对氧磷酶1基因的表达纯化方法
对氧磷酶1基因的表达纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程和蛋白工程技术领域，具体涉及对氧磷酶I基因的表达纯化方法。
【背景技术】
[0002]对氧磷酶I (paraoxonasel, PONI)在研究有机磷中毒预防和治疗方面具有重要作用，但目前天然PONl很难获得，利用大肠杆菌表达的PONl虽然廉价且生产周期短，但获得的蛋白因缺少糖基化及磷酸化修饰，在体内应用时存在免疫排斥，半衰期短，易降解等问题。
[0003]目前虽然也有通过基因工程方法表达出具有活性的PONl基因的报道，但未能得到纯化的重组蛋白，也就没有比较完善的对氧磷酶I的表达纯化方法。
【发明内容】
[0004]为了解决现有技术中表达、纯化具有活性的PONl基因困难的问题，本发明提供了一种对氧磷酶I基因的表达纯化方法。
[0005]本发明的对氧磷酶I基因的表达纯化方法，步骤如下:
(1)扩增对氧磷酶I基因，连接到转移载体pFastBaC?l上构建重组转移载体，重组转移载体转化大肠杆菌DHlOBac感受态细胞，获得含有对氧磷酶I基因的重组杆状病毒DNA，将重组杆状病毒DNA转染家蚕BmN细胞使其在细胞内复制装配成含对氧磷酶I基因的重组病毒;
(2)步骤(I)的重组病毒接种家蚕五龄幼虫，发病后取蚕血，经离心过滤除杂并经浓缩后用汽巴蓝亲和层析以及抗体亲和层析纯化蚕血，获得对氧磷酶I蛋白。
[0006]优选地，上述对氧磷酶I基因的表达纯化方法中，步骤(I)所述扩增使用的引物核苷酸序列如SEQ ID NO: Γ2所示。
[0007]优选地，上述对氧磷酶I基因的表达纯化方中，步骤(2)所述离心为4°C条件下以10000 rpm的转速离心30 min ;所述过滤除杂是采用9层医用纱布过滤后再经过0.45 μ m滤膜；所述浓缩是用10 kD超滤管进行。
[0008]优选地，上述对氧磷酶I基因的表达纯化方法中，步骤(2)所述汽巴蓝亲和层析使用的固定相为汽巴蓝琼脂糖-3GA3000-CL。
[0009]优选地，上述对氧磷酶I基因的表达纯化方法中，步骤(2)所述抗体亲和层析所用抗体是通过原核表达的对氧磷酶I基因四次免疫新西兰雄兔后取血然后通过ProteinA纯化制得。
[0010]本发明的有益效果:通过设计引物,构建重组病毒vBm-Z^W/，将其接种家蚕五龄幼虫，使其表达目的蛋白PONl，通过汽巴蓝亲和层析和抗体亲和层析纯化得到了纯度较高的PONl。此方法解决了天然PONl含量低，纯化难得问题，为以后研究PONl功能奠定基础。
【附图说明】
[0011]图1为重组转移载体pFastBacTMl-ZYW/的双酶切-PCR鉴定图M:DNA laddermarker ；1:双酶切产物；2:PCR产物。
[0012]图 2 为重组 Bacmid-ZYW/ 的 PCR 鉴定图；M.DNA ladder marker, 1.PONl F/P0N1RPCR 产物，2.PONl F/M13R PCR 产物，3.M13F/P0N1R PCR 产物，4.M13F/M13R PCR 产物。
[0013]图3为重组杆状病毒BmNPV-Z^W/在家蚕五龄幼虫中表达产物的SDS-PAGE图，M.蛋白质低分子质量标记，1.接种野生病毒的蚕血，2.接种重组病毒的蚕血。
[0014]图4为重组杆状病毒BmNPV-Z^W/在家蚕五龄幼虫中表达产物的Westernblotting鉴定图，Μ.蛋白质低分子质量标记，I’.接种野生病毒的蚕血，2’.接种重组病毒的蚕血。
[0015]图5为纯化蚕血的SDS-PAGE鉴定图，Μ.:蛋白质低分子质量标记，1:接种野生病毒的蚕血,2:接种重组病毒的蚕血原样，3:汽巴蓝亲和层析柱初步纯化的蚕血，4:抗体亲和层析柱进一步纯化的蚕血。
[0016]图6为纯化蚕血的Western blotting鉴定图，Μ.:蛋白质低分子质量标记，I’:接种野生病毒的蚕血，2’:接种重组病毒的蚕血原样，3’:汽巴蓝亲和层析柱初步纯化的蚕血，4’:抗体亲和层析柱进一步纯化的蚕血。
【具体实施方式】
[0017]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
[0018]生物材料及试剂来源:
pFastBac?l载体购自Invitrogen公司，限制性内切酶及?07? I和ZSo I购自Fermentas公司，连接酶Ligat1n high购自Fermentas公司，大肠杆菌TGl感受态细胞和大肠杆菌DHlOBac感受态细胞购自Fermentas公司，Sf_900 II SFM(IX)无血清培养基购于美国GIBCO公司，胎牛血清(FBS)购于奥地利PAA公司。本实施例中的家蚕BmN细胞和家蚕五龄幼虫由上海生化所吴祥甫老师惠赠，公众可在市面购买同类商品，本发明申请人也可以提供，不会影响发明目的的实现。
[0019]实施例1:重组转移载体pFastBacTMl-ZYW/的构建
根据对氧磷酶I基因特性，设计引物F和R，以家蚕总RNA为模板进行逆转录合成cDNA，以cDNA为模板，F和R为引物，进行PCR扩增。
[0020]h游引物 F: 5’ -CCGGAATTCATGGCTAAACTGACAGCG-3，(SEQ ID N0:1),其中下划线为EC。》I酶切位点；
下游引物 R:5’-CCGCTCGAGCTACAGCTCACAGTAAAG-3’ (SEQ ID NO: 2)，下划线为ZAo I 酶切位点。
[0021]扩增程序为:95°C预变性5min，95°C变性45s，59°C退火30s，72°C延伸lmin，循环30次；最后72°C延伸8min，回收产物，得到对氧磷酶I (PONl)基因。
[0022]将PONl基因及pFastBac?l载体分别用EcoR I和沿ο I同时进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收酶切产物；将回收的PONl基因片段用Ligat1n high连接酶连接到经酶切的pFastBacTMl载体上，使PONl基因位于多角体启动子控制之下，构建转移载体pFastBac?l-PONl，转化大肠杆菌TGl感受态细胞，常规方法筛选阳性克隆，将该重组转移载体进行PCR与双酶切，产物进行琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，结果如图1所示，I号泳道双酶切产物出现两条亮带，其中一条为1065bp的PONl基因片段，另一条为质粒酶切后片段；2号泳道中的亮带为1065bp的PONl基因片段的PCR产物，琼脂糖凝胶电泳初步鉴定质粒构建成功，然后送去测序，经测序知其序列如SEQ ID N0:3所示，目的基因已成功克隆到pFastBac?l 载体上。
[0023]实施例2:家蚕重组杆状病毒vBm-PONl的构建 (I)重组杆状病毒DNA (Bacmid-PONl)的获得
将实施例1构建好的重组转移载体pFastBacTMl-PONl转化到大肠杆菌DHlOBac感受态细胞中，通过蓝白斑筛选获得阳性克隆，分别以M13上下游引物、PONl上下游、M13下游引物和PONl上游引物以及M13上游引物和PONl下游引物四组引物对，进行 PCR 鉴定，其中 M13F:5 ' -CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3 ' (SEQ ID NO:4) ；M13R:5' -AGCGGATAACAATTTTCACACAGG-3' (SEQ ID NO: 5)，取少量 PCR 产物进 行琼脂糖凝胶电泳电泳，结果如图2所示，表明获得正确的Bacmid-PONl阳性克隆。
[0024](2)重组杆状病毒DNA(Bacmid-PONl)转染家蚕BmN细胞
a.提前8?12h将生长状态良好的家蚕BmN细胞用移液器取ImL铺于小型细胞培养皿(规格为3.5cm)中。
[0025]b.取10μ L Bacmid-PONl与8μ L脂质体于已灭菌的EP管中，加入100μ L的Sf-900 II SFM(IX)无血清培养基，室温孵育约20min，得到Bacmid-PONl/脂质体复合物。
[0026]c.将步骤a中贴壁生长状态良好的家蚕BmN细胞弃去培养基后加入2mLSf-900 II SFM(IX)无血清培养基洗涤两次，以清除原培养基中残留的胎牛血清。
[0027]d.加入新鲜的Sf-900 II SFM(IX)无血清培养基lmL，然后加入Bacmid-PONl/脂质体复合物100 μ L，轻轻晃动培养皿使复合物分布均匀；28°C细胞培养箱中孵育6h左右向该培养基中加入10 μ L胎牛血清(FBS)继续培养。
[0028]e.28°C培养:T5d后，显微镜下观察细胞的发病状况(典型发病症状:细胞由长梭形变圆，核仁增大，细胞游离于培养基中；而正常细胞排列紧密且呈梭形，细胞核明显，细胞贴壁生长明显)。细胞发病表明重组Bacmid成功转染家蚕BmN细胞，并在细胞内成功进行复制、装配形成重组病毒vBm-PONl。
[0029]实施例3家蚕重组杆状病毒vBm-PONl接种家蚕五龄幼虫的SDS-PAGE与Westernblotting分析鉴定
家蚕重组杆状病毒vBm-PONl扩增后针刺法接种家蚕(箐松X皓月)五龄幼虫，待其发病后收集家蚕血淋巴进行下一步实验或于-80°C冰箱冻存。
[0030]发病的家蚕幼虫血淋巴处理方法:将血淋巴经9层医用纱布过滤后，4°C经2000rpm离心lOmin，收集上清，沉淀用0.9%的生理盐水重悬。对处理后的蚕血淋巴进行SDS-PAGE及Western blotting分析。结果如图3和图4所示,显示上清中43kD附近出现特异性条带，说明家蚕重组杆状病毒在家蚕五龄幼虫中成功表达。
[0031]实施例4用汽巴蓝亲和层析和抗体亲和层析纯化蚕血
将蚕血离心30 min (4°C, 10000 rpm)，取上清过9层医用纱布后过0.45 μπι滤膜以除杂，用10 kD超滤管对其进行浓缩。血清中的对氧磷酶(PON)主要与高密度脂蛋白(HDL)结合，汽巴蓝琼脂糖-3GA3000-CL对血清脂蛋白有特异吸附作用。因此选择其作为亲和层析介质，对上述浓缩的蚕血进行亲和层析初步纯化，然后再用抗体亲和层析柱进一步纯化蚕血。具体纯化方法如下:
1.家蚕血淋巴的浓缩处理
(I)从_80°C冰箱中取出保存的蚕血置于冰上至完全溶解后，离心30 min (4°C, 10000rpm)，将上清过9层医用纱布以去除脂类物质。
[0032](2)滤液再用0.45 μ m滤膜过滤，收集滤液。
[0033](3)用10 kD超滤管对滤液进行浓缩。
[0034]2.汽巴蓝亲和层析纯化
血清中的对氧磷酶(PON)主要与高密度脂蛋白(HDL)结合，汽巴蓝琼脂糖-3GA3000-CL对血清脂蛋白有特异吸附作用。因此选择其作为亲和层析介质，对血清中的目的酶蛋白进行亲和层析。具体步骤如下:
(I)取浓缩的蚕血10 mL，加入30 mL的平衡缓冲液，再加入7 mL汽巴蓝琼脂糖后混匀，4°C搅拌过夜，使血清中的蛋白与汽巴蓝充分结合。
[0035](2)装柱，用30 mL平衡缓冲液连续冲洗，以洗掉没有结合到填料上的蛋白(利用平衡液的盐析作用)。
[0036](3)用30 mL的洗涤缓冲液冲洗层析柱脱盐。
[0037](4)用30 mL洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，并浓缩除盐(用pH 7.4的PBS)。
[0038]3.抗体亲和层析纯化
(I)实施例1获得的对氧磷酶I基因通过原核表达获得蛋白，所得蛋白四次免疫新西兰雄兔后取血然后通过ProteinA纯化制得抗体，抗体经纯化后制备抗体亲和层析柱。
[0039](2)将浓缩后的蚕血样品用抗体亲和层析柱进行纯化。
[0040](3)将收集的洗脱液浓缩，并检测样品中蛋白浓度(BCA蛋白定量试剂盒)。
[0041]4.将两种层析洗脱液分别浓缩,对其进行SDS-PAGE及Western blotting分析。结果如图5和图6所示，显示通过两次层析，得到了较纯的蚕血P0N1，说明这种纯化方法很成功。PONl蛋白氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示。
[0042]以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
【主权项】
1.一种对氧磷酶I基因的表达纯化方法，其特征在于，步骤如下: (1)扩增对氧磷酶I基因，连接到转移载体pFastBaC?l上构建重组转移载体，重组转移载体转化大肠杆菌DHlOBac感受态细胞，获得含有对氧磷酶I基因的重组杆状病毒DNA，将重组杆状病毒DNA转染家蚕BmN细胞使其在细胞内复制装配成含对氧磷酶I基因的重组病毒; (2)步骤(I)的重组病毒接种家蚕五龄幼虫，发病后取蚕血，经离心过滤除杂并经浓缩后用汽巴蓝亲和层析以及抗体亲和层析纯化蚕血，获得对氧磷酶I蛋白。
2.根据权利要求1所述的对氧磷酶I基因的表达纯化方法，其特征在于，步骤(I)所述扩增使用的引物核苷酸序列如SEQ ID NO: 1?2所示。
3.根据权利要求1所述的对氧磷酶I基因的表达纯化方法，其特征在于，步骤(2)所述离心为4°C条件下以10000 rpm的转速离心30 min ;所述过滤除杂是采用9层医用纱布过滤后再经过0.45 μ m滤膜；所述浓缩是用10 kD超滤管进行。
4.根据权利要求1所述的对氧磷酶I基因的表达纯化方法，其特征在于，步骤(2)所述汽巴蓝亲和层析使用的固定相为汽巴蓝琼脂糖-3GA3000-CL。
5.根据权利要求1所述的对氧磷酶I基因的表达纯化方法，其特征在于，步骤(2)所述抗体亲和层析所用抗体是通过原核表达的对氧磷酶I基因四次免疫新西兰雄兔后取血然后通过ProteinA纯化制得。
【专利摘要】本发明公开了一种对氧磷酶1基因的表达纯化方法，属于基因工程技术领域。本发明的方法是首先扩增对氧磷酶1基因，连接到转移载体pFastBacTMⅠ上构建重组转移载体，转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，获得含有对氧磷酶1基因的重组杆状病毒DNA，将其转染家蚕BmN细胞，复制装配成含对氧磷酶1基因的重组病毒后，接种家蚕五龄幼虫，发病后取蚕血，经离心过滤除杂并经浓缩后用汽巴蓝亲和层析以及抗体亲和层析纯化蚕血，获得对氧磷酶1蛋白。该方法实现了蛋白的高效表达且结构接近天然蛋白，解决了天然PON1含量低、难纯化的问题。
【IPC分类】C12N15-866, C12N15-55, C12N9-16
【公开号】CN104726497
【申请号】CN201310701927
【发明人】张耀洲, 谭淑敏, 李 杰, 王小飞, 盖其静
【申请人】天津耀宇生物技术有限公司
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2013年12月19日
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程和蛋白工程技术领域，具体涉及对氧磷酶I基因的表达纯化方法。
【背景技术】
[0002]对氧磷酶I (paraoxonasel, PONI)在研究有机磷中毒预防和治疗方面具有重要作用，但目前天然PONl很难获得，利用大肠杆菌表达的PONl虽然廉价且生产周期短，但获得的蛋白因缺少糖基化及磷酸化修饰，在体内应用时存在免疫排斥，半衰期短，易降解等问题。
[0003]目前虽然也有通过基因工程方法表达出具有活性的PONl基因的报道，但未能得到纯化的重组蛋白，也就没有比较完善的对氧磷酶I的表达纯化方法。
【发明内容】
[0004]为了解决现有技术中表达、纯化具有活性的PONl基因困难的问题，本发明提供了一种对氧磷酶I基因的表达纯化方法。
[0005]本发明的对氧磷酶I基因的表达纯化方法，步骤如下:
(1)扩增对氧磷酶I基因，连接到转移载体pFastBaC?l上构建重组转移载体，重组转移载体转化大肠杆菌DHlOBac感受态细胞，获得含有对氧磷酶I基因的重组杆状病毒DNA，将重组杆状病毒DNA转染家蚕BmN细胞使其在细胞内复制装配成含对氧磷酶I基因的重组病毒;
(2)步骤(I)的重组病毒接种家蚕五龄幼虫，发病后取蚕血，经离心过滤除杂并经浓缩后用汽巴蓝亲和层析以及抗体亲和层析纯化蚕血，获得对氧磷酶I蛋白。
[0006]优选地，上述对氧磷酶I基因的表达纯化方法中，步骤(I)所述扩增使用的引物核苷酸序列如SEQ ID NO: Γ2所示。
[0007]优选地，上述对氧磷酶I基因的表达纯化方中，步骤(2)所述离心为4°C条件下以10000 rpm的转速离心30 min ;所述过滤除杂是采用9层医用纱布过滤后再经过0.45 μ m滤膜；所述浓缩是用10 kD超滤管进行。
[0008]优选地，上述对氧磷酶I基因的表达纯化方法中，步骤(2)所述汽巴蓝亲和层析使用的固定相为汽巴蓝琼脂糖-3GA3000-CL。
[0009]优选地，上述对氧磷酶I基因的表达纯化方法中，步骤(2)所述抗体亲和层析所用抗体是通过原核表达的对氧磷酶I基因四次免疫新西兰雄兔后取血然后通过ProteinA纯化制得。
[0010]本发明的有益效果:通过设计引物,构建重组病毒vBm-Z^W/，将其接种家蚕五龄幼虫，使其表达目的蛋白PONl，通过汽巴蓝亲和层析和抗体亲和层析纯化得到了纯度较高的PONl。此方法解决了天然PONl含量低，纯化难得问题，为以后研究PONl功能奠定基础。
【附图说明】
[0011]图1为重组转移载体pFastBacTMl-ZYW/的双酶切-PCR鉴定图M:DNA laddermarker ；1:双酶切产物；2:PCR产物。
[0012]图 2 为重组 Bacmid-ZYW/ 的 PCR 鉴定图；M.DNA ladder marker, 1.PONl F/P0N1RPCR 产物，2.PONl F/M13R PCR 产物，3.M13F/P0N1R PCR 产物，4.M13F/M13R PCR 产物。
[0013]图3为重组杆状病毒BmNPV-Z^W/在家蚕五龄幼虫中表达产物的SDS-PAGE图，M.蛋白质低分子质量标记，1.接种野生病毒的蚕血，2.接种重组病毒的蚕血。
[0014]图4为重组杆状病毒BmNPV-Z^W/在家蚕五龄幼虫中表达产物的Westernblotting鉴定图，Μ.蛋白质低分子质量标记，I’.接种野生病毒的蚕血，2’.接种重组病毒的蚕血。
[0015]图5为纯化蚕血的SDS-PAGE鉴定图，Μ.:蛋白质低分子质量标记，1:接种野生病毒的蚕血,2:接种重组病毒的蚕血原样，3:汽巴蓝亲和层析柱初步纯化的蚕血，4:抗体亲和层析柱进一步纯化的蚕血。
[0016]图6为纯化蚕血的Western blotting鉴定图，Μ.:蛋白质低分子质量标记，I’:接种野生病毒的蚕血，2’:接种重组病毒的蚕血原样，3’:汽巴蓝亲和层析柱初步纯化的蚕血，4’:抗体亲和层析柱进一步纯化的蚕血。
【具体实施方式】
[0017]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
[0018]生物材料及试剂来源:
pFastBac?l载体购自Invitrogen公司，限制性内切酶及?07? I和ZSo I购自Fermentas公司，连接酶Ligat1n high购自Fermentas公司，大肠杆菌TGl感受态细胞和大肠杆菌DHlOBac感受态细胞购自Fermentas公司，Sf_900 II SFM(IX)无血清培养基购于美国GIBCO公司，胎牛血清(FBS)购于奥地利PAA公司。本实施例中的家蚕BmN细胞和家蚕五龄幼虫由上海生化所吴祥甫老师惠赠，公众可在市面购买同类商品，本发明申请人也可以提供，不会影响发明目的的实现。
[0019]实施例1:重组转移载体pFastBacTMl-ZYW/的构建
根据对氧磷酶I基因特性，设计引物F和R，以家蚕总RNA为模板进行逆转录合成cDNA，以cDNA为模板，F和R为引物，进行PCR扩增。
[0020]h游引物 F: 5’ -CCGGAATTCATGGCTAAACTGACAGCG-3，(SEQ ID N0:1),其中下划线为EC。》I酶切位点；
下游引物 R:5’-CCGCTCGAGCTACAGCTCACAGTAAAG-3’ (SEQ ID NO: 2)，下划线为ZAo I 酶切位点。
[0021]扩增程序为:95°C预变性5min，95°C变性45s，59°C退火30s，72°C延伸lmin，循环30次；最后72°C延伸8min，回收产物，得到对氧磷酶I (PONl)基因。
[0022]将PONl基因及pFastBac?l载体分别用EcoR I和沿ο I同时进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收酶切产物；将回收的PONl基因片段用Ligat1n high连接酶连接到经酶切的pFastBacTMl载体上，使PONl基因位于多角体启动子控制之下，构建转移载体pFastBac?l-PONl，转化大肠杆菌TGl感受态细胞，常规方法筛选阳性克隆，将该重组转移载体进行PCR与双酶切，产物进行琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，结果如图1所示，I号泳道双酶切产物出现两条亮带，其中一条为1065bp的PONl基因片段，另一条为质粒酶切后片段；2号泳道中的亮带为1065bp的PONl基因片段的PCR产物，琼脂糖凝胶电泳初步鉴定质粒构建成功，然后送去测序，经测序知其序列如SEQ ID N0:3所示，目的基因已成功克隆到pFastBac?l 载体上。
[0023]实施例2:家蚕重组杆状病毒vBm-PONl的构建 (I)重组杆状病毒DNA (Bacmid-PONl)的获得
将实施例1构建好的重组转移载体pFastBacTMl-PONl转化到大肠杆菌DHlOBac感受态细胞中，通过蓝白斑筛选获得阳性克隆，分别以M13上下游引物、PONl上下游、M13下游引物和PONl上游引物以及M13上游引物和PONl下游引物四组引物对，进行 PCR 鉴定，其中 M13F:5 ' -CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3 ' (SEQ ID NO:4) ；M13R:5' -AGCGGATAACAATTTTCACACAGG-3' (SEQ ID NO: 5)，取少量 PCR 产物进 行琼脂糖凝胶电泳电泳，结果如图2所示，表明获得正确的Bacmid-PONl阳性克隆。
[0024](2)重组杆状病毒DNA(Bacmid-PONl)转染家蚕BmN细胞
a.提前8?12h将生长状态良好的家蚕BmN细胞用移液器取ImL铺于小型细胞培养皿(规格为3.5cm)中。
[0025]b.取10μ L Bacmid-PONl与8μ L脂质体于已灭菌的EP管中，加入100μ L的Sf-900 II SFM(IX)无血清培养基，室温孵育约20min，得到Bacmid-PONl/脂质体复合物。
[0026]c.将步骤a中贴壁生长状态良好的家蚕BmN细胞弃去培养基后加入2mLSf-900 II SFM(IX)无血清培养基洗涤两次，以清除原培养基中残留的胎牛血清。
[0027]d.加入新鲜的Sf-900 II SFM(IX)无血清培养基lmL，然后加入Bacmid-PONl/脂质体复合物100 μ L，轻轻晃动培养皿使复合物分布均匀；28°C细胞培养箱中孵育6h左右向该培养基中加入10 μ L胎牛血清(FBS)继续培养。
[0028]e.28°C培养:T5d后，显微镜下观察细胞的发病状况(典型发病症状:细胞由长梭形变圆，核仁增大，细胞游离于培养基中；而正常细胞排列紧密且呈梭形，细胞核明显，细胞贴壁生长明显)。细胞发病表明重组Bacmid成功转染家蚕BmN细胞，并在细胞内成功进行复制、装配形成重组病毒vBm-PONl。
[0029]实施例3家蚕重组杆状病毒vBm-PONl接种家蚕五龄幼虫的SDS-PAGE与Westernblotting分析鉴定
家蚕重组杆状病毒vBm-PONl扩增后针刺法接种家蚕(箐松X皓月)五龄幼虫，待其发病后收集家蚕血淋巴进行下一步实验或于-80°C冰箱冻存。
[0030]发病的家蚕幼虫血淋巴处理方法:将血淋巴经9层医用纱布过滤后，4°C经2000rpm离心lOmin，收集上清，沉淀用0.9%的生理盐水重悬。对处理后的蚕血淋巴进行SDS-PAGE及Western blotting分析。结果如图3和图4所示,显示上清中43kD附近出现特异性条带，说明家蚕重组杆状病毒在家蚕五龄幼虫中成功表达。
[0031]实施例4用汽巴蓝亲和层析和抗体亲和层析纯化蚕血
将蚕血离心30 min (4°C, 10000 rpm)，取上清过9层医用纱布后过0.45 μπι滤膜以除杂，用10 kD超滤管对其进行浓缩。血清中的对氧磷酶(PON)主要与高密度脂蛋白(HDL)结合，汽巴蓝琼脂糖-3GA3000-CL对血清脂蛋白有特异吸附作用。因此选择其作为亲和层析介质，对上述浓缩的蚕血进行亲和层析初步纯化，然后再用抗体亲和层析柱进一步纯化蚕血。具体纯化方法如下:
1.家蚕血淋巴的浓缩处理
(I)从_80°C冰箱中取出保存的蚕血置于冰上至完全溶解后，离心30 min (4°C, 10000rpm)，将上清过9层医用纱布以去除脂类物质。
[0032](2)滤液再用0.45 μ m滤膜过滤，收集滤液。
[0033](3)用10 kD超滤管对滤液进行浓缩。
[0034]2.汽巴蓝亲和层析纯化
血清中的对氧磷酶(PON)主要与高密度脂蛋白(HDL)结合，汽巴蓝琼脂糖-3GA3000-CL对血清脂蛋白有特异吸附作用。因此选择其作为亲和层析介质，对血清中的目的酶蛋白进行亲和层析。具体步骤如下:
(I)取浓缩的蚕血10 mL，加入30 mL的平衡缓冲液，再加入7 mL汽巴蓝琼脂糖后混匀，4°C搅拌过夜，使血清中的蛋白与汽巴蓝充分结合。
[0035](2)装柱，用30 mL平衡缓冲液连续冲洗，以洗掉没有结合到填料上的蛋白(利用平衡液的盐析作用)。
[0036](3)用30 mL的洗涤缓冲液冲洗层析柱脱盐。
[0037](4)用30 mL洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，并浓缩除盐(用pH 7.4的PBS)。
[0038]3.抗体亲和层析纯化
(I)实施例1获得的对氧磷酶I基因通过原核表达获得蛋白，所得蛋白四次免疫新西兰雄兔后取血然后通过ProteinA纯化制得抗体，抗体经纯化后制备抗体亲和层析柱。
[0039](2)将浓缩后的蚕血样品用抗体亲和层析柱进行纯化。
[0040](3)将收集的洗脱液浓缩，并检测样品中蛋白浓度(BCA蛋白定量试剂盒)。
[0041]4.将两种层析洗脱液分别浓缩,对其进行SDS-PAGE及Western blotting分析。结果如图5和图6所示，显示通过两次层析，得到了较纯的蚕血P0N1，说明这种纯化方法很成功。PONl蛋白氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示。
[0042]以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
【主权项】
1.一种对氧磷酶I基因的表达纯化方法，其特征在于，步骤如下: (1)扩增对氧磷酶I基因，连接到转移载体pFastBaC?l上构建重组转移载体，重组转移载体转化大肠杆菌DHlOBac感受态细胞，获得含有对氧磷酶I基因的重组杆状病毒DNA，将重组杆状病毒DNA转染家蚕BmN细胞使其在细胞内复制装配成含对氧磷酶I基因的重组病毒; (2)步骤(I)的重组病毒接种家蚕五龄幼虫，发病后取蚕血，经离心过滤除杂并经浓缩后用汽巴蓝亲和层析以及抗体亲和层析纯化蚕血，获得对氧磷酶I蛋白。
2.根据权利要求1所述的对氧磷酶I基因的表达纯化方法，其特征在于，步骤(I)所述扩增使用的引物核苷酸序列如SEQ ID NO: 1?2所示。
3.根据权利要求1所述的对氧磷酶I基因的表达纯化方法，其特征在于，步骤(2)所述离心为4°C条件下以10000 rpm的转速离心30 min ;所述过滤除杂是采用9层医用纱布过滤后再经过0.45 μ m滤膜；所述浓缩是用10 kD超滤管进行。
4.根据权利要求1所述的对氧磷酶I基因的表达纯化方法，其特征在于，步骤(2)所述汽巴蓝亲和层析使用的固定相为汽巴蓝琼脂糖-3GA3000-CL。
5.根据权利要求1所述的对氧磷酶I基因的表达纯化方法，其特征在于，步骤(2)所述抗体亲和层析所用抗体是通过原核表达的对氧磷酶I基因四次免疫新西兰雄兔后取血然后通过ProteinA纯化制得。
【专利摘要】本发明公开了一种对氧磷酶1基因的表达纯化方法，属于基因工程技术领域。本发明的方法是首先扩增对氧磷酶1基因，连接到转移载体pFastBacTMⅠ上构建重组转移载体，转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，获得含有对氧磷酶1基因的重组杆状病毒DNA，将其转染家蚕BmN细胞，复制装配成含对氧磷酶1基因的重组病毒后，接种家蚕五龄幼虫，发病后取蚕血，经离心过滤除杂并经浓缩后用汽巴蓝亲和层析以及抗体亲和层析纯化蚕血，获得对氧磷酶1蛋白。该方法实现了蛋白的高效表达且结构接近天然蛋白，解决了天然PON1含量低、难纯化的问题。
【IPC分类】C12N15-866, C12N15-55, C12N9-16
【公开号】CN104726497
【申请号】CN201310701927
【发明人】张耀洲, 谭淑敏, 李 杰, 王小飞, 盖其静
【申请人】天津耀宇生物技术有限公司
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2013年12月19日
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