植物糖原纳米颗粒及其制造方法
植物糖原纳米颗粒及其制造方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的引证
[0002] 本申请要求2013年4月26日提交的美国专利申请61/816686的优先权，并且其内容 由此W其整体并入。
技术领域
[0003] 本发明设及植物糖原(phytoglycogen)纳米颗粒W及生产植物糖原纳米颗粒的方 法。
【背景技术】
[0004] 植物糖原和糖原是由1,4-葡聚糖链组成的葡萄糖多糖，其通过α-1,6-葡萄糖巧键 高度支化，其在植物动物细胞中发挥储能介质的作用。糖原W直径为20-200nm的致密颗粒 的形式存在于动物组织中。糖原也发现积累在微生物中，例如细菌和酵母菌。植物糖原是一 种在结构和物理性质上与糖原相似的多糖，并且起源于植物。
[0005] 糖原和植物糖原被认为是"高度分散的"或非均质材料。对于已知的制剂，糖原典 型地具有处于1〇6和1〇8道尔顿之间的分子量，具有相应的大的多分散性。动物和植物组织W 及提取的糖原/植物糖原制剂的透射电子显微镜(TEM)观察已经掲示了运些多糖的微粒性 质。常报道的糖原或植物糖原的颗粒直径处于20-300nm的范围内并且具有连续或多峰 (multimodal)尺寸分布。20-30nm的小颗粒被称为β-颗粒，而100-300nm的大颗粒被称为α- 颗粒。认为，α-颗粒是由β-颗粒聚集(aggregation)或群聚（clustering)组成的[1]。
[0006] 已经开发了各种方法从活有机体中分离糖原和植物糖原，最常见的是为了量化生 物样品中积累的总糖原的量，并且偶尔为了将糖原在应用中用作产品。
[0007] 最常用的方法是从动物组织、特别是从海洋动物、尤其是软体动物提取，因为它们 有能力积聚糖原。例如，美国专利5,734,045公开了通过使用热碱提取、随后使用阳离子树 脂中和并处理所产生的溶液从蛛类制备不含蛋白质的糖原的方法。例如，在专利申请W0/ 1997/021828所描述的，糖原也可W通过酵母菌发酵来生产。美国专利7，670,812描述了一 种通过使酶的混合物与低分子量糊精接触生物合成生产糖原样多糖的方法。甜玉米和香稻 可作为糖原的来源;参见例如专利申请EP0860448B1，其描述了从香稻粒分离糖原的方法。 [000引糖原/植物糖原分离的主要步骤通常包括:通过粉碎/研磨/娠磨等破碎生物质;将 糖原提取到水相中；通过过滤和/或离屯、分离不溶性固体颗粒；消除微细分散或溶解的脂 质、蛋白质和低分子量污染物;和浓缩并干燥。
[0009] 为了提高第二提取步骤中糖原的收率，通常在提高的溫度下和/或使用碱性溶液 或酸性溶液进行提取。此种工艺包括使用热的浓(20-40 % )碱溶液[2，3 ]、冷酸[4]或沸水 [引对研细的生物材料进行初始处理。
[0010] 在糖原分离/纯化的常规方法中使用的工序导致糖原结构的大量水解、低分子量 产物的显著增加和分子的化学改变。
[0011] 已经开发了各种较溫和的提取工序，诸如冷水提取[6]，并且得到的产物据称接近 天然状态的糖原的表现度。但是，已知由冷水提取法生产的糖原制剂是高度多分散的[7， 1]〇
[0012] 已知有多种方法用于进行从精细分散的蛋白质、脂质、核酸和其他多糖中纯化粗 制糖原提取物的步骤。可W通过使用脱氧胆酸盐(D0C)、S氯乙酸(TCA)、多价阳离子和/或 酶处理(蛋白酶、核酸酶）的选择性沉淀来除去蛋白质和核酸。还已经使用通过将蛋白质盐 析出来(例如使用硫酸锭)或通过离子交换W去除蛋白质的方法。蛋白质去除的另一种常用 方法是热凝固，通常在65-100°C，随后离屯、或过滤。高压灭菌法（121°C，latm)也已经被用来 凝固蛋植物糖原提取物中的蛋白质[引。另外，可W使用酪水提取法除去蛋白质和脂质。
[0013] 国际专利申请公开号W0 2013/019977(化0)教导了一种获得包括植物糖原的提取 物的方法，其包括超滤，但是也使水性提取物经受酶处理，运同时降解了植物糖原及其他多 糖。Yao提取了一种降低植物糖原粘度的方法，其通过使植物糖原经受β-淀粉分解，即使用 β-淀粉酶进行酶促水解。通过化0的方法产出的"经纯化的植物糖原"不仅包括植物糖原，而 且包括植物原的衍生物，衍生物包括β-糊精和其他多糖的消化产物。化0的方法进一步包括 将提取物加热至l〇〇°C (参见化〇的实施例1)。
[0014] 美国专利5,895,686公开了一种用于通过水或含水溶液(在室溫下)从水稻提取植 物糖原的方法，并且通过热变性和TCA沉淀除去蛋白质。产物具有多峰分子量分布，相应地 具有高多分散性和大水溶液粘度。运些性质可归因于来自植物材料的糖原制剂中大量支链 淀粉和直链淀粉的存在，还归因于糖原提取过程中糖原的降解。
[0015] 美国专利5，597，913和5，734，045描述了产生基本不含含氮化合物和还原糖的糖 原的工序，指示了其不含蛋白质和核酸的纯度。运些专利教导了选定组织在高pH溶液中沸 腾的使用。
[0016] 转让给本发明的拥有人的美国专利申请公开号US20100272639 A1提供了一种用 于从细菌和贝类生物质中分离糖原的方法。细菌被教导为是优选的，因为可W进行方法W 获得不具有其他大分子量多糖(诸如支链淀粉和直链淀粉)并且不含与贝类或动物组织有 关的致病细菌、寄生虫、病毒和航病毒的生物质。所公开的方法大体包括步骤:通过法式按 压（French pressing)或通过化学处理进行细胞瓦解（disintegration);通过离屯、分离不 溶性细胞组分;通过酶处理、随后渗析从细胞裂解物中除去蛋白质和核酸，其产生含有粗制 多糖和脂多糖(LPS)的提取物或，可替代地，酪-水提取;通过弱酸水解或通过多价阳离子的 盐的处理(其引起不溶性LPS产物的沉淀)消除LPS;和通过超滤和/或尺寸排阻色谱法纯化 富集了糖原的级分;和使用适合的有机溶剂沉淀糖原或可W通过超滤或超速离屯、法获得浓 缩的糖原溶液;和冷冻干燥W产生糖原的粉末。从细菌生物质分离出的糖原的特点是MWt 5.3-12.7x 106Da，具有直径为35-40nm的颗粒尺寸并且是单分散性的(PDI =Mn/Mw= 1.007- 1.03)。
【发明内容】
[0017] 在一个实施方式中，描述了一种从含有植物糖原的植物材料中获得植物糖原纳米 颗粒的组合物，通过动态光散射(DLS)测定，该植物糖原纳米颗粒具有小于0.3的多分散指 数。在一个实施方式中，通过化S测量，植物糖原纳米颗粒具有小于0.2的多分散指数。在一 个实施方式中，通过化S测量，植物糖原纳米颗粒具有小于0.1的多分散指数。
[001引在一个实施方式中，植物糖原纳米颗粒具有约30nm至约150nm之间的平均颗粒直 径。在一个实施方式中，植物糖原纳米颗粒具有约60nm至llOnm之间的平均颗粒直径。
[0019] 在一个实施方式中，组合物基于干重包括多于80%的植物糖原纳米颗粒，该植物 糖原纳米颗粒具有约30nm至150nm之间的平均颗粒直径。在一个实施方式中，组合物基于干 重包括多于90 %的植物糖原纳米颗粒，该植物糖原纳米颗粒具有约30nm至15化m之间的平 均颗粒直径。在一个实施方式中，组合物基于干重包括多于99 %的植物糖原纳米颗粒，该植 物糖原纳米颗粒具有约30nm至150nm之间的平均颗粒直径。在一个实施方式中，组合物基于 干重包括多于80 %的植物糖原纳米颗粒，该植物糖原纳米颗粒具有约60nm至llOnm之间的 平均颗粒直径。在一个实施方式中，组合物基于干重包括多于90%的植物糖原纳米颗粒，该 植物糖原纳米颗粒具有约60nm至llOnm之间的平均颗粒直径。在一个实施方式中，组合物基 于干重包括多于99 %的植物糖原纳米颗粒，该植物糖原纳米颗粒具有约60nm至llOnm之间 的平均颗粒直径。
[0020] 在一个实施方式中，含有植物糖原的植物材料获自玉米、水稻、大麦、高梁或它们 的组合。在一个实施方式中，含有植物糖原的植物材料是标准型（SU)或含糖增量剂 (surgary extender,se)型甜玉米。在一个实施方式中，含有植物糖原的植物材料获自乳熟 期或凹陷期玉米粒。
[0021] 在一个实施方式中，组合物是粉末。在另一个实施方式中，组合物是植物糖原纳米 颗粒的含水分散体。
[0022] 本文还描述了一种生产单分散性植物糖原纳米颗粒的方法，包括:a.将破碎的含 有植物糖原的植物材料沉浸在约0和约50°C之间的水中；b.使步骤(a.)的产物经受固液分 离W获得含水提取物;C.使步骤(b.)的含水提取物通过具有约0.05和0.15WI1之间的最大平 均孔径的微滤材料;和d.使来自步骤C.的滤出液经受超滤W除去具有低于约300W)a的分子 量的杂质，从而获得包含单分散性植物糖原纳米颗粒的含水组合物。
[0023] 在方法的一个实施方式中，含有植物糖原的植物材料是谷物。在一个实施方式中， 谷物是玉米、水稻、大麦、高梁或它们的混合物。在一个实施方式中，含有植物糖原的植物材 料是标准型（SU)或含糖增量剂（se)型甜玉米。在一个实施方式中，含有植物糖原的植物材 料是标准型(SU)或含糖增量剂(se)型甜玉米的乳熟期或凹陷期巧粒。
[0024] 在一个实施方式中，方法包括步骤(e.)使包含单分散性植物糖原纳米颗粒的含水 组合物经受使用淀粉薦糖酶、糖基转移酶、支化酶或它们的任何组合的酶处理。
[0025] 在一个实施方式中，方法包括步骤(e.l)干燥包含单分散性植物糖原纳米颗粒的 含水组合物，W获得基本上为单分散性植物糖原纳米颗粒的干燥的组合物。
[0026] 在一个实施方式中，方法包括在步骤C或步骤d之前添加吸附性过滤助剂。在一个 实施方式中，吸附性过滤助剂是娃藻±。 [0027] 在一个实施方式中，固液分离步骤包括将步骤(a.)的产物揽拌10至30分钟的时间 段。
[00%]在方法的一个实施方式中，步骤(d.)的超滤除去分子量低于500W)a的杂质。
[0029]在一个实施方式中，步骤C.包括使步骤(b.)的含水提取物通过W下（c.l)、（c.2) 和(C. 3): (C.1)具有约10皿至约40皿之间的最大平均孔径的第一微滤材料；（C. 2)具有约 0.5μπι至约2.0皿之间的最大平均孔径的第二微滤材料;和(C. 3)具有约0.05至0.15皿之间 的最大平均孔径的第Ξ微滤材料。
[0030] 在一个实施方式中，方法进一步包含将步骤b.的产物离屯、。
[0031] 本文中还描述了根据所描述的方法产生的基本上是单分散性的纳米颗粒的组合 物。
[0032] 在一个实施方式中，本文所描述的组合物被用作成膜剂。在一个实施方式中，本文 所描述的组合物被用作药物递送剂。
【附图说明】
[0033] 图1是植物糖原纳米颗粒的示意图。
[0034] 图2示出了使用化S测量的根据实施例1分离的植物糖原的颗粒尺寸分度。
[0035] 图3示出了使用化S测量的根据实施例2分离的植物糖原的颗粒尺寸分布。
[0036] 图4示出了对于根据本发明一个实施方式的单分散性植物糖原纳米颗粒的水分散 体的粘度对浓度(w/w%)。
【具体实施方式】
[0037] 本文中使用的"植物抗原"是指从植物材料获得的a-D葡萄糖链的纳米颗粒，该a-D 葡萄糖链具有11至12的平均链长、具有1^4键并且在1^6处发生支化点并且具有约6%至 约13 %的支化度。
[0038] 在一个实施方式中，提供了一种高分子量葡萄糖均聚物的单分散性纳米颗粒的组 合物。在一个实施方式中，提供了一种单分散性植物糖原纳米颗粒的组合物。
[0039] 通过动态光散射(DLS)技术确定的多分散指数(PDI)，被定义为标准偏差与平均直 径的比率的平方:PDI = (〇/d)2。另外，可W通过聚合物的分子量分布来表示PDI，并且定义 为Mw与Μη的比率，其中Mw是重量平均摩尔质量并且Μη为数量平均摩尔质量(运种PDI量度在 下文中被称为PDI*)。在第一种情况下，单分散性材料具有接近0的PDK0.0)并且在第二种 情况下一1.0。在一个实施方式中，提供了一种植物糖原纳米颗粒的组合物，通过化S测量， 该植物糖原纳米颗粒具有小于约0.3、小于约0.2、小于约0.15、小于约0.10、小于0.07或小 于0.05的PDI。在一个实施方式中，提供了一种植物糖原纳米颗粒的组合物，通过SEC MALS 测量，该植物糖原纳米颗粒具有小于约1.3、小于约1.2、小于约1.15、小于约1.10或小于 1.05 的 PDI*。
[0040] 由于许多原因，单分散性是有利的，包括如果组合物的纳米颗粒是单分散性的，那 么表面改性和衍生的发生更具可预测性。尺寸也影响纳米颗粒在生物组织中的分布和累积 W及药代动力学。另外，窄尺寸分布对于诸如诊断探针、催化剂、纳米薄膜和受控流变等应 用是至关重要的。
[0041] 可W通过本领域众所周知的方法来测评纳米颗粒尺寸，包括直径的分布(分散性） 和平均值。运些方法主要包括化S和显微技术，例如TEM和原子力显微镜。
[0042] 在一个实施方式中，提供了一种植物糖原纳米颗粒的单分散性组合物，该植物糖 原纳米颗粒具有约30至约150nm之间的平均颗粒直径，在一个实施方式中为约60nm至约 llOnm之间。与在现有组合物中看到的聚集的α-颗粒相反，运些纳米颗粒是单个颗粒。
[0043] 在一个实施方式中，植物糖原纳米颗粒产自谷物。在一个实施方式中，植物糖原产 自玉米、水稻、大麦、高梁或它们的混合物。
[0044] 所使用的品种必须是含有植物糖原的。可W容易地由本领域技术人员使用公知技 术进行确定品种是否含有植物糖原。此外，对于许多品种，公开的文献确定了品种是否含有 植物糖原。
[0045] 在一个实施方式中，组合物获自甜玉米（玉米(Zea mays)变种saccharata和玉米 (Zea mays)变种rugosa)。在一个实施方式中，甜玉米是标准型(SU)或含糖增强(se)型。
[0046] 在一个实施方式中，组合物获自甜玉米的凹陷期或乳熟期巧粒。
[0047] 在一个实施方式中，植物糖原纳米颗粒的单分散性组合物基本上是纯的。在一个 实施方式中，组合物基于干重由至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%的具有 约30nm至约15化m之间的直径尺寸的植物糖原纳米颗粒组成。在另一个实施方式中，组合物 基于干重由至少约99%的具有约30nm至约150nm之间的直径尺寸的植物糖原纳米颗粒组 成。在一个实施方式中，组合物基于干重由至少约80 %、至少约85 %、至少约90 %、至少约 95%的具有约60nm至约IWnm之间的直径尺寸的植物糖原纳米颗粒组成。在另一个实施方 式中，组合物基于干重由至少约99%的具有约60nm至约11化m之间的直径尺寸的植物糖原 纳米颗粒组成。
[0048] 在一个实施方式中，组合物基本上不含其他多糖。在一个实施方式中，组合物含有 少于约10%的其他多糖。在一个实施方式中，组合物含有少于约5%的其他多糖。在一个实 施方式中，组合物含有少于约1 %的其他多糖。
[0049] 糖原
[0050] 糖原和植物糖原由通过α-1^4-葡萄糖巧键连接的葡萄糖残基的直链组成，其中 侧链通过α-1^6-葡萄糖巧键附接。来自不同来源的哺乳动物糖原的化学分析显示其平均 链长度为~13个残基[9]。如图1所示，糖原结构的接受的模型具有内链和外链，内链通常含 有两个支化点，外链是未支化的。整个树形聚合物根植于蛋白质糖原蛋白（G)的单分子。 [0051 ]糖原分子的密度随着层的数目呈指数增加。经计算，向糖原分子添加的第13层不 能增加糖原残基的密度，使得12层为理论最大[9]。一个重要的特征是，W运种方式完全形 成的任何分子的最外层会含有该分子的总葡萄糖残基的~45-50%作为未支化的Α-链，而 首先的八个内层仅含有总葡萄糖的~5%。因此，运种模型中的全尺寸糖原分子会由12层组 成，总共~53000个葡萄糖残基，分子质量为~10化化且直径为~25皿。虽然主要由葡萄糖 残基组成，糖原可W含有其他痕量组分，尤其是葡糖胺和憐酸醋[1]。数学建模显示，糖原分 子的结构性质取决于Ξ个参数，即，支化度(r)、层数(t)和每个链中的葡萄糖残基的数目 (gc)[9、10、ll、12、13]。
[0052] 虽然由生长机理显示了糖原分子为球形，但是当分子生长超出一定的限制时，其 会失去结构的同质性，因为支化度和链长度在最终层中退化(degenerate)。
[0053] 植物糖原
[0054] 尽管糖原和植物糖原具有非常类似的结构，但是在运些多糖的功能目的上存在主 要差异。糖原在动物和细菌中旨在用作短期"燃料"储备W优化快速周转。
[0055] 在植物中，主要能量来源是淀粉，其存储在树叶、茎、种子、根等中。与糖原相反，淀 粉是一种长期的能源策略，其允许植物在恶劣的气候环境中生存。淀粉包含两种类型的多 聚葡糖:支链淀粉(其是高度支化的）和直链淀粉(其几乎是直链的，几乎没有分支）。在来自 不同来源的淀粉中，两种组分的含量存在较大的变化，但是通常认为，支链淀粉是储存淀粉 中的主要组分并且占据约65-85重量％。
[0056] 支链淀粉具有由串联式集群(各自长度为约9-lOnm)组成的确定结构，其中直链α- 1,4-葡聚糖链是通过α-1，6-葡萄糖巧键高度规律支化的。由支链淀粉支链形成的半结晶结 构是生物和经济重要的，因为运种结构允许植物高密度地储存碳(~1.6g cm-3) [ 14]。
[0057] 支链淀粉是由四类酶的多个同种型合成的：可溶性淀粉合成酶(SS)、淀粉支化酶 (BEKADP葡萄糖焦憐酸化酶和淀粉脱支酶(DBE)。存在相同的4类设及糖原合成的酶。
[005引运解释了支链淀粉和糖原结构之间的类似性:均为α-1,6-支化的α-1,4-聚葡糖。 然而，支链淀粉中的平均链长(g。)为20-25,约为糖原的两倍，而支化度(r)低约1.5-2倍。
[0059] 异淀粉酶（ISA)中的突变W及由此的脱支化活性的缺陷，导致支链淀粉被植物糖 原的部分替代。在植物中积累的此种植物糖原的最常见实例是玉米、水稻和其他谷物的含 糖l(su)突变体。
[0060] 植物糖原在结构上类似于糖原，具有11-12的平均链长度和类似的支化度，并且典 型地具有1〇6-1〇8化的分子量。但是，所报道的比糖原更大的颗粒尺寸暗示着更低的支化度 和/或更低的结构均一性。鉴于糖原是高度优化的代谢产物，而植物糖原是支链淀粉合成中 排列素乱的结果，所W植物糖原的较低结构均一性是不可预期的。
[0061] 本发明人们已经实验确定，所报道的植物糖原组合物的多分散性事实上部分地由 破坏性分离方法所致，并且所观察到的多分散性可进一步起因于精细分散的污染物诸如蛋 白质、脂质和其他多糖的存在。使用本文所描述的方法，本发明人们已经产生了植物糖原的 单分散性组合物。
[0062] 生产单分散性植物糖原的方法
[0063] 如上所讨论的，糖原/植物糖原分离的主要步骤典型地包括:1.通过粉碎/研磨/娠 磨等破碎生物质；2.将糖原提取到水相中；3.通过过滤和/或离屯、分离不溶性固体颗粒（固 体）；4.消除微细分散或溶解的脂质、蛋白质和低分子量污染物;和5.浓缩并干燥。一些操作 可W被合并，例如娠磨和提取。
[0064] 在一个实施方式中，一种生产单分散性植物糖原纳米颗粒的方法包括：[0065] a.在约0和约50°C之间的溫度下，将破碎的植物材料浸泡在水中；在一个实施方式 中，在约4°C和约20°C之间的溫度下；
[0066] b.使步骤(a.)的产物经受固液分离W获得含水提取物；
[0067] C.适合地在多级过滤过程中过滤步骤(b.)的含水提取物，但是至少穿过具有约 0. Ιμπι的最大平均孔径的微滤材料；
[0068] d.使来自步骤C.的滤出液经受超滤W除去分子量低于约300kDa(在一个实施方式 中，低于约400kDa;在一个实施方式中，低于约500kDa)的杂质，W获得包含单分散性植物糖 原纳米颗粒的组合物。
[0069] 在一个实施方式中，方法进一步包括离屯、步骤b的产物。
[0070] 然后可W干燥含水组合物W得到基本上为单分散性植物糖原纳米颗粒的组合物。 [0071 ]在一个实施方式中，植物材料是谷物。在一个实施方式中，植物材料是玉米、水稻、 大麦、高梁或它们的混合物。在一个实施方式中，植物材料是甜玉米(玉米变种saccharata 和玉米变种rugosa)的巧粒。在一个实施方式中，使用甜玉米的乳熟期或凹陷期的成熟巧 粒。
[0072] 在各个实施方式中，植物糖原的收率为植物材料干重的约5%和50%之间、约10% 和约50%之间、约20%和50%之间、约30%和约50%之间、约40%和约50%之间、约10%和 约40 %之间、约20 %和40 %之间、约30 %和约40 %之间。植物糖原的准确产率将取决于所使 用的植物材料，包括品种和成熟期。W玉米为例，对于乳熟期巧粒成熟期，发明人们已经获 得在巧粒干重的35-40%的范围内的收率，而对于凹陷成熟期获得了20-30%的收率。考虑 到先前报道的植物糖原的高多分散性，单分散性植物糖原的运些收率是出乎预料的。
[0073] 制备破碎植物材料的方法对于本领域技术人员是众所周知的。生物质破碎的方法 包括研磨、娠磨或粉碎生物材料。植物材料被适合地破碎成小于约0.5mm的平均颗粒尺寸。
[0074] 在一个实施方式中，通过适度揽拌10-30分钟进行冷水提取。在一个实施方式中， 冷水提取是在约〇°C和约50°C之间的溫度下进行的。在一个实施方式中，在约4°C和约20°C 之间的溫度下进行冷水提取。揽拌的最佳周期、溫度和揽拌速率取决于破碎的生物质的性 质，并且对它们的确定处于本领域技术人员的技能范围内。
[0075] 将由冷水提取产生的含水提取物离屯、W分离出粗制非可溶性固体。适合地，可选 地在约3,000至约6,OOOx g下离屯、提取物。适合地，通过在约6,000至约12,OOOx g下进行进 一步离屯、，运从粗制植物糖原提取物中部分地分离出精细分散的蛋白质和脂质。
[0076] 离屯、之后是过滤上清液。如本文所描述的，进行多级过滤和超滤，已经惊人地发现 运除去了大部分的蛋白质、脂质和污染性多糖(包括直链淀粉和支链淀粉），而不需要任何 的化学处理、酶处理或热处理，由此产生单分散性植物糖原纳米颗粒的组合物。适合地在使 用Ο.?μπι最终介质孔径的阶段中进行微滤。在一个实施方式中，微滤依次使用如下介质孔径 进行:a)在一个实施方式中，约5μπι和约50μπι之间，在一个实施方式中，约ΙΟμπι和约40μπι之 间，在一个实施方式中，约15μπ?和约35μπ?之间，在一个实施方式中，约20μπ?和约30μπ?之间，并 且在一个实施方式中，约25ym;b)在一个实施方式中，约0.5WI1和约2. Ομπι之间，在一个实施 方式中，约1.Ομπι;和C)在一个实施方式中，约0.05μπι和约0.15μπι之间，在一个实施方式中， 0. Ιμπι。在一个实施方式中，在离屯、之前，可W向植物抗原提取物中加入吸附性过滤助剂诸 如娃藻±。在一个实施方式中，W约2-10%wt/体积的量使用吸附性过滤助剂，在一个实施 方式中，约3-5 % wt/体积之间。
[0077] 使来自微滤的最终滤出液经受超滤，其从中去除低分子量污染物包括盐、蛋白质 和糖(例如糊精、葡萄糖、薦糖或麦芽糖）。超滤可W使用具有约300至约500W)a的分子量截 止(MWC0)的交叉流过滤(CF巧来进行。
[0078] 微滤和超滤的各种方法均为本领域技术人员众所周知并且可W采用任何适合的 方法。
[0079] 可选地，在超滤之后，可W使含有植物糖原的含水分散体经受酶处理W降低多分 散性。适合地，其可W使用淀粉薦糖酶、糖原合成酶、糖基转移酶和支化酶或它们的任何组 合进行处理。但是，应当避免消化支链淀粉和直链淀粉(例如，β-淀粉酶）的酶，因为它们会 产生各种降解的聚葡糖的溶液，而非植物糖原纳米颗粒的纯化组合物。
[0080] 可W通过CFF超滤工艺浓缩植物糖原分散体(最高达30% )。可替代地，在CFF超滤 之后，可W使用适合的有机溶剂诸如丙酬、甲醇、丙醇等(优选乙醇)沉淀植物糖原。方法进 一步包括适合地通过喷雾干燥或冷冻干燥来干燥植物糖原提取物。各种标准浓缩和/或干 燥方法诸如使用降膜蒸发器、升膜蒸发器、喷雾干燥、冷冻干燥、滚筒干燥或它们的组合等 来脱水植物糖原分散体和/或收集固体形式的植物糖原产物。
[0081] 如实施例中示出的，取决于所使用的起始植物材料，所得到的植物糖原的材料的 特征在于30nm和150nm之间的颗粒直径，连同通过化S现慢的低至0.07的多分散指数。
[0082] 确保高纯度材料及其单分散性的关键在于精细微滤和超滤的组合。
[0083] 纳米颗粒的化学官能化
[0084] 本发明的实施方式包括具有化学官能化表面的纳米颗粒和分子和/或与各种各样 的分子结合的纳米颗粒。化学官能化在合成领域中是众所周知的。参见例如March, Advanced (Organic Chemistry,第六版,Wiley,2007。官能化可W在颗粒的表面进行或同时 在颗粒的表面和内部进行，但是将糖原分子的结构维持为如上的单支化均聚物。
[0085] 此类官能化的表面基团包括但不限于亲核基团与亲电基团、酸性基团和碱性基 团，包括例如幾基、胺基、硫醇基、簇基或其他酸性基团。氨基可W是伯、仲、叔或季氨基。可 W使用不饱和基团诸如乙締基和締丙基官能化本文所描述的纳米颗粒。
[0086] 所分离和纯化的纳米颗粒可W被直接或间接官能化，在间接官能化中可W使用一 个或多个中间接头或间隔子。纳米颗粒可W经受一个或多于一个官能化步骤，包括两个或 更多个、Ξ个或更多个或四个或更多个官能化步骤。
[0087] 官能化的纳米颗粒可W进一步与各种的分子结合，分子在各种应用中是感兴趣 的，诸如生物分子、小分子、治疗剂、微粒和纳米颗粒、药物活性部分、大分子、诊断标签、馨 合剂、分散剂、电荷改性剂、粘度改性剂、表面活性剂、凝聚剂和絮凝剂，W及运些化合物的 各种组合。
[0088] 可W使用用于多糖官能化或衍生化的已知方法。例如，一种方法是通过选择性氧 化C-2、C-3、C-4和/或C-6位的葡萄糖径基来导入幾基。存在有广泛的可使用的氧化剂，诸如 高舰酸盐(例如高舰酸钟）、漠、二甲基亚讽/乙酸酢(DMS0/AC20)[例如，美国专利号4,683， 298]、戴斯-马下高舰烧(Dess-Ma;rtin periodinane)等。
[0089] 本文所描述的纳米颗粒在用幾基官能化时可容易地与携带有伯胺基或仲胺基的 化合物反应。运导致形成亚胺，其可W使用还原剂例如棚氨化钢被进一步还原为胺。因此， 还原步骤提供比亚胺中间体更稳定的氨基产物，并且还将未反应的幾基转化为径基。幾基 的消除显著地降低了衍生的纳米颗粒与非祀分子(例如血浆蛋白）的非特异性相互作用的 可能性。
[0090] 可W在一个容器中同时进行幾基化合物和氨基化合物之间的反应W及还原步骤 (向相同反应混合物中导入适合的还原剂）。运种反应被称为直接还原胺化反应。此处，可W 使用在幾基的存在下选择性还原亚胺的任何还原剂，例如氯基棚氨化钢。
[0091] 为了从幾基官能化的纳米颗粒制备氨基官能化的纳米颗粒，可W使用任何锭盐或 含伯胺或仲胺的化合物，例如乙酸锭、氯化锭、阱、乙二胺或己二胺。运种反应可W在水中或 在含水极性有机溶剂例如乙醇、DMS0或二甲基甲酯胺中进行。
[0092] 还可W通过使用下列两步法来实现本文所描述的纳米颗粒的还原胺化。该第一步 是締丙基化，即通过在还原剂例如棚氨化钢的存在下与締丙基面反应将径基转化为締丙 基。在第二步骤中，使締丙基与双官能氨基硫醇化合物例如氨基乙硫醇反应。
[0093] 可W进一步修饰氨基官能化的纳米颗粒。例如，氨基与幾基化合物(醒和酬）、簇酸 及其衍生物(例如酷氯、醋）、班巧酷亚胺醋、异硫氯酸醋、横酷氯化物等反应。
[0094] 在某些实施方式中，使用氯基化过程将本文的纳米颗粒官能化。运种过程导致在 多糖径基上形成氯酸醋和亚氨基碳酸醋。运些基团在非常溫和的条件下可W与伯胺容易地 反应，形成共价键。氯化剂诸如漠化氯并且优选1-氯基-4-二乙基氨基-化晚盐(CDAP)可W 被用于纳米颗粒的官能化。
[0095] 官能化的纳米颗粒可W被直接附接至携带有能够结合幾基或氨基的官能团的化 合物。但是，对于一些应用，通过间隔子或接头(包括例如聚合物间隔子或接头)来附接化合 物可能是重要的。运些可W是携带有官能团（包括但不限于氨基、幾基、琉基、班巧酷亚胺 基、马来酷亚胺基和异氯酸醋）的同双官能接头或异双官能接头，例如二氨基己烧、糖双(横 基班巧酷亚胺基班巧酸）乙二醋(横基-EGS)、二横基班巧酷亚氨基酒石酸醋(横基-DST)、二 硫代双(横基班巧酷亚胺基丙酸醋KDTSSP)、氨基乙硫醇等。
[0096] 用于纳米颗粒/结合的化合物和改性剂
[0097] 在某些实施方式中，可W被用来修饰 本文所描述的纳米颗粒的化合物包括但不限 于:生物分子、小分子、治疗剂、微粒和纳米颗粒、药物活性部分、大分子、诊断标签、馨合剂、 分散剂、电荷改性剂、粘度改性剂、表面活性剂、凝聚剂和絮凝剂、W及运些化合物的各种组 厶 1=1 〇
[0098] 在某些实施方式中，作为用于修饰本文所描述的纳米颗粒的化合物的生物分子包 括但不限于酶、受体、神经递质、激素、细胞因子、细胞应答的化合物(诸如生长因子和趋化 因子）、抗体、疫苗、半抗原、毒素、干扰素、核酶、反义剂和核酸。
[0099] 在某些实施方式中，本文所描述的纳米颗粒的小分子改性剂可W是可用作催化剂 的那些，并且包括但不限于金属有机络合物。
[0100] 在某些实施方式中，作为纳米颗粒的改性剂的药用部分包括但不限于疏水性改性 剂、药代动力学改性剂、生物活性改性剂和可检测的改性剂。
[0101] 在某些实施方式中，可W使用具有光吸收、光发射、巧光、发光、拉曼散射、巧光共 振能量转移和电致发光特性的化合物来修饰纳米颗粒。
[0102] 在某些实施方式中，纳米颗粒的诊断标签包括但不限于用于丫闪烁和正电子发射 断层扫描(PET)的诊断放射性药物或放射性同位素，用于磁共振成像(MRI)的造影剂(例如 顺磁性原子和超顺磁性纳米晶体），计算机断层扫描用造影剂，X射线成像用造影剂，超声诊 断方法用造影剂，中子活化剂，W及W各种光学程序中可W反射、散射或影响X光、超声波、 无线电波和微波、巧光的其他部分等。诊断用放射性药物包括γ -发射放射性核素，例如铜- 111、得-99m、舰-131等。MRI (磁共振成像）用造影剂包括磁性化合物，例如顺磁性离子、铁、 儘、礼、铜系元素、有机顺磁性部分和超顺磁性、铁磁性和反铁磁性化合物，例如氧化铁胶 体、铁素体胶体等。计算机断层扫描及其他X射线基成像方法用造影剂包括吸收X射线的化 合物，例如舰、领等。基于超声的方法用造影剂包括吸收、反射和散射超声波的化合物，例如 乳液、晶体、气泡等。其他实例包括用于中子活化的物质，诸如棚和礼。进一步的，可W采用 的标签能够反射、折射、散射或W其他方式影响X射线、超声波、无线电波、微波和在诊断程 序中有用的其他射线。在某些实施方式中，改性剂包括顺磁性离子或基团。
[0103] 在某些实施方式中，可W使用两种或更多种不同的化合物来生产多官能衍生物。 例如，第一化合物选自潜在特异性结合生物分子的列表，诸如抗休和核酸适体，并且第二化 合物选自潜在诊断标签的列表。
[0104] 在某些实施方式中，使用本领域一般公知的方法(参见，例如，化nobiotechnology II,Eds Mirkin and化6111巧61',胖;[1巧-￥邸,2007.)，本文所描述的纳米颗粒可^被用作制 造无机纳米材料的模板。运可W包括用带电荷的官能团官能化纳米颗粒，随后矿化，运可包 括在各种阳离子例如金属、半导体的溶液中溫育官能化的纳米颗粒。然后可W将本文所描 述的矿化的纳米颗粒纯化并且用于各种应用中，应用包括但不限于医学诊断、传感器、光 学、电子等。
[010引组合物
[0106] 在一个实施方式中，纳米颗粒组合物为如在超滤步骤后获得的含水提取物的形 式。
[0107] 在一个实施方式中，纳米颗粒组合物是干燥的并且该组合物是粉末。
[0108] 本发明的干燥纳米颗粒组合物容易地可溶于/可分散于水、甘油中W及一些有机 溶剂诸如二甲基亚讽(DMS0)或二甲基甲酯胺DMF中。在一个实施方式中，组合物包含分散于 水或溶剂中的干燥纳米颗粒。与先前的糖原组合物相比，单分散性纳米颗粒组合物具有独 特的流变性质。本发明的纳米颗粒组合物的含水分散体在最高达按重量计25%的浓度下未 显示出显著的粘度。与此相比，Yao(W0 2013/019977)的"纯植物糖原"在15.2w/w下显示出 3.645pas 的粘度（3645 ± 315mPas)。
[0109] 在一个实施方式中，组合物的在室溫下的为从制造日期起保持至少24个月货架稳 定。
[0110] 工业适用性
[0111] 本文所公开的单分散性植物糖原纳米颗粒的组合物可W被用在广泛的食品、个人 护理、工业和医学应用中。例如，组合物可W被用作控制流变性、保水性和表面特性的添加 剂。应用的实例包括:成膜、碳水化合物的低血糖指数来源、纹理增强剂、皮肤填充剂、维生 素和其他光敏生物活性化合物的稳定剂、体质颜料(pigment extender)、医学润滑剂和赋 形剂、药物递送剂。本发明的组合物还可W被用来提高防晒配方的UV保护并且提高生物活 性物质和其他对光不稳定的化合物(如防晒霜、维生素和药物）的光稳定性。在由同一申请 人与本申请同时提交的标题为"多官能糖原和植物糖原添加剂(polyfunctional glycogen and地ytoglycogen additives)"的国际专利申请中详细的说明了各种应用，并且其内容 通过引用W其整体并入本文。
[0112] 本文所公开的单分散性植物糖原纳米颗粒作为成膜剂是特别有用的。因为纳米颗 粒可能是单分散的、均匀密堆积膜。组合物形成具有低水活度(water activity)的稳定膜。 水活度表征了材料可W结合水的程度W及水分子可W在材料中迁移的程度。水活度在需要 在产品的物理强度和产品的口味之间寻求平衡的食品工业中是重要的，产品物理强度随其 干燥而提高，而产品口味经常随含水量的提高而增加。水活度的控制在含有多种结构不同 组分的食品产品中尤其重要，例如松饼的主体和在松饼顶部的糖霜涂层。本发明的组合物 可W被用作食品产品的不同组分之间的隔离膜。例如，如果食品产品相对干燥，在将另一组 分与第一种组分接触之前，将本发明的单分散性植物糖原纳米颗粒的浓缩含水溶液喷散在 食品产品第一组分的表面上，并且使其干燥。对于食品产品已经含有大量水分的情况，可W 将植物糖原纳米颗粒的细粉洒在第一食品组分的表面上直至形成了连续膜，之后使其接触 第二组分。组合物形成隔离膜并且本质上减少了水分子从一种食品组分向另一食品组分的 扩散。运种隔离膜形成特性也可W被用在不希望水在组分之间扩散的药品和维生素片的制 造中。
[0113] 在一个实施方式中，本文所公开的单分散性植物糖原纳米颗粒的组合物被用于药 物递送。单分散性植物糖原纳米颗粒是无毒的，没有已知的变应原性，并且可W被人体的糖 原分解酶(例如淀粉酶和憐酸化酶)降解。酶降解的产物是无毒的中性葡萄糖分子。纳米颗 粒表现出优异的化合物承载能力，因为它们可W与药物直接结合或通过分子间隔子或系链 结合。可W使用特异性组分祀向分子(诸如叶酸、抗体或核酸适体)进一步修饰药物结合的 纳米颗粒。低多分散性允许均匀的衍生化和药物分布、W及相关可预测的药代动力学。最 后，紧凑的球形分子、中性电荷和高亲水性与有效的细胞摄取相关。
[0114] 实施例1.从甜玉米粒提取糖原(植物糖原）
[0115] 在20°C下将1kg冻甜玉米粒(75%含水量）与化去离子水混合，并且在捣碎机中在 3000巧m下粉碎3分钟。在4°C下将糊状物在12,000x g下离屯、15分钟。使用具有Ο.?μπι孔径的 膜滤器，使合并的上清部分经受CFF。使用具有500W)a的MWC0的膜，并且在室溫和6的体积倍 数下，通过间歇渗滤进一步纯化滤出液(体积倍数是在渗滤过程中导入到操作中的总mQ水 体积与滞留体积的比）。
[0116] 将滞留部分与2.5体积95%乙醇混合，并且在4°C下在8,000x g下离屯、10分钟。将 滞留物与2.5体积95%的乙醇混合并且在4°C下在8,000x g下离屯、10分钟。将含有植物糖原 的沉淀在烘箱中在50°C下干燥24小时，然后研磨至45目。干燥的植物糖原的重量为97邑。
[0117] 根据化S测量，所产生的植物糖原纳米颗粒具有为83.Onm的颗粒尺寸直径和0.081 的多分散指数(图2)。
[011引实施例2
[0119] 将250g在凹陷期收获的NK199品种的干玉米粒研磨至小于0.5mm的颗粒尺寸。在20 适度揽拌20分钟进行冷水提取。通过在8,000x g离屯、沉淀出不溶性组分。使用10.0、 1.0和0.1WI1的过滤介质孔径对上清液进行多级微滤。在室溫和6的体积倍数下，使用300W)a 的MWC0进行交叉流过滤(渗滤）。将滞留物与2.5体积95%乙醇混合并且在4°C在8,000xg下 离屯、10分钟。将含有植物糖原的沉淀在烘箱中在50°C下干燥24小时，然后研磨至45目。干燥 的植物糖原的重量为17.5g。
[0120] 根据化S测量，所生产的植物糖原纳米颗粒具有为63. Onm的颗粒尺寸直径和0.053 的多分散指数(图3)。
[0121 ]实施例3.本发明的玉米粒植物糖原的表征
[0122]通过化S来表征本发明的如在实施例2中制备的植物糖原纳米颗粒，且结构示于表 1中。所有品种均为标准型(SU)。
[0123]
[0124]
[0125] 所生产的植物糖原纳米颗粒具有处于0.071和0.129之间的多分散指数，平均多分 散指数为0.10。
[0126] 实施例3.本发明的玉米粒植物糖原的表征
[0127] 表征了如实施例2使用在凹陷期收获的se和sh类型的玉米粒制备的植物糖原纳米 颗粒，并且结果示于表2中。
[012 引
[0129] 实施例4
[0130] W从5至30w/w%的各浓度，将本发明的干燥纳米颗粒组合物溶解于水中。结果示 于图4中。所提供的溶液是澄清的，在最高达按重量计25%的浓度下无显著粘度。对于大于 25 % w/w的浓度，粘度显著提高。对于高于20 % w/w的浓度，溶液表现出较强的剪切稀化特 性。
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【主权项】
1. 一种组合物，包含获自含有植物糖原的植物材料的植物糖原纳米颗粒，通过动态光 散射(DLS)测量，所述植物糖原纳米颗粒具有小于0.3的多分散指数。2. 根据权利要求1所述的组合物，其中，通过DLS测量，所述植物糖原纳米颗粒具有小于 0.2的多分散指数。3. 根据权利要求2所述的组合物，其中，通过DLS测量，所述植物糖原纳米颗粒具有小于 0.1的多分散指数。4. 根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中，所述植物糖原纳米颗粒具有约 30nm和约150nm之间的平均颗粒直径。5. 根据权利要求4所述的组合物，其中，所述植物糖原纳米颗粒具有约60nm和llOnm之 间的平均颗粒直径。6. 根据权利要求4所述的组合物，其中，所述组合物基于干重包含多于80%的具有约 30nm和50nm之间的平均颗粒直径的植物糖原纳米颗粒。7. 根据权利要求6所述的组合物，其中，所述组合物基于干重包含多于90%的具有约 30nm和150nm之间的平均颗粒直径的植物糖原纳米颗粒。8. 根据权利要求7所述的组合物，其中，所述组合物基于干重包含多于99%的具有约 30nm和150nm之间的平均颗粒直径的植物糖原纳米颗粒。9. 根据权利要求5所述的组合物，其中，所述组合物基于干重包含多于80%的具有约 60nm和11 Onm之间的平均颗粒直径的植物糖原纳米颗粒。10. 根据权利要求9所述的组合物，其中，所述组合物基于干重包含多于90%的具有约 60nm和11 Onm之间的平均颗粒直径的植物糖原纳米颗粒。11. 根据权利要求10所述的组合物，其中，所述组合物基于干重包含多于99%的具有约 60nm和11 Onm之间的平均颗粒直径的植物糖原纳米颗粒。12. 根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中，所述含有植物糖原的植物材料 是获自玉米、水稻、大麦、高粱或它们的组合。13. 根据权利要求12所述的组合物，其中，所述含有植物糖原的植物材料是标准型（su) 或含糖增量剂(se)型甜玉米。14. 根据权利要求12或13所述的组合物，其中，所述含有植物糖原的植物材料获自乳熟 期或凹陷期玉米粒。15. 根据权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中，所述组合物是粉末。16. 根据权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中，所述组合物是所述植物糖原纳 米颗粒的含水分散体。17. 根据权利要求1至16中任一项所述的组合物作为成膜剂的用途。18. 根据权利要求1至16中任一项所述的组合物作为药物递送剂的用途。19. 一种生产单分散性植物糖原纳米颗粒的方法，包括： a. 将破碎的含有植物糖原的植物材料沉浸在约0和约50°C之间的温度的水中； b. 使步骤(a.)的产物经受固液分离以获得含水提取物； c .使步骤(b.)的含水提取物通过具有约0.05和0.15μπι之间的最大平均孔径的微滤材 料;和 d.使来自步骤c.的滤出液经受超滤以除去具有低于约300kDa的分子量的杂质，从而获 得包含单分散性植物糖原纳米颗粒的含水组合物。20. 根据权利要求19所述的方法，其中，所述含有植物糖原的植物材料是谷物。21. 根据权利要求20所述的方法，其中，所述谷物是玉米、水稻、大麦、高粱或它们的混 合物。22. 根据权利要求21所述的方法，其中，所述含有植物糖原的植物材料是标准型（su)或 含糖增量剂(se)型甜玉米。23. 根据权利要求21或22所述的方法，其中，所述含有植物糖原的植物材料是标准型 (su)或含糖增量剂(se)型甜玉米的乳熟期或凹陷期籽粒。24. 根据权利要求19至23中任一项所述的方法，包括步骤(e.)使所述包含单分散性植 物糖原纳米颗粒的所述含水组合物经受使用淀粉蔗糖酶、糖基转移酶、支化酶或它们的任 何组合的酶处理。25. 根据权利要求19至24中任一项所述的方法，进一步包括在步骤c或步骤d之前添加 吸附性过滤助剂。26. 根据权利要求25所述的方法，其中，所述吸附性过滤助剂是硅藻土。27. 根据权利要求19至26中任一项所述的方法，其中，所述固液分离包括将步骤(a.)的 产物搅拌1 〇至30分钟的时间段。28. 根据权利要求19至27中任一项所述的方法，其中，步骤(d.)的超滤除去具有小于约 500kDa分子量的杂质。29. 根据权利要求19至28中任一项所述的方法，其中，步骤c.包括使步骤(b.)的所述含 水提取物穿过(c.l)具有约ΙΟμπι和约40μπι之间的最大平均孔径的第一微滤材料；（C.2)具有 约0 · 5μπ?和约2 · ΟμL?之间的最大平均孔径的第二微滤材料;和(C · 3)具有约0 · 05μπ?和约0 · 15μ m之间的最大平均孔径的第三微滤材料。30. 根据权利要求19至29中任一项所述的方法，进一步包括离心步骤b.的产物。31. 根据权利要求19至30中任一项所述的方法，进一步包括(e.l)干燥包含单分散性植 物糖原纳米颗粒的所述含水组合物，以获得基本上单分散性植物糖原纳米颗粒的干燥的组 合物。32. -种组合物，包含根据权利要求19至31中任一项所述的方法生产的基本上单分散 性纳米颗粒。33. 根据权利要求16所述的组合物，其是根据权利要求19至30中任一项的方法生产的。34. 根据权利要求15所述的组合物，其是根据权利要求31的方法生产的。
【专利摘要】提供了一种纯化自含植物糖原的植物材料的植物糖原纳米颗粒的组合物。植物糖原纳米颗粒的组合物是单分散性的。提供了一种从含植物糖原的植物材料分离组合物的方法，其包括微滤和超滤的步骤，但是避免了使用降解植物糖原材料的化学处理、酶处理或热处理。
【IPC分类】C12N5/04, C08J5/18, A61K9/00, C08J3/12, C12P19/00, A61K47/36, C08L5/00, A61K9/14
【公开号】CN105555856
【申请号】CN201480036795
【发明人】安东·科列涅夫斯基, 埃尔兹塞贝特·帕普-绍博, 约翰·罗伯特·达彻, 奥列格·斯图卡洛夫
【申请人】奇迹连结生物技术公司
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2014年4月25日
【公告号】CA2910393A1, CA2910399A1, CN105491994A, EP2988725A1, EP2988725A4, EP2989156A1, EP2989156A4, US20160083484, US20160114045, WO2014172785A1, WO2014172786A1, WO2014172786A8
【专利说明】
[0001] 相关申请的引证
[0002] 本申请要求2013年4月26日提交的美国专利申请61/816686的优先权，并且其内容 由此W其整体并入。
技术领域
[0003] 本发明设及植物糖原(phytoglycogen)纳米颗粒W及生产植物糖原纳米颗粒的方 法。
【背景技术】
[0004] 植物糖原和糖原是由1,4-葡聚糖链组成的葡萄糖多糖，其通过α-1,6-葡萄糖巧键 高度支化，其在植物动物细胞中发挥储能介质的作用。糖原W直径为20-200nm的致密颗粒 的形式存在于动物组织中。糖原也发现积累在微生物中，例如细菌和酵母菌。植物糖原是一 种在结构和物理性质上与糖原相似的多糖，并且起源于植物。
[0005] 糖原和植物糖原被认为是"高度分散的"或非均质材料。对于已知的制剂，糖原典 型地具有处于1〇6和1〇8道尔顿之间的分子量，具有相应的大的多分散性。动物和植物组织W 及提取的糖原/植物糖原制剂的透射电子显微镜(TEM)观察已经掲示了运些多糖的微粒性 质。常报道的糖原或植物糖原的颗粒直径处于20-300nm的范围内并且具有连续或多峰 (multimodal)尺寸分布。20-30nm的小颗粒被称为β-颗粒，而100-300nm的大颗粒被称为α- 颗粒。认为，α-颗粒是由β-颗粒聚集(aggregation)或群聚（clustering)组成的[1]。
[0006] 已经开发了各种方法从活有机体中分离糖原和植物糖原，最常见的是为了量化生 物样品中积累的总糖原的量，并且偶尔为了将糖原在应用中用作产品。
[0007] 最常用的方法是从动物组织、特别是从海洋动物、尤其是软体动物提取，因为它们 有能力积聚糖原。例如，美国专利5,734,045公开了通过使用热碱提取、随后使用阳离子树 脂中和并处理所产生的溶液从蛛类制备不含蛋白质的糖原的方法。例如，在专利申请W0/ 1997/021828所描述的，糖原也可W通过酵母菌发酵来生产。美国专利7，670,812描述了一 种通过使酶的混合物与低分子量糊精接触生物合成生产糖原样多糖的方法。甜玉米和香稻 可作为糖原的来源;参见例如专利申请EP0860448B1，其描述了从香稻粒分离糖原的方法。 [000引糖原/植物糖原分离的主要步骤通常包括:通过粉碎/研磨/娠磨等破碎生物质;将 糖原提取到水相中；通过过滤和/或离屯、分离不溶性固体颗粒；消除微细分散或溶解的脂 质、蛋白质和低分子量污染物;和浓缩并干燥。
[0009] 为了提高第二提取步骤中糖原的收率，通常在提高的溫度下和/或使用碱性溶液 或酸性溶液进行提取。此种工艺包括使用热的浓(20-40 % )碱溶液[2，3 ]、冷酸[4]或沸水 [引对研细的生物材料进行初始处理。
[0010] 在糖原分离/纯化的常规方法中使用的工序导致糖原结构的大量水解、低分子量 产物的显著增加和分子的化学改变。
[0011] 已经开发了各种较溫和的提取工序，诸如冷水提取[6]，并且得到的产物据称接近 天然状态的糖原的表现度。但是，已知由冷水提取法生产的糖原制剂是高度多分散的[7， 1]〇
[0012] 已知有多种方法用于进行从精细分散的蛋白质、脂质、核酸和其他多糖中纯化粗 制糖原提取物的步骤。可W通过使用脱氧胆酸盐(D0C)、S氯乙酸(TCA)、多价阳离子和/或 酶处理(蛋白酶、核酸酶）的选择性沉淀来除去蛋白质和核酸。还已经使用通过将蛋白质盐 析出来(例如使用硫酸锭)或通过离子交换W去除蛋白质的方法。蛋白质去除的另一种常用 方法是热凝固，通常在65-100°C，随后离屯、或过滤。高压灭菌法（121°C，latm)也已经被用来 凝固蛋植物糖原提取物中的蛋白质[引。另外，可W使用酪水提取法除去蛋白质和脂质。
[0013] 国际专利申请公开号W0 2013/019977(化0)教导了一种获得包括植物糖原的提取 物的方法，其包括超滤，但是也使水性提取物经受酶处理，运同时降解了植物糖原及其他多 糖。Yao提取了一种降低植物糖原粘度的方法，其通过使植物糖原经受β-淀粉分解，即使用 β-淀粉酶进行酶促水解。通过化0的方法产出的"经纯化的植物糖原"不仅包括植物糖原，而 且包括植物原的衍生物，衍生物包括β-糊精和其他多糖的消化产物。化0的方法进一步包括 将提取物加热至l〇〇°C (参见化〇的实施例1)。
[0014] 美国专利5,895,686公开了一种用于通过水或含水溶液(在室溫下)从水稻提取植 物糖原的方法，并且通过热变性和TCA沉淀除去蛋白质。产物具有多峰分子量分布，相应地 具有高多分散性和大水溶液粘度。运些性质可归因于来自植物材料的糖原制剂中大量支链 淀粉和直链淀粉的存在，还归因于糖原提取过程中糖原的降解。
[0015] 美国专利5，597，913和5，734，045描述了产生基本不含含氮化合物和还原糖的糖 原的工序，指示了其不含蛋白质和核酸的纯度。运些专利教导了选定组织在高pH溶液中沸 腾的使用。
[0016] 转让给本发明的拥有人的美国专利申请公开号US20100272639 A1提供了一种用 于从细菌和贝类生物质中分离糖原的方法。细菌被教导为是优选的，因为可W进行方法W 获得不具有其他大分子量多糖(诸如支链淀粉和直链淀粉)并且不含与贝类或动物组织有 关的致病细菌、寄生虫、病毒和航病毒的生物质。所公开的方法大体包括步骤:通过法式按 压（French pressing)或通过化学处理进行细胞瓦解（disintegration);通过离屯、分离不 溶性细胞组分;通过酶处理、随后渗析从细胞裂解物中除去蛋白质和核酸，其产生含有粗制 多糖和脂多糖(LPS)的提取物或，可替代地，酪-水提取;通过弱酸水解或通过多价阳离子的 盐的处理(其引起不溶性LPS产物的沉淀)消除LPS;和通过超滤和/或尺寸排阻色谱法纯化 富集了糖原的级分;和使用适合的有机溶剂沉淀糖原或可W通过超滤或超速离屯、法获得浓 缩的糖原溶液;和冷冻干燥W产生糖原的粉末。从细菌生物质分离出的糖原的特点是MWt 5.3-12.7x 106Da，具有直径为35-40nm的颗粒尺寸并且是单分散性的(PDI =Mn/Mw= 1.007- 1.03)。
【发明内容】
[0017] 在一个实施方式中，描述了一种从含有植物糖原的植物材料中获得植物糖原纳米 颗粒的组合物，通过动态光散射(DLS)测定，该植物糖原纳米颗粒具有小于0.3的多分散指 数。在一个实施方式中，通过化S测量，植物糖原纳米颗粒具有小于0.2的多分散指数。在一 个实施方式中，通过化S测量，植物糖原纳米颗粒具有小于0.1的多分散指数。
[001引在一个实施方式中，植物糖原纳米颗粒具有约30nm至约150nm之间的平均颗粒直 径。在一个实施方式中，植物糖原纳米颗粒具有约60nm至llOnm之间的平均颗粒直径。
[0019] 在一个实施方式中，组合物基于干重包括多于80%的植物糖原纳米颗粒，该植物 糖原纳米颗粒具有约30nm至150nm之间的平均颗粒直径。在一个实施方式中，组合物基于干 重包括多于90 %的植物糖原纳米颗粒，该植物糖原纳米颗粒具有约30nm至15化m之间的平 均颗粒直径。在一个实施方式中，组合物基于干重包括多于99 %的植物糖原纳米颗粒，该植 物糖原纳米颗粒具有约30nm至150nm之间的平均颗粒直径。在一个实施方式中，组合物基于 干重包括多于80 %的植物糖原纳米颗粒，该植物糖原纳米颗粒具有约60nm至llOnm之间的 平均颗粒直径。在一个实施方式中，组合物基于干重包括多于90%的植物糖原纳米颗粒，该 植物糖原纳米颗粒具有约60nm至llOnm之间的平均颗粒直径。在一个实施方式中，组合物基 于干重包括多于99 %的植物糖原纳米颗粒，该植物糖原纳米颗粒具有约60nm至llOnm之间 的平均颗粒直径。
[0020] 在一个实施方式中，含有植物糖原的植物材料获自玉米、水稻、大麦、高梁或它们 的组合。在一个实施方式中，含有植物糖原的植物材料是标准型（SU)或含糖增量剂 (surgary extender,se)型甜玉米。在一个实施方式中，含有植物糖原的植物材料获自乳熟 期或凹陷期玉米粒。
[0021] 在一个实施方式中，组合物是粉末。在另一个实施方式中，组合物是植物糖原纳米 颗粒的含水分散体。
[0022] 本文还描述了一种生产单分散性植物糖原纳米颗粒的方法，包括:a.将破碎的含 有植物糖原的植物材料沉浸在约0和约50°C之间的水中；b.使步骤(a.)的产物经受固液分 离W获得含水提取物;C.使步骤(b.)的含水提取物通过具有约0.05和0.15WI1之间的最大平 均孔径的微滤材料;和d.使来自步骤C.的滤出液经受超滤W除去具有低于约300W)a的分子 量的杂质，从而获得包含单分散性植物糖原纳米颗粒的含水组合物。
[0023] 在方法的一个实施方式中，含有植物糖原的植物材料是谷物。在一个实施方式中， 谷物是玉米、水稻、大麦、高梁或它们的混合物。在一个实施方式中，含有植物糖原的植物材 料是标准型（SU)或含糖增量剂（se)型甜玉米。在一个实施方式中，含有植物糖原的植物材 料是标准型(SU)或含糖增量剂(se)型甜玉米的乳熟期或凹陷期巧粒。
[0024] 在一个实施方式中，方法包括步骤(e.)使包含单分散性植物糖原纳米颗粒的含水 组合物经受使用淀粉薦糖酶、糖基转移酶、支化酶或它们的任何组合的酶处理。
[0025] 在一个实施方式中，方法包括步骤(e.l)干燥包含单分散性植物糖原纳米颗粒的 含水组合物，W获得基本上为单分散性植物糖原纳米颗粒的干燥的组合物。
[0026] 在一个实施方式中，方法包括在步骤C或步骤d之前添加吸附性过滤助剂。在一个 实施方式中，吸附性过滤助剂是娃藻±。 [0027] 在一个实施方式中，固液分离步骤包括将步骤(a.)的产物揽拌10至30分钟的时间 段。
[00%]在方法的一个实施方式中，步骤(d.)的超滤除去分子量低于500W)a的杂质。
[0029]在一个实施方式中，步骤C.包括使步骤(b.)的含水提取物通过W下（c.l)、（c.2) 和(C. 3): (C.1)具有约10皿至约40皿之间的最大平均孔径的第一微滤材料；（C. 2)具有约 0.5μπι至约2.0皿之间的最大平均孔径的第二微滤材料;和(C. 3)具有约0.05至0.15皿之间 的最大平均孔径的第Ξ微滤材料。
[0030] 在一个实施方式中，方法进一步包含将步骤b.的产物离屯、。
[0031] 本文中还描述了根据所描述的方法产生的基本上是单分散性的纳米颗粒的组合 物。
[0032] 在一个实施方式中，本文所描述的组合物被用作成膜剂。在一个实施方式中，本文 所描述的组合物被用作药物递送剂。
【附图说明】
[0033] 图1是植物糖原纳米颗粒的示意图。
[0034] 图2示出了使用化S测量的根据实施例1分离的植物糖原的颗粒尺寸分度。
[0035] 图3示出了使用化S测量的根据实施例2分离的植物糖原的颗粒尺寸分布。
[0036] 图4示出了对于根据本发明一个实施方式的单分散性植物糖原纳米颗粒的水分散 体的粘度对浓度(w/w%)。
【具体实施方式】
[0037] 本文中使用的"植物抗原"是指从植物材料获得的a-D葡萄糖链的纳米颗粒，该a-D 葡萄糖链具有11至12的平均链长、具有1^4键并且在1^6处发生支化点并且具有约6%至 约13 %的支化度。
[0038] 在一个实施方式中，提供了一种高分子量葡萄糖均聚物的单分散性纳米颗粒的组 合物。在一个实施方式中，提供了一种单分散性植物糖原纳米颗粒的组合物。
[0039] 通过动态光散射(DLS)技术确定的多分散指数(PDI)，被定义为标准偏差与平均直 径的比率的平方:PDI = (〇/d)2。另外，可W通过聚合物的分子量分布来表示PDI，并且定义 为Mw与Μη的比率，其中Mw是重量平均摩尔质量并且Μη为数量平均摩尔质量(运种PDI量度在 下文中被称为PDI*)。在第一种情况下，单分散性材料具有接近0的PDK0.0)并且在第二种 情况下一1.0。在一个实施方式中，提供了一种植物糖原纳米颗粒的组合物，通过化S测量， 该植物糖原纳米颗粒具有小于约0.3、小于约0.2、小于约0.15、小于约0.10、小于0.07或小 于0.05的PDI。在一个实施方式中，提供了一种植物糖原纳米颗粒的组合物，通过SEC MALS 测量，该植物糖原纳米颗粒具有小于约1.3、小于约1.2、小于约1.15、小于约1.10或小于 1.05 的 PDI*。
[0040] 由于许多原因，单分散性是有利的，包括如果组合物的纳米颗粒是单分散性的，那 么表面改性和衍生的发生更具可预测性。尺寸也影响纳米颗粒在生物组织中的分布和累积 W及药代动力学。另外，窄尺寸分布对于诸如诊断探针、催化剂、纳米薄膜和受控流变等应 用是至关重要的。
[0041] 可W通过本领域众所周知的方法来测评纳米颗粒尺寸，包括直径的分布(分散性） 和平均值。运些方法主要包括化S和显微技术，例如TEM和原子力显微镜。
[0042] 在一个实施方式中，提供了一种植物糖原纳米颗粒的单分散性组合物，该植物糖 原纳米颗粒具有约30至约150nm之间的平均颗粒直径，在一个实施方式中为约60nm至约 llOnm之间。与在现有组合物中看到的聚集的α-颗粒相反，运些纳米颗粒是单个颗粒。
[0043] 在一个实施方式中，植物糖原纳米颗粒产自谷物。在一个实施方式中，植物糖原产 自玉米、水稻、大麦、高梁或它们的混合物。
[0044] 所使用的品种必须是含有植物糖原的。可W容易地由本领域技术人员使用公知技 术进行确定品种是否含有植物糖原。此外，对于许多品种，公开的文献确定了品种是否含有 植物糖原。
[0045] 在一个实施方式中，组合物获自甜玉米（玉米(Zea mays)变种saccharata和玉米 (Zea mays)变种rugosa)。在一个实施方式中，甜玉米是标准型(SU)或含糖增强(se)型。
[0046] 在一个实施方式中，组合物获自甜玉米的凹陷期或乳熟期巧粒。
[0047] 在一个实施方式中，植物糖原纳米颗粒的单分散性组合物基本上是纯的。在一个 实施方式中，组合物基于干重由至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%的具有 约30nm至约15化m之间的直径尺寸的植物糖原纳米颗粒组成。在另一个实施方式中，组合物 基于干重由至少约99%的具有约30nm至约150nm之间的直径尺寸的植物糖原纳米颗粒组 成。在一个实施方式中，组合物基于干重由至少约80 %、至少约85 %、至少约90 %、至少约 95%的具有约60nm至约IWnm之间的直径尺寸的植物糖原纳米颗粒组成。在另一个实施方 式中，组合物基于干重由至少约99%的具有约60nm至约11化m之间的直径尺寸的植物糖原 纳米颗粒组成。
[0048] 在一个实施方式中，组合物基本上不含其他多糖。在一个实施方式中，组合物含有 少于约10%的其他多糖。在一个实施方式中，组合物含有少于约5%的其他多糖。在一个实 施方式中，组合物含有少于约1 %的其他多糖。
[0049] 糖原
[0050] 糖原和植物糖原由通过α-1^4-葡萄糖巧键连接的葡萄糖残基的直链组成，其中 侧链通过α-1^6-葡萄糖巧键附接。来自不同来源的哺乳动物糖原的化学分析显示其平均 链长度为~13个残基[9]。如图1所示，糖原结构的接受的模型具有内链和外链，内链通常含 有两个支化点，外链是未支化的。整个树形聚合物根植于蛋白质糖原蛋白（G)的单分子。 [0051 ]糖原分子的密度随着层的数目呈指数增加。经计算，向糖原分子添加的第13层不 能增加糖原残基的密度，使得12层为理论最大[9]。一个重要的特征是，W运种方式完全形 成的任何分子的最外层会含有该分子的总葡萄糖残基的~45-50%作为未支化的Α-链，而 首先的八个内层仅含有总葡萄糖的~5%。因此，运种模型中的全尺寸糖原分子会由12层组 成，总共~53000个葡萄糖残基，分子质量为~10化化且直径为~25皿。虽然主要由葡萄糖 残基组成，糖原可W含有其他痕量组分，尤其是葡糖胺和憐酸醋[1]。数学建模显示，糖原分 子的结构性质取决于Ξ个参数，即，支化度(r)、层数(t)和每个链中的葡萄糖残基的数目 (gc)[9、10、ll、12、13]。
[0052] 虽然由生长机理显示了糖原分子为球形，但是当分子生长超出一定的限制时，其 会失去结构的同质性，因为支化度和链长度在最终层中退化(degenerate)。
[0053] 植物糖原
[0054] 尽管糖原和植物糖原具有非常类似的结构，但是在运些多糖的功能目的上存在主 要差异。糖原在动物和细菌中旨在用作短期"燃料"储备W优化快速周转。
[0055] 在植物中，主要能量来源是淀粉，其存储在树叶、茎、种子、根等中。与糖原相反，淀 粉是一种长期的能源策略，其允许植物在恶劣的气候环境中生存。淀粉包含两种类型的多 聚葡糖:支链淀粉(其是高度支化的）和直链淀粉(其几乎是直链的，几乎没有分支）。在来自 不同来源的淀粉中，两种组分的含量存在较大的变化，但是通常认为，支链淀粉是储存淀粉 中的主要组分并且占据约65-85重量％。
[0056] 支链淀粉具有由串联式集群(各自长度为约9-lOnm)组成的确定结构，其中直链α- 1,4-葡聚糖链是通过α-1，6-葡萄糖巧键高度规律支化的。由支链淀粉支链形成的半结晶结 构是生物和经济重要的，因为运种结构允许植物高密度地储存碳(~1.6g cm-3) [ 14]。
[0057] 支链淀粉是由四类酶的多个同种型合成的：可溶性淀粉合成酶(SS)、淀粉支化酶 (BEKADP葡萄糖焦憐酸化酶和淀粉脱支酶(DBE)。存在相同的4类设及糖原合成的酶。
[005引运解释了支链淀粉和糖原结构之间的类似性:均为α-1,6-支化的α-1,4-聚葡糖。 然而，支链淀粉中的平均链长(g。)为20-25,约为糖原的两倍，而支化度(r)低约1.5-2倍。
[0059] 异淀粉酶（ISA)中的突变W及由此的脱支化活性的缺陷，导致支链淀粉被植物糖 原的部分替代。在植物中积累的此种植物糖原的最常见实例是玉米、水稻和其他谷物的含 糖l(su)突变体。
[0060] 植物糖原在结构上类似于糖原，具有11-12的平均链长度和类似的支化度，并且典 型地具有1〇6-1〇8化的分子量。但是，所报道的比糖原更大的颗粒尺寸暗示着更低的支化度 和/或更低的结构均一性。鉴于糖原是高度优化的代谢产物，而植物糖原是支链淀粉合成中 排列素乱的结果，所W植物糖原的较低结构均一性是不可预期的。
[0061] 本发明人们已经实验确定，所报道的植物糖原组合物的多分散性事实上部分地由 破坏性分离方法所致，并且所观察到的多分散性可进一步起因于精细分散的污染物诸如蛋 白质、脂质和其他多糖的存在。使用本文所描述的方法，本发明人们已经产生了植物糖原的 单分散性组合物。
[0062] 生产单分散性植物糖原的方法
[0063] 如上所讨论的，糖原/植物糖原分离的主要步骤典型地包括:1.通过粉碎/研磨/娠 磨等破碎生物质；2.将糖原提取到水相中；3.通过过滤和/或离屯、分离不溶性固体颗粒（固 体）；4.消除微细分散或溶解的脂质、蛋白质和低分子量污染物;和5.浓缩并干燥。一些操作 可W被合并，例如娠磨和提取。
[0064] 在一个实施方式中，一种生产单分散性植物糖原纳米颗粒的方法包括：[0065] a.在约0和约50°C之间的溫度下，将破碎的植物材料浸泡在水中；在一个实施方式 中，在约4°C和约20°C之间的溫度下；
[0066] b.使步骤(a.)的产物经受固液分离W获得含水提取物；
[0067] C.适合地在多级过滤过程中过滤步骤(b.)的含水提取物，但是至少穿过具有约 0. Ιμπι的最大平均孔径的微滤材料；
[0068] d.使来自步骤C.的滤出液经受超滤W除去分子量低于约300kDa(在一个实施方式 中，低于约400kDa;在一个实施方式中，低于约500kDa)的杂质，W获得包含单分散性植物糖 原纳米颗粒的组合物。
[0069] 在一个实施方式中，方法进一步包括离屯、步骤b的产物。
[0070] 然后可W干燥含水组合物W得到基本上为单分散性植物糖原纳米颗粒的组合物。 [0071 ]在一个实施方式中，植物材料是谷物。在一个实施方式中，植物材料是玉米、水稻、 大麦、高梁或它们的混合物。在一个实施方式中，植物材料是甜玉米(玉米变种saccharata 和玉米变种rugosa)的巧粒。在一个实施方式中，使用甜玉米的乳熟期或凹陷期的成熟巧 粒。
[0072] 在各个实施方式中，植物糖原的收率为植物材料干重的约5%和50%之间、约10% 和约50%之间、约20%和50%之间、约30%和约50%之间、约40%和约50%之间、约10%和 约40 %之间、约20 %和40 %之间、约30 %和约40 %之间。植物糖原的准确产率将取决于所使 用的植物材料，包括品种和成熟期。W玉米为例，对于乳熟期巧粒成熟期，发明人们已经获 得在巧粒干重的35-40%的范围内的收率，而对于凹陷成熟期获得了20-30%的收率。考虑 到先前报道的植物糖原的高多分散性，单分散性植物糖原的运些收率是出乎预料的。
[0073] 制备破碎植物材料的方法对于本领域技术人员是众所周知的。生物质破碎的方法 包括研磨、娠磨或粉碎生物材料。植物材料被适合地破碎成小于约0.5mm的平均颗粒尺寸。
[0074] 在一个实施方式中，通过适度揽拌10-30分钟进行冷水提取。在一个实施方式中， 冷水提取是在约〇°C和约50°C之间的溫度下进行的。在一个实施方式中，在约4°C和约20°C 之间的溫度下进行冷水提取。揽拌的最佳周期、溫度和揽拌速率取决于破碎的生物质的性 质，并且对它们的确定处于本领域技术人员的技能范围内。
[0075] 将由冷水提取产生的含水提取物离屯、W分离出粗制非可溶性固体。适合地，可选 地在约3,000至约6,OOOx g下离屯、提取物。适合地，通过在约6,000至约12,OOOx g下进行进 一步离屯、，运从粗制植物糖原提取物中部分地分离出精细分散的蛋白质和脂质。
[0076] 离屯、之后是过滤上清液。如本文所描述的，进行多级过滤和超滤，已经惊人地发现 运除去了大部分的蛋白质、脂质和污染性多糖(包括直链淀粉和支链淀粉），而不需要任何 的化学处理、酶处理或热处理，由此产生单分散性植物糖原纳米颗粒的组合物。适合地在使 用Ο.?μπι最终介质孔径的阶段中进行微滤。在一个实施方式中，微滤依次使用如下介质孔径 进行:a)在一个实施方式中，约5μπι和约50μπι之间，在一个实施方式中，约ΙΟμπι和约40μπι之 间，在一个实施方式中，约15μπ?和约35μπ?之间，在一个实施方式中，约20μπ?和约30μπ?之间，并 且在一个实施方式中，约25ym;b)在一个实施方式中，约0.5WI1和约2. Ομπι之间，在一个实施 方式中，约1.Ομπι;和C)在一个实施方式中，约0.05μπι和约0.15μπι之间，在一个实施方式中， 0. Ιμπι。在一个实施方式中，在离屯、之前，可W向植物抗原提取物中加入吸附性过滤助剂诸 如娃藻±。在一个实施方式中，W约2-10%wt/体积的量使用吸附性过滤助剂，在一个实施 方式中，约3-5 % wt/体积之间。
[0077] 使来自微滤的最终滤出液经受超滤，其从中去除低分子量污染物包括盐、蛋白质 和糖(例如糊精、葡萄糖、薦糖或麦芽糖）。超滤可W使用具有约300至约500W)a的分子量截 止(MWC0)的交叉流过滤(CF巧来进行。
[0078] 微滤和超滤的各种方法均为本领域技术人员众所周知并且可W采用任何适合的 方法。
[0079] 可选地，在超滤之后，可W使含有植物糖原的含水分散体经受酶处理W降低多分 散性。适合地，其可W使用淀粉薦糖酶、糖原合成酶、糖基转移酶和支化酶或它们的任何组 合进行处理。但是，应当避免消化支链淀粉和直链淀粉(例如，β-淀粉酶）的酶，因为它们会 产生各种降解的聚葡糖的溶液，而非植物糖原纳米颗粒的纯化组合物。
[0080] 可W通过CFF超滤工艺浓缩植物糖原分散体(最高达30% )。可替代地，在CFF超滤 之后，可W使用适合的有机溶剂诸如丙酬、甲醇、丙醇等(优选乙醇)沉淀植物糖原。方法进 一步包括适合地通过喷雾干燥或冷冻干燥来干燥植物糖原提取物。各种标准浓缩和/或干 燥方法诸如使用降膜蒸发器、升膜蒸发器、喷雾干燥、冷冻干燥、滚筒干燥或它们的组合等 来脱水植物糖原分散体和/或收集固体形式的植物糖原产物。
[0081] 如实施例中示出的，取决于所使用的起始植物材料，所得到的植物糖原的材料的 特征在于30nm和150nm之间的颗粒直径，连同通过化S现慢的低至0.07的多分散指数。
[0082] 确保高纯度材料及其单分散性的关键在于精细微滤和超滤的组合。
[0083] 纳米颗粒的化学官能化
[0084] 本发明的实施方式包括具有化学官能化表面的纳米颗粒和分子和/或与各种各样 的分子结合的纳米颗粒。化学官能化在合成领域中是众所周知的。参见例如March, Advanced (Organic Chemistry,第六版,Wiley,2007。官能化可W在颗粒的表面进行或同时 在颗粒的表面和内部进行，但是将糖原分子的结构维持为如上的单支化均聚物。
[0085] 此类官能化的表面基团包括但不限于亲核基团与亲电基团、酸性基团和碱性基 团，包括例如幾基、胺基、硫醇基、簇基或其他酸性基团。氨基可W是伯、仲、叔或季氨基。可 W使用不饱和基团诸如乙締基和締丙基官能化本文所描述的纳米颗粒。
[0086] 所分离和纯化的纳米颗粒可W被直接或间接官能化，在间接官能化中可W使用一 个或多个中间接头或间隔子。纳米颗粒可W经受一个或多于一个官能化步骤，包括两个或 更多个、Ξ个或更多个或四个或更多个官能化步骤。
[0087] 官能化的纳米颗粒可W进一步与各种的分子结合，分子在各种应用中是感兴趣 的，诸如生物分子、小分子、治疗剂、微粒和纳米颗粒、药物活性部分、大分子、诊断标签、馨 合剂、分散剂、电荷改性剂、粘度改性剂、表面活性剂、凝聚剂和絮凝剂，W及运些化合物的 各种组合。
[0088] 可W使用用于多糖官能化或衍生化的已知方法。例如，一种方法是通过选择性氧 化C-2、C-3、C-4和/或C-6位的葡萄糖径基来导入幾基。存在有广泛的可使用的氧化剂，诸如 高舰酸盐(例如高舰酸钟）、漠、二甲基亚讽/乙酸酢(DMS0/AC20)[例如，美国专利号4,683， 298]、戴斯-马下高舰烧(Dess-Ma;rtin periodinane)等。
[0089] 本文所描述的纳米颗粒在用幾基官能化时可容易地与携带有伯胺基或仲胺基的 化合物反应。运导致形成亚胺，其可W使用还原剂例如棚氨化钢被进一步还原为胺。因此， 还原步骤提供比亚胺中间体更稳定的氨基产物，并且还将未反应的幾基转化为径基。幾基 的消除显著地降低了衍生的纳米颗粒与非祀分子(例如血浆蛋白）的非特异性相互作用的 可能性。
[0090] 可W在一个容器中同时进行幾基化合物和氨基化合物之间的反应W及还原步骤 (向相同反应混合物中导入适合的还原剂）。运种反应被称为直接还原胺化反应。此处，可W 使用在幾基的存在下选择性还原亚胺的任何还原剂，例如氯基棚氨化钢。
[0091] 为了从幾基官能化的纳米颗粒制备氨基官能化的纳米颗粒，可W使用任何锭盐或 含伯胺或仲胺的化合物，例如乙酸锭、氯化锭、阱、乙二胺或己二胺。运种反应可W在水中或 在含水极性有机溶剂例如乙醇、DMS0或二甲基甲酯胺中进行。
[0092] 还可W通过使用下列两步法来实现本文所描述的纳米颗粒的还原胺化。该第一步 是締丙基化，即通过在还原剂例如棚氨化钢的存在下与締丙基面反应将径基转化为締丙 基。在第二步骤中，使締丙基与双官能氨基硫醇化合物例如氨基乙硫醇反应。
[0093] 可W进一步修饰氨基官能化的纳米颗粒。例如，氨基与幾基化合物(醒和酬）、簇酸 及其衍生物(例如酷氯、醋）、班巧酷亚胺醋、异硫氯酸醋、横酷氯化物等反应。
[0094] 在某些实施方式中，使用氯基化过程将本文的纳米颗粒官能化。运种过程导致在 多糖径基上形成氯酸醋和亚氨基碳酸醋。运些基团在非常溫和的条件下可W与伯胺容易地 反应，形成共价键。氯化剂诸如漠化氯并且优选1-氯基-4-二乙基氨基-化晚盐(CDAP)可W 被用于纳米颗粒的官能化。
[0095] 官能化的纳米颗粒可W被直接附接至携带有能够结合幾基或氨基的官能团的化 合物。但是，对于一些应用，通过间隔子或接头(包括例如聚合物间隔子或接头)来附接化合 物可能是重要的。运些可W是携带有官能团（包括但不限于氨基、幾基、琉基、班巧酷亚胺 基、马来酷亚胺基和异氯酸醋）的同双官能接头或异双官能接头，例如二氨基己烧、糖双(横 基班巧酷亚胺基班巧酸）乙二醋(横基-EGS)、二横基班巧酷亚氨基酒石酸醋(横基-DST)、二 硫代双(横基班巧酷亚胺基丙酸醋KDTSSP)、氨基乙硫醇等。
[0096] 用于纳米颗粒/结合的化合物和改性剂
[0097] 在某些实施方式中，可W被用来修饰 本文所描述的纳米颗粒的化合物包括但不限 于:生物分子、小分子、治疗剂、微粒和纳米颗粒、药物活性部分、大分子、诊断标签、馨合剂、 分散剂、电荷改性剂、粘度改性剂、表面活性剂、凝聚剂和絮凝剂、W及运些化合物的各种组 厶 1=1 〇
[0098] 在某些实施方式中，作为用于修饰本文所描述的纳米颗粒的化合物的生物分子包 括但不限于酶、受体、神经递质、激素、细胞因子、细胞应答的化合物(诸如生长因子和趋化 因子）、抗体、疫苗、半抗原、毒素、干扰素、核酶、反义剂和核酸。
[0099] 在某些实施方式中，本文所描述的纳米颗粒的小分子改性剂可W是可用作催化剂 的那些，并且包括但不限于金属有机络合物。
[0100] 在某些实施方式中，作为纳米颗粒的改性剂的药用部分包括但不限于疏水性改性 剂、药代动力学改性剂、生物活性改性剂和可检测的改性剂。
[0101] 在某些实施方式中，可W使用具有光吸收、光发射、巧光、发光、拉曼散射、巧光共 振能量转移和电致发光特性的化合物来修饰纳米颗粒。
[0102] 在某些实施方式中，纳米颗粒的诊断标签包括但不限于用于丫闪烁和正电子发射 断层扫描(PET)的诊断放射性药物或放射性同位素，用于磁共振成像(MRI)的造影剂(例如 顺磁性原子和超顺磁性纳米晶体），计算机断层扫描用造影剂，X射线成像用造影剂，超声诊 断方法用造影剂，中子活化剂，W及W各种光学程序中可W反射、散射或影响X光、超声波、 无线电波和微波、巧光的其他部分等。诊断用放射性药物包括γ -发射放射性核素，例如铜- 111、得-99m、舰-131等。MRI (磁共振成像）用造影剂包括磁性化合物，例如顺磁性离子、铁、 儘、礼、铜系元素、有机顺磁性部分和超顺磁性、铁磁性和反铁磁性化合物，例如氧化铁胶 体、铁素体胶体等。计算机断层扫描及其他X射线基成像方法用造影剂包括吸收X射线的化 合物，例如舰、领等。基于超声的方法用造影剂包括吸收、反射和散射超声波的化合物，例如 乳液、晶体、气泡等。其他实例包括用于中子活化的物质，诸如棚和礼。进一步的，可W采用 的标签能够反射、折射、散射或W其他方式影响X射线、超声波、无线电波、微波和在诊断程 序中有用的其他射线。在某些实施方式中，改性剂包括顺磁性离子或基团。
[0103] 在某些实施方式中，可W使用两种或更多种不同的化合物来生产多官能衍生物。 例如，第一化合物选自潜在特异性结合生物分子的列表，诸如抗休和核酸适体，并且第二化 合物选自潜在诊断标签的列表。
[0104] 在某些实施方式中，使用本领域一般公知的方法(参见，例如，化nobiotechnology II,Eds Mirkin and化6111巧61',胖;[1巧-￥邸,2007.)，本文所描述的纳米颗粒可^被用作制 造无机纳米材料的模板。运可W包括用带电荷的官能团官能化纳米颗粒，随后矿化，运可包 括在各种阳离子例如金属、半导体的溶液中溫育官能化的纳米颗粒。然后可W将本文所描 述的矿化的纳米颗粒纯化并且用于各种应用中，应用包括但不限于医学诊断、传感器、光 学、电子等。
[010引组合物
[0106] 在一个实施方式中，纳米颗粒组合物为如在超滤步骤后获得的含水提取物的形 式。
[0107] 在一个实施方式中，纳米颗粒组合物是干燥的并且该组合物是粉末。
[0108] 本发明的干燥纳米颗粒组合物容易地可溶于/可分散于水、甘油中W及一些有机 溶剂诸如二甲基亚讽(DMS0)或二甲基甲酯胺DMF中。在一个实施方式中，组合物包含分散于 水或溶剂中的干燥纳米颗粒。与先前的糖原组合物相比，单分散性纳米颗粒组合物具有独 特的流变性质。本发明的纳米颗粒组合物的含水分散体在最高达按重量计25%的浓度下未 显示出显著的粘度。与此相比，Yao(W0 2013/019977)的"纯植物糖原"在15.2w/w下显示出 3.645pas 的粘度（3645 ± 315mPas)。
[0109] 在一个实施方式中，组合物的在室溫下的为从制造日期起保持至少24个月货架稳 定。
[0110] 工业适用性
[0111] 本文所公开的单分散性植物糖原纳米颗粒的组合物可W被用在广泛的食品、个人 护理、工业和医学应用中。例如，组合物可W被用作控制流变性、保水性和表面特性的添加 剂。应用的实例包括:成膜、碳水化合物的低血糖指数来源、纹理增强剂、皮肤填充剂、维生 素和其他光敏生物活性化合物的稳定剂、体质颜料(pigment extender)、医学润滑剂和赋 形剂、药物递送剂。本发明的组合物还可W被用来提高防晒配方的UV保护并且提高生物活 性物质和其他对光不稳定的化合物(如防晒霜、维生素和药物）的光稳定性。在由同一申请 人与本申请同时提交的标题为"多官能糖原和植物糖原添加剂(polyfunctional glycogen and地ytoglycogen additives)"的国际专利申请中详细的说明了各种应用，并且其内容 通过引用W其整体并入本文。
[0112] 本文所公开的单分散性植物糖原纳米颗粒作为成膜剂是特别有用的。因为纳米颗 粒可能是单分散的、均匀密堆积膜。组合物形成具有低水活度(water activity)的稳定膜。 水活度表征了材料可W结合水的程度W及水分子可W在材料中迁移的程度。水活度在需要 在产品的物理强度和产品的口味之间寻求平衡的食品工业中是重要的，产品物理强度随其 干燥而提高，而产品口味经常随含水量的提高而增加。水活度的控制在含有多种结构不同 组分的食品产品中尤其重要，例如松饼的主体和在松饼顶部的糖霜涂层。本发明的组合物 可W被用作食品产品的不同组分之间的隔离膜。例如，如果食品产品相对干燥，在将另一组 分与第一种组分接触之前，将本发明的单分散性植物糖原纳米颗粒的浓缩含水溶液喷散在 食品产品第一组分的表面上，并且使其干燥。对于食品产品已经含有大量水分的情况，可W 将植物糖原纳米颗粒的细粉洒在第一食品组分的表面上直至形成了连续膜，之后使其接触 第二组分。组合物形成隔离膜并且本质上减少了水分子从一种食品组分向另一食品组分的 扩散。运种隔离膜形成特性也可W被用在不希望水在组分之间扩散的药品和维生素片的制 造中。
[0113] 在一个实施方式中，本文所公开的单分散性植物糖原纳米颗粒的组合物被用于药 物递送。单分散性植物糖原纳米颗粒是无毒的，没有已知的变应原性，并且可W被人体的糖 原分解酶(例如淀粉酶和憐酸化酶)降解。酶降解的产物是无毒的中性葡萄糖分子。纳米颗 粒表现出优异的化合物承载能力，因为它们可W与药物直接结合或通过分子间隔子或系链 结合。可W使用特异性组分祀向分子(诸如叶酸、抗体或核酸适体)进一步修饰药物结合的 纳米颗粒。低多分散性允许均匀的衍生化和药物分布、W及相关可预测的药代动力学。最 后，紧凑的球形分子、中性电荷和高亲水性与有效的细胞摄取相关。
[0114] 实施例1.从甜玉米粒提取糖原(植物糖原）
[0115] 在20°C下将1kg冻甜玉米粒(75%含水量）与化去离子水混合，并且在捣碎机中在 3000巧m下粉碎3分钟。在4°C下将糊状物在12,000x g下离屯、15分钟。使用具有Ο.?μπι孔径的 膜滤器，使合并的上清部分经受CFF。使用具有500W)a的MWC0的膜，并且在室溫和6的体积倍 数下，通过间歇渗滤进一步纯化滤出液(体积倍数是在渗滤过程中导入到操作中的总mQ水 体积与滞留体积的比）。
[0116] 将滞留部分与2.5体积95%乙醇混合，并且在4°C下在8,000x g下离屯、10分钟。将 滞留物与2.5体积95%的乙醇混合并且在4°C下在8,000x g下离屯、10分钟。将含有植物糖原 的沉淀在烘箱中在50°C下干燥24小时，然后研磨至45目。干燥的植物糖原的重量为97邑。
[0117] 根据化S测量，所产生的植物糖原纳米颗粒具有为83.Onm的颗粒尺寸直径和0.081 的多分散指数(图2)。
[011引实施例2
[0119] 将250g在凹陷期收获的NK199品种的干玉米粒研磨至小于0.5mm的颗粒尺寸。在20 适度揽拌20分钟进行冷水提取。通过在8,000x g离屯、沉淀出不溶性组分。使用10.0、 1.0和0.1WI1的过滤介质孔径对上清液进行多级微滤。在室溫和6的体积倍数下，使用300W)a 的MWC0进行交叉流过滤(渗滤）。将滞留物与2.5体积95%乙醇混合并且在4°C在8,000xg下 离屯、10分钟。将含有植物糖原的沉淀在烘箱中在50°C下干燥24小时，然后研磨至45目。干燥 的植物糖原的重量为17.5g。
[0120] 根据化S测量，所生产的植物糖原纳米颗粒具有为63. Onm的颗粒尺寸直径和0.053 的多分散指数(图3)。
[0121 ]实施例3.本发明的玉米粒植物糖原的表征
[0122]通过化S来表征本发明的如在实施例2中制备的植物糖原纳米颗粒，且结构示于表 1中。所有品种均为标准型(SU)。
[0123]
[0124]
[0125] 所生产的植物糖原纳米颗粒具有处于0.071和0.129之间的多分散指数，平均多分 散指数为0.10。
[0126] 实施例3.本发明的玉米粒植物糖原的表征
[0127] 表征了如实施例2使用在凹陷期收获的se和sh类型的玉米粒制备的植物糖原纳米 颗粒，并且结果示于表2中。
[012 引
[0129] 实施例4
[0130] W从5至30w/w%的各浓度，将本发明的干燥纳米颗粒组合物溶解于水中。结果示 于图4中。所提供的溶液是澄清的，在最高达按重量计25%的浓度下无显著粘度。对于大于 25 % w/w的浓度，粘度显著提高。对于高于20 % w/w的浓度，溶液表现出较强的剪切稀化特 性。
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【主权项】
1. 一种组合物，包含获自含有植物糖原的植物材料的植物糖原纳米颗粒，通过动态光 散射(DLS)测量，所述植物糖原纳米颗粒具有小于0.3的多分散指数。2. 根据权利要求1所述的组合物，其中，通过DLS测量，所述植物糖原纳米颗粒具有小于 0.2的多分散指数。3. 根据权利要求2所述的组合物，其中，通过DLS测量，所述植物糖原纳米颗粒具有小于 0.1的多分散指数。4. 根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中，所述植物糖原纳米颗粒具有约 30nm和约150nm之间的平均颗粒直径。5. 根据权利要求4所述的组合物，其中，所述植物糖原纳米颗粒具有约60nm和llOnm之 间的平均颗粒直径。6. 根据权利要求4所述的组合物，其中，所述组合物基于干重包含多于80%的具有约 30nm和50nm之间的平均颗粒直径的植物糖原纳米颗粒。7. 根据权利要求6所述的组合物，其中，所述组合物基于干重包含多于90%的具有约 30nm和150nm之间的平均颗粒直径的植物糖原纳米颗粒。8. 根据权利要求7所述的组合物，其中，所述组合物基于干重包含多于99%的具有约 30nm和150nm之间的平均颗粒直径的植物糖原纳米颗粒。9. 根据权利要求5所述的组合物，其中，所述组合物基于干重包含多于80%的具有约 60nm和11 Onm之间的平均颗粒直径的植物糖原纳米颗粒。10. 根据权利要求9所述的组合物，其中，所述组合物基于干重包含多于90%的具有约 60nm和11 Onm之间的平均颗粒直径的植物糖原纳米颗粒。11. 根据权利要求10所述的组合物，其中，所述组合物基于干重包含多于99%的具有约 60nm和11 Onm之间的平均颗粒直径的植物糖原纳米颗粒。12. 根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中，所述含有植物糖原的植物材料 是获自玉米、水稻、大麦、高粱或它们的组合。13. 根据权利要求12所述的组合物，其中，所述含有植物糖原的植物材料是标准型（su) 或含糖增量剂(se)型甜玉米。14. 根据权利要求12或13所述的组合物，其中，所述含有植物糖原的植物材料获自乳熟 期或凹陷期玉米粒。15. 根据权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中，所述组合物是粉末。16. 根据权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中，所述组合物是所述植物糖原纳 米颗粒的含水分散体。17. 根据权利要求1至16中任一项所述的组合物作为成膜剂的用途。18. 根据权利要求1至16中任一项所述的组合物作为药物递送剂的用途。19. 一种生产单分散性植物糖原纳米颗粒的方法，包括： a. 将破碎的含有植物糖原的植物材料沉浸在约0和约50°C之间的温度的水中； b. 使步骤(a.)的产物经受固液分离以获得含水提取物； c .使步骤(b.)的含水提取物通过具有约0.05和0.15μπι之间的最大平均孔径的微滤材 料;和 d.使来自步骤c.的滤出液经受超滤以除去具有低于约300kDa的分子量的杂质，从而获 得包含单分散性植物糖原纳米颗粒的含水组合物。20. 根据权利要求19所述的方法，其中，所述含有植物糖原的植物材料是谷物。21. 根据权利要求20所述的方法，其中，所述谷物是玉米、水稻、大麦、高粱或它们的混 合物。22. 根据权利要求21所述的方法，其中，所述含有植物糖原的植物材料是标准型（su)或 含糖增量剂(se)型甜玉米。23. 根据权利要求21或22所述的方法，其中，所述含有植物糖原的植物材料是标准型 (su)或含糖增量剂(se)型甜玉米的乳熟期或凹陷期籽粒。24. 根据权利要求19至23中任一项所述的方法，包括步骤(e.)使所述包含单分散性植 物糖原纳米颗粒的所述含水组合物经受使用淀粉蔗糖酶、糖基转移酶、支化酶或它们的任 何组合的酶处理。25. 根据权利要求19至24中任一项所述的方法，进一步包括在步骤c或步骤d之前添加 吸附性过滤助剂。26. 根据权利要求25所述的方法，其中，所述吸附性过滤助剂是硅藻土。27. 根据权利要求19至26中任一项所述的方法，其中，所述固液分离包括将步骤(a.)的 产物搅拌1 〇至30分钟的时间段。28. 根据权利要求19至27中任一项所述的方法，其中，步骤(d.)的超滤除去具有小于约 500kDa分子量的杂质。29. 根据权利要求19至28中任一项所述的方法，其中，步骤c.包括使步骤(b.)的所述含 水提取物穿过(c.l)具有约ΙΟμπι和约40μπι之间的最大平均孔径的第一微滤材料；（C.2)具有 约0 · 5μπ?和约2 · ΟμL?之间的最大平均孔径的第二微滤材料;和(C · 3)具有约0 · 05μπ?和约0 · 15μ m之间的最大平均孔径的第三微滤材料。30. 根据权利要求19至29中任一项所述的方法，进一步包括离心步骤b.的产物。31. 根据权利要求19至30中任一项所述的方法，进一步包括(e.l)干燥包含单分散性植 物糖原纳米颗粒的所述含水组合物，以获得基本上单分散性植物糖原纳米颗粒的干燥的组 合物。32. -种组合物，包含根据权利要求19至31中任一项所述的方法生产的基本上单分散 性纳米颗粒。33. 根据权利要求16所述的组合物，其是根据权利要求19至30中任一项的方法生产的。34. 根据权利要求15所述的组合物，其是根据权利要求31的方法生产的。
【专利摘要】提供了一种纯化自含植物糖原的植物材料的植物糖原纳米颗粒的组合物。植物糖原纳米颗粒的组合物是单分散性的。提供了一种从含植物糖原的植物材料分离组合物的方法，其包括微滤和超滤的步骤，但是避免了使用降解植物糖原材料的化学处理、酶处理或热处理。
【IPC分类】C12N5/04, C08J5/18, A61K9/00, C08J3/12, C12P19/00, A61K47/36, C08L5/00, A61K9/14
【公开号】CN105555856
【申请号】CN201480036795
【发明人】安东·科列涅夫斯基, 埃尔兹塞贝特·帕普-绍博, 约翰·罗伯特·达彻, 奥列格·斯图卡洛夫
【申请人】奇迹连结生物技术公司
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2014年4月25日
【公告号】CA2910393A1, CA2910399A1, CN105491994A, EP2988725A1, EP2988725A4, EP2989156A1, EP2989156A4, US20160083484, US20160114045, WO2014172785A1, WO2014172786A1, WO2014172786A8
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