分离和提纯埃坡霉素的方法
专利名称：分离和提纯埃坡霉素的方法
技术领域：
本发明涉及一种从树脂中解吸埃坡霉素(epothilone)、尤其是埃坡霉素A和/或埃坡霉素B的新方法，并涉及包括所述解吸方法在内的埃坡霉素的新的生产、后处理或提纯方法或制造方法，以及某些溶剂用于从树脂中解吸埃坡霉素的用途。
背景技术：
埃坡霉素A和B代表下式表示的、新的一类稳定微管的细胞毒素活性成分(参见Gerth，K.等人，J.Antibiot.(抗生素杂志)49，第560-563页(1966)) 其中R代表氢(埃坡霉素A)或甲基(埃坡霉素B)。
自从描述了这些埃坡霉素(见WO 93/10121)后，已经公开了几种合成和制造这两种埃坡霉素和大量主要的埃坡霉素衍生物(以下统称为“埃坡霉素”)的方法，例如在WO 99/03848、WO 00/49020、WO 00/49021、WO00/47584、WO 00/000485、WO 00/23452、WO 99/03848、WO 00/49019、WO 99/07692、WO 98/22461、WO 99/65913、WO 98/38192、WO 00/50423、WO 00/22139、WO 99/58534、WO 97/19086、WO 98/25929、WO 99/67252、WO 99/67253、WO 00/31247、WO 99/42602、WO 99/28324、WO 00/50423、WO 00/39276、WO 99/27890、WO 99/54319、WO 99/54318、WO 99/02514、WO 99/59985、WO 00/37473、WO 98/08849、US 6,043,372、US 5,969,145、WO 99/40047、WO 99/01124和WO 99/43653中公开的那些。除了埃坡霉素A和埃坡霉素B以外，尤其是在WO 97/19086和WO 98/22461中描述的埃坡霉素D和E，在WO 98/22461中描述的埃坡霉素E和F，以及在WO 99/02514中描述的埃坡霉素显示出令人感兴趣的性能。
作为治疗用途的实例，国际申请WO 99/43320描述了埃坡霉素作为抗增生疾病、尤其是抗肿瘤疾病药剂的各种给药方式，由于机理相似，该药剂的作用方式与熟知的且市场化的抗癌药剂Taxol相似。WO 99/39694公开了埃坡霉素、尤其是埃坡霉素A和B的一些具体的制剂。
与已经确立的治疗相比，尤其是在肿瘤对用Taxol治疗已经产生耐药性的情况下，埃坡霉素、尤其是埃坡霉素A且最优选埃坡霉素B具有各种优势。因此，为了满足预期需要，迫切需要大量合成它们的方法。
迄今为止，最有效的生产方法至少包括一些生物合成步骤和埃坡霉素从培养基或类似物质中分离的步骤。
最初，通过粘细菌提取天然物质，尤其是从细胞株SorangiumCellulosum Soce90(在German Collection of Microorganisms(德国微生物保存中心)以编号6773保藏，见WO 93/10121)提取埃坡霉素的描述见于文献。为了获得天然物质、尤其是埃坡霉素的满意浓度，以前总是将基于聚苯乙烯的吸附物树脂如Amberlite XAD-1180(Rohm&Haas，法兰克福，德国)加入培养基中以吸收该培养基。
但是，该方法的缺点是大规模生产会产生许多问题。阀门被树脂球损坏，管道可能堵塞，设备可能因机械摩擦而受到较大磨损。树脂球是多孔的，因此具有较大的内表面积(约825m2/g树脂)。由于包含在树脂中的空气不是高压灭菌的，所以消毒成为问题。因此该方法不能在培养生产埃坡霉素的微生物过程中向其中添加树脂而大规模地切合实际地进行。
因此，发现了一种生产埃坡霉素、尤其是埃坡霉素A和B的先进方法，该方法描述在WO 99/42602中。该方法包括埃坡霉素自生产埃坡霉素的微生物培养基的络合，所述培养基包含环糊精或其它络合物形成剂；无细胞培养基(例如所述培养基的滤液或离心液)与作为基质的合成树脂如基于苯乙烯/二乙烯基苯共聚物的树脂[如Amberlite XAD-16(Rohm&HaasGermany GmbH，法兰克福，德国)或Diaion HP-20(Resindion S.R.L.，Mitsubishi Chemical Co.，米兰，意大利)]混合以吸附埃坡霉素；以及尤其是用醇、最优选用异丙醇的解吸。随后，将水加入醇相，除去溶剂相(优选通过蒸发)；将所得残余物在酯、尤其是乙酸乙酯或乙酸异丙酯存在下相分离；通常分子过滤(凝胶色谱法)干燥后的酯相；通过反相HPLC(优选用腈/水混合物，例如乙腈/水混合物洗脱)分离所得埃坡霉素混合物；任选通过在水/醚混合物存在下的相分离进一步提纯；优选随后进行在硅胶上的吸附色谱法以进一步除去杂质；以及结晶/再结晶。
尽管该方法具有有益的进步且适合于工业规模生产，但是仍然具有某些缺点。
例如，为了获得足够的纯度，利用分子过滤步骤或硅胶吸附色谱法步骤或两者是可行的。更多的困难来自在酯如乙酸乙酯存在下的相分离—该过程(尤其由于大工业规模的水/酯相的相分离时间较长)非常耗时，以及随后的蒸发由于发泡和溅射也难于处理。
因此，本发明要解决的问题是尽可能多地避免上述困难，并发现分离吸附到树脂中的埃坡霉素、尤其是埃坡霉素A和B的有利方法。
发明概述非常令人惊奇的是，现在已经发现通过简单地用某些其它溶剂(如下面详细说明的弱极性或非极性溶剂)替换用作解吸溶剂的醇，在获得解决上述问题的方案方面就提供了实质性突破，产生了附加优点如改善的解吸和较高最终产率。其中的附加优点是(i)较高的解吸选择性；(ii)较高的埃坡霉素解吸量(这说明解吸更完全)；(iii)无需使用酯(例如乙酸乙酯)再提取且无需随后的醚蒸发，其中使用酯再提取需要进行高度麻烦的水/酯相分离；(iv)无需分子过滤且通常无需吸附色谱法；(v)解吸需要的时间显著减少；(vi)工艺步骤较少；(vii)污染危险减少(对具有高毒性的埃坡霉素非常重要)，和/或(viii)处理更好且更安全(取决于用于解吸(提取)的溶剂)；和(ix)同样取决于溶剂，在反相色谱法分离后，出乎意料地甚至更少量的与埃坡霉素、尤其是埃坡霉素B极性相似的副产物或杂质需要除去。这些和其它优点可从下面的发明详述中推论出。
发明详述本发明的一个方面涉及一种用弱极性或非极性溶剂从树脂、尤其是合成树脂中解吸埃坡霉素、尤其是埃坡霉素A和/或B、特别是埃坡霉素B的方法。
本发明的另一方面涉及一种尤其当埃坡霉素在化学合成用的标准介质或优选在培养基中生产之后后处理(或提纯)它们的方法，所述培养基特别是包含适于生产埃坡霉素、尤其是埃坡霉素A和/或B的Sorangium属微生物，尤其是粘细菌以及络合物形成成分，所述方法包括使用弱极性或非极性溶剂将所述埃坡霉素从树脂中解吸。
本发明的第三方面涉及弱极性或非极性溶剂用于从树脂、尤其是合成树脂中解吸埃坡霉素、尤其是埃坡霉素A和/或B、特别是埃坡霉素B的用途。
以上和以下使用的通用术语优选具有下面给定的含义术语“埃坡霉素”优选涉及以下专利申请中提及的任何埃坡霉素或埃坡霉素衍生物WO 99/03848、WO 00/49020、WO 00/49021、WO 00/47584、WO 00/00485、WO 00/23452、WO 99/03848、WO 00/49019、WO 99/07692、WO 98/22461、WO 99/65913、WO 98/38192、WO 00/50423、WO 00/22139、WO 99/58534、WO 97/19086、WO 98/25929、WO 99/67252、WO 99/67253、WO 00/31247、WO 99/42602、WO 99/28324、WO 00/50423、WO 00/39276、WO 99/27890、WO 99/54319、WO 99/54318、WO 99/02514、WO 99/59985、WO 00/37473、WO 98/08849、US 6,043,372、US 5,969,1 45、WO 99/40047、WO 99/01124和/或WO 99/43653，更优选涉及埃坡霉素A且尤其是埃坡霉素B，但是在本发明的更宽范围内还涉及在WO 97/19086和WO 98/22461中描述的埃坡霉素D和E、在WO 98/22461中描述的埃坡霉素E和F或在WO99/02514中描述的埃坡霉素。此处引用所有这些文件，尤其是有关埃坡霉素衍生物和其中提到的优选埃坡霉素衍生物的文件作为参考。
弱极性或非极性溶剂具有以下特征优选的是在根据Snyder等人，J.Chromatogr.Sci.(色谱科学杂志)16，223(1978)确定的洗脱序中显示出以下特征的溶剂或这些溶剂的混合物，其中xe是质子受体参数(表示作为氢受体形成氢键的趋势)，xd是质子供体参数(表示作为氢供体形成氢键的趋势)，以及xn是偶极参数(表示偶极特性)，条件是xe+xd+xn＝1xe＝0.20-0.40；xd＝0.15-0.36；以及xn＝0.38-0.60；优选xe＝0.22-0.32；xd＝0.17-0.34；以及xn＝0.39-0.54.
在弱极性或非极性溶剂中，非常优选低级烷基·低级烷基酮或环酮，例如丙酮、甲基·乙基酮、2-戊酮、甲基·异丁基酮或环己酮；更优选醚，尤其是环醚，更尤其是四氢呋喃或二噁烷；甚至更优选脂族卤素化合物，尤其是低级烷基卤化物，尤其是二氯甲烷或1，2-二氯乙烷；或最尤其是芳族溶剂，尤其是萘或(优选)苯，或被1个或多个、优选1-3个选自下列的基团取代的萘或(优选)苯低级烷基，尤其是甲基、乙基或异丙基，低级烷氧基，尤其是甲氧基或乙氧基，卤素，尤其是氟、氯、溴或碘，硝基和低级烷氧基-低级烷基，尤其是乙氧基甲基；尤其是甲苯、乙苯、二甲苯(尤其是邻-、间-或对二甲苯)，1，3，5-三甲基苯，假枯烯，连三甲苯，枯烯，异丙基甲苯，苯基卤化物，尤其是氟代苯、氯代苯、溴代苯或碘代苯，低级烷氧基苯，尤其是乙氧基苯或甲氧基苯，或低级烷氧基-低级烷基苯，尤其是乙氧基甲基苯(苄基·乙基醚)；或两种或更多种如2-4种这些溶剂的混合物；最优选的是低级烷基苯，尤其是乙苯、二甲苯(尤其是邻-、间-或对二甲苯)、1，3，5-三甲基苯、假枯烯、连三甲苯、枯烯、异丙基甲苯；以及最尤其是甲苯。
术语“弱极性或非极性溶剂”也包括以上和以下所述溶剂中两种或更多种如2-4种这些溶剂的混合物。
前缀“低级”总是表示相应指定的基团含有优选至多7个碳原子，特别是至多4个碳原子，并且是支化的或未支化的。低级烷基可以例如是未支化的或支化一次或多次的，且例如为甲基，乙基，丙基如异丙基和正丙基，丁基如异丁基、仲丁基、叔丁基或正丁基，或还为戊基如戊基或正戊基。
卤素优选为碘、溴、氯或氟。
烃优选为含有4-32、更优选4-20、甚至更优选6-16个碳原子的有机化合物，且可以是脂族的，例如线性、支化或环状的饱和烷烃如环己烷；具有1个或多个双键和/或叁键的线性、支化或环状(非芳族)有机化合物；或芳族烃。后者为未取代的或被1个或多个如至多3个选自下列的基团取代低级烷基，尤其是甲基、乙基或异丙基，低级烷氧基，尤其是甲氧基或乙氧基，卤素，尤其是氟、氯、溴或碘，硝基和低级烷氧基-低级烷基，尤其是乙氧基甲基；优选被1-3个低级烷基取代。
醇优选为羟基-低级烷烃，尤其是甲醇、乙醇、正丙醇或异丙醇。
树脂尤其是合成树脂，优选基于苯乙烯和二乙烯基苯共聚物的树脂，更优选Amberlite XAD-4或优选Amberlite XAD-16[Rohm&HaasGermany GmbH，法兰克福]或Diaion HP-20 [Resindion S.R.L.，MitsubishiChemical Co.，米兰]。无需赘言，一种或多种埃坡霉素根据本发明从其中解吸的树脂含有与之非共价键接触(例如与之可逆结合或吸附)的埃坡霉素。换言之，在使用术语“树脂”时，其用于指“含有一种或多种与之接触、尤其与之可逆结合或吸附的埃坡霉素的树脂”。
本发明的优选实施方式在本发明的优选实施方式中，本发明涉及一种方法，该方法包括用上述或下述弱极性或非极性溶剂从树脂中的解吸，还包括任何其它期望的或要求的提纯步骤，优选本发明中优选描述的那些，以产生纯净形式的各种埃坡霉素，尤其是埃坡霉素A且最尤其是埃坡霉素B。
埃坡霉素的后处理在产生包含待后处理埃坡霉素的反应产物的反应或方法之后进行，将该埃坡霉素(i)在溶于适当的极性水性介质后从化学反应混合物中分离，或(ii)更优选从具有生产该埃坡霉素的微生物的培养基的上层清液(例如含有一种如WO 99/42602中描述的埃坡霉素的环糊精)中通过将培养基分离为液相(例如离心液或滤液)和固相(细胞)、尤其是通过过滤或离心分离(管式离心机或分离器)来分离。
在该预处理后，优选直接将所述溶液((i))或液相((ii))与作为基质的树脂、尤其是合成树脂、尤其是基于苯乙烯和二乙烯基苯共聚物的树脂(以下也简称为聚苯乙烯树脂)如Amberlite XAD-16或Diaion HP-20混合(离心液与树脂的体积比优选为约10∶1-100∶1，优选为约50∶1)。在优选0.25-50小时、尤其是0.8-22小时的接触时间后，例如通过过滤、沉降或离心分离将树脂分离出来。需要的话，吸附后用强极性溶剂、优选用水洗涤该树脂。
然后，开始本发明的优选后处理方法用弱极性或非极性溶剂、特别是用低级烷基卤化物、尤其是二氯甲烷或1，2-二氯乙烷；或更优选用芳族溶剂，尤其是萘或(优选)苯，或被1个或多个、优选1-3个选自下列的基团取代的萘或(优选)苯低级烷基，尤其是甲基、乙基或异丙基，低级烷氧基，尤其是甲氧基或乙氧基，卤素，尤其是氟、氯、溴或碘，硝基和低级烷氧基-低级烷基，尤其是乙氧基甲基；最优选用甲苯来进行埃坡霉素的解吸(本身构成本发明非常优选的实施方式)。必要或需要的话，该提取步骤可重复1次或多次，优选0-3次，尤其是1次，以获得更完全的解吸。
在可这样获得的(在重复提取的情况下，已合并)解吸的埃坡霉素溶液的后处理之后，优选将用于解吸的溶剂从所得溶液中通过蒸发(蒸馏)、优选通过在反应器内并随后在真空下在旋转式汽化器内浓缩而除去。
随后，采用以下步骤进行进一步处理，其中通过用腈洗脱的反相色谱法进行的提纯步骤是必须的，而其它步骤是任选的-解吸后使埃坡霉素结晶；尤其为使埃坡霉素B结晶，加入醇与烃的混合物，尤其是低级链烷醇与含有3-10个环原子的脂环烃的混合物，最尤其是甲醇与环己烷的混合物，其中所述混合物的体积比优选是1∶10-10∶1，尤其是1∶3-3∶1。加入水引起快速相分离，并且例如利用旋转式汽化器在真空下将醇相蒸发至干。之后将所得包含埃坡霉素B的提取物从适当的溶剂混合物、尤其是从醇/脂环烃混合物、最优选是从异丙醇/环己烷混合物中结晶，其中所述混合物的体积比优选为1∶10-10∶1，更优选为1∶6-6∶1，最优选为1∶6-1∶4；-(必须的)在溶于适当溶剂、尤其是腈与水的混合物、优选为乙腈/水混合物后，通过反相色谱法分离埃坡霉素，并用腈与水的混合物洗脱，其中所述溶剂混合物的体积比优选为1∶10-10∶1，尤其为1∶3-1∶1，优选特征在于该色谱法在反相材料的柱子中进行，该反相材料带有烃链，例如含有18个碳原子的烃链，尤其是RP-18材料，以及使用包含腈、尤其是低级烷基腈、特别是乙腈的洗脱剂，特别使用腈/水混合物，尤其是乙腈/水混合物，其中腈与水的比例优选为约1∶99-99∶1，基本为1∶9-9∶1，例如为2∶8-7∶3，例如3∶7或4∶6；并通过蒸发(蒸馏)从收集的包含埃坡霉素(尤其是埃坡霉素A或最尤其是埃坡霉素B)的级分中除去所述腈；需要的话，然后将含埃坡霉素的剩余水用酯、尤其是低级链烷酸的低级烷基酯、优选乙酸异丙酯提取，随后将含埃坡霉素的酯相蒸发(优选首先在反应器内，然后在真空下在旋转式汽化器内)至干；(需要的话，起始的埃坡霉素溶液可以分流并分成一个以上的反相独立流；)-仅当需要时(例如，作为解吸后结晶的替换)，进行吸附色谱法，特别是通过加入到硅胶柱中并用适当的溶剂或溶剂混合物、尤其是酯/烃混合物如链烷酸的低级烷基酯/C4-C10烷烃、尤其是乙酸乙酯或乙酸异丙酯/正己烷的混合物洗脱，其中优选所述酯与烃的比例为99∶1-1∶99，优选为10∶1-1∶10，例如4∶1；-以及最后的再结晶，例如从适当的溶剂或溶剂混合物中再结晶，该溶剂例如包括酯、酯/烃混合物或醇，尤其是乙酸乙酯或乙酸异丙酯/甲苯的1∶10-10∶1、优选2∶3混合物(埃坡霉素A)或甲醇或乙酸乙酯(埃坡霉素B)；在该方法中，必要和/或需要的话，在所使用的各步骤之间，将所得溶液或悬浮液浓缩，和/或特别通过沉降、过滤或离心分离溶液/悬浮液将液体和固体组分彼此分离。上述和下述更精确的定义可优选用于上述各步骤中。
本发明的优选实施方式还涉及一种用于分离吸附到合成树脂中的埃坡霉素、尤其是埃坡霉素A或最尤其是埃坡霉素B的方法，该方法包括(i)用弱极性或非极性溶剂、特别是用低级烷基卤化物、尤其是二氯甲烷或1，2-二氯乙烷；或更优选用芳族溶剂，尤其是萘或(优选)苯，或被1个或多个、优选1-3个选自下列的基团取代的萘或(优选)苯低级烷基，尤其是甲基、乙基或异丙基，低级烷氧基，尤其是甲氧基或乙氧基，卤素，尤其是氟、氯、溴或碘，硝基和低级烷氧基-低级烷基，尤其是乙氧基甲基；最优选用甲苯；或在本发明的更宽范围内用两种或更多种这些溶剂的混合物将埃坡霉素从所述合成树脂中解吸；以及(ii)在溶于适当溶剂、尤其是腈与水的混合物、优选为乙腈/水混合物后，通过反相色谱法分离埃坡霉素，并用腈与水的混合物洗脱，其中所述混合溶剂的体积比优选为1∶10-10∶1，尤其为1∶3-1∶1，优选特征在于该色谱法在反相材料、尤其是RP-18材料的柱子中进行，该材料带有烃链，
例如含有18个碳原子的烃链，以及使用包含腈、尤其是低级烷基腈、特别是乙腈的洗脱剂，特别使用腈/水混合物，尤其是乙腈/水混合物，其中腈与水的比例优选为约1∶99-99∶1，基本为1∶9-9∶1，例如为2∶8-7∶3，例如3∶7或4∶6。
在本发明的另一优选实施方式中，上一段落中的从步骤(i)起始且包括步骤(ii)的方法还包括任何其它期望或需要的提纯步骤，优选本发明中优选描述的那些，以产生纯净形式的各种埃坡霉素，尤其是埃坡霉素A且最尤其是埃坡霉素B。
后处理的准备优选按下述进行埃坡霉素的吸附，尤其是从化学反应混合物中或更优选从微生物培养液的上层清液中的吸附可按WO 99/42602中所述或类似方法实现；简言之，在离心液中发现有埃坡霉素，随后将该离心液与合成树脂、尤其是苯乙烯/二乙烯基苯共聚物树脂如AmberliteXAD-16或Diaion HP-20直接混合(优选离心液与树脂的体积比为约10∶1-100∶1，优选为约50∶1)并用搅拌器搅拌。在该步骤中，埃坡霉素转移到树脂中。在经充分吸附的时间如约0.2-10小时的接触时间后，通过离心分离或过滤将该树脂分离出来。埃坡霉素在树脂上的吸附也可以在色谱柱中进行，通过将该树脂放置在柱内并使离心液流过该树脂。吸附后，用水洗涤该树脂。
然后，开始本发明的优选方法并按下述进行埃坡霉素从树脂中的解吸优选用根据本发明的弱极性或非极性溶剂、尤其是如上述或下述的优选溶剂、尤其是二氯甲烷或最尤其是甲苯进行。然后尽可能地除去该溶剂，优选直到获得干燥残余物为止。适当的话，将该残余物以较低体积溶于优选上述比例的醇/烃混合物、尤其是甲醇/环己烷混合物中。蒸发醇相，优选至干，然后将该醇提取物从优选上述比例的醇(尤其是异丙醇)与烃(尤其是环己烷)的混合物中结晶。然后将所得固体结晶物质溶于优选如上所述的腈/水混合物、尤其是体积比为2∶3的乙腈/水混合物中，并且需要的话，将所得料液在分流成一个以上支流后倒入制备型反相柱中。随后，用腈/水混合物、尤其是刚才提到的混合物洗脱。通过蒸发(蒸馏)从所得含有埃坡霉素、尤其是埃坡霉素A且最尤其是埃坡霉素B的级分中除去所述(乙)腈，并且将所得水相用酯、尤其是乙酸异丙酯提取。然后蒸发酯提取物，优选至干，并随后再结晶所得物质，例如将埃坡霉素A级分直接从酯/烃混合物(例如乙酸乙酯∶甲苯＝2∶3)中结晶，埃坡霉素B级分从酯(尤其是乙酸乙酯)或优选从醇(尤其是甲醇)中结晶。
已经发现，甲苯是高选择性的洗脱剂(解吸剂)，它可在一半用异丙醇(WO 99/42602所用)所需的解吸时间内达到约100％的产率。令人惊奇的是，与异丙醇解吸相比，用甲苯解吸后，解吸的埃坡霉素量增加，例如增至130％。(尽管从理论角度看，这一点初步看来是不可能的，但它恰恰说明了本发明的主要优点所述结果与负载树脂的分析相关。由于该分析用异丙醇解吸，因此不得不采用不完全解吸作为基础，从而一开始就导致分析值降低，现在发现该值具有欺骗性)。埃坡霉素混合物(未经或经先前的结晶)可直接施加到反相柱中。本发明方法在溶剂量、搅拌速率和温度方面变得高度稳定。而对于搅拌下的醇(例如乙醇或异丙醇)，可能显示出两步解吸，其中第一批包含埃坡霉素的物质在第一时间段内解吸(可由具有两个分布峰的聚苯乙烯XAD-16中发现的孔度分布来解释)，经另一时间段后，第二批解吸—这一不期望的行为在使用甲苯或二氯甲烷时没有观察到，因为其中所有物质在第一时间阶段内就已解吸。在类似条件下，在使用异丙醇解吸埃坡霉素A和B的情况下，一个实施例中发现蒸发残余物为40g，在使用二氯甲烷的情况下，蒸发残余物为3.3g，在使用甲苯的情况下蒸发残余物仅0.9g，从苯乙烯/二乙烯基苯共聚物树脂中解吸后，从如WO 99/42602中所述的包含环糊精的培养基上层清液中获得例如17-18g％埃坡霉素B，这表明纯度高得多。尽管甲苯具有最显著的优点，但二氯甲烷由于其低沸点而具有易于除去的优点。
埃坡霉素A和B的分离也可以通过进行这里公开的色谱法以它的模拟移动床(SMB)方式来实现。SMB-色谱法广泛用于分离二元混合物，例如分离手性固定相上的外消旋物，它们例如是石化工业中的SORBEX方法，像Parex或Molex，或糖工业中的SAREx方法。与间歇色谱法相比，SMB-色谱法具有连续逆流单元操作的优点，该操作使生产率提高且流动相消耗降低。几个用于展开SMB-色谱法方法的系统工序已为本领域熟练技术人员所知。这些工序描述在例如R.-M.Nicoud，M.Bailly，J.Kinkel，R.M.Devant，T.R.E.Hampe和E.Küsters，Proceedings of the 1stEuropean Meeting onSimulated Moving Bed Chromatography(第一届欧洲模拟移动床色谱法会议会刊)，(1993)，ISBN 2-905-267-21-6，第65-88页；E.Küsters，G.Gerber和F.D.Antia，Chromatographia(色谱学)，40(1995)387；T.Prll和E.Küsters，J.Chromatogr.A(色谱学杂志A)，800(1998)135；或C.Heuer，E.Küters，T.Plattner和A.Seidel-Morgenstern，J.Chromatogr.A，827(1998)175中。用SMB色谱法分离埃坡霉素A和B的基本参数可以直接从传统的LC分离获取。优选地，反相硅胶(RP 18)作为固定相，水/乙腈混合物作为流动相。流速(分别对于各个SMB区和切换时间)的最终设定可由E.Küters等人在Chromatographia，40(1995)387中公开的简单流程图获取，或者对如J.Chromatogr.A，800(1998)135和J.Chromatogr.A，827(1998)175中公开的吸附等温线的仔细估算后来确定。提取物和残余物流的后处理也可按为传统LC分离所述的方法进行。
本发明最优选涉及下列实施例中描述的工艺和方法。
实施例下列实施例用于阐述本发明，但并不限制其范围。注意由于埃坡霉素毒性高，必要的话，处理埃坡霉素时必须采取适当的保护措施。实施例1埃坡霉素B的后处理工序将591.7kg负载的树脂(负载有来自培养基的埃坡霉素A和B的苯乙烯/二乙烯基苯共聚物树脂XAD-16)通过搅拌该树脂分两批进行解吸，其中每批用720升甲苯(分四份)搅拌约8小时。使用吸滤器将甲苯相从树脂中分离。合并的甲苯相分两批、每批用250升水洗涤。相分离后，将甲苯提取物在1000升的反应器内浓缩到约20-40升，之后在真空下在旋转式汽化器内浓缩至干。结果得到4.095kg含有209g埃坡霉素B的甲苯提取物。将该甲苯提取物溶于16.5升甲醇和24.5升环己烷中。在加入0.8升水后，立即发生相分离。将甲醇部分在真空下在旋转式汽化器内蒸发至干，得到1.025kg含有194g埃坡霉素B的蒸发残余物。之后将甲醇提取物在由2.05升异丙醇和10.25升环己烷组成的溶剂混合物中结晶，得到0.4kg含有184g埃坡霉素B的结晶物质。将该晶体溶于3.2升体积比为2/3的乙腈/水混合物中，并且将所得料液以三支独立支流转移至制备型反相柱(25kg RP-18球形硅胶，YMC-Gel ODS-A120；5-15μm；Waters Corp.，Milford，Massachusetts，USA)中。以体积比为2/3的乙腈/水混合物作为流动相进行洗脱，流速为2.3升/分钟；埃坡霉素A的停留时间为77-96分钟，埃坡霉素B的停留时间为96-119分钟。用UV探测仪在250nm处监测分级。蒸馏除去(三支流的)合并的埃坡霉素B级分中的乙腈，剩余的水相用504升乙酸异丙酯提取。将乙酸异丙酯提取物在630升的反应器内浓缩到大约20-40升，并且之后在真空下在旋转式汽化器内浓缩至干。埃坡霉素B级分的蒸发残余物的重量为170g，依照HPLC(外标)其含量为98.4％。最后将所得物质于0-5℃下在2.89升甲醇中结晶，得到150g埃坡霉素B纯结晶物。
熔点124-125℃；埃坡霉素B的1H-NMR数据(500MHz-NMR，溶剂DMSO-d6。相对于TMS的化学位移δ，以ppm表示。s表示单峰，d表示双峰，m表示多重峰)δ(多重性)积分(H的数量)7.34(s) 16.50(s) 15.28(d) 15.08(d) 14.46(d) 14.08(m) 13.47(m) 13.11(m) 12.83(dd) 12.64(s) 32.36(m) 22.09(s) 32.04(m) 1
1.83(m) 11.61(m) 11.47-1.24(m)41.18(s) 61.13(m) 21.06(d) 30.89(d+s，重叠) 6∑＝41实施例2制造埃坡霉素B的不同解吸方法的比较将通过WO 99/42602描述的方法制备的、各360ml负载有来自粘细菌培养液的埃坡霉素A和B的苯乙烯/二乙烯基苯共聚物树脂XAD-16的水悬浮液(相当于194g湿AmberliteXAD-16)在下表给出的条件下于搅拌(普通的实验室锚式搅拌器)的、底部具有烧结的玻璃料的玻璃反应器(自制固相间歇反应器，内径10cm×20cm长，以下称为“搅拌器/玻璃料”)内用溶剂提取。表1制造埃坡霉素B的解吸方法的比较起始树脂(负载有吸附的埃坡霉素的树脂)-#1001，理论负载70mg/360ml树脂悬浮液(相当于70mg/194g湿XAD-16)-#1003，理论负载114mg/360ml树脂悬浮液(相当于114mg/194g湿XAD-16)
a没有优化；在提取2次的情况下，损失约5％产率。b用水反萃取3次，保留极性成分c 3次相分离中的第一次进行一夜d与乙酸乙酯蒸发残余物相比，可以更好地在硅胶上对该物质进行色谱分离e相当于约25-30g蒸发残余物f烘箱干燥一周末(高度真空)g可能是有关所用时间的强烈第一相分离的结果h回收第一次提取为700ml；第二次提取为660ml；第三次提取为680mli回收第一次提取为670ml；第二次提取为710ml；第三次提取为720mlj加水的必要性还没有得到证实k简化原始所存在水的除去(XAD-16被所用水覆盖)l鉴于方案8、11和12的结果以及所有使用甲苯的实验的洗脱曲线，不能排除使用较少量树脂。“Erl./mag.St.”代表锥形瓶中的磁力搅拌。“Methylenchloride”(“Methylenchl.”)为二氯甲烷“Stir./Frit”代表搅拌器/玻璃料“RT”代表室温从这些实验和其它数据可以推论与异丙醇相比，用二氯甲烷提取具有更好的选择性，更短的提取时间(大约缩短到1/2)，更快的溶剂蒸馏(二氯甲烷的沸点约40℃，异丙醇的沸点为81-83℃)，不再需要费时且非常麻烦的乙酸乙酯/水相分离，不再需要第二次溶剂蒸馏，因此可使用更少的工艺步骤，结果产生更低的污染危险，更好且更安全的处理；可以以一半体积(例如在1000升的反应器内，而不是在2000升的反应器内)进行后处理；产物埃坡霉素B具有更好的纯度分布(与埃坡霉素B极性类似的副产物更少)，并且如在使用乙酸乙酯提取的情况下，蒸发残余物不发生溅射和起泡。对于使用甲苯的解吸，获得了与异丙醇提取相比更高的产率(约100％，而不是约80％)，可以观察到更好的选择性(使用异丙醇时，约10倍量的副产物被解吸)，提取时间显著缩短(大约缩短到1/3)，用异丙醇解吸后的复杂过滤得到简化(使用异丙醇的提取难于在更大规模上实施)，不再需要第二次溶剂蒸馏，后处理可以在更小的反应器内进行(再一次，例如可以用1000升的反应器代替2000升的反应器)，可以省去硅胶色谱法(解吸后的蒸发残余物已经含有约40％的埃坡霉素A/B混合物)，并且解吸后的蒸发残余物不表现出在用乙酸乙酯提取的残余物中观察到的起泡和溅射。
权利要求
1.一种从树脂中解吸埃坡霉素的方法，所述方法使用弱极性或非极性溶剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中待解吸的埃坡霉素是埃坡霉素A或埃坡霉素B。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述树脂是合成树脂。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述树脂是基于苯乙烯/二乙烯基苯共聚物的合成树脂。
5.如权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中所述弱极性或非极性溶剂选自低级烷基卤化物和芳族溶剂或两种或更多种这些溶剂的混合物。
6.如权利要求5所述的方法，其中使用的芳族溶剂选自萘，苯或被一个或多个选自下列的基团取代的萘或苯低级烷基、低级烷氧基、卤素、硝基和低级烷氧基-低级烷基。
7.一种分离吸附到合成树脂中的埃坡霉素的方法，该方法包括(iii)用弱极性或非极性溶剂从所述合成树脂中解吸埃坡霉素；以及(iv)在溶于适当溶剂后通过反相色谱法分离埃坡霉素并用腈与水的混合物洗脱。
8.如权利要求1-7中任意一项所述的方法，还包括任何其它期望或需要的提纯步骤，以得到纯净形式的各种埃坡霉素。
9.一种从反应混合物中后处理埃坡霉素的方法，所述方法包括-用弱极性或非极性溶剂、特别是用低级烷基卤化物或芳族溶剂解吸埃坡霉素，其中该解吸步骤可以重复进行以获得更完全的解吸；-通过蒸发从所得溶液中除去用于解吸的溶剂；-解吸后任选使埃坡霉素结晶；尤其为使埃坡霉素B结晶，加入醇与烃的混合物、尤其是低级链烷醇与含有3-10个环原子的脂环烃的混合物，将醇相蒸发至干，并将埃坡霉素B从适当的溶剂混合物中、尤其是从醇/脂环烃的混合物中结晶；-(必须步骤)在将来自先前步骤的残余物溶于适当溶剂、尤其是腈与水的混合物后，通过反相色谱法分离埃坡霉素，并用腈与水的混合物洗脱，优选特征在于该色谱法在反相材料的柱子中进行，该反相材料带有烃链、尤其是包含含有18个碳原子的烃链的RP-18材料，以及使用包含腈、尤其是低级烷基腈的洗脱剂，特别使用腈/水混合物，尤其是乙腈/水混合物；并通过蒸发从收集的包含埃坡霉素的级分中除去所述腈；需要的话，然后将含埃坡霉素的剩余水用酯、尤其是低级链烷酸的低级烷基酯提取，随后将含埃坡霉素的酯相蒸发至干；-任选通过吸附色谱法、特别是通过加入到硅胶柱中并用适当的溶剂或溶剂混合物洗脱而进一步提纯；-以及最后将提纯的埃坡霉素从适当的溶剂或溶剂混合物中再结晶；在该方法中，必要和/或需要的话，在所使用的各步骤之间，将所得溶液或悬浮液浓缩，和/或特别通过沉降、过滤或离心分离溶液/悬浮液将液体和固体组分彼此分离。
10.如权利要求9所述的方法，其中埃坡霉素从树脂中的解吸使用弱极性或非极性溶剂、尤其是权利要求5或6中提到的优选溶剂进行；然后尽可能地除去该溶剂，优选直到获得干燥残余物为止，适当的话，将该残余物以较低体积溶于醇/烃混合物中；蒸发醇相，优选至干，然后将该醇提取物从醇与烃的混合物中结晶，并然后将所得固体结晶物质溶于如权利要求8所述的腈/水混合物、尤其是体积比为2∶3的乙腈/水混合物中，并且需要的话，将所得料液在分流成一个以上支流后倒入制备型反相柱中；随后用腈/水混合物洗脱；然后通过蒸发从所得含有埃坡霉素的级分中除去所述腈，并且将所得水相用酯提取；然后蒸发所述酯提取物并随后再结晶所得物质。
11.如权利要求7、9或10中任意一项所述的方法，其中埃坡霉素A和B的分离通过模拟移动床(SMB)色谱法实现。
12.弱极性或非极性溶剂用于从树脂中解吸埃坡霉素的用途。
13.如权利要求12所述的用途，其中所述弱极性或非极性溶剂选自低级烷基卤化物和芳族溶剂，尤其是萘，苯或被一个或多个选自下列的基团取代的萘或苯低级烷基、低级烷氧基、卤素、硝基和低级烷氧基-低级烷基，或为两种或更多种这些溶剂的混合物；所述树脂为合成树脂。
全文摘要
本发明涉及一种从树脂中解吸埃坡霉素、尤其是埃坡霉素A和/或埃坡霉素B的方法，并涉及包括所述解吸方法在内的埃坡霉素的新的生产、后处理或提纯方法或制造方法，以及某些溶剂用于从树脂中解吸埃坡霉素的用途。
文档编号A61K31/335GK1479741SQ01820141
公开日2004年3月3日 申请日期2001年12月5日 优先权日2000年12月7日
发明者E·屈斯特斯, H·昂特内赫尔, E 屈斯特斯, 啬诤斩 申请人:诺瓦提斯公司
技术领域：
本发明涉及一种从树脂中解吸埃坡霉素(epothilone)、尤其是埃坡霉素A和/或埃坡霉素B的新方法，并涉及包括所述解吸方法在内的埃坡霉素的新的生产、后处理或提纯方法或制造方法，以及某些溶剂用于从树脂中解吸埃坡霉素的用途。
背景技术：
埃坡霉素A和B代表下式表示的、新的一类稳定微管的细胞毒素活性成分(参见Gerth，K.等人，J.Antibiot.(抗生素杂志)49，第560-563页(1966)) 其中R代表氢(埃坡霉素A)或甲基(埃坡霉素B)。
自从描述了这些埃坡霉素(见WO 93/10121)后，已经公开了几种合成和制造这两种埃坡霉素和大量主要的埃坡霉素衍生物(以下统称为“埃坡霉素”)的方法，例如在WO 99/03848、WO 00/49020、WO 00/49021、WO00/47584、WO 00/000485、WO 00/23452、WO 99/03848、WO 00/49019、WO 99/07692、WO 98/22461、WO 99/65913、WO 98/38192、WO 00/50423、WO 00/22139、WO 99/58534、WO 97/19086、WO 98/25929、WO 99/67252、WO 99/67253、WO 00/31247、WO 99/42602、WO 99/28324、WO 00/50423、WO 00/39276、WO 99/27890、WO 99/54319、WO 99/54318、WO 99/02514、WO 99/59985、WO 00/37473、WO 98/08849、US 6,043,372、US 5,969,145、WO 99/40047、WO 99/01124和WO 99/43653中公开的那些。除了埃坡霉素A和埃坡霉素B以外，尤其是在WO 97/19086和WO 98/22461中描述的埃坡霉素D和E，在WO 98/22461中描述的埃坡霉素E和F，以及在WO 99/02514中描述的埃坡霉素显示出令人感兴趣的性能。
作为治疗用途的实例，国际申请WO 99/43320描述了埃坡霉素作为抗增生疾病、尤其是抗肿瘤疾病药剂的各种给药方式，由于机理相似，该药剂的作用方式与熟知的且市场化的抗癌药剂Taxol相似。WO 99/39694公开了埃坡霉素、尤其是埃坡霉素A和B的一些具体的制剂。
与已经确立的治疗相比，尤其是在肿瘤对用Taxol治疗已经产生耐药性的情况下，埃坡霉素、尤其是埃坡霉素A且最优选埃坡霉素B具有各种优势。因此，为了满足预期需要，迫切需要大量合成它们的方法。
迄今为止，最有效的生产方法至少包括一些生物合成步骤和埃坡霉素从培养基或类似物质中分离的步骤。
最初，通过粘细菌提取天然物质，尤其是从细胞株SorangiumCellulosum Soce90(在German Collection of Microorganisms(德国微生物保存中心)以编号6773保藏，见WO 93/10121)提取埃坡霉素的描述见于文献。为了获得天然物质、尤其是埃坡霉素的满意浓度，以前总是将基于聚苯乙烯的吸附物树脂如Amberlite XAD-1180(Rohm&Haas，法兰克福，德国)加入培养基中以吸收该培养基。
但是，该方法的缺点是大规模生产会产生许多问题。阀门被树脂球损坏，管道可能堵塞，设备可能因机械摩擦而受到较大磨损。树脂球是多孔的，因此具有较大的内表面积(约825m2/g树脂)。由于包含在树脂中的空气不是高压灭菌的，所以消毒成为问题。因此该方法不能在培养生产埃坡霉素的微生物过程中向其中添加树脂而大规模地切合实际地进行。
因此，发现了一种生产埃坡霉素、尤其是埃坡霉素A和B的先进方法，该方法描述在WO 99/42602中。该方法包括埃坡霉素自生产埃坡霉素的微生物培养基的络合，所述培养基包含环糊精或其它络合物形成剂；无细胞培养基(例如所述培养基的滤液或离心液)与作为基质的合成树脂如基于苯乙烯/二乙烯基苯共聚物的树脂[如Amberlite XAD-16(Rohm&HaasGermany GmbH，法兰克福，德国)或Diaion HP-20(Resindion S.R.L.，Mitsubishi Chemical Co.，米兰，意大利)]混合以吸附埃坡霉素；以及尤其是用醇、最优选用异丙醇的解吸。随后，将水加入醇相，除去溶剂相(优选通过蒸发)；将所得残余物在酯、尤其是乙酸乙酯或乙酸异丙酯存在下相分离；通常分子过滤(凝胶色谱法)干燥后的酯相；通过反相HPLC(优选用腈/水混合物，例如乙腈/水混合物洗脱)分离所得埃坡霉素混合物；任选通过在水/醚混合物存在下的相分离进一步提纯；优选随后进行在硅胶上的吸附色谱法以进一步除去杂质；以及结晶/再结晶。
尽管该方法具有有益的进步且适合于工业规模生产，但是仍然具有某些缺点。
例如，为了获得足够的纯度，利用分子过滤步骤或硅胶吸附色谱法步骤或两者是可行的。更多的困难来自在酯如乙酸乙酯存在下的相分离—该过程(尤其由于大工业规模的水/酯相的相分离时间较长)非常耗时，以及随后的蒸发由于发泡和溅射也难于处理。
因此，本发明要解决的问题是尽可能多地避免上述困难，并发现分离吸附到树脂中的埃坡霉素、尤其是埃坡霉素A和B的有利方法。
发明概述非常令人惊奇的是，现在已经发现通过简单地用某些其它溶剂(如下面详细说明的弱极性或非极性溶剂)替换用作解吸溶剂的醇，在获得解决上述问题的方案方面就提供了实质性突破，产生了附加优点如改善的解吸和较高最终产率。其中的附加优点是(i)较高的解吸选择性；(ii)较高的埃坡霉素解吸量(这说明解吸更完全)；(iii)无需使用酯(例如乙酸乙酯)再提取且无需随后的醚蒸发，其中使用酯再提取需要进行高度麻烦的水/酯相分离；(iv)无需分子过滤且通常无需吸附色谱法；(v)解吸需要的时间显著减少；(vi)工艺步骤较少；(vii)污染危险减少(对具有高毒性的埃坡霉素非常重要)，和/或(viii)处理更好且更安全(取决于用于解吸(提取)的溶剂)；和(ix)同样取决于溶剂，在反相色谱法分离后，出乎意料地甚至更少量的与埃坡霉素、尤其是埃坡霉素B极性相似的副产物或杂质需要除去。这些和其它优点可从下面的发明详述中推论出。
发明详述本发明的一个方面涉及一种用弱极性或非极性溶剂从树脂、尤其是合成树脂中解吸埃坡霉素、尤其是埃坡霉素A和/或B、特别是埃坡霉素B的方法。
本发明的另一方面涉及一种尤其当埃坡霉素在化学合成用的标准介质或优选在培养基中生产之后后处理(或提纯)它们的方法，所述培养基特别是包含适于生产埃坡霉素、尤其是埃坡霉素A和/或B的Sorangium属微生物，尤其是粘细菌以及络合物形成成分，所述方法包括使用弱极性或非极性溶剂将所述埃坡霉素从树脂中解吸。
本发明的第三方面涉及弱极性或非极性溶剂用于从树脂、尤其是合成树脂中解吸埃坡霉素、尤其是埃坡霉素A和/或B、特别是埃坡霉素B的用途。
以上和以下使用的通用术语优选具有下面给定的含义术语“埃坡霉素”优选涉及以下专利申请中提及的任何埃坡霉素或埃坡霉素衍生物WO 99/03848、WO 00/49020、WO 00/49021、WO 00/47584、WO 00/00485、WO 00/23452、WO 99/03848、WO 00/49019、WO 99/07692、WO 98/22461、WO 99/65913、WO 98/38192、WO 00/50423、WO 00/22139、WO 99/58534、WO 97/19086、WO 98/25929、WO 99/67252、WO 99/67253、WO 00/31247、WO 99/42602、WO 99/28324、WO 00/50423、WO 00/39276、WO 99/27890、WO 99/54319、WO 99/54318、WO 99/02514、WO 99/59985、WO 00/37473、WO 98/08849、US 6,043,372、US 5,969,1 45、WO 99/40047、WO 99/01124和/或WO 99/43653，更优选涉及埃坡霉素A且尤其是埃坡霉素B，但是在本发明的更宽范围内还涉及在WO 97/19086和WO 98/22461中描述的埃坡霉素D和E、在WO 98/22461中描述的埃坡霉素E和F或在WO99/02514中描述的埃坡霉素。此处引用所有这些文件，尤其是有关埃坡霉素衍生物和其中提到的优选埃坡霉素衍生物的文件作为参考。
弱极性或非极性溶剂具有以下特征优选的是在根据Snyder等人，J.Chromatogr.Sci.(色谱科学杂志)16，223(1978)确定的洗脱序中显示出以下特征的溶剂或这些溶剂的混合物，其中xe是质子受体参数(表示作为氢受体形成氢键的趋势)，xd是质子供体参数(表示作为氢供体形成氢键的趋势)，以及xn是偶极参数(表示偶极特性)，条件是xe+xd+xn＝1xe＝0.20-0.40；xd＝0.15-0.36；以及xn＝0.38-0.60；优选xe＝0.22-0.32；xd＝0.17-0.34；以及xn＝0.39-0.54.
在弱极性或非极性溶剂中，非常优选低级烷基·低级烷基酮或环酮，例如丙酮、甲基·乙基酮、2-戊酮、甲基·异丁基酮或环己酮；更优选醚，尤其是环醚，更尤其是四氢呋喃或二噁烷；甚至更优选脂族卤素化合物，尤其是低级烷基卤化物，尤其是二氯甲烷或1，2-二氯乙烷；或最尤其是芳族溶剂，尤其是萘或(优选)苯，或被1个或多个、优选1-3个选自下列的基团取代的萘或(优选)苯低级烷基，尤其是甲基、乙基或异丙基，低级烷氧基，尤其是甲氧基或乙氧基，卤素，尤其是氟、氯、溴或碘，硝基和低级烷氧基-低级烷基，尤其是乙氧基甲基；尤其是甲苯、乙苯、二甲苯(尤其是邻-、间-或对二甲苯)，1，3，5-三甲基苯，假枯烯，连三甲苯，枯烯，异丙基甲苯，苯基卤化物，尤其是氟代苯、氯代苯、溴代苯或碘代苯，低级烷氧基苯，尤其是乙氧基苯或甲氧基苯，或低级烷氧基-低级烷基苯，尤其是乙氧基甲基苯(苄基·乙基醚)；或两种或更多种如2-4种这些溶剂的混合物；最优选的是低级烷基苯，尤其是乙苯、二甲苯(尤其是邻-、间-或对二甲苯)、1，3，5-三甲基苯、假枯烯、连三甲苯、枯烯、异丙基甲苯；以及最尤其是甲苯。
术语“弱极性或非极性溶剂”也包括以上和以下所述溶剂中两种或更多种如2-4种这些溶剂的混合物。
前缀“低级”总是表示相应指定的基团含有优选至多7个碳原子，特别是至多4个碳原子，并且是支化的或未支化的。低级烷基可以例如是未支化的或支化一次或多次的，且例如为甲基，乙基，丙基如异丙基和正丙基，丁基如异丁基、仲丁基、叔丁基或正丁基，或还为戊基如戊基或正戊基。
卤素优选为碘、溴、氯或氟。
烃优选为含有4-32、更优选4-20、甚至更优选6-16个碳原子的有机化合物，且可以是脂族的，例如线性、支化或环状的饱和烷烃如环己烷；具有1个或多个双键和/或叁键的线性、支化或环状(非芳族)有机化合物；或芳族烃。后者为未取代的或被1个或多个如至多3个选自下列的基团取代低级烷基，尤其是甲基、乙基或异丙基，低级烷氧基，尤其是甲氧基或乙氧基，卤素，尤其是氟、氯、溴或碘，硝基和低级烷氧基-低级烷基，尤其是乙氧基甲基；优选被1-3个低级烷基取代。
醇优选为羟基-低级烷烃，尤其是甲醇、乙醇、正丙醇或异丙醇。
树脂尤其是合成树脂，优选基于苯乙烯和二乙烯基苯共聚物的树脂，更优选Amberlite XAD-4或优选Amberlite XAD-16[Rohm&HaasGermany GmbH，法兰克福]或Diaion HP-20 [Resindion S.R.L.，MitsubishiChemical Co.，米兰]。无需赘言，一种或多种埃坡霉素根据本发明从其中解吸的树脂含有与之非共价键接触(例如与之可逆结合或吸附)的埃坡霉素。换言之，在使用术语“树脂”时，其用于指“含有一种或多种与之接触、尤其与之可逆结合或吸附的埃坡霉素的树脂”。
本发明的优选实施方式在本发明的优选实施方式中，本发明涉及一种方法，该方法包括用上述或下述弱极性或非极性溶剂从树脂中的解吸，还包括任何其它期望的或要求的提纯步骤，优选本发明中优选描述的那些，以产生纯净形式的各种埃坡霉素，尤其是埃坡霉素A且最尤其是埃坡霉素B。
埃坡霉素的后处理在产生包含待后处理埃坡霉素的反应产物的反应或方法之后进行，将该埃坡霉素(i)在溶于适当的极性水性介质后从化学反应混合物中分离，或(ii)更优选从具有生产该埃坡霉素的微生物的培养基的上层清液(例如含有一种如WO 99/42602中描述的埃坡霉素的环糊精)中通过将培养基分离为液相(例如离心液或滤液)和固相(细胞)、尤其是通过过滤或离心分离(管式离心机或分离器)来分离。
在该预处理后，优选直接将所述溶液((i))或液相((ii))与作为基质的树脂、尤其是合成树脂、尤其是基于苯乙烯和二乙烯基苯共聚物的树脂(以下也简称为聚苯乙烯树脂)如Amberlite XAD-16或Diaion HP-20混合(离心液与树脂的体积比优选为约10∶1-100∶1，优选为约50∶1)。在优选0.25-50小时、尤其是0.8-22小时的接触时间后，例如通过过滤、沉降或离心分离将树脂分离出来。需要的话，吸附后用强极性溶剂、优选用水洗涤该树脂。
然后，开始本发明的优选后处理方法用弱极性或非极性溶剂、特别是用低级烷基卤化物、尤其是二氯甲烷或1，2-二氯乙烷；或更优选用芳族溶剂，尤其是萘或(优选)苯，或被1个或多个、优选1-3个选自下列的基团取代的萘或(优选)苯低级烷基，尤其是甲基、乙基或异丙基，低级烷氧基，尤其是甲氧基或乙氧基，卤素，尤其是氟、氯、溴或碘，硝基和低级烷氧基-低级烷基，尤其是乙氧基甲基；最优选用甲苯来进行埃坡霉素的解吸(本身构成本发明非常优选的实施方式)。必要或需要的话，该提取步骤可重复1次或多次，优选0-3次，尤其是1次，以获得更完全的解吸。
在可这样获得的(在重复提取的情况下，已合并)解吸的埃坡霉素溶液的后处理之后，优选将用于解吸的溶剂从所得溶液中通过蒸发(蒸馏)、优选通过在反应器内并随后在真空下在旋转式汽化器内浓缩而除去。
随后，采用以下步骤进行进一步处理，其中通过用腈洗脱的反相色谱法进行的提纯步骤是必须的，而其它步骤是任选的-解吸后使埃坡霉素结晶；尤其为使埃坡霉素B结晶，加入醇与烃的混合物，尤其是低级链烷醇与含有3-10个环原子的脂环烃的混合物，最尤其是甲醇与环己烷的混合物，其中所述混合物的体积比优选是1∶10-10∶1，尤其是1∶3-3∶1。加入水引起快速相分离，并且例如利用旋转式汽化器在真空下将醇相蒸发至干。之后将所得包含埃坡霉素B的提取物从适当的溶剂混合物、尤其是从醇/脂环烃混合物、最优选是从异丙醇/环己烷混合物中结晶，其中所述混合物的体积比优选为1∶10-10∶1，更优选为1∶6-6∶1，最优选为1∶6-1∶4；-(必须的)在溶于适当溶剂、尤其是腈与水的混合物、优选为乙腈/水混合物后，通过反相色谱法分离埃坡霉素，并用腈与水的混合物洗脱，其中所述溶剂混合物的体积比优选为1∶10-10∶1，尤其为1∶3-1∶1，优选特征在于该色谱法在反相材料的柱子中进行，该反相材料带有烃链，例如含有18个碳原子的烃链，尤其是RP-18材料，以及使用包含腈、尤其是低级烷基腈、特别是乙腈的洗脱剂，特别使用腈/水混合物，尤其是乙腈/水混合物，其中腈与水的比例优选为约1∶99-99∶1，基本为1∶9-9∶1，例如为2∶8-7∶3，例如3∶7或4∶6；并通过蒸发(蒸馏)从收集的包含埃坡霉素(尤其是埃坡霉素A或最尤其是埃坡霉素B)的级分中除去所述腈；需要的话，然后将含埃坡霉素的剩余水用酯、尤其是低级链烷酸的低级烷基酯、优选乙酸异丙酯提取，随后将含埃坡霉素的酯相蒸发(优选首先在反应器内，然后在真空下在旋转式汽化器内)至干；(需要的话，起始的埃坡霉素溶液可以分流并分成一个以上的反相独立流；)-仅当需要时(例如，作为解吸后结晶的替换)，进行吸附色谱法，特别是通过加入到硅胶柱中并用适当的溶剂或溶剂混合物、尤其是酯/烃混合物如链烷酸的低级烷基酯/C4-C10烷烃、尤其是乙酸乙酯或乙酸异丙酯/正己烷的混合物洗脱，其中优选所述酯与烃的比例为99∶1-1∶99，优选为10∶1-1∶10，例如4∶1；-以及最后的再结晶，例如从适当的溶剂或溶剂混合物中再结晶，该溶剂例如包括酯、酯/烃混合物或醇，尤其是乙酸乙酯或乙酸异丙酯/甲苯的1∶10-10∶1、优选2∶3混合物(埃坡霉素A)或甲醇或乙酸乙酯(埃坡霉素B)；在该方法中，必要和/或需要的话，在所使用的各步骤之间，将所得溶液或悬浮液浓缩，和/或特别通过沉降、过滤或离心分离溶液/悬浮液将液体和固体组分彼此分离。上述和下述更精确的定义可优选用于上述各步骤中。
本发明的优选实施方式还涉及一种用于分离吸附到合成树脂中的埃坡霉素、尤其是埃坡霉素A或最尤其是埃坡霉素B的方法，该方法包括(i)用弱极性或非极性溶剂、特别是用低级烷基卤化物、尤其是二氯甲烷或1，2-二氯乙烷；或更优选用芳族溶剂，尤其是萘或(优选)苯，或被1个或多个、优选1-3个选自下列的基团取代的萘或(优选)苯低级烷基，尤其是甲基、乙基或异丙基，低级烷氧基，尤其是甲氧基或乙氧基，卤素，尤其是氟、氯、溴或碘，硝基和低级烷氧基-低级烷基，尤其是乙氧基甲基；最优选用甲苯；或在本发明的更宽范围内用两种或更多种这些溶剂的混合物将埃坡霉素从所述合成树脂中解吸；以及(ii)在溶于适当溶剂、尤其是腈与水的混合物、优选为乙腈/水混合物后，通过反相色谱法分离埃坡霉素，并用腈与水的混合物洗脱，其中所述混合溶剂的体积比优选为1∶10-10∶1，尤其为1∶3-1∶1，优选特征在于该色谱法在反相材料、尤其是RP-18材料的柱子中进行，该材料带有烃链，
例如含有18个碳原子的烃链，以及使用包含腈、尤其是低级烷基腈、特别是乙腈的洗脱剂，特别使用腈/水混合物，尤其是乙腈/水混合物，其中腈与水的比例优选为约1∶99-99∶1，基本为1∶9-9∶1，例如为2∶8-7∶3，例如3∶7或4∶6。
在本发明的另一优选实施方式中，上一段落中的从步骤(i)起始且包括步骤(ii)的方法还包括任何其它期望或需要的提纯步骤，优选本发明中优选描述的那些，以产生纯净形式的各种埃坡霉素，尤其是埃坡霉素A且最尤其是埃坡霉素B。
后处理的准备优选按下述进行埃坡霉素的吸附，尤其是从化学反应混合物中或更优选从微生物培养液的上层清液中的吸附可按WO 99/42602中所述或类似方法实现；简言之，在离心液中发现有埃坡霉素，随后将该离心液与合成树脂、尤其是苯乙烯/二乙烯基苯共聚物树脂如AmberliteXAD-16或Diaion HP-20直接混合(优选离心液与树脂的体积比为约10∶1-100∶1，优选为约50∶1)并用搅拌器搅拌。在该步骤中，埃坡霉素转移到树脂中。在经充分吸附的时间如约0.2-10小时的接触时间后，通过离心分离或过滤将该树脂分离出来。埃坡霉素在树脂上的吸附也可以在色谱柱中进行，通过将该树脂放置在柱内并使离心液流过该树脂。吸附后，用水洗涤该树脂。
然后，开始本发明的优选方法并按下述进行埃坡霉素从树脂中的解吸优选用根据本发明的弱极性或非极性溶剂、尤其是如上述或下述的优选溶剂、尤其是二氯甲烷或最尤其是甲苯进行。然后尽可能地除去该溶剂，优选直到获得干燥残余物为止。适当的话，将该残余物以较低体积溶于优选上述比例的醇/烃混合物、尤其是甲醇/环己烷混合物中。蒸发醇相，优选至干，然后将该醇提取物从优选上述比例的醇(尤其是异丙醇)与烃(尤其是环己烷)的混合物中结晶。然后将所得固体结晶物质溶于优选如上所述的腈/水混合物、尤其是体积比为2∶3的乙腈/水混合物中，并且需要的话，将所得料液在分流成一个以上支流后倒入制备型反相柱中。随后，用腈/水混合物、尤其是刚才提到的混合物洗脱。通过蒸发(蒸馏)从所得含有埃坡霉素、尤其是埃坡霉素A且最尤其是埃坡霉素B的级分中除去所述(乙)腈，并且将所得水相用酯、尤其是乙酸异丙酯提取。然后蒸发酯提取物，优选至干，并随后再结晶所得物质，例如将埃坡霉素A级分直接从酯/烃混合物(例如乙酸乙酯∶甲苯＝2∶3)中结晶，埃坡霉素B级分从酯(尤其是乙酸乙酯)或优选从醇(尤其是甲醇)中结晶。
已经发现，甲苯是高选择性的洗脱剂(解吸剂)，它可在一半用异丙醇(WO 99/42602所用)所需的解吸时间内达到约100％的产率。令人惊奇的是，与异丙醇解吸相比，用甲苯解吸后，解吸的埃坡霉素量增加，例如增至130％。(尽管从理论角度看，这一点初步看来是不可能的，但它恰恰说明了本发明的主要优点所述结果与负载树脂的分析相关。由于该分析用异丙醇解吸，因此不得不采用不完全解吸作为基础，从而一开始就导致分析值降低，现在发现该值具有欺骗性)。埃坡霉素混合物(未经或经先前的结晶)可直接施加到反相柱中。本发明方法在溶剂量、搅拌速率和温度方面变得高度稳定。而对于搅拌下的醇(例如乙醇或异丙醇)，可能显示出两步解吸，其中第一批包含埃坡霉素的物质在第一时间段内解吸(可由具有两个分布峰的聚苯乙烯XAD-16中发现的孔度分布来解释)，经另一时间段后，第二批解吸—这一不期望的行为在使用甲苯或二氯甲烷时没有观察到，因为其中所有物质在第一时间阶段内就已解吸。在类似条件下，在使用异丙醇解吸埃坡霉素A和B的情况下，一个实施例中发现蒸发残余物为40g，在使用二氯甲烷的情况下，蒸发残余物为3.3g，在使用甲苯的情况下蒸发残余物仅0.9g，从苯乙烯/二乙烯基苯共聚物树脂中解吸后，从如WO 99/42602中所述的包含环糊精的培养基上层清液中获得例如17-18g％埃坡霉素B，这表明纯度高得多。尽管甲苯具有最显著的优点，但二氯甲烷由于其低沸点而具有易于除去的优点。
埃坡霉素A和B的分离也可以通过进行这里公开的色谱法以它的模拟移动床(SMB)方式来实现。SMB-色谱法广泛用于分离二元混合物，例如分离手性固定相上的外消旋物，它们例如是石化工业中的SORBEX方法，像Parex或Molex，或糖工业中的SAREx方法。与间歇色谱法相比，SMB-色谱法具有连续逆流单元操作的优点，该操作使生产率提高且流动相消耗降低。几个用于展开SMB-色谱法方法的系统工序已为本领域熟练技术人员所知。这些工序描述在例如R.-M.Nicoud，M.Bailly，J.Kinkel，R.M.Devant，T.R.E.Hampe和E.Küsters，Proceedings of the 1stEuropean Meeting onSimulated Moving Bed Chromatography(第一届欧洲模拟移动床色谱法会议会刊)，(1993)，ISBN 2-905-267-21-6，第65-88页；E.Küsters，G.Gerber和F.D.Antia，Chromatographia(色谱学)，40(1995)387；T.Prll和E.Küsters，J.Chromatogr.A(色谱学杂志A)，800(1998)135；或C.Heuer，E.Küters，T.Plattner和A.Seidel-Morgenstern，J.Chromatogr.A，827(1998)175中。用SMB色谱法分离埃坡霉素A和B的基本参数可以直接从传统的LC分离获取。优选地，反相硅胶(RP 18)作为固定相，水/乙腈混合物作为流动相。流速(分别对于各个SMB区和切换时间)的最终设定可由E.Küters等人在Chromatographia，40(1995)387中公开的简单流程图获取，或者对如J.Chromatogr.A，800(1998)135和J.Chromatogr.A，827(1998)175中公开的吸附等温线的仔细估算后来确定。提取物和残余物流的后处理也可按为传统LC分离所述的方法进行。
本发明最优选涉及下列实施例中描述的工艺和方法。
实施例下列实施例用于阐述本发明，但并不限制其范围。注意由于埃坡霉素毒性高，必要的话，处理埃坡霉素时必须采取适当的保护措施。实施例1埃坡霉素B的后处理工序将591.7kg负载的树脂(负载有来自培养基的埃坡霉素A和B的苯乙烯/二乙烯基苯共聚物树脂XAD-16)通过搅拌该树脂分两批进行解吸，其中每批用720升甲苯(分四份)搅拌约8小时。使用吸滤器将甲苯相从树脂中分离。合并的甲苯相分两批、每批用250升水洗涤。相分离后，将甲苯提取物在1000升的反应器内浓缩到约20-40升，之后在真空下在旋转式汽化器内浓缩至干。结果得到4.095kg含有209g埃坡霉素B的甲苯提取物。将该甲苯提取物溶于16.5升甲醇和24.5升环己烷中。在加入0.8升水后，立即发生相分离。将甲醇部分在真空下在旋转式汽化器内蒸发至干，得到1.025kg含有194g埃坡霉素B的蒸发残余物。之后将甲醇提取物在由2.05升异丙醇和10.25升环己烷组成的溶剂混合物中结晶，得到0.4kg含有184g埃坡霉素B的结晶物质。将该晶体溶于3.2升体积比为2/3的乙腈/水混合物中，并且将所得料液以三支独立支流转移至制备型反相柱(25kg RP-18球形硅胶，YMC-Gel ODS-A120；5-15μm；Waters Corp.，Milford，Massachusetts，USA)中。以体积比为2/3的乙腈/水混合物作为流动相进行洗脱，流速为2.3升/分钟；埃坡霉素A的停留时间为77-96分钟，埃坡霉素B的停留时间为96-119分钟。用UV探测仪在250nm处监测分级。蒸馏除去(三支流的)合并的埃坡霉素B级分中的乙腈，剩余的水相用504升乙酸异丙酯提取。将乙酸异丙酯提取物在630升的反应器内浓缩到大约20-40升，并且之后在真空下在旋转式汽化器内浓缩至干。埃坡霉素B级分的蒸发残余物的重量为170g，依照HPLC(外标)其含量为98.4％。最后将所得物质于0-5℃下在2.89升甲醇中结晶，得到150g埃坡霉素B纯结晶物。
熔点124-125℃；埃坡霉素B的1H-NMR数据(500MHz-NMR，溶剂DMSO-d6。相对于TMS的化学位移δ，以ppm表示。s表示单峰，d表示双峰，m表示多重峰)δ(多重性)积分(H的数量)7.34(s) 16.50(s) 15.28(d) 15.08(d) 14.46(d) 14.08(m) 13.47(m) 13.11(m) 12.83(dd) 12.64(s) 32.36(m) 22.09(s) 32.04(m) 1
1.83(m) 11.61(m) 11.47-1.24(m)41.18(s) 61.13(m) 21.06(d) 30.89(d+s，重叠) 6∑＝41实施例2制造埃坡霉素B的不同解吸方法的比较将通过WO 99/42602描述的方法制备的、各360ml负载有来自粘细菌培养液的埃坡霉素A和B的苯乙烯/二乙烯基苯共聚物树脂XAD-16的水悬浮液(相当于194g湿AmberliteXAD-16)在下表给出的条件下于搅拌(普通的实验室锚式搅拌器)的、底部具有烧结的玻璃料的玻璃反应器(自制固相间歇反应器，内径10cm×20cm长，以下称为“搅拌器/玻璃料”)内用溶剂提取。表1制造埃坡霉素B的解吸方法的比较起始树脂(负载有吸附的埃坡霉素的树脂)-#1001，理论负载70mg/360ml树脂悬浮液(相当于70mg/194g湿XAD-16)-#1003，理论负载114mg/360ml树脂悬浮液(相当于114mg/194g湿XAD-16)
a没有优化；在提取2次的情况下，损失约5％产率。b用水反萃取3次，保留极性成分c 3次相分离中的第一次进行一夜d与乙酸乙酯蒸发残余物相比，可以更好地在硅胶上对该物质进行色谱分离e相当于约25-30g蒸发残余物f烘箱干燥一周末(高度真空)g可能是有关所用时间的强烈第一相分离的结果h回收第一次提取为700ml；第二次提取为660ml；第三次提取为680mli回收第一次提取为670ml；第二次提取为710ml；第三次提取为720mlj加水的必要性还没有得到证实k简化原始所存在水的除去(XAD-16被所用水覆盖)l鉴于方案8、11和12的结果以及所有使用甲苯的实验的洗脱曲线，不能排除使用较少量树脂。“Erl./mag.St.”代表锥形瓶中的磁力搅拌。“Methylenchloride”(“Methylenchl.”)为二氯甲烷“Stir./Frit”代表搅拌器/玻璃料“RT”代表室温从这些实验和其它数据可以推论与异丙醇相比，用二氯甲烷提取具有更好的选择性，更短的提取时间(大约缩短到1/2)，更快的溶剂蒸馏(二氯甲烷的沸点约40℃，异丙醇的沸点为81-83℃)，不再需要费时且非常麻烦的乙酸乙酯/水相分离，不再需要第二次溶剂蒸馏，因此可使用更少的工艺步骤，结果产生更低的污染危险，更好且更安全的处理；可以以一半体积(例如在1000升的反应器内，而不是在2000升的反应器内)进行后处理；产物埃坡霉素B具有更好的纯度分布(与埃坡霉素B极性类似的副产物更少)，并且如在使用乙酸乙酯提取的情况下，蒸发残余物不发生溅射和起泡。对于使用甲苯的解吸，获得了与异丙醇提取相比更高的产率(约100％，而不是约80％)，可以观察到更好的选择性(使用异丙醇时，约10倍量的副产物被解吸)，提取时间显著缩短(大约缩短到1/3)，用异丙醇解吸后的复杂过滤得到简化(使用异丙醇的提取难于在更大规模上实施)，不再需要第二次溶剂蒸馏，后处理可以在更小的反应器内进行(再一次，例如可以用1000升的反应器代替2000升的反应器)，可以省去硅胶色谱法(解吸后的蒸发残余物已经含有约40％的埃坡霉素A/B混合物)，并且解吸后的蒸发残余物不表现出在用乙酸乙酯提取的残余物中观察到的起泡和溅射。
权利要求
1.一种从树脂中解吸埃坡霉素的方法，所述方法使用弱极性或非极性溶剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中待解吸的埃坡霉素是埃坡霉素A或埃坡霉素B。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述树脂是合成树脂。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述树脂是基于苯乙烯/二乙烯基苯共聚物的合成树脂。
5.如权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中所述弱极性或非极性溶剂选自低级烷基卤化物和芳族溶剂或两种或更多种这些溶剂的混合物。
6.如权利要求5所述的方法，其中使用的芳族溶剂选自萘，苯或被一个或多个选自下列的基团取代的萘或苯低级烷基、低级烷氧基、卤素、硝基和低级烷氧基-低级烷基。
7.一种分离吸附到合成树脂中的埃坡霉素的方法，该方法包括(iii)用弱极性或非极性溶剂从所述合成树脂中解吸埃坡霉素；以及(iv)在溶于适当溶剂后通过反相色谱法分离埃坡霉素并用腈与水的混合物洗脱。
8.如权利要求1-7中任意一项所述的方法，还包括任何其它期望或需要的提纯步骤，以得到纯净形式的各种埃坡霉素。
9.一种从反应混合物中后处理埃坡霉素的方法，所述方法包括-用弱极性或非极性溶剂、特别是用低级烷基卤化物或芳族溶剂解吸埃坡霉素，其中该解吸步骤可以重复进行以获得更完全的解吸；-通过蒸发从所得溶液中除去用于解吸的溶剂；-解吸后任选使埃坡霉素结晶；尤其为使埃坡霉素B结晶，加入醇与烃的混合物、尤其是低级链烷醇与含有3-10个环原子的脂环烃的混合物，将醇相蒸发至干，并将埃坡霉素B从适当的溶剂混合物中、尤其是从醇/脂环烃的混合物中结晶；-(必须步骤)在将来自先前步骤的残余物溶于适当溶剂、尤其是腈与水的混合物后，通过反相色谱法分离埃坡霉素，并用腈与水的混合物洗脱，优选特征在于该色谱法在反相材料的柱子中进行，该反相材料带有烃链、尤其是包含含有18个碳原子的烃链的RP-18材料，以及使用包含腈、尤其是低级烷基腈的洗脱剂，特别使用腈/水混合物，尤其是乙腈/水混合物；并通过蒸发从收集的包含埃坡霉素的级分中除去所述腈；需要的话，然后将含埃坡霉素的剩余水用酯、尤其是低级链烷酸的低级烷基酯提取，随后将含埃坡霉素的酯相蒸发至干；-任选通过吸附色谱法、特别是通过加入到硅胶柱中并用适当的溶剂或溶剂混合物洗脱而进一步提纯；-以及最后将提纯的埃坡霉素从适当的溶剂或溶剂混合物中再结晶；在该方法中，必要和/或需要的话，在所使用的各步骤之间，将所得溶液或悬浮液浓缩，和/或特别通过沉降、过滤或离心分离溶液/悬浮液将液体和固体组分彼此分离。
10.如权利要求9所述的方法，其中埃坡霉素从树脂中的解吸使用弱极性或非极性溶剂、尤其是权利要求5或6中提到的优选溶剂进行；然后尽可能地除去该溶剂，优选直到获得干燥残余物为止，适当的话，将该残余物以较低体积溶于醇/烃混合物中；蒸发醇相，优选至干，然后将该醇提取物从醇与烃的混合物中结晶，并然后将所得固体结晶物质溶于如权利要求8所述的腈/水混合物、尤其是体积比为2∶3的乙腈/水混合物中，并且需要的话，将所得料液在分流成一个以上支流后倒入制备型反相柱中；随后用腈/水混合物洗脱；然后通过蒸发从所得含有埃坡霉素的级分中除去所述腈，并且将所得水相用酯提取；然后蒸发所述酯提取物并随后再结晶所得物质。
11.如权利要求7、9或10中任意一项所述的方法，其中埃坡霉素A和B的分离通过模拟移动床(SMB)色谱法实现。
12.弱极性或非极性溶剂用于从树脂中解吸埃坡霉素的用途。
13.如权利要求12所述的用途，其中所述弱极性或非极性溶剂选自低级烷基卤化物和芳族溶剂，尤其是萘，苯或被一个或多个选自下列的基团取代的萘或苯低级烷基、低级烷氧基、卤素、硝基和低级烷氧基-低级烷基，或为两种或更多种这些溶剂的混合物；所述树脂为合成树脂。
全文摘要
本发明涉及一种从树脂中解吸埃坡霉素、尤其是埃坡霉素A和/或埃坡霉素B的方法，并涉及包括所述解吸方法在内的埃坡霉素的新的生产、后处理或提纯方法或制造方法，以及某些溶剂用于从树脂中解吸埃坡霉素的用途。
文档编号A61K31/335GK1479741SQ01820141
公开日2004年3月3日 申请日期2001年12月5日 优先权日2000年12月7日
发明者E·屈斯特斯, H·昂特内赫尔, E 屈斯特斯, 啬诤斩 申请人:诺瓦提斯公司
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