新型突变体鸟氨酸脱羧酶蛋白和其用图
新型突变体鸟氨酸脱羧酶蛋白和其用图
【技术领域】
[0001] 本公开内容设及新型修饰的鸟氨酸脱簇酶蛋白和其用途。
【背景技术】
[0002] 腐胺(或1,4-下二胺)是用于生产包括尼龙-4、6在内的聚酷胺-4、6的重要原料，并 且主要通过班巧腊的加氨W工业规模生产，所述班巧腊通过氯化氨的加成自丙締腊产生。 此化合物的化学合成需要不可再生的石油化学产品作为原料、和多步骤与多反应器设计中 相对高的溫度和压力、W及使用昂贵的催化剂体系。另外，因为运些原料是高毒性和易燃 的，所W已知的化学合成工艺是不利于环境的。因此，作为化学生产工艺的替代选择，需要 从源自可再生的生物质的碳源生产腐胺的方法。近来，通过环境友好的微生物生产腐胺的 生化方法已经受到很多关注。腐胺是在从细菌到动物和植物范围的广谱的生物体中发现的 一种多胺。大肠杆菌中腐胺的浓度已知为极其高，多达大约2.8g/L。同样地，微生物具有对 高浓度多胺的潜在的良好抗性，并且因而它们能够在其高浓度的存在下生长和生存。例如， 已经报道谷氨酸棒状杆菌甚至可W在大于30g/L的尸胺的存在下生长。因此，已经持续地进 行研究W在可工业获得的高浓度多胺的生产中使用微生物。然而，对使用微生物生产多胺 的研究还不足够先进而可工业应用。因此，需要开发出能够W高产量生产多胺的菌株(Qian ZG等，Biotechnol Bioeng,104:651-662,2009;Schneide;r J等，Appl Microbiol Biotechnol,88:859-868,2010)。
[0003] 同时，鸟氨酸脱簇酶(ODC)是在大多数微生物中发现的酶，其将鸟氨酸转化为腐 胺。大肠杆菌中的0DC通常形成同型二聚体，并且在二聚体界面(dimerinterface)处形成活 性位点。0DC的反应机制需要憐酸化唉醒(PLP)作为辅助因子，并且PLP在酶的活性位点的赖 氨酸残基处形成希夫碱，其随后被经历脱簇的底物鸟氨酸替换。当产生腐胺时，0DC再次与 PLP形成希夫碱。
[0004] 当0DC被引入产腐胺菌株一一棒状杆菌属一一时，其是由大肠杆菌spec基因编码 的蛋白质，并且其活性被报道为非常低。因此，为了开发W高产量生产腐胺的菌株，0DC-一 其是参与腐胺生物合成途径的最后步骤的酶一一的改进是非常重要的。至今，仅对0DC蛋白 的结构或反应机制进行了突变研究，并且还没有关于其活性增加的报道。
【发明内容】
[0005] 技术问题
[0006] 本发明人已经做出了许多努力W改进0DC蛋白，其在腐胺的生产中发挥重要的作 用但显示低活性。结果，本发明人发现了新型突变位点，并且在该位点上引入了突变W制备 具有改进的产腐胺活性的修饰的0DC蛋白，并且他们发现当该修饰的0DC蛋白被引入产腐胺 微生物时，微生物能够W高产量生产腐胺，从而完成本申请。
[0007] 技术方案
[000引本发明的目标是提供新型修饰的鸟氨酸脱簇酶(0DC)蛋白。
[0009] 本发明的另一个目标是提供编码该修饰的ODC蛋白的多核巧酸、包括所述多核巧 酸的载体和转化有所述载体的转化体。
[0010] 本发明的仍另一个目标是提供制备腐胺的方法，所述方法包括W下步骤:使レ鸟 氨酸、包含k鸟氨酸的混合物或k鸟氨酸发酵液与该修饰的0DC蛋白反应。
[0011] 本发明的仍另一个目标是提供重组微生物，其通过改变为具有产腐胺活性的棒状 杆菌属某种微生物中的修饰的0DC蛋白而具有改进的产腐胺活性。
[0012] 本发明的仍另一个目标是提供生产腐胺的方法，所述方法包括W下步骤:培养通 过引入修饰的0DC蛋白而具有改进的产腐胺活性的棒状杆菌属某种微生物;和从在上面的 步骤中获得的培养物回收腐胺。
[OOU]有益效果
[0014] 根据本发明的修饰的鸟氨酸脱簇酶蛋白具有比天然形式高21倍的腐胺转化活性。 当修饰的鸟氨酸脱簇酶蛋白被引入产腐胺菌株时，腐胺生产力显著地增加。因此，其可W作 为已知的化学合成途径的替代选择，广泛地应用于腐胺的高效大批量生产。
【附图说明】
[0015] 图1显示了源自天然的大肠杆菌的0DC蛋白和具有I163A或E165A突变的0DC蛋白之 间的腐胺转化活性的比较。详细地，当发生转化反应时，抑增加，并且当通过酪红检验pH增 加时，观察到吸光度的增加。发现具有I163A或E165A或全部两种突变的0DC蛋白与天然的 0DC蛋白相比显示卓越的腐胺转化活性。
[0016] 发明的最佳模式
[0017] 在实现上面目标的方面中，本发明提供新型修饰的0DC蛋白，该修饰的0DC蛋白在 一个或多个氨基酸残基处具有突变，所述氨基酸残基选自距鸟氨酸脱簇酶(0DC)的N-末端 163位的异亮氨酸氨基酸残基和165位的谷氨酸氨基酸残基，所述鸟氨酸脱簇酶(0DC)具有 由SEQ ID NO: 1表示的氨基酸序列。
[0018] 如本文使用的，术语"鸟氨酸脱簇酶(ODCr是指催化W下反应的酶，所述反应是从 鸟氨酸合成多胺的第一步和腐胺合成途径的最后一步。在使用心鸟氨酸作为底物生产腐胺 中，憐酸化唉醒(PLP)起辅助因子的作用。
[0019][反应方案]
[0020] k鸟氨酸 < =〉腐胺+C〇2
[0021] 在本发明中，鸟氨酸脱簇酶(0DC)可W具体地是源自大肠杆菌的0DC，并且更具体 地是具有由SEQ ID NO: 1表示的氨基酸序列的0DC，其源自大肠埃希杆菌。
[0022] 在本发明中，获得0DC(鸟氨酸脱簇酶）的方法可W通过应用本领域中已知的各种 方法进行。例如，可W通过基因合成技术一一其包括通常在酶表达中使用的用于在大肠杆 菌中W高产量获得酶的密码子优化、和基于微生物的基因组信息通过生物信息学筛选有用 的酶资源的方法一一获得0DC，但不限于此。
[0023] 如本文使用的，术语"修饰的0DC蛋白"是指其中0DC蛋白的氨基酸序列中的一个或 多个氨基酸被添加、缺失或置换的0DC蛋白。具体地，修饰的0DC蛋白是指其中通过0DC蛋白 的修饰其活性与野生型的活性相比高效地增加的蛋白质。在本发明中，可W非限制性地使 用本领域中已知的改进酶的任何一般方法进行修饰，并且方法由策略比如合理设计和定向 进化示例。例如，合理设计策略可w包括在特定位点处的氨基酸的突变(位点定向诱变），并 且定向进化策略可W包括随机诱变。进一步，天然修饰(一个或多个)可W在SEQ ID NO: 1的 163位和/或165位的氨基酸残基(一个或多个)处发生，而没有外部操纵。如本文使用的，术 语"修饰的0DC蛋白"、"0DC突变体"和"spec突变体"可W互换地使用。
[0024] 具体地，本发明的修饰的0DC蛋白可具有在距鸟氨酸脱簇酶(0DC)的N-末端163位 的异亮氨酸氨基酸残基和/或165位的谷氨酸氨基酸残基的修饰(一个或多个），所述鸟氨酸 脱簇酶(0DC)源自大肠埃希杆菌并具有由SEQ ID NO: 1表示的氨基酸序列。例如，165位的谷 氨酸可用丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸或鄉氨酸替换，或者163位的异亮氨酸可用丙氨酸、甘氨 酸、丝氨酸或鄉氨酸替换。进一步，修饰的0DC蛋白可具有163位的异亮氨酸和165位的谷氨 酸的双重修饰，其中163位的异亮氨酸和165位的谷氨酸可W分别用选自丙氨酸、鄉氨酸、丝 氨酸和甘氨酸的氨基酸替换。具体地，163位的异亮氨酸和165位的谷氨酸可W分别用丙氨 酸-丙氨酸、丙氨酸-鄉氨酸、丝氨酸-鄉氨酸或鄉氨酸-鄉氨酸替换。
[0025] 在本发明的实施方式中，当发现对野生型0DC的163和165位的氨基酸的突变的多 种组合导致增加腐胺生产力时，建议运些位置在制备具有改进的腐胺生产力的0DC突变体 中非常重要。具体而言，当在重要的突变位点处存在的氨基酸被替换为小的氨基酸残基(丙 氨酸、丝氨酸、鄉氨酸或甘氨酸)时，腐胺生产力增加。
[0026] 进一步，本发明的修饰的0DC蛋白可W由SEQ ID N0:34至SEQ ID N0:57中的任一 个氨基酸序列组成，和具体地，由沈Q ID NO: 34至SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO:45和沈Q ID N0:49和SEQ ID N0:57中的任一个氨基酸序列组成，其是修饰的ODC蛋白的氨基酸序列，其 中分别距N-末端163或165位的异亮氨酸或谷氨酸被替换为小的残基。修饰的0DC蛋白可W 包括具有与上面的序列50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%或更高 的同源性的任何多肤，只要其具有上面的修饰并且相对于野生型的腐胺转化活性具有卓越 的腐胺转化活性。
[0027] 如本文使用的，术语"同源性"是指两个多核巧酸或多肤部分之间的同一性的百分 比。可W通过本领域中已知的技术确定从一个部分至另一个的序列对应。例如，通过使用容 易获得并且能够比对序列信息的计算机程序，可W通过直接比对两个多核巧酸分子或两个 多肤分子的序列信息来测定同源性。此外，可W通过W下过程测定同源性:使多核巧酸在用 于形成稳定的双链的条件下在同源区中杂交，并且然后通过单链特异性核酸酶消化杂交的 链W测定消化片段的大小。
[0028] 如本文使用的，术语"同源的"是指蛋白质之间的相关性，其中全部语法形式和拼 写变化包括源自超家族的蛋白质和具有"共同进化起源 "的源自其它物种的同源蛋白质。运 样的蛋白质（和其编码基因）具有由高度的序列相似性反映的序列同源性。然而，在一般用 途和在本发明中，当由形容词比如"非常高"修饰术语"相同性"时，其是指序列相似性，而不 是共同进化起源。
[0029] 如本文使用的，术语"序列相似性"是指可W或不可W共享共同进化起源的蛋白质 的核巧酸序列或氨基酸序列之间的同一性或同源性的程度。在【具体实施方式】中，当对于固 定长度的氨基酸序列，两个氨基酸序列之间的多肤匹配是至少21 % (具体地至少大约50% 和最具体地大约75 %、90 %、95 %、96 %、97 %或99 % )时，那两个序列是"基本上同源的"或 "基本上相似的"。可W通过使用在数据库中使用的标准软件比较序列，或者例如通过在为 某一系统限定的严格条件下进行DM杂交实验，来鉴定基本上同源的序列。适于杂交的限定 条件在本领域中的常规技术的范围内（例如，参见Sambrook等人，1989,下文）。
[0030] 在本发明的【具体实施方式】中，进行源自大肠杆菌的0DC蛋白的结构分析，并且基于 结构信息，通过合理设计策略进行诱变。设计和制备用于拓宽底物进入活性位点的路径的 入口区（entrance region)的突变（V156、D160、I163、E165、Q691)和用于稳定化P--其是 结合至活性位点的辅助因子一一的突变(N153、D309)(实施例1和2)。详细地，当通过将路径 的入口区处的体积大的残基替换为小的残基一一丙氨酸一一的修饰，异亮氨酸一一作为距 N-末端163位的氨基酸--和谷氨酸--作为距N-末端165位的氨基酸--被替换为丙氨 酸时，发现0DC蛋白的活性明显地增加(实施例3)。同时，用于化P稳定的具有6种其它类型的 突变体--￥1564、01604、969心、化530、化536和030犯--的0DC蛋白与野生型相比显示非 常低的活性或极少的活性。因此，可W看出源自大肠杆菌的0DC蛋白（SEQ ID N0:1)的163位 的异亮氨酸和165位的谷氨酸是重要的残基，其起到增加蛋白质活性的作用。使用表1中给 出的引物和PCR通过位点定向诱变进行突变。
[0031] 进一步，在本发明的【具体实施方式】中，163位的异亮氨酸和165位的谷氨酸除了被 替换为丙氨酸之外，还可替换为其它小的残基一一丝氨酸、鄉氨酸或甘氨酸一一W优化相 应残基的修饰(实施例4和表4)。163和165位的各自氨基酸残基被替换为甘氨酸(G)、丝氨酸 (S)或鄉氨酸(V)。结果，当163位的氨基酸残基被替换为丝氨酸并且165位的氨基酸残基被 替换为鄉氨酸时，kcat/KM值与野生型相比分别增加4.4倍和6.9倍(表5)。基于该结果，自发 地改变两个残基，并且检验0DC活性。通过显示在单突变上的最高活性的I163S和E165V的组 合，活性增加至比野生型的活性高8倍。另一方面，通过将163和165位的氨基酸残基二者都 替换为鄉氨酸，活性增加至比野生型的活性高21.3倍(实施例4和表5)。
[0032] 总之，0DC酶突变体的增加的活性归因于kcat/KM值的增加--其由于kcat值的增 加，而不是Km值的减小。其意味着0DC酶的结构改变W增加成为产物--腐胺--的转化 率，而不是增加底物一一鸟氨酸一一对酶的结合亲和力。
[0033] 在本发明中，通过使用将鸟氨酸转化为腐胺的反应分析0DC酶的活性。详细地，当 0DC酶将一个分子的鸟氨酸转化为腐胺时，消耗一个分子的水，并且一个分子的二氧化碳和 一个Of离子与腐胺一起产生。因此，总抑增加。当使用酪红一一抑指示剂一一在55化m下测 量增加的抑时，吸光度与在反应期间的抑增加成比例地增加。此性质用于间接地测量腐胺 的产量。
[0034] 如本文使用的，术语"鸟氨酸"是指在鸟氨酸循环中发挥重要作用的碱性氨基酸， 并且具体而言，1^-鸟氨酸广泛地发现于植物、动物和微生物中。一般而言，鸟氨酸连同具有 鸟氨酸循环的生物体中的尿素循环发挥重要作用。进一步，鸟氨酸可W在生物体中与精氨 酸、谷氨酸和脯氨酸相互转换，并且其将氨基基团转移至α-酬酸和乙醒酸。鸟氨酸是通过鸟 氨酸脱簇酶生产胺(腐胺)的底物，并且由其合成多胺。在本发明中，鸟氨酸可W具体地是心 鸟氨酸，其可被用作鸟氨酸脱簇酶的底物。
[0035] 如本文使用的，术语"腐胺"是通过鸟氨酸的脱簇或精胺的水解产生的物质。腐胺 可W在腐败物(putrefaction)中发现，但也经常在生物体中的正常组分中发现。腐胺是多 胺，并且起构成核糖体和促进细胞生长或RNA合成的作用。工业上，腐胺是用于生产包括尼 龙-4、6在内的聚酷胺-4、6的重要原料，并且持续地需要对其大规模生产的研究。
[0036] 在另一方面，本发明提供编码本发明的修饰的ODC蛋白的多核巧酸。
[0037] 如本文使用的，术语"多核巧酸"包含DNA和RNA分子，并且作为多核巧酸的基本单 位的核巧酸包括天然核巧酸W及具有修饰的糖或碱基的类似物。
[0038] 在仍另一个方面，本发明提供包括编码本发明的修饰的0DC蛋白的多核巧酸的载 体。
[0039] 如本文使用的，术语"载体"是指用于克隆和/或将碱基转移至宿主细胞的任何运 载体。载体可W是复制子W考虑与其它DNA片段结合的片段的复制。"复制子"是指充当用于 DNA体内复制的自主复制单位--即通过自主调控可复制的--的任何遗传单位(例如，质 粒、隧菌体、粘粒、染色体和病毒）。术语"载体"可W包括病毒和非病毒运载体，用于在体外、 离体、或在体内将核巧酸引入宿主细胞，并且其还可W包括微球形dm (mini- sphericalDNA)。例如，载体可W是不具有细菌DNA序列的质粒。已经进行移除富含CpG区的 细菌DNA序列W减少转基因表达的沉默并促进质粒DNA载体的连续表达。术语"载体"也可W 包括转座子或人工染色体。
[0040] 在本发明中，载体是包括编码本发明的修饰的0DC蛋白的多核巧酸的载体，并且其 可W是但不具体限制于能够在真核或原核细胞中复制和/或表达多核巧酸的载体，所述真 核或原核细胞包括哺乳动物细胞(例如，人、猴、兔、大鼠、仓鼠、小鼠细胞等）、植物细胞、酵 母细胞、昆虫细胞或细菌细胞(例如，大肠杆菌等）。具体地，载体可W是如此载体:其可操作 地连接至适当的启动子W允许多核巧酸在宿主细胞中表达，并且包括至少一个选择标记。 更具体地，载体可W处于如此形式:其中多核巧酸被引入隧菌体、质粒、粘粒、微型染色体、 病毒或逆转录病毒载体。
[0041] 通常在本领域中使用的使用T7启动子的pET系统是众所周知的，并且可W使用本 领域中已知的多种表达系统，但不限于此。在本发明中，具体地，包括编码修饰的0DC蛋白的 多核巧酸的载体可W是祀T28a载体。
[0042] 在本发明的【具体实施方式】中，将编码位点定向修饰的0DC蛋白的多核巧酸通过PCR 插入pET28a载体。通过此方法，制备了修饰的ODC(speC)-表达载体--pET28a-speC_ I163A、pET28a-speC_I163G、pET28a-speC_I163S、pET28a-speC_I163V、pET28a-speC_ E165A、pET28a-speC_E165S、pET28a-speC_E165G、pET28a-speC_E165V、pET28a-speC_ I163A_E165A、pET28a-speC_I163S_E165V、pET28a-speC_I163A_E165V和pET28a-speC_ I163V_E165V，并且通过序列分析确认突变。
[0043] 在仍另一个方面，本发明提供转化有载体的转化体。
[0044] 在本发明中，转化体不具体限制，只要本申请的修饰的0DC通过引入载体能够表 达。转化体可W是细菌细胞比如转化的大肠杆菌、棒状杆菌、链霉菌、鼠伤寒沙口氏菌等;酵 母细胞;真菌细胞比如己斯德毕赤酵母(pichiapastoris)等；昆虫细胞比如果蛹属、夜蛾属 S巧细胞等;动物细胞比如CH0(中国仓鼠卵巢细胞）、SP2/0(小鼠骨髓瘤细胞）、人类淋己母 细胞、C0S、NS0(小鼠骨髓瘤细胞）、293T、Bowes黑素瘤细胞、HT-1080、B服（幼仓鼠 （baby hamster)肾细胞）、肥K(人胚胎肾细胞)或PERC.6(人胚胎视网膜细胞）；或植物细胞。
[0045] 在仍另一个方面，本发明提供制备腐胺的方法，该方法包括使心鸟氨酸、包含心鸟 氨酸的混合物或心鸟氨酸发酵液与修饰的0DC蛋白反应的步骤。
[0046] k鸟氨酸、修饰的0DC蛋白和腐胺与上面描述的相同。
[0047]在本发明中，与修饰的ODC蛋白反应用于制备腐胺的物质可^是心鸟氨酸、包含k 鸟氨酸的混合物或k鸟氨酸发酵液。包含k鸟氨酸的混合物是指分离地存在的心鸟氨酸和 其它组分的混合物，并且k鸟氨酸发酵液是指在其中产生心鸟氨酸或心鸟氨酸的量在发酵 期间增加的发酵液，并且因此，包括对于反应足够的心鸟氨酸，但不限于此。
[004引例如，通过发酵生产心鸟氨酸的方法和产生的发酵液公开在美国专利号3668072 中，其通过引用并入本文(大肠杆菌，ATCC 21104)。
[0049] 在本发明中，修饰的0DC蛋白可W是纯化的修饰的0DC蛋白或包含修饰的0DC蛋白 的微生物发酵液。具体地，在微生物发酵液的制备中使用的微生物可W是表达本发明的修 饰的0DC蛋白的微生物，并且更具体地，其可W是转化有包括编码本发明的修饰的0DC蛋白 的多核巧酸的载体的转化体微生物。
[0050] 在仍另一个方面，本发明提供具有改进的腐胺生产力的微生物，其通过改变成为 具有腐胺生产力的棒状杆菌属某种微生物中的修饰的0DC蛋白来制备。
[0051] 如本文使用的，术语"微生物"包括所有野生型微生物和天然地或人工地基因修饰 的微生物，并且其可W是由于外源基因的插入或内源基因的活性的增强或衰减而具有特定 的衰减或增强机制的微生物。
[0052] 如本文使用的，术语"具有腐胺生产力的棒状杆菌属某种微生物"是指天然地或通 过修饰具有腐胺生产力的棒状杆菌属某种微生物。已经知道腐胺包括在棒状杆菌属某种微 生物的培养物中。然而，其腐胺生产力过低，并且参与生产的基因或机制还没有被掲示。因 此，本发明中的"具有腐胺生产力的棒状杆菌属某种微生物"是指天然菌株自身或棒状杆菌 属某种微生物，其中参与腐胺生产机制的外源基因被插入或内源基因的活性被增强或减 弱，W便具有改进的腐胺生产力。
[0053] 如本文使用的，术语"棒状杆菌属某种微生物"可W具体地是谷氨酸棒状杆菌、产 氨棒状杆菌、发酵乳短杆菌、黄色短杆菌、热产氨棒状杆菌（Corynebacterium thermoaminogenes)、有效棒状杆菌（Corynebacterium eff iciens)等，但不限于此。更具体 地，本发明中的棒状杆菌属某种微生物可W是甚至当暴露于高浓度的腐胺时其细胞生长和 生存几乎不受影响的谷氨酸棒状杆菌。例如，棒状杆菌属某种微生物可W是谷氨酸棒状杆 菌KCCM11240P化CCM11138PΔNCgll469)菌株，其被修饰W与其内源活性相比具有减弱的 NCgll469活性，从而具有改进的腐胺生产力，但不限于此。KCCM11240P菌株是为了阻断来自 腐胺的N-乙酷腐胺的生物合成途径，通过缺失编码NCgll469的基因而制备的腐胺过表达菌 株，并且公开在国际专利公布号W02013/105827中。
[0054] 在本发明的【具体实施方式】中，基于通过与其内源活性相比减弱NCgll469活性而具 有改进的腐胺生产力的棒状杆菌属某种微生物化CCM11240P化CCM11138PANCgll469))，通 过在染色体中将野生型spec改变为具有增加的腐胺转化活性的0DC I163S/E165V(speC)突 变体来制备修饰的菌株(实施例6)。该修饰的菌株命名为谷氨酸棒状杆菌CC01-0578,并且 在2013年6月10日依照布达佩斯条约在韩国微生物保藏中屯、（KCCM)保藏，登录号为 KCCM11425P。
[0055] 在仍另一个方面，本发明提供生产腐胺的方法，方法包括W下步骤:培养通过改变 成为根据本发明的修饰的0DC蛋白而具有改进的产腐胺活性的棒状杆菌属某种微生物;和 从上面的步骤中获得的培养物回收腐胺。
[0056] 棒状杆菌属某种微生物可W具体地是谷氨酸棒状杆菌，并且更具体地是谷氨酸棒 状杆菌CC01-0578(登录号:KCCM11425P)菌株。
[0057] 如本文使用的，术语"培养"是指在人工控制环境条件下培养微生物。在本发明中， 可W使用本领域中众所周知的方法进行使用棒状杆菌属某种微生物生产腐胺的方法。具体 地，培养方法的实例包括分批方法和连续方式的补料分批或重复补料分批方法，但不限于 此。
[0058] 培养中使用的培养基必须适当地满足具体菌株的需要。公开了用于棒状杆菌属某 种微生物的培养基（例如，Manual of Methods for General Bacteriology.American Society for Bacteriology.Washington D.C.,USA,1981)。作为培养基中的碳源，可W使 用糖和碳水化合物，比如葡萄糖、薦糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素；油脂(oils and fats)比如大豆油、葵花巧油、藍麻油和挪子油；脂肪酸比如栋桐酸、硬脂酸和亚油酸;醇比 如丙Ξ醇和乙醇;和有机酸比如醋酸等。运些物质可W单独地使用或作为混合物使用。作为 氮源，可W使用蛋白腺、酵母提取物、牛肉膏、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉和尿素、或无机化 合物比如硫酸锭、氯化锭、憐酸锭、碳酸锭和硝酸锭，并且运些物质可W单独地使用或作为 混合物使用。作为憐源，可W使用憐酸二氨钟或憐酸氨二钟或相应的含钢盐。此外，培养基 可W包括金属盐比如硫酸儀或硫酸铁，其对生长是必需的，并且最后，除上面提及的物质之 夕h还可W使用必需的促生长物质比如氨基酸和维生素。合适的前体可W添加至培养基。上 面的物质可分批或连续方式充分地补料入培养物。
[0059] 可W通过适当的碱性化合物比如氨氧化钢、氨氧化钟或氨，或者酸性化合物比如 憐酸或硫酸调节培养物的抑。可W通过防泡剂比如脂肪酸聚乙二醇醋调节泡沫形成。可W 通过引入氧气或含氧气体混合物(例如，空气)维持培养物的需氧条件。培养溫度可W通常 是20°C至45°C，具体地是25°C至40°C。可W持续培养直到腐胺的生产达到期望的最大，并且 经常可W在10小时至160小时内到达。腐胺可W释放入培养基，或包含在细胞中。
[0060] 本发明的生产腐胺的方法包括从细胞或培养物回收腐胺的步骤。可W使用适当的 本领域中已知的方法一一例如，离屯、、过滤、阴离子交换层析、结晶和HPLC，但不限于此一一 进行从细胞或培养物回收腐胺的方法。
[0061] 发明的实施例
[0062] 下文中，将参照实施例更详细地描述本发明。然而，运些实施例仅用于说明性目 的，并且本发明不意欲被运些实施例限制。
[00创实施例1.0DC(鸟氨酸脱簇酶)的结构分析和其突变体的设计
[0064] 一般而言，大肠杆菌已知具有两种类型的0DC。一种是诱导型ODC(speF)，其表达在 酸性抑下被诱导，另一种是组成型ODC(speC)，其参与二胺比如腐胺的生产(Applebaum DM 等，Biochemishy, 16:1590-1581,1977)。运些之中，spec--其是参与腐胺生产的组成型 0DC--被选择作为勒1基因。
[0065] 至今，已经掲示了弧菌属和乳酸杆菌属细菌的0DC结构。运些之中，预测大肠杆菌 ODC(speC)具有与乳酸杆菌属30a 0DC相似的结构。因此，基于乳酸杆菌属0DC的3D结构，使 用GeneDoc程序进行大肠杆菌ODC(speC)的氨基酸序列的比对(Momany C等，J Mol Biol,4: 849-854,1995)。作为比较氨基酸序列的结果，大肠杆菌spec和乳酸杆菌属30a ODC之间的 序列同一性是53%，并且其间的序列相似性是65%，其指示两种酶彼此非常相似。因此，基 于由RCSB Protein Data Bank提供的乳酸杆菌属30a ODC(PDB号：10畑）的结构，进行大肠 杆菌spec结构的同源性建模。结果，蛋白质的整体骨架几乎彼此相同，并且参与同PLP(憐酸 化唉醒)结合的活性位点的氨基酸序列也几乎彼此相同。
[0066] 分析两种酶的结构的结果显示0DC作为二聚体存在于细胞中，其活性位点在二聚 体界面处形成，并且底物进入活性位点的路径的入口区很窄。因此，为了加宽使底物有效地 进入活性位点的入口区并迅速地转化产物，设计了将入口区处的体积大的残基替换为小的 残基的修饰(V156、D160、I163、E165、Q691)。
[0067] 额外地，为了稳定结合至活性位点的辅助因子化P，还设计了使围绕活性位点的残 基的突变(N153、D309)。
[00側实施例2.大肠杆菌ODC(speC)基因的克隆和表达
[0069] 为了表达大肠杆菌spec基因，使用了通常在酶表达中使用的pET28a(Novagen)载 体系统。首先，使用野生型大肠杆菌W3110的染色体作为模板和W下表1中给出的引物，通过 PCR扩增spec基因。使用限制酶Ndel和化〇1处理通过PCR扩增获得的基因片段和载体祀T28a (37°C，3小时），并且然后通过一般连接方法将spec基因片段插入祀T28a载体。
[0070] [表1]
[0071]
[0072] 通过测序分析确认如此制备的spec表达载体(pET28a-speC)的突变。
[0073] 实施例1中的祀残基分别被替换为小的残基丙氨酸。为了稳定PLP，根据与化P结合 的位置，围绕活性位点的残基被不同地修饰。
[0074] 使用制备的祀T28a-speC载体作为模板和表及W下表2中给出的引物进行PCR。 首先，为了突变spec基因，对于相对于待突变的区的正向（5'）和反向（3'）区，进行初级PCR， 并且然后进行连接两个PCR片段的次级PCR。例如，在spec V156A的情况下，使用speC_起始 (NdeI)_5(SEQ ID N0:2)和speC_V156A_3(沈Q ID N0:5)作为引物通过PCR扩增正向区，并 且使用speC_V156A_5(SEQ ID N0:4)和speCj冬止(XhoI)_3(SEQ ID N0:3)作为引物通过 PCR扩增反向区。使用通过初级PCR获得的两种PCR片段作为模板，和speC_起始(Ndel)_5 (SEQ ID N0:2)与speCj冬止(XhoI)_3(SEQ ID N0:3)作为引物，进行 次级PCR。最后获得的 spec V156A基因 W与在spec基因片段中相同的方式插入祀T28a载体。使用表2中给出的引 物W与上面相同的方式将其它突变片段也通过PCR分别引入祀T28a载体。
[00巧]通过测序分析确认如此制备的spec突变体表达载体的突变(pET28a-speC_V156A、 pET28a-speC_D160A、pET28a-speC_I163A、pET28a-speC_E165A、pET28a-speC_Q691A、 祀T28a-speC_Nl53D、祀T28a-speC_Nl53E、祀T28a-speC_D30犯）。
[0076] [表 2]
[0077]
[0079] 实施例3.0DC(speC)突变体酶的活性的测量
[0080] 3-1.0DC突变体酶的制备
[0081 ]将在实施例2中制备的每个祀T28a-speC突变体载体转化入具有DE3基因型的大肠 杆菌W制备表达0DC酶的菌株。
[0082] 参照祀T系统手册(Novagen)进行祀T28a-speC突变体载体的表达。详细地，从LB平 板培养基选择各自菌株的单一菌落并接种入3mL的LB液体培养基(+卡那霉素 50yg/mL)，接 着在37°C和20化pm下溫育16小时。培养物再接种入15mL的新鲜LB培养基(+卡那霉素 50yg/ mU，并且在相同条件下溫育直到OD600达到大约0.6。然后，立刻W〇.5mM的终浓度添加 IPTG， 并且在18°C和18化pm下溫育20小时W诱导酶表达。
[0083] 在诱导酶表达后，将获得的细胞超声处理并离屯、。得到的上清液用于初级活性测 试。额外地，为了表征酶，酶被纯化，并且然后经历次级活性测试。使用连接至祀T载体中的 酶的His-标签通过Ni-NTA柱分离酶。在纯化中，使用畑elating Excel lose自旋试剂盒 (Bioprogen)。如此获得的0DC(野生型和突变体spec)酶通过8%SDS PAGEW可溶形式表达， 并且因而从上清液回收。
[0084] 3-2.0DC(speC)突变体酶的活性的测量
[0085] 为了使用鸟氨酸作为底物通过0DC评估腐胺转化活性，测量在实施例3-1中获得的 0DC(野生型和突变体spec)酶的活性。参照先前报道的标准（Vienozinskiene J等，Anal Biochem，146:180-183，1985)进行检验腐胺转化活性的ODC活性测试。
[0086] 也就是说，当0DC酶将一个分子的鸟氨酸转化为腐胺时，消耗一个分子的水，并且 一个分子的二氧化碳和一个Of离子与腐胺一起产生。因此，总抑增加(反应方案1)。当使用 酪红一一pH指示剂一一在559皿下测量增加的抑时，吸光度改变。吸光度与抑增加成比例地 增加。通过使用该性质间接地测量腐胺的量。
[0087] [反应方案1]
[008引 k鸟氨酸+出0->腐胺+C02+0H-
[0089] 对于0DC酶的初级活性测试，定量纯化前上清液中总蛋白质的量，并且相等地调节 上清液的浓度。使用30yg的酶上清液、lOmM鸟氨酸和1.25yMPLP制备反应溶液，并且然后使 用40μΜ酪红监测抑变化。
[0090] 作为活性测量的结果，0DC突变体酶的Ι163Α和Ε165Α的活性比野生型的活性显示 更高的腐胺生产率。其余6种类型的0DC突变体--￥1564、01604、96914、^530、^536和 D309E--的活性显示559nm下吸光度的极小变化(参见图1)。
[0091] 为了表征两种0DC突变体酶--I163A和E165A，其在初次筛选中选择，它们利用 化S-标签纯化并进行量化，并且然后测量根据鸟氨酸浓度的腐胺转化率。0DC酶在lOyg的浓 度下使用，并且鸟氨酸在〇.15mM至lOmM的浓度下使用。在此范围中，使用酪红测量pH变化。
[0092] [表 3]
[0093]
[0094] 运些结果显示通过0DC结构分析设计的修饰的0DC酶--I163A和E165A--与野 生型相比分别显示53%和27%的Km值减小，运指示它们对底物鸟氨酸的结合亲和力增加。 进一步，修饰的0DC I163A和E165A的活性与WT相比分别显示12.5%和50%的1?3曰*值增加， 运指示将鸟氨酸转化为腐胺的能力也增加。最后，计算显示酶活性的特性的kcat/KM值。 I163A和E165A与WT相比分别显示2.4和2倍的1?3曰1/1(|?值增加(表3)。
[00巧]实施例4.0DC( spec)突变的优化
[0096] 如在实施例3中确认的，进行了为0DC活性中重要残基的163位的氨基酸（异亮氨 酸)和165位的氨基酸(谷氨酸)处的多种小氨基酸残基的突变。W与实施例1中相同的方式 进行突变，并且其中使用的引物在W下表4中给出。另外地，分别在163和165位中进行单突 变，并且然后通过在每个位置引入显示增加的0DC活性的突变组合来制备双突变体，接着进 行评估。
[0097] [表 4]
[009引
[0099] 根据实施例2和3的方法纯化通过使用表4的引物制备的ODC突变体，并且测量腐胺 转化率。测量制备的0DC突变体的腐胺转化率的结果在W下表5中给出。
[0100] [表引
[0101]
[0103] 如表5中所示，当氨基酸残基163和165被分别引入甘氨酸(G)、丝氨酸(S)和鄉氨酸 (V)的单突变时，残基163替换为丝氨酸和残基165替换为鄉氨酸与野生型相比分别显示4.4 和6.9倍的kcat/KM值增加。基于此结果，将双突变引入两个残基，并且检验它们的活性。令 人吃惊地，不是I163S和E165V组合的双突变--每个单突变显示最高的活性，而是163和 165残基二者都替换为鄉氨酸的双突变与野生型相比显示21.3倍的活性增加。
[0104] 总之，0DC酶突变体的增加的活性归因于kcat/KM值的增加--其由于kcat值的增 加而不是Km值的减小，运意味着0DC酶被突变W具有增加成为产物腐胺的转化率的结构，而 不是增加底物鸟氨酸对酶的结合亲和力的结构。
[ο…引实施例5.使用鸟氨酸作为底物制备ODC突变体酶表达菌株并测量腐胺转化
[0106] 评估其中突变在实施例4中被优化的0DC突变体酶是否实际地影响微生物中鸟氨 酸至腐胺的转化。
[0107] 详细地，使用通过在具有DE3基因型的大肠杆菌中引入制备的祀T28a-speC突变体 载体而制备的菌株进行实验。从LB平板培养基选择各自菌株的单一菌落并接种入3mL的LB 液体培养基（+卡那霉素50yg/mL)，接着在37°C和2(K)rpm下溫育16小时。培养物再接种入 25mL的新鲜LB培养基(+卡那霉素50yg/mL和0.2%葡萄糖），并且溫育直到ODsgg达到0.5至 0.6。然后，添加0.5mM IPTGW诱导ODC(speC)表达，并且在18°C和200巧m下溫育20小时。然 后，进行离屯、W丢弃上清液并收集细胞。将W沉淀物形式获得的细胞重悬在1XM9基本培养 基（3.37mM 化抽P〇4、2.2mM KH2P〇4、0.86mM 化Cl、0.94mM 畑此1)中W调节OD600值至20。另外 地，添加 lOmM鸟氨酸作为底物且〇.5μΜ PLP作为辅助因子至10血的最终体积。使得反应在25 °〇和20化pm伴随震荡的条件下，并且随时间进行取样。通过使用TNBS量化腐胺的方法测量 转化的腐胺的浓度(Ngo TT等，Anal Biochem, 160:290-293,1987)。
[0108] 在TNBS方法中，将通过离屯、取样的培养物获得的上清液稀释50倍，并且用于进行 分析。将ImL的4N化0H添加至0.5mL的稀释样品，并且然后进一步添力日2mL的1-戊醇并均匀 混合。在2000巧m下进行离屯、5分钟，并且然后添加 ImL的上清液至包含ImL的0.1M NasB地7 (pH 8.0)的新管，并且它们被混合均匀。进一步添加 ImL的lOmM TNBS并均匀混合，并且将 2mL的DMS0添加至其并混合。然后，进行离屯、，并且在426nm下测量得到的上清液的吸光度。
[0109] [表 6]
[0110]
[0111] 测量野生型和3种类型的0DC突变体的腐胺转化。结果，与野生型相比，0DC突变体 显示在2小时收集的样品中增加大约32%至39%的鸟氨酸至腐胺的转化率。在0DC突变之间 的转化率中存在极小差异，并且它们在活性中没有显示差异，其中纯化的0DC突变体在体外 实验中显示出大的差异。然而，野生型甚至在4小时后显示不完全反应，而突变体在4小时内 显示几乎完全反应。结果，0DC突变体的增加的活性还在酶转化菌株中在体内被确认。
[0112] 实施例6.制备具有0DC突变体的产腐胺菌株并测量腐胺生产力
[0113] 为了检验当将具有增加的腐胺转化活性的0DC突变体实际地引入产腐胺菌株时， 腐胺生产力是否受影响，测量腐胺生产力。
[0114] 6-1.制备具有0DC突变体的产腐胺菌株
[0115] 基于棒状杆菌属某种微生物化CCM11240P)，其与NCgll469内源活性相比通过减弱 NCgl 1469活性而具有改进的腐胺 生产力，通过在染色体中将野生型spec改变成为具有增加 的腐胺转化活性的ODC(speC)来制备突变体菌株。
[0116] 具有改进的腐胺生产力的谷氨酸棒状杆菌化CCM11240P)菌株是在国际专利公布 号W02013/105827中公开的菌株，并且其使用具有腐胺生产力的棒状杆菌属某种微生物 化CCM11138P)作为母菌株(mother S化ain)制备，公开在国际专利公布号W02012/077995 中。更详细地，通过W下过程制备菌株:基于ATCC13032菌株的NCgl 1469基因的碱基序列，将 NCgll469的N-末端区域和C-末端区域克隆入pDZ载体，通过电穿孔将该载体引入具有腐胺 生产力的棒状杆菌属某种微生物化CCM11138P)，并且之后在包含卡那霉素（2扣g/mL)的培 养基上铺板菌株，然后选择。通过在包含X-gal(5-漠-4-氯-3-吗I噪基-β-D-半乳糖巧）的培 养基上选择蓝色菌落来确认载体的成功的染色体插入。在营养培养基中培养初次 (prima巧)染色体插入的菌株，接着在包含X-gal并且不包含抗生素的培养基上涂布稀释的 菌株，并且选择W相对低的比率出现的白色菌落。最后，通过交换选择NCgll469基因缺失的 菌株。如此制备的最终KCCM11138PANCgll469菌株是与母菌株KCCM11138P相比具有改进的 腐胺生产力的腐胺过表达菌株，KCCM11138PANCgl 1469菌株具有编码NCgl 1469的基因的缺 失，所述NCgll469是参与在细胞中将腐胺分解为N-乙酷腐胺的途径的蛋白质。
[0117] 详细地，使用W下表7中给出的speC_起始(BamHI )_5和speCj冬止(Xbal )_3引物， 扩增在实施例巧日4中制备的ODC(speC)突变体的DNA片段。具体地，使用制备的祀T28a-speC 突变体(I163S、I163V、I163S E165V)载体作为模板和W下表7中给出的两条引物speC_起始 (BamHI)_5 和 speCj冬止(甜 al)_3 进行 PCR。
[011 引[表7]
[0119]
[0120] 使用限制酶BamHI和Xbal处理通过PCR获得的基因片段和载体pDZ(37°C，3小时）， 并且然后将spec突变体的基因片段通过一般连接方法分别插入pDZ载体。通过测序分析确 认如此制备的用于染色体插入的重组载体(pDZ-speC_I163S、pDZ-speC_I163V、pDZ-speC_ I163S E165V)。
[0121] 为了获得其中spec突变体被插入染色体的菌株，将制备的pDZ-speC_I163S、pDZ- speC_I163V和pDZ-speC_I163S E165V重组载体中的每个通过电穿孔转化入KCCM11240P菌 株，并且然后涂布在BHIS平板培养基(每1L中37g/L的脑屯、浸液、91g/L的山梨醇和2%琼脂+ 25yg/mL的卡那霉素)上。
[0122] 通过检验在包含X-gal(5-漠-4-氯-3-吗I噪基-β-D-半乳糖巧）的固体培养基上蓝 色菌落的出现来测定载体的成功的染色体插入。将初次染色体插入的菌株在营养培养基中 伴随震荡培养(30°C，8小时），接着连续稀释并涂布在包含X-gal的固体培养基上。大多数菌 落是蓝色的，而白色菌落W相对低的比率出现。从选择的菌落中，最终获得通过二次交换在 染色体中具有spec突变体的菌株。通过突变体的测序分析最终鉴定运些菌株。鉴定的菌株 被命名为KCCM11240P: :speC_I163S、KCCM11240P: :speC_I163V和KCCM11240P: :speC_I163S E165V。在运些中，KCCMl 1240P: : speC_1163S E165V被命名为谷氨酸棒状杆菌CCOl-0578，并 且在2013年6月10日依照布达佩斯条约在韩国微生物保藏中屯、（KCCM)保藏，登录号为 KCCM11425P。
[0。引 6-2.测量具有ODC突变体的产腐胺菌株的腐胺生产力
[0124] 为了检验ODC(speC)突变体对产腐胺菌株的腐胺生产力的作用，评估在实施例6-1 中制备的菌株的腐胺生产力。
[0125] 详细地，制备的菌株在30°C下在包含ImM精氨酸的CM平板培养基(每1L中1%葡萄 糖、1 %聚腺、0.5%酵母提取物、0.5%牛肉膏、0.25%化C1、0.2%尿素、100化的50%化0H、 2%琼脂，pH 6.8)中培养16小时，并且然后将一接种环（loop)的细胞培养物接种在25mL的 W下表8的效价培养基中，并且在30°C、200rpm下震荡培养24小时。在发酵期间在培养基中 添加 ImM精氨酸，培养全部制备的菌株。
[0126] [表 8]
[0127]
[0128] ~如表9中所示，引入具有改进的活性的ODC(speC)突变体的每种菌株显示在24小时' 37%至105%的腐胺生产的增加。
[0129] 运些结果显示具有0DC突变体的产腐胺菌株与已知的菌株相比能够相对于糖消耗 产生高浓度的腐胺。
[0130] [表 9]
[0131]
[0132]
[0133] 基于上面的描述，本领域技术人员将理解可WW不同的具体形式实施本发明，而 不改变其技术精神或基本特性。因此，应当理解上面的实施方式在全部方面不是限制性的， 而是说明性的。本发明的范围由所附的权利要求限定，而不是由之前的描述所限定，并且因 此落入权利要求的边界和界限或运样的边界和界限的等价物内的全部变化和修改，因此意 欲被权利要求所涵盖。
[0134] 国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约
[0135] 国际表格
[0136] 原始保藏接收证明
[0137] 由该页下部确定的国际保藏机构根据第7.1条发出 [013引至:CJ第一制糖株式会社
[0139] CJ第一制糖中屯、，
[0140] 330，D0NGW-R0，
[0141] JUNG-GU，首尔 100-400
[0142] 大韩民国
[0143]
[0144] 1如果第6.4(d)条适用，该日期是获得国际保藏机构资格的日期;如果在获得国际 保藏机构资格的日期之后在布达佩斯条约之外的保藏被转化成在布达佩斯条约之下的保 藏，该日期是由该国际保藏机构收到该微生物的日期。
[0145] BP/4 表单页
【主权项】
1. 修饰的鸟氨酸脱羧酶(ODC)蛋白，其在一个或多个氨基酸残基处具有突变，所述一个 或多个氨基酸残基选自距0DC的N-末端163位的异亮氨酸和165位的谷氨酸，所述0DC具有由 SEQ ID NO: 1表示的氨基酸序列。2. 根据权利要求1所述的修饰的0DC蛋白，其中所述165位的谷氨酸被替换为丙氨酸、甘 氨酸、丝氨酸或缬氨酸。3. 根据权利要求1所述的修饰的0DC蛋白，其中所述163位的异亮氨酸被替换为丙氨酸、 甘氨酸、丝氨酸或缬氨酸。4. 根据权利要求1所述的修饰的0DC蛋白，其中所述163位的异亮氨酸和所述165位的谷 氨酸分别被替换为丙氨酸-丙氨酸、丙氨酸-缬氨酸、丝氨酸-缬氨酸或缬氨酸-缬氨酸。5. 根据权利要求1所述的修饰的0DC蛋白，其具有SEQ ID N0:34至57的任何氨基酸序 列。6. 编码权利要求1至5中任一项所述的修饰的0DC蛋白的多核苷酸。7. 包括编码权利要求1至5中任一项所述的修饰的0DC蛋白的多核苷酸的载体。8. 转化有权利要求7所述的载体的转化体。9. 制备腐胺的方法，所述方法包括使L-鸟氨酸、包含L-鸟氨酸的混合物或L-鸟氨酸发 酵液与权利要求1至5中任一项所述的修饰的0DC蛋白反应的步骤。10. 根据权利要求9所述的方法，其中所述修饰的0DC蛋白是纯化的修饰的0DC蛋白或包 含所述修饰的0DC蛋白的微生物发酵液。11. 重组微生物，其通过改变成为具有产腐胺活性的棒状杆菌属某种微生物中的权利 要求1至5中任一项所述的修饰的0DC蛋白而具有改进的产腐胺活性。12. 根据权利要求11所述的重组微生物，其中所述棒状杆菌属某种微生物是谷氨酸棒 状杆菌。13. 生产腐胺的方法，其包括以下步骤： (a) 培养棒状杆菌属某种微生物，其通过改变成为权利要求1至5中任一项所述的修饰 的0DC蛋白而具有改进的产腐胺活性;和 (b) 从在步骤(a)中获得的培养物回收腐胺。14. 根据权利要求13所述的方法，其中所述棒状杆菌属某种微生物是谷氨酸棒状杆菌。
【专利摘要】本发明涉及具有改进的腐胺生产力的新型突变体鸟氨酸脱羧酶蛋白和其用途。KCCM11425P20130610
【IPC分类】C12N15/60, C12P13/04, C12N9/88
【公开号】CN105555953
【申请号】CN201480050697
【发明人】崔香, 郑熙景, H·S·金, H·H·京, J·M·崔, J·J·李, H·D·苏
【申请人】Cj第一制糖株式会社, 韩国科学技术院
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2014年7月17日
【公告号】EP3023493A2, US20160168605, WO2015009074A2, WO2015009074A3
【技术领域】
[0001] 本公开内容设及新型修饰的鸟氨酸脱簇酶蛋白和其用途。
【背景技术】
[0002] 腐胺(或1,4-下二胺)是用于生产包括尼龙-4、6在内的聚酷胺-4、6的重要原料，并 且主要通过班巧腊的加氨W工业规模生产，所述班巧腊通过氯化氨的加成自丙締腊产生。 此化合物的化学合成需要不可再生的石油化学产品作为原料、和多步骤与多反应器设计中 相对高的溫度和压力、W及使用昂贵的催化剂体系。另外，因为运些原料是高毒性和易燃 的，所W已知的化学合成工艺是不利于环境的。因此，作为化学生产工艺的替代选择，需要 从源自可再生的生物质的碳源生产腐胺的方法。近来，通过环境友好的微生物生产腐胺的 生化方法已经受到很多关注。腐胺是在从细菌到动物和植物范围的广谱的生物体中发现的 一种多胺。大肠杆菌中腐胺的浓度已知为极其高，多达大约2.8g/L。同样地，微生物具有对 高浓度多胺的潜在的良好抗性，并且因而它们能够在其高浓度的存在下生长和生存。例如， 已经报道谷氨酸棒状杆菌甚至可W在大于30g/L的尸胺的存在下生长。因此，已经持续地进 行研究W在可工业获得的高浓度多胺的生产中使用微生物。然而，对使用微生物生产多胺 的研究还不足够先进而可工业应用。因此，需要开发出能够W高产量生产多胺的菌株(Qian ZG等，Biotechnol Bioeng,104:651-662,2009;Schneide;r J等，Appl Microbiol Biotechnol,88:859-868,2010)。
[0003] 同时，鸟氨酸脱簇酶(ODC)是在大多数微生物中发现的酶，其将鸟氨酸转化为腐 胺。大肠杆菌中的0DC通常形成同型二聚体，并且在二聚体界面(dimerinterface)处形成活 性位点。0DC的反应机制需要憐酸化唉醒(PLP)作为辅助因子，并且PLP在酶的活性位点的赖 氨酸残基处形成希夫碱，其随后被经历脱簇的底物鸟氨酸替换。当产生腐胺时，0DC再次与 PLP形成希夫碱。
[0004] 当0DC被引入产腐胺菌株一一棒状杆菌属一一时，其是由大肠杆菌spec基因编码 的蛋白质，并且其活性被报道为非常低。因此，为了开发W高产量生产腐胺的菌株，0DC-一 其是参与腐胺生物合成途径的最后步骤的酶一一的改进是非常重要的。至今，仅对0DC蛋白 的结构或反应机制进行了突变研究，并且还没有关于其活性增加的报道。
【发明内容】
[0005] 技术问题
[0006] 本发明人已经做出了许多努力W改进0DC蛋白，其在腐胺的生产中发挥重要的作 用但显示低活性。结果，本发明人发现了新型突变位点，并且在该位点上引入了突变W制备 具有改进的产腐胺活性的修饰的0DC蛋白，并且他们发现当该修饰的0DC蛋白被引入产腐胺 微生物时，微生物能够W高产量生产腐胺，从而完成本申请。
[0007] 技术方案
[000引本发明的目标是提供新型修饰的鸟氨酸脱簇酶(0DC)蛋白。
[0009] 本发明的另一个目标是提供编码该修饰的ODC蛋白的多核巧酸、包括所述多核巧 酸的载体和转化有所述载体的转化体。
[0010] 本发明的仍另一个目标是提供制备腐胺的方法，所述方法包括W下步骤:使レ鸟 氨酸、包含k鸟氨酸的混合物或k鸟氨酸发酵液与该修饰的0DC蛋白反应。
[0011] 本发明的仍另一个目标是提供重组微生物，其通过改变为具有产腐胺活性的棒状 杆菌属某种微生物中的修饰的0DC蛋白而具有改进的产腐胺活性。
[0012] 本发明的仍另一个目标是提供生产腐胺的方法，所述方法包括W下步骤:培养通 过引入修饰的0DC蛋白而具有改进的产腐胺活性的棒状杆菌属某种微生物;和从在上面的 步骤中获得的培养物回收腐胺。
[OOU]有益效果
[0014] 根据本发明的修饰的鸟氨酸脱簇酶蛋白具有比天然形式高21倍的腐胺转化活性。 当修饰的鸟氨酸脱簇酶蛋白被引入产腐胺菌株时，腐胺生产力显著地增加。因此，其可W作 为已知的化学合成途径的替代选择，广泛地应用于腐胺的高效大批量生产。
【附图说明】
[0015] 图1显示了源自天然的大肠杆菌的0DC蛋白和具有I163A或E165A突变的0DC蛋白之 间的腐胺转化活性的比较。详细地，当发生转化反应时，抑增加，并且当通过酪红检验pH增 加时，观察到吸光度的增加。发现具有I163A或E165A或全部两种突变的0DC蛋白与天然的 0DC蛋白相比显示卓越的腐胺转化活性。
[0016] 发明的最佳模式
[0017] 在实现上面目标的方面中，本发明提供新型修饰的0DC蛋白，该修饰的0DC蛋白在 一个或多个氨基酸残基处具有突变，所述氨基酸残基选自距鸟氨酸脱簇酶(0DC)的N-末端 163位的异亮氨酸氨基酸残基和165位的谷氨酸氨基酸残基，所述鸟氨酸脱簇酶(0DC)具有 由SEQ ID NO: 1表示的氨基酸序列。
[0018] 如本文使用的，术语"鸟氨酸脱簇酶(ODCr是指催化W下反应的酶，所述反应是从 鸟氨酸合成多胺的第一步和腐胺合成途径的最后一步。在使用心鸟氨酸作为底物生产腐胺 中，憐酸化唉醒(PLP)起辅助因子的作用。
[0019][反应方案]
[0020] k鸟氨酸 < =〉腐胺+C〇2
[0021] 在本发明中，鸟氨酸脱簇酶(0DC)可W具体地是源自大肠杆菌的0DC，并且更具体 地是具有由SEQ ID NO: 1表示的氨基酸序列的0DC，其源自大肠埃希杆菌。
[0022] 在本发明中，获得0DC(鸟氨酸脱簇酶）的方法可W通过应用本领域中已知的各种 方法进行。例如，可W通过基因合成技术一一其包括通常在酶表达中使用的用于在大肠杆 菌中W高产量获得酶的密码子优化、和基于微生物的基因组信息通过生物信息学筛选有用 的酶资源的方法一一获得0DC，但不限于此。
[0023] 如本文使用的，术语"修饰的0DC蛋白"是指其中0DC蛋白的氨基酸序列中的一个或 多个氨基酸被添加、缺失或置换的0DC蛋白。具体地，修饰的0DC蛋白是指其中通过0DC蛋白 的修饰其活性与野生型的活性相比高效地增加的蛋白质。在本发明中，可W非限制性地使 用本领域中已知的改进酶的任何一般方法进行修饰，并且方法由策略比如合理设计和定向 进化示例。例如，合理设计策略可w包括在特定位点处的氨基酸的突变(位点定向诱变），并 且定向进化策略可W包括随机诱变。进一步，天然修饰(一个或多个)可W在SEQ ID NO: 1的 163位和/或165位的氨基酸残基(一个或多个)处发生，而没有外部操纵。如本文使用的，术 语"修饰的0DC蛋白"、"0DC突变体"和"spec突变体"可W互换地使用。
[0024] 具体地，本发明的修饰的0DC蛋白可具有在距鸟氨酸脱簇酶(0DC)的N-末端163位 的异亮氨酸氨基酸残基和/或165位的谷氨酸氨基酸残基的修饰(一个或多个），所述鸟氨酸 脱簇酶(0DC)源自大肠埃希杆菌并具有由SEQ ID NO: 1表示的氨基酸序列。例如，165位的谷 氨酸可用丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸或鄉氨酸替换，或者163位的异亮氨酸可用丙氨酸、甘氨 酸、丝氨酸或鄉氨酸替换。进一步，修饰的0DC蛋白可具有163位的异亮氨酸和165位的谷氨 酸的双重修饰，其中163位的异亮氨酸和165位的谷氨酸可W分别用选自丙氨酸、鄉氨酸、丝 氨酸和甘氨酸的氨基酸替换。具体地，163位的异亮氨酸和165位的谷氨酸可W分别用丙氨 酸-丙氨酸、丙氨酸-鄉氨酸、丝氨酸-鄉氨酸或鄉氨酸-鄉氨酸替换。
[0025] 在本发明的实施方式中，当发现对野生型0DC的163和165位的氨基酸的突变的多 种组合导致增加腐胺生产力时，建议运些位置在制备具有改进的腐胺生产力的0DC突变体 中非常重要。具体而言，当在重要的突变位点处存在的氨基酸被替换为小的氨基酸残基(丙 氨酸、丝氨酸、鄉氨酸或甘氨酸)时，腐胺生产力增加。
[0026] 进一步，本发明的修饰的0DC蛋白可W由SEQ ID N0:34至SEQ ID N0:57中的任一 个氨基酸序列组成，和具体地，由沈Q ID NO: 34至SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO:45和沈Q ID N0:49和SEQ ID N0:57中的任一个氨基酸序列组成，其是修饰的ODC蛋白的氨基酸序列，其 中分别距N-末端163或165位的异亮氨酸或谷氨酸被替换为小的残基。修饰的0DC蛋白可W 包括具有与上面的序列50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%或更高 的同源性的任何多肤，只要其具有上面的修饰并且相对于野生型的腐胺转化活性具有卓越 的腐胺转化活性。
[0027] 如本文使用的，术语"同源性"是指两个多核巧酸或多肤部分之间的同一性的百分 比。可W通过本领域中已知的技术确定从一个部分至另一个的序列对应。例如，通过使用容 易获得并且能够比对序列信息的计算机程序，可W通过直接比对两个多核巧酸分子或两个 多肤分子的序列信息来测定同源性。此外，可W通过W下过程测定同源性:使多核巧酸在用 于形成稳定的双链的条件下在同源区中杂交，并且然后通过单链特异性核酸酶消化杂交的 链W测定消化片段的大小。
[0028] 如本文使用的，术语"同源的"是指蛋白质之间的相关性，其中全部语法形式和拼 写变化包括源自超家族的蛋白质和具有"共同进化起源 "的源自其它物种的同源蛋白质。运 样的蛋白质（和其编码基因）具有由高度的序列相似性反映的序列同源性。然而，在一般用 途和在本发明中，当由形容词比如"非常高"修饰术语"相同性"时，其是指序列相似性，而不 是共同进化起源。
[0029] 如本文使用的，术语"序列相似性"是指可W或不可W共享共同进化起源的蛋白质 的核巧酸序列或氨基酸序列之间的同一性或同源性的程度。在【具体实施方式】中，当对于固 定长度的氨基酸序列，两个氨基酸序列之间的多肤匹配是至少21 % (具体地至少大约50% 和最具体地大约75 %、90 %、95 %、96 %、97 %或99 % )时，那两个序列是"基本上同源的"或 "基本上相似的"。可W通过使用在数据库中使用的标准软件比较序列，或者例如通过在为 某一系统限定的严格条件下进行DM杂交实验，来鉴定基本上同源的序列。适于杂交的限定 条件在本领域中的常规技术的范围内（例如，参见Sambrook等人，1989,下文）。
[0030] 在本发明的【具体实施方式】中，进行源自大肠杆菌的0DC蛋白的结构分析，并且基于 结构信息，通过合理设计策略进行诱变。设计和制备用于拓宽底物进入活性位点的路径的 入口区（entrance region)的突变（V156、D160、I163、E165、Q691)和用于稳定化P--其是 结合至活性位点的辅助因子一一的突变(N153、D309)(实施例1和2)。详细地，当通过将路径 的入口区处的体积大的残基替换为小的残基一一丙氨酸一一的修饰，异亮氨酸一一作为距 N-末端163位的氨基酸--和谷氨酸--作为距N-末端165位的氨基酸--被替换为丙氨 酸时，发现0DC蛋白的活性明显地增加(实施例3)。同时，用于化P稳定的具有6种其它类型的 突变体--￥1564、01604、969心、化530、化536和030犯--的0DC蛋白与野生型相比显示非 常低的活性或极少的活性。因此，可W看出源自大肠杆菌的0DC蛋白（SEQ ID N0:1)的163位 的异亮氨酸和165位的谷氨酸是重要的残基，其起到增加蛋白质活性的作用。使用表1中给 出的引物和PCR通过位点定向诱变进行突变。
[0031] 进一步，在本发明的【具体实施方式】中，163位的异亮氨酸和165位的谷氨酸除了被 替换为丙氨酸之外，还可替换为其它小的残基一一丝氨酸、鄉氨酸或甘氨酸一一W优化相 应残基的修饰(实施例4和表4)。163和165位的各自氨基酸残基被替换为甘氨酸(G)、丝氨酸 (S)或鄉氨酸(V)。结果，当163位的氨基酸残基被替换为丝氨酸并且165位的氨基酸残基被 替换为鄉氨酸时，kcat/KM值与野生型相比分别增加4.4倍和6.9倍(表5)。基于该结果，自发 地改变两个残基，并且检验0DC活性。通过显示在单突变上的最高活性的I163S和E165V的组 合，活性增加至比野生型的活性高8倍。另一方面，通过将163和165位的氨基酸残基二者都 替换为鄉氨酸，活性增加至比野生型的活性高21.3倍(实施例4和表5)。
[0032] 总之，0DC酶突变体的增加的活性归因于kcat/KM值的增加--其由于kcat值的增 加，而不是Km值的减小。其意味着0DC酶的结构改变W增加成为产物--腐胺--的转化 率，而不是增加底物一一鸟氨酸一一对酶的结合亲和力。
[0033] 在本发明中，通过使用将鸟氨酸转化为腐胺的反应分析0DC酶的活性。详细地，当 0DC酶将一个分子的鸟氨酸转化为腐胺时，消耗一个分子的水，并且一个分子的二氧化碳和 一个Of离子与腐胺一起产生。因此，总抑增加。当使用酪红一一抑指示剂一一在55化m下测 量增加的抑时，吸光度与在反应期间的抑增加成比例地增加。此性质用于间接地测量腐胺 的产量。
[0034] 如本文使用的，术语"鸟氨酸"是指在鸟氨酸循环中发挥重要作用的碱性氨基酸， 并且具体而言，1^-鸟氨酸广泛地发现于植物、动物和微生物中。一般而言，鸟氨酸连同具有 鸟氨酸循环的生物体中的尿素循环发挥重要作用。进一步，鸟氨酸可W在生物体中与精氨 酸、谷氨酸和脯氨酸相互转换，并且其将氨基基团转移至α-酬酸和乙醒酸。鸟氨酸是通过鸟 氨酸脱簇酶生产胺(腐胺)的底物，并且由其合成多胺。在本发明中，鸟氨酸可W具体地是心 鸟氨酸，其可被用作鸟氨酸脱簇酶的底物。
[0035] 如本文使用的，术语"腐胺"是通过鸟氨酸的脱簇或精胺的水解产生的物质。腐胺 可W在腐败物(putrefaction)中发现，但也经常在生物体中的正常组分中发现。腐胺是多 胺，并且起构成核糖体和促进细胞生长或RNA合成的作用。工业上，腐胺是用于生产包括尼 龙-4、6在内的聚酷胺-4、6的重要原料，并且持续地需要对其大规模生产的研究。
[0036] 在另一方面，本发明提供编码本发明的修饰的ODC蛋白的多核巧酸。
[0037] 如本文使用的，术语"多核巧酸"包含DNA和RNA分子，并且作为多核巧酸的基本单 位的核巧酸包括天然核巧酸W及具有修饰的糖或碱基的类似物。
[0038] 在仍另一个方面，本发明提供包括编码本发明的修饰的0DC蛋白的多核巧酸的载 体。
[0039] 如本文使用的，术语"载体"是指用于克隆和/或将碱基转移至宿主细胞的任何运 载体。载体可W是复制子W考虑与其它DNA片段结合的片段的复制。"复制子"是指充当用于 DNA体内复制的自主复制单位--即通过自主调控可复制的--的任何遗传单位(例如，质 粒、隧菌体、粘粒、染色体和病毒）。术语"载体"可W包括病毒和非病毒运载体，用于在体外、 离体、或在体内将核巧酸引入宿主细胞，并且其还可W包括微球形dm (mini- sphericalDNA)。例如，载体可W是不具有细菌DNA序列的质粒。已经进行移除富含CpG区的 细菌DNA序列W减少转基因表达的沉默并促进质粒DNA载体的连续表达。术语"载体"也可W 包括转座子或人工染色体。
[0040] 在本发明中，载体是包括编码本发明的修饰的0DC蛋白的多核巧酸的载体，并且其 可W是但不具体限制于能够在真核或原核细胞中复制和/或表达多核巧酸的载体，所述真 核或原核细胞包括哺乳动物细胞(例如，人、猴、兔、大鼠、仓鼠、小鼠细胞等）、植物细胞、酵 母细胞、昆虫细胞或细菌细胞(例如，大肠杆菌等）。具体地，载体可W是如此载体:其可操作 地连接至适当的启动子W允许多核巧酸在宿主细胞中表达，并且包括至少一个选择标记。 更具体地，载体可W处于如此形式:其中多核巧酸被引入隧菌体、质粒、粘粒、微型染色体、 病毒或逆转录病毒载体。
[0041] 通常在本领域中使用的使用T7启动子的pET系统是众所周知的，并且可W使用本 领域中已知的多种表达系统，但不限于此。在本发明中，具体地，包括编码修饰的0DC蛋白的 多核巧酸的载体可W是祀T28a载体。
[0042] 在本发明的【具体实施方式】中，将编码位点定向修饰的0DC蛋白的多核巧酸通过PCR 插入pET28a载体。通过此方法，制备了修饰的ODC(speC)-表达载体--pET28a-speC_ I163A、pET28a-speC_I163G、pET28a-speC_I163S、pET28a-speC_I163V、pET28a-speC_ E165A、pET28a-speC_E165S、pET28a-speC_E165G、pET28a-speC_E165V、pET28a-speC_ I163A_E165A、pET28a-speC_I163S_E165V、pET28a-speC_I163A_E165V和pET28a-speC_ I163V_E165V，并且通过序列分析确认突变。
[0043] 在仍另一个方面，本发明提供转化有载体的转化体。
[0044] 在本发明中，转化体不具体限制，只要本申请的修饰的0DC通过引入载体能够表 达。转化体可W是细菌细胞比如转化的大肠杆菌、棒状杆菌、链霉菌、鼠伤寒沙口氏菌等;酵 母细胞;真菌细胞比如己斯德毕赤酵母(pichiapastoris)等；昆虫细胞比如果蛹属、夜蛾属 S巧细胞等;动物细胞比如CH0(中国仓鼠卵巢细胞）、SP2/0(小鼠骨髓瘤细胞）、人类淋己母 细胞、C0S、NS0(小鼠骨髓瘤细胞）、293T、Bowes黑素瘤细胞、HT-1080、B服（幼仓鼠 （baby hamster)肾细胞）、肥K(人胚胎肾细胞)或PERC.6(人胚胎视网膜细胞）；或植物细胞。
[0045] 在仍另一个方面，本发明提供制备腐胺的方法，该方法包括使心鸟氨酸、包含心鸟 氨酸的混合物或心鸟氨酸发酵液与修饰的0DC蛋白反应的步骤。
[0046] k鸟氨酸、修饰的0DC蛋白和腐胺与上面描述的相同。
[0047]在本发明中，与修饰的ODC蛋白反应用于制备腐胺的物质可^是心鸟氨酸、包含k 鸟氨酸的混合物或k鸟氨酸发酵液。包含k鸟氨酸的混合物是指分离地存在的心鸟氨酸和 其它组分的混合物，并且k鸟氨酸发酵液是指在其中产生心鸟氨酸或心鸟氨酸的量在发酵 期间增加的发酵液，并且因此，包括对于反应足够的心鸟氨酸，但不限于此。
[004引例如，通过发酵生产心鸟氨酸的方法和产生的发酵液公开在美国专利号3668072 中，其通过引用并入本文(大肠杆菌，ATCC 21104)。
[0049] 在本发明中，修饰的0DC蛋白可W是纯化的修饰的0DC蛋白或包含修饰的0DC蛋白 的微生物发酵液。具体地，在微生物发酵液的制备中使用的微生物可W是表达本发明的修 饰的0DC蛋白的微生物，并且更具体地，其可W是转化有包括编码本发明的修饰的0DC蛋白 的多核巧酸的载体的转化体微生物。
[0050] 在仍另一个方面，本发明提供具有改进的腐胺生产力的微生物，其通过改变成为 具有腐胺生产力的棒状杆菌属某种微生物中的修饰的0DC蛋白来制备。
[0051] 如本文使用的，术语"微生物"包括所有野生型微生物和天然地或人工地基因修饰 的微生物，并且其可W是由于外源基因的插入或内源基因的活性的增强或衰减而具有特定 的衰减或增强机制的微生物。
[0052] 如本文使用的，术语"具有腐胺生产力的棒状杆菌属某种微生物"是指天然地或通 过修饰具有腐胺生产力的棒状杆菌属某种微生物。已经知道腐胺包括在棒状杆菌属某种微 生物的培养物中。然而，其腐胺生产力过低，并且参与生产的基因或机制还没有被掲示。因 此，本发明中的"具有腐胺生产力的棒状杆菌属某种微生物"是指天然菌株自身或棒状杆菌 属某种微生物，其中参与腐胺生产机制的外源基因被插入或内源基因的活性被增强或减 弱，W便具有改进的腐胺生产力。
[0053] 如本文使用的，术语"棒状杆菌属某种微生物"可W具体地是谷氨酸棒状杆菌、产 氨棒状杆菌、发酵乳短杆菌、黄色短杆菌、热产氨棒状杆菌（Corynebacterium thermoaminogenes)、有效棒状杆菌（Corynebacterium eff iciens)等，但不限于此。更具体 地，本发明中的棒状杆菌属某种微生物可W是甚至当暴露于高浓度的腐胺时其细胞生长和 生存几乎不受影响的谷氨酸棒状杆菌。例如，棒状杆菌属某种微生物可W是谷氨酸棒状杆 菌KCCM11240P化CCM11138PΔNCgll469)菌株，其被修饰W与其内源活性相比具有减弱的 NCgll469活性，从而具有改进的腐胺生产力，但不限于此。KCCM11240P菌株是为了阻断来自 腐胺的N-乙酷腐胺的生物合成途径，通过缺失编码NCgll469的基因而制备的腐胺过表达菌 株，并且公开在国际专利公布号W02013/105827中。
[0054] 在本发明的【具体实施方式】中，基于通过与其内源活性相比减弱NCgll469活性而具 有改进的腐胺生产力的棒状杆菌属某种微生物化CCM11240P化CCM11138PANCgll469))，通 过在染色体中将野生型spec改变为具有增加的腐胺转化活性的0DC I163S/E165V(speC)突 变体来制备修饰的菌株(实施例6)。该修饰的菌株命名为谷氨酸棒状杆菌CC01-0578,并且 在2013年6月10日依照布达佩斯条约在韩国微生物保藏中屯、（KCCM)保藏，登录号为 KCCM11425P。
[0055] 在仍另一个方面，本发明提供生产腐胺的方法，方法包括W下步骤:培养通过改变 成为根据本发明的修饰的0DC蛋白而具有改进的产腐胺活性的棒状杆菌属某种微生物;和 从上面的步骤中获得的培养物回收腐胺。
[0056] 棒状杆菌属某种微生物可W具体地是谷氨酸棒状杆菌，并且更具体地是谷氨酸棒 状杆菌CC01-0578(登录号:KCCM11425P)菌株。
[0057] 如本文使用的，术语"培养"是指在人工控制环境条件下培养微生物。在本发明中， 可W使用本领域中众所周知的方法进行使用棒状杆菌属某种微生物生产腐胺的方法。具体 地，培养方法的实例包括分批方法和连续方式的补料分批或重复补料分批方法，但不限于 此。
[0058] 培养中使用的培养基必须适当地满足具体菌株的需要。公开了用于棒状杆菌属某 种微生物的培养基（例如，Manual of Methods for General Bacteriology.American Society for Bacteriology.Washington D.C.,USA,1981)。作为培养基中的碳源，可W使 用糖和碳水化合物，比如葡萄糖、薦糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素；油脂(oils and fats)比如大豆油、葵花巧油、藍麻油和挪子油；脂肪酸比如栋桐酸、硬脂酸和亚油酸;醇比 如丙Ξ醇和乙醇;和有机酸比如醋酸等。运些物质可W单独地使用或作为混合物使用。作为 氮源，可W使用蛋白腺、酵母提取物、牛肉膏、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉和尿素、或无机化 合物比如硫酸锭、氯化锭、憐酸锭、碳酸锭和硝酸锭，并且运些物质可W单独地使用或作为 混合物使用。作为憐源，可W使用憐酸二氨钟或憐酸氨二钟或相应的含钢盐。此外，培养基 可W包括金属盐比如硫酸儀或硫酸铁，其对生长是必需的，并且最后，除上面提及的物质之 夕h还可W使用必需的促生长物质比如氨基酸和维生素。合适的前体可W添加至培养基。上 面的物质可分批或连续方式充分地补料入培养物。
[0059] 可W通过适当的碱性化合物比如氨氧化钢、氨氧化钟或氨，或者酸性化合物比如 憐酸或硫酸调节培养物的抑。可W通过防泡剂比如脂肪酸聚乙二醇醋调节泡沫形成。可W 通过引入氧气或含氧气体混合物(例如，空气)维持培养物的需氧条件。培养溫度可W通常 是20°C至45°C，具体地是25°C至40°C。可W持续培养直到腐胺的生产达到期望的最大，并且 经常可W在10小时至160小时内到达。腐胺可W释放入培养基，或包含在细胞中。
[0060] 本发明的生产腐胺的方法包括从细胞或培养物回收腐胺的步骤。可W使用适当的 本领域中已知的方法一一例如，离屯、、过滤、阴离子交换层析、结晶和HPLC，但不限于此一一 进行从细胞或培养物回收腐胺的方法。
[0061] 发明的实施例
[0062] 下文中，将参照实施例更详细地描述本发明。然而，运些实施例仅用于说明性目 的，并且本发明不意欲被运些实施例限制。
[00创实施例1.0DC(鸟氨酸脱簇酶)的结构分析和其突变体的设计
[0064] 一般而言，大肠杆菌已知具有两种类型的0DC。一种是诱导型ODC(speF)，其表达在 酸性抑下被诱导，另一种是组成型ODC(speC)，其参与二胺比如腐胺的生产(Applebaum DM 等，Biochemishy, 16:1590-1581,1977)。运些之中，spec--其是参与腐胺生产的组成型 0DC--被选择作为勒1基因。
[0065] 至今，已经掲示了弧菌属和乳酸杆菌属细菌的0DC结构。运些之中，预测大肠杆菌 ODC(speC)具有与乳酸杆菌属30a 0DC相似的结构。因此，基于乳酸杆菌属0DC的3D结构，使 用GeneDoc程序进行大肠杆菌ODC(speC)的氨基酸序列的比对(Momany C等，J Mol Biol,4: 849-854,1995)。作为比较氨基酸序列的结果，大肠杆菌spec和乳酸杆菌属30a ODC之间的 序列同一性是53%，并且其间的序列相似性是65%，其指示两种酶彼此非常相似。因此，基 于由RCSB Protein Data Bank提供的乳酸杆菌属30a ODC(PDB号：10畑）的结构，进行大肠 杆菌spec结构的同源性建模。结果，蛋白质的整体骨架几乎彼此相同，并且参与同PLP(憐酸 化唉醒)结合的活性位点的氨基酸序列也几乎彼此相同。
[0066] 分析两种酶的结构的结果显示0DC作为二聚体存在于细胞中，其活性位点在二聚 体界面处形成，并且底物进入活性位点的路径的入口区很窄。因此，为了加宽使底物有效地 进入活性位点的入口区并迅速地转化产物，设计了将入口区处的体积大的残基替换为小的 残基的修饰(V156、D160、I163、E165、Q691)。
[0067] 额外地，为了稳定结合至活性位点的辅助因子化P，还设计了使围绕活性位点的残 基的突变(N153、D309)。
[00側实施例2.大肠杆菌ODC(speC)基因的克隆和表达
[0069] 为了表达大肠杆菌spec基因，使用了通常在酶表达中使用的pET28a(Novagen)载 体系统。首先，使用野生型大肠杆菌W3110的染色体作为模板和W下表1中给出的引物，通过 PCR扩增spec基因。使用限制酶Ndel和化〇1处理通过PCR扩增获得的基因片段和载体祀T28a (37°C，3小时），并且然后通过一般连接方法将spec基因片段插入祀T28a载体。
[0070] [表1]
[0071]
[0072] 通过测序分析确认如此制备的spec表达载体(pET28a-speC)的突变。
[0073] 实施例1中的祀残基分别被替换为小的残基丙氨酸。为了稳定PLP，根据与化P结合 的位置，围绕活性位点的残基被不同地修饰。
[0074] 使用制备的祀T28a-speC载体作为模板和表及W下表2中给出的引物进行PCR。 首先，为了突变spec基因，对于相对于待突变的区的正向（5'）和反向（3'）区，进行初级PCR， 并且然后进行连接两个PCR片段的次级PCR。例如，在spec V156A的情况下，使用speC_起始 (NdeI)_5(SEQ ID N0:2)和speC_V156A_3(沈Q ID N0:5)作为引物通过PCR扩增正向区，并 且使用speC_V156A_5(SEQ ID N0:4)和speCj冬止(XhoI)_3(SEQ ID N0:3)作为引物通过 PCR扩增反向区。使用通过初级PCR获得的两种PCR片段作为模板，和speC_起始(Ndel)_5 (SEQ ID N0:2)与speCj冬止(XhoI)_3(SEQ ID N0:3)作为引物，进行 次级PCR。最后获得的 spec V156A基因 W与在spec基因片段中相同的方式插入祀T28a载体。使用表2中给出的引 物W与上面相同的方式将其它突变片段也通过PCR分别引入祀T28a载体。
[00巧]通过测序分析确认如此制备的spec突变体表达载体的突变(pET28a-speC_V156A、 pET28a-speC_D160A、pET28a-speC_I163A、pET28a-speC_E165A、pET28a-speC_Q691A、 祀T28a-speC_Nl53D、祀T28a-speC_Nl53E、祀T28a-speC_D30犯）。
[0076] [表 2]
[0077]
[0079] 实施例3.0DC(speC)突变体酶的活性的测量
[0080] 3-1.0DC突变体酶的制备
[0081 ]将在实施例2中制备的每个祀T28a-speC突变体载体转化入具有DE3基因型的大肠 杆菌W制备表达0DC酶的菌株。
[0082] 参照祀T系统手册(Novagen)进行祀T28a-speC突变体载体的表达。详细地，从LB平 板培养基选择各自菌株的单一菌落并接种入3mL的LB液体培养基(+卡那霉素 50yg/mL)，接 着在37°C和20化pm下溫育16小时。培养物再接种入15mL的新鲜LB培养基(+卡那霉素 50yg/ mU，并且在相同条件下溫育直到OD600达到大约0.6。然后，立刻W〇.5mM的终浓度添加 IPTG， 并且在18°C和18化pm下溫育20小时W诱导酶表达。
[0083] 在诱导酶表达后，将获得的细胞超声处理并离屯、。得到的上清液用于初级活性测 试。额外地，为了表征酶，酶被纯化，并且然后经历次级活性测试。使用连接至祀T载体中的 酶的His-标签通过Ni-NTA柱分离酶。在纯化中，使用畑elating Excel lose自旋试剂盒 (Bioprogen)。如此获得的0DC(野生型和突变体spec)酶通过8%SDS PAGEW可溶形式表达， 并且因而从上清液回收。
[0084] 3-2.0DC(speC)突变体酶的活性的测量
[0085] 为了使用鸟氨酸作为底物通过0DC评估腐胺转化活性，测量在实施例3-1中获得的 0DC(野生型和突变体spec)酶的活性。参照先前报道的标准（Vienozinskiene J等，Anal Biochem，146:180-183，1985)进行检验腐胺转化活性的ODC活性测试。
[0086] 也就是说，当0DC酶将一个分子的鸟氨酸转化为腐胺时，消耗一个分子的水，并且 一个分子的二氧化碳和一个Of离子与腐胺一起产生。因此，总抑增加(反应方案1)。当使用 酪红一一pH指示剂一一在559皿下测量增加的抑时，吸光度改变。吸光度与抑增加成比例地 增加。通过使用该性质间接地测量腐胺的量。
[0087] [反应方案1]
[008引 k鸟氨酸+出0->腐胺+C02+0H-
[0089] 对于0DC酶的初级活性测试，定量纯化前上清液中总蛋白质的量，并且相等地调节 上清液的浓度。使用30yg的酶上清液、lOmM鸟氨酸和1.25yMPLP制备反应溶液，并且然后使 用40μΜ酪红监测抑变化。
[0090] 作为活性测量的结果，0DC突变体酶的Ι163Α和Ε165Α的活性比野生型的活性显示 更高的腐胺生产率。其余6种类型的0DC突变体--￥1564、01604、96914、^530、^536和 D309E--的活性显示559nm下吸光度的极小变化(参见图1)。
[0091] 为了表征两种0DC突变体酶--I163A和E165A，其在初次筛选中选择，它们利用 化S-标签纯化并进行量化，并且然后测量根据鸟氨酸浓度的腐胺转化率。0DC酶在lOyg的浓 度下使用，并且鸟氨酸在〇.15mM至lOmM的浓度下使用。在此范围中，使用酪红测量pH变化。
[0092] [表 3]
[0093]
[0094] 运些结果显示通过0DC结构分析设计的修饰的0DC酶--I163A和E165A--与野 生型相比分别显示53%和27%的Km值减小，运指示它们对底物鸟氨酸的结合亲和力增加。 进一步，修饰的0DC I163A和E165A的活性与WT相比分别显示12.5%和50%的1?3曰*值增加， 运指示将鸟氨酸转化为腐胺的能力也增加。最后，计算显示酶活性的特性的kcat/KM值。 I163A和E165A与WT相比分别显示2.4和2倍的1?3曰1/1(|?值增加(表3)。
[00巧]实施例4.0DC( spec)突变的优化
[0096] 如在实施例3中确认的，进行了为0DC活性中重要残基的163位的氨基酸（异亮氨 酸)和165位的氨基酸(谷氨酸)处的多种小氨基酸残基的突变。W与实施例1中相同的方式 进行突变，并且其中使用的引物在W下表4中给出。另外地，分别在163和165位中进行单突 变，并且然后通过在每个位置引入显示增加的0DC活性的突变组合来制备双突变体，接着进 行评估。
[0097] [表 4]
[009引
[0099] 根据实施例2和3的方法纯化通过使用表4的引物制备的ODC突变体，并且测量腐胺 转化率。测量制备的0DC突变体的腐胺转化率的结果在W下表5中给出。
[0100] [表引
[0101]
[0103] 如表5中所示，当氨基酸残基163和165被分别引入甘氨酸(G)、丝氨酸(S)和鄉氨酸 (V)的单突变时，残基163替换为丝氨酸和残基165替换为鄉氨酸与野生型相比分别显示4.4 和6.9倍的kcat/KM值增加。基于此结果，将双突变引入两个残基，并且检验它们的活性。令 人吃惊地，不是I163S和E165V组合的双突变--每个单突变显示最高的活性，而是163和 165残基二者都替换为鄉氨酸的双突变与野生型相比显示21.3倍的活性增加。
[0104] 总之，0DC酶突变体的增加的活性归因于kcat/KM值的增加--其由于kcat值的增 加而不是Km值的减小，运意味着0DC酶被突变W具有增加成为产物腐胺的转化率的结构，而 不是增加底物鸟氨酸对酶的结合亲和力的结构。
[ο…引实施例5.使用鸟氨酸作为底物制备ODC突变体酶表达菌株并测量腐胺转化
[0106] 评估其中突变在实施例4中被优化的0DC突变体酶是否实际地影响微生物中鸟氨 酸至腐胺的转化。
[0107] 详细地，使用通过在具有DE3基因型的大肠杆菌中引入制备的祀T28a-speC突变体 载体而制备的菌株进行实验。从LB平板培养基选择各自菌株的单一菌落并接种入3mL的LB 液体培养基（+卡那霉素50yg/mL)，接着在37°C和2(K)rpm下溫育16小时。培养物再接种入 25mL的新鲜LB培养基(+卡那霉素50yg/mL和0.2%葡萄糖），并且溫育直到ODsgg达到0.5至 0.6。然后，添加0.5mM IPTGW诱导ODC(speC)表达，并且在18°C和200巧m下溫育20小时。然 后，进行离屯、W丢弃上清液并收集细胞。将W沉淀物形式获得的细胞重悬在1XM9基本培养 基（3.37mM 化抽P〇4、2.2mM KH2P〇4、0.86mM 化Cl、0.94mM 畑此1)中W调节OD600值至20。另外 地，添加 lOmM鸟氨酸作为底物且〇.5μΜ PLP作为辅助因子至10血的最终体积。使得反应在25 °〇和20化pm伴随震荡的条件下，并且随时间进行取样。通过使用TNBS量化腐胺的方法测量 转化的腐胺的浓度(Ngo TT等，Anal Biochem, 160:290-293,1987)。
[0108] 在TNBS方法中，将通过离屯、取样的培养物获得的上清液稀释50倍，并且用于进行 分析。将ImL的4N化0H添加至0.5mL的稀释样品，并且然后进一步添力日2mL的1-戊醇并均匀 混合。在2000巧m下进行离屯、5分钟，并且然后添加 ImL的上清液至包含ImL的0.1M NasB地7 (pH 8.0)的新管，并且它们被混合均匀。进一步添加 ImL的lOmM TNBS并均匀混合，并且将 2mL的DMS0添加至其并混合。然后，进行离屯、，并且在426nm下测量得到的上清液的吸光度。
[0109] [表 6]
[0110]
[0111] 测量野生型和3种类型的0DC突变体的腐胺转化。结果，与野生型相比，0DC突变体 显示在2小时收集的样品中增加大约32%至39%的鸟氨酸至腐胺的转化率。在0DC突变之间 的转化率中存在极小差异，并且它们在活性中没有显示差异，其中纯化的0DC突变体在体外 实验中显示出大的差异。然而，野生型甚至在4小时后显示不完全反应，而突变体在4小时内 显示几乎完全反应。结果，0DC突变体的增加的活性还在酶转化菌株中在体内被确认。
[0112] 实施例6.制备具有0DC突变体的产腐胺菌株并测量腐胺生产力
[0113] 为了检验当将具有增加的腐胺转化活性的0DC突变体实际地引入产腐胺菌株时， 腐胺生产力是否受影响，测量腐胺生产力。
[0114] 6-1.制备具有0DC突变体的产腐胺菌株
[0115] 基于棒状杆菌属某种微生物化CCM11240P)，其与NCgll469内源活性相比通过减弱 NCgl 1469活性而具有改进的腐胺 生产力，通过在染色体中将野生型spec改变成为具有增加 的腐胺转化活性的ODC(speC)来制备突变体菌株。
[0116] 具有改进的腐胺生产力的谷氨酸棒状杆菌化CCM11240P)菌株是在国际专利公布 号W02013/105827中公开的菌株，并且其使用具有腐胺生产力的棒状杆菌属某种微生物 化CCM11138P)作为母菌株(mother S化ain)制备，公开在国际专利公布号W02012/077995 中。更详细地，通过W下过程制备菌株:基于ATCC13032菌株的NCgl 1469基因的碱基序列，将 NCgll469的N-末端区域和C-末端区域克隆入pDZ载体，通过电穿孔将该载体引入具有腐胺 生产力的棒状杆菌属某种微生物化CCM11138P)，并且之后在包含卡那霉素（2扣g/mL)的培 养基上铺板菌株，然后选择。通过在包含X-gal(5-漠-4-氯-3-吗I噪基-β-D-半乳糖巧）的培 养基上选择蓝色菌落来确认载体的成功的染色体插入。在营养培养基中培养初次 (prima巧)染色体插入的菌株，接着在包含X-gal并且不包含抗生素的培养基上涂布稀释的 菌株，并且选择W相对低的比率出现的白色菌落。最后，通过交换选择NCgll469基因缺失的 菌株。如此制备的最终KCCM11138PANCgll469菌株是与母菌株KCCM11138P相比具有改进的 腐胺生产力的腐胺过表达菌株，KCCM11138PANCgl 1469菌株具有编码NCgl 1469的基因的缺 失，所述NCgll469是参与在细胞中将腐胺分解为N-乙酷腐胺的途径的蛋白质。
[0117] 详细地，使用W下表7中给出的speC_起始(BamHI )_5和speCj冬止(Xbal )_3引物， 扩增在实施例巧日4中制备的ODC(speC)突变体的DNA片段。具体地，使用制备的祀T28a-speC 突变体(I163S、I163V、I163S E165V)载体作为模板和W下表7中给出的两条引物speC_起始 (BamHI)_5 和 speCj冬止(甜 al)_3 进行 PCR。
[011 引[表7]
[0119]
[0120] 使用限制酶BamHI和Xbal处理通过PCR获得的基因片段和载体pDZ(37°C，3小时）， 并且然后将spec突变体的基因片段通过一般连接方法分别插入pDZ载体。通过测序分析确 认如此制备的用于染色体插入的重组载体(pDZ-speC_I163S、pDZ-speC_I163V、pDZ-speC_ I163S E165V)。
[0121] 为了获得其中spec突变体被插入染色体的菌株，将制备的pDZ-speC_I163S、pDZ- speC_I163V和pDZ-speC_I163S E165V重组载体中的每个通过电穿孔转化入KCCM11240P菌 株，并且然后涂布在BHIS平板培养基(每1L中37g/L的脑屯、浸液、91g/L的山梨醇和2%琼脂+ 25yg/mL的卡那霉素)上。
[0122] 通过检验在包含X-gal(5-漠-4-氯-3-吗I噪基-β-D-半乳糖巧）的固体培养基上蓝 色菌落的出现来测定载体的成功的染色体插入。将初次染色体插入的菌株在营养培养基中 伴随震荡培养(30°C，8小时），接着连续稀释并涂布在包含X-gal的固体培养基上。大多数菌 落是蓝色的，而白色菌落W相对低的比率出现。从选择的菌落中，最终获得通过二次交换在 染色体中具有spec突变体的菌株。通过突变体的测序分析最终鉴定运些菌株。鉴定的菌株 被命名为KCCM11240P: :speC_I163S、KCCM11240P: :speC_I163V和KCCM11240P: :speC_I163S E165V。在运些中，KCCMl 1240P: : speC_1163S E165V被命名为谷氨酸棒状杆菌CCOl-0578，并 且在2013年6月10日依照布达佩斯条约在韩国微生物保藏中屯、（KCCM)保藏，登录号为 KCCM11425P。
[0。引 6-2.测量具有ODC突变体的产腐胺菌株的腐胺生产力
[0124] 为了检验ODC(speC)突变体对产腐胺菌株的腐胺生产力的作用，评估在实施例6-1 中制备的菌株的腐胺生产力。
[0125] 详细地，制备的菌株在30°C下在包含ImM精氨酸的CM平板培养基(每1L中1%葡萄 糖、1 %聚腺、0.5%酵母提取物、0.5%牛肉膏、0.25%化C1、0.2%尿素、100化的50%化0H、 2%琼脂，pH 6.8)中培养16小时，并且然后将一接种环（loop)的细胞培养物接种在25mL的 W下表8的效价培养基中，并且在30°C、200rpm下震荡培养24小时。在发酵期间在培养基中 添加 ImM精氨酸，培养全部制备的菌株。
[0126] [表 8]
[0127]
[0128] ~如表9中所示，引入具有改进的活性的ODC(speC)突变体的每种菌株显示在24小时' 37%至105%的腐胺生产的增加。
[0129] 运些结果显示具有0DC突变体的产腐胺菌株与已知的菌株相比能够相对于糖消耗 产生高浓度的腐胺。
[0130] [表 9]
[0131]
[0132]
[0133] 基于上面的描述，本领域技术人员将理解可WW不同的具体形式实施本发明，而 不改变其技术精神或基本特性。因此，应当理解上面的实施方式在全部方面不是限制性的， 而是说明性的。本发明的范围由所附的权利要求限定，而不是由之前的描述所限定，并且因 此落入权利要求的边界和界限或运样的边界和界限的等价物内的全部变化和修改，因此意 欲被权利要求所涵盖。
[0134] 国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约
[0135] 国际表格
[0136] 原始保藏接收证明
[0137] 由该页下部确定的国际保藏机构根据第7.1条发出 [013引至:CJ第一制糖株式会社
[0139] CJ第一制糖中屯、，
[0140] 330，D0NGW-R0，
[0141] JUNG-GU，首尔 100-400
[0142] 大韩民国
[0143]
[0144] 1如果第6.4(d)条适用，该日期是获得国际保藏机构资格的日期;如果在获得国际 保藏机构资格的日期之后在布达佩斯条约之外的保藏被转化成在布达佩斯条约之下的保 藏，该日期是由该国际保藏机构收到该微生物的日期。
[0145] BP/4 表单页
【主权项】
1. 修饰的鸟氨酸脱羧酶(ODC)蛋白，其在一个或多个氨基酸残基处具有突变，所述一个 或多个氨基酸残基选自距0DC的N-末端163位的异亮氨酸和165位的谷氨酸，所述0DC具有由 SEQ ID NO: 1表示的氨基酸序列。2. 根据权利要求1所述的修饰的0DC蛋白，其中所述165位的谷氨酸被替换为丙氨酸、甘 氨酸、丝氨酸或缬氨酸。3. 根据权利要求1所述的修饰的0DC蛋白，其中所述163位的异亮氨酸被替换为丙氨酸、 甘氨酸、丝氨酸或缬氨酸。4. 根据权利要求1所述的修饰的0DC蛋白，其中所述163位的异亮氨酸和所述165位的谷 氨酸分别被替换为丙氨酸-丙氨酸、丙氨酸-缬氨酸、丝氨酸-缬氨酸或缬氨酸-缬氨酸。5. 根据权利要求1所述的修饰的0DC蛋白，其具有SEQ ID N0:34至57的任何氨基酸序 列。6. 编码权利要求1至5中任一项所述的修饰的0DC蛋白的多核苷酸。7. 包括编码权利要求1至5中任一项所述的修饰的0DC蛋白的多核苷酸的载体。8. 转化有权利要求7所述的载体的转化体。9. 制备腐胺的方法，所述方法包括使L-鸟氨酸、包含L-鸟氨酸的混合物或L-鸟氨酸发 酵液与权利要求1至5中任一项所述的修饰的0DC蛋白反应的步骤。10. 根据权利要求9所述的方法，其中所述修饰的0DC蛋白是纯化的修饰的0DC蛋白或包 含所述修饰的0DC蛋白的微生物发酵液。11. 重组微生物，其通过改变成为具有产腐胺活性的棒状杆菌属某种微生物中的权利 要求1至5中任一项所述的修饰的0DC蛋白而具有改进的产腐胺活性。12. 根据权利要求11所述的重组微生物，其中所述棒状杆菌属某种微生物是谷氨酸棒 状杆菌。13. 生产腐胺的方法，其包括以下步骤： (a) 培养棒状杆菌属某种微生物，其通过改变成为权利要求1至5中任一项所述的修饰 的0DC蛋白而具有改进的产腐胺活性;和 (b) 从在步骤(a)中获得的培养物回收腐胺。14. 根据权利要求13所述的方法，其中所述棒状杆菌属某种微生物是谷氨酸棒状杆菌。
【专利摘要】本发明涉及具有改进的腐胺生产力的新型突变体鸟氨酸脱羧酶蛋白和其用途。KCCM11425P20130610
【IPC分类】C12N15/60, C12P13/04, C12N9/88
【公开号】CN105555953
【申请号】CN201480050697
【发明人】崔香, 郑熙景, H·S·金, H·H·京, J·M·崔, J·J·李, H·D·苏
【申请人】Cj第一制糖株式会社, 韩国科学技术院
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2014年7月17日
【公告号】EP3023493A2, US20160168605, WO2015009074A2, WO2015009074A3
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