生物膜，运 与先前的报道21-致。然而，原始娃酬膜和经修饰之娃酬膜上黏附的细菌数目的定量显示， 与原始膜相比，经修饰的娃酬(娃酬-g-AG4和娃酬-g-AG-肥P1)将黏附的金黄色葡萄球菌和 大肠杆菌数目分别降低了约2.4和约3.3个数量级（图6(a)和6(b))。除了大肠杆菌和金黄色 葡萄球菌，还评估经AG和AG-皿P修饰之娃酬膜上的革兰氏阴性铜绿假单胞菌生物膜形成， 因为铜绿假单胞菌是PD透析中感染的另一个主要原因。与原始的娃酬相比，经AG和AG-皿P 修饰之娃酬膜上黏附的铜绿假单胞菌细胞数目降低超过2个数量级（图S4)。因此，细菌黏附 和生物膜形成测定指示AG和AG-皿P接枝层有效地对抗革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌物种 二者。
[0112] 真菌感染在死亡率和发病率方面是比细菌感染更严重的PD相关感染，在受感染的 PD患者中的死亡率多至44%。22评估AG修饰之娃酬膜在抑制真菌生物膜形成中的效力并且 在图S5中示出SEM图像结果。如图S5(a)所示，光滑念珠菌容易在原始娃酬膜上黏附并形成 多个集群。在娃酬表面上表面接枝AG后，观察到真菌细胞和集群的数目显著降低（图S5 (b))，指示AG涂层有效地抑制真菌生物膜形成。
[0113] 在图7中示出了用经AG和AG-HEP修饰之Ti锥和聚氨醋膜暴露于生长培养基中的大 肠杆菌所获得的相应结果。将该图中的结果与图5(d)至5(f)相比，可W得出W下结论:在抑 制生物膜形成方面，AG和AG-HEP接枝层在Ti和聚氨醋上与在娃酬上同等有效。
[0114]除了平娃酬膜表面，通过w下将AG和AG-皿P聚合物接枝到管状PD导管表面上:臭 氧处理，随后加热诱导聚合物层的固定化和交联。通过改变加热时间，AG接枝层的厚度可不 同。在图S6(a)和S6(b)中举例说明运一点，其示出分别使用8小时和18小时加热时间制备的 经AG修饰之PD导管的截面。运些加热时间分别导致约2皿和约扣m厚的AG接枝层。图S6k)示 出在培养基中解育48小时后原始导管表面和经修饰导管表面上黏附的大肠杆菌的数目。与 用娃酬-g-AG4膜所获得的结果类似，经AG和AG-肥P修饰的PD导管使黏附的细菌细胞数目降 低超过3个数量级。此外，发现在具有2μπι和扣m聚合物接枝层的经修饰导管上的黏附细菌细 胞数目没有显著差异，指示超过2μπι厚度的AG和AG-HEP涂层的抗菌效力没有显著的改进。还 测试了通过W下将AG和AG-皿Ρ聚合物接枝到管状导尿管表面:臭氧处理，随后UV诱导固定 化。图S7示出经修饰之导尿管段也非常显著地降低了细菌定殖。
[011引 3.3稳定性
[0116] 如果将涂层施加到导管上，其稳定性是一项重要的需求，因为导管可能长时间放 置在身体中。通过W下评估经AG和AG-肥Ρ修饰之娃酬膜的稳定性:将膜在溶菌酶溶液中于 37°C老化30天后在其上进行细菌生物膜测定。如图6(a)中所示，在生物膜测定之后黏附的 金黄色葡萄球菌数目稍微提高，但对于老化的AG和AG-肥P修饰的膜不显著(P>0.05)。对于 大肠杆菌获得了类似的结果（图6(b))。此外，生物膜形成测定还示出，在121°C高压灭菌20 分钟后，娃酬-g-AG4和娃酬-g-AG-肥P1保持其抗菌特性（图6 (a)和6 (b))。运些结果表明，娃 酬上的交联AG和AG-肥P层是稳定的。老化30天后接枝层的稳定性还指示交联的AG和AG-肥P 层能够防止娃酬的疏水性恢复并维持其抗菌效力。
[0117] 用交联的AG和AG-皿P水凝胶和未交联的AG水凝胶在溶菌酶溶液中进行30天的类 似老化试验。对于交联的AG和AG-HEP水凝胶，分别观察到13.5%和11.8%的重量损失。未交 联的AG水凝胶示出22.7%的更高重量损失。用老化的娃酬-C-AG膜(未交联的AG涂覆的娃酬 膜)进行生物膜测定（图6)也确认未交联的AG涂层不如交联的涂层稳定。此外，在121°C高压 灭菌20分钟后，娃酬-C-AG膜不具有抗菌特性，因为未交联的AG层仅物理吸附到膜上并且其 在高压灭菌过程中烙化。
[0118] 当导管插入到体内时，其将遇到摩擦力和弯曲力。在经历运样的力之后，使用细菌 生物膜形成测定评价PD导管上交联的AG和AG-肥P层的稳定性，结果在图S8中示出。经AG和 AG-HEP修饰之导管示出良好的稳定性，因为在摩擦和弯曲测试之后，经修饰的导管上黏附 的细菌数目没有显著改变。
[0119] 3.4蛋白质吸附和细胞黏附
[0120] 网膜包裹是PD治疗中PD流出失败的首要原因。网膜(omentum)是主要的腹膜防御 器官，并且响应于炎症或异物，其将黏附并隔离开受影响的区域。ro导管表面上的蛋白质吸 附对于网膜包裹是关键因素，因为认为网膜黏附的机制设及在攻击部位纤维蛋白渗出物的 形成，运吸引成纤维细胞和白细胞主动迁移并最终导致受影响区域被包裹。在运个工作中， 研究 在经修饰娃酬膜上两种蛋白质FBG和BSA的吸附。如图8所示，在原始娃酬膜上吸附的 FBG和BSA的量分别为约2.化g/cm2和约1.化g/cm2。在用AG接枝后，蛋白质吸附非常显著地降 低。娃酬-g-AG4降低约98 %的BSA和FBG吸附，并且娃酬-g-AG-皿P1膜示出类似的蛋白质吸 附降低。已知亲水性AG聚合物上蛋白质的非特异性吸附是非常低的，并且AG及其衍生物经 常用作蛋白质分离的支持材料W使非特异性吸附最小化。因此，在娃酬-g-AG4膜和娃酬-g- AG-肥PI膜上观察到的蛋白质吸附降低可归因于AG层。另一方面，娃酬-g-肥P膜在降低蛋白 质吸附方面不太有效(吸附的BSA和FBG分别降低约51%和约80%)。运是由于皿P能够与某 些种类的蛋白质（包括BSA和FBG)相互作用。然而，如果（例如娃酬-g-AG-皿P1膜上）固定化 肥P较低(2.化g/cm2)，则保留了 AG的蛋白质排斥特性(与娃酬-g-A(M相比，图8)。
[0121] 使用FBG和金黄色葡萄球菌研究原始娃酬膜和娃酬-g-AG4膜上蛋白质吸附对后续 细菌黏附和生物膜形成的影响。图S9(a)和S9(b)示出用FBG预处理后在运些膜上黏附的金 黄色葡萄球菌的沈Μ图像。与图4(a)相比，可W在图S9(a)中观察到细菌细胞的集群提高，运 与更早报道的结果一致，所述结果示出在聚化咯表面上预吸附的FBG增强金黄色葡萄球菌 黏附到表面上和凝集。运归因于由金黄色葡萄球菌细胞表达的FBG结合蛋白（凝集因子）。用 FBG预处理后娃酬-g-A(M膜上黏附的细菌细胞数目轻微地升高(将图S9(b)与4(b)比较），但 运些细胞保持为单独单元而非成簇。图S9(c)和S9(d)示出用FBG预处理的原始娃酬膜和娃 酬-g-AG4膜上金黄色葡萄球菌生物膜的SEM图像。无论FBG存在与否，在原始娃酬膜上形成 厚的生物膜。然而，在FBG预处理后，娃酬-g-AG4膜仍能够抵抗生物膜形成，因为FBG吸附的 程度低（图8)。
[0122] 在细胞黏附测定中，选择3T3小鼠成纤维细胞作为模式哺乳动物细胞来研究其与 经修饰娃酬膜的相互作用。图9(a-c)示出在原始娃酬表面和经修饰娃酬表面上黏附的3T3 成纤维细胞的光学显微术图像。大量的3T3成纤维细胞容易地黏附在原始娃酬表面上（图9 (a))，而成纤维细胞在AG和AG-HEP修饰的表面上的黏附几乎被完全抑制（图9(b)和9(c))。 从图9(d)还可W看出，在防止3T3成纤维细胞黏附方面，肥P不如AG和AG-肥P那样有效。与原 始娃酬相比，经AG和AG-HEP修饰的娃酬分别降低了约92%和约93%的3T3成纤维细胞黏附， 然而经皿P修饰的娃酬上的降低为约83 % (图9(e))。在AG、AG-皿P和皿P修饰的娃酬膜上成 纤维细胞黏附程度的差异可与其蛋白质排斥性质相关，因为已报道非特异性蛋白质吸附对 于抑制细胞与材料表面的相互作用是关键的。
[0123] 虽然已知AG和肥P是无毒的，但是需要测试经修饰娃酬膜的细胞毒性，因为所制备 的AG和AG-肥P涂层旨在用于可植入装置。使用Μ?Τ测定用3T3成纤维细胞评价原始娃酬膜和 经修饰娃酬膜的细胞毒性。在所有情况下，放置成与原始膜和经修饰膜接触24小时的3T3成 纤维细胞的存活力大于95% (图S10)。与对照试验(不存在任何膜)相比，在细胞生存力中没 有发现显著差异，指示运些膜没有细胞毒性或具有很低的细胞毒性。运些细胞生存力结果 还确认了经修饰娃酬表面上细胞黏附的降低（图9)是由于聚合物涂层的抗黏附特性而非由 于其细胞毒性。
[0124] 3.5血液相容性测定
[0125] 血液相容性是在人体中与血液接触的生物医学装置(例如中央静脉导管）的重要 特性。表面上的血小板黏附和活化可诱导血液凝集和血栓形成。在PD中，运样的事件可导致 腔内阻塞W及最终导致导管的流出失败。通过血小板黏附和活化、溶血和血浆复巧时间 (PRT)测试评价经AG和AG-HEP修饰的娃酬膜的血液相容性。在图lO(a-d)中示出了原始娃酬 膜和经修饰娃酬膜上血小板黏附的SEM图像。血小板很容易黏附到原始娃酬表面上（图10 (a))并且黏附的血小板是高度活化的，具有伪足和伸展（spreading)的特征。在将AG和AG- 肥P接枝到娃酬上后，黏附的血小板的数目显著降低（图10(b)和10(c))。多种膜上黏附的血 小板数目的定量比较（图10(e))示出与原始表面相比，经修饰娃酬表面上的血小板黏附降 低了超过一个数量级。AG和AG-HEP修饰之娃酬膜上对血小板黏附的抗性再次归因于如上所 讨论的其蛋白质排斥特性，因为血浆蛋白吸附（特别是血小板黏附促进蛋白（FBG)的吸附） 在血小板黏附到生物材料表面上中发挥重要作用。然而，应当注意到，娃酬-g-AG4膜上的血 小板仍然是活化的（图10(b)的插图），表明AG涂层不能有效地抑制血小板活化。另一方面， AG-皿P涂层有效地防止了血小板的活化（图10(c)的插图），并且运可W归因于AG-肥P层中 肥P的存在。肥P通常用作抗凝剂并且已经被报道能够抑制血小板黏附和活化，运通过娃酬- g-HEP膜上低程度的血小板黏附和活化得到确认（图10(d))。
[0126] 图11(a)示出了从原始娃酬膜和经修饰娃酬膜上的血液凝集测试所得到的PRT结 果。将AG接枝到娃酬上导致PRT显著降低约13至约16分钟(P<0.05)，而在AG接枝层中存在 HEP的情况下，PRT进一步降低至约1 9分钟。已知HEP W高亲和力结合抗凝血酶111 (antit虹ombin ΙΙΙ,ΑΤΠΙ)，导致ΑΤΠΙ构象改变。随着运一构象改变，ΑΤΠΙ的活性位点更 暴露，运极大地促进了 ΑΤΠΙ抑制凝血蛋白酶的活性，继而延迟了纤维蛋白原向纤维蛋白的 转变并抑制凝血。溶血是与血液接触的生物材料之血液相容性相关的另一个问题。图11(b) 示出用原始娃酬膜和经修饰娃酬膜获得的溶血程度。原始娃酬的溶血程度为约1%。在AG、 AG-HEP和皿Ρ接枝后，经修饰娃酬膜示出显著更低的溶血程度(Ρ<0.05)，娃酬-g-AG4的 O. 77%到娃酬-g-皿P膜的0.56%。尽管根据美国材料与试验协会(American Society for Testing and Materials，ASTM)F 756-00标准，对于生物材料，2%的溶血程度被认为是非 溶血性的并且原始娃酬满足运一要求，但经修饰的膜进一步降低了溶血的程度，继而改善 娃酬的血液相容性。
[0127] 4.结论
[0128] 将AG和皿P聚合物共价固定化在医用级生物材料和导管表面上(腔内和腔外改 善其抗微生物、抗真菌、防污着和血液相容特性特性。与原始娃酬相比，在经AG修饰的表面 上，革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的黏附和生物膜形成分别降低98%和>99%。光滑念珠 菌在AG修饰之表面上的生物膜形成也被抑制。通过类似方法在Ti锥、聚氨醋膜和娃酬导尿 管表面上接枝的AG和肥P聚合物同样成功地抑制生物膜形成。约2皿厚的经交联AG涂层是稳 定的并且在溶菌酶溶液中老化30天后W及还在高压灭菌后保持其抗菌效力。此外，AG涂层 可有效地抵抗非特异性蛋白质吸附、成纤维细胞和血小板黏附。运分别在图8、9和10中举例 说明。在AG涂层中共固定化2.化g/cm2的皿P通过抑制血小板活化、延长PRT和降低溶血程度 进一步改善血液相容性。伴随地，保留AG的抗菌和防污着效力。基于AG之涂层的有利的抗微 生物、防污着和改善的血液相容性特性W及无细胞毒性为W下提供了有前景的机会:对抗 感染和PD导管的网膜包裹W及当使用其他类型之导管时降低CABSI和CAUTI，等。
[0129] 参考文献
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[0152] 表1经聚合物修饰之娃酬膜的水接触角和通过XPS确定的表面组成
[0153]
[0154] a通过敏感度因数校正的XPS C ls、Si 2p、S 2p和N Is芯能级谱面积比计算的[C] :[Si]:[S]:[N]摩尔比。
[01W] b通过丙締酸化AG的UV诱导的固定化和交联制备的AG接枝的娃酬。
[0156] κ通过丙締酸化AG和甲基丙締酸化皿P的UV诱导的固定化和交联制备的AG-皿P接 枝的娃酬。
[0157] d通过甲基丙締酸化肥P的UV诱导的固定化和交联制备的肥P接枝的娃酬。
【主权项】
1. 医用或兽医用装置，所述装置在其表面的至少一部分上包含共价固定化且交联的琼 脂糖涂层。2. 根据权利要求1所述的装置，其中所述涂层在选自包含W下的组的表面上提供:生物 材料、娃酬、聚氨醋和铁。3. 根据权利要求2所述的装置，其中所述表面是医用级表面。4. 根据前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述涂层在所述装置与患者或动物接 触的至少一部分上提供。5. 根据前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述琼脂糖通过引入W下进行修饰： 丙締酸醋、甲基丙締酸醋、（甲基)丙締酷胺、硅烷、硫醇、叠氮化物、烘、乙締基化晚或乙締基 咪挫基团或者运些基团的衍生物。6. 根据权利要求5所述的装置，其中所述衍生物选自包含W下的组:丙締酸酢、甲基丙 締酷氯、N-径乙基（甲基)丙締酷胺、1-2-簇乙基-4-乙締基化晚淮f漠化物和1-径乙基-3-乙 締基咪挫:輪漠化物。7. 根据前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述涂层还包含肝素。8. 根据权利要求7所述的装置，其中所述肝素通过引入W下进行修饰：甲基丙締酸醋、 丙締酸醋、（甲基）丙締酷胺、硅烷、硫醇、叠氮化物、烘、乙締基化晚或乙締基咪挫基团或者 运些基团的衍生物。9. 根据权利要求8所述的装置，其中所述衍生物选自包含W下的组:丙締酸酢、甲基丙 締酷氯、N-?乙基（甲基)丙締酷胺、l-2-簇乙基-4-乙締基化晚^4翁:漠化物和l-?乙基-3-乙 締基咪挫:備:漠化物。10. 根据前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述涂层为1至ΙΟμπι厚。11. 根据权利要求10所述的装置，其中所述涂层的厚度选自包含W下的组：1、2、3、4或5 μηι。12. 根据权利要求11所述的装置，其中所述涂层为约2μπι。13. 根据权利要求7至11中任一项所述的装置，其中所述涂层中肝素的量为1至15yg/ cm2。14. 根据权利要求13所述的装置，其中所述涂层中肝素的量选自包含W下的组：2.0、 2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8或2.化邑/細2。15. 根据权利要求14所述的装置，其中所述涂层中肝素的量为约2.化g/cm2。16. 根据前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述装置是导管。17. 根据权利要求16所述的装置，其中所述装置选自包含W下的组:腹膜透析导管、中 央静脉导管和导尿管。18. 用于制造医用或兽医用装置的方法，所述装置在其表面的至少一部分上具有共价 固定化且交联的琼脂糖涂层，所述方法包括： i.使所述装置的表面氧化； ii .将所述经氧化的表面暴露于经修饰的琼脂糖；W及 iii.使所述表面固化。19. 根据权利要求18所述的方法，其中所述琼脂糖通过添加 W下进行修饰:丙締酸醋、 甲基丙締酸醋、（甲基)丙締酷胺、硅烷、硫醇、叠氮化物、烘、乙締基化晚或乙締基咪挫基团、 或者运些基团的衍生物。20. 根据权利要求19所述的方法，其中所述衍生物选自包含W下的组：丙締酸酢、甲基 丙締酷氯、N-径乙基（甲基)丙締酷胺、1-2-簇乙基-4-乙締基化晚,翰漠化物和1-径乙基-3- 乙締基咪挫铺?漠化物。21. 根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中使所述表面氧化包括使所述表面 暴露于利用气体例如氣、氨、氮或氨进行的等离子体处理，随后暴露于空气。22. 根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中使所述表面氧化包括电晕放电处 理或丫照射处理。23. 根据权利要求18至22中任一项所述的方法，其中所述琼脂糖处于水溶液中。24. 根据权利要求23所述的方法，其中所述溶液包含5wt. %的所述琼脂糖。25. 根据权利要求23或34所述的方法，其中将所述溶液滴到或喷洒到所述装置的表面 上。26. 根据权利要求25所述的方法，其中使用旋涂法使所述溶液沉积。27. 根据权利要求23或34所述的方法，其中将所述装置的表面浸入所述溶液中。28. 根据权利要求18至27中任一项所述的方法，其中所述固化在脱气环境中进行。29. 根据权利要求18至28中任一项所述的方法，其中所述固化使用紫外(UV)光或加热 进行。30. 根据权利要求29所述的方法，在其中使用UV来固化所述表面的情况下，将所述表面 暴露于UV持续15至120分钟的时间。31. 根据权利要求18至30中任一项所述的方法，其中还使所述经氧化的表面暴露于经 修饰的肝素。32. 根据权利要求31所述的方法，其中所述肝素通过引入W下进行修饰：甲基丙締酸 醋、丙締酸醋、（甲基)丙締酷胺、硅烷、硫醇、叠氮化物、烘、乙締基化晚或乙締基咪挫基团或 者运些基团的衍生物。33. 根据权利要求32所述的方法，其中所述衍生物选自包含W下的组：丙締酸酢、甲基 丙締酷氯、N-径乙基（甲基)丙締酷胺、1-2-簇乙基-4-乙締基化晚.Ip漠化物和1-径乙基-3- 乙締基咪挫；輪漠化物。34. 根据权利要求32或33所述的方法，其中所述肝素是甲基丙締酸化的。35. 根据权利要求31至34所述的方法，其中所述涂层中肝素的量为1至15yg/cm2。36. 根据权利要求35中任一项所述的方法，其中甲基丙締酸化的肝素的量为约2.化g/ cm^o37. 根据权利要求18至36中任一项所述的方法，其中所述涂层沉积为1至lOwii的厚度。38. 根据权利要求37所述的方法，其中所述涂层为约2μπι。39. 根据权利要求18至38中任一项所述的方法，其中所述装置是导管。40. 根据权利要求39所述的方法，其中所述装置选自包含W下的组:腹膜透析导管、中 央静脉导管和导尿管。41. 导管，所述导管在其表面的至少一部分上具有共价固定化且交联的琼脂糖涂层。42. 导管，所述导管在其表面的至少一部分上具有共价固定化且交联的琼脂糖和肝素 涂层。43. 根据权利要求42所述的导管，其中肝素的量为约2.化g/cm2。44. 本文中所描述的交联的琼脂糖涂层，其用于W共价固定化的方式施加至医用或兽 医用装置表面的至少一部分来防止生物污着、细菌或真菌感染。45. 根据权利要求1至17所述的医用或兽医用装置、根据权利要求18至40所述的方法、 根据权利要求41至43所述的导管或根据权利要求44所述的涂层，其基本上如本文中参照附 图所述。
【专利摘要】本发明涉及包含共价固定化且交联的琼脂糖涂层的医用或兽医用装置、其生产方法和交联的琼脂糖涂层。
【IPC分类】A61L27/34, A61L29/04, A61L31/04, A61L33/08, C08B37/12
【公开号】CN105555806
【申请号】CN201480035487
【发明人】李敏, 梁君仪, 提多伟良·刘, 钟俞明, 康燕堂
【申请人】新加坡国立大学
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2014年6月16日
【公告号】EP3010942A1, US20160193389, WO2014204402A1
【技术领域】
[0001] 本发明设及包含共价固定化且交联的琼脂糖涂层的医用或兽医用装置、其生产方 法和交联的琼脂糖涂层。
【背景技术】
[0002] 腹膜透析(peritoneal dialysis，PD)是用于患有严重肾病之患者的有效的居家 化ome-based)透析处理形式，并且其已在许多国家中用作血液透析的显著更低成本的替代 方案。然而，与导管相关的并发症可危害PD的成功，所述导管通常由娃酬制成。生物污着 (biofoulingKW蛋白质吸附和细胞黏附的形式)和微生物(细菌和真菌）附着到高度疏水 的娃酬表面上可导致网膜包裹(omental wrapping)和感染，运分别是PD流出失败的首要原 因和PD患者死亡的第二常见原因。此外，当与血液接触时，血小板黏附和活化诱导的血栓形 成可导致PD导管的腔内阻塞。可W认为PD导管是PD患者的"生命线"，并且导管相关的并发 症是广泛PD使用的首要障碍。自从在20世纪60年代中期引入了坦克霍夫导管(Tenckhoff catheter)，对新PD导管设计的开发尚未在降低感染和提高PD患者的生存率方面显示出令 人信服的改进。1因此，近些年来，对导管表面进行修饰W改进其防污着(antifouling)、抗 菌和血液相容性化emocompatible)特性已经吸引了越来越多的关注。2
[0003] 另一种类型的导管，中央静脉导管(通常由聚氨醋或娃酬制成)在临床上广泛用于 施用药物、抽取血液样品和血液透析处理。在运些留置导管的内部或外部上可容易地发生 微生物定殖，并且由使用此类血管接入装置导致的导管相关的血流感染（catheter- associated bloodstream infect ion, CABSI) 仍然是主要的临床问题， 对患者发病率 、死亡 率和医疗保健成本有不利影响。在使用留置导尿管(通常由尿娃酬制成）时出现类似的情 况，导尿管是医院和疗养院设施中的标准医用装置。导管相关的尿路感染（catheter- associated urinaiT tract infection, CAUTI) 是世界范围内最常见的医院获得性感染 化ospital-acquired infection)。因此，抑制微生物定殖的导管表面修饰将高度地有利于 抗击 CABSI 和 CAUTI。
[0004] 通过共价键合拴系功能性聚合物涂层为修饰导管表面性质提供了有效途径。合成 的亲水聚合物聚（乙二醇KPEG)及其衍生物是最广泛使用的防污着和抗菌材料。然而，PEG 受困于一些限制：PEG涂覆的表面由于其与蛋白质相互作用而不能将蛋白质吸附降低到非 常低的水平，并且它们在氧气和过渡金属离子的存在下易于氧化降解，运在体内限制了其 长期防污着和抗菌性能。已经广泛研究了另一些合成聚合物(例如聚（丙締酷胺）、聚(横基 甜菜碱甲基丙締酸醋）、3'4聚(簇基甜菜碱甲基丙締酸醋）和聚(拟肤））用作防污着涂层。天 然聚合物(与其来自石油化学制品的合成对应物相比）提供了有吸引力的替代。壳聚糖及其 衍生物是用于抗菌涂层的最广泛使用的天然聚合物，但是其防污着性能由于其与蛋白质的 强相互作用而受限。5已经报道常用的抗凝剂肝素化eparin，皿P)提供在体内和体外均可降 低感染的抗菌涂层。6然而，皿P的抗菌作用仍是有争议的。一些研究报道皿P不显著降低金 黄色葡萄球菌(S.aureus)的生物膜形成并且甚至可刺激该过程。7'8此外，已发现蛋白质降 解酶(例如链霉蛋白酶和α-膜凝乳蛋白酶)的固定化降低表面上的蛋白质吸附。9'w
[0005] 琼脂糖(agarose, AG)是中性的多糖，其来自琼脂。作为食品及药物管理局（Food and Drug Admiηi S化at ion，FDA)批准的成分，AG广泛地用于生物医学应用的多个领域，例 如神经再生、药物和基因递送W及牙印模(dental impression),原因是其生物相容性、稳 定性和惰性。在较早的报道中，膜或水凝胶形式的AG显示出对奇异变形杆菌（Proteus mirabilis)细菌黏附11和海洋污着(marine fouling)"的抵抗。
[0006] 目前，为了长期改善生物材料(例如娃酬、聚氨醋和铁)所缺乏的防污着、抗菌/抗 真菌和血液相容性特性，用共价固定化的天然聚合物涂层对其进行表面修饰。
【发明内容】
[0007] 根据本发明的第一方面，提供了医用或兽医用装置，所述装置在其表面的至少一 部分上包含共价固定化且交联的琼脂糖涂层。
[0008] 在本发明的一个优选实施方案中，所述涂层在生物材料表面(例如娃酬、聚氨醋或 铁表面)上提供，所述生物材料表面理想地为医用级生物材料表面。
[0009] 除了在金属表面，在生物材料表面修饰中频繁遇到的问题是疏水性恢复 化yho曲obic recove巧），运是由于生物材料聚合物的高柔性和低玻璃化转变溫度所造成 的疏水性生物材料链段和涂层聚合物的重定向和迁移引起的。
[0010] 因此，本文中提及的固定化且交联的涂层是防止聚合物材料的疏水性恢复和/或 相对于现有涂层来说稳定或具有改进的稳定性的涂层。因此，在本工作中，琼脂糖涂层被交 联W防止疏水性恢复并改善其稳定性。
[0011] 更优选地，所述涂层在所述装置与患者接触的至少一部分上提供。
[0012] 在本发明的另一个优选的实施方案中，通过引入W下对琼脂糖进行修饰W促进琼 脂糖涂层的共价固定化和交联:丙締酸醋、甲基丙締酸醋、（甲基)丙締酷胺、硅烷、硫醇、叠 氮化物、烘、乙締基化晚或乙締基咪挫基团或者运些基团的衍生物，例如但不限于：丙締酸 酢、甲基丙締酷氯、N-径乙基（甲基)丙締酷胺、1-2-簇乙基-4-乙締基化晚輪漠化物和1-径 乙基-3-乙締基咪挫11'漠化物W及本领域技术人员已知的其他衍生物。在一个实施方案 中，如此修饰的琼脂糖(例如丙締酸化的琼脂糖)用于所述涂层。
[0013] 作为替代或补充，所述涂层还包含肝素和理想地经修饰的肝素。最优选地，肝素用 W下进行修饰W使其被共价并入到交联的AG涂层中：甲基丙締酸醋、丙締酸醋、（甲基)丙締 酷胺、硅烷、硫醇、叠氮化物、烘、乙締基化晚或乙締基咪挫基团或者运些基团的衍生物，例 如但不限于丙締酸酢、甲基丙締酷氯、N-径乙基（甲基）丙締酷胺、1-2-簇乙基-4-乙締基化 晚備漠化物和1-径乙基-3-乙締基咪挫II漠化物W及本领域技术人员已知的其他衍生物。
[0014] 因此，理想地，用丙締酸醋基团（例如甲基丙締酸醋基团）修饰的皿P共价并入到交 联的AG层W进一步改进装置的血液相容性。
[0015] 更优选地，所述涂层为1至ΙΟμηι厚并且最优选为2、3、4或化m厚，如本文中所证明 的，2皿的涂层有效地实现期望的生物学特性，所W涂层理想地为2皿或约2皿。
[0016]更优选地，交联的琼脂糖涂层中肝素的量为1至15yg/cm2,最理想地为1、2、3、4或5 yg/cm2，更理想地为 1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、 2.5、2.6、2.7、2.8或2.化g/cm2,并且更优选2.化g/cm2。我们发现，如果固定化的肝素为2.化 g/cm2或约2.化g/cm2,则涂层(特别是琼脂糖组分)的蛋白质排斥特性得W保留。此外，如果 固定化肝素的表面浓度限制到为2.化g/cm2或约2.化g/cm2或更少，则琼脂糖和肝素的抗菌 效力将与单独琼脂糖没有显著差异。
[0017] 我们发现，当共价地固定化在医用级生物材料表面(例如，例如但不限于导管表面 (例如导尿管、腹膜透析导管或中央静脉导管）上提供的娃酬表面)上时，琼脂糖及还理 想地肝素)具有改善的抗菌、抗真菌、防污着和血液相容性特性。出人意料地，我们发现，与 原始(pristine)娃酬上的那些相比，在根据本发明的经琼脂糖修饰的表面上的革兰氏阴性 菌和革兰氏阳性菌二者的黏附和生物膜形成分别降低了 98%和>99%。无论下表面是否由 娃酬、聚氨醋或铁制成，均获得运些结果。经琼脂糖修饰的表面还抑制真菌生物膜的发生。 优选1、2、3、4或扣m厚的交联琼脂糖涂层，更理想地优选约2WI1厚的涂层，因为其在溶菌酶溶 液中老化30天之后并且还在高压灭菌之后是稳定的并且保持其抗微生物效力。此外，我们 发现，交联的琼脂糖涂层可有效地抵抗非特异性蛋白质吸附W及成纤维细胞和血小板黏 附。有利地，在涂层中共固定化(co-immobilization)约2.化g/cm2的肝素通过抑制血小板 活化、延长血浆复巧时间（plasma recalcification time,PRT)和降低溶血的程度进一步 改善了血液相容性，同时保持了涂层的防污着效力。
[0018] 根据本发明的第二方面，提供了用于制造医用或兽医用装置的方法，所述装置在 其表面的至少一部分上具有共价固定化且交联的琼脂糖涂层，所述方法包括：
[0019] i.使所述装置的表面氧化；
[0020] ii .将所述经氧化的表面暴露于经修饰的琼脂糖；W及
[0021 ] iii .使所述表面固化(curing)。
[0022] 在本发明的一个优选方法中，通过添加 W下对所述琼脂糖进行修饰:丙締酸醋、甲 基丙締酸醋、（甲基)丙締酷胺、硅烷、硫醇、叠氮化物、烘、乙締基化晚或乙締基咪挫基团、或 者本领域人员公知的运些基团的衍生物。
[0023] 在本发明的另一个优选方法中，氧化所述表面包括将所述表面暴露于氧等离子体 (oxygen plasma)或臭氧。作为替代或补充，使用利用气体(例如氣、氨、氮或氨)进行的等离 子体处理、然后暴露于空气来氧化所述表面。再次，所述表面可W使用电晕放电处理 (corona discharge treatment)或丫照射来氧化所述表面。
[0024] 在本发明的另一个优选方法中，将所述经氧化的表面暴露于经修饰的琼脂糖包 括:使用水溶液(例如丙締酸化琼脂糖的水溶液，通常但不排他地为5wt. % )并且理想地还 将该溶液涂覆在所述生物材料的表面上，理想地使用旋涂法(spin-coating procedure)或 通过将生物材料浸入溶液中。
[0025] 在本发明的另一个优选方法中，所述固化使用紫外(ultra violet,UV)光或加热 进行。理想地，固化在脱气环境中进行。在使用UV来固化表面的情况下，UV的量决定了固化 的量，并且我们发现，随UV照射时间延长(例如从15分钟至120分钟），经固定化的琼脂糖的 接枝密度提高。
[0026] 在本发明的另一个优选方法中，还将所述经氧化的表面暴露于经修饰的肝素。理 想地，使用丙締酸化琼脂糖和甲基丙締酸化肝素溶液的混合物。优选地，丙締酸化AG和/或 甲基丙締酸化肥P在溶液中的浓度为1至5wt%，理想地5wt. %。
[0027] 优选地，涂层中甲基丙締酸化肝素的量为约2.化g/cm2。根据本发明的另一方面， 提供了导管，所述导管在其表面的至少一部分上具有共价固定化且交联的琼脂糖涂层。
[0028] 根据本发明的另一方面，提供了导管，所述导管在其表面的至少一部分上具有共 价固定化且交联的琼脂糖和肝素涂层。
[0029] 在本发明的该方面中，所述肝素的浓度为约2.化g/cm2。
[0030] 在前述方面的任一项中，所述导管是腹膜透析导管或中央静脉导管或导尿管。
[0031] 根据本发明的另一方面，提供了适于防止细菌或真菌感染的医用或兽医用装置， 其包括如本文中所述的在其表面的至少一部分上具有共价固定化且交联的琼脂糖涂层的 医用装置。
[0032] 根据本发明的又一个方面，提供了适于防止网膜包裹的医用或兽医用装置，其包 括如本文中所述的在其表面的至少一部分上具有共价固定化且交联的琼脂糖涂层的医用 装置。
[0033] 根据本发明的另一方面，提供了如本文中所述的交联的琼脂糖涂层，其用于W共 价固定化的方式施加至医用或兽医用装置表面的至少一部分，来防止生物污着、细菌或真 菌感染。
[0034] 在本发明的所附权利要求书中和前述说明书中，除非上下文中因为语言表达或必 须暗示而另有说明，否则词语"包含"或变化形式例如"包括"或"含有"W包容性含义使用， 即列出所陈述特征的存在，但在本发明的各实施方案中不排除存在或添加另外的特征。
[0035] 在本说明书中引用的所有参考文献(包括任何专利或专利申请)通过引用并入本 文。不 承认任何参考文献构成现有技术。此外，不承认任何现有技术构成本领域公知常识的 一部分。
[0036] 本发明的各方面的优选特征可W结合任何其他方面进行描述。
[0037] 通过W下实施例，本发明的另一些特征将变得明显。一般而言，本发明延伸至本说 明书(包括所附权利要求书和附图）中所公开的特征中任意的新颖的一个特征或任意的新 颖的特征组合。因此，结合本发明的一个具体方面、实施方案或实施例描述的特征、整数、特 性、化合物或化学部分应理解为可应用于本文中所述的任何其他方面、实施方案或实施例， 除非与其不相容。
[0038] 此外，除非另有说明，本文中所公开的任何特征可被用于相同或相似目的的替代 特征所替换。
[0039] 本申请的整个说明书和权利要求书中，除非上下文中另有说明，否则没有数量词 修饰的名词表示一个/种或更多个/种。特别地，说明书中没有数量词修饰的名词应理解为 表示一个/种或更多个/种，除非上下文中另有说明。
[0040] 本申请的整个说明书和权利要求书中，琼脂糖表示为AG，并且肝素表示为肥P。
[0041] 现在通过举例且仅具体参考W下来描述本发明的一个实施方案，其中：
[00创主附图
[0043] 图1示意性地举例说明了娃酬表面的修饰，通过氧等离子体或臭氧处理在娃酬表 面上产生过氧化物和径基过氧化物，W充当用于随后AG聚合物链之固定化的错定位点（步 骤(1))，W及UV或加热诱导的丙締酸化AG和甲基丙締酸化肥P的固定化和交联(步骤(2))。
[0044] 图 2，（ a，a '）娃酬-g-AG4、（ b，b '）娃酬-g-HEP和（C，C '）娃酬-g-AG-HEP 1 膜的宽 扫描(widescan)和S化忍能级谱（core-level spectra)。插图示出对应膜的N Is忍能级 谱。在交联AG接枝的娃酬膜、娃酬-g-AG4的宽扫描谱中Si化和Si 2s信号的强度（图2(a)) 与原始娃酬膜的信号强度（图Sl(a))相比显著降低，表明AG成功地接枝到娃酬膜上。
[0045] 图3，（a)娃酬-g-AG4和(b)娃酬-g-AG-肥P1膜截面的FESEM图像。标尺条为1皿。
[0046] 图4,在暴露于金黄色葡萄球菌的PBS混悬液（108个细胞/mL)4个小时后，（a)原始 娃酬、（b)娃酬-g-AG4、k)娃酬-g-AG-HEP 1和(d)娃酬-g-HEP膜表面的SEM图像。标尺条为10 μηι。
[0047] 图5,在含有107个细菌细胞/mL的生长培养基中解育48小时后，（a-c)金黄色葡萄 球菌和(d-f)大肠杆菌化.coli)生物膜在(a，d)原始的、（b，e)娃酬-g-AG4和(c，f)娃酬-g- AG-肥P1膜上的沈Μ图像。标尺条为10皿。
[0048] 图6,在含有107个细菌细胞/mL的生长培养基中解育48小时后，通过涂布平板法 (spread plate method)确定在原始的和经修饰的膜表面上每cm2黏附的(a)金黄色葡萄球 菌和(b)大肠杆菌细胞的定量计数。*与原始娃酬相比的显著性差异(P<0.05)。#与各个所 制备的膜相比的显著性差异(P<〇.05)。
[0049] 图7,在含有107个细菌细胞/mL的生长培养基中解育48小时后，（a)原始铁锥、（b) AG修饰的铁锥、（C)AG-皿P修饰的铁锥、（d)原始聚氨醋膜、（e)AG修饰的聚氨醋膜和(f )AG- 肥P修饰的聚氨醋膜上大肠杆菌生物膜的沈Μ图像。标尺条为lOwii。
[0050] 图8，用1. Omg/mL的纯蛋白质溶液处理膜4小时后，在原始娃酬、娃酬-g-AG4、娃酬- g-AG-肥P1和娃酬-g-HEP膜上的BSA和FBG吸附。*与原始娃酬相比的显著性差异（P< 0.05)。
[0051] 图9,用3T3成纤维细胞(2X105个细胞/mL)解育24小时后，（a)原始娃酬、（b)娃酬- g-AG4、（c)娃酬-g-AG-皿Pl和(d)娃酬-g-皿P膜表面的光学显微术图像。标尺条为100皿。 (e)使用MTT测定定量分析每cm2膜表面黏附的3T3成纤维细胞。*与原始娃酬相比的显著性 差异(P<0.05)。
[0052] 图10,用富血小板血浆(platelet-rich plasma)解育1小时后，（a)原始娃酬、（b) 娃酬-g-AG4、（ C)娃酬-g-AG-皿P1和(d)娃酬-g-肥P膜表面的沈Μ图像。（a-d)及其插图中的 标尺条分别为10皿和扣m"(e)相对于原始娃酬表面，经修饰的娃酬表面上的血小板黏附。* 与原始娃酬相比的显著性差异(P<〇.05)。
[0化3 ] 图11，在原始娃酬、娃酬-g-AG4、娃酬-g-AG-肥P1和娃酬-g-肥P膜表面上的(a) PRT 和(b)溶血程度。*与原始娃酬相比的显著性差异(P<0.05)。
[0054] 补充附图
[0055] 图S1，原始娃酬膜的XPS(a)宽扫描和(a'）S化忍能级谱。（曰'）的插图示出原始娃 酬的N Is忍能级谱。
[0056] 图S2，UV诱导的接枝时间对娃酬-g-AG膜上黏附的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌细 胞之数目的影响。在暴露于各细菌的PBS混悬液（108个细胞/mU4小时后，使用涂布平板法 定量膜表面上黏附的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌细胞的数目。
[0057] 图S3,固定化肝素的浓度对娃酬-g-AG-皿P膜上黏附的金黄色葡萄球菌之数目的 影响。在暴露于金黄色葡萄球菌的PBS混悬液（108个细胞/mL)4小时后，使用涂布平板法定 量膜表面上黏附的金黄色葡萄球菌细胞的数目。
[0058] 图S4,在含有107个细菌细胞/mL的生长培养基中解育48小时后，通过涂布平板法 确定在每cm2原始娃酬表面和经琼脂糖修饰的（有或没有肝素)膜表面上黏附之铜绿假单胞 菌(P.aeruginosa)细胞的定量计数。*与原始娃酬相比的显著性差异(P<0.05)。
[0059] 图S5,在含有107个真菌细胞/mL的生长培养基中解育24小时后，（a)原始娃酬和 (b)娃酬-g-AG4膜上光滑念珠菌(C.glabrata)生物膜的沈Μ图像。标尺条为10皿。
[0060] 图S6，w(a)8小时和(b)18小时的加热时间制备的AG接枝的PD导管段之截面的SEM 图像。（a)和(b)中的标尺条分别为2WI1和扣m"(c)在含有107个细菌细胞/mL的生长培养基中 解育48小时后，通过涂布平板法确定在每cm2原始PD导管段表面和经修饰的PD导管段表面 上黏附之大肠杆菌细胞的定量计数。*与原始PD导管相比的显著性差异(P<0.05)。
[0061] 图S7,在含有107个细菌细胞/mL的生长培养基中解育48小时后，通过涂布平板法 确定在每cm2原始导尿管段表面和经修饰的导尿管段表面上黏附之大肠杆菌细胞的定量计 数。*与原始导尿管相比的显著性差异(P<〇.05)。
[0062] 图S8,在含有107个细菌细胞/mL的生长培养基中解育48小时后，通过涂布平板法 确定在每cm2原始PD导管段表面和经修饰的PD导管段表面上黏附之大肠杆菌细胞的定量计 数。*与原始PD导管相比的显著性差异(P<0.05)。
[0063] 图S9，用1. Omg/mL的FBG蛋白溶液预处理4小时后，（a，C)原始的和（b，d)娃酬-g- AG4膜上的(a, b)金黄色葡萄球菌黏附和(c，d)金黄色葡萄球菌生物膜的沈Μ图像。标尺条为 ΙΟμπ?ο
[0064] 图S10,原始娃酬、娃酬-g-AG4、娃酬-g-AG-HEPl和娃酬-g-HEP膜对3Τ3成纤维细胞 之生存力的影响。生存力表示为相对于由对照(没有任何膜存在下解育的3T3成纤维细胞） 所获得之结果的百分比。
[0065] 图S11，当（通常但不排他地）由娃酬制成的医用或兽医用装置通过与固定化且交 联的琼脂糖涂层相同的涂层(特别地但不排他地，通过添加肝素进一步修饰的涂层)修饰时 实现的有利作用的图解展示。
[0066] 表1通过确定的表面组成和经聚合物修饰之娃酬膜的水接触角。
[0067] 2.实验部分 [006引 2.1材料
[0069] 医用级娃酬膜购自Bioplexus Inc. (Ventura，CA，USA)。所有娃酬如inton?腹膜透 析（PD)导管均购自 Tyco International Ltd. (Princeton，NJ，USA)。铁（Ti)锥购自 Goodfellow Inc. (Huntingdon，!?)。聚氨酯膜贝勾自Central Polymer Engineering Supply (Singapore)。所有的娃酬.Bardex潑Foley导尿管均购自C.R.Bard Inc. (Murray Hill， NJ，USA)。琼脂糖（AG)购自Bio-Rad Laboratories化ercules，CA，USA)。肝素钢化EP)和3- [4，5-二甲基-嚷挫-2-基]-2，5-二苯基漠化四氮挫備漠化物(MTT)购自Alfa Aesar Co . (Ward Hill, MA，USA)。丙締酷氯(97%)、甲基丙締酸酢(94%)、牛血清白蛋白（BSA)、牛血浆 纤维蛋白原(FBG)和所使用的所有溶剂(分析级）购自Sigma-Al化ich( St丄ouiS，M0，USA)。 大肠杆菌化scherichia coli，ATCC D册α)、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, ATCC 25923)、光滑念珠菌（Candida glabra化，ATCC CBS138)、和3T3小鼠成纤维细胞购自 American Type Culture Collection(Manassas，VA，USA)。铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA01)贝勾自National Collection of Industrial Food and Marine Bacte;ria(NCIMB，Bucksbu;rn，Aberdeen,Scotland)。使用文献中所描述的程序类似制备丙 締酸化的AG。"简而言之，在100°C下将l.Og AG溶解在25血的N，N-二甲基乙酷胺(DMAC)中。 在AG完全溶解后，将溶液在冰水浴中冷却至0°C。然后，将2.5mL DMAC中的0.125mL丙締酷氯 在揽拌下逐滴添加到AG溶液中。允许反应在0°C进行1小时，在25°C另外进行4小时。丙締酸 化的AG产物在过量体积的丙酬中沉淀并用丙酬彻底清洗，随后在减压下干燥。使用与文献 中所述类似的方法制备甲基丙締酸化的肥Pc/4将200mg皿P溶解在lOmL双蒸水中。然后，将 10化甲基丙締酸酢添加到溶液中，使用4M化0田容液将该溶液的抑调整至8.5。将溶液在揽 拌下在0°C反应过夜。在过量体积的冷乙醇中沉淀甲基丙締酸化的肥P产物，随后使用透析 管（分子量截断值为1000，Spect;rum Laboratories Inc.，Rancho Dominguez,CA，USA)相对 于水进行透析，持续72小时。透析后，将甲基丙締酸化肥P溶液冷冻干燥。
[0070] 2.2制备琼脂糖^6)、肝素化6?)和46-肥?接枝的膜和导管
[0071] 为了制备交联AG接枝的娃酬膜(娃酬-g-AG)，将医用级娃酬膜切成2X2cm2的块并 在异丙醇、乙醇和双蒸水中超声清洁，每个步骤持续10分钟。使洁净的娃酬膜在Anatech SP100等离子体系统中经受氧等离子体5分钟。然后将经氧等离子体处理的膜暴露于大气另 外10分钟W促进在经等离子体处理的表面上形成过氧化物基团。运些过氧化物基团充当活 性位点W起始随后的UV诱导的固定化和交联反应，从而将丙締酸化AG接枝到经氧化的表面 上。将20化L丙締酸化AG水溶液(5wt. % )滴到经等离子体处理的娃酬膜表面上，所述膜放置 在SCS P6206旋涂仪上。WlOOOrpm的速度进行旋涂，持续60秒。然后对膜的另一面重复该过 程。将具有经旋涂之丙締酸化AG的娃酬膜放置在Pyrex玻璃管中并用氣气脱气30分钟。将玻 璃管密封并用UV光在Riko旋转光化学反应器(Model畑400-10W)中照射15、30、60和120分 钟W分别获得Silicone-g-AGl、娃酬-g-AG2、娃酬-g-AG3和娃酬-g-AG4膜(表1)。照射后，将 娃酬-g-AG膜用60°C的双蒸水彻底清洗24小时W除去物理吸附的 丙締酸化AG。类似地，分别 使用甲基丙締酸化的皿P溶液和具有如表1中所示之不同比例的丙締酸化AG和甲基丙締酸 化皿P溶液的混合物制备经皿P修饰的娃酬膜(娃酬-g-皿P)和经AG-皿P修饰的娃酬膜(娃 酬-g-AG-皿P)。类似地，使用未经修饰的AG溶液制备未交联AG涂覆的娃酬膜(娃酬-C-AG)。 溶液中丙締酸化AG、甲基丙締酸化肥P和未修饰AG的浓度固定在5wt. %。
[0072] 用于经交联AG接枝的Ti锥和AG-皿P接枝的Ti锥W及聚氨醋膜的制备方法与用于 AG接枝之娃酬膜的那些类似。将Ti锥切割成1 X 1cm2的块，然后依次在Kroll试剂(4.0%HF、 7.2%HN03、88.8%水）、二氯甲烧、丙酬和水中超声清洁，每一步持续10分钟，然后用AG或 AG-皿P接枝，而将聚氨醋膜切成2 X 2cm2的块并在乙醇和水中超声清洁，每一步持续10分 钟。之后，采用如上所述的旋涂和UV照射。
[0073] 为了制备AG和AG-皿P接枝的娃酬导管，将PD导管切成6cm的段并如上所述用异丙 醇、乙醇和水进行清洗。为了活化导管段的腔外表面和腔内表面二者，使用臭氧替代氧等离 子体。在用氧-臭氧气体混合物（由Azcozon臭氧发生器(Model VMUS-4PSE)产生，氧流入速 率为60L/小时，臭氧产生速率为约3.6g/小时)预处理20分钟之后，将经臭氧处理的导管段 引入含有如上所述各试剂(5wt.%的AG或AG-HEP)的Pyrex玻璃管中并用氣气脱气30分钟。 将玻璃管密封，在油浴中加热至70°C，然后在70°C维持8小时。反应后，将AG或AG-HEP修饰的 导管段用双蒸水在60°C清洗24小时。类似地，通过臭氧预处理、暴露于各试剂和UV照射，用 AG和AG-HEP接枝导尿管段（1cm长）。
[0074] 通过向含有10血丙締酸化AG水溶液(5wt. %)的Pyrex管添加5mg 4,4'-偶氮双(4- 氯基戊酸)来制备交联AG水凝胶(没有娃酬膜）。用氣气吹扫30分钟后，将烧瓶密封并在Riko 旋转光化学反应器中用UV光照射120分钟。照射后，用乙醇和双蒸水在60°C清洗交联AG水凝 胶24小时，随后冷冻干燥。类似地，使用丙締酸化AG和甲基丙締酸化肥P溶液的混合物(丙締 酸化AG:甲基丙締酸化皿P = 9:l(w/w))制备交联AG-皿P水凝胶。通过W下制备未交联的AG 凝胶，将未经修饰的AG溶液加热至120°C并冷却至25°C，随后冷冻干燥。
[0075] 2.3微生物黏附和生物膜形成测定
[0076] 在生长培养基中过夜培养细菌(膜蛋白酶大豆肉汤用于金黄色葡萄球菌，营养肉 汤用于大肠杆菌，并且溶原性肉汤用于铜绿假单胞菌）。然后将含有细菌的生长肉汤W2， 70化pm离屯、10分钟W除去上清。用PBS(抑7.4)清洗细菌细胞并W108个细胞/mL的浓度重悬 在PBS中，如从540nm的光密度(0D)所估计的（540nm处的0D为0.1等同于基于平板涂布计数 的约108个细胞/mL)。在37°C，将1 X 1cm2大小的原始娃酬膜和经修饰的娃酬膜放置在24孔板 中并用ImL细菌混悬液覆盖4小时。在细菌黏附过程之后，将膜用PBS清洗Ξ次W除去未黏附 的细菌。为了定量黏附的细菌，如文献所述进行涂布平板法。1S简而言之，将具有黏附细菌的 膜放到2mL PBS中并超声处理7分钟，随后满旋30秒W将细菌细胞释放到PBS中。将细菌混悬 液连续稀释并铺到琼脂平板上。培养过夜后，通过对琼脂平板上的菌落数目进行计数来定 量活细菌细胞的数目。为了扫描电子显微术（scanning electron microscopy,沈M)观察， 将膜上黏附的细菌用PBS中3vol. %戊二醒在4°C固定过夜。在用25%、50%、75%和100%乙 醇连续脱水(每次10分钟)后，将膜在减压下干燥，涂覆销，并在沈Μ下观察。为了评估原始娃 酬和经修饰娃酬上黏附细菌的生存力，用组合染料化IVE/DEAD Ba化ight细菌生存力试剂 盒)对膜进行染色并在配备100W Hg灯的Leica DMLM显微镜下观察。
[0077] 为了评估金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌的生物膜形成，将过夜细菌 培养肉汤用其相应的生长培养基稀释到1〇7个细胞/mL的浓度。在37°C，将原始的和经修饰 的基材（IX 1cm2膜或1cm导管段)放置在24孔板中并用ImL细菌混悬液覆盖48小时W允许生 物膜生长。生物膜生长阶段之后，用PBS将基材清洗Ξ次。在沈Μ下观察膜，使用如上所述的 涂布平板法定量膜和导管段(腔内表面和腔外表面二者)上生物膜细菌细胞的数目。
[0078] 为了评估光滑念珠菌的生物膜形成，将过夜真菌培养肉汤稀释到107个细胞/mL的 浓度。在37°C，将原始的和经修饰的基材（IX 1cm2膜)放置在24孔板中并用ImL真菌混悬液 覆盖。1.5小时之后，将真菌混悬液除去并用PBS清洗基材两次。然后在基材上添加 ImL的新 鲜培养基，在37°C保持24小时W允许真菌生物膜生长。在生物膜生长阶段之后，将基材用 PBS中的3vol. %戊二醒固定并经历用25%、50%、75%和100%乙醇连续脱水并在沈Μ下观 察。
[00巧]2.4稳定性测试
[0080]通过使膜在37°C在溶菌酶水溶液（1化g/mU中老化30天来评估娃酬膜上AG和AG- 皿P接枝层的稳定性。选择溶菌酶浓度来模拟人血清中的浓度。在老化阶段之后，如上所述 进行膜上细菌生物膜形成的评估W测试涂层的稳定性。处于比较的目的，还进行了溶菌酶 溶液中所制备的AG和AG-肥P水凝胶(没有娃酬膜）的降解。1 OOmg的干AG和AG-皿P水凝胶在 37°C在lOmL溶菌酶溶液（1化g/mL)中老化30天。老化阶段之后，使用透析管(分子量截断值 为3500，Spect;rum Laboratories Inc.，Rancho Dominguez,CA，USA)相对于水对水凝胶进 行透析，持续72小时，随后冷冻干燥。重量损失(wei曲t loss)的程度如下计算：
[0081 ] WL=(WB-WA)/WBX100% (1)
[0082] 其中WB和WA分别是老化之前和之后的水凝胶重量。
[0083] 通过在两块生肉（猪肉）之间牵拉导管段研究摩擦力下经修饰的PD导管的稳定性。 将肉固定在长度为5cm的两个PMMA平板之间。将6cm长的经修饰导管段从一侧插入到两块肉 之间并从另一侧拉出。将运一过程重复5次。在摩擦测试之后，将导管段切成1cm长并如上所 述在导管段上进行细菌生物膜形成的测定W测试接枝层的稳定性。还对6cm经修饰导管段 进行弯曲测试，其中该段向上和向下弯曲成圆15次。在弯曲测试之后，将导管的中间3cm(经 受最高的弯曲应力）切成1cm长的Ξ段，然后在运些段上进行细菌生物膜形成的测定。
[0084] 2.5蛋白质吸附
[0085] 首先将2 X 2cm2大小的原始娃酬膜和经修饰娃酬膜在CPBS(巧樣酸盐-憐酸盐缓冲 盐水、PBS和0.01M巧樣酸钢，pH 7.4)中平衡1小时，然后在37°C浸入纯BSA或FBG蛋白质溶液 (CPBS中的1. Omg/mL)中4小时。在该蛋白质吸附阶段之后，分别用CPBS和双蒸水清洗膜两 次。使用与文献中所述类似的方法，采用修改的染料相互作用法使用Bio-Rad蛋白质染色试 剂(Catalog No.500-0006)确定吸附在膜上之蛋白质的量。1S简而言之，将不同已知浓度的 蛋白质溶液(〇.4mL)添加到lOmL的5倍稀释的胆藏染料溶液。10分钟后，W50(K)rpm离屯、15分 钟，然后使用在465nm的蛋白质-染料溶液之上清液的吸光度来获得标准校准曲线。为了定 量吸附到膜上的蛋白质，将膜放到lOmL的染料溶液中。浸入3小时后，移出膜。将剩余的溶液 离屯、并在465nm测量上清液的吸光度。由标准校准曲线计算吸附到膜上之蛋白质的量。
[00化]2.6细胞毒性测定
[0087]使用标准MTT测定研究经修饰娃酬膜的细胞毒性。使用补充有10%胎牛血清、ImM k谷氨酷胺、lOOIU/mL青霉素的DMEM培养3T3成纤维细胞。将含有密度为104个细胞/mL之 DMEM 3T3成纤维细胞的ImL培养基放置到24孔板的各个孔中。然后将板在95%空气和5% C〇2的潮湿气氛中于37°C解育24小时。用新鲜培养基替换培养基之后，将IX 1cm2大小的膜轻 轻的放在孔中的细胞层上。使用不含膜的完全生长培养基进行对照试验(无毒对照）。在37 °〇另外解育24小时后，除去每个孔中的培养基和膜。然后向每个孔添加9(Κ)化的培养基和 100化的ΜΤΤ溶液(PBS中5mg/mL)。解育4小时后，除去ΜΤΤ溶液和培养基并添力日ImL二甲基亚 讽（DMS0) W溶解甲歷结晶（formazan ciTstal)。然后在BI0-TEK微孔板读取仪（Model 化werwave XS)上测量570皿处的吸光度。结果表示为相对于在对照试验中所获得之吸光度 的百分比。
[008引2.7细胞黏附
[0089] 将1 X 1cm2大小的原始娃酬膜和经修饰的娃酬膜放置在24孔板中。添加含有密度 为2 X105个细胞/mL之3T3成纤维细胞的ImL培养基并解育24小时。在解育阶段之后，用培养 基润洗膜Ξ次W除去未黏附细胞。使用Leica DMLM显微镜查看具有黏附细胞的膜表面。为 了对黏附的3T3成纤维细胞进行定量，将具有黏附细胞的膜放置在24孔板中并进行MTT测 定。通过W下来建立标准校准曲线:在24孔板中接种已知数目的3T3成纤维细胞并于37°C解 育4小时，随后进行Μ?Τ测定。由标准校准曲线计算黏附到膜上的3T3成纤维细胞之数目。
[0090] 2.8血小板黏附
[0091 ]将从健康兔收集的新鲜血液立即与3.8wt%巧樣酸钢溶液W9:1 (v/v)的比例混 合。通过将血液在8°CW700rpm离屯、10分钟获得富血小板血浆（Platelet-rich plasma, PRP)。用PBS W1:1 (v/v)的比例稀释PRP，并将ο. 1血经稀释PRP引入到1 X 1 cm2的娃酬膜表面 上。在37°C解育1小时后，将膜用PBS清洗Ξ次。然后将黏附血小板用PBS溶液中的3vol%戊 二醒在4°C固定过夜。在用10%、25%、50%、75%、90%和100%乙醇连续脱水(每次10分钟） 后，将膜在减压下干燥，涂覆销，并在serf观察。通过在相同放大倍数（X2,000)通过代表 性沈Μ图像计数的黏附血小板总数定量膜上血小板的数目。U从经修饰的膜获得的结果相对 于从原始娃酬获得的结果进行归一化。
[0092] 2.9血浆复巧时间。脚）
[0093] 如上所述制备与3.8wt %巧樣酸钢溶液混合的来自健康兔的新鲜血液。通过将血 液在8°CW3,000rpm离屯、20分钟获得贫血小板血浆（platelet poor plasma，PPP)，并将 O.lmL的PP巧I入到2X2cm2娃酬膜的表面上。所述膜在37°C解育10分钟后，向娃酬膜上的 PPP添加0.1 mL 37°C的0.025M CaCb水溶液。监测PPP溶液的凝结，通过将用娃酬涂覆的不 诱钢丝钩手动浸入到溶液中W检测纤维蛋白丝(fibrin thread)。在第一次出现丝样纤维 蛋白时记录PRT。
[0094] 2.10溶血测试
[00巧]将1 X 1cm2大小的娃酬膜和lOmL的PB巧I入到BIOLOGIX"'离屯、管中。管在37°C 解育1小时后，添加0.2mL的经稀释兔血液(8mL血液与10血的PBS混合)并将管在37°C再解育 1小时。使用PBS和双蒸水分别作为阴性对照和阳性对照。然后将管Wl，5(K)rpm离屯、10分钟 并用HITACHI分光光度计(Model U-2800)在545nm处测量上清液的吸光度。如下计算溶血率 (hemolysis rate,HR)：
[0096] HR=(AS-AN)/(AP-AN) (2)
[0097] 其中AS、AN和AP分别是含有膜、阴性对照和阳性对照之溶液的上清液的吸光度。 [009引 2.11表征
[0099] 由于导管的弯曲表面(curved surface)，无法在其表面上容易地对黏附的细菌细 胞实施表征方法，例如X射线光电子能谱法(X-ray photoelectron spectroscopy，XPS)和 接触角测量W及SEM观察。因此，选择平的医用级娃酬片作为模型表面，在修饰后，进行涂层 表征的研究。在具有单色A1 ΚαΧ射线源（1486.71eV光子）的AXI S叫traDLD光谱仪化ratos Anal}ftical Ltd.，UK)上通过XPS分析娃酬膜的表面化学组成。通过SEM(J"E0L，Model 560化V)观察娃酬膜表面，并分别通过场发射扫描电子显微镜术(FESEM，JE0L，Model JSM- 6700)和沈Μ观察膜和导管的截面。使用双面碳胶带(double-sided carbon tape)将样品固 定在SEM金属粧(metal stub)上并瓣射涂覆薄的销层W增强图像的对比度和质量，然后用 SEM和FESEM进行观察。使用如先前所述的甲苯胺蓝方法对经修饰膜上固定化肝素浓度进行 定量。"在室溫，在Rame-化rt伸缩式测角仪（Rame-化；rt telescopic goniometer，Model 100-00-(230))中使用：3化水滴通过液滴法(sessile drop method)测量不同表面的静态接 触角。对于每个样品，在表面的不同区域进行Ξ次测量，并且每次用一式Ξ份的样品进行至 少Ξ次独立的测试。
[0100] 2.12统计学分析
[0101] 结果报告为平均值±标准差（SD)并使用单因素方差分析(AN0VA)和化k巧事后检 验在统计学上进行评估。接受P<〇.05为统计学显著。
[0102] 3.结果和讨论
[0103] 3.1表面表征
[0104] 在图1中图示举例说明了在娃酬表面上共价接枝和交联AG和AG-HEP聚合物的过 程。通过氧等离子体或臭氧处理在娃酬表面上产生的过氧化物或径基过氧化物充当错定位 点，用于后续聚合物链的固定化。1嘴图帥示出了AG、肥巧日AG-肥P接枝的娃酬膜的XPS宽扫 描、S化忍能级谱和N Is忍能级谱。在娃酬-g-AG4膜的宽扫描谱中Si化和Si 2s信号的强 度（图2(a))与原始娃酬膜（图Sl(a))的信号强度相比显著降低，表明成功地将AG接枝到娃 酬膜上。如所预期的，在娃酬-g-AG4的S化忍能级谱和N Is忍能级谱中没有可辨别的硫和 氮信号(分别为图2(a'）及其插图），因为运些元素不存在于娃酬或丙締酸化AG聚合物中。如 表1所示，通过XPS确定原始的娃酬和聚合物修饰之娃酬的表面元素组成。娃酬-g-AG4膜的 [Si]/[C]比例为约0.08:1并且远低于原始娃酬的比例(0.52:1)。可^从[51]/[口比例定量 地评估AG接枝的程度，因为Si仅存在于娃酬中并且不存在于丙締酸化AG中。如表1所示，随 着UV照射时间从15分钟延长至120分钟，娃酬-g-AGl、娃酬-g-AG2、娃酬-g-AG3和娃酬-g- AG4膜的[Si]/[C]比例降低，表明固定化AG之接枝密度提高。
[0105] 对于娃酬-g-皿P膜，120分钟的UV诱导甲基丙締酸化皿P接枝后，在S化忍能级谱 和N Is忍能级谱（分别为图2(b'）及其插图）中存在硫和氮信号。此外，娃酬-g-HEP膜的 [Si]/[C]比例降低至0.14:1，运也确认了娃酬膜上肥P的成功接枝。如通过甲苯胺蓝法确定 的，固定化肥P的表面浓度为12. lyg/cm2娃酬-g-肥P膜。
[0106] 对于娃酬-g-AG-皿P1膜，在S 2p忍能级谱和N Is忍能级谱中可辨别硫和氮信号 (分别为图2(c'）及其插图）。娃酬-g-AG-HEPl膜的[Si]/[C]比例降低至0.10:1。图3示出了 经AG和AG-HEP修饰膜之截面的FESEM图像。可W清楚地观察到娃酬-g-A(M上接枝的AG层（图 3 (a)中的上层）的厚度和娃酬-g-AG-肥P1上AG-HEP层（图3 (b)的上层）的厚度为约2皿，确认 AG和AG-皿P成功地接枝到娃酬表面上。接枝的AG层的厚度可通过改变UV照射时间而不同。 当UV照射时间降低至60分钟和15分钟，接枝AG层的厚度分别降低至0.祉m和0.3μπι。随着反 应溶液中甲基丙締酸化肥Ρ的进料比（feed ratio)的提高，固定化皿Ρ的表面浓度提高（与 表1中娃酬-g-AG-皿P1和娃酬-g-AG-皿P2的固定化皿P浓度相比），运也被表1中运些膜的
[S]/[C]和[N]/[C]比例提高所确认。
[0107] 原始的娃酬和聚合物修饰娃酬之水接触角的改变也提供了娃酬膜表面已经被成 功修饰的支持证据。如表1所示，原始娃酬膜是疏水的，水接触角为107°。用AG、肥P和AG-HEP 接枝后，经修饰之娃酬膜变成亲水的，具有低得多的水接触角。此外，可W观察到，经AG修饰 之娃酬膜的接触角随UV反应时间的延长而提高，表明固定化AG的接枝密度提高，运与运些 膜的表面[Si]/[C]比例所掲示的结果一致(表1)。
[0108] 3.2微生物黏附和生物膜形成测定
[0109] 形成对细菌黏附的表面抗性是防止细菌感染的关键步骤。在黏附到表面上后，细 菌将在生长培养基的存在下增殖并形成生物膜。生物膜继而保护细菌不受宿主天然防御系 统W及抗生素的影响。对于植入的装置(例如PD导管），插入后的前几个小时被认为是重要 的时期，其中所引入的病原体仍然处于静止阶段，并且宿主免疫系统可主动地中和入侵的 病原体。使用模型细菌(革兰氏阳性金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性大肠杆菌)评价经聚合物 修饰之娃酬膜降低细菌黏附的效力，因为它们是引起PD相关感染的最常见物种。图4示出原 始娃酬膜和经修饰之娃酬膜上黏附的金黄色葡萄球菌细胞的沈Μ图像。在PBS中解育4小时 后，在原始娃酬上观察到大量的金黄色葡萄球菌（图4(a))。在用AG、AG-皿P和皿P对娃酬膜 的表面进行修饰之后，黏附的金黄色葡萄球菌的数目显著降低（图4(b-d))。公知的是，微生 物因为疏水相互作用偏好附着至疏水性表面。W因此，经AG、AG-HEP和肥P修饰之娃酬抑制金 黄色葡萄球菌黏附的能力可归因于表面亲水性的改进，运是由亲水性聚合物的接枝导致 的。因此，AG和肥P聚合物是抗黏附的，但并非杀菌的。经AG修饰之娃酬的抗黏附特性强烈依 赖于固化定AG层的接枝密度，运与UV诱导的接枝时间相关（图S2)。抑制金黄色葡萄球菌和 大肠杆菌黏附的效力随着UV照射时间的延长而提高。120分钟的UV诱导接枝后，所得的娃 酬-g-AG4分别将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌黏附降低约98%和约99%。
[0110] 肥P在降低金黄色葡萄球菌黏附方面不如AG有效(比较图4(d)与图4(b))。因此，在 经AG-肥P修饰之娃酬上接枝大量的肥巧尋导致黏附的细菌数目提高。如果固定化皿P之表面 浓度被限制到2.化g/cm2或更低，则娃酬-g-AG-肥P的抗菌效力将没有与娃酬-g-A(M的抗菌 效力显著不同（比较图S3中具有不同表面浓度之皿P的娃酬-g-AG-皿P膜上黏附的细菌数 目）。
[0111] 细菌和真菌生物膜是PD透析中腹膜炎和其他PD导管相关感染的主要原因。类似 地，在中央静脉导管和导尿管上的生物膜形成分别提高了 CABSI和CAUTI的风险。在本工作 中，在含有1〇7个细菌细胞/mL的生长培养基中解育48小时后评估经聚合物修饰的娃酬膜在 抑制细菌生物膜形成中的效力。图5示出在原始娃酬表面和经修饰娃酬表面上细菌生物膜 的沈Μ图像。从图5(a)和5(d)可W看出，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌二者在原始娃酬膜上都 容易形成厚的生物膜。在娃酬表面上接枝AG之后，观察到细菌生物膜显著降低。在娃酬-g- AG4膜和娃酬-g-AG-肥P1膜(分别为图5(b)和5(c))上没有明显的金黄色葡萄球菌生物膜， 但存在一些细菌集群(cluster)。娃酬-g-AG4膜和娃酬-g-AG-皿P1膜在防止大肠杆菌生物 膜形成方面甚至更有效，仅可观察到几个单独的细菌细胞(分别为图5(e)和5(f))。运些结 果表明，与大肠杆菌生物膜相比，更难W防止在娃酬表面上形成金黄色葡萄球菌生物膜，运 与先前的报道21-致。然而，原始娃酬膜和经修饰之娃酬膜上黏附的细菌数目的定量显示， 与原始膜相比，经修饰的娃酬(娃酬-g-AG4和娃酬-g-AG-肥P1)将黏附的金黄色葡萄球菌和 大肠杆菌数目分别降低了约2.4和约3.3个数量级（图6(a)和6(b))。除了大肠杆菌和金黄色 葡萄球菌，还评估经AG和AG-皿P修饰之娃酬膜上的革兰氏阴性铜绿假单胞菌生物膜形成， 因为铜绿假单胞菌是PD透析中感染的另一个主要原因。与原始的娃酬相比，经AG和AG-皿P 修饰之娃酬膜上黏附的铜绿假单胞菌细胞数目降低超过2个数量级（图S4)。因此，细菌黏附 和生物膜形成测定指示AG和AG-皿P接枝层有效地对抗革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌物种 二者。
[0112] 真菌感染在死亡率和发病率方面是比细菌感染更严重的PD相关感染，在受感染的 PD患者中的死亡率多至44%。22评估AG修饰之娃酬膜在抑制真菌生物膜形成中的效力并且 在图S5中示出SEM图像结果。如图S5(a)所示，光滑念珠菌容易在原始娃酬膜上黏附并形成 多个集群。在娃酬表面上表面接枝AG后，观察到真菌细胞和集群的数目显著降低（图S5 (b))，指示AG涂层有效地抑制真菌生物膜形成。
[0113] 在图7中示出了用经AG和AG-HEP修饰之Ti锥和聚氨醋膜暴露于生长培养基中的大 肠杆菌所获得的相应结果。将该图中的结果与图5(d)至5(f)相比，可W得出W下结论:在抑 制生物膜形成方面，AG和AG-HEP接枝层在Ti和聚氨醋上与在娃酬上同等有效。
[0114]除了平娃酬膜表面，通过w下将AG和AG-皿P聚合物接枝到管状PD导管表面上:臭 氧处理，随后加热诱导聚合物层的固定化和交联。通过改变加热时间，AG接枝层的厚度可不 同。在图S6(a)和S6(b)中举例说明运一点，其示出分别使用8小时和18小时加热时间制备的 经AG修饰之PD导管的截面。运些加热时间分别导致约2皿和约扣m厚的AG接枝层。图S6k)示 出在培养基中解育48小时后原始导管表面和经修饰导管表面上黏附的大肠杆菌的数目。与 用娃酬-g-AG4膜所获得的结果类似，经AG和AG-肥P修饰的PD导管使黏附的细菌细胞数目降 低超过3个数量级。此外，发现在具有2μπι和扣m聚合物接枝层的经修饰导管上的黏附细菌细 胞数目没有显著差异，指示超过2μπι厚度的AG和AG-HEP涂层的抗菌效力没有显著的改进。还 测试了通过W下将AG和AG-皿Ρ聚合物接枝到管状导尿管表面:臭氧处理，随后UV诱导固定 化。图S7示出经修饰之导尿管段也非常显著地降低了细菌定殖。
[011引 3.3稳定性
[0116] 如果将涂层施加到导管上，其稳定性是一项重要的需求，因为导管可能长时间放 置在身体中。通过W下评估经AG和AG-肥Ρ修饰之娃酬膜的稳定性:将膜在溶菌酶溶液中于 37°C老化30天后在其上进行细菌生物膜测定。如图6(a)中所示，在生物膜测定之后黏附的 金黄色葡萄球菌数目稍微提高，但对于老化的AG和AG-肥P修饰的膜不显著(P>0.05)。对于 大肠杆菌获得了类似的结果（图6(b))。此外，生物膜形成测定还示出，在121°C高压灭菌20 分钟后，娃酬-g-AG4和娃酬-g-AG-肥P1保持其抗菌特性（图6 (a)和6 (b))。运些结果表明，娃 酬上的交联AG和AG-肥P层是稳定的。老化30天后接枝层的稳定性还指示交联的AG和AG-肥P 层能够防止娃酬的疏水性恢复并维持其抗菌效力。
[0117] 用交联的AG和AG-皿P水凝胶和未交联的AG水凝胶在溶菌酶溶液中进行30天的类 似老化试验。对于交联的AG和AG-HEP水凝胶，分别观察到13.5%和11.8%的重量损失。未交 联的AG水凝胶示出22.7%的更高重量损失。用老化的娃酬-C-AG膜(未交联的AG涂覆的娃酬 膜)进行生物膜测定（图6)也确认未交联的AG涂层不如交联的涂层稳定。此外，在121°C高压 灭菌20分钟后，娃酬-C-AG膜不具有抗菌特性，因为未交联的AG层仅物理吸附到膜上并且其 在高压灭菌过程中烙化。
[0118] 当导管插入到体内时，其将遇到摩擦力和弯曲力。在经历运样的力之后，使用细菌 生物膜形成测定评价PD导管上交联的AG和AG-肥P层的稳定性，结果在图S8中示出。经AG和 AG-HEP修饰之导管示出良好的稳定性，因为在摩擦和弯曲测试之后，经修饰的导管上黏附 的细菌数目没有显著改变。
[0119] 3.4蛋白质吸附和细胞黏附
[0120] 网膜包裹是PD治疗中PD流出失败的首要原因。网膜(omentum)是主要的腹膜防御 器官，并且响应于炎症或异物，其将黏附并隔离开受影响的区域。ro导管表面上的蛋白质吸 附对于网膜包裹是关键因素，因为认为网膜黏附的机制设及在攻击部位纤维蛋白渗出物的 形成，运吸引成纤维细胞和白细胞主动迁移并最终导致受影响区域被包裹。在运个工作中， 研究 在经修饰娃酬膜上两种蛋白质FBG和BSA的吸附。如图8所示，在原始娃酬膜上吸附的 FBG和BSA的量分别为约2.化g/cm2和约1.化g/cm2。在用AG接枝后，蛋白质吸附非常显著地降 低。娃酬-g-AG4降低约98 %的BSA和FBG吸附，并且娃酬-g-AG-皿P1膜示出类似的蛋白质吸 附降低。已知亲水性AG聚合物上蛋白质的非特异性吸附是非常低的，并且AG及其衍生物经 常用作蛋白质分离的支持材料W使非特异性吸附最小化。因此，在娃酬-g-AG4膜和娃酬-g- AG-肥PI膜上观察到的蛋白质吸附降低可归因于AG层。另一方面，娃酬-g-肥P膜在降低蛋白 质吸附方面不太有效(吸附的BSA和FBG分别降低约51%和约80%)。运是由于皿P能够与某 些种类的蛋白质（包括BSA和FBG)相互作用。然而，如果（例如娃酬-g-AG-皿P1膜上）固定化 肥P较低(2.化g/cm2)，则保留了 AG的蛋白质排斥特性(与娃酬-g-A(M相比，图8)。
[0121] 使用FBG和金黄色葡萄球菌研究原始娃酬膜和娃酬-g-AG4膜上蛋白质吸附对后续 细菌黏附和生物膜形成的影响。图S9(a)和S9(b)示出用FBG预处理后在运些膜上黏附的金 黄色葡萄球菌的沈Μ图像。与图4(a)相比，可W在图S9(a)中观察到细菌细胞的集群提高，运 与更早报道的结果一致，所述结果示出在聚化咯表面上预吸附的FBG增强金黄色葡萄球菌 黏附到表面上和凝集。运归因于由金黄色葡萄球菌细胞表达的FBG结合蛋白（凝集因子）。用 FBG预处理后娃酬-g-A(M膜上黏附的细菌细胞数目轻微地升高(将图S9(b)与4(b)比较），但 运些细胞保持为单独单元而非成簇。图S9(c)和S9(d)示出用FBG预处理的原始娃酬膜和娃 酬-g-AG4膜上金黄色葡萄球菌生物膜的SEM图像。无论FBG存在与否，在原始娃酬膜上形成 厚的生物膜。然而，在FBG预处理后，娃酬-g-AG4膜仍能够抵抗生物膜形成，因为FBG吸附的 程度低（图8)。
[0122] 在细胞黏附测定中，选择3T3小鼠成纤维细胞作为模式哺乳动物细胞来研究其与 经修饰娃酬膜的相互作用。图9(a-c)示出在原始娃酬表面和经修饰娃酬表面上黏附的3T3 成纤维细胞的光学显微术图像。大量的3T3成纤维细胞容易地黏附在原始娃酬表面上（图9 (a))，而成纤维细胞在AG和AG-HEP修饰的表面上的黏附几乎被完全抑制（图9(b)和9(c))。 从图9(d)还可W看出，在防止3T3成纤维细胞黏附方面，肥P不如AG和AG-肥P那样有效。与原 始娃酬相比，经AG和AG-HEP修饰的娃酬分别降低了约92%和约93%的3T3成纤维细胞黏附， 然而经皿P修饰的娃酬上的降低为约83 % (图9(e))。在AG、AG-皿P和皿P修饰的娃酬膜上成 纤维细胞黏附程度的差异可与其蛋白质排斥性质相关，因为已报道非特异性蛋白质吸附对 于抑制细胞与材料表面的相互作用是关键的。
[0123] 虽然已知AG和肥P是无毒的，但是需要测试经修饰娃酬膜的细胞毒性，因为所制备 的AG和AG-肥P涂层旨在用于可植入装置。使用Μ?Τ测定用3T3成纤维细胞评价原始娃酬膜和 经修饰娃酬膜的细胞毒性。在所有情况下，放置成与原始膜和经修饰膜接触24小时的3T3成 纤维细胞的存活力大于95% (图S10)。与对照试验(不存在任何膜)相比，在细胞生存力中没 有发现显著差异，指示运些膜没有细胞毒性或具有很低的细胞毒性。运些细胞生存力结果 还确认了经修饰娃酬表面上细胞黏附的降低（图9)是由于聚合物涂层的抗黏附特性而非由 于其细胞毒性。
[0124] 3.5血液相容性测定
[0125] 血液相容性是在人体中与血液接触的生物医学装置(例如中央静脉导管）的重要 特性。表面上的血小板黏附和活化可诱导血液凝集和血栓形成。在PD中，运样的事件可导致 腔内阻塞W及最终导致导管的流出失败。通过血小板黏附和活化、溶血和血浆复巧时间 (PRT)测试评价经AG和AG-HEP修饰的娃酬膜的血液相容性。在图lO(a-d)中示出了原始娃酬 膜和经修饰娃酬膜上血小板黏附的SEM图像。血小板很容易黏附到原始娃酬表面上（图10 (a))并且黏附的血小板是高度活化的，具有伪足和伸展（spreading)的特征。在将AG和AG- 肥P接枝到娃酬上后，黏附的血小板的数目显著降低（图10(b)和10(c))。多种膜上黏附的血 小板数目的定量比较（图10(e))示出与原始表面相比，经修饰娃酬表面上的血小板黏附降 低了超过一个数量级。AG和AG-HEP修饰之娃酬膜上对血小板黏附的抗性再次归因于如上所 讨论的其蛋白质排斥特性，因为血浆蛋白吸附（特别是血小板黏附促进蛋白（FBG)的吸附） 在血小板黏附到生物材料表面上中发挥重要作用。然而，应当注意到，娃酬-g-AG4膜上的血 小板仍然是活化的（图10(b)的插图），表明AG涂层不能有效地抑制血小板活化。另一方面， AG-皿P涂层有效地防止了血小板的活化（图10(c)的插图），并且运可W归因于AG-肥P层中 肥P的存在。肥P通常用作抗凝剂并且已经被报道能够抑制血小板黏附和活化，运通过娃酬- g-HEP膜上低程度的血小板黏附和活化得到确认（图10(d))。
[0126] 图11(a)示出了从原始娃酬膜和经修饰娃酬膜上的血液凝集测试所得到的PRT结 果。将AG接枝到娃酬上导致PRT显著降低约13至约16分钟(P<0.05)，而在AG接枝层中存在 HEP的情况下，PRT进一步降低至约1 9分钟。已知HEP W高亲和力结合抗凝血酶111 (antit虹ombin ΙΙΙ,ΑΤΠΙ)，导致ΑΤΠΙ构象改变。随着运一构象改变，ΑΤΠΙ的活性位点更 暴露，运极大地促进了 ΑΤΠΙ抑制凝血蛋白酶的活性，继而延迟了纤维蛋白原向纤维蛋白的 转变并抑制凝血。溶血是与血液接触的生物材料之血液相容性相关的另一个问题。图11(b) 示出用原始娃酬膜和经修饰娃酬膜获得的溶血程度。原始娃酬的溶血程度为约1%。在AG、 AG-HEP和皿Ρ接枝后，经修饰娃酬膜示出显著更低的溶血程度(Ρ<0.05)，娃酬-g-AG4的 O. 77%到娃酬-g-皿P膜的0.56%。尽管根据美国材料与试验协会(American Society for Testing and Materials，ASTM)F 756-00标准，对于生物材料，2%的溶血程度被认为是非 溶血性的并且原始娃酬满足运一要求，但经修饰的膜进一步降低了溶血的程度，继而改善 娃酬的血液相容性。
[0127] 4.结论
[0128] 将AG和皿P聚合物共价固定化在医用级生物材料和导管表面上(腔内和腔外改 善其抗微生物、抗真菌、防污着和血液相容特性特性。与原始娃酬相比，在经AG修饰的表面 上，革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的黏附和生物膜形成分别降低98%和>99%。光滑念珠 菌在AG修饰之表面上的生物膜形成也被抑制。通过类似方法在Ti锥、聚氨醋膜和娃酬导尿 管表面上接枝的AG和肥P聚合物同样成功地抑制生物膜形成。约2皿厚的经交联AG涂层是稳 定的并且在溶菌酶溶液中老化30天后W及还在高压灭菌后保持其抗菌效力。此外，AG涂层 可有效地抵抗非特异性蛋白质吸附、成纤维细胞和血小板黏附。运分别在图8、9和10中举例 说明。在AG涂层中共固定化2.化g/cm2的皿P通过抑制血小板活化、延长PRT和降低溶血程度 进一步改善血液相容性。伴随地，保留AG的抗菌和防污着效力。基于AG之涂层的有利的抗微 生物、防污着和改善的血液相容性特性W及无细胞毒性为W下提供了有前景的机会:对抗 感染和PD导管的网膜包裹W及当使用其他类型之导管时降低CABSI和CAUTI，等。
[0129] 参考文献
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[0152] 表1经聚合物修饰之娃酬膜的水接触角和通过XPS确定的表面组成
[0153]
[0154] a通过敏感度因数校正的XPS C ls、Si 2p、S 2p和N Is芯能级谱面积比计算的[C] :[Si]:[S]:[N]摩尔比。
[01W] b通过丙締酸化AG的UV诱导的固定化和交联制备的AG接枝的娃酬。
[0156] κ通过丙締酸化AG和甲基丙締酸化皿P的UV诱导的固定化和交联制备的AG-皿P接 枝的娃酬。
[0157] d通过甲基丙締酸化肥P的UV诱导的固定化和交联制备的肥P接枝的娃酬。
【主权项】
1. 医用或兽医用装置，所述装置在其表面的至少一部分上包含共价固定化且交联的琼 脂糖涂层。2. 根据权利要求1所述的装置，其中所述涂层在选自包含W下的组的表面上提供:生物 材料、娃酬、聚氨醋和铁。3. 根据权利要求2所述的装置，其中所述表面是医用级表面。4. 根据前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述涂层在所述装置与患者或动物接 触的至少一部分上提供。5. 根据前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述琼脂糖通过引入W下进行修饰： 丙締酸醋、甲基丙締酸醋、（甲基)丙締酷胺、硅烷、硫醇、叠氮化物、烘、乙締基化晚或乙締基 咪挫基团或者运些基团的衍生物。6. 根据权利要求5所述的装置，其中所述衍生物选自包含W下的组:丙締酸酢、甲基丙 締酷氯、N-径乙基（甲基)丙締酷胺、1-2-簇乙基-4-乙締基化晚淮f漠化物和1-径乙基-3-乙 締基咪挫:輪漠化物。7. 根据前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述涂层还包含肝素。8. 根据权利要求7所述的装置，其中所述肝素通过引入W下进行修饰：甲基丙締酸醋、 丙締酸醋、（甲基）丙締酷胺、硅烷、硫醇、叠氮化物、烘、乙締基化晚或乙締基咪挫基团或者 运些基团的衍生物。9. 根据权利要求8所述的装置，其中所述衍生物选自包含W下的组:丙締酸酢、甲基丙 締酷氯、N-?乙基（甲基)丙締酷胺、l-2-簇乙基-4-乙締基化晚^4翁:漠化物和l-?乙基-3-乙 締基咪挫:備:漠化物。10. 根据前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述涂层为1至ΙΟμπι厚。11. 根据权利要求10所述的装置，其中所述涂层的厚度选自包含W下的组：1、2、3、4或5 μηι。12. 根据权利要求11所述的装置，其中所述涂层为约2μπι。13. 根据权利要求7至11中任一项所述的装置，其中所述涂层中肝素的量为1至15yg/ cm2。14. 根据权利要求13所述的装置，其中所述涂层中肝素的量选自包含W下的组：2.0、 2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8或2.化邑/細2。15. 根据权利要求14所述的装置，其中所述涂层中肝素的量为约2.化g/cm2。16. 根据前述权利要求中任一项所述的装置，其中所述装置是导管。17. 根据权利要求16所述的装置，其中所述装置选自包含W下的组:腹膜透析导管、中 央静脉导管和导尿管。18. 用于制造医用或兽医用装置的方法，所述装置在其表面的至少一部分上具有共价 固定化且交联的琼脂糖涂层，所述方法包括： i.使所述装置的表面氧化； ii .将所述经氧化的表面暴露于经修饰的琼脂糖；W及 iii.使所述表面固化。19. 根据权利要求18所述的方法，其中所述琼脂糖通过添加 W下进行修饰:丙締酸醋、 甲基丙締酸醋、（甲基)丙締酷胺、硅烷、硫醇、叠氮化物、烘、乙締基化晚或乙締基咪挫基团、 或者运些基团的衍生物。20. 根据权利要求19所述的方法，其中所述衍生物选自包含W下的组：丙締酸酢、甲基 丙締酷氯、N-径乙基（甲基)丙締酷胺、1-2-簇乙基-4-乙締基化晚,翰漠化物和1-径乙基-3- 乙締基咪挫铺?漠化物。21. 根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中使所述表面氧化包括使所述表面 暴露于利用气体例如氣、氨、氮或氨进行的等离子体处理，随后暴露于空气。22. 根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中使所述表面氧化包括电晕放电处 理或丫照射处理。23. 根据权利要求18至22中任一项所述的方法，其中所述琼脂糖处于水溶液中。24. 根据权利要求23所述的方法，其中所述溶液包含5wt. %的所述琼脂糖。25. 根据权利要求23或34所述的方法，其中将所述溶液滴到或喷洒到所述装置的表面 上。26. 根据权利要求25所述的方法，其中使用旋涂法使所述溶液沉积。27. 根据权利要求23或34所述的方法，其中将所述装置的表面浸入所述溶液中。28. 根据权利要求18至27中任一项所述的方法，其中所述固化在脱气环境中进行。29. 根据权利要求18至28中任一项所述的方法，其中所述固化使用紫外(UV)光或加热 进行。30. 根据权利要求29所述的方法，在其中使用UV来固化所述表面的情况下，将所述表面 暴露于UV持续15至120分钟的时间。31. 根据权利要求18至30中任一项所述的方法，其中还使所述经氧化的表面暴露于经 修饰的肝素。32. 根据权利要求31所述的方法，其中所述肝素通过引入W下进行修饰：甲基丙締酸 醋、丙締酸醋、（甲基)丙締酷胺、硅烷、硫醇、叠氮化物、烘、乙締基化晚或乙締基咪挫基团或 者运些基团的衍生物。33. 根据权利要求32所述的方法，其中所述衍生物选自包含W下的组：丙締酸酢、甲基 丙締酷氯、N-径乙基（甲基)丙締酷胺、1-2-簇乙基-4-乙締基化晚.Ip漠化物和1-径乙基-3- 乙締基咪挫；輪漠化物。34. 根据权利要求32或33所述的方法，其中所述肝素是甲基丙締酸化的。35. 根据权利要求31至34所述的方法，其中所述涂层中肝素的量为1至15yg/cm2。36. 根据权利要求35中任一项所述的方法，其中甲基丙締酸化的肝素的量为约2.化g/ cm^o37. 根据权利要求18至36中任一项所述的方法，其中所述涂层沉积为1至lOwii的厚度。38. 根据权利要求37所述的方法，其中所述涂层为约2μπι。39. 根据权利要求18至38中任一项所述的方法，其中所述装置是导管。40. 根据权利要求39所述的方法，其中所述装置选自包含W下的组:腹膜透析导管、中 央静脉导管和导尿管。41. 导管，所述导管在其表面的至少一部分上具有共价固定化且交联的琼脂糖涂层。42. 导管，所述导管在其表面的至少一部分上具有共价固定化且交联的琼脂糖和肝素 涂层。43. 根据权利要求42所述的导管，其中肝素的量为约2.化g/cm2。44. 本文中所描述的交联的琼脂糖涂层，其用于W共价固定化的方式施加至医用或兽 医用装置表面的至少一部分来防止生物污着、细菌或真菌感染。45. 根据权利要求1至17所述的医用或兽医用装置、根据权利要求18至40所述的方法、 根据权利要求41至43所述的导管或根据权利要求44所述的涂层，其基本上如本文中参照附 图所述。
【专利摘要】本发明涉及包含共价固定化且交联的琼脂糖涂层的医用或兽医用装置、其生产方法和交联的琼脂糖涂层。
【IPC分类】A61L27/34, A61L29/04, A61L31/04, A61L33/08, C08B37/12
【公开号】CN105555806
【申请号】CN201480035487
【发明人】李敏, 梁君仪, 提多伟良·刘, 钟俞明, 康燕堂
【申请人】新加坡国立大学
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2014年6月16日
【公告号】EP3010942A1, US20160193389, WO2014204402A1
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