胶原水解物及其用图
胶原水解物及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种新型的胶原水解物。
[0002] 本发明还涉及该新型的胶原水解物作为用于维持和/或改善骨头健康，特别是用 于预防和/或治疗骨质疏松症的有效物质的用途。本发明还涉及一种营养补充剂，其包括 该胶原水解物。
【背景技术】
[0003] 脊椎动物的以及进而人类的骨头的高强度以及力学稳定性归因于骨基质的特别 构造，该骨基质由成骨细胞（Knochenzelle)合成。骨基质的两种主要成分包括：一是由横 向交联的胶原形成的骨架，其中，特别是在骨基质的情况下为I型胶原。其横向交联主要通 过氨基酸：赖氨酸和羟赖氨酸来实现。第二成分是羟磷灰石（也被称作磷灰石（CaOH))，其 沉积在骨基质中（骨头的矿化作用）。骨头的该结构与钢筋混凝土的结构大致相似，其中， 钢骨架（对应于胶原）和混凝土（对应于羟磷灰石）的性能同样在构造出非常有承载能力 的结构的情况下得以补充。
[0004] 相对于许多其他组织类型，骨头具有相对高的再生能力，也就是说细胞外骨基质 被持续地构建以及降解。在对平衡出现干扰，即新骨基质构建不足的时候，就会发生骨质流 失。骨密度下降被称作骨质疏松症，并且可能有不同的原因。典型地，骨质疏松症随着年 龄增长而出现（通常在五十岁开始），对于女士特别是经常在绝经后出现（绝经后骨质疏 松）。
[0005] 长久以来公知的是，通过口服胶原水解物可以抵抗在骨质疏松情况下的骨密度流 失。通过动物胶原的酶法水解获得的胶原水解物分别包括具有不同链长或者分子量的肽 的混合物。例如，欧洲专利EP 0777 491 Bl公开了具有1000 Da至40000Da平均分子量的 胶原水解物的用途，其通过皮肤胶原的酶法水解制成，用于治疗绝经后骨质疏松。据推测， 该胶原水解物对于骨头健康的有利效果是基于通过成骨细胞对I型胶原和其他基质蛋白 的生物合成的刺激，这类似于针对软骨细胞已经在体外所证实的那样（参见S. Oesser和 J. Seiffert (2003)，CellTissue Research (细胞组织研宄）（311) 393-399)。
【发明内容】
[0006] 在所含的肽的分子量分布、氨基酸序列和其他参数方面，不同的胶原水解物有所 不同，这依赖于起始材料和制造方法。本发明的目的在于提供一种胶原水解物，其在维持和 /或改善骨头健康方面具有特别高的有效性。
[0007] 根据本发明，通过如下胶原水解物实现了该目的，该胶原水解物通过B型骨胶质 的酶促水解制成，其中，该胶原水解物由肽形成，这些肽中的至少50重量％具有1500Da至 13500Da的分子量，并且其平均分子量在4000Da至8000Da范围内。
[0008] 由本申请发明人所实施的、用于在体外通过成骨细胞对基质蛋白合成进行刺激的 研宄（在下文中对其进行详细描述）令人惊奇地表明：这种胶原水解物相对于其他不同的 水解物具有明显更高的刺激效果，特别是对I型胶原的合成。如下胶原水解物被证实是特 别有利的，在该胶原水解物中，肽的至少70重量％具有1500Da至13500Da的分子量和/或 其平均分子量在4500Da至6000Da范围内。
[0009] 在该结果中，特别令人感兴趣的是：特别是来自骨胶质的胶原水解物的高有效性， 这尤其是因为在现有技术中早就已经公知了来自动物皮肤的胶原或者胶质（主要来自于 猪皮，但例如也来自于鱼皮）的水解物的用途。通常作为胶原的变性的、溶解的形式，胶质 是适宜的酶促水解起始材料。在本发明的框架内用作水解物起始原料的骨胶质是B型胶 质，该B型骨胶质优选通过来自于脊椎动物的骨头、特别是来自于骨胶原的胶原的碱分解 制成。"骨胶原"是指去脂以及去矿物质的骨头。有利的是采用来自于牛骨的骨胶原。 [0010] 作为起始原料所采用的骨胶质的等电点（IEP)优选在5. 5之下。而A型胶质（其 通过胶原酸分解而成）具有在7之上的等电点。
[0011] 对于根据本发明的胶原水解物，肽优选具有总共少于15%的、特别是少于10%的 谷氨酰胺残基或者说谷氨酸残基以及天冬酰胺残基或者说天冬氨酸残基的酰胺化度。因 此，酰胺化度通过将肽中的谷氨酰胺残基以及天冬酰胺残基的摩尔份额除以谷氨酰胺残 基、谷氨酸残基、天冬酰胺残基以及天冬氨酸残基的摩尔份额计算出。最后提及的值由胶原 的天然氨基酸组成得出，并且典型地为约I. 12mmol/g。谷氨酰胺残基以及天冬酰胺残基的 摩尔份额可以通过酰胺的酸水解以及通过确定在此形成的氨气来求得。肽的低酰胺化度可 以特别通过所采用的（B型）胶质的碱分解来实现。
[0012] 令人感兴趣的是通过成骨细胞来刺激基质蛋白合成的研宄也表明：根据本发明 的、具有4600Da至6000Da的优选的平均分子量的胶原水解物具有比不同的低分子水解物 更高的有效性。所包含的肽的分子量也与胶原水解物的粘度相关。就此而言，优选的是：胶 原水解物的20重量％的水性溶液在25°C下具有多于5mPa *S、特别是多于6mPa *S的粘度。
[0013] 根据本发明的胶原水解物优选具有含量分别少于300ppm、特别是少于IOOppm的 铵、硫酸盐和磷酸盐。相应地，在制造用于水解的骨胶质时就已经能保持很低的盐含量。
[0014] 对于酶法制造胶原水解液，可以采用不同的蛋白酶，特别是微生物来源的蛋白酶， 其中，它针对特定的氨基酸的不同的特异性直接影响得到的肽的分子结构，并进而直接影 响了它的有效性。已经证明：在刺激成骨细胞方面特别有效的胶原水解物优选能通过利用 来自于枯草芽孢杆菌的中性内切蛋白酶使胶质水解制成。
[0015] 根据本发明的优选实施方式，该胶原水解物通过使内切蛋白酶在40°C至60°C、特 别是50°C的温度下，经20分钟至40分钟、特别是约30分钟的持续时间发生反应制成。
[0016] 除了前面所描述的胶原水解物本身，本发明特别还涉及该胶原水解物作为用于维 持和/或改善骨头健康，特别是用于预防和/或治疗骨质疏松症的有效物质的用途。由于 根据本发明的胶原水解物对于通过成骨细胞合成基质蛋白具有显著的刺激作用（这已通 过体外实验证实），口服胶原水解物能够有针对性地抵抗对骨头构建与骨头降解之间的平 衡的干扰。
[0017] 本发明的主要方面涉及：胶原水解物作为预防和/或治疗绝经后骨质疏松的有效 物质的用途。根据估计，这种形式的骨质流失涉及年龄超过50岁的女性的大约50%，其中， 在绝经后的头五年可以流失至多20%的骨物质。
[0018] 因此，本发明还涉及用于预防和/或治疗骨质疏松（特别是绝经后骨质疏松）的 方法，其中，该方法包括给病患（特别是年龄超过50岁的病患）口服根据本发明的胶原水 解物。
[0019] 由于对于来自于动物或植物蛋白的水解物来说不需要作为药品的许可，根据本发 明的胶原水解物可以有利地配制为营养补充剂。该胶原水解物可以例如以粉末、颗粒、溶液 或者悬浊液的形式，或者以片剂、胶囊、盒剂或者袋剂的形式存在，必要时可以结合适合的 助剂或辅剂。作为替代，胶原水解物也可以直接加入食物中。
[0020] 优选的是，每日口服摄入量处在Ig至15g、优选2g至10g、更优选2g至7g、特别是 2. 5g至5g的范围内。相应的量可以有利地配制为一次性的一日用量。
[0021] 本发明另一优选实施方式涉及一种营养补充剂，其包括根据本发明的胶原水解物 以及一种或多种益生素。胶原水解物与一种或多种益生素的组合基于以下考虑，即，针对特 别有效的骨物质再生，不仅必须要实现胶原和其他基质蛋白的生物合成，还必须要实现以 足够的量形成并沉积出羟磷灰石。在这种情况下，限制的因素是：对骨基质的钙供应，其中， 问题并不在于是否通过食物摄入了足够的钙（其在均衡饮食的情况下通常得以保障），而 是在肠子中是否足够地吸收了摄入的钙，钙供应特别是由于形成难溶的钙盐而受限。
[0022] 已经证明，钙的吸收以及骨头的矿物化可以通过服用益生素得到改善。益生素通 常是不易消化的食物成分，其有针对性地促进肠道菌群的特定的微生物的生长和/或活 性，并且由此对健康具有有利的影响。尽管确切的机制（益生素通过该机制有利地影响钙 吸收）还没有完全解释清楚，但是前面提及的有利效果例如在给约12岁的孩子服用果聚糖 的情况下得到了证实（见 S. Abrams 等（2005)，American Journal of Clinical Nutrition 美国临床营养学期刊（82)471-476)。
[0023] 因此，通过一起服用胶原水解物和益生素可以刺激骨基质的两种主要成分的形 成，并由此实现了在骨健康方面的协同效应，特别是在预防和/或骨质疏松症方面的协同 效应。
[0024] 根据本发明的营养补充剂原则上可以包括任意重量比的胶原水解物和一种或多 种益生素。但为了确保两种组分的足够供应，优选的是，胶原水解物和一种或多种益生素的 份额分别为约20重量％至约80重量％，更优选分别为约40重量％至约60重量％。营养 补充剂特别是可以包括重量比为约1:1的两种组分的混合物。
[0025] 在根据本发明的营养补充剂中所使用的一种或多种益生素优选由寡糖和/或多 糖选出。寡糖和多糖构成了公知的起益生作用的物质的绝大部分，其中，通过使用该类物质 得出了额外的有利效果，即该营养补充剂的味道相对于纯胶原水解物得到了显著的改善。 尽管胶原水解物可以通过相应的通常被称为味道中和（geschmacksneutral)的方法制成， 但很多使用者还是感觉到被称为"胶味"的味觉损害。令人惊讶的是：胶原水解物的 不良味 道成分通过与益生的寡糖和/或多糖相结合而几乎完全消失。
[0026] 一种或多种益生素优选选自：菊粉、果聚糖、低聚半乳糖（GOS)、低聚果糖（FOS)、 抗性麦芽糊精、聚葡萄糖以及它们的混合物。这些物质既包括天然来源的糖分，也包括以合 成方法制成的糖分。菊粉是果聚糖，其包括至多100个果糖单元以及末端的葡萄糖单元。低 聚果糖和低聚半乳糖仅包括果糖单元或半乳糖单元（通常至多10个），而聚葡萄糖则是由 葡萄糖单元、山梨糖醇单元、梓檬酸单元制成的合成多糖。
[0027] 另外优选的是：该营养补充剂包括至少一种可溶性的钙盐作为其他的组分。由此， 同时确保了给使用者供应足够的钙，而不依赖于他其他方面的饮食习惯。
[0028] 原则上可以使用所有能溶的没有毒性或者其他不利作用的钙盐。优选至少一种能 溶的钙盐选自：柠檬酸钙、乳酸钙、葡萄糖酸钙、乳酸-葡萄糖酸钙、乳糖醛酸钙以及它们的 混合物。
[0029] 根据本发明的营养补充剂作为组合制剂还可以含有其他组分，这些组分对于骨头 健康具有有利的影响，或者通常作为营养补充是有用的。特别有利的是：该营养补充剂例如 还包括一种或多种维生素，其选自：维生素 C、维生素 D、维生素 D3、维生素 E、维生素 K以及 它们的代谢物。
[0030] 另外，根据本发明的营养补充剂补充以不同的矿物质，例如特别是氟盐、钾盐和镁 盐。此外，通过短链脂肪酸可以辅助通过肠壁吸收这些矿物质。
[0031] 另一有利的补充剂是欧米伽-3-脂肪酸，其可以导致提高骨头中的降血钙素含 量。此外，它还具有抗炎作用。
[0032] 大豆异黄酮对骨密度也可以具有有利的效果，并且可以加入根据本发明的营养补 充剂中。
[0033] 最后，还要提到的是调味料及其内含物（像例如姜黄素和辣椒），他们能够以其抗 炎作用以及免疫调节作用而对根据本发明的营养补充剂的有利效果有所贡献。
[0034] 通过根据本发明的胶原水解物对骨健康的有利效果，能够实现的是：通过服用营 养补充剂在某些情况下避免了使用药品或者至少减少了药品剂量，这些药品通常用于该 目的，特别是用于预防和/或治疗绝经后骨质疏松。这些应用在部分情况下是有问题的 药学有效物质例如是选择性雌激素受体调节剂（SERM)、甲状旁腺素及其类似物特立帕肽 (Teriparatit)、其他激素（特别是雌激素和生长素）、二磷酸盐和单克隆抗体。
[0035] 本发明的另一主题是一种用于制造根据本发明的胶原水解物的方法，其包括下述 步骤：
[0036] -制造 B型骨胶质的水性溶液，其浓度为5重量％至20重量％，特别是约10重 量％ ;
[0037] -加入来自于枯草芽孢杆菌的中性内切蛋白酶，其用量为基于胶质用量的1重 量％至4重量％，特别是约2重量％ ;
[0038] -使内切蛋白酶在40°C至60°C的、特别是50°C的温度下，以5. 5至6. 5、特别是约 6的pH值，经20分钟至40分钟、特别是约30分钟的持续时间发生反应；并且
[0039] -使内切蛋白酶热失活。
[0040] 根据本发明的方法的特别的优点和有利实施方式已经结合根据本发明的胶原水 解物进行了阐明。
【附图说明】
[0041 ] 参照附图，下面的实施例用于阐明本发明。
[0042] 在附图中：
[0043] 图1示出具有根据本发明的胶原水解物和对照水解物的分子量分布的凝胶渗透 色谱；
[0044] 图2示出通过根据本发明的胶原水解物和对照水解物对I型胶原和骨钙蛋白的合 成进行刺激的图表；并且
[0045] 图3示出通过根据本发明的胶原水解物和四个不同的对照水解物对不同的基质 蛋白和酶的合成进行刺激的图表。
【具体实施方式】
[0046] 胶原水解物的制i告
[0047] 在下文中描述了 ：根据本发明的胶原水解物的制造（实施例），以及不对应于本发 明的四种胶原水解物的制造（对比实施例1至4)。
[0048] 作为起始原料，采用两种不同的胶质，即，来自于牛骨的B型胶质（下文中称作骨 胶质）以及A型的猪皮胶质。它们的主要参数在图1中示出：
[0049] 表 1
[0050]
【主权项】
1. 一种胶原水解物，所述胶原水解物通过B型骨胶质的酶促水解制成，其中，所述胶原 水解物由肽形成，在所述肽中至少50重量％、特别是至少70重量％具有1500Da至13500Da 的分子量，并且所述肽的平均分子量在4000Da至8000Da的范围内、特别是在4500Da至 6000Da的范围内。
2. 根据权利要求1所述的胶原水解物，其中，所述骨胶质通过来自于脊椎动物的骨头、 特别是来自于骨胶原的胶原的碱分解制成。
3. 根据前述权利要求中任意一项所述的胶原水解物，其中，所述骨胶质具有在5. 5之 下的等电点。
4. 根据前述权利要求中任意一项所述的胶原水解物，其中，所述肽具有总共少于 15 %、特别是少于10 %的谷氨酰胺残基或者说谷氨酸残基以及天冬酰胺残基或者说天冬氨 酸残基的酰胺化度。
5. 根据前述权利要求中任意一项所述的胶原水解物，其中，所述胶原水解物的20重 量％的水性溶液在25°C下具有多于5mPa?S、特别是多于6mPa?S的粘度。
6. 根据前述权利要求中任意一项所述的胶原水解物，其中，所述胶原水解物具有含量 分别少于300ppm、特别是少于IOOppm的按、硫酸盐和磷酸盐。
7. 根据前述权利要求中任意一项所述的胶原水解物，其中，所述胶原水解物通过利用 来自于枯草芽孢杆菌的中性内切蛋白酶使所述胶质水解制成。
8. 根据权利要求7所述的胶原水解物，其中，所述胶原水解物通过使所述内切蛋白酶 在40°C至60°C的、特别是50°C的温度下，经20分钟至40分钟、特别是约30分钟的持续时 间发生反应制成。
9. 根据前述权利要求中任意一项所述的胶原水解物，所述胶原水解物作为用于维持和 /或改善骨头健康，特别是用于预防和/或治疗骨质疏松症的有效物质。
10. 根据权利要求9所述的胶原水解物，所述胶原水解物作为用于预防和/或治疗绝经 后骨质疏松的有效物质。
11. 根据权利要求9或10所述的胶原水解物，其中，所述胶原水解物配制为营养补充 剂，特别是以粉末、颗粒、溶液或者悬浊液的形式，或者以片剂、胶囊、盒剂或者袋剂的形式。
12. 根据权利要求11所述的胶原水解物，其中，规定：每日口服Ig至15g、优选2g至 l〇g、更优选2g至7g、特别是2. 5g至5g的胶原水解物。
13. -种营养补充剂，所述营养补充剂包括根据前述权利要求中任意一项所述的胶原 水解物以及一种或多种益生素。
14. 根据权利要求13所述的营养补充剂，其中，所述一种或多种益生素选自：寡聚糖和 /或多聚糖，特别是选自：菊粉、果聚糖、低聚半乳糖（G0S)、低聚果糖（F0S)、抗性麦芽糊精、 聚葡萄糖以及它们的混合物。
15. 根据权利要求13或14所述的营养补充剂，所述营养补充剂还包括：一种或多种能 溶的钙盐，所述一种或多种能溶的钙盐特别是选自：柠檬酸钙、乳酸钙、葡萄糖酸钙、乳酸葡 萄糖酸钙、乳糖醛酸钙以及它们的混合物。
16. 根据权利要求13至15中任意一项所述的营养补充剂，所述营养补充剂还包括：一 种或多种维生素，所述维生素选自：维生素C、维生素D、维生素D3、维生素E、维生素K以及 它们的代谢物。
17. 根据权利要求13至16中任意一项所述的营养补充剂，所述营养补充剂还包括一种 或多种矿物质，所述矿物质选自：氟盐、钾盐和镁盐。
18. -种用于制造根据权利要求1至12中任意一项所述的胶原水解物的方法，所述方 法包括下述步骤： -制造B型骨胶质的水性溶液，所述水性溶液的浓度为5重量％至20重量％，特别是约 10重量％ ; -加入来自于枯草芽孢杆菌的中性内切蛋白酶，所述中性内切蛋白酶用量为基于胶质 用量的1重量％至4重量％，特别是约2重量％ ; -使所述内切蛋白酶在40°C至60°C、特别是50°C的温度下，以5. 5至6. 5、特别是约6 的pH值，经20分钟至40分钟、特别是约30分钟的持续时间发生反应；并且 _使所述内切蛋白酶热失活。
【专利摘要】本发明涉及一种胶原水解物，其通过B型骨胶质的酶促水解制成，其中，胶原水解物由肽形成，在这些肽中至少50重量％、特别是至少70重量％具有1500DA至3500Da的分子量，并且这些肽的平均分子量在4000Da至8000Da的范围内、特别是在4500Da至6000Da的范围内。此外，本发明还涉及该胶原水解物作为用于维持和/或改善骨头健康，特别是用于预防和/或治疗骨质疏松症的有效物质的用途。此外，本发明还涉及一种营养补充剂，其包括胶原水解物。
【IPC分类】A61P19-10, A61K35-32, A61K38-01
【公开号】CN104768566
【申请号】CN201380057628
【发明人】斯特芬·奥瑟尔, 莫尼卡·吉森-维泽尔, 汉斯-乌尔里希·弗雷希, 斯特凡·豪斯曼斯
【申请人】格利达股份公司
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2013年11月4日
【公告号】DE102012110612A1, EP2916855A1, US20150232534, WO2014072235A1
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种新型的胶原水解物。
[0002] 本发明还涉及该新型的胶原水解物作为用于维持和/或改善骨头健康，特别是用 于预防和/或治疗骨质疏松症的有效物质的用途。本发明还涉及一种营养补充剂，其包括 该胶原水解物。
【背景技术】
[0003] 脊椎动物的以及进而人类的骨头的高强度以及力学稳定性归因于骨基质的特别 构造，该骨基质由成骨细胞（Knochenzelle)合成。骨基质的两种主要成分包括：一是由横 向交联的胶原形成的骨架，其中，特别是在骨基质的情况下为I型胶原。其横向交联主要通 过氨基酸：赖氨酸和羟赖氨酸来实现。第二成分是羟磷灰石（也被称作磷灰石（CaOH))，其 沉积在骨基质中（骨头的矿化作用）。骨头的该结构与钢筋混凝土的结构大致相似，其中， 钢骨架（对应于胶原）和混凝土（对应于羟磷灰石）的性能同样在构造出非常有承载能力 的结构的情况下得以补充。
[0004] 相对于许多其他组织类型，骨头具有相对高的再生能力，也就是说细胞外骨基质 被持续地构建以及降解。在对平衡出现干扰，即新骨基质构建不足的时候，就会发生骨质流 失。骨密度下降被称作骨质疏松症，并且可能有不同的原因。典型地，骨质疏松症随着年 龄增长而出现（通常在五十岁开始），对于女士特别是经常在绝经后出现（绝经后骨质疏 松）。
[0005] 长久以来公知的是，通过口服胶原水解物可以抵抗在骨质疏松情况下的骨密度流 失。通过动物胶原的酶法水解获得的胶原水解物分别包括具有不同链长或者分子量的肽 的混合物。例如，欧洲专利EP 0777 491 Bl公开了具有1000 Da至40000Da平均分子量的 胶原水解物的用途，其通过皮肤胶原的酶法水解制成，用于治疗绝经后骨质疏松。据推测， 该胶原水解物对于骨头健康的有利效果是基于通过成骨细胞对I型胶原和其他基质蛋白 的生物合成的刺激，这类似于针对软骨细胞已经在体外所证实的那样（参见S. Oesser和 J. Seiffert (2003)，CellTissue Research (细胞组织研宄）（311) 393-399)。
【发明内容】
[0006] 在所含的肽的分子量分布、氨基酸序列和其他参数方面，不同的胶原水解物有所 不同，这依赖于起始材料和制造方法。本发明的目的在于提供一种胶原水解物，其在维持和 /或改善骨头健康方面具有特别高的有效性。
[0007] 根据本发明，通过如下胶原水解物实现了该目的，该胶原水解物通过B型骨胶质 的酶促水解制成，其中，该胶原水解物由肽形成，这些肽中的至少50重量％具有1500Da至 13500Da的分子量，并且其平均分子量在4000Da至8000Da范围内。
[0008] 由本申请发明人所实施的、用于在体外通过成骨细胞对基质蛋白合成进行刺激的 研宄（在下文中对其进行详细描述）令人惊奇地表明：这种胶原水解物相对于其他不同的 水解物具有明显更高的刺激效果，特别是对I型胶原的合成。如下胶原水解物被证实是特 别有利的，在该胶原水解物中，肽的至少70重量％具有1500Da至13500Da的分子量和/或 其平均分子量在4500Da至6000Da范围内。
[0009] 在该结果中，特别令人感兴趣的是：特别是来自骨胶质的胶原水解物的高有效性， 这尤其是因为在现有技术中早就已经公知了来自动物皮肤的胶原或者胶质（主要来自于 猪皮，但例如也来自于鱼皮）的水解物的用途。通常作为胶原的变性的、溶解的形式，胶质 是适宜的酶促水解起始材料。在本发明的框架内用作水解物起始原料的骨胶质是B型胶 质，该B型骨胶质优选通过来自于脊椎动物的骨头、特别是来自于骨胶原的胶原的碱分解 制成。"骨胶原"是指去脂以及去矿物质的骨头。有利的是采用来自于牛骨的骨胶原。 [0010] 作为起始原料所采用的骨胶质的等电点（IEP)优选在5. 5之下。而A型胶质（其 通过胶原酸分解而成）具有在7之上的等电点。
[0011] 对于根据本发明的胶原水解物，肽优选具有总共少于15%的、特别是少于10%的 谷氨酰胺残基或者说谷氨酸残基以及天冬酰胺残基或者说天冬氨酸残基的酰胺化度。因 此，酰胺化度通过将肽中的谷氨酰胺残基以及天冬酰胺残基的摩尔份额除以谷氨酰胺残 基、谷氨酸残基、天冬酰胺残基以及天冬氨酸残基的摩尔份额计算出。最后提及的值由胶原 的天然氨基酸组成得出，并且典型地为约I. 12mmol/g。谷氨酰胺残基以及天冬酰胺残基的 摩尔份额可以通过酰胺的酸水解以及通过确定在此形成的氨气来求得。肽的低酰胺化度可 以特别通过所采用的（B型）胶质的碱分解来实现。
[0012] 令人感兴趣的是通过成骨细胞来刺激基质蛋白合成的研宄也表明：根据本发明 的、具有4600Da至6000Da的优选的平均分子量的胶原水解物具有比不同的低分子水解物 更高的有效性。所包含的肽的分子量也与胶原水解物的粘度相关。就此而言，优选的是：胶 原水解物的20重量％的水性溶液在25°C下具有多于5mPa *S、特别是多于6mPa *S的粘度。
[0013] 根据本发明的胶原水解物优选具有含量分别少于300ppm、特别是少于IOOppm的 铵、硫酸盐和磷酸盐。相应地，在制造用于水解的骨胶质时就已经能保持很低的盐含量。
[0014] 对于酶法制造胶原水解液，可以采用不同的蛋白酶，特别是微生物来源的蛋白酶， 其中，它针对特定的氨基酸的不同的特异性直接影响得到的肽的分子结构，并进而直接影 响了它的有效性。已经证明：在刺激成骨细胞方面特别有效的胶原水解物优选能通过利用 来自于枯草芽孢杆菌的中性内切蛋白酶使胶质水解制成。
[0015] 根据本发明的优选实施方式，该胶原水解物通过使内切蛋白酶在40°C至60°C、特 别是50°C的温度下，经20分钟至40分钟、特别是约30分钟的持续时间发生反应制成。
[0016] 除了前面所描述的胶原水解物本身，本发明特别还涉及该胶原水解物作为用于维 持和/或改善骨头健康，特别是用于预防和/或治疗骨质疏松症的有效物质的用途。由于 根据本发明的胶原水解物对于通过成骨细胞合成基质蛋白具有显著的刺激作用（这已通 过体外实验证实），口服胶原水解物能够有针对性地抵抗对骨头构建与骨头降解之间的平 衡的干扰。
[0017] 本发明的主要方面涉及：胶原水解物作为预防和/或治疗绝经后骨质疏松的有效 物质的用途。根据估计，这种形式的骨质流失涉及年龄超过50岁的女性的大约50%，其中， 在绝经后的头五年可以流失至多20%的骨物质。
[0018] 因此，本发明还涉及用于预防和/或治疗骨质疏松（特别是绝经后骨质疏松）的 方法，其中，该方法包括给病患（特别是年龄超过50岁的病患）口服根据本发明的胶原水 解物。
[0019] 由于对于来自于动物或植物蛋白的水解物来说不需要作为药品的许可，根据本发 明的胶原水解物可以有利地配制为营养补充剂。该胶原水解物可以例如以粉末、颗粒、溶液 或者悬浊液的形式，或者以片剂、胶囊、盒剂或者袋剂的形式存在，必要时可以结合适合的 助剂或辅剂。作为替代，胶原水解物也可以直接加入食物中。
[0020] 优选的是，每日口服摄入量处在Ig至15g、优选2g至10g、更优选2g至7g、特别是 2. 5g至5g的范围内。相应的量可以有利地配制为一次性的一日用量。
[0021] 本发明另一优选实施方式涉及一种营养补充剂，其包括根据本发明的胶原水解物 以及一种或多种益生素。胶原水解物与一种或多种益生素的组合基于以下考虑，即，针对特 别有效的骨物质再生，不仅必须要实现胶原和其他基质蛋白的生物合成，还必须要实现以 足够的量形成并沉积出羟磷灰石。在这种情况下，限制的因素是：对骨基质的钙供应，其中， 问题并不在于是否通过食物摄入了足够的钙（其在均衡饮食的情况下通常得以保障），而 是在肠子中是否足够地吸收了摄入的钙，钙供应特别是由于形成难溶的钙盐而受限。
[0022] 已经证明，钙的吸收以及骨头的矿物化可以通过服用益生素得到改善。益生素通 常是不易消化的食物成分，其有针对性地促进肠道菌群的特定的微生物的生长和/或活 性，并且由此对健康具有有利的影响。尽管确切的机制（益生素通过该机制有利地影响钙 吸收）还没有完全解释清楚，但是前面提及的有利效果例如在给约12岁的孩子服用果聚糖 的情况下得到了证实（见 S. Abrams 等（2005)，American Journal of Clinical Nutrition 美国临床营养学期刊（82)471-476)。
[0023] 因此，通过一起服用胶原水解物和益生素可以刺激骨基质的两种主要成分的形 成，并由此实现了在骨健康方面的协同效应，特别是在预防和/或骨质疏松症方面的协同 效应。
[0024] 根据本发明的营养补充剂原则上可以包括任意重量比的胶原水解物和一种或多 种益生素。但为了确保两种组分的足够供应，优选的是，胶原水解物和一种或多种益生素的 份额分别为约20重量％至约80重量％，更优选分别为约40重量％至约60重量％。营养 补充剂特别是可以包括重量比为约1:1的两种组分的混合物。
[0025] 在根据本发明的营养补充剂中所使用的一种或多种益生素优选由寡糖和/或多 糖选出。寡糖和多糖构成了公知的起益生作用的物质的绝大部分，其中，通过使用该类物质 得出了额外的有利效果，即该营养补充剂的味道相对于纯胶原水解物得到了显著的改善。 尽管胶原水解物可以通过相应的通常被称为味道中和（geschmacksneutral)的方法制成， 但很多使用者还是感觉到被称为"胶味"的味觉损害。令人惊讶的是：胶原水解物的 不良味 道成分通过与益生的寡糖和/或多糖相结合而几乎完全消失。
[0026] 一种或多种益生素优选选自：菊粉、果聚糖、低聚半乳糖（GOS)、低聚果糖（FOS)、 抗性麦芽糊精、聚葡萄糖以及它们的混合物。这些物质既包括天然来源的糖分，也包括以合 成方法制成的糖分。菊粉是果聚糖，其包括至多100个果糖单元以及末端的葡萄糖单元。低 聚果糖和低聚半乳糖仅包括果糖单元或半乳糖单元（通常至多10个），而聚葡萄糖则是由 葡萄糖单元、山梨糖醇单元、梓檬酸单元制成的合成多糖。
[0027] 另外优选的是：该营养补充剂包括至少一种可溶性的钙盐作为其他的组分。由此， 同时确保了给使用者供应足够的钙，而不依赖于他其他方面的饮食习惯。
[0028] 原则上可以使用所有能溶的没有毒性或者其他不利作用的钙盐。优选至少一种能 溶的钙盐选自：柠檬酸钙、乳酸钙、葡萄糖酸钙、乳酸-葡萄糖酸钙、乳糖醛酸钙以及它们的 混合物。
[0029] 根据本发明的营养补充剂作为组合制剂还可以含有其他组分，这些组分对于骨头 健康具有有利的影响，或者通常作为营养补充是有用的。特别有利的是：该营养补充剂例如 还包括一种或多种维生素，其选自：维生素 C、维生素 D、维生素 D3、维生素 E、维生素 K以及 它们的代谢物。
[0030] 另外，根据本发明的营养补充剂补充以不同的矿物质，例如特别是氟盐、钾盐和镁 盐。此外，通过短链脂肪酸可以辅助通过肠壁吸收这些矿物质。
[0031] 另一有利的补充剂是欧米伽-3-脂肪酸，其可以导致提高骨头中的降血钙素含 量。此外，它还具有抗炎作用。
[0032] 大豆异黄酮对骨密度也可以具有有利的效果，并且可以加入根据本发明的营养补 充剂中。
[0033] 最后，还要提到的是调味料及其内含物（像例如姜黄素和辣椒），他们能够以其抗 炎作用以及免疫调节作用而对根据本发明的营养补充剂的有利效果有所贡献。
[0034] 通过根据本发明的胶原水解物对骨健康的有利效果，能够实现的是：通过服用营 养补充剂在某些情况下避免了使用药品或者至少减少了药品剂量，这些药品通常用于该 目的，特别是用于预防和/或治疗绝经后骨质疏松。这些应用在部分情况下是有问题的 药学有效物质例如是选择性雌激素受体调节剂（SERM)、甲状旁腺素及其类似物特立帕肽 (Teriparatit)、其他激素（特别是雌激素和生长素）、二磷酸盐和单克隆抗体。
[0035] 本发明的另一主题是一种用于制造根据本发明的胶原水解物的方法，其包括下述 步骤：
[0036] -制造 B型骨胶质的水性溶液，其浓度为5重量％至20重量％，特别是约10重 量％ ;
[0037] -加入来自于枯草芽孢杆菌的中性内切蛋白酶，其用量为基于胶质用量的1重 量％至4重量％，特别是约2重量％ ;
[0038] -使内切蛋白酶在40°C至60°C的、特别是50°C的温度下，以5. 5至6. 5、特别是约 6的pH值，经20分钟至40分钟、特别是约30分钟的持续时间发生反应；并且
[0039] -使内切蛋白酶热失活。
[0040] 根据本发明的方法的特别的优点和有利实施方式已经结合根据本发明的胶原水 解物进行了阐明。
【附图说明】
[0041 ] 参照附图，下面的实施例用于阐明本发明。
[0042] 在附图中：
[0043] 图1示出具有根据本发明的胶原水解物和对照水解物的分子量分布的凝胶渗透 色谱；
[0044] 图2示出通过根据本发明的胶原水解物和对照水解物对I型胶原和骨钙蛋白的合 成进行刺激的图表；并且
[0045] 图3示出通过根据本发明的胶原水解物和四个不同的对照水解物对不同的基质 蛋白和酶的合成进行刺激的图表。
【具体实施方式】
[0046] 胶原水解物的制i告
[0047] 在下文中描述了 ：根据本发明的胶原水解物的制造（实施例），以及不对应于本发 明的四种胶原水解物的制造（对比实施例1至4)。
[0048] 作为起始原料，采用两种不同的胶质，即，来自于牛骨的B型胶质（下文中称作骨 胶质）以及A型的猪皮胶质。它们的主要参数在图1中示出：
[0049] 表 1
[0050]
【主权项】
1. 一种胶原水解物，所述胶原水解物通过B型骨胶质的酶促水解制成，其中，所述胶原 水解物由肽形成，在所述肽中至少50重量％、特别是至少70重量％具有1500Da至13500Da 的分子量，并且所述肽的平均分子量在4000Da至8000Da的范围内、特别是在4500Da至 6000Da的范围内。
2. 根据权利要求1所述的胶原水解物，其中，所述骨胶质通过来自于脊椎动物的骨头、 特别是来自于骨胶原的胶原的碱分解制成。
3. 根据前述权利要求中任意一项所述的胶原水解物，其中，所述骨胶质具有在5. 5之 下的等电点。
4. 根据前述权利要求中任意一项所述的胶原水解物，其中，所述肽具有总共少于 15 %、特别是少于10 %的谷氨酰胺残基或者说谷氨酸残基以及天冬酰胺残基或者说天冬氨 酸残基的酰胺化度。
5. 根据前述权利要求中任意一项所述的胶原水解物，其中，所述胶原水解物的20重 量％的水性溶液在25°C下具有多于5mPa?S、特别是多于6mPa?S的粘度。
6. 根据前述权利要求中任意一项所述的胶原水解物，其中，所述胶原水解物具有含量 分别少于300ppm、特别是少于IOOppm的按、硫酸盐和磷酸盐。
7. 根据前述权利要求中任意一项所述的胶原水解物，其中，所述胶原水解物通过利用 来自于枯草芽孢杆菌的中性内切蛋白酶使所述胶质水解制成。
8. 根据权利要求7所述的胶原水解物，其中，所述胶原水解物通过使所述内切蛋白酶 在40°C至60°C的、特别是50°C的温度下，经20分钟至40分钟、特别是约30分钟的持续时 间发生反应制成。
9. 根据前述权利要求中任意一项所述的胶原水解物，所述胶原水解物作为用于维持和 /或改善骨头健康，特别是用于预防和/或治疗骨质疏松症的有效物质。
10. 根据权利要求9所述的胶原水解物，所述胶原水解物作为用于预防和/或治疗绝经 后骨质疏松的有效物质。
11. 根据权利要求9或10所述的胶原水解物，其中，所述胶原水解物配制为营养补充 剂，特别是以粉末、颗粒、溶液或者悬浊液的形式，或者以片剂、胶囊、盒剂或者袋剂的形式。
12. 根据权利要求11所述的胶原水解物，其中，规定：每日口服Ig至15g、优选2g至 l〇g、更优选2g至7g、特别是2. 5g至5g的胶原水解物。
13. -种营养补充剂，所述营养补充剂包括根据前述权利要求中任意一项所述的胶原 水解物以及一种或多种益生素。
14. 根据权利要求13所述的营养补充剂，其中，所述一种或多种益生素选自：寡聚糖和 /或多聚糖，特别是选自：菊粉、果聚糖、低聚半乳糖（G0S)、低聚果糖（F0S)、抗性麦芽糊精、 聚葡萄糖以及它们的混合物。
15. 根据权利要求13或14所述的营养补充剂，所述营养补充剂还包括：一种或多种能 溶的钙盐，所述一种或多种能溶的钙盐特别是选自：柠檬酸钙、乳酸钙、葡萄糖酸钙、乳酸葡 萄糖酸钙、乳糖醛酸钙以及它们的混合物。
16. 根据权利要求13至15中任意一项所述的营养补充剂，所述营养补充剂还包括：一 种或多种维生素，所述维生素选自：维生素C、维生素D、维生素D3、维生素E、维生素K以及 它们的代谢物。
17. 根据权利要求13至16中任意一项所述的营养补充剂，所述营养补充剂还包括一种 或多种矿物质，所述矿物质选自：氟盐、钾盐和镁盐。
18. -种用于制造根据权利要求1至12中任意一项所述的胶原水解物的方法，所述方 法包括下述步骤： -制造B型骨胶质的水性溶液，所述水性溶液的浓度为5重量％至20重量％，特别是约 10重量％ ; -加入来自于枯草芽孢杆菌的中性内切蛋白酶，所述中性内切蛋白酶用量为基于胶质 用量的1重量％至4重量％，特别是约2重量％ ; -使所述内切蛋白酶在40°C至60°C、特别是50°C的温度下，以5. 5至6. 5、特别是约6 的pH值，经20分钟至40分钟、特别是约30分钟的持续时间发生反应；并且 _使所述内切蛋白酶热失活。
【专利摘要】本发明涉及一种胶原水解物，其通过B型骨胶质的酶促水解制成，其中，胶原水解物由肽形成，在这些肽中至少50重量％、特别是至少70重量％具有1500DA至3500Da的分子量，并且这些肽的平均分子量在4000Da至8000Da的范围内、特别是在4500Da至6000Da的范围内。此外，本发明还涉及该胶原水解物作为用于维持和/或改善骨头健康，特别是用于预防和/或治疗骨质疏松症的有效物质的用途。此外，本发明还涉及一种营养补充剂，其包括胶原水解物。
【IPC分类】A61P19-10, A61K35-32, A61K38-01
【公开号】CN104768566
【申请号】CN201380057628
【发明人】斯特芬·奥瑟尔, 莫尼卡·吉森-维泽尔, 汉斯-乌尔里希·弗雷希, 斯特凡·豪斯曼斯
【申请人】格利达股份公司
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2013年11月4日
【公告号】DE102012110612A1, EP2916855A1, US20150232534, WO2014072235A1
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