酵素微反应器的制造方法

酵素微反应器的制造方法
【技术领域】
[0001 ] 本实用新型关于一种生物检测晶片，尤指一种酵素微反应器。
【背景技术】
[0002]生物检测晶片(b1chip)是一种微型装置，利用微电子技术将仪器微小化，然后在微小化后的装置上放置特定的生物材料(例如核酸或蛋白质)，这些生物材料可以与其他预测生物样品发生特异性的生化反应，反应后的信号可经各种感应器或感应物质定量，进而得知生物反应。此种利用微电子、微流体及生物技术所制出的微型装置称之为生物检测晶片，它结合了各层面的专业领域，如医学诊断、基因探针、制药、生物技术、微机电、半导体及电脑等领域发展而成的。
[0003]生物检测晶片通常以硅晶片、玻璃或高分子为基材(substrate)，以微小化技术整合生物有机分子如核酸或蛋白质为生化探针，用来检测或分析生物性分子。生物检测晶片的体积小、反应快速并且能够平行分析大量生物资讯，因此适用于生化处理、分析、检验、新药开发及环境监测等用途上。生物晶片大致上可分为两大类，一为着眼于功能整合的处理型晶片(lab-on-a-chip)，二为能获得大量资讯的微阵列晶片(microarray)。微阵列晶片因其探针种类不同又可分为基因晶片(gene chip)及蛋白质晶片(protein chip)两种，主要是将不同的DNA或蛋白质分子，以数百微米的间距，密集地固定排列在数平方公分的面积上做为探针，待检测的生物样品经过处理后与晶片上的探针进行反应，产生的信号由扫描仪器与分析仪器判读，如此便可以在短时间内一次提供大量的基因序列或蛋白质表现的相关讯息。
[0004]生物检测晶片是半导体积体电路制程技术应用在生物医学科学研宄非常成功的实例。传统的生物检测晶片在基材上形成一层光阻图案层后，便直接在其表面结合生物材料用以检测待测物，但此种作法可能因生物材料与光阻结合力不足，导致检测上的不精准及稳定性不足等问题，因此，如何发展一种可改善现有技术缺失的生物检测晶片，实为目前迫切需解决的问题。
【实用新型内容】
[0005]本实用新型的主要目的在于提供一生物检测晶片，俾解决现有生物检测晶片检测不精准及稳定性不足的问题，并同时达到成本降低及制程方便快速的目的，使生物检测晶片的应用更加广泛。
[0006]本实用新型的又一目的在于提供一酵素微反应器，以检测酵素与酵素抑制剂或酵素受质的反应，藉此定量并筛选样品溶液中酵素抑制剂或酵素受质的含量，并可进一步应用于药物的开发筛选。
[0007]为达上述目的，本实用新型的提供一种酵素微反应器，至少包括:一基材；一光阻图案层，形成于该基材的一表面；一阻断层，形成于该基材的该表面未被该光阻图案层覆盖的区域；一键结层，以共价键结方式形成于该光阻图案层上；至少一衔接分子，以共价键结方式与该键结层结合；以及一探针分子，由一酵素所构成，并以共价键结方式与该衔接分子结合，用以与一酵素抑制剂或一酵素受质结合。
[0008]本实用新型提供的酵素微反应器中，该基材为玻璃、硅晶片或塑胶。
[0009]本实用新型提供的酵素微反应器中，该光阻图案层成分为SU-8光阻。
[0010]本实用新型提供的酵素微反应器中，该光阻图案层每一点的直径大小为10至300 μ m0
[0011]本实用新型提供的酵素微反应器中，该光阻图案层利用无光罩微影技术所形成。
[0012]本实用新型提供的酵素微反应器中，该阻断层成分为二甲基二氯硅烷(dimethyldichlorosilane)。
[0013]本实用新型提供的酵素微反应器中，该键结层成分为3-[双(2-羟乙基)氨基]丙基三乙氧基娃烧(3-[Bis (2-hydroxyethyl) amino] propyl-triethoxy si lane)。
[0014]本实用新型提供的酵素微反应器中，该衔接分子成分为1，4-苯二异硫氰酸(I, 4-phenylene diisoth1cyanate)。
[0015]本实用新型提供的酵素微反应器中，该酵素为甲型醣苷酶、葡萄糖神经酰胺合成酶、或尿素酶。
[0016]本实用新型提供的酵素微反应器藉由键结层及衔接分子的设计，使探针分子以共价键结方式结合于光阻图案层上，故具有较强的结合力，使本实用新型的酵素微反应器具有较佳的稳定性以及精准度，同时还具有成本低、制程方便的优点。
【附图说明】
[0017]图1为本实用新型较佳实施例的生物检测晶片结构示意图。
[0018]图2为本实用新型较佳实施例的生物检测晶片制造方法流程图。
[0019]图3A至3F为本实用新型较佳实施例的生物检测晶片制造方法的结构示意图。
[0020]其中，附图标记说明如下:
[0021]1:生物检测晶片
[0022]10:基材
[0023]11:光阻图案层
[0024]12:阻断层
[0025]13:键结层
[0026]14:衔接分子
[0027]15:探针分子
【具体实施方式】
[0028]体现本实用新型特征与优点的一些典型实施例将在后段的说明中详细叙述。应理解的是本实用新型能够在不同的态样上具有各种的变化，其皆不脱离本实用新型的范围，且其中的说明及附图在本质上当作说明之用，而非用以限制本实用新型。
[0029]本实用新型的酵素微反应器可为一生物检测晶片。请参阅图1，其为本实用新型较佳实施例的生物检测晶片结构示意图。如图所示，本实用新型的生物检测晶片I至少包括基材10、光阻图案层11、阻断层12、键结层13、衔接分子14及探针分子15。其中，光阻图案层11形成于基材10的表面，阻隔层12形成于基材10表面未被光阻图案层11覆盖的区域，键结层13以共价键结方式形成于光阻图案层11上，衔接分子14以共价键结方式与键结层13结合，探针分子15以共价键结方式与衔接分子14结合，用以与一待测分子进行特异性反应。以下则进一步说明本实用新型生物检测晶片的制造方法。
[0030]请同时参阅图2及图3A至3F，其中图2为本实用新型较佳实施例的生物检测晶片制造方法流程图，图3A至3F为本实用新型较佳实施例的生物检测晶片制造方法的结构示意图。如图3A所示，制造生物检测晶片I首先必须提供一基材10(步骤S10)，其中基材10可为但不限于玻璃、硅晶片、塑胶、或其他高分子材料。接着，如图3B所示，使用微影技术于基材10的表面上形成一光阻图案层11 (步骤Sll)，其首先于基材10表面上形成一光阻层，并于光阻层的特定区域上照光，使光阻产生聚合反应，再利用显影液将未产生聚合反应的光阻洗掉，以形成光阻图案层11。该光阻图案层11即定义出微阵列结构，其中每一点的直径大小约为10至300 μ m，高度约为1-5 μ m，且该光阻较佳为环氧树脂类的SU-8光阻，但不以此为限。
[0031]传统的微影技术藉由一光罩进行图案转移。使用该技术前，须将预先设计好的微结构图形制作在光罩上，并将基材10表面清洁干净，以增加基材10与光阻的附着性。接着以光阻涂布机将光阻均匀涂布在基材10上，经过软烤，再以UV光照射光罩上的图形，使得光阻能呈现出光罩上所设计的图形，最后再以显影液将图形显影呈现出来，经过硬烤后，便能制作出经设计的光阻图案层11。
[0032]另外，也可使用无光罩微影技术进行光阻图案层11的制作。此技术由一数字化微镜面取代传统的光罩，以数字化微镜面元件的晶片控制聚合反应的光阻图案形状。UV光源通过聚光镜、数字化微镜面、光圈、准直镜以及反射镜等光路架设系统直接投影于倒立式萤光显微镜的样品平台，再经由自行撰写设计的电脑程序控制数字化微镜面的方向及入射光的曝光图形影像成像，以于基材10表面上形成光阻图案层11。
[0033]然后，如图3C所示，再于基材10表面未覆盖光阻图案层11的区域形成一阻断层12(步骤S12)，其中阻断层12的表面不具有活性官能基，可阻断待测分子以非特异性反应附着于此，使得后续生物检测反应可精确地发生于由光阻图案层11所定义的微阵列结构上。在一较佳实施例中，阻断层12可藉由娃烧化反应(silanizat1n)来形成，例如以二甲基二氯娃烧(dimethyldichlorosi lane)与基材10进行反应而形成阻断层12，且可形成于微结构的微小间隔(例如约50-150 μπι)中。在另一些实施例中，阻断层12成分亦可为氧化娃(silicon oxide)、聚乙稀卩比略烧酮(polyvinylpyrrolidone, PVP)、小牛血清蛋白(bovine serum albumin, BSA)或脱脂奶粉，但不以此为限。
[0034]之后，如图3D所示，以共价键结方式形成一键结层13于光阻图案层11上(步骤S13)，且键结层13具有至少一活性官能基，例如氢氧基或胺基，可用来连接衔接分子14。在一较佳实施例中，键结层13成分可为但不限于3-氨丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane, APTES)，例如3-[双(2-轻乙基)氨基]丙基三乙氧基娃烧(3_ [Bis (2-hydroxyethyl) amino] propyl-triethoxy si lane)，其可与光阻图案层 11 表面的氧原子形成共价键结，并具有氢氧基作为活性官能基，用以连接衔接分子14。在另一些实施例中，键结层13成分亦可为环氧丙氧丙基三甲氧基娃烧(glycidoxypropyltrimethoxysilane)、正十八烧基三氯娃烧(n-octadecyltrichlorosilane)或氯二甲基辛娃烧(chlorodimethyloctylsilane)，但不以此为限。
[0035]接着，如图3E所示，形成至少一衔接分子14于键结层13上(步骤S14)，其中衔接分子14以共价键结方式与键结层13的活性官能基结合。在一较佳实施例中，衔接分子14成分可为但不限于1，4-苯二异硫氰酸(1，4-phenylene diisoth1cyanate, F1DITC)，其所含的一异硫氰酸官能基可与键结层13的活性官能基结合，另一异硫氰酸官能基则可与探针分子15的活性官能基结合，例如与蛋白质分子N端的胺基结合。在另一些实施例中，衔接分子14成分亦可为戊二醛(glutaraldehyde)、1_甲基咪挫(l-methylimidazole)、4-轻基苯甲酸(4-hydroxybenaldehyde)或4_氨基 节胺(4_aminobenzylamine)，但不以此为限。
[0036]最后，如图3F所示，形成一探针分子15于衔接分子14上(步骤S15)，便完成本实用新型生物检测晶片的制作，其中探针分子15以共价键结方式与衔接分子14结合，用以与待测分子进行特异性反应，达到生物检测的目的。而根据不同的生物检测标的，探针分子15可为核酸或蛋白质，俾用于基因检测、抗体抗原(antibody-antigen)反应检测、酵素受质(enzyme-substrate)反应检测、受体配体(receptor-ligand)反应检测、适体(aptamer)与标的物的反应检测、细胞反应检测、或其他蛋白质与蛋白质反应检测。因此，探针分子15因应待测分子而选择与待测分子具有特异性反应的生物材料作为探针分子15。
[0037]在本实用新型的酵素微反应器中，探针分子15为一酵素，用以与一酵素抑制剂结合，藉此定量并筛选样品溶液中酵素抑制剂的含量与抑制效果。举例来说，含氮醣类(iminosugar)是一种甚有潜力的醣类作用过程的酵素抑制剂，已经被应用在临床上糖尿病的治疗及醣类酵素缺乏症的疾病医疗上。因此，可利用醣类酵素作为探针分子，来检测样品溶液中的含氮醣类等酵素抑制剂。
[0038]在一实施例中，本实用新型的探针分子15可为甲型醣苷酶(alpha-glucosidase)，可用来检测样品溶液中的含氮醣类米格列醇(Miglitol) (l_(2_Hydroxyethyl) ~2~ (hydroxymethyl) _3，4, 5-piperidinetr1l)，其为甲型酿苷酶抑制剂(alpha-glucosidase inhibitor)，已被广泛用于治疗第2型糖尿病。Miglitol的作用机转为可逆性抑制小肠粘膜上的甲型醣苷酶，此酶可分解多醣、寡醣或双醣等复杂醣类(如淀粉、蔗糖)成为单醣(如葡萄糖、果糖)。因此Miglitol可延缓葡萄糖的吸收，降低餐后高血糖，临床使用经验显示约可降低糖化血色素0.5-1 %。
[0039]在另一实施例中，本实用新型的探针分子15可为葡萄糖神经酰胺合成酶(glucosylceramide synthase)，可用来检测样品溶液中的含氮醣类美格鲁特(Miglustat) (N-butyl-deoxyno jirimycin)，其为葡萄糖神经酰胺合成酶的抑制齐丨J(glucosylceramide synthase inhibitor)，可用于治疗高血氏症(Gaucher disease)。高血氏症的病因是缺乏葡萄糖脑苷脂酶(glucocerebrosidase)而无法分解葡萄糖神经酰胺(glucosylceramide)。Miglustat 会抑制葡萄神经酰胺合成酶(glucosylceramidesynthase)，进而减少葡萄糖脑苷脂的堆积，达到治疗的效果。
[0040]另一方面，在以酵素作为探针分子15的酵素微反应器中，除可用来检测酵素与酵素抑制剂的反应外，亦可用来检测酵素与酵素受质的反应。举例来说，在一实施例中，本实用新型的探针分子15可为尿素酶(Urease)，用来检测样品溶液中的尿素(Urea)。尿素酶可催化尿素转换成氨(ammonia)及二氧化碳，代谢肾脏功能，用以反应血液及尿液中尿素化合物的浓度。
[0041]当然，本实用新型可作为探针分子15的酵素不限于上述，其他可固定于衔接分子14上，并与酵素抑制剂或酵素受质进行反应的酵素分子皆可应用于本实用新型的酵素微反应器中作为探针分子15。
[0042]综合而言，本实用新型的生物检测晶片主要包含基材10、光阻图案层11、阻断层12、键结层13、衔接分子14及探针分子15，其中键结层13以共价键结方式形成于光阻图案层11上，衔接分子14以共价键结方式与键结层13结合，探针分子15以共价键结方式与衔接分子14结合，因此，本实用新型的探针分子15经由衔接分子14及键结层13而共价键结于光阻图案层11上，相较于习知探针分子与光阻的非共价结合方式而言，本实用新型的探针分子15以较强的结合力固定于晶片上，故本实用新型的生物检测晶片具有较佳的稳定性。
[0043]再者，本实用新型的生物检测晶片具有一阻断层12，形成于基材10表面未覆盖光阻图案层11的区域，可阻断待测分子以非特异性反应附着于此，故可增加生物检测晶片的精准度。此外，本实用新型的光阻图案层11可利用无光罩微影技术形成，不但可免除传统光罩的高成本，且可有效微小化生物检测晶片的微阵列结构，使单点直径可小于300 μ m，进而有助于生物检测晶片的微量化，且具有制程方便快速的优点。
[0044]以下将以实例说明本实用新型的生物检测晶片及其制造方法。
[0045]取一玻璃晶片作为基材，利用旋转涂布机于玻璃晶片上涂布一层厚度约5 ym的SU-8光阻(溶于环戊烷溶剂中)。对晶片进行软烤以去除过多的溶剂后，将SU-8光阻经由无光罩微影技术的数字化微镜面光学光路系统进行曝光活化，依据所使用的数字化微镜面元件的微镜面数在一特定的空间成像，并经由曝后烤后，以SU-8显影液进行显影，之后以异丙醇润洗并以氮气枪干燥后，得到具有SU-8微结构阵列(光阻图案层)的晶片，且每一点的直径大小约为300 μ m。
[0046]将晶片放置在玻璃培养皿中，于室温下放置数分钟后，以二甲基二氯硅烷(dimethy ldichlorosi lane)当做阻断剂(blocking reagent)，平均布满整个晶片约30分钟至I小时，由于SU-8微结构阵列具有约5 μπι的高度，使得阻断剂会流至不具SU-8微结构阵列的晶片表面，故可于不具SU-8微结构阵列的晶片表面形成阻断层。之后，在含有SU-8微结构阵列的反应区域滴加键结剂，其为溶于95% (ν/ν)乙醇的20%(v/v) 3-[ M (2-轻乙基)氨基]丙基三乙氧基娃烧(3-[Bis (2-hydroxyethyl)amino]propyl-triethoxysilane)，并于室温下反应约I至2小时，以形成键结层于SU-8微结构阵列上，然后以95% (v/v)乙醇洗去没有共价键结的键结剂，并在室温下干燥后即可保存在4°C备用。
[0047]之后，于SU-8微结构阵列的反应区域上滴加衔接分子溶液，其为溶于二甲基甲酰胺(dimethylformamide, DMF)的 0.2 % 1，4-苯二异硫氛酸(1，4-phenylenediisoth1cyanate, F1DITC)，并于室温下反应约I至2小时，然后再加入探针分子。以酵素微反应器为例，可于SU-8微结构阵列的反应区域上加入酵素，例如甲型醣苷酶、葡萄糖神经酰胺合成酶、或尿素酶，并于室温下反应约30分钟至I小时，使酵素共价键结于1，4-苯二异硫氰酸上，并以PBST缓冲液流洗三次后，即完成酵素微反应器的制作。
[0048]综上所述，本实用新型的生物检测晶片藉由键结层及衔接分子的设计，使探针分子以共价键结方式结合于光阻图案层上，故具有较强的结合力，使本实用新型的生物检测晶片具有较佳的稳定性。再者，本实用新型的生物检测晶片具有形成于基材表面未覆盖光阻图案层区域的阻断层，可阻断待测分子以非特异性反应附着于此，故可增加生物检测晶片的精准度。此外，本实用新型的光阻图案层可利用无光罩微影技术形成，不但可免除传统光罩的高成本，且可有效微小化生物检测晶片的微阵列结构，使单点直径可小于300 μ m，进而有助于生物检测晶片的微量化，且具有制程方便快速的优点。因此，本实用新型的生物检测晶片可解决现有生物检测晶片检测不精准及稳定性不足的问题，并同时达到成本降低及制程方便快速的目的，使生物检测晶片的应用更加广泛。而且，本实用新型可以酵素作为探针分子，以制作酵素微反应器，并检测酵素与酵素抑制剂或酵素受质的反应，藉此定量并筛选样品溶液中酵素抑制剂或酵素受质的含量，并可进一步应用于药物的开发筛选。
[0049]本实用新型已由上述实施例详细叙述而可由本领域普通技术人员任施匠思而为诸般修饰，然皆不脱如附权利要求书所欲保护者。
【主权项】
1.一种酵素微反应器，其特征在于，至少包括: 一基材; 一光阻图案层，形成于该基材的一表面； 一阻断层，形成于该基材的该表面未被该光阻图案层覆盖的区域； 一键结层，以共价键结方式形成于该光阻图案层上； 至少一衔接分子，以共价键结方式与该键结层结合；以及 一探针分子，由一酵素所构成，并以共价键结方式与该衔接分子结合，用以与一酵素抑制剂或一酵素受质结合。
2.如权利要求1所述的酵素微反应器，其特征在于，该基材为玻璃、硅晶片或塑胶。
3.如权利要求1所述的酵素微反应器，其特征在于，该光阻图案层成分为SU-8光阻。
4.如权利要求1所述的酵素微反应器，其特征在于，该光阻图案层每一点的直径大小为 10 至 300 μ??ο
5.如权利要求1所述的酵素微反应器，其特征在于，该光阻图案层利用无光罩微影技术所形成。
6.如权利要求1所述的酵素微反应器，其特征在于，该阻断层成分为二甲基二氯硅烷。
7.如权利要求1所述的酵素微反应器，其特征在于，该键结层成分为3-[双(2-羟乙基)氨基]丙基三乙氧基硅烷。
8.如权利要求1所述的酵素微反应器，其特征在于，该衔接分子成分为1，4-苯二异硫氰酸。
9.如权利要求1所述的酵素微反应器，其特征在于，该酵素为甲型醣苷酶、葡萄糖神经酰胺合成酶、或尿素酶。
【专利摘要】本实用新型关于一种酵素微反应器，至少包括：一基材；一光阻图案层，形成于该基材的一表面；一阻断层，形成于该基材的该表面未被该光阻图案层覆盖的区域；一键结层，以共价键结方式形成于该光阻图案层上；至少一衔接分子，以共价键结方式与该键结层结合；以及一探针分子，由一酵素所构成，并以共价键结方式与该衔接分子结合，用以与一酵素抑制剂或一酵素受质结合。本实用新型的酵素微反应器藉由键结层及衔接分子的设计，使探针分子以共价键结方式结合于光阻图案层上，故具有较强的结合力，使本实用新型的酵素微反应器具有较佳的稳定性以及精准度，同时还具有成本低、制程方便的优点。
【IPC分类】G01N33-543
【公开号】CN204613213
【申请号】CN201520184714
【发明人】池俊利, 陈朝胜, 吴安台, 陈志洪, 万金凤
【申请人】万金凤
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2015年3月30日