金钗石斛生物总碱在制备治疗老年痴呆的药物中的应用及产品的制作方法
专利名称：金钗石斛生物总碱在制备治疗老年痴呆的药物中的应用及产品的制作方法
技术领域：
本发明涉及金钗石斛生物总碱在制备治疗老年痴呆的药物中的应用及产品， 属于中药技术领域。
背景技术：
阿尔茨海默病(AD)是一种与老龄化相关的疾病，是65岁以上老年人发生痴 呆的主要病因。随着我国人口老龄化问题的出现，AD已成为家庭负担和社会医保的重要问题 。AD临床表现为进行性智能减退、精神及运动障碍，主要病理特征为老年斑(SP)、神经纤 维缠结(NFT)、血管淀粉样变性、神经元变性及缺失。AD是一种多因异质性疾病，确切病 因和发病机制尚不清楚。现有研究表明，其发病可能涉及到基因缺陷、中枢神经递质紊乱、 代谢紊乱、氧化应激、神经元凋亡、环境毒素及慢性炎症等方面。目前，国内外对老年痴呆 尚无理想的治疗方法(或药物)， 一方面继续深入研究AD的发病机理，另一方面根据AD发病 的网络学说，结合疾病的诱因，采用自由基清除剂、抗炎药、胆碱酯酶抑制药、钙阻滞药、 兴奋性氨基酸拮抗药等进行综合治疗，以减轻症状或延缓病程。药理学上， 一方面通过疾病 的基因组学、蛋白质组学研究来确认药物的靶点，是寻找相关疾病的治疗药物的理想方法， 例如，e-淀粉样前体蛋白(APP)降解酶的异常表达、M受体蛋白表达、NDMA受体表达等为确 定药物作用的靶点提供了方向；另一方面，由于AD发病机制是多因素的，因此利用中草药作 用的多耙点特点，寻找有效的AD治疗药物具有重要意义。
石斛(Dendrobium)在我国传统医学中为名贵中药材，其主要化学成分为多糖、生物碱、
氨基酸、酚类、挥发油等。石斛生物碱可引起超极化反应，并作为一种可能的e-丙氨酸或
牛磺酸的拮抗剂，具有抗肿瘤活性及免疫调节活性。有研究表明石斛提取物能显著抑制经过 细菌脂多糖(LPS)诱导的小鼠腹腔巨噬细胞分泌IL一IO、 TNF-a、 iN0S和IL一8，但其作 用机制尚不清楚，有待进一步考察研究。金钗石斛是石斛中的一种，金钗石斛提取物可拮抗 阿托品、促进肠蠕动；降低血黏度，拮抗花生四烯酸和胶原蛋白致兔血小板凝集；有抗自由 基损伤作用；拟似单胺氧化酶抑制剂，可调节单胺类递质。目前还没有关于金钗石斛提取物 对老年痴呆的相关作用研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供金钗石斛生物总碱在制备治疗老年痴呆的药物中的应用及产品 。本发明通过研究金钗石斛生物总碱对神经细胞、脑缺血模型的保护作用及对痴呆大鼠学习 记忆能力的影响，阐明了金钗石斛生物总碱治疗老年痴呆的药理作用机制，为金钗石斛药材的进一步开发应用提供了药理学依据。
本发明是这样构成的金钗石斛生物总碱在制备治疗老年痴呆的药物中的应用。 所述的金钗石斛生物总碱是从金钗石斛中提取的亲脂性总生物碱类成分。 前述金钗石斛生物总碱的制备方法为取金钗石斛药材，粉碎成粗粉，加入乙醇提取3
次，回收乙醇至无醇味，用酸溶液调PH至3 4，滤过，滤液用碱溶液调PH至IO，再用适量氯
仿萃取5 8次，收集氯仿层，回收氯仿，干燥，即得。
优选的制备方法为取金钗石斛药材，粉碎成粗粉，加入95%的乙醇回流提取3次，回收
乙醇至无醇味，用盐酸调PH至3 4，滤过，滤液用10。/。氨水调PH至10，再用适量氯仿萃取5
8次，收集氯仿层，回收氯仿，干燥，即得。
前述金钗石斛生物总碱中亲脂性总生物碱的含量》60%。
一种治疗老年痴呆的药物制剂，是以金钗石斛生物总碱为原料药，加入适量辅料制成的 口服制剂或注射剂。
所述的药物制剂为片剂、胶囊剂、颗粒剂、软胶囊、滴丸剂、糖浆剂、舌下含片或注射剂。
金钗石斛具有生津益胃、清热养阴的作用，本申请人通过对其化学成分、药理作用、作 用机制等方面进行深入细致的研究，发现金钗石斛药材中所含的生物碱成分能明显减轻缺氧 缺糖/复氧复糖致原代培养神经元损伤，对大鼠急性脑缺血模型有保护作用，可以缓解LPS诱 导的大鼠神经细胞炎症并且改善其学习记忆能力，能够改善LPS诱导的大鼠学习记忆功能减 退，减轻神经细胞调亡。试验研究的主要内容及结果如下
一.实验内容
1.采用培养大鼠原代神经细胞进行缺氧缺糖损伤，观察了金钗石斛生物总碱对神经原细 胞的保护作用
1 )采用MTT法观察了金钗石斛生物总碱对缺氧缺糖致神经细胞的损伤保护作用；
2) 采用荧光染色法、流式细胞仪从细胞形态观察金钗石斛生物总碱对神经原细胞凋亡 的影响；
3) 缺糖/复氧复糖对神经细胞线粒体膜电位(丽P)的影响及金钗石斛生物总碱的作用
4) 缺氧缺糖/复氧复糖对神经细胞内游离Ca2+的影响及金钗石斛生物总碱的作用；
5) 采用RT-PCR观察了金钗石斛生物总碱对缺氧缺糖/复氧复糖神经细胞凋亡基因 caspase-3禾口caspase-12的影卩向。2. 采用线拴法制造大鼠右侧大脑中动脉阻塞的局灶性脑缺血模型，观察金钗石斛生物总 碱对其损伤的保护作用
1) 测量脑梗死体积、缺血侧皮质及海马进行HE染色，观察病理变化；
2) 组织匀浆测定MDA、 N0的含量，SOD、 NOS的活性及MDA与SOD变化；
3) 采用Real time RT-RCR的方法，观察脑组织中caspase-3、 caspase-8 mRNA的表达。
3. 侧脑室注射脂多糖(lipopolysaccharide， LPS)诱导大鼠老年痴呆的模型，观察金 钗石斛生物总碱对脂多糖所诱导的大鼠学习记忆功能障碍的保护作用，并探讨其作用机制
1) Morris水迷宫检测大鼠的空间辨别学习记忆能力；
2) 免疫组化法检测大脑皮层及海马内腿C-II (OX-6) 、 TNF-a、 IL-1 P 、 S-100P、 iN0S及C0X-2的表达情况；免疫组织化学法检测海马内Af3 P42片断含量，并通过BI2000图像 分析系统作半定量分析；
3) Real time RT-PCR检测海马*APP695、 BACEl、 PS-1、 caspase-3、 caspase-8、 TNF-a 、 IL-1 P 、 iNOS、 NF- k b 、及COX-2的m丽表达；
4) HE染色光镜下观察神经元形态变化，电镜下观察海马神经元超微结构的改变。
4. 统计学处理
结果以f 士s表示，应用SPSS12.0统计软件分析，组间比较用单因素方差分析结合LSD检验。
二、实验结果
1.金钗石斛生物总碱(DNLA)对缺氧缺糖所致大鼠原代培养神经细胞损伤的影响
1) 与空白组比较，缺氧损伤后MTT吸光度值明显下降:各模型组与同时点空白组吸光度值 比较均有显著性差异；缺氧缺糖lh、 2h、各剂量组、缺氧4h高剂量组可提高MTT吸光度值， 与同时点模型组比较均有差异(P〈0.05);缺氧2h/复氧3h各剂量组、缺氧2h/复氧12h中、高 剂量组、缺氧2h/复氧24h高剂量组可提高MTT吸光度值，与同时点模型组比较均有差异。
2) 缺氧损伤后LDH漏出率明显升高各模型组与同时点空白组比较均有显著性差异，缺 氧lh中、高剂量组、缺氧2h各剂量组、缺氧4h高剂量组可降低LDH漏出率；缺氧/复氧3h中、 高剂量组、缺氧2h/复氧12h中、高剂量组、缺氧2h/复氧24h高剂量组使LDH漏出率下降，与 同时点模型组比较均有差异。
3) 缺氧缺糖2h/复氧复糖12h损伤后神经细胞凋亡率显著升高模型组与空白组比较有显 著性差异；金钗石斛生物总碱各剂量组均可降低细胞凋亡率，与模型组比较有差异。
4) 缺氧缺糖2h/复氧复糖12h损伤后细胞内游离钙浓度均显著升高模型组与空白组比较
5有显著性差异；各剂量组可降低细胞内游离Ca」+浓度，与模型组比较均有显著性差异。
5) 缺氧缺糖2h/复氧复糖12h损伤后丽P显著下降，模型组与空白组比较有显著性差异； 金钗石斛生物总碱各剂量组使丽P升高，与模型组比较均有显著性差异。
6) Real time RT-RCR检测结果表明，缺氧缺糖2拟复氧复糖12h损伤后casPase-3和 casPase-12表达显著升高，模型组细胞与空白组比较有显著性差异；金钗石斛生物总碱各剂 量组均可降低caspase-3和caspase-12的表达，与模型组比较有显著性差异。
7) 形态学观察缺氧损伤后细胞失去折光性，胞体轮廓模糊，突起减少或回縮、断裂， HE检测发现模型组细胞还有核固縮、浓染等现象，电镜微观结构观察线粒体肿胀，晴断裂、 模糊；金钗石斛生物总碱组损伤比模型组明显减轻。
2. 金钗石斛生物总碱(DNLA)对大脑中动脉阻塞脑缺血模型的保护作用
1) 与模型组比较，DNLA高剂量组和尼莫地平组的神经功能症状评分减少(P〈0.05); DNLA中、高剂量组和尼莫地平组的脑梗死体积縮小(P〈0.05);形态学观察HE染色发现模型 组颞叶皮质细胞水肿、细胞间隙增宽、细胞结构受损；海马颗粒细胞排列松散、紊乱，胞核 浓縮。高剂量组、尼莫地平组细胞损伤比模型组明显减轻。
2) 与模型组比较，中、高剂量组和尼莫地平组的MDA、 NO的含量减少，NOS的活性降低， SOD的活性升高(P〈0.05) ， MDA与SOD的比值减少(P〈0.05);与模型组比较，中、高剂量 组和尼莫地平组均能不同程度下调caspase-3、 caspase-8 mRNA的表达(P〈0. 05)。
3. 对脂多糖诱导的大鼠老年痴呆的模型的保护作用
1) 行为学检测结果显示，DNLA对侧脑室注射脂多糖溶液6天和13天后，与模型对照组比 较，DNLA(20mgkg—、 40mgkg—、 80mgkg—^连续灌胃给药7天和14天可以縮短大鼠在 定位航行实验中的逃避潜伏期及搜索距离，增加空间探索实验中大鼠在原安全岛所在象限的 搜索时间及原安全岛所在象限游泳距离占总距离百分比(P〈0.05)。模型大鼠的逃避潜伏期 及搜索距离较对照组明显延长(P〈0.01)，提示学习记忆减退；DNLA和布洛芬均能够縮短模 型大鼠逃避潜伏期及搜索距离。
2) 免疫组化检测结果显示，可以降低大鼠海马内OX-6、 TNF-a、 IL-1 {3 、 S-100 {3 、 iNOS、 C0X—2光密度值及TNF—a 、 IL一1 P 、 NF—k b、 iNOS禾口 C0X—2 mRNA的表达量；并呈齐U 量相关性和时效相关性。
3) LPS制模后7天和14天，光电镜下观察模型大鼠海马神经元数量明显减少，出现神经 细胞凋亡和坏死改变，减轻神经细胞的凋亡和坏死。
4) Real time RT-PCR检测结果显示，与空白组比较，模型组海马内A {3 P42片段的含量和APP695、 BACE1、 PS-1、 caspase-3、 caspase-8 mRNA的表达量明显增加；与模型组比较， DNLA (40mg kg—1 d—、 80mg kg—1 d—4均可降低海马内A {3 42片段的含量和APP哪、 BACE1、 PS-1、 caspase-3、 caspase-8 m丽的表达量，其中D亂A (40mg kg—1 d—、 80mg kg—1 d—4组与布洛芬组比较差异无非常显著性，且呈一定的剂量依赖性和时间依赖型。 三、结论
1. 金钗石斛生物总碱能明显减轻缺氧缺糖/复氧复糖致原代培养神经元损伤，其作用机 制可能涉及改善能量代谢、减少凋亡、抑制细胞内ca2+超载和抑制凋亡特异性蛋白酶等多种因素。
2. 金钗石斛生物总碱对大鼠急性脑缺血模型有保护作用，其机制可能涉及减少氧自由基 的生成，抗氧化应激，降低大鼠脑内凋亡基因转录水平，抑制神经细胞凋亡。
3. 金钗石斛生物总碱可以缓解LPS诱导的大鼠神经细胞炎症并且改善其学习记忆能力， 其作用机制可能包括l)抑制LPS激活的胶质细胞的细胞毒性反应，减少炎症所至大鼠神经 细胞的损伤；2)通过抑制iNOS的表达而减少NO的产生，以降低NO对神经细胞的损伤；3)通 过抑制C0X-2以保护神经细胞；4)通过抑制NF-k b的激活而阻断NF-k b介导的信号传导通 路，从而减轻iN0S、 C0X-2和其他诱导型基因引起的急性脑损伤。
4. 金钗石斛生物总碱能够改善LPS诱导的大鼠学习记忆功能减退，减轻神经细胞凋亡， 其机制可能与抑制海马内APP695、 BACE1、 PS-1、 caspase-3和caspase-8 mRNA的表达，降低 海马内AI3i-42片断含量有关。
与现有技术相比，本发明通过研究金钗石斛生物总碱对神经细胞、脑缺血模型的保护作 用及对痴呆大鼠学习记忆能力的影响，明确了其治疗老年痴呆的药理作用和作用机制，为金 钗石斛药材的开发应用提供了药理学依据。
具体实施例方式
本发明的实施例l:金钗石斛生物总碱的提取
取金钗石斛药材，粉碎成粗粉，加入95%的乙醇回流提取3次，回收乙醇至无醇味，用盐 酸调PH至3 4，滤过，滤液用10。/。氨水调PH至10，再用适量氯仿萃取7 8次，收集氯仿层， 回收氯仿，干燥，即得金钗石斛生物总碱；其中亲脂性总生物碱的含量为68.3%。
本发明的实施例2:金钗石斛生物总碱的提取
取金钗石斛药材，粉碎成粗粉，加入乙醇提取3次，回收乙醇至无醇味，用盐酸调PH至 3 4，滤过，滤液用氢氧化钠溶液调PH至IO，再用适量氯仿萃取5 6次，收集氯仿层，回收 氯仿，干燥，即得金钗石斛生物总碱；其中亲脂性总生物碱的含量为61.9%。
7本发明的实施例3:金钗石斛生物总碱的应用
取实施例1制得的金钗石斛生物总碱提取物50 2000毫克、硬脂酸镁O. 1 0.40毫克、羧 甲基淀粉钠4 12毫克、微晶纤维素50 100毫克，将提取物与羧甲基淀粉钠、微晶纤维素混 合，过筛，使其混匀，加入适量水或乙醇制粒，干燥后，整粒，加入硬脂酸镁，然后用冲压 装置将颗粒压制成片，即得治疗老年痴呆的片剂。该片剂口服， 一日3次，每次1 3片。
本发明的实施例4:金钗石斛生物总碱的应用
取实施例2制得的金钗石斛生物总碱提取物50 2000毫克、硬脂酸镁O. 1 0. 30毫克、羧 甲基淀粉钠4 12毫克、淀粉50 100毫克，将提取物与羧甲基淀粉钠、淀粉混合均匀，加入 适量乙醇制粒，干燥，整粒，加入硬脂酸镁，然后装入明胶胶囊中，即得治疗老年痴呆的胶 囊剂。该胶囊剂口服， 一日3次，每次1 3粒。
本发明的实施例5:金钗石斛生物总碱的应用
取金钗石斛生物总碱提取物100 5000毫克、糊精或蔗糖1 10克、矫味剂和甜味剂适量 ，将提取物与蔗糖/糊精、矫味剂和甜味剂混合均匀，加入适量水或乙醇制成软材，过筛制 粒，干燥，整粒，分装，即得治疗老年痴呆的颗粒剂。该颗粒剂口服， 一日3次，每次5 10克。
本发明的实施例6:金钗石斛生物总碱的应用
取金钗石斛生物总碱提取物100 2000毫克、聚乙醇或豆油100 2000毫克、助悬剂3 IO毫克、乳化剂3 10毫克和明胶50 100毫克、甘油10 30毫克、纯化水50 100毫克及防
腐剂适量，将明胶置于溶胶罐中，加入纯化水，7crc下加热使溶解，加入甘油和防腐剂，搅
拌均匀，真空除去气泡后保温静置，按比例将提取物与聚乙醇/豆油、乳化剂、助悬剂混合 均匀，再和制备好的明胶置于旋转压囊机，压制成软胶囊，定型，干燥，即得治疗老年痴呆
的软胶囊。该软胶囊口服， 一日3次，每次1 3粒。 本发明的实施例7:金钗石斛生物总碱的应用
取金钗石斛生物总碱提取物10 200毫克、聚乙二醇4000 20 40毫克、甲基硅油适量， 将提取物加水制成均匀糊状，再加入溶融的基质(聚乙二醇4000)液，加热熔融成澄清液体 ，倒入已预热的滴丸器中，控制滴制温度和速度，滴入甲基硅油冷凝液中，成丸后吸干冷凝 液，收集滴丸，置干燥器内，即得治疗老年痴呆的滴丸剂。该滴丸剂口服， 一日3次，每次 10 50毫克。
本发明的实施例8:金钗石斛生物总碱的应用取金钗石斛生物总碱提取物200 5000毫 克、羧甲基纤维素纳1.5克、糖精钠O. l克、矫味剂适量、防腐剂适量和纯化水100毫升，将羧甲基纤维素纳分散在热水中，冷却，然后与含有提取物、糖精钠、矫味剂和防腐剂的含水 混悬液混合，将溶液调配成所需体积并混合均匀，灭菌后分装，即得治疗老年痴呆的糖浆剂 。该糖浆剂口服， 一日3次，每次5 10毫升。
本发明的实施例9:金钗石斛生物总碱的应用取金钗石斛生物总碱提取物50 2000毫 克、可压蔗糖40 80毫克、硬脂酸镁O. 1 0.3毫克，将提取物过筛后与可压蔗糖、硬脂酸镁 混合均匀，并用冲压装置压片，即得治疗老年痴呆的舌下含片。该制剂含服， 一日3次，每 次1片。
本发明的实施例10:金钗石斛生物总碱的应用取金钗石斛生物总碱提取物10 2000毫 克，加水至1000ml，加入O. 5%活性炭，保持PH值7.0，加热微沸15分钟，冷却，滤过，加注 射用水至全量，罐装，于115i:灭菌30分钟，冷藏48小时，滤过，滤液浓縮，喷雾干燥，分 装，即得治疗老年痴呆的注射剂。该制剂注射用， 一日3次，每次5 10毫升。
权利要求
1.金钗石斛生物总碱在制备治疗老年痴呆的药物中的应用。
2.按照权利要求l所述金钗石斛生物总碱的应用，其特征在于所述 的金钗石斛生物总碱是从金钗石斛中提取的亲脂性总生物碱类成分。
3.按照权利要求1或2所述金钗石斛生物总碱的应用，其特征在于 所述金钗石斛生物总碱的制备方法为取金钗石斛药材，粉碎成粗粉，加入乙醇提取3次， 回收乙醇至无醇味，用酸溶液调PH至3 4，滤过，滤液用碱溶液调PH至IO，再用适量氯仿萃 取5 8次，收集氯仿层，回收氯仿，干燥，即得。
4.按照权利要求3所述金钗石斛生物总碱的应用，其特征在于所述 金钗石斛生物总碱的制备方法为取金钗石斛药材，粉碎成粗粉，加入95%的乙醇回流提取 3次，回收乙醇至无醇味，用盐酸调PH至3 4，滤过，滤液用10。/。氨水调PH至10，再用适量氯 仿萃取5 8次，收集氯仿层，回收氯仿，干燥，即得。
5.按照权利要求4所述金钗石斛生物总碱的应用，其特征在于所述 金钗石斛生物总碱中亲脂性总生物碱的含量》60%。
6. 一种治疗老年痴呆的药物制剂，其特征在于它是以金钗石斛生 物总碱为原料药，加入适量辅料制成的口服制剂或注射剂。
7.按照权利要求6所述治疗老年痴呆的药物制剂，其特征在于所述的药物制剂为片剂、胶囊剂、颗粒剂、软胶囊、滴丸剂、糖浆剂、舌下含片或注射剂。
全文摘要
本发明公开了金钗石斛生物总碱在制备治疗老年痴呆的药物中的应用及产品，所述的金钗石斛生物总碱是从金钗石斛中提取的亲脂性总生物碱类成分。与现有技术相比，本发明通过研究金钗石斛生物总碱对神经细胞、脑缺血模型的保护作用及对痴呆大鼠学习记忆能力的影响，明确了其治疗老年痴呆的药理作用和作用机制，为金钗石斛药材的开发应用提供了药理学依据。
文档编号A61P25/28GK101537128SQ20091030176
公开日2009年9月23日 申请日期2009年4月23日 优先权日2009年4月23日
发明者石京山 申请人:遵义医学院
技术领域：
本发明涉及金钗石斛生物总碱在制备治疗老年痴呆的药物中的应用及产品， 属于中药技术领域。
背景技术：
阿尔茨海默病(AD)是一种与老龄化相关的疾病，是65岁以上老年人发生痴 呆的主要病因。随着我国人口老龄化问题的出现，AD已成为家庭负担和社会医保的重要问题 。AD临床表现为进行性智能减退、精神及运动障碍，主要病理特征为老年斑(SP)、神经纤 维缠结(NFT)、血管淀粉样变性、神经元变性及缺失。AD是一种多因异质性疾病，确切病 因和发病机制尚不清楚。现有研究表明，其发病可能涉及到基因缺陷、中枢神经递质紊乱、 代谢紊乱、氧化应激、神经元凋亡、环境毒素及慢性炎症等方面。目前，国内外对老年痴呆 尚无理想的治疗方法(或药物)， 一方面继续深入研究AD的发病机理，另一方面根据AD发病 的网络学说，结合疾病的诱因，采用自由基清除剂、抗炎药、胆碱酯酶抑制药、钙阻滞药、 兴奋性氨基酸拮抗药等进行综合治疗，以减轻症状或延缓病程。药理学上， 一方面通过疾病 的基因组学、蛋白质组学研究来确认药物的靶点，是寻找相关疾病的治疗药物的理想方法， 例如，e-淀粉样前体蛋白(APP)降解酶的异常表达、M受体蛋白表达、NDMA受体表达等为确 定药物作用的靶点提供了方向；另一方面，由于AD发病机制是多因素的，因此利用中草药作 用的多耙点特点，寻找有效的AD治疗药物具有重要意义。
石斛(Dendrobium)在我国传统医学中为名贵中药材，其主要化学成分为多糖、生物碱、
氨基酸、酚类、挥发油等。石斛生物碱可引起超极化反应，并作为一种可能的e-丙氨酸或
牛磺酸的拮抗剂，具有抗肿瘤活性及免疫调节活性。有研究表明石斛提取物能显著抑制经过 细菌脂多糖(LPS)诱导的小鼠腹腔巨噬细胞分泌IL一IO、 TNF-a、 iN0S和IL一8，但其作 用机制尚不清楚，有待进一步考察研究。金钗石斛是石斛中的一种，金钗石斛提取物可拮抗 阿托品、促进肠蠕动；降低血黏度，拮抗花生四烯酸和胶原蛋白致兔血小板凝集；有抗自由 基损伤作用；拟似单胺氧化酶抑制剂，可调节单胺类递质。目前还没有关于金钗石斛提取物 对老年痴呆的相关作用研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供金钗石斛生物总碱在制备治疗老年痴呆的药物中的应用及产品 。本发明通过研究金钗石斛生物总碱对神经细胞、脑缺血模型的保护作用及对痴呆大鼠学习 记忆能力的影响，阐明了金钗石斛生物总碱治疗老年痴呆的药理作用机制，为金钗石斛药材的进一步开发应用提供了药理学依据。
本发明是这样构成的金钗石斛生物总碱在制备治疗老年痴呆的药物中的应用。 所述的金钗石斛生物总碱是从金钗石斛中提取的亲脂性总生物碱类成分。 前述金钗石斛生物总碱的制备方法为取金钗石斛药材，粉碎成粗粉，加入乙醇提取3
次，回收乙醇至无醇味，用酸溶液调PH至3 4，滤过，滤液用碱溶液调PH至IO，再用适量氯
仿萃取5 8次，收集氯仿层，回收氯仿，干燥，即得。
优选的制备方法为取金钗石斛药材，粉碎成粗粉，加入95%的乙醇回流提取3次，回收
乙醇至无醇味，用盐酸调PH至3 4，滤过，滤液用10。/。氨水调PH至10，再用适量氯仿萃取5
8次，收集氯仿层，回收氯仿，干燥，即得。
前述金钗石斛生物总碱中亲脂性总生物碱的含量》60%。
一种治疗老年痴呆的药物制剂，是以金钗石斛生物总碱为原料药，加入适量辅料制成的 口服制剂或注射剂。
所述的药物制剂为片剂、胶囊剂、颗粒剂、软胶囊、滴丸剂、糖浆剂、舌下含片或注射剂。
金钗石斛具有生津益胃、清热养阴的作用，本申请人通过对其化学成分、药理作用、作 用机制等方面进行深入细致的研究，发现金钗石斛药材中所含的生物碱成分能明显减轻缺氧 缺糖/复氧复糖致原代培养神经元损伤，对大鼠急性脑缺血模型有保护作用，可以缓解LPS诱 导的大鼠神经细胞炎症并且改善其学习记忆能力，能够改善LPS诱导的大鼠学习记忆功能减 退，减轻神经细胞调亡。试验研究的主要内容及结果如下
一.实验内容
1.采用培养大鼠原代神经细胞进行缺氧缺糖损伤，观察了金钗石斛生物总碱对神经原细 胞的保护作用
1 )采用MTT法观察了金钗石斛生物总碱对缺氧缺糖致神经细胞的损伤保护作用；
2) 采用荧光染色法、流式细胞仪从细胞形态观察金钗石斛生物总碱对神经原细胞凋亡 的影响；
3) 缺糖/复氧复糖对神经细胞线粒体膜电位(丽P)的影响及金钗石斛生物总碱的作用
4) 缺氧缺糖/复氧复糖对神经细胞内游离Ca2+的影响及金钗石斛生物总碱的作用；
5) 采用RT-PCR观察了金钗石斛生物总碱对缺氧缺糖/复氧复糖神经细胞凋亡基因 caspase-3禾口caspase-12的影卩向。2. 采用线拴法制造大鼠右侧大脑中动脉阻塞的局灶性脑缺血模型，观察金钗石斛生物总 碱对其损伤的保护作用
1) 测量脑梗死体积、缺血侧皮质及海马进行HE染色，观察病理变化；
2) 组织匀浆测定MDA、 N0的含量，SOD、 NOS的活性及MDA与SOD变化；
3) 采用Real time RT-RCR的方法，观察脑组织中caspase-3、 caspase-8 mRNA的表达。
3. 侧脑室注射脂多糖(lipopolysaccharide， LPS)诱导大鼠老年痴呆的模型，观察金 钗石斛生物总碱对脂多糖所诱导的大鼠学习记忆功能障碍的保护作用，并探讨其作用机制
1) Morris水迷宫检测大鼠的空间辨别学习记忆能力；
2) 免疫组化法检测大脑皮层及海马内腿C-II (OX-6) 、 TNF-a、 IL-1 P 、 S-100P、 iN0S及C0X-2的表达情况；免疫组织化学法检测海马内Af3 P42片断含量，并通过BI2000图像 分析系统作半定量分析；
3) Real time RT-PCR检测海马*APP695、 BACEl、 PS-1、 caspase-3、 caspase-8、 TNF-a 、 IL-1 P 、 iNOS、 NF- k b 、及COX-2的m丽表达；
4) HE染色光镜下观察神经元形态变化，电镜下观察海马神经元超微结构的改变。
4. 统计学处理
结果以f 士s表示，应用SPSS12.0统计软件分析，组间比较用单因素方差分析结合LSD检验。
二、实验结果
1.金钗石斛生物总碱(DNLA)对缺氧缺糖所致大鼠原代培养神经细胞损伤的影响
1) 与空白组比较，缺氧损伤后MTT吸光度值明显下降:各模型组与同时点空白组吸光度值 比较均有显著性差异；缺氧缺糖lh、 2h、各剂量组、缺氧4h高剂量组可提高MTT吸光度值， 与同时点模型组比较均有差异(P〈0.05);缺氧2h/复氧3h各剂量组、缺氧2h/复氧12h中、高 剂量组、缺氧2h/复氧24h高剂量组可提高MTT吸光度值，与同时点模型组比较均有差异。
2) 缺氧损伤后LDH漏出率明显升高各模型组与同时点空白组比较均有显著性差异，缺 氧lh中、高剂量组、缺氧2h各剂量组、缺氧4h高剂量组可降低LDH漏出率；缺氧/复氧3h中、 高剂量组、缺氧2h/复氧12h中、高剂量组、缺氧2h/复氧24h高剂量组使LDH漏出率下降，与 同时点模型组比较均有差异。
3) 缺氧缺糖2h/复氧复糖12h损伤后神经细胞凋亡率显著升高模型组与空白组比较有显 著性差异；金钗石斛生物总碱各剂量组均可降低细胞凋亡率，与模型组比较有差异。
4) 缺氧缺糖2h/复氧复糖12h损伤后细胞内游离钙浓度均显著升高模型组与空白组比较
5有显著性差异；各剂量组可降低细胞内游离Ca」+浓度，与模型组比较均有显著性差异。
5) 缺氧缺糖2h/复氧复糖12h损伤后丽P显著下降，模型组与空白组比较有显著性差异； 金钗石斛生物总碱各剂量组使丽P升高，与模型组比较均有显著性差异。
6) Real time RT-RCR检测结果表明，缺氧缺糖2拟复氧复糖12h损伤后casPase-3和 casPase-12表达显著升高，模型组细胞与空白组比较有显著性差异；金钗石斛生物总碱各剂 量组均可降低caspase-3和caspase-12的表达，与模型组比较有显著性差异。
7) 形态学观察缺氧损伤后细胞失去折光性，胞体轮廓模糊，突起减少或回縮、断裂， HE检测发现模型组细胞还有核固縮、浓染等现象，电镜微观结构观察线粒体肿胀，晴断裂、 模糊；金钗石斛生物总碱组损伤比模型组明显减轻。
2. 金钗石斛生物总碱(DNLA)对大脑中动脉阻塞脑缺血模型的保护作用
1) 与模型组比较，DNLA高剂量组和尼莫地平组的神经功能症状评分减少(P〈0.05); DNLA中、高剂量组和尼莫地平组的脑梗死体积縮小(P〈0.05);形态学观察HE染色发现模型 组颞叶皮质细胞水肿、细胞间隙增宽、细胞结构受损；海马颗粒细胞排列松散、紊乱，胞核 浓縮。高剂量组、尼莫地平组细胞损伤比模型组明显减轻。
2) 与模型组比较，中、高剂量组和尼莫地平组的MDA、 NO的含量减少，NOS的活性降低， SOD的活性升高(P〈0.05) ， MDA与SOD的比值减少(P〈0.05);与模型组比较，中、高剂量 组和尼莫地平组均能不同程度下调caspase-3、 caspase-8 mRNA的表达(P〈0. 05)。
3. 对脂多糖诱导的大鼠老年痴呆的模型的保护作用
1) 行为学检测结果显示，DNLA对侧脑室注射脂多糖溶液6天和13天后，与模型对照组比 较，DNLA(20mgkg—、 40mgkg—、 80mgkg—^连续灌胃给药7天和14天可以縮短大鼠在 定位航行实验中的逃避潜伏期及搜索距离，增加空间探索实验中大鼠在原安全岛所在象限的 搜索时间及原安全岛所在象限游泳距离占总距离百分比(P〈0.05)。模型大鼠的逃避潜伏期 及搜索距离较对照组明显延长(P〈0.01)，提示学习记忆减退；DNLA和布洛芬均能够縮短模 型大鼠逃避潜伏期及搜索距离。
2) 免疫组化检测结果显示，可以降低大鼠海马内OX-6、 TNF-a、 IL-1 {3 、 S-100 {3 、 iNOS、 C0X—2光密度值及TNF—a 、 IL一1 P 、 NF—k b、 iNOS禾口 C0X—2 mRNA的表达量；并呈齐U 量相关性和时效相关性。
3) LPS制模后7天和14天，光电镜下观察模型大鼠海马神经元数量明显减少，出现神经 细胞凋亡和坏死改变，减轻神经细胞的凋亡和坏死。
4) Real time RT-PCR检测结果显示，与空白组比较，模型组海马内A {3 P42片段的含量和APP695、 BACE1、 PS-1、 caspase-3、 caspase-8 mRNA的表达量明显增加；与模型组比较， DNLA (40mg kg—1 d—、 80mg kg—1 d—4均可降低海马内A {3 42片段的含量和APP哪、 BACE1、 PS-1、 caspase-3、 caspase-8 m丽的表达量，其中D亂A (40mg kg—1 d—、 80mg kg—1 d—4组与布洛芬组比较差异无非常显著性，且呈一定的剂量依赖性和时间依赖型。 三、结论
1. 金钗石斛生物总碱能明显减轻缺氧缺糖/复氧复糖致原代培养神经元损伤，其作用机 制可能涉及改善能量代谢、减少凋亡、抑制细胞内ca2+超载和抑制凋亡特异性蛋白酶等多种因素。
2. 金钗石斛生物总碱对大鼠急性脑缺血模型有保护作用，其机制可能涉及减少氧自由基 的生成，抗氧化应激，降低大鼠脑内凋亡基因转录水平，抑制神经细胞凋亡。
3. 金钗石斛生物总碱可以缓解LPS诱导的大鼠神经细胞炎症并且改善其学习记忆能力， 其作用机制可能包括l)抑制LPS激活的胶质细胞的细胞毒性反应，减少炎症所至大鼠神经 细胞的损伤；2)通过抑制iNOS的表达而减少NO的产生，以降低NO对神经细胞的损伤；3)通 过抑制C0X-2以保护神经细胞；4)通过抑制NF-k b的激活而阻断NF-k b介导的信号传导通 路，从而减轻iN0S、 C0X-2和其他诱导型基因引起的急性脑损伤。
4. 金钗石斛生物总碱能够改善LPS诱导的大鼠学习记忆功能减退，减轻神经细胞凋亡， 其机制可能与抑制海马内APP695、 BACE1、 PS-1、 caspase-3和caspase-8 mRNA的表达，降低 海马内AI3i-42片断含量有关。
与现有技术相比，本发明通过研究金钗石斛生物总碱对神经细胞、脑缺血模型的保护作 用及对痴呆大鼠学习记忆能力的影响，明确了其治疗老年痴呆的药理作用和作用机制，为金 钗石斛药材的开发应用提供了药理学依据。
具体实施例方式
本发明的实施例l:金钗石斛生物总碱的提取
取金钗石斛药材，粉碎成粗粉，加入95%的乙醇回流提取3次，回收乙醇至无醇味，用盐 酸调PH至3 4，滤过，滤液用10。/。氨水调PH至10，再用适量氯仿萃取7 8次，收集氯仿层， 回收氯仿，干燥，即得金钗石斛生物总碱；其中亲脂性总生物碱的含量为68.3%。
本发明的实施例2:金钗石斛生物总碱的提取
取金钗石斛药材，粉碎成粗粉，加入乙醇提取3次，回收乙醇至无醇味，用盐酸调PH至 3 4，滤过，滤液用氢氧化钠溶液调PH至IO，再用适量氯仿萃取5 6次，收集氯仿层，回收 氯仿，干燥，即得金钗石斛生物总碱；其中亲脂性总生物碱的含量为61.9%。
7本发明的实施例3:金钗石斛生物总碱的应用
取实施例1制得的金钗石斛生物总碱提取物50 2000毫克、硬脂酸镁O. 1 0.40毫克、羧 甲基淀粉钠4 12毫克、微晶纤维素50 100毫克，将提取物与羧甲基淀粉钠、微晶纤维素混 合，过筛，使其混匀，加入适量水或乙醇制粒，干燥后，整粒，加入硬脂酸镁，然后用冲压 装置将颗粒压制成片，即得治疗老年痴呆的片剂。该片剂口服， 一日3次，每次1 3片。
本发明的实施例4:金钗石斛生物总碱的应用
取实施例2制得的金钗石斛生物总碱提取物50 2000毫克、硬脂酸镁O. 1 0. 30毫克、羧 甲基淀粉钠4 12毫克、淀粉50 100毫克，将提取物与羧甲基淀粉钠、淀粉混合均匀，加入 适量乙醇制粒，干燥，整粒，加入硬脂酸镁，然后装入明胶胶囊中，即得治疗老年痴呆的胶 囊剂。该胶囊剂口服， 一日3次，每次1 3粒。
本发明的实施例5:金钗石斛生物总碱的应用
取金钗石斛生物总碱提取物100 5000毫克、糊精或蔗糖1 10克、矫味剂和甜味剂适量 ，将提取物与蔗糖/糊精、矫味剂和甜味剂混合均匀，加入适量水或乙醇制成软材，过筛制 粒，干燥，整粒，分装，即得治疗老年痴呆的颗粒剂。该颗粒剂口服， 一日3次，每次5 10克。
本发明的实施例6:金钗石斛生物总碱的应用
取金钗石斛生物总碱提取物100 2000毫克、聚乙醇或豆油100 2000毫克、助悬剂3 IO毫克、乳化剂3 10毫克和明胶50 100毫克、甘油10 30毫克、纯化水50 100毫克及防
腐剂适量，将明胶置于溶胶罐中，加入纯化水，7crc下加热使溶解，加入甘油和防腐剂，搅
拌均匀，真空除去气泡后保温静置，按比例将提取物与聚乙醇/豆油、乳化剂、助悬剂混合 均匀，再和制备好的明胶置于旋转压囊机，压制成软胶囊，定型，干燥，即得治疗老年痴呆
的软胶囊。该软胶囊口服， 一日3次，每次1 3粒。 本发明的实施例7:金钗石斛生物总碱的应用
取金钗石斛生物总碱提取物10 200毫克、聚乙二醇4000 20 40毫克、甲基硅油适量， 将提取物加水制成均匀糊状，再加入溶融的基质(聚乙二醇4000)液，加热熔融成澄清液体 ，倒入已预热的滴丸器中，控制滴制温度和速度，滴入甲基硅油冷凝液中，成丸后吸干冷凝 液，收集滴丸，置干燥器内，即得治疗老年痴呆的滴丸剂。该滴丸剂口服， 一日3次，每次 10 50毫克。
本发明的实施例8:金钗石斛生物总碱的应用取金钗石斛生物总碱提取物200 5000毫 克、羧甲基纤维素纳1.5克、糖精钠O. l克、矫味剂适量、防腐剂适量和纯化水100毫升，将羧甲基纤维素纳分散在热水中，冷却，然后与含有提取物、糖精钠、矫味剂和防腐剂的含水 混悬液混合，将溶液调配成所需体积并混合均匀，灭菌后分装，即得治疗老年痴呆的糖浆剂 。该糖浆剂口服， 一日3次，每次5 10毫升。
本发明的实施例9:金钗石斛生物总碱的应用取金钗石斛生物总碱提取物50 2000毫 克、可压蔗糖40 80毫克、硬脂酸镁O. 1 0.3毫克，将提取物过筛后与可压蔗糖、硬脂酸镁 混合均匀，并用冲压装置压片，即得治疗老年痴呆的舌下含片。该制剂含服， 一日3次，每 次1片。
本发明的实施例10:金钗石斛生物总碱的应用取金钗石斛生物总碱提取物10 2000毫 克，加水至1000ml，加入O. 5%活性炭，保持PH值7.0，加热微沸15分钟，冷却，滤过，加注 射用水至全量，罐装，于115i:灭菌30分钟，冷藏48小时，滤过，滤液浓縮，喷雾干燥，分 装，即得治疗老年痴呆的注射剂。该制剂注射用， 一日3次，每次5 10毫升。
权利要求
1.金钗石斛生物总碱在制备治疗老年痴呆的药物中的应用。
2.按照权利要求l所述金钗石斛生物总碱的应用，其特征在于所述 的金钗石斛生物总碱是从金钗石斛中提取的亲脂性总生物碱类成分。
3.按照权利要求1或2所述金钗石斛生物总碱的应用，其特征在于 所述金钗石斛生物总碱的制备方法为取金钗石斛药材，粉碎成粗粉，加入乙醇提取3次， 回收乙醇至无醇味，用酸溶液调PH至3 4，滤过，滤液用碱溶液调PH至IO，再用适量氯仿萃 取5 8次，收集氯仿层，回收氯仿，干燥，即得。
4.按照权利要求3所述金钗石斛生物总碱的应用，其特征在于所述 金钗石斛生物总碱的制备方法为取金钗石斛药材，粉碎成粗粉，加入95%的乙醇回流提取 3次，回收乙醇至无醇味，用盐酸调PH至3 4，滤过，滤液用10。/。氨水调PH至10，再用适量氯 仿萃取5 8次，收集氯仿层，回收氯仿，干燥，即得。
5.按照权利要求4所述金钗石斛生物总碱的应用，其特征在于所述 金钗石斛生物总碱中亲脂性总生物碱的含量》60%。
6. 一种治疗老年痴呆的药物制剂，其特征在于它是以金钗石斛生 物总碱为原料药，加入适量辅料制成的口服制剂或注射剂。
7.按照权利要求6所述治疗老年痴呆的药物制剂，其特征在于所述的药物制剂为片剂、胶囊剂、颗粒剂、软胶囊、滴丸剂、糖浆剂、舌下含片或注射剂。
全文摘要
本发明公开了金钗石斛生物总碱在制备治疗老年痴呆的药物中的应用及产品，所述的金钗石斛生物总碱是从金钗石斛中提取的亲脂性总生物碱类成分。与现有技术相比，本发明通过研究金钗石斛生物总碱对神经细胞、脑缺血模型的保护作用及对痴呆大鼠学习记忆能力的影响，明确了其治疗老年痴呆的药理作用和作用机制，为金钗石斛药材的开发应用提供了药理学依据。
文档编号A61P25/28GK101537128SQ20091030176
公开日2009年9月23日 申请日期2009年4月23日 优先权日2009年4月23日
发明者石京山 申请人:遵义医学院
最新回复(0)