基因重组的h9n1亚型禽流感病毒及其应用的制作方法
专利名称：基因重组的h9n1亚型禽流感病毒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因重组的H9m亚型禽流感病毒，以及该病毒在制备预防H9N2 亚型禽流感病毒感染的灭活疫苗的应用，该病毒已于2009年8月3日保藏于中国典型培 养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，其分类命名为流感病毒H9W亚型A/Wuhan/ Re-l/2009(H9m)，保藏编号为 CCTCC NO :V200913。
背景技术：
(Avian Influenza, Al)(Avian Influenza Virus, AIV) 引起的禽类感染和/或疾病综合征。AIV在分类上属于病毒界(Vira)...正粘病毒科 (Orthomyxoviridae)...流感病毒属(Influenza Virus A and B)…禽流感病毒(Avian InfluenzaVirus)。AIV的基因组由8个单股负链RNA片段组成。根据表面蛋白抗原性不同， AIV被分为16个血凝素(HA)和9个神经氨酸酶(NA)亚型。HA是AIV主要的免疫原蛋白， 它可以诱导机体产生抗体介导的特异性体液免疫应答，抗HA的抗体可以通过干扰病毒与唾 液酸受体的结合或者病毒囊膜与内吞体膜的融合过程从而中和病毒的感染。H9N2亚型AIV 于1966年首次在美国的火鸡中首次出现，目前在全球的野禽和家禽中广泛分布与流行。1998 年，研究者首次从我国大陆的人体样品中分离到了 H9N2禽流感病毒，之后从香港以及我国大 陆的患者体内再次分离到了该亚型病毒；2003年和2007年，研究者多次从香港的患者体内分 离到了 H9N2禽流感病毒。H9N2禽流感病毒频繁感染人的事件，标志着该亚型病毒具有公共 卫生意义。随着H9N2禽流感病毒对人类造成的威胁，人们已经意识到，阻止H9N2禽流感病毒 向人群扩散的最有效的途径，就是有效的控制动物源性H9N2禽流感病毒。自1996年以来，我 国养禽业一直受到H9N2禽流感的困扰，尤其是1998年，该病给我国养禽业造成了灾难性损 失。鸡胚生产的H9N2全病毒灭活苗在养禽业的应用使该病的控制取得了较好的效果，但由于 现地分离的野毒株鸡胚适应性差，致使现行使用的疫苗存在成本高、免疫期短等缺点；另外， 用现行的疫苗免疫动物后，无法区分是免疫后或者野毒感染后产生的抗体。为解决上述的难题，人们开发了标记疫苗(marker vaccine)或称之为DIVA疫苗 (differentiating infected from vaccinated animals),就是用一禾中疫苗给动物免疫后， 通过与之相配套的血清学检测方法，可将免疫动物和自然感染动物区分开来。在1999-2001 年意大利暴发H7W禽流感期间，采用H7N3分离株制备成了灭活疫苗，接种鸡群后，动物产 生了高效价的抗HA抗原的抗体，且能够完全抵抗H7W禽流感病毒的攻击。同时，免疫动物 产生了针对N3的NA抗体，借助于试剂盒可以将免疫家禽和感染家禽区分开来。利用这种 标记疫苗意大利有效地消灭了由H7W禽流感病毒引起的流行。在实施DIVA策略时，疫苗 毒株的产生是一个关键性的问题。目前，借助反向遗传学操作技术，可以方便地产生目的 病毒毒株。
发明内容
本发明的目的是提供一种基因重组的H9m亚型禽流感病毒，命名为A/Wuhan/Re-1/2009 (H9N1)，该病毒具有高度鸡胚适应性，但对鸡及鸡胚无致病性；用该病毒作为毒 种，在鸡胚中增殖并灭活后，制备成油乳剂灭活疫苗，对我国流行的H9N2亚型禽流感病毒 具有特异免疫原性，另外，通过对免疫动物特异性的NA抗体的检测，可以区分免疫(Η·1) 或野毒(H9N2)感染状况。本发明的目的是通过以下的技术方案实现基因重组的H9m亚型禽流感病毒，其 特征在于其组成包括具有H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Hubei/Cl/2007 (H9N2)的HA 基因以及HlNl流感病毒A/PR/8/34 (HlNl)的7个内部基因PB2、PBl、PA、NP、ΝΑ、M禾口 NS, 其保藏号为CCTCC-V200913。该病毒已于2009年8月3日由中国典型培养物保藏中心收到，并登记入册。该培 养物的存活性已于2009年8月31日检测完毕，结果为存活。按上述方案，所述的HA基因具有序列表SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。按上述方案，所述的Hmi流感病毒A/PR/8/34(HlNl)的7个内部基因PB2、PBU ΡΑ、ΝΡ、ΝΑ、M和NS具有序列表SEQ ID NO. 2 SEQ ID NO. 8所示的核苷酸序列。上述的基因重组的H9m亚型禽流感病毒对我国流行的H9N2亚型禽流感病毒具有 特异免疫原性，具有高度鸡胚适应性，但对鸡和鸡胚无致病性。上述的基因重组的H9m亚型禽流感病毒在制备预防H9N2亚型禽流感病毒感染的 灭活疫苗的应用。上述的H9m亚型禽流感灭活疫苗在区分免疫(H9N1)或野毒(H9N2)感染状况中 的应用。本发明采用的技术是将病毒RNA逆转录成cDNA，由含病毒基因组cDNA的质粒获 取RNA病毒的一种技术，借助反向遗传操作技术，将我国流行的H9N2亚型禽流感病毒A/ Chicken/Hubei/Cl/2007 (H9N2)的HA基因克隆入表达载体pHW2000，同时，将流感病毒A/ PR/8/34 (HlNl)的 7 个基因(PB2、PBU ΡΑ、ΝΡ、ΝΑ、M 和 NS)也克隆入表达载体 pHW2000， 获取了 8 个表达质粒，分别命名为 ρ冊-H9-HA，pHW-PR8-PB2、ρ冊-PR8-PB1、pHW-PR8_PA、 ρ冊-PR8-NP、ρ冊-PR8-NA、ρ冊-PR8-M和ρ冊-PR8-NS。将上述的8个表达质粒共转染293Τ 细胞，获取了基因重组的H9W亚型禽流感病毒。用上述的基因重组的H9m亚型禽流感病毒，经鸡胚增殖并灭活后制备成灭活疫 苗，免疫动物后产生高滴度的HI抗体，能够预防H9N2亚型禽流感病毒的感染。用上述的基因重组的H9m亚型禽流感病毒灭活疫苗免疫动物后，检测特异性NA 抗体，能够区分免疫(H9m)或野毒(H9N2)感染状况。本发明的有益效果1.本发明利用流感病毒的反向遗传学操作技术，获取了 H9W重组禽流感病毒(A/ Wuhan/Re-l/2009(H9m))。该病毒保持了我国H9亚型禽流感病毒特有的抗原性，以此作为 生产疫苗毒株，将对H9N2亚型禽流感流行株的感染产生良好的特异保护；2.现行使用的禽流感疫苗均为鸡胚繁殖的全病毒灭活疫苗，疫苗质量与病毒 抗原含量直接相关。本发明的基因重组的H9m亚型禽流感病毒含有鸡胚适应株A/ PR/8/34 (HlNl)的6个内部基因(PB2、PB1、ΡΑ、ΝΡ、M和NS)，病毒生长滴度与野毒相比，可 提高10倍左右，以此为疫苗株生产的疫苗，可大大降低疫苗生产成本，提高疫苗质量；3.能否区分疫苗免疫与野毒感染，这也是禽流感疫苗使用的一个影响因素，本发明的基因重组的H9m亚型禽流感病毒保留了 A/PR/8/34 (HlNl)的NA基因，通过对免疫动 物特异性NA抗体的检测，可以区分动物的免疫与野毒感染状况。
具体实施例方式下面结合实施例进一步介绍本发明，但是实施例不会构成对本发明的限制。实施例1 本发明基因重组的亚型禽流感病毒(A/Wuhan/Re-l/2009(H9m))，保藏号为 CCTCC-V200913,其组成包括具有 H9N2 亚型禽流感病毒 A/Chicken/Hubei/Cl/2007 (H9N2) 的HA基因以及Hmi流感病毒A/PR/8/34 (HlNl)的7个内部基因PB2、PB1、PA、NP、NA、M和 NS，其制备方法包括以下几个步骤1.以我国 H9N2 亚型禽流感病毒 A/Chicken/Hubei/Cl/2007(H9N2)株 RNA 为模板， 以特异性引物RT-PCR扩增HA全长cDNA，并插入含有RNA聚合酶I，RNA聚合酶II的RNA双 向转录载体PHW2000的BsmB I位点。2. RT-PCR扩增流感病毒高滴度鸡胚适应株的7个基因片段PB2，PBl，PA, NP, NA, M和NS全基因cDNA，分别按上述方法插入pHW2000中，获取了 8个表达质粒，分别命名为 PHW-H9-HA, pHW-PR8-PB2、pHW-PR8_PBl、pHW-PR8_PA、pHW_PR8-NP、pHW_PR8-NA、pHW-PR8_M 和 pHW-PR8-NS。3.利用脂质体转染法将上述8个基因的双向表达质粒同时导入单层的293T细胞， 72小时收获细胞上清，接种10日龄鸡胚尿囊腔，72小时后收取尿囊液并检测血凝(HA)活 性。HA阳性样品即为基因重组的H9W亚型禽流感病毒。实施例2 基因重组的H9W亚型禽流感病毒的生长特性将基因重组的H9W亚型禽流感病毒10倍稀释后(KT1-I(Tiq)，接种于10日龄鸡 胚，每胚0. 2ml，每个剂量组5枚鸡胚。35°C培养，72小时后收集鸡胚尿囊液并检测血凝(HA) 活性，其HA效价可达1024，而鸡胚半数感染量(EID5tl)可达IO1q 3EID5cAiI,表明该疫苗毒株 生长特性良好。实施例3 基因重组的H9W亚型禽流感病毒的致病性分析将基因重组的H9W亚型禽流感病毒病毒10倍稀释后，接种10日龄鸡胚，每胚 0. 2ml。35°C培养，每隔6小时观察鸡胚，收集死亡鸡胚，直至接种后7天，统计鸡胚的平均 死亡时间(MDT)。实验结果显示，重组病毒的MDT > 168小时，表明该重组病毒对鸡胚无致 病性。另外，将10倍稀释后的基因重组的H9m亚型禽流感病毒接种7日龄鸡，观察接种 后的临床症状、发病情况和死亡情况，连续观察21天。结果显示，病毒感染后，实验鸡无任 何临床症状、全部存活，表明该病毒对鸡无致病性、安全。实施例4 基因重组的H9W亚型禽流感病毒的抗原性分析将我国2000-2007年流行的18个H9N2禽流感病毒地方分离株多次免疫兔子后， 制备成高免血清。以基因重组的H9m亚型禽流感病毒与上述的高免血清进行HI实验，测定重组病毒的抗原性。结果显示，基因重组的H9m亚型禽流感病毒能与所有的高免血清均 发生交叉反应，其HI效价> 640，表明该病毒的免疫原性好。实施例5 油乳剂灭活疫苗免疫动物后诱导的抗体反应将基因重组的H9W亚型禽流感病毒接种10日龄鸡胚，72小时后收获病毒尿囊液 (彡IO8EID5ciAil)，加入终体积为0. 的甲醛进行灭活，灭活检验合格的病毒尿囊液按水 相与油相比例为1 1.5加入油佐剂，制备成油乳剂灭活疫苗。4-6周龄雌性BALB/c小鼠 免疫油乳剂灭活疫苗0. Iml/只，不同日龄的鸡(7日龄、14日龄和36周龄)免疫油乳剂灭 活疫苗，分别为0. 25ml/只、0. 25ml/只和0. 5ml/只，免疫后28天，采集血清测定HI抗体效 价。结果显示，BALB/c小鼠免疫后14天的HI抗体效价彡256，28天后彡1024;不同日龄鸡 (1周龄、2周龄和36周龄)免疫14天后的HI抗体效价彡256，28天后彡1024。实施例6 油乳剂灭活疫苗的保护效力4-6周龄雌性BALB/c小鼠免疫油乳剂灭活疫苗0. Iml/只，不同日龄的鸡(7日龄、 14日龄和36周龄)免疫油乳剂灭活疫苗分别为0. 25ml/只、0. 25ml/只和0. 5ml/只，免疫 后28天，用H9N2禽流感病毒进行攻击。观察感染动物的临床症状、发病情况和死亡情况， 连续监测21天。结果显示，免疫组BALB/c小鼠全部存活(保护率100%)，对照组全部死 亡；不同日龄的免疫鸡无任何临床症状且全部存活，而对照组的鸡出现明显的临床症状，其 死亡率可达25%。实施例7:血清学鉴别诊断以H9W基因重组禽流感油乳剂灭活疫苗免疫14日龄鸡20只，0. 25ml/只，免疫后 28天收集血清；同时，以IO7EID5tl剂量的H9N2禽流感病毒感染14日龄鸡20只，免疫后28 天收集血清。以N2为诊断抗原，采用WHO推荐的标准NI试验方法，对H9W基因重组禽流 感油乳剂灭活疫苗免疫的血清和H9N2禽流感病毒感染的血清进行检测。结果显示，免疫油 乳剂灭活疫苗的所有鸡均为阴性，而H9N2禽流感病毒感染的血清均呈阳性，这表明采用血 清学检测方法可以区分动物的免疫与感染。基因重组的A/Wuhan/Re-1/2009 (H9N1)病毒基因序列SEQ ID No. 1AGCMMGCAGGGGMTTTCACMOCAGTCMMTGGMACMTATCACTMTAGCTATACTACTAGTAGTMCAGTMGCMTGCAGATAMATCTGCATOGGCTAOCMTCMCMACTCCACAGMCCTGTGGATAOGCTMCAGMMCMTGTOCCTGTGACACATGCTMAGAMTGCTCCACACAGAGCACMTGGGATGCTGTGTGCMCAMTCTGGGACATOCTCTCATTCTAMCAOCTGTAOCATTGMGGACTGATCTATGGCMOCCTTCTOGTGATCAGCTGTTGGGAGGAGGMMTGGTOCTACATOGTOGMAGACCATOGGCOGTTMTGGMTGTGTTAOCCTGGGMTGTAGMMOCTAGAGGMCTMGATC
ACTCTTTAGTTCTGCTAGnOCTAOCMAGAMTOGGATCnTOCAGACAOGATCTGGMTGTGTCTTACMTGGMCAAGCAMGCATGTTCAGATTCATTCTACAGMGCATGAGATGGCTGACTCMMGMCACOGCTTAOCCTATTCMGAOGOCCMTACACMATMTAGAGGMAGAaMTCTTTTCATGTGGGGCATMATCAOCCAOCCAOOGATACTGTACAGACMAITTGTACACMGGACOGACACMCMCMGTGTGACMCAGAGGATATMCTAGMOCTTCAMOCMTGATAGGGOCMGGCCOCTTGTCMTGGTCAGCAGGGGAGAMTGATTAnATTGGTOGGTATTMMCCAGGTCAGACATTGCGM
TMGATOCMTGGGMTCTMTTGCTOCATGGTATGGACACATTCTTOCAGGAGAGAGCCAOGGMGMTCCTGMGACTGAITTMACAGTGGTMCTGTGTAGTGCMTGTCAGACTGMAGAGGTGGCTTAMCAOCACATTGCOGTTCCACMTGTCAGTMGTATGCAITTGGGMCTGQXAMGTATGnGGAGTAMGAGTCTCAGACTGGCAGTTGGTCTMGAMTGTGCCTGCTAGATCMGTAGAGGACTATTTGGGGCTATAGCTGGTTTCATAGAGGGAGGTTGGTCAGGGTTAGTOGCTGGnGGTATGGCTTOCAGCATTCAMTGATCMGGGGTAGGTATGGCTGCAGATAGAGGGTCMCTCMAGGGCMTTGACMMTMCATOCMAGTGMTMTATAGTOGATAMATGMCMGCAGTATGMMTATTGATCATGMTTCAGCGAGGnGAMCTAGACTCMTATGATCMTMTMGATTGATGATCAMTACMGACATATGGGCTTATMTGCAGMTTGCTAGTGCTGCTTGAMATCAGAMACACTOGATGMCATGATGCAMTGTGMCMTCTATATMCAMGTGMGAGGGCACTGGGTTCCMTGCCATGGMGAOGGGAMGGATGTITTGAGCTATAOCATMATGTGCTGATCAGTGCATGGAGACMnOGGMOGGGAOCTATMCAGGAGAMGTATMAGAGGMGCMMCTAGMAGACAGMMTAGMGGGGTCMGCTGGMTCTGMGGMCTTACAMATOCTCACCATTTATTOGACTGTOGCCTCATCTCTTGTGATTGCMTGGGGTTTGCTGCCTTCTTGTTCTGGGCCATGTOCMTGGATCTTGCAGATGCMCAITTGTATATAMTGGCAMMCAOCCTTGTTTCTACTSEQ ID No. 2AGCGMAGCAGGTCAMTATATTCMTATGGAMGMTAMAGMCTMGAMTCTMTGTOGCAGTCTOGCAOCOGCGAGATACTCACMMACCAOOGTGGACCATATGGCCATMTCMGMGTACACATCAGGMGACAGGAGMGMOCCAGCACTTAGGATGMATGGATGATGGCMTGMATATOCMTTACAGCAGACMGAGGATMOGGAMTGATTCCTGAGAGAMTGAGCMGGACAMCnTATGGAGTAMATGMTGATGCOGGATCAGACOGMTGATGGTATCACCTCTGGCTGTGACATGGTGGMTAGGMTGGAOCMTGACMATACAGTTCATTATCCAMMTCTACAMACTTATTTTGMAGAGTOGAMGGCTMAGCATGGMCCnTGGCCCTGTOCATTTTAGMACCMGTCMMTAOGTOGGAGAGnGACATAMTCCTGGTCATGCAGATCTCAGTGCCMGGAGGCACAGGATGTMTCATGGMGnGTTTTCOCTMOGMGTGGGAGCCAGGATACTMCATOGGMTOGCMCTMOGATMOCMAGAGMGMAGMGMCTCCAGGATTGCAMAITTCTOCTTTMTGCTTGCATACATGTTGGAGAGAGMCTGGTOOGCMMOGAGAnOCTCOCAGTGGCTGGTGGMCMGCAGTGTGTACATTGMGTGTTGCATTTGACTCMGGMCATGCTGGGMCAGATGTATACTOCAGGAGGGGMGTGAGGMTGATGATGnGATCMAGCTTGATTAnGCTGCTAGGMCATAGTGAGMGAGCTGCAGTATCAGCAGATCCACTAGCATCTnMT
GGAGATGTGCCACAGCACACAGATTGGTGGAMTAGGATGGTAGACATCCTTAGGCAGMCOCMCAGMGAGCMGCCGTGGATATATGCMGGCTGCMTGGGACTGAGAMTAGCTCATOCTTCAGTTTTGGTGGATTCACAITTMGAGMCMGCGGATCATCAGTCMGAGAGAGGMGAGGTGCTTAOGGGCMTCTTCMMMTGMGATMGAGTGCATGAGGGATATGMGAGTTCACMTGGTTGGGAGMGAGCMCAGCCATACTCAGMMGCMOCAGGAGAnGATTCAGCTGATAGTGAGTGGGAGAGAOGMCAGTOGAnGCOGMGCMTAMTGTGGCCATGGTATTTTCACAGGAGGAnGTATGATMAAGCAGTTAGAGGTGATCTGMITTOGTCMTAGGGCGMTCAGCGATTGMTCCTATGCATCMCTnTMGACATTTTCAGMGGATGCGMAGTGCnTTTCMMTTGGGGAGTTGMCCTATOGACMTGTGATGGGMTGAnGGGATAnGCOCGACATGACTCCMGCATOGAGATGTCMTGAGAGGAGTGAGMTCAGCAMATGGGTGTAGATGAGTACTCCAGCAOGGAGAGGGTAGTGGTGAaMTGAOOGGTnTTGAGMTOOGGGAOCMOGAGGAMTGTACTACTGTCTCOOGAGGAGGTCAGTGAMCACAGGGMCAGAGMACTGACMTMCTTACTCATOGTCMTGATGTGGGAGATTMTGGTCCTGMTCAGTGTTGGTCMTACCTATCMTGGATCATCAGMACTGGGAMCTGTTMMTTCAGTGGTOCCAGMCOCTACMTGCTATACMTMMTGGMITTGMCCATTTCAGTCTTTAGTAOCTMGGCmTAGAGGCCMTACAGTGGGTTTGTMGMCTCTGTTCCMCMATGAGGGATGTGCTTGGGACATTTGATACOGCACAGATMTMMCTTCTTOCCTTOGCAGCCGCTCCAOCMAGCAMGTAGMTGCAGTTCTCCTCAITTACTGTGMTGTGAGGGGATCAGGMTGAGMTACTTGTM
7GGGGCMTTCTCCTGTATTCMCTACMCMGGCCAOGMGAGACTCACAGnCTOGGAMGGATGCTGGCACTTTMC
TGMGAOCCAGATGMGGCACAGCTGGAGTGGMTCOGCTCTTCTGAGGGGATTCCKMTCTGGGCMAGMGACAGG
AGATATGGGCCAGCATTMGCATCMTGMCTGAGCMCCTTGCGMAGGAGAGMGGCTMTGTGCTMTTGGGCMG
GAGAOGTGGTGTTGGTMTGMAOGAMAOGGGACTCTAGCATACTTACTGACAGCCAGACAGCGACCAMAGAMTOG
GATGGCCATCAMTAGTGTOGMTAGTTTAMMOGAOCTTGITTCTACT
SEQ ID No. 3
AGCGMAGCAGGCAMOCAITTGMTGGATGTCMTCOGACCTTACnTTCTTMMGTGCCAGCACMMTGCTATM
GCACMCnTOCCTTATAOOGGAGACOCTCOCTACAGCCATGGGACAGGMCAGGATACACCATGGATACTGTCMCAG
GACACATCAGTACTCAGAMAGGGMGATGGACMCAMCAOOGAMCTGGAGCAOOGCMCTCMaimTGATGGG
OCACTGCCAGMGACMTGMCCMGTGGTTATGCCCMACAGATTGimMTGGMGCMTGGCTTTCCTTGAGGMT
OCCATCCTGGTATnTTGMMCTOGimMTGAMOGATGGAGCTTGTTCAGCAMCAOGAGTAGACAGGCTGACACA
AGGCOGACAGACCTATGACTGGACTCTAMTAGAMCCAGCCTGCTGCMCAOMTGGCCMCACMTAGMGTGTTC
AGATCAMTGGCCTCAOGGCCMTGAGTCTGGMGGCTCATAGACTTOCTTMGGATGTMTGGAGTCMTGMCMAG
MGAMTGGGGATCACMCTCATnTCAGAGAMGAGAOGGGTGAGAGACMTATGACTMGAMATGATMCACAGAG
MCMTAGGTMMGGMGCAGAGATTGMCAMAGGAGnATaMTTAGAaMTGAOCCTGMCACMTGACCAM
GATGCTGAGAGAGGGMGCTMMOGGAGAGCAMTGCMCOCCAGGGATGCAMTMGGGGGTTTGTATACnTGTTG
AGACACTGGCMGMGTATATGTGAGMACTTGMCMTCAGGGTTGCCAGnGGAGGCMTGAGMGAMGCMAGn
GGCAMTCTTGTMGGMGATGATGAaMTTCTCAGGACAOOGMCTTTCTTTCACCATCACTGGAGATMCACCAM
TGGMOGAMATCAGMTOCTOGGATGTTnTGGCCATGATCACATATATGACCAGAMTCAGCCOGMTGGTTCAGM
ATGTTCTMGTAnGCTCCMTMTCTTCTCAMCMMTGGCGAGACTGGGAMAGGGTATATGTTTGAGAGCMGAG
TATGMACTTAGMOCCAMTAOCTGCAGAMTGCTAGCMGCATTGAITTGAMTATTTCMTGATTCMCMGMAG
MGAnGMMMTOOGAOOGCTCTTMTAGAGGGGACTGCAimTGAGCOCTGGMTGATGATGGGCATGTTCMTA
TCTTMGCACTGTAnAGGCGTCTOCATOCTGMTCTTGGACAMAGAGATACACCMGACTACTTACTGGTGGGATGG
TCTTCMTOCTCTGAOGATnTGCTCTGATTGTGMTGCACOCMTCATGMGGGATTCMGCOGGAGTOGACAGGITT
TATOGMCCTGTMGCTACTTGGMTCMTATGAGCMGMMAGTCTTACATMACAGMCAGGTACATTTGMTTCA
CMGimTTCTATOCTTATGGGITTGTTGCCMTTTCAGCATGGAGCTTCOCAGTnTGGGGTGTCTGGGATCMOGA
GTCAGCGGACATGAGTATTGGAGTTACTGTCATCMAMCMTATGATAMCMTGATCTTGGTCCAGCMCAGCTCM
ATGGCCCTTCAGnGTTCATCAMGAnACAGGTACAOGTAOOGATGCCATAGAGGTGACACACAMTACAMOCOGM
GATCAITTGAMTAMGAMCTGTGGGAGCMAamTOCMAGCTGGACTGCTGGTCTCOGAOGGAGGCOCMAITT
ATACAMMTAGMATCTOCACATTCCTGMGTCTGCCTMMTGGGAMTGATGGATGAGGAnACCAGGGGCGTTTA
TGCMCOCACTGMOCCATTTGTCAGCCATMAGMMTGMTCMTGMCMTGCAGTGATGATGCCAGCACATGGTC
CAGCCAMMCATGGAGTATGATGCTGTTGCMCMCACACTCCTGGATOCOCMMGAMTOGATCCATCTTGMTAC
MGTCAMGAGGAGTACTTGMGATGMCAMTGTACCAMGGTGCTGCMTTTATTTGMMATTCTTOCOCAGCAGT
TCATACAGMGAOCAGTOGGGATATCCAGTATGGTGGAGGCTATGGITTOCAGAGCCOGAMTGATGCAOGGAnGAn
TOGMTCTGGMGGATMAGMAGMGAGTTCACTGAGATCATGMGATCTGTTCCAOCATTGMGAGCTCAGAOGGCA
MMTAGTGMITTAGCTTGTCCTTCATGMMAATGCnTGITTCTACT
SEQ ID No. 4
AGCGMAGCAGGTACTGATCCAMATGGMGATnTGTGCGACMTGCTTCMTCOGATGAnGTOGAGCTTGCGGAM MACMTGMAGAGTATGGGGAGGACCTGAMATOGAMCAMCAMTTTGCAGCMTATGCACTCACTTGGMGTATGCTTCATGTATTCAGATTTTCACTTCATCMTGAGCMGGCGAGTCMTMTOGTAGMCTTGGTGATOCMATGCACTT
Hgmgcacagatttgmatmtogagggmgagatogcacmtggcctggacagtagtmacagtatttgcmcacta
CAGGGGCTGGGAMOCMAGTTTCTAOCAGAITTGTATGATTACMGGAGMTAGATTCATOGMATTGGAGTMCMG
GAGAGMGTTCACATATACTATCTGGMMGGCCMTMAMTMATCTGAGAMACACACATOCACATTTTCTOGTTC
ACTGGGGMGMATGGCCACMAGGCAGACTACACTCTOGATGMGAMGCAGGGCTAGGATCMMOCAGACTATTCA
OCATMGACMGMATGGCCAGCAGAGGCCTCTGGGAnOCTTTOGTCAGTOOGAGAGAGGAGMGAGACMTTGMGA
MGGTTTGMATCACAGGMCMTGCGCMGCTTGCOGAOCMAGTCTCOOGCOGMCTTCTCCAGCCTTGMMTnT
AGAGCCTATGTGGATGGAnOGMOOGMOGGCTACAnGAGGGCMGCTGTCOCMATGTOCMAGMGTMATGCTA
GMTOGMOCTmTTGMMCMCAOCAOGAOCACTTAGACTTCOGMTGGGCCTCOCTCTTCTCAGCGGTCCMGn
OCTGCTGATGGATGCCTTMAMTMGCATTGAGGACOCMGTCATGMGGAGAGGGMTAOOGCTATATGATGCMTC
MATGCATGAGMCATTCTTTGGATGGMGGMCOCMTGTTCTTMACCACAOGMMGGGMTMATOCMATTATC
nCTGTCATGGMGCMGTACTGGCAGMCTGCAGGACAnGAGMTGAGGAGMAMTOCMAGACTAMMTATGM
GAMACMGTCAGCTAMGTGGGCACTTGGTGAGMCATGGCAOCAGMMGGTAGACnTGAOGACTGTAMGATGTA
GGTGAITTGMGCMTATGATAGTGATGMOCAGMTTGAGGTOGCTTGCMGnGGATTCAGMTGAGTTTMCMGG
CATGCGMCTGACAGATTCMGCTGGATAGAGCTOGATGAGATTGGAGMGATGTGGCTaMTTGMCACATTGCMG
CATGAGMGGAMTATTTCACATCAGAGGTGTCTCACTGCAGAGCCACAGMTACATMTGMGGGGGTGTACATCMT
ACTGCCTTGCTTMTGCATCTTGTGCAGCMTGGATGAITTaMnMrTOCMTGATMGCMGTGTAGMCTMGG
AGGGMGGCGMAGACCMCTTGTATGGTTTCATCATMMGGMGATCOCACTTMGGMTGACACOGAOGTGGTAM
CnTGTGAGCATGGAGTnTCTCTCACTGAOCCMGACTTGMOCACACMATGGGAGMGTACTGTGTTCTTGAGATA
GGAGATATGCTTCTMGMGTGCCATAGGCCAGGTTTCMGGCOCATGTTCTTGTATGTGAGMCMATGGMOCTCM
MATTAMATGAMTGGGGMTGGAGATGAGGCmGCCTCCTOCAGTCACTTCMCMATTGAGAGTATGATTGMGC
TGAGTCCTCTGTCAMGAGAMGACATGACCAMGAGncnTGAGMCMATCAGAMCATGGCOCATTGGAGAGTOC
OCCAMGGAGTGGAGGMAGnOCATTGGGMGGTCTGCAGGACnTATTAGCMAGTOGGTATTCMCAGCTTGTATG
CATCTCCACMCTAGMGGATTTTCAGCTGMTCMGMMCTGCTTCTTATOGTTCMGCTCTTAGGGACMOCTGGA
ACCTGGGAOCTTTGATCTTGGGGGGCTATATGMGCMTTGAGGAGTGCOMrTMTGATOCCTGGGTTTTGCTTMT
GCTTCTTGGTTCMCTOCTTOCTTACACATGCATTGAGTTAGTTGTGGCAGTGCTACTATTTGCTATOCATACTGTCCA
AAAAAGTAOCTTGmCTACT
SEQ ID No. 5
AGCMMGCAGGGTAGATMTCACTCACTGAGTGACATCMMTCATGGCGTCOCMGGCAOCMAOGGTCTTAOGMC AGATGGAGACTGATGGAGMOGCCAGMTGCCACTGAMTCAGAGCATCOGTOGGMMATGAnGGTGGMTTGGAOG ATTCTACATCCAMTGTGCAOOGMCTTMACTCAGTGAnATGAGGGAOGGTTGATOCMMCAGCTTMCMTAGAG AGMTGGTGCTCTCTGCnTTGAOGAMGGAGMATAMTAOCTGGMGMCATCOCAGTGCGGGGAMGATCCTMGA MACTGGAGGACCTATATACAGGAGAGTMAOGGMAGTGGATGAGAGMCTCATOCTTTATGACMAGMGAMTMG GCGMTCTGGCGCCMGCTMTMTGGTGAOGATGCMOGGCTGGTCTGACTCACATGATGATCTGOMTOCMTTTG MTGATGCMCTTATCAGAGGACMGAGCTCTTCTTOGCACOGGMTGGATOCCAGGATGTGCTCTCTGATGCMGCTT CMCTCTCOCTAGGAGGTCTGGAGCOGCAGGTGCTGCAGTCMAGGAGTTGGMCMTGGTGATGGMTTGGTCAGGAT GATCMAOGTGGGATCMTGATOGGMCTTCTGGAGGGGTGAGMTGGAOGMMACMGMTTGCTTATGMAGMTG TGCMCATTCTCMAGGGMATTTCAMCTGCTGCACMMAGCMTGATGGATCMGTGAGAGAGAGCOGGMCOCAG GGMTGCTGAGTTOGMGATCTCACnTTCTAGCAOGGTCTGCACTCATATTGAGAGGGTOGCTTGCTCACMGTOCTGOCTGCCTGCCTGTGTGTATGGAOCTGCOGTAGCCAGTGGGTAOGACnTGAMGAGAGGGATACTCTCTAGTOGGMTA
GAOCCnTCAGACTGCTTCAMACAGCCMGTGTACAGCCTMTCAGACCAMTGAGMTCCAGCACACMGAGTCMC
TGGTGTGGATGGCATGCCATTCTGCOGCAITTGMGATCTMGAGTAnMGCTTCATCMAGGGAOGMGGTGGTCOC
MGAGGGMGCnTOCACTAGAGGAGTTCMMTGCTTCCMTGAMATATGGAGACTATGGMTCMGTACACTTGM
CTGAGMGCAGGTACTGGGCCATMGGAOCAGMGTGGAGGMACACCMTCMCAGAGGGCATCTGCGGGCCMATCA
GCATACMOCTAOCTTCTCAGTACAGAGMATCTOCCTnTGACAGMCMOCATTATGGCAGCATTCACTGGGMTAC
AGAGGGGAGMCATCTGACATGAGGAOOGAMTCATMGGATGATGGMAGTGCMGACCAGMGATGTGTCnTOCAG
GGGCGGGGAGTCTTOGAGCTCTOGGAOGMMGGCAGCGAGCCOGATOGTGCCTTOCTTTGACATGAGTMTGMGGAT
CTTATTTCTTOGGAGACMTGCAGAGGAGTAOGACAMTMAGMMATACOCTTGITTCTACT
SEQ ID No. 6
AGCGMAGCAGGGGTTTMMTGMTOCMATCAGMMTMTMOCATTGGATCMTCTGTATGGTAGTOGGACTMT
TAGCCTAMMTGCMATAGGAMTATMCCTCMTATGGAnAGCCATTCMTTCAMCTGGMGTCMMCCATACT
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SEQ ID No. 7
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权利要求
基因重组的H9N1亚型禽流感病毒，其特征在于其组成包括具有H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Hubei/C1/2007(H9N2)的HA基因以及H1N1流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的7个内部基因PB2、PB1、PA、NP、NA、M和NS，其保藏号为CCTCC V200913。
2.按权利要求1所述的基因重组的H9W亚型禽流感病毒，其特征在于所述的HA基 因具有序列表SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。
3.按权利要求1或2所述的基因重组的H9W亚型禽流感病毒，其特征在于所述的 HlNl流感病毒A/PR/8/34 (HlNl)的7个内部基因PB2、PB1、PA、NP、NA、M和NS具有序列表 SEQ ID NO. 2 SEQ ID NO. 8所示的核苷酸序列。
4.权利要求1所述的基因重组的H9W亚型禽流感病毒在制备预防H9N2亚型禽流感病 毒感染的灭活疫苗的应用。
5.按权利要求4所述的应用，其特征在于所述的预防H9N2亚型禽流感病毒感染的灭活 疫苗在区分免疫(H9m)或野毒(H9N2)感染状况中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种基因重组的H9N1亚型禽流感病毒，以及该病毒在制备预防H9N2亚型禽流感病毒感染的灭活疫苗中的应用，该病毒已于2009年8月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC V200913，包括具有H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Hubei/C1/2007(H9N2)的HA基因以及H1N1流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的7个内部基因PB2、PB1、PA、NP、NA、M和NS，上述的基因重组的H9N1亚型禽流感病毒在制备预防H9N2亚型禽流感病毒感染的灭活疫苗的应用以及H9N1亚型禽流感灭活疫苗在区分免疫(H9N1)或野毒(H9N2)感染状况中的应用。
文档编号A61P31/16GK101914500SQ200910272278
公开日2010年12月15日 申请日期2009年9月28日 优先权日2009年9月28日
发明者伍锐, 刘泽文, 周丹娜, 徐涤平, 杨克礼, 梁望旺, 段正赢, 熊忠良, 邓均华 申请人:湖北省农业科学院畜牧兽医研究所
技术领域：
本发明涉及一种基因重组的H9m亚型禽流感病毒，以及该病毒在制备预防H9N2 亚型禽流感病毒感染的灭活疫苗的应用，该病毒已于2009年8月3日保藏于中国典型培 养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，其分类命名为流感病毒H9W亚型A/Wuhan/ Re-l/2009(H9m)，保藏编号为 CCTCC NO :V200913。
背景技术：
(Avian Influenza, Al)(Avian Influenza Virus, AIV) 引起的禽类感染和/或疾病综合征。AIV在分类上属于病毒界(Vira)...正粘病毒科 (Orthomyxoviridae)...流感病毒属(Influenza Virus A and B)…禽流感病毒(Avian InfluenzaVirus)。AIV的基因组由8个单股负链RNA片段组成。根据表面蛋白抗原性不同， AIV被分为16个血凝素(HA)和9个神经氨酸酶(NA)亚型。HA是AIV主要的免疫原蛋白， 它可以诱导机体产生抗体介导的特异性体液免疫应答，抗HA的抗体可以通过干扰病毒与唾 液酸受体的结合或者病毒囊膜与内吞体膜的融合过程从而中和病毒的感染。H9N2亚型AIV 于1966年首次在美国的火鸡中首次出现，目前在全球的野禽和家禽中广泛分布与流行。1998 年，研究者首次从我国大陆的人体样品中分离到了 H9N2禽流感病毒，之后从香港以及我国大 陆的患者体内再次分离到了该亚型病毒；2003年和2007年，研究者多次从香港的患者体内分 离到了 H9N2禽流感病毒。H9N2禽流感病毒频繁感染人的事件，标志着该亚型病毒具有公共 卫生意义。随着H9N2禽流感病毒对人类造成的威胁，人们已经意识到，阻止H9N2禽流感病毒 向人群扩散的最有效的途径，就是有效的控制动物源性H9N2禽流感病毒。自1996年以来，我 国养禽业一直受到H9N2禽流感的困扰，尤其是1998年，该病给我国养禽业造成了灾难性损 失。鸡胚生产的H9N2全病毒灭活苗在养禽业的应用使该病的控制取得了较好的效果，但由于 现地分离的野毒株鸡胚适应性差，致使现行使用的疫苗存在成本高、免疫期短等缺点；另外， 用现行的疫苗免疫动物后，无法区分是免疫后或者野毒感染后产生的抗体。为解决上述的难题，人们开发了标记疫苗(marker vaccine)或称之为DIVA疫苗 (differentiating infected from vaccinated animals),就是用一禾中疫苗给动物免疫后， 通过与之相配套的血清学检测方法，可将免疫动物和自然感染动物区分开来。在1999-2001 年意大利暴发H7W禽流感期间，采用H7N3分离株制备成了灭活疫苗，接种鸡群后，动物产 生了高效价的抗HA抗原的抗体，且能够完全抵抗H7W禽流感病毒的攻击。同时，免疫动物 产生了针对N3的NA抗体，借助于试剂盒可以将免疫家禽和感染家禽区分开来。利用这种 标记疫苗意大利有效地消灭了由H7W禽流感病毒引起的流行。在实施DIVA策略时，疫苗 毒株的产生是一个关键性的问题。目前，借助反向遗传学操作技术，可以方便地产生目的 病毒毒株。
发明内容
本发明的目的是提供一种基因重组的H9m亚型禽流感病毒，命名为A/Wuhan/Re-1/2009 (H9N1)，该病毒具有高度鸡胚适应性，但对鸡及鸡胚无致病性；用该病毒作为毒 种，在鸡胚中增殖并灭活后，制备成油乳剂灭活疫苗，对我国流行的H9N2亚型禽流感病毒 具有特异免疫原性，另外，通过对免疫动物特异性的NA抗体的检测，可以区分免疫(Η·1) 或野毒(H9N2)感染状况。本发明的目的是通过以下的技术方案实现基因重组的H9m亚型禽流感病毒，其 特征在于其组成包括具有H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Hubei/Cl/2007 (H9N2)的HA 基因以及HlNl流感病毒A/PR/8/34 (HlNl)的7个内部基因PB2、PBl、PA、NP、ΝΑ、M禾口 NS, 其保藏号为CCTCC-V200913。该病毒已于2009年8月3日由中国典型培养物保藏中心收到，并登记入册。该培 养物的存活性已于2009年8月31日检测完毕，结果为存活。按上述方案，所述的HA基因具有序列表SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。按上述方案，所述的Hmi流感病毒A/PR/8/34(HlNl)的7个内部基因PB2、PBU ΡΑ、ΝΡ、ΝΑ、M和NS具有序列表SEQ ID NO. 2 SEQ ID NO. 8所示的核苷酸序列。上述的基因重组的H9m亚型禽流感病毒对我国流行的H9N2亚型禽流感病毒具有 特异免疫原性，具有高度鸡胚适应性，但对鸡和鸡胚无致病性。上述的基因重组的H9m亚型禽流感病毒在制备预防H9N2亚型禽流感病毒感染的 灭活疫苗的应用。上述的H9m亚型禽流感灭活疫苗在区分免疫(H9N1)或野毒(H9N2)感染状况中 的应用。本发明采用的技术是将病毒RNA逆转录成cDNA，由含病毒基因组cDNA的质粒获 取RNA病毒的一种技术，借助反向遗传操作技术，将我国流行的H9N2亚型禽流感病毒A/ Chicken/Hubei/Cl/2007 (H9N2)的HA基因克隆入表达载体pHW2000，同时，将流感病毒A/ PR/8/34 (HlNl)的 7 个基因(PB2、PBU ΡΑ、ΝΡ、ΝΑ、M 和 NS)也克隆入表达载体 pHW2000， 获取了 8 个表达质粒，分别命名为 ρ冊-H9-HA，pHW-PR8-PB2、ρ冊-PR8-PB1、pHW-PR8_PA、 ρ冊-PR8-NP、ρ冊-PR8-NA、ρ冊-PR8-M和ρ冊-PR8-NS。将上述的8个表达质粒共转染293Τ 细胞，获取了基因重组的H9W亚型禽流感病毒。用上述的基因重组的H9m亚型禽流感病毒，经鸡胚增殖并灭活后制备成灭活疫 苗，免疫动物后产生高滴度的HI抗体，能够预防H9N2亚型禽流感病毒的感染。用上述的基因重组的H9m亚型禽流感病毒灭活疫苗免疫动物后，检测特异性NA 抗体，能够区分免疫(H9m)或野毒(H9N2)感染状况。本发明的有益效果1.本发明利用流感病毒的反向遗传学操作技术，获取了 H9W重组禽流感病毒(A/ Wuhan/Re-l/2009(H9m))。该病毒保持了我国H9亚型禽流感病毒特有的抗原性，以此作为 生产疫苗毒株，将对H9N2亚型禽流感流行株的感染产生良好的特异保护；2.现行使用的禽流感疫苗均为鸡胚繁殖的全病毒灭活疫苗，疫苗质量与病毒 抗原含量直接相关。本发明的基因重组的H9m亚型禽流感病毒含有鸡胚适应株A/ PR/8/34 (HlNl)的6个内部基因(PB2、PB1、ΡΑ、ΝΡ、M和NS)，病毒生长滴度与野毒相比，可 提高10倍左右，以此为疫苗株生产的疫苗，可大大降低疫苗生产成本，提高疫苗质量；3.能否区分疫苗免疫与野毒感染，这也是禽流感疫苗使用的一个影响因素，本发明的基因重组的H9m亚型禽流感病毒保留了 A/PR/8/34 (HlNl)的NA基因，通过对免疫动 物特异性NA抗体的检测，可以区分动物的免疫与野毒感染状况。
具体实施例方式下面结合实施例进一步介绍本发明，但是实施例不会构成对本发明的限制。实施例1 本发明基因重组的亚型禽流感病毒(A/Wuhan/Re-l/2009(H9m))，保藏号为 CCTCC-V200913,其组成包括具有 H9N2 亚型禽流感病毒 A/Chicken/Hubei/Cl/2007 (H9N2) 的HA基因以及Hmi流感病毒A/PR/8/34 (HlNl)的7个内部基因PB2、PB1、PA、NP、NA、M和 NS，其制备方法包括以下几个步骤1.以我国 H9N2 亚型禽流感病毒 A/Chicken/Hubei/Cl/2007(H9N2)株 RNA 为模板， 以特异性引物RT-PCR扩增HA全长cDNA，并插入含有RNA聚合酶I，RNA聚合酶II的RNA双 向转录载体PHW2000的BsmB I位点。2. RT-PCR扩增流感病毒高滴度鸡胚适应株的7个基因片段PB2，PBl，PA, NP, NA, M和NS全基因cDNA，分别按上述方法插入pHW2000中，获取了 8个表达质粒，分别命名为 PHW-H9-HA, pHW-PR8-PB2、pHW-PR8_PBl、pHW-PR8_PA、pHW_PR8-NP、pHW_PR8-NA、pHW-PR8_M 和 pHW-PR8-NS。3.利用脂质体转染法将上述8个基因的双向表达质粒同时导入单层的293T细胞， 72小时收获细胞上清，接种10日龄鸡胚尿囊腔，72小时后收取尿囊液并检测血凝(HA)活 性。HA阳性样品即为基因重组的H9W亚型禽流感病毒。实施例2 基因重组的H9W亚型禽流感病毒的生长特性将基因重组的H9W亚型禽流感病毒10倍稀释后(KT1-I(Tiq)，接种于10日龄鸡 胚，每胚0. 2ml，每个剂量组5枚鸡胚。35°C培养，72小时后收集鸡胚尿囊液并检测血凝(HA) 活性，其HA效价可达1024，而鸡胚半数感染量(EID5tl)可达IO1q 3EID5cAiI,表明该疫苗毒株 生长特性良好。实施例3 基因重组的H9W亚型禽流感病毒的致病性分析将基因重组的H9W亚型禽流感病毒病毒10倍稀释后，接种10日龄鸡胚，每胚 0. 2ml。35°C培养，每隔6小时观察鸡胚，收集死亡鸡胚，直至接种后7天，统计鸡胚的平均 死亡时间(MDT)。实验结果显示，重组病毒的MDT > 168小时，表明该重组病毒对鸡胚无致 病性。另外，将10倍稀释后的基因重组的H9m亚型禽流感病毒接种7日龄鸡，观察接种 后的临床症状、发病情况和死亡情况，连续观察21天。结果显示，病毒感染后，实验鸡无任 何临床症状、全部存活，表明该病毒对鸡无致病性、安全。实施例4 基因重组的H9W亚型禽流感病毒的抗原性分析将我国2000-2007年流行的18个H9N2禽流感病毒地方分离株多次免疫兔子后， 制备成高免血清。以基因重组的H9m亚型禽流感病毒与上述的高免血清进行HI实验，测定重组病毒的抗原性。结果显示，基因重组的H9m亚型禽流感病毒能与所有的高免血清均 发生交叉反应，其HI效价> 640，表明该病毒的免疫原性好。实施例5 油乳剂灭活疫苗免疫动物后诱导的抗体反应将基因重组的H9W亚型禽流感病毒接种10日龄鸡胚，72小时后收获病毒尿囊液 (彡IO8EID5ciAil)，加入终体积为0. 的甲醛进行灭活，灭活检验合格的病毒尿囊液按水 相与油相比例为1 1.5加入油佐剂，制备成油乳剂灭活疫苗。4-6周龄雌性BALB/c小鼠 免疫油乳剂灭活疫苗0. Iml/只，不同日龄的鸡(7日龄、14日龄和36周龄)免疫油乳剂灭 活疫苗，分别为0. 25ml/只、0. 25ml/只和0. 5ml/只，免疫后28天，采集血清测定HI抗体效 价。结果显示，BALB/c小鼠免疫后14天的HI抗体效价彡256，28天后彡1024;不同日龄鸡 (1周龄、2周龄和36周龄)免疫14天后的HI抗体效价彡256，28天后彡1024。实施例6 油乳剂灭活疫苗的保护效力4-6周龄雌性BALB/c小鼠免疫油乳剂灭活疫苗0. Iml/只，不同日龄的鸡(7日龄、 14日龄和36周龄)免疫油乳剂灭活疫苗分别为0. 25ml/只、0. 25ml/只和0. 5ml/只，免疫 后28天，用H9N2禽流感病毒进行攻击。观察感染动物的临床症状、发病情况和死亡情况， 连续监测21天。结果显示，免疫组BALB/c小鼠全部存活(保护率100%)，对照组全部死 亡；不同日龄的免疫鸡无任何临床症状且全部存活，而对照组的鸡出现明显的临床症状，其 死亡率可达25%。实施例7:血清学鉴别诊断以H9W基因重组禽流感油乳剂灭活疫苗免疫14日龄鸡20只，0. 25ml/只，免疫后 28天收集血清；同时，以IO7EID5tl剂量的H9N2禽流感病毒感染14日龄鸡20只，免疫后28 天收集血清。以N2为诊断抗原，采用WHO推荐的标准NI试验方法，对H9W基因重组禽流 感油乳剂灭活疫苗免疫的血清和H9N2禽流感病毒感染的血清进行检测。结果显示，免疫油 乳剂灭活疫苗的所有鸡均为阴性，而H9N2禽流感病毒感染的血清均呈阳性，这表明采用血 清学检测方法可以区分动物的免疫与感染。基因重组的A/Wuhan/Re-1/2009 (H9N1)病毒基因序列SEQ ID No. 1AGCMMGCAGGGGMTTTCACMOCAGTCMMTGGMACMTATCACTMTAGCTATACTACTAGTAGTMCAGTMGCMTGCAGATAMATCTGCATOGGCTAOCMTCMCMACTCCACAGMCCTGTGGATAOGCTMCAGMMCMTGTOCCTGTGACACATGCTMAGAMTGCTCCACACAGAGCACMTGGGATGCTGTGTGCMCAMTCTGGGACATOCTCTCATTCTAMCAOCTGTAOCATTGMGGACTGATCTATGGCMOCCTTCTOGTGATCAGCTGTTGGGAGGAGGMMTGGTOCTACATOGTOGMAGACCATOGGCOGTTMTGGMTGTGTTAOCCTGGGMTGTAGMMOCTAGAGGMCTMGATC
ACTCTTTAGTTCTGCTAGnOCTAOCMAGAMTOGGATCnTOCAGACAOGATCTGGMTGTGTCTTACMTGGMCAAGCAMGCATGTTCAGATTCATTCTACAGMGCATGAGATGGCTGACTCMMGMCACOGCTTAOCCTATTCMGAOGOCCMTACACMATMTAGAGGMAGAaMTCTTTTCATGTGGGGCATMATCAOCCAOCCAOOGATACTGTACAGACMAITTGTACACMGGACOGACACMCMCMGTGTGACMCAGAGGATATMCTAGMOCTTCAMOCMTGATAGGGOCMGGCCOCTTGTCMTGGTCAGCAGGGGAGAMTGATTAnATTGGTOGGTATTMMCCAGGTCAGACATTGCGM
TMGATOCMTGGGMTCTMTTGCTOCATGGTATGGACACATTCTTOCAGGAGAGAGCCAOGGMGMTCCTGMGACTGAITTMACAGTGGTMCTGTGTAGTGCMTGTCAGACTGMAGAGGTGGCTTAMCAOCACATTGCOGTTCCACMTGTCAGTMGTATGCAITTGGGMCTGQXAMGTATGnGGAGTAMGAGTCTCAGACTGGCAGTTGGTCTMGAMTGTGCCTGCTAGATCMGTAGAGGACTATTTGGGGCTATAGCTGGTTTCATAGAGGGAGGTTGGTCAGGGTTAGTOGCTGGnGGTATGGCTTOCAGCATTCAMTGATCMGGGGTAGGTATGGCTGCAGATAGAGGGTCMCTCMAGGGCMTTGACMMTMCATOCMAGTGMTMTATAGTOGATAMATGMCMGCAGTATGMMTATTGATCATGMTTCAGCGAGGnGAMCTAGACTCMTATGATCMTMTMGATTGATGATCAMTACMGACATATGGGCTTATMTGCAGMTTGCTAGTGCTGCTTGAMATCAGAMACACTOGATGMCATGATGCAMTGTGMCMTCTATATMCAMGTGMGAGGGCACTGGGTTCCMTGCCATGGMGAOGGGAMGGATGTITTGAGCTATAOCATMATGTGCTGATCAGTGCATGGAGACMnOGGMOGGGAOCTATMCAGGAGAMGTATMAGAGGMGCMMCTAGMAGACAGMMTAGMGGGGTCMGCTGGMTCTGMGGMCTTACAMATOCTCACCATTTATTOGACTGTOGCCTCATCTCTTGTGATTGCMTGGGGTTTGCTGCCTTCTTGTTCTGGGCCATGTOCMTGGATCTTGCAGATGCMCAITTGTATATAMTGGCAMMCAOCCTTGTTTCTACTSEQ ID No. 2AGCGMAGCAGGTCAMTATATTCMTATGGAMGMTAMAGMCTMGAMTCTMTGTOGCAGTCTOGCAOCOGCGAGATACTCACMMACCAOOGTGGACCATATGGCCATMTCMGMGTACACATCAGGMGACAGGAGMGMOCCAGCACTTAGGATGMATGGATGATGGCMTGMATATOCMTTACAGCAGACMGAGGATMOGGAMTGATTCCTGAGAGAMTGAGCMGGACAMCnTATGGAGTAMATGMTGATGCOGGATCAGACOGMTGATGGTATCACCTCTGGCTGTGACATGGTGGMTAGGMTGGAOCMTGACMATACAGTTCATTATCCAMMTCTACAMACTTATTTTGMAGAGTOGAMGGCTMAGCATGGMCCnTGGCCCTGTOCATTTTAGMACCMGTCMMTAOGTOGGAGAGnGACATAMTCCTGGTCATGCAGATCTCAGTGCCMGGAGGCACAGGATGTMTCATGGMGnGTTTTCOCTMOGMGTGGGAGCCAGGATACTMCATOGGMTOGCMCTMOGATMOCMAGAGMGMAGMGMCTCCAGGATTGCAMAITTCTOCTTTMTGCTTGCATACATGTTGGAGAGAGMCTGGTOOGCMMOGAGAnOCTCOCAGTGGCTGGTGGMCMGCAGTGTGTACATTGMGTGTTGCATTTGACTCMGGMCATGCTGGGMCAGATGTATACTOCAGGAGGGGMGTGAGGMTGATGATGnGATCMAGCTTGATTAnGCTGCTAGGMCATAGTGAGMGAGCTGCAGTATCAGCAGATCCACTAGCATCTnMT
GGAGATGTGCCACAGCACACAGATTGGTGGAMTAGGATGGTAGACATCCTTAGGCAGMCOCMCAGMGAGCMGCCGTGGATATATGCMGGCTGCMTGGGACTGAGAMTAGCTCATOCTTCAGTTTTGGTGGATTCACAITTMGAGMCMGCGGATCATCAGTCMGAGAGAGGMGAGGTGCTTAOGGGCMTCTTCMMMTGMGATMGAGTGCATGAGGGATATGMGAGTTCACMTGGTTGGGAGMGAGCMCAGCCATACTCAGMMGCMOCAGGAGAnGATTCAGCTGATAGTGAGTGGGAGAGAOGMCAGTOGAnGCOGMGCMTAMTGTGGCCATGGTATTTTCACAGGAGGAnGTATGATMAAGCAGTTAGAGGTGATCTGMITTOGTCMTAGGGCGMTCAGCGATTGMTCCTATGCATCMCTnTMGACATTTTCAGMGGATGCGMAGTGCnTTTCMMTTGGGGAGTTGMCCTATOGACMTGTGATGGGMTGAnGGGATAnGCOCGACATGACTCCMGCATOGAGATGTCMTGAGAGGAGTGAGMTCAGCAMATGGGTGTAGATGAGTACTCCAGCAOGGAGAGGGTAGTGGTGAaMTGAOOGGTnTTGAGMTOOGGGAOCMOGAGGAMTGTACTACTGTCTCOOGAGGAGGTCAGTGAMCACAGGGMCAGAGMACTGACMTMCTTACTCATOGTCMTGATGTGGGAGATTMTGGTCCTGMTCAGTGTTGGTCMTACCTATCMTGGATCATCAGMACTGGGAMCTGTTMMTTCAGTGGTOCCAGMCOCTACMTGCTATACMTMMTGGMITTGMCCATTTCAGTCTTTAGTAOCTMGGCmTAGAGGCCMTACAGTGGGTTTGTMGMCTCTGTTCCMCMATGAGGGATGTGCTTGGGACATTTGATACOGCACAGATMTMMCTTCTTOCCTTOGCAGCCGCTCCAOCMAGCAMGTAGMTGCAGTTCTCCTCAITTACTGTGMTGTGAGGGGATCAGGMTGAGMTACTTGTM
7GGGGCMTTCTCCTGTATTCMCTACMCMGGCCAOGMGAGACTCACAGnCTOGGAMGGATGCTGGCACTTTMC
TGMGAOCCAGATGMGGCACAGCTGGAGTGGMTCOGCTCTTCTGAGGGGATTCCKMTCTGGGCMAGMGACAGG
AGATATGGGCCAGCATTMGCATCMTGMCTGAGCMCCTTGCGMAGGAGAGMGGCTMTGTGCTMTTGGGCMG
GAGAOGTGGTGTTGGTMTGMAOGAMAOGGGACTCTAGCATACTTACTGACAGCCAGACAGCGACCAMAGAMTOG
GATGGCCATCAMTAGTGTOGMTAGTTTAMMOGAOCTTGITTCTACT
SEQ ID No. 3
AGCGMAGCAGGCAMOCAITTGMTGGATGTCMTCOGACCTTACnTTCTTMMGTGCCAGCACMMTGCTATM
GCACMCnTOCCTTATAOOGGAGACOCTCOCTACAGCCATGGGACAGGMCAGGATACACCATGGATACTGTCMCAG
GACACATCAGTACTCAGAMAGGGMGATGGACMCAMCAOOGAMCTGGAGCAOOGCMCTCMaimTGATGGG
OCACTGCCAGMGACMTGMCCMGTGGTTATGCCCMACAGATTGimMTGGMGCMTGGCTTTCCTTGAGGMT
OCCATCCTGGTATnTTGMMCTOGimMTGAMOGATGGAGCTTGTTCAGCAMCAOGAGTAGACAGGCTGACACA
AGGCOGACAGACCTATGACTGGACTCTAMTAGAMCCAGCCTGCTGCMCAOMTGGCCMCACMTAGMGTGTTC
AGATCAMTGGCCTCAOGGCCMTGAGTCTGGMGGCTCATAGACTTOCTTMGGATGTMTGGAGTCMTGMCMAG
MGAMTGGGGATCACMCTCATnTCAGAGAMGAGAOGGGTGAGAGACMTATGACTMGAMATGATMCACAGAG
MCMTAGGTMMGGMGCAGAGATTGMCAMAGGAGnATaMTTAGAaMTGAOCCTGMCACMTGACCAM
GATGCTGAGAGAGGGMGCTMMOGGAGAGCAMTGCMCOCCAGGGATGCAMTMGGGGGTTTGTATACnTGTTG
AGACACTGGCMGMGTATATGTGAGMACTTGMCMTCAGGGTTGCCAGnGGAGGCMTGAGMGAMGCMAGn
GGCAMTCTTGTMGGMGATGATGAaMTTCTCAGGACAOOGMCTTTCTTTCACCATCACTGGAGATMCACCAM
TGGMOGAMATCAGMTOCTOGGATGTTnTGGCCATGATCACATATATGACCAGAMTCAGCCOGMTGGTTCAGM
ATGTTCTMGTAnGCTCCMTMTCTTCTCAMCMMTGGCGAGACTGGGAMAGGGTATATGTTTGAGAGCMGAG
TATGMACTTAGMOCCAMTAOCTGCAGAMTGCTAGCMGCATTGAITTGAMTATTTCMTGATTCMCMGMAG
MGAnGMMMTOOGAOOGCTCTTMTAGAGGGGACTGCAimTGAGCOCTGGMTGATGATGGGCATGTTCMTA
TCTTMGCACTGTAnAGGCGTCTOCATOCTGMTCTTGGACAMAGAGATACACCMGACTACTTACTGGTGGGATGG
TCTTCMTOCTCTGAOGATnTGCTCTGATTGTGMTGCACOCMTCATGMGGGATTCMGCOGGAGTOGACAGGITT
TATOGMCCTGTMGCTACTTGGMTCMTATGAGCMGMMAGTCTTACATMACAGMCAGGTACATTTGMTTCA
CMGimTTCTATOCTTATGGGITTGTTGCCMTTTCAGCATGGAGCTTCOCAGTnTGGGGTGTCTGGGATCMOGA
GTCAGCGGACATGAGTATTGGAGTTACTGTCATCMAMCMTATGATAMCMTGATCTTGGTCCAGCMCAGCTCM
ATGGCCCTTCAGnGTTCATCAMGAnACAGGTACAOGTAOOGATGCCATAGAGGTGACACACAMTACAMOCOGM
GATCAITTGAMTAMGAMCTGTGGGAGCMAamTOCMAGCTGGACTGCTGGTCTCOGAOGGAGGCOCMAITT
ATACAMMTAGMATCTOCACATTCCTGMGTCTGCCTMMTGGGAMTGATGGATGAGGAnACCAGGGGCGTTTA
TGCMCOCACTGMOCCATTTGTCAGCCATMAGMMTGMTCMTGMCMTGCAGTGATGATGCCAGCACATGGTC
CAGCCAMMCATGGAGTATGATGCTGTTGCMCMCACACTCCTGGATOCOCMMGAMTOGATCCATCTTGMTAC
MGTCAMGAGGAGTACTTGMGATGMCAMTGTACCAMGGTGCTGCMTTTATTTGMMATTCTTOCOCAGCAGT
TCATACAGMGAOCAGTOGGGATATCCAGTATGGTGGAGGCTATGGITTOCAGAGCCOGAMTGATGCAOGGAnGAn
TOGMTCTGGMGGATMAGMAGMGAGTTCACTGAGATCATGMGATCTGTTCCAOCATTGMGAGCTCAGAOGGCA
MMTAGTGMITTAGCTTGTCCTTCATGMMAATGCnTGITTCTACT
SEQ ID No. 4
AGCGMAGCAGGTACTGATCCAMATGGMGATnTGTGCGACMTGCTTCMTCOGATGAnGTOGAGCTTGCGGAM MACMTGMAGAGTATGGGGAGGACCTGAMATOGAMCAMCAMTTTGCAGCMTATGCACTCACTTGGMGTATGCTTCATGTATTCAGATTTTCACTTCATCMTGAGCMGGCGAGTCMTMTOGTAGMCTTGGTGATOCMATGCACTT
Hgmgcacagatttgmatmtogagggmgagatogcacmtggcctggacagtagtmacagtatttgcmcacta
CAGGGGCTGGGAMOCMAGTTTCTAOCAGAITTGTATGATTACMGGAGMTAGATTCATOGMATTGGAGTMCMG
GAGAGMGTTCACATATACTATCTGGMMGGCCMTMAMTMATCTGAGAMACACACATOCACATTTTCTOGTTC
ACTGGGGMGMATGGCCACMAGGCAGACTACACTCTOGATGMGAMGCAGGGCTAGGATCMMOCAGACTATTCA
OCATMGACMGMATGGCCAGCAGAGGCCTCTGGGAnOCTTTOGTCAGTOOGAGAGAGGAGMGAGACMTTGMGA
MGGTTTGMATCACAGGMCMTGCGCMGCTTGCOGAOCMAGTCTCOOGCOGMCTTCTCCAGCCTTGMMTnT
AGAGCCTATGTGGATGGAnOGMOOGMOGGCTACAnGAGGGCMGCTGTCOCMATGTOCMAGMGTMATGCTA
GMTOGMOCTmTTGMMCMCAOCAOGAOCACTTAGACTTCOGMTGGGCCTCOCTCTTCTCAGCGGTCCMGn
OCTGCTGATGGATGCCTTMAMTMGCATTGAGGACOCMGTCATGMGGAGAGGGMTAOOGCTATATGATGCMTC
MATGCATGAGMCATTCTTTGGATGGMGGMCOCMTGTTCTTMACCACAOGMMGGGMTMATOCMATTATC
nCTGTCATGGMGCMGTACTGGCAGMCTGCAGGACAnGAGMTGAGGAGMAMTOCMAGACTAMMTATGM
GAMACMGTCAGCTAMGTGGGCACTTGGTGAGMCATGGCAOCAGMMGGTAGACnTGAOGACTGTAMGATGTA
GGTGAITTGMGCMTATGATAGTGATGMOCAGMTTGAGGTOGCTTGCMGnGGATTCAGMTGAGTTTMCMGG
CATGCGMCTGACAGATTCMGCTGGATAGAGCTOGATGAGATTGGAGMGATGTGGCTaMTTGMCACATTGCMG
CATGAGMGGAMTATTTCACATCAGAGGTGTCTCACTGCAGAGCCACAGMTACATMTGMGGGGGTGTACATCMT
ACTGCCTTGCTTMTGCATCTTGTGCAGCMTGGATGAITTaMnMrTOCMTGATMGCMGTGTAGMCTMGG
AGGGMGGCGMAGACCMCTTGTATGGTTTCATCATMMGGMGATCOCACTTMGGMTGACACOGAOGTGGTAM
CnTGTGAGCATGGAGTnTCTCTCACTGAOCCMGACTTGMOCACACMATGGGAGMGTACTGTGTTCTTGAGATA
GGAGATATGCTTCTMGMGTGCCATAGGCCAGGTTTCMGGCOCATGTTCTTGTATGTGAGMCMATGGMOCTCM
MATTAMATGAMTGGGGMTGGAGATGAGGCmGCCTCCTOCAGTCACTTCMCMATTGAGAGTATGATTGMGC
TGAGTCCTCTGTCAMGAGAMGACATGACCAMGAGncnTGAGMCMATCAGAMCATGGCOCATTGGAGAGTOC
OCCAMGGAGTGGAGGMAGnOCATTGGGMGGTCTGCAGGACnTATTAGCMAGTOGGTATTCMCAGCTTGTATG
CATCTCCACMCTAGMGGATTTTCAGCTGMTCMGMMCTGCTTCTTATOGTTCMGCTCTTAGGGACMOCTGGA
ACCTGGGAOCTTTGATCTTGGGGGGCTATATGMGCMTTGAGGAGTGCOMrTMTGATOCCTGGGTTTTGCTTMT
GCTTCTTGGTTCMCTOCTTOCTTACACATGCATTGAGTTAGTTGTGGCAGTGCTACTATTTGCTATOCATACTGTCCA
AAAAAGTAOCTTGmCTACT
SEQ ID No. 5
AGCMMGCAGGGTAGATMTCACTCACTGAGTGACATCMMTCATGGCGTCOCMGGCAOCMAOGGTCTTAOGMC AGATGGAGACTGATGGAGMOGCCAGMTGCCACTGAMTCAGAGCATCOGTOGGMMATGAnGGTGGMTTGGAOG ATTCTACATCCAMTGTGCAOOGMCTTMACTCAGTGAnATGAGGGAOGGTTGATOCMMCAGCTTMCMTAGAG AGMTGGTGCTCTCTGCnTTGAOGAMGGAGMATAMTAOCTGGMGMCATCOCAGTGCGGGGAMGATCCTMGA MACTGGAGGACCTATATACAGGAGAGTMAOGGMAGTGGATGAGAGMCTCATOCTTTATGACMAGMGAMTMG GCGMTCTGGCGCCMGCTMTMTGGTGAOGATGCMOGGCTGGTCTGACTCACATGATGATCTGOMTOCMTTTG MTGATGCMCTTATCAGAGGACMGAGCTCTTCTTOGCACOGGMTGGATOCCAGGATGTGCTCTCTGATGCMGCTT CMCTCTCOCTAGGAGGTCTGGAGCOGCAGGTGCTGCAGTCMAGGAGTTGGMCMTGGTGATGGMTTGGTCAGGAT GATCMAOGTGGGATCMTGATOGGMCTTCTGGAGGGGTGAGMTGGAOGMMACMGMTTGCTTATGMAGMTG TGCMCATTCTCMAGGGMATTTCAMCTGCTGCACMMAGCMTGATGGATCMGTGAGAGAGAGCOGGMCOCAG GGMTGCTGAGTTOGMGATCTCACnTTCTAGCAOGGTCTGCACTCATATTGAGAGGGTOGCTTGCTCACMGTOCTGOCTGCCTGCCTGTGTGTATGGAOCTGCOGTAGCCAGTGGGTAOGACnTGAMGAGAGGGATACTCTCTAGTOGGMTA
GAOCCnTCAGACTGCTTCAMACAGCCMGTGTACAGCCTMTCAGACCAMTGAGMTCCAGCACACMGAGTCMC
TGGTGTGGATGGCATGCCATTCTGCOGCAITTGMGATCTMGAGTAnMGCTTCATCMAGGGAOGMGGTGGTCOC
MGAGGGMGCnTOCACTAGAGGAGTTCMMTGCTTCCMTGAMATATGGAGACTATGGMTCMGTACACTTGM
CTGAGMGCAGGTACTGGGCCATMGGAOCAGMGTGGAGGMACACCMTCMCAGAGGGCATCTGCGGGCCMATCA
GCATACMOCTAOCTTCTCAGTACAGAGMATCTOCCTnTGACAGMCMOCATTATGGCAGCATTCACTGGGMTAC
AGAGGGGAGMCATCTGACATGAGGAOOGAMTCATMGGATGATGGMAGTGCMGACCAGMGATGTGTCnTOCAG
GGGCGGGGAGTCTTOGAGCTCTOGGAOGMMGGCAGCGAGCCOGATOGTGCCTTOCTTTGACATGAGTMTGMGGAT
CTTATTTCTTOGGAGACMTGCAGAGGAGTAOGACAMTMAGMMATACOCTTGITTCTACT
SEQ ID No. 6
AGCGMAGCAGGGGTTTMMTGMTOCMATCAGMMTMTMOCATTGGATCMTCTGTATGGTAGTOGGACTMT
TAGCCTAMMTGCMATAGGAMTATMCCTCMTATGGAnAGCCATTCMTTCAMCTGGMGTCMMCCATACT
GGMTATGCMCCAMACAimTACCTATMMATAGCATCTGGGTMAGGAOCCMCTTCAGTGATAnMOOGGCA
ATTCATCTCnTGTOCCATCOGTGGGTGGGCTATATACAGCMAGACMTAGCATMGMTTGGTTCCAMGGAGAOGT
TnTGTCATMGAGAGamTATTTCATCTTCTCACTTGGMTGCAGGACCTTTTTTCTGACOCMGGTGCnTACTG
MTGACAGGCATTCMATGGGACTGTTMGGACAGMGCOCTTATAGGGCnTMTGAGCTGCOCTGTOGGTGMGCTC
OGTCOCOGTACMTTCMGATTTGMTOGCTTGCTTGGTCAGCMGTGCATGTCATGATGGCATGGGCTGGCTMCMT
OGGMTTTCAGGTCCAGATMTGGAGCAGTGGCTGTAnMMTACMOGGCATMTMCTGAMOCATMMAGnGG
AGGMGMAMMTGAGGACACMGAGTCTGMTGTGCCTGTGTAMTGGTTCATGTTTTACTATMTGACTGATGGCC
OGAGTGATGGGCTGGCCTOGTACAMATTTTCMGATOGMMGGGGMGCTTACTAMTCMTAGAGTTGMTGCAOC
TMTTCTCACTATGAGGMTGTTCCTGTTAOCCTGATACOGGCMAGTGATGTGTGTGTGCAGAGACAMTGGCATGGT
TOGMCOGGCOGTGGGTGTCTTTOGATCMMOCTGGATTATCMATAGGATACATCTGCAGTGGGGTnTOGGTGACA
ACOOGCGTOCCAMGATGGMCAGGCAGCTGTGGTCCAGTGTATCTTGATGGAGCMAOGGAGTAMGGGATTTTCATA
TAGGTATGGTMTGGTGITTGGATAGGMGGAOCMMGTCACAGnOCAGACATGGGITTGAGATGAITTGGGATCCT
MTGGATGGACAGAGACTGATAGTMGTTCTCTGTGAGGCMGATGTTGTGGCMTGACTGATTGGTCAGGGTATAGCG
GMGTTTOGTTCMCATCCTGAGCTMCAGGGCTAGACTGTATMGGCOGTGCTTCTGGGTTGAMTMTCAGGGGAOG
ACCTMAGMMMCMTCTGGACTAGTGCGAGCAGCAITTCITnTGTGGCGTGMTAGTGATACTGTAGATTGGTCT
TGGCCAGAOGGTGCTGAGnGCCATTCAOCATTGACMGTAGTCTGTTCMMMCTOCTTGITTCTACT
SEQ ID No. 7
AGCAMAGCAGGTAGATAnGAMGATGAGTCTTCTMCOGAGGTOGMAOGTAOGTTCTCTCTATCATOCOGTCAGGC OCOCTCMAGCOGAGATAGCACAGAGACTTGMGATGTCTTTGCAGGGMGMCAOOGATCTTGAGCTTCTCATGGMT GGCTMAGACMGAOCMTCCTGTCAOCTCTGACTMGGGGATTTTAGGAITTGTGTTCAOGCTCACOGTGCCCAGTGA GCGAGGACTGCAGCGTAGAOGCTTTGTCCAMCTGCCCTTMTGGGMOGGGGATOCMATMCATGGACAMGCAGn MACTGTATAGGMGCTCMGAGGGAGATMCATTCCATGGGGCCMAGMATCTCACTCAGTTAnCTGCTGGTGCAC nGCCAGTTGTATGGGCCTCATATACMCAGGATGGGGGCTGTGAOCACTGMGTGGCATTTGGCCTGGTATGTGCMC CTGTGMCAGATTGCTGACTOCCAGCATOGGTCTCATAGGCMATGGTGACMCMCCMTOCACTMTCAGACATGAG MCAGMTGGTnTAGCCAGCACTACAGCTMGGCTATGGAGCMATGGCTGGATOGAGTGAGCMGCAGCAGAGGCCA TGGAGCTTGCTAGTCAGGCTAGGCMATGGTGCMGCGATGAGMOCATTGGGACTCATOCTAGCTCCAGTGCTGGTCT GAMMTGATCTTCTTGAMAITTGCAGGCCTATCAGMAOGMTGGGGGTGCAGATGCMOGGTTCMGTGATCCTCT
OGCTATTGCOGCMATAimTGGGATCTTGCACTTGACATTGTGGAnCTTGATOGTCTTTTTTTCMATGCAITTACOGTOGCTTTAMTAOGGACTGAMGGAGGGCCTTCTAOGGMGGAGTGCCAMGTCTATGAGGGMGMTATOGAMGGMCAGCAGAGTGCTGTGGATGCTGAOGATGGTCATTTTGTCAGCATAGAGCTGGAGTMMMCTACCTTGTTTCTACTSEQ ID No. 8AGCAMAGCAGGGTGACAMMCATMTGGATTCMACACTGTGTCMGCnTCAGGTAGAnGCTTTCTTTGGCATGTOOGCMGCGAGTTGCAGAOCMGMCTAGGTGATGCCOCATTCCTTGATOGGCTTOGCOGAGATCAGMATOCCTMGAGGMGGGGCAGCACTCTOGGTCTGGACATOGAGACAGCCACAOGTGCTGGAMGCAGATAGTGGAGCGGATTCTGMAGMGMTOOGATGAGGCACTTMMTGACCATGGCCTCTGTAOCTGCGTOGCGTTAOCTMCTGACATGACTCTTGAGGAMTGTCMGGGACTGGTCCATGCTCATAOCCMGCAGMAGTGGCAGGCOCTCTTTGTATCAGMTGGAOCAGGCGATC
ATGGATMGMCCTCATACTGAMGCGMCTTCAGTGTGATTnTGAOOGGCTGGAGACTCTMTATTGCTMGGGCTTTCACOGMGAGGGAGCAMTGTTGGCGAMTTTCACCATTGCCTTCTCTTCCAGGACATACTGCTGAGGATGTCAMMTGCAGTTGGAGTOCTCATOGGAGGGCTTGMTGGMTGATMCACAGnOGAGTCTCTGMACTCTACAGAGAnOGCTTGGAGMGCAGTMTGAGMTGGGAGACCTOCACTCACTOCMMCAGAMOGAGMATGGCGGGMCMTTAGGTCAGMGITTGMGMATMGATGGTTGATTGMGMGTGAGACACAMCTGMGGTMCAGAGMTAGTnTGAGCMATMCATTTATGCMGCCTTACATCTATTGCTTGMGTGGAGCMGAGATMGMCnTCTCATTTCAGCTTATTTMTMTAAAAAACACOCTTGmCTACT
权利要求
基因重组的H9N1亚型禽流感病毒，其特征在于其组成包括具有H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Hubei/C1/2007(H9N2)的HA基因以及H1N1流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的7个内部基因PB2、PB1、PA、NP、NA、M和NS，其保藏号为CCTCC V200913。
2.按权利要求1所述的基因重组的H9W亚型禽流感病毒，其特征在于所述的HA基 因具有序列表SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。
3.按权利要求1或2所述的基因重组的H9W亚型禽流感病毒，其特征在于所述的 HlNl流感病毒A/PR/8/34 (HlNl)的7个内部基因PB2、PB1、PA、NP、NA、M和NS具有序列表 SEQ ID NO. 2 SEQ ID NO. 8所示的核苷酸序列。
4.权利要求1所述的基因重组的H9W亚型禽流感病毒在制备预防H9N2亚型禽流感病 毒感染的灭活疫苗的应用。
5.按权利要求4所述的应用，其特征在于所述的预防H9N2亚型禽流感病毒感染的灭活 疫苗在区分免疫(H9m)或野毒(H9N2)感染状况中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种基因重组的H9N1亚型禽流感病毒，以及该病毒在制备预防H9N2亚型禽流感病毒感染的灭活疫苗中的应用，该病毒已于2009年8月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC V200913，包括具有H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Hubei/C1/2007(H9N2)的HA基因以及H1N1流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的7个内部基因PB2、PB1、PA、NP、NA、M和NS，上述的基因重组的H9N1亚型禽流感病毒在制备预防H9N2亚型禽流感病毒感染的灭活疫苗的应用以及H9N1亚型禽流感灭活疫苗在区分免疫(H9N1)或野毒(H9N2)感染状况中的应用。
文档编号A61P31/16GK101914500SQ200910272278
公开日2010年12月15日 申请日期2009年9月28日 优先权日2009年9月28日
发明者伍锐, 刘泽文, 周丹娜, 徐涤平, 杨克礼, 梁望旺, 段正赢, 熊忠良, 邓均华 申请人:湖北省农业科学院畜牧兽医研究所
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