γ-分泌酶抑制剂用于治疗癌症的应用的制作方法
专利名称：γ-分泌酶抑制剂用于治疗癌症的应用的制作方法
Y“分泌酶抑制剂用于治疗癌症的应用尽管最近成功使用了为患者提供生存益处的药物，癌症仍然是世界上死亡率和发 病率的主要原因。对于大部分实体瘤，仍然存在与极差的预后相关的高肿瘤复发率和转移 率。目前可用的药物包括细胞毒性化学治疗剂、抗血管生成剂、和靶向药剂。由于发展了耐 药性或可能影响大部分器官的不可耐受的毒性(例如，血液学毒性、肝脏毒性、肾脏毒性、 和神经毒性)，使用大部分目前可用的抗癌药获得的临床益处是有限的。癌症是一种以不可控的增殖为特征的疾病。在对驱动癌症的信号的理解中取得了 进步。在发育和组织重建过程中，多能干细胞作用为分化细胞的来源，以产生非专门增殖的 细胞类型。这些干细胞的特征和肿瘤的快速不可控的增殖之间的联系逐渐变得清楚。一种 主要的发育信号传导轴是Notch途径。Notch信号传导通过在成体多能干细胞的发育和自 我更新过程中介导祖细胞的分化而调控细胞命运。Notch起作用保持祖细胞处于多能快速 增殖状态。Notch途径在造血作用和淋巴细胞增殖的发育分化和进行中起重要作用。在胚 胎发育过程中，其参与造血干细胞的生成、增殖和分化。Notch基因扩增、染色体易位或突变导致升高的Notch信号传导，由此通过将肿瘤 细胞保持在干细胞样增殖状态而给予肿瘤生长的优势。因此，在Notch信号传导途径的突 变和恶性病发病机理之间存在非常强的相关性。由哺乳动物中的4种同系物(Notchl，Notch2，Notch3，和Notch4)所代表的Notch 蛋白与配体δ样1，δ样3，δ样4，Jagged UPJagged 2相互作用。在配体结合后， Notch受体通过系列的蛋白水解分裂事件而被激活，所述蛋白水解分裂事件包括由Y _分 泌酶(Y -secretase)调控的膜内分裂。这样的Y -分泌酶加工的Notch变成有活性的，其 作为一种称为细胞内亚基(ICN)的形式。ICN易位至核，并且形成包括直接改变关键的增 殖_和分化_特异性基因的表达的CSL (CBF-1，秃头的抑制子，Lag)转录调控子的大转录复 合物的一部分。另外，Y _分泌酶参与几种其他蛋白的膜内蛋白水解加工，所述其他蛋白包括淀粉 样前体蛋白[APP]，CD44干细胞标记，和HER4 [ErbB4])。通过、-分泌酶抑制阻断Notch信 号传导在体内在人类癌症细胞中产生较缓慢的生长、较少转化的表型。重要的是，该表型在 不存在进一步给药的条件下保持是稳定的。这种类型的新型治疗途径具有使癌症成为更易 处理的疾病的潜力，而没有传统细胞毒性药物的强副作用。在WO 2005/023772 中公开 2，2- 二 甲基-N_((S)_6-氧代-6，7- 二 氢-5H-二苯并[b，d]氮杂-7-基)-N' _(2，2，3，3，3_五氟-丙基)-丙二酰胺(2，
2-Dimethyl-N-((S)-6-oxo-6,7-dihydro-5H-dibenzo[b,d]azepin-7-yl)-N'-(2,2,3,3,
3-pentafluoro-propyl)-malonamide)(1)有效用于治疗阿尔茨海默病。 因此，需要开发新的药物/化学治疗方案，从而进一步改善可用于癌症患者的治疗。发明概述本发明提供治疗癌症患者的方法，所述方法包括给所述患者施用治疗有效量的化 合物(1)，或其药用盐，该化合物(1)具有下式 本发明还提供治疗癌症患者的方法，所述方法包括给所述患者施用治疗有效量的 化合物(1)，或其药用盐，该化合物(1)具有下式 其中化合物(1)在21天周期的第1，2，3，8，9和10天以约400ng-hr/ml-约 9000ng-hr/ml的量每天施用一次。本发明还提供治疗癌症患者的方法，所述方法包括给所述患者施用治疗有效量的化合物(1)，或其药用盐，该化合物(1)具有下式
其中化合物(1)在21天周期的第1-7天以约400ng-hr/ml-约9000ng_hr/ml的
量每天施用一次。本发明还提供包括一种以上口服单位剂型的试剂盒，每个单位包含约3mg_约 300mg化合物(1)，或其药用盐，该化合物(1)具有下式 本发明还进一步提供上述式(1)的化合物、或其药用盐用于制备治疗癌症特别是 实体瘤的药物的应用，所述实体瘤诸如例如非小细胞肺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、结肠癌、乳 腺癌或前列腺癌。本发明还进一步提供上述式(1)的化合物、或其药用盐用于制备治疗癌症特别是 实体瘤的药物的应用，所述实体瘤诸如例如非小细胞肺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、结肠癌、乳 腺癌或前列腺癌，所述应用包括按照本文所述的具体方法、剂量方案和/或治疗周期中的 任一种施用式(1)的化合物、或其药用盐。本发明另外提供用于制备目的是治疗癌症特别是实体瘤的药物的方法，所述实体 瘤诸如例如非小细胞肺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、结肠癌、乳腺癌或前列腺癌，所述方法的特 征在于使用式(1)的化合物、或其药用盐。本发明另外提供用于制备目的是治疗癌症特别是实体瘤的药物的方法，所述实体 瘤诸如例如非小细胞肺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、结肠癌、乳腺癌或前列腺癌，所述方法的特 征在于，按照本文所示的具体方法、剂量方案和/或治疗周期中的任一种使用式(1)的化合 物、或其药用盐。本发明最后提供本文所示的具体方法和应用，其中化合物(1)与治疗有效量的吉西他滨(gemcitabine)组合使用，优选地用于治疗胰腺癌。发明详述本发明提供治疗癌症患者的新型方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量 的化合物(1)、或其药用盐。化合物(1)是Y-分泌酶的有效且选择性的抑制剂，其在肿瘤 细胞中产生对Notch信号传导的抑制活性。当用于本文时，下述术语具有下文描述的意思。术语“抗肿瘤”意指抑制或防止恶性细胞的发育、成熟或增殖。术语“曲线下面积”(AUC)是在血浆中的药物浓度针对时间绘制的图中曲线下的面 积。AUC表示被机体吸收的药物总量，与吸收速率无关。这有效用于药物的治疗性监测。患 者血浆中药物浓度的测量和AUC的计算有效用于指导该药物的剂量。AUC对于获知在一定 时间间隔的平均浓度AUC/t是有用的。AUC通常表示为(质量*时间/体积)，例如，ng-hr/ ml ο术语“药用的”，诸如药用载体、赋形剂等，意指对于施用特定化合物的受试者是药 学可接受的且基本上无毒。术语“药用盐”指常规的酸加成盐或碱加成盐，其保留本发明化 合物的生物学效用和特性，并且由适当的无毒有机酸或无机酸或有机碱或无机碱形成。样 品酸加成盐包括来源于无机酸的那些和来源于有机酸的那些，所述无机酸诸如盐酸、氢溴 酸、氢碘酸、硫酸、磺酸、磷酸和硝酸，所述有机酸诸如对-甲苯磺酸、水杨酸、甲磺酸、草酸、 琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸等。样品碱加成盐包括来源于铵、钾、钠、和季铵氢氧 化物诸如例如四甲基氢氧化铵的那些。术语化合物的“药用酯”意指具有羧基的常规酯化化 合物，所述酯保留该化合物的生物学效用和特性。将药物化合物(即，药物)化学修饰成盐 是制药化学家获得化合物提高的物理和化学稳定性、亲水性(hydroscopicity)和溶解性 的熟知的技术。参见，例如，H. Ansel 等,Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (药物剂型和药物递送系统)(第6版，1995)，第196和1456-1457页。术语“前体药物”指在表现出其药物作用之前进行转化的化合物。为了克服制药 学问题而对药物进行化学修饰还被称为“药物潜在化”。药物潜在化是对生物活性化合物 进行化学修饰，以形成新化合物，所述新化合物在体内酶攻击时将释放母体化合物。母体化 合物的化学改变是这样的，从而物理化学特性的改变将影响吸收、分布和酶代谢。药物潜在 化的定义还被延伸以包括母体化合物的非酶再生。再生作为水解、解离、和其它不需要酶介 导的反应结果而发生。所述术语，前体药物，潜在化的药物，和生物可逆衍生物可以互换使 用。经过推论，潜在化意指参与在体内产生生物活性母体分子的时间延迟元件(time lag element)或时间成分(time component)。术语前体药物是概括性的，因为其包括潜在化的 药物衍生物以及与受体组合、在施用后转化为实际物质的那些物质。术语前体药物是这样 的药剂的通用术语，所述药剂在表现出其药学活性之前进行生物转化。术语“治疗有效量”意指在施用给患者时有效产生需要的治疗效果的药物量，所述 治疗效果例如阻止癌肿瘤的生长、或导致其收缩。与化合物(1)组合施用的治疗有效量的 吉西他滨优选地意指如在下述实施例7中公开的具体剂量和时间表。术语“与……组合施用”当用于本文时意指同时或顺序地施用。化合物“吉西他滨”意指4-氨基-1-[3，3- 二氟-4-羟基_5_ (羟甲基)-四氢呋 喃-2-基]-IH-嘧啶-2-酮(4-Amino-l-[3，3-dif luor-4-hydroxy-5- (hydroxymethyl) _tetrahydrofuran-2-yl] -1 H-pyrimidin-2-on)，并且例如以 Gemzar 市售。术语“治疗指数”是选择临床试验用抗癌药剂的重要参数。治疗指数考虑抗癌药 剂的功效、药物代谢动力学、代谢和生物利用度。参见，例如，J. Natl. Cancer Inst.(国家 癌症研究杂志)81 (13) 988-94 (1989年7月5日)。术语“肿瘤控制”意指从最后测量其可测量的损伤的垂直直径没有增加25%以 上。参见,例如，World Health Organization (世界卫生组织)(〃 WHO" ) Handbook for Reporting Results of Cancer Treatment, Geneva(曰内瓦 艮告癌症治疗结果的手册) (1979)。术语“实体瘤”意指非小细胞肺癌(NSCLC)，结肠直肠癌，胰腺癌，结肠癌，乳腺癌， 前列腺癌等。当用在整个说明书和权利要求书中时，“化合物⑴，，的意思包括下式的具体化合 物及其药用盐 本发明提供用于治疗癌症患者的方法，其包括给所述患者施用治疗有效量的化合 物(1)，或其药用盐，所述化合物(1)具有下式 化合物(1)是Y-分泌酶的有效且选择性的抑制剂，Y-分泌酶是负责分裂和 激活Notch受体的关键酶。由于基因扩增、染色体易位、或突变导致的Notch信号传导 失调已经参与多种类型的癌症，包括白血病(Leukemia)，成神经管细胞瘤和成胶质细胞 瘤(medullo-and glioblastoma),乳腺癌(breadcarcinoma)，头颈癌(head and neck cancer)，和胰腺癌(pancreatic carcinoma)。临床前的证据已经表明通过抑制γ-分泌酶 的蛋白水解活性阻断Notch信号传导在小鼠异种移植模型中导致对肿瘤生长的阻止。化合物(1)的治疗有效量是在施用给患者时有效产生需要的治疗效果从而阻止癌肿瘤的生长、或导致其收缩的量。优选地，化合物(1)的治疗有效量为约400ng-hr/ml-约 9000ng-hr/ml,更优选地约 1100ng-hr/ml-约 4100ng_hr/ml，且最优选地约 1380ng_hr/ ml-约 2330ng-hr/mlo在一个实施方案中，化合物(1)的治疗有效量为约400ng-hr/ml-约9000ng-hr/ ml,更优选地约 1100ng-hr/ml-约 4100ng-hr/ml,且最优选地约 1380ng-hr/ml-约 2330ng-hr/ml，在至多约21天的时间阶段中施用。在另一个实施方案中，化合物(1)在21天周期中的第1，2，3，8，9和10天每天施 用一次。在一个优选的实施方案中，化合物(1)在21天周期中的第1，2，3，8，9和10天以 约400ng-hr/ml-约9000ng_hr/ml的量每天施用一次。在另一个实施方案中，化合物(1)在21天周期中的第1-7天每天施用一次。在 一个优选的实施方案中，化合物(1)在21天周期中的第1-7天以约400ng-hr/ml-约 9000ng-hr/ml的量每天施用一次。优选地，化合物(1)以药物口服单位剂型存在。本方法还包括另外对患者进行放 射治疗。在一个具体实施方案中，本发明提供用于治疗癌症患者的方法，其包括给所述患 者施用治疗有效量的化合物(1)，或其药用盐，所述化合物(1)具有下式 其中化合物(1)在21天周期中的第1，2，3，8，9和10天以约400ng-hr/ml-约 9000ng-hr/ml的量每天施用一次，只要癌症保持为得到控制就重复进行。在另一个具体实施方案中，本发明提供用于治疗癌症患者的方法，其包括给所述 患者施用治疗有效量的化合物(1)，或其药用盐，所述化合物(1)具有下式 其中化合物(1)在21天周期中的第1-7天以约400ng-hr/ml-约9000ng_hr/ml的量每天施用一次，只要癌症保持为得到控制就重复进行。在另一个具体实施方案中，本发明提供化合物(1) 或其药用盐用于制备治疗癌症特别是实体瘤的药物的应用。在另一个具体实施方案中，本发明提供上述化合物(1)的应用，其中所述治疗包 括施用约400ng-hr/ml-约9000ng-hr/ml治疗有效量的化合物(1)。在另一个具体实施方案中，本发明提供上述化合物(1)的应用，其中治疗有效量 的化合物(1)为约 1100ng-hr/ml-约 4100ng-hr/ml。在另一个具体实施方案中，本发明提供上述化合物(1)的应用，其中治疗有效量 的化合物(1)为约 1380ng-hr/ml-约 2330ng-hr/ml。在另一个具体实施方案中，本发明提供上述化合物(1)的应用，其中治疗有效量 的化合物(1)为约400ng-hr/ml-约9000ng-hr/ml，其在至多约21天的时期内施用。在另一个具体实施方案中，本发明提供上述化合物(1)的应用，其中治疗有效量 的化合物(1)为约llOOng-hr/ml-约4100ng-hr/ml，其在至多约21天的时期内施用。在另一个具体实施方案中，本发明提供上述化合物(1)的应用，其中治疗有效量 的化合物(1)为约1380ng-hr/ml-约2330ng-hr/ml，其在至多约21天的时期内施用。在另一个具体实施方案中，本发明提供上述化合物(1)的应用，其中化合物(1)在 21天周期中的第1，2，3，8，9和10天每天施用一次。在另一个具体实施方案中，本发明提供上述化合物⑴的应用，其中化合物⑴在 21天周期中的第1，2，3，8，9和10天以约400ng-hr/ml_约9000ng_hr/ml的量每天施用一次。在另一个具体实施方案中，本发明提供上述化合物(1)的应用，其中化合物(1)在 21天周期中的第1-7天每天施用一次。在另一个具体实施方案中，本发明提供上述化合物(1)的应用，其中化合物(1)在 21天周期中的第1-7天以约400ng-hr/ml-约9000ng-hr/ml的量每天施用一次。在另一个具体实施方案中，本发明提供上述化合物(1)的应用，其中化合物(1)以 药物口服单位剂型存在。在另一个具体实施方案中，本发明提供上述化合物(1)的应用，其包括另外使患 者进行放射治疗。在另一个具体实施方案中，本发明提供化合物(1)
或其药用盐用于制备治疗癌症特别是实体瘤的药物的应用，其中所述治疗包括在 21天周期中的第1，2，3，8，9和10天以约400ng-hr/ml_约9000ng_hr/ml的量每天施用化 合物⑴一次。在另一个具体实施方案中，本发明提供化合物(1) 或其药用盐用于制备治疗癌症特别是实体瘤的药物的应用，其中所述治疗包括在 21天周期中的第1-7天以约400ng-hr/ml-约9000ng-hr/ml的量每天施用化合物(1) 一次。在另一个具体实施方案中，本发明提供制备目的是用于治疗癌症特别是实体瘤的 药物的方法，所述方法特征在于，以治疗有效量使用式(1)的化合物 在另一个具体实施方案中，本发明提供上述方法，其中化合物(1)的治疗有效量 为约 400ng-hr/ml-约 9000ng-hr/ml。在另一个具体实施方案中，本发明提供上述方法，其中化合物(1)的治疗有效量为约 1100ng-hr/ml-约 4100ng_hr/ml。在另一个具体实施方案中，本发明提供上述方法，其中化合物(1)的治疗有效量 为约 1380ng-hr/ml-约 2330ng_hr/ml。在另一个具体实施方案中，本发明提供上述方法，其中化合物(1)的治疗有效量 为约400ng-hr/ml-约9000ng_hr/ml，其在至多约21天的时期内施用。在另一个具体实施方案中，本发明提供上述方法，其中化合物(1)的治疗有效量 为约1100ng-hr/ml-约4100ng_hr/ml，其在至多约21天的时期内施用。在另一个具体实施方案中，本发明提供上述方法，其中化合物(1)的治疗有效量 为约1380ng-hr/ml-约2330ng-hr/ml，其在至多约21天的时期内施用。在另一个具体实施方案中，本发明提供上述方法，其中化合物(1)在21天的周期 中的第1，2，3，8，9和10天每天施用一次。在另一个具体实施方案中，本发明提供上述方法，其中化合物(1)在21天周期中 的第1，2，3，8，9和10天以约400ng-hr/ml-约9000ng_hr/ml的量每天施用一次。在另一个具体实施方案中，本发明提供上述方法，其中化合物(1)在21天周期中 的第1-7天每天施用一次。在另一个具体实施方案中，本发明提供上述方法，其中化合物(1)在21天周期中 的第1-7天以约400ng-hr/ml-约9000ng_hr/ml的量每天施用一次。在另一个具体实施方案中，本发明提供上述方法，其中化合物(1)以药物口服单 位剂型存在。在另一个具体实施方案中，本发明提供上述方法，其包括另外使患者进行放射治疗。在另一个具体实施方案中，本发明提供制备目的用于治疗癌症特别是实体瘤的药 物的方法，其特征在于，式(1)的化合物 或其药用盐，在21天周期中的第1，2，3，8，9和10天以约400ng-hr/ml-约 9000ng-hr/ml的量每天使用一次。在另一个具体实施方案中，本发明提供制备目的用于治疗癌症特别是实体瘤的药 物的方法，其特征在于，式(1)的化合物 或其药用盐，在21天周期中的第1-7天以约400ng-hr/ml-约9000ng-hr/ml的量
每天使用一次。在另一个具体实施方案中，本发明提供上述方法和应用，其中化合物(1)与有效 量的吉西他滨组合施用。在这一实施方案中，化合物(1)和吉西他滨的组合优选地用于制备治疗胰腺癌的 药物。在另一个具体实施方案中，本发明提供一种试剂盒，其包括一种以上口服单位剂 型，每一单位包含约3mg-约300mg化合物(1)，或其药用盐，所述化合物(1)具有下式 在这一实施方案中，所述试剂盒可以包括包含足够数量的单位足以可以在约21 天的时期内每天给患者施用约300mg的化合物(1)、或其药用盐的口服单位剂型。在这一实施方案中，所述试剂盒还可以包括包含有效量的吉西他滨的单位剂型。医师可以根据患者的需要、以及患者对治疗的反应而改变每种组分的剂量水平至 低于或高于本文所述的剂量水平。剂量可以按照由医师根据患者需要确定的任意给药时间 表施用。例如，两种组分中每一种的剂量可以在数天的时期内以单次给药或分开给药施用、 或改变日常时间表施用。优选地，每21天、或只要由毒性恢复所允许就重复治疗时间表，条件是肿瘤得到 控制且患者耐受治疗方案或肿瘤消退。优选地，这些治疗周期重复总共至多约8个周期。本发明的方法可以按照下文所述的实施例进行准备。所述实施例以证明而不是限 制本发明的化合物和组合物的制备的目的进行描述。实施例实施例1在裸鼠中人肿瘤异种移植中每天口服施用一次化合物(1)的抗肿瘤活性的广度。在先前的抗肿瘤功效研究中，当给携带A549非小细胞肺癌(NSCLC)异种移植物的 小鼠口服施用化合物⑴时，与赋形剂处理的对照动物相比较，以3，10，或30mg/kg的剂量 每天给药一次或两次持续14(14+/7_)或21天导致显著且持续不变的肿瘤生长抑制，肿瘤 生长抑制(TGIs) %在66-83%范围内。使用14+/7-或21天的治疗时间表每天施用化合物 (1) 一次与每天两次治疗一样有效，没有剂量依赖性。此外，较短的给药持续时间(14+/7-) 与完整的21天给药一样有效地抑制A549肿瘤生长。为了研究化合物(1)的抗肿瘤活性的广度，在两个结肠直肠癌(Lovo和HCT116) 和两个非小细胞肺癌(NSCLC) (Calu-6和H460a)异种移植模型中进行4种另外的功效研 究。尽管可能驱动功效的参数是未知的，认为Notch下游靶标Hes-I和Hey-I的表达表示活 性Notch信号传导途径。此外，已经报道Ras癌基因的表达在Notch激活中起作用。基于 Notch配体、受体、和下游靶标的内部基因表达模式，预测L0V0，HCT116，和Calu_6肿瘤模型 对化合物(1)介导的生长抑制敏感，而预测H460a模型是不敏感的。例如，Lovo结肠直肠癌 细胞系具有与已经表明对化合物(1)介导的肿瘤生长抑制敏感的A549异种移植模型相似 的基因表达，具有Notch配体Jag 1和DNER，Notch受体1，2，和3，以及下游靶标Hes-I和 Hey-I的表达。NSCLC细胞系Calu_6和H460a具有相似的配体和受体基因模式，具有Notch 1和Notch 3的高表达。这两种细胞系还具有升高的Hes-I，Hey-I和NUMB的表达。此外， 所有这些细胞系均具有突变的K-ras。在目前的研究中，在至多三周内给携带确定的皮下(sc)L0V0，Calu-6, HCT116，或 H460a肿瘤的小鼠口服施用化合物(1)。化合物(1)以每天3mg/kg和10mg/kg(qd)给药21 天，或按照间断的时间表(7天给药，14天不给药，然后7天给药(7+/14-/7+))以30mg/kg 和60mg/kg给药。材料和方法_使用获自查理斯河实验室(CharlesRiver Laboratories) (Wilmington,ΜΑ)的雌 性裸鼠(10只/组)，此时它们约为13-14周龄，并且重约23-25克。通过对实验动物的总体 观察和通过分析笼养在共用架台上的sentinel动物的血液样品而每天确定所有动物的健 康。在实验应用之前，允许所有动物适应并且由任何运输相关的压力恢复最少72小时。随 意提供高压灭菌的水和照射过的食物[5058-ms Pico chow (小鼠)Purina，Richmond，IN]， 并且保持动物为12小时光照和黑暗的周期。在使用之前将笼、草垫和水瓶高压灭菌，并且 每周更换。IiSLovo 人结肠直肠，Calu-6 NSCLC，和 HCTl 16 结肠直肠细胞购自 ATCC (Manassas， VA)。H460a NSCLC细胞为德克萨斯州休斯顿MD安德森医学中心(MD Anderson Medical Center, Houston, TX) Jack Roth 博士的馈赠。Lovo 细胞在 F12K 培养基中培养，Calu-6 和 H460a 在 Dulbecco 改良的基本培养基(Dulbecco' s Modified Essential Medium) (DMEM) 中生长，并且HCT116细胞在McCoy’ s 5A培养基中生长。所有的培养基补充有10% (ν/ν)FBS 和 (ν/ν) 200nM L-谷氨酰胺。在 9/22/06，9/22/06，9/26/06 和 9/29/06 分别对小鼠 在右后腰窝处皮下(sc)植入处于0. 2ml PBS体积中的5xl06 Lovo,3xl06 Calu-6或HCT116， 或IxlO7 H460a细胞/小鼠。检测药剂按下述，将化合物(1)用0. 2%吐温-80配制为在水中的1. 0% Klucel中的混悬 液用于口服(Po)施用。药物配制 将配制的化合物和赋形剂保存在4°C，并且每周制备。在施用前强烈混合化合物 ⑴。随机化在植入后第19天，将植入Lovo和Calu-6异种移植物的小鼠随机化，并且在第20 天将植入HCT116异种移植物的小鼠随机化，，而植入H460a异种移植物的小鼠在植入后第 12天进行随机化。所有小鼠按照肿瘤体积随机化，从而所有组具有约IOO-ISOmm3的相似的 起始平均肿瘤体积。研究设计在该报道中用于所有4种体内研究的研究设计是相同的。剂量组在下述文列出。研究设计 *除了 H460a功效研究之外，接受两轮7天的治疗，所述H460a功效研究早已停止i^x对于Lovo和Calu-6肿瘤研究的治疗于10/11/06 (肿瘤细胞植入后第19天)开 始，对于HCTl 16的研究于10/16/06 (肿瘤细胞植入后第20天)开始，并且对于H460a研究于10/11/06 (肿瘤细胞植入后第12天)开始。使用无菌Icc注射器和18 口径的管饲针头 (0. 2ml/动物)每天一次(qd)给药赋形剂或化合物(1)混悬液共21天，或使用间断的时间 表(7天给药，14天不给药，然后7天给药(7+/14-/7+))给药。对于Lovo和Calu_6研究， 21天的给药在肿瘤细胞植入后第40天结束。对于间断给药，治疗在第26天结束，在第40 天重新开始，并且在第47天结束。对于HCT116研究，21天的给药在肿瘤细胞植入后第42 天结束。间断给药在第27天结束，在第42天重新开始，并且在第49天结束。对于H460a 研究，21天的给药早在肿瘤细胞植入后第27天结束，而对于间断给药，治疗在第19天结束， 并且没有重新开始(由于缺乏功效)。病理学/尸体剖检在研究结束时，对于Eff#l 137 (Lovo)，Eff#1147 (HCT116)，和 Eff#1148 (H460a) 进行尸体剖检。在处死之前2小时对动物注射在Iml无菌水中的Img BrdU(溴脱氧尿苷 (bromodeoxyuridine))来评估肿瘤细胞增殖。通过用CO2诱导然后断颈而处死动物。收集 来自赋形剂处理的组和所选化合物(1)处理的组的肿瘤，并且在锌-福尔马林中固定过夜， 处理，石蜡包埋，并且切片，用于组织病理学(苏木精和曙红(H&E)染色用于形态学评估，和 BrdU染色)，如下文所述。尸体剖检/病理学总结 厕每周测量肿瘤和小鼠体重两次。所有的动物分别进行整个实验。计算和统计学分析体重减少使用下式以平均组体重变化百分数绘图表示((W-W0) /W0) xlOO其中W表示在具体某一天治疗组的平均体重，Wtl表示同一治疗组在治疗开始时的 平均体重。最大体重减少也使用上式表示，并且表示在关于具体某一组的整个实验过程中 的任意时间观察到的最大体重减少百分数。功效数据以平均肿瘤体积士平均值的标准误差(SEM)绘图表示。治疗组的肿瘤 体积利用下式表示为对照组的肿瘤体积的百分数(％ T/C)
IOOx ((T-T0)/(C-C0))其中T表示治疗组在实验过程中具体某一天的平均肿瘤体积，T0表示同一治疗 组在治疗的第一天的平均肿瘤体积；C表示对照组在实验过程中具体某一天的平均肿瘤体 积，C0表示同一治疗组在治疗的第一天的平均肿瘤体积。使用椭圆体式计算肿瘤体积(单位为立方毫米)(Dx(d2))/2其中D表示肿瘤的大直径，d表示小直径。在一些情形中，使用下式计算肿瘤消退和/或肿瘤体积的百分数改变((T-T0) /T0) XlOO其中T表示治疗组在具体某一天的平均肿瘤体积，T0表示同一治疗组在开始治疗 时的平均肿瘤体积。通过秩禾口检验(rank sum test)禾口单向 Anova 禾口 post—hoc Bonferroni t_ 检验 (SigmaStat，版本 2. 0，Jandel Scientific, San Francisco，CA)确定统计学分析。当概率 值(ρ) ( 0. 05时，认为组间差异是显著的。MM先前发现在本研究设置中所检测的化合物(1)的剂量和方案在裸鼠中是很好耐 受的。如预测的，在本研究中没有观察到体重减少或其它临床毒性迹象。在本研究设置中，化合物(1)以每日3和10mg/kg 21天，或按照间断的时间表(7 天给药，14天不给药，然后7天给药(7+/14-/7+))以30和60mg/kg进行检测。当按照21天 或7+/14-/7+时间表用化合物(1)治疗携带Lovo结肠直肠异种移植物的裸鼠时，肿瘤生长 被显著抑制，在第47天，即在21-天治疗组最后一天后7天(21+/7-)，或在第二轮7天治疗 结束时(7+/14-/7+)，鉴定了最大的肿瘤生长抑制。与赋形剂治疗的对照相比较，3和IOmg/ kg qd χ 21天的化合物(1)剂量分别导致40% (ρ = 0. 136)和83% (ρ彡0. 001) TGI，而间 断给药 30 和 60mg/kg 剂量的化合物(1)产生 59% (ρ = 0. 021)和 85% (ρ = 0. 001)TGI。与化合物(1)在Lovo结肠直肠肿瘤模型中的抗肿瘤活性相比，在Calu-6 NSCLC 模型中，肿瘤生长抑制减弱。在第47天，即在21-天治疗组(21+/7-)最后一天后7天，或 在第二轮7天治疗结束时(7+/14-/7+)，获得最大肿瘤生长抑制。在最低剂量3mg/kg发现 最大抗肿瘤效果，其抑制肿瘤生长59%，(ρ = 0.011)，而10mg/kg仅具有42%的TGI，并且 与赋形剂治疗的对照小鼠相比较不是统计学显著的(P = 0. 083)。在两个7天治疗周期后， 30mg/kg的剂量没有显著抑制Calu-6肿瘤生长(34% TGI,p = 0. 179)，而将该剂量加倍至 60mg/kg 化合物(1)导致 52% TGI (ρ = 0. 035)。化合物(1)在HCT116结肠直肠模型中介导的肿瘤生长抑制与在Lovo结肠直肠 模型中介导的肿瘤生长抑制非常相似，使用所有的剂量和时间表均鉴定了显著的抗肿瘤活 性。对于21天方案在第42天(21天治疗结束时)，对于7+/14-/7+方案在第53天(第二 个7天治疗结束后3天)，观察到最大抗肿瘤活性。与赋形剂对照相比较，在每天用3mg/kg 化合物(1)连续治疗21天结束时，HCTl 16结肠直肠肿瘤生长被抑制85% (ρ彡0. 001)，并 且每天10mg/kg的剂量产生76% (ρ = 0. 003) TGI。使用30mg/kg和60mg/kg化合物(1)进 行两轮7天的治疗分别产生63% (ρ = 0. 016)和90% (ρ彡0. 001)的TGIs。证明H460aNSCLC模型完全抗化合物(1)介导的肿瘤生长抑制。由于在所有剂量均缺少功效，很早(仅 2周后)终止对携带H460异种移植物的小鼠的治疗。与A549 NSCLC异种移植物模型中先前的功效研究相似，在本研究中，值得注意的 是关于肿瘤生长抑制一般缺少对每日给药的剂量响应。例如，当对HCT116荷瘤小鼠以3或 10mg/kg给药化合物(1)21天时，获得的％ TGIs不与剂量成比例，分别具有85%和76%的 TGI0当对Calu-6荷瘤小鼠施用相同剂量的化合物(1) 21天时，较高剂量的％ TGI小于较 低剂量的％ TGI (42% TGI相对于59% TGI)。通过对携带建立的肿瘤的裸鼠口服施用Y-分泌酶抑制剂化合物(1)引起的 Notch信号传导中断产生了抗肿瘤功效。较早的发现已经表明化合物(1)对于植入裸鼠中 的A549 NSCLC肿瘤的延长且持久的抑制是有效的。开始进行另外的体内研究，来研究化合 物(1)抗肿瘤功效的广度。基于内源性Notch信号传导的事实，在体内异种移植物研究中， 选择Lovo结肠直肠癌，Calu-6 NSCLC，HCT116结肠直肠癌和H460a NSCLC进行检测。在所 述4种肿瘤模型中的3种中，化合物(1)是有效的，并且显著抑制肿瘤生长，而无毒性。在本功效研究设置中，以两种不同的方案检测两种剂量的化合物(1)中的每一 种3和10mg/kg qd 21天，或30和60mg/kg间断给与(7+/14-7+)。预先检测这些剂量和 时间表，并且发现在裸鼠中是很好耐受的。化合物(1)在两种结肠直肠模型Lovo和HCTl 16 中表现出最大的抗肿瘤活性。在给药21天后，与赋形剂治疗的对照相比，3和10mg/kg的化 合物(1)剂量分别导致40%和83% TGI，而30和60mg/kg的化合物(1)剂量产生59%和 85% TGI0在HCT116模型中，最低的3mg/kg剂量甚至更有活性(TGI = 85% )，并且IOmg/ kg的剂量同样有效，与赋形剂治疗的对照相比较，具有76% TGI。使用30mg/kg和60mg/kg 化合物(1)进行两轮7天的治疗分别产生63%和90%的TGIs。针对检测的两种NSCLC异种移植物模型(Calu-6和H460a)，化合物(1)较不有效。 在Calu-6模型中，以最低剂量3mg/kg每天给药21天获得最大生长抑制(与赋形剂相比较， 59% TGI)，而所有的其它剂量和方案证明是较不有效的。对于化合物(1)的抗肿瘤作用， H460a模型是完全难治愈的。尽管到目前数据组较小，总共仅检测了 4种肿瘤模型，但是所观察到的体内抗肿 瘤反应似乎与细胞系Notch 1/Notch 3的表达比例相关。已经表明Notch 3在由γ.-分 泌酶加工和蛋白水解分裂后作用为胞内Notch 1 (ICN)的负调控子。Notch 3在核易位后与 ICN竞争，并且结合转录因子。内部数据揭示H460a细胞中升高的Notch 3蛋白表达，和在 敏感细胞系(即，Lovo，HCT116，和A549)中减少的或低的表达。如先前使用化合物(1)的体内研究所示，当小鼠每天给药21天后，关于肿瘤生长 抑制，此处观察到一般缺少剂量比例性。另一方面，关于按照间断(7+/14-/7+)时间表给药 的较高剂量，似乎确实存在剂量响应。所认知到的剂量响应的缺少不能完全由药物暴露解 释。在用10mg/kg化合物(1)急性相对于长期给药的小鼠中的血浆暴露的比较表明相似的 暴露，这表明不存在暴露随时间的减少，这可能解释剂量比例性抗肿瘤响应的缺乏。此外， 裸鼠中的另一个药物代谢动力学研究揭示关于至多30mg/kg剂量的血浆暴露的杰出剂量 比例性。因此，关于TGI缺少剂量比例性响应不是由于血浆暴露药物饱和。同样地，这些研 究验证了％ TGI不总是与暴露成比例，并且暗示生物学阈值效应。来自本文所述的体内研究的结果表明Y.-分泌酶抑制剂化合物的抗肿瘤活性的广度。每天口服施用或间断(S卩，两个周期)给药可以有效抑制肿瘤生长而没有毒性。在4 种异种移植物模型中的3种中，化合物(1)是口服活性的。这些数据表明通过施用Y-分 泌酶抑制剂即化合物(1)产生的Notch抑制可能是一种有效的癌症治疗策略。Mrk化合物(1)是γ-分泌酶的一种有效的抑制剂，其阻断肿瘤细胞中Notch信号 传导的激活。在先前的研究中，对A549荷瘤小鼠口服施用化合物(1)导致持续的抗肿瘤 反应。为了进一步评估化合物⑴的抗肿瘤活性广度，在Lovo和HCT116人结肠直肠，与 Calu-6和H460a NSCLC异种移植物模型中进行4种功效研究。两种剂量(3和10mg/kg)每 天给药21天，而30和60mg/kg使用间断时间表给药(7天给药，14天不给药，然后7天给药 (7+/14-/7+))。在两种结肠直肠模型Lovo和HCTl 16中，化合物(1)表现出最大抗肿瘤活 性。在给药21天后，与赋形剂治疗的对照相比较，10mg/kg的化合物⑴剂量导致83%的肿 瘤生长抑制(TGI)，而30和60mg/kg的化合物(1)剂量产生59%和85%的TGI。在HCTl 16 模型中，低如3mg/kg的剂量是有效的，与赋形剂对照相比较，具有85% TGI，并且10mg/kg 的剂量同样是有效的。用30mg/kg和60mg/kg化合物(1)进行两轮7天的治疗分别产生 63%和90%的TGIS。对于两种所检测的NSCLC异种移植物模型Calu_6和H460a，化合物 (1)是较不有效的。在Calu-6模型中，仅在以3mg/kg的最低剂量每天给药21天获得显著 的生长抑制(与赋形剂相比较，59% TGI)，而所有其它剂量和方案证明是较不有效的。对于 化合物(1)的抗肿瘤作用，H460a模型是完全难治愈的。所观察到的抗肿瘤活性模式似乎 与细胞系N0tchl/N0tch3表达比例相关，然而，数据组较小，并且对于驱动功效的因素仍然 理解很少。这些数据表明通过施用Y-分泌酶抑制剂化合物(1)产生的Notch抑制可能是 一种有效的癌症治疗策略。实施例2化合物(1)在A549 NSCLC肿瘤细胞中的细胞活性化合物(1)在细胞和无细胞测定中的IC5tl在低的纳摩尔范围内，关于不同类型 (受体、离子通道、酶)的75种其它结合位点观察到具有>2 log单位的选择性。化合物 (1)的生长抑制活性是复杂的。化合物(1)不阻止肿瘤细胞增殖，也不诱导凋亡，而是产生 较少转化的、更扁平、更缓慢的生长表型。这种机制与Notch抑制相一致，并且排除了收集 标准(collecting standard)的EC50值。如通过蛋白质印迹测量ICN表达的减少，化合物 (1)减少Notch加工。这导致转录靶基因产物Hesl减少的表达，其同样通过蛋白质印迹测
Mo在发育和组织重建过程中，多能干细胞作为分化细胞的来源，以产生非专门增殖 的细胞类型。这些干细胞的特征和肿瘤的快速不可控增殖之间的联系逐渐变得清楚。一种 主要的发育信号传导轴是Notch途径。Notch信号传导通过在成体多能干细胞的发育和自 我更新过程中介导祖细胞的分化而调控细胞命运。Notch起作用保持祖细胞处于多能快速 增殖状态。Notch基因扩增、染色体易位或突变导致升高的Notch信号传导，由此通过将肿 瘤细胞保持在干细胞样增殖状态而给予肿瘤生长的优势。膜内加工是膜受体激活和信号传导的发生主题。Y -分泌酶是包括Notch的几种 信号传导受体(其它由Y-分泌酶加工的蛋白的实例为淀粉样前体蛋白[APP]，CD44干细 胞标记，和HER4[ErbB4])膜内蛋白水解加工中的关键酶。Notch的Y -分泌酶加工产生称
21为ICN的活性形式。该蛋白易位至核，并且形成包括直接改变关键的增殖-和分化_特异性 基因的表达的CSL转录调控子的大转录复合物的一部分。通过Y-分泌酶抑制阻断Notch 信号传导在体内在人类癌症细胞中产生较缓慢的生长、较少转化的表型。这种类型的新型 治疗途径具有使癌症成为更易处理的疾病的潜力，而没有传统细胞毒性药物的强副作用。材料和方法细胞系和培养A549 细胞系获自美国组织培养物中心(American Tissue CultureCollection) (ATCC)，ManassasVA并且保持在Ham培养基中，所述Ham培养基补充了 10%热灭活的胎牛 血清(HI-FBS ；GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD)和 2mM L-谷氨酰胺(GIBC0/BRL)。将 IxlO6 A549细胞接种在IOcm3板中用于FACS分析，并且将3xl05细胞/孔接种在6孔板中用于蛋 白质印迹分析。允许细胞附着24小时，然后用化合物(1)以下述浓度0. 1,0. 25,0.5,1,2.5 和5 μ M处理。将细胞温育72或120小时，并且收集用于FACS分析。检测套装将测试化合物(1)以IOmM溶解在100% 二甲亚砜(DMSO) (Sigma(西格玛))中，并 且在玻璃小瓶中在_20°C保存。5-点给药和蛋白质印迹分析通过用冷PBS洗涤板并且直接向板添加样品缓冲液(1 1水2X含有5%2-β 巯基乙醇的Tris-甘氨酸SDS样品缓冲液(Invitrogen，Carlsbad, CA))而收集A549细胞。 所用的裂解缓冲液的体积约为ΙΟΟμΙ/ΙΧΙΟ5个细胞。通过煮沸5分钟变性蛋白，通过使用 4-20% Tris-甘氨酸凝胶(Invitrogen)进行的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并且电转 到0.45μπι硝基纤维素膜(Invitrogen)上。将膜在室温下在封闭缓冲液(PBS/0. 吐温 20中的5%牛奶)中封闭1小时，然后用一级抗体在4°C温育过夜。洗涤膜，并用二级抗体 在室温下温育30分钟。使用增强的化学发光(ECL Plus, Amersham Pharmacia Biotech (安 玛西亚法玛西亚生物技术)，Piscataway，NJ)进行免疫检测。对于蛋白质印迹，使用处于 1 1000稀释的来自细胞信号传导(Cell Signaling)的分裂的Notch-I (vall744)抗体 (#2421)检测总ICN，使用处于1 1000稀释的来自US Biological (美国生物学)的Hesl 抗体(#H2034-35)检测Hesl，并且使用处于1 10，000稀释的来自Sigma (西格玛)的肌 动蛋白抗体(#5316)检测肌动蛋白。细胞周期分析将细胞用化合物(1)温育72或120小时，通过刮擦收集，在磷酸盐缓冲液(PBS)中 洗涤两次，以1.5xl03rpm离心，并且用70%乙醇在_20°C固定过夜。然后，使用MPM2-FITC 和碘化丙啶(PI)双重染色(Becton Dickinson, San Jose, CA)分析细胞。简言之，将细 胞用冰冷的包含0. 05%吐温-20的PBS(PBST)洗涤两次，用抗-磷Ser/Thr MPM2抗体 (#05-368,Upstate/Mi 11 ipore,BulIerica,ΜΑ)温育 2 小时，再次用 PBST 洗涤，在暗处用二 级 IgG-FITC 抗体(#AP308F，Chemicon, Temecula, CA)温育，用 PBST 洗涤并再用 PI/RNA 酶 溶液(Becton Dickinson, San Jose, CA)在 37°C温育另外 30 分钟。在装配有488nm氩离子激光的FACScan流式细胞计数仪(Becton Dickinson, San Jose, CA)上分析样品。使用对数放大用530/30nm通带滤光片(bandpass filter)收集绿 色荧光素异硫氰酸盐(FITC)荧光，并且使用线性放大通过585/42nm通带滤光片滤过来自碘化丙啶(PI)的橙色发射。每份样品最少收集20，000个事件。使用Flowjo软件(Tree Star Inc.(三星公司)，Ashland, OR)进行DNA柱状图的细胞周期分析。Notch加工的蛋白质印迹分析通过Y-分泌酶进行Notch受体分裂后的ICN蛋白形成是Notch信号传导中的关 键步骤。ICN迁移至核，成为调控包括Hesl的各种靶基因的转录的较大转录复合物的一部 分。通过蛋白质印迹监测肿瘤细胞系中ICN表达和Notch靶基因产物Hesl的减少。在人 NSCLC A549细胞中在处理5天后的组织培养物中，化合物(1)抑制ICN产生，所述ICN诱导 扁平且更少转化的肿瘤细胞表型。这种形态与在组织培养物中生长的非转化原代支气管上 皮细胞相似。由Clonetics网站获得用于视觉比较的比较。这一数据与抑制肿瘤细胞中的 Y“分泌酶相一致。没有观察到在化合物处理后的凋亡表型的出现。细胞周期分析利用FACS分析获得对化合物(1)处理后的细胞周期抑制作用的理解。用增加浓 度的化合物⑴处理A549细胞72和120小时。FACS分析表明对细胞周期进展的非常小的 作用，在72和120小时使用5μ M具有中等细胞周期减缓，如下文所述。FACS分析的量化
化合物(1)，μΜ时间，hrssubGl，%Gl, %G2/M, %05.260.123.50.106.563.123.30.25725.964.820.30.504.366.619.41.06.66421.55.08.464.92007.258.2590.106.859.024.10.251206.761.123.80.509.658.623.31.08.060.919.85.013.758.718.3化合物(1)不阻断肿瘤细胞增殖，也不诱导凋亡，而是相反产生较少转化的、更扁 平的且更缓慢的生长表型。这一机制与Notch抑制相一致。如通过蛋白质印迹测量ICN表 达的减少，化合物(1)减少Notch加工。这导致转录靶基因产物Hesl减少的表达，其同样 通过蛋白质印迹测量。
23
实施例3在化合物(1)给药后的A549异种移植物蛋白质印迹分析化合物(1)是Y-分泌酶的有效且选择性的抑制剂，其在肿瘤细胞中对Notch信 号传导产生抑制活性(1)。化合物(1)在细胞和不含细胞的测定中的IC5tl在低的纳摩尔范 围内，关于不同类型(受体、离子通道、酶)的75种其它结合位点观察到具有>2 log单位 的选择性。化合物(1)的生长抑制活性是复杂的。化合物(1)不阻止肿瘤细胞增殖，也不诱 导凋亡，而是产生较少转化的、更扁平、更缓慢的生长表型。这种机制与Notch抑制相一致。 化合物(1)治疗的肿瘤具有降低的胞外基质蛋白5型胶原蛋白水平和升高的MFAP5水平。 另外，如通过ICN和Notch-I受体表达的减少测量的，肿瘤细胞中的Notch加工被抑制。当 对携带A549异种移植物的小鼠每天给药化合物(1)至多60mg/kg时，ICN和Notch-I是变 化的。这可能是由于在功效研究过程中重复给药后暴露的减少或在肿瘤内极差的化合物分 布。在发育和组织重建过程中，多能干细胞作为分化细胞的来源，以产生非专门增殖 的细胞类型。这些干细胞的特征和肿瘤的快速不可控增殖之间的联系逐渐变得清楚。一种 主要的发育信号传导轴是Notch途径。Notch信号传导通过在成体多能干细胞的发育和自 我更新过程中介导祖细胞的分化而调控细胞命运。Notch起作用保持祖细胞处于多能快速 增殖状态。Notch基因扩增、染色体易位或突变导致升高的Notch信号传导，由此通过将肿 瘤细胞保持在干细胞样增殖状态而给予肿瘤生长的优势。膜内加工是膜受体激活和信号传导的发生主题。Y -分泌酶是包括Notch的几种 信号传导受体(其它由Y-分泌酶加工的蛋白的实例为淀粉样前体蛋白[APP]，CD44干细 胞标记，和HER4[ErbB4])膜内蛋白水解加工中的关键酶。Notch的Y -分泌酶加工产生称 为ICN的活性形式。该蛋白易位至核，并且形成包括直接改变关键的增殖-和分化_特异性 基因的表达的CSL转录调控子的大转录复合物的一部分。通过Y-分泌酶抑制阻断Notch 信号传导在体内在人类癌症细胞中产生较缓慢的生长、较少转化的表型。这种类型的新型 治疗途径具有使癌症成为更易处理的疾病的潜力，而没有传统细胞毒性药物的强副作用。材料和方法检测套装将测试化合物(1)以IOmM溶解在100% 二甲亚砜(DMSO) (Sigma(西格玛))中，并 且在玻璃小瓶中在_20°C保存。肿瘤收集和蛋白质印迹分析对携带A549肿瘤的裸鼠按照每日口服时间表以指定剂量给药21天。在尸体剖 检时收集来自每组的三种A549肿瘤，并且急速冷冻。通过向肿瘤中直接添加样品缓冲液 (1 1水2X含有5% 2-β巯基乙醇的Tris-甘氨酸SDS样品缓冲液(Invitrogen， Carlsbad, CA))并且利用印pendorf研棒分解而制备蛋白提取物。所用的裂解缓冲液的体 积约为100 μ 1/1Χ106个细胞。通过煮沸5分钟变性蛋白，通过使用4-20% Tris-甘氨酸凝 胶(Invitrogen)进行的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并且电转到0. 45 μ m硝基纤维素 膜(Invitrogen)上。将膜在室温下在封闭缓冲液(PBS/0. 吐温20中的5%牛奶)中封 闭1小时，然后用一级抗体在4°C温育过夜。洗涤膜，并用二级抗体在室温下温育30分钟。 使用增强的化学发光(ECL Plus,Amersham Pharmacia Biotech(安玛西亚法玛西亚生物技术)，PiSCataWay，NJ)进行免疫检测。对于蛋白质印迹，使用处于1 1000稀释的来自细 胞信号传导(Cell Signaling)的分裂的Notch-1 (vall744)抗体(#2421)检测总ICN，使用 处于 1 1000 稀释的来自 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz 生物技术)的 Notch-1 C-20抗体(#SC-6014)检测总Notch-1，使用处于1 1000稀释的来自US Biological (美 国生物学)的Hesl抗体(#H2034-35)检测Hesl，使用处于1 1000稀释的来自Sigma (西 格玛)的肌动蛋白抗体(#5316)检测肌动蛋白，使用处于1 1000稀释的来自Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz生物技术)的H-200抗体(#20648)检测V型胶原蛋白，并且使 用处于1 1000稀释的来自Abnova的MFAP5抗体(#H00008076_A01)检测MFAP5。异种移棺物蛋白质印迹分析γ -分泌酶抑制剂处理的A549异种移植物肿瘤的微阵列分析揭示RNA表达变化 与胞外基质改变一致。制备化合物(1)处理的肿瘤用于蛋白质印迹分析。V胶原蛋白表达 显著减少，而MFAP5蛋白表达增加。Notch-I蛋白水平和ICN的表达在除最高剂量组外的 所有动物组中减少。V型胶原蛋白和MFAP5是补充胞外基质的结构蛋白。在更加分化的组 织中，V型胶原蛋白表达通常减少，MFAP5表达通常增加。这一数据与A549肿瘤细胞中的 Notch-I抑制导致更加分化的表型的发挥作用假说相一致。Mrk化合物(1)处理的肿瘤具有减少的胞外基质蛋白5型胶原蛋白水平和升高的 MFAP5水平。另外，如通过ICN和Notch-I受体表达减少测量的，肿瘤细胞中的Notch加工 被抑制。当对携带A549异种移植物的小鼠每天给药化合物(1)至多60mg/kg时，ICN和 Notch-I是变化的。这可能是由于在功效研究过程中重复给药后暴露的减少或在肿瘤内极 差的化合物分布。实施例4在化合物(1)给药后，MDA-MB-468乳腺肿瘤细胞中软琼脂生长潜能的丧失化合物(1)是Y-分泌酶的有效且选择性的抑制剂，其在肿瘤细胞中对Notch信 号传导产生抑制活性。化合物(1)在细胞和不含细胞的测定中的IC5tl在低的纳摩尔范围 内，关于不同类型(受体、离子通道、酶)的75种其它结合位点观察到具有>2 log单位的 选择性。化合物(1)的生长抑制活性是复杂的。化合物(1)不阻止肿瘤细胞增殖，也不诱 导凋亡，而是产生较少转化的、更扁平、更缓慢的生长表型。这种机制与Notch抑制相一致， 并且排除收集标准的EC5tl值。在软琼脂中，化合物(1)减小MDA-MB-468群落的尺寸。在发育和组织重建过程中，多能干细胞作为分化细胞的来源，以产生非专门增殖 的细胞类型。这些干细胞的特征和肿瘤的快速不可控增殖之间的联系逐渐变得清楚。一种 主要的发育信号传导轴是Notch途径。Notch信号传导通过在成体多能干细胞的发育和自 我更新过程中介导祖细胞的分化而调控细胞命运。Notch起作用保持祖细胞处于多能快速 增殖状态。Notch基因扩增、染色体易位或突变导致升高的Notch信号传导，由此通过将肿 瘤细胞保持在干细胞样增殖状态而给予肿瘤生长的优势。膜内加工是膜受体激活和信号传导的发生主题。Y -分泌酶是包括Notch的几种 信号传导受体(其它由Y-分泌酶加工的蛋白的实例为淀粉样前体蛋白[APP]，CD44干细 胞标记，和HER4[ErbB4])膜内蛋白水解加工中的关键酶。Notch的Y -分泌酶加工产生称 为ICN的活性形式。该蛋白易位至核，并且形成包括直接改变关键的增殖-和分化_特异性基因的表达的CSL转录调控子的大转录复合物的一部分。通过Y-分泌酶抑制阻断Notch 信号传导在体内在人类癌症细胞中产生较缓慢的生长、较少转化的表型。这种类型的新型 治疗途径具有使癌症成为更易处理的疾病的潜力，而没有传统细胞毒性药物的强副作用。材料和方法细胞系和培养MDA-MB-468细胞系获自美国组织培养物中心(American Tissue Culture Collection) (ATCC)，Manassas, VA并且保持在RPMI培养基中，所述RPMI培养基补充 7 10%热灭活的胎牛血清(HI-FBS ；GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD)和 2mM L-谷氨酰胺 (GIBC0/BRL)。检测套装将测试化合物(1)以IOmM溶解在100% 二甲亚砜(DMSO) (Sigma(西格玛))中，并 且在玻璃小瓶中在_20°C保存。软琼脂群落形成测定对于不依赖锚定性生长测定，向6孔板的每个孔中倾倒2ml包含0. 5%低熔点 SeaPlaque琼脂糖(#50100，Cambrex, Rockland, ME)的细胞型特异性完全培养基(补充了 20%胎牛血清(FBS)，1%青霉素/链霉素，丙酮酸钠，HEPES的RPMI培养基)的底 层。待琼脂培养基在室温下固化后，加入处于0. 5ml如上述包含0. 3% SeaPlaque琼脂糖 的完全培养基中的3xl03个细胞/孔。次日，向每个孔中加入包含0，100，或250nM化合物 (1)的Iml培养基。温育细胞4周，以允许群落形成，包含化合物的培养基每周更换两次。软琼脂生长化合物(1)是Y-分泌酶的有效且选择性的抑制剂，其在肿瘤细胞中对Notch信 号传导产生抑制活性(1)。化合物(1)的生长抑制活性是复杂的。化合物(1)不阻止肿瘤 细胞增殖，也不诱导凋亡，而是产生较少转化的、更扁平、更缓慢的生长表型。在软琼脂中形 成群落的能力表示肿瘤细胞进展中的重要事件。不转化的细胞和极差致瘤性的细胞在接种 在软琼脂中时不能生长。相反，高致瘤性细胞在软琼脂条件下快速生长，产生大的群落。在 人乳腺癌细胞系MDA-MB-468中通过测量在软琼脂中的生长潜能，而评估化合物(1)对转化 的表型的作用。化合物(1)以剂量依赖性方式(250nM> 100nM>对照)减少群落生长。Mrk化合物(1)不阻止肿瘤细胞增殖，而是减小MDA-MB-468群落在软琼脂中的尺寸。 这与化合物(1)在MDA-MB-468乳腺肿瘤细胞中诱导较少转化的表型相一致。实施例5在携带A549非小细胞肺癌异种移植物的裸鼠中每天一次或两次口服施用γ-分 泌酶抑制剂化合物(1)的耐受性和功效化合物(1)是Y-分泌酶的有效且高度选择性的抑制剂，其最初用于治疗阿尔茨 海默病。在体外，化合物(1)以纳摩尔浓度抑制Notch激活和加工，并且向培养物中的肿瘤 细胞添加化合物(1)诱导较少转化的表型，并且阻止在软琼脂中的生长。在体内，化合物 (1)在啮齿动物、狗和人类中具有良好的口服生物利用度和有利的药物代谢动力学模式。在 本研究中，将携带A549非小细胞肺癌(NSCLC)异种移植物的裸鼠在21天治疗周期中的7、 14或21天口服每日或每日两次(qd or bid)给药化合物(1)。对于每日两次(bid)给药，
26鉴定最大耐受剂量(MTDs)为60mg/kg 7天，30mg/kg 14天，和10mg/kg 21天。对于每日 (qd)给药，注意到最大耐受剂量为60mg/kg 14天或30mg/kg 21天。当仅在21天周期中的 7天(7+/14-)施用60mg/kg的化合物(1)时，开始时观察到肿瘤消退，并且在不进行治疗的 14天后，％肿瘤生长抑制(TGI)与赋形剂治疗的对照动物相比仍然为91%。另外，每日给 药一次或两次较低剂量的化合物(1) (3mg/kg, 10mg/kg和30mg/kg) 14(14+/7_)或21天在 21天周期结束时导致显著且持续的肿瘤生长抑制，％ TGIs在66-83%范围内。每天施用 化合物(1) 一次与使用14+/7-或21天治疗时间表每天两次治疗一样有效，具有剂量依赖 性。此外，较短的给药持续时间(7+/14-或14+/7-)与完整的21天给药一样有效抑制A549 肿瘤生长。这一数据支持通过施用Y分泌酶抑制剂化合物(1)进行的Notch抑制可能是 治疗癌症的一种有效的临床治疗法的观点。Notch信号传导途径在发育过程中通过调控祖细胞和多能干细胞的分化、增殖和 凋亡而参与决定细胞的命运。由于基因扩增、染色体易位或突变导致的Notch信号传导元 件的失调参与多种类型的恶性病，包括白血病(Leukemia)，成神经管细胞瘤和成胶质细胞
(medullo-and glioblastoma), ？L (breast carcinoma)，Lf^ (head and neck cancer)，和胰腺癌(pancreatic carcinoma)。例如，Notch在造血系统中起决定细胞世系 的作用，并且已表明激活Notch-I突变负责所有T细胞ALLs (急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia))中的大约一半。Notch信号传导途径由Notch受体(Notch受 体1-4)构成，其在与配体(δ -样-1，-3，-4，Jagged-I和_2)结合并且通过蛋白水解分裂 激活时，易位至核，在核中它们作用为靶基因的转录激活剂。γ -分泌酶是负责Notch受体分裂和激活的两种重要酶中的一种，并且已经提议 其为癌症治疗的靶标。由Y-分泌酶酶促分解胞内Notch(ICN)允许ICN易位至核，导致 下游致癌性靶标的转录，所述下游致癌性靶标包括Hes，Hes相关的bHLH受体，Hey, HERP, 细胞周期调控子(P21，细胞周期蛋白A，细胞周期蛋白D1)，SKP2，NF-kB的转录因子，AKT， PI-3K，erbB2, β -联蛋白和凋亡过程的调控剂。Ras癌基因可以激活野生型Notch信号传 导，其是Ras-介导的向恶性病转化的明显需要。最近的证据表明来自肿瘤细胞的Notch信 号传导可以引发邻近的内皮细胞的Notch激活，因此促进肿瘤发生和血管生成。因此，靶向 Notch活性的Y-分泌酶抑制剂可能在不同癌症类型中具有多效性作用。除了加工Notch，Y-分泌酶还负责加工β-淀粉样前体肽(APP)，其是阿尔茨海 默病治疗中的靶标。已经表明靶向Y-分泌酶的小分子在某种选择性程度上能够相对于 Notch阻断APP的加工。当前临床前沿，开发化合物(1)用于阿尔茨海默病，但是相对于 Y-分泌酶缺乏抑制APP的充分的特异性。认为靶向正常细胞中的Notch的后果不适于阿尔 茨海默病适应征，但是对于肿瘤学是可接受的。例如，在给药Y-分泌酶抑制剂的Fischer 大鼠中的毒性研究揭示Notch途径激活的阻断导致粘膜分泌的杯形细胞尺寸和数量的增 加。化合物⑴是高度选择性且有效的Y -分泌酶抑制剂(ICsi = 4nM)。认识到联系 Notch信号传导途径的失调和癌症的mounting数据，利用一种交叉治疗策略将Y -分泌酶 抑制剂用作癌症治疗。在细胞报告子测定(IC5tl = 5nM)中，化合物(1)以纳摩尔范围抑制 人Αβ蛋白生产(IC5tl = 4-14ηΜ)，和Notch活性/加工。化合物(1)在小鼠中具有有利的 药物代谢动力学，具有中等至高的口服生物利用度。
在本研究中，针对裸鼠中的A549 NSCLC人异种移植物模型，评估化合物(1)的抗 肿瘤活性。由于表达受体、配体和下游效应子如Hes-I和Hey-I (如通过基于PCR的基因表 达模式评估)，A549细胞似乎具有功能性Notch信号传导途径。A549细胞在Notch途径中 具有至少一种可以确认的缺陷；负调控子Numb仅以低水平表达。在体外，nM浓度的化合物 (1)在Α549细胞中诱导较少转化的表型以及MDA-MB-468乳腺肿瘤细胞失去在软琼脂中的 生长，这与Notch激活的机制性抑制相一致。为了检验化合物(1)的体内抗肿瘤作用，在 本研究中，在21天的时间表中的7，14或21天向携带A549异种移植物的雌性无胸腺nu/ nu(裸)小鼠每天一次(qd)或两次(bid)施用化合物(1)。材料和方法使用获自查理斯河实验室(CharlesRiver Laboratories) (Wilmington,ΜΑ)的雌 性裸鼠(10只/组)，此时它们约为13-14周龄，并且重约23-25克。通过对实验动物的总 体观察和通过分析笼养在共用架台上的岗哨动物(sentinel animal)的血液样品而每天确 定所有动物的健康状况。在实验应用之前，允许所有动物适应并且由任何运输相关的压力 恢复最少72小时。随意提供高压灭菌的水和照射过的食物[5058-ms Pico chow(小鼠) Purina, Richmond, IN]，并且保持动物为12小时光照和黑暗的周期。在使用之前将笼、草垫 和水瓶高压灭菌，并且每周更换。肿瘤A549 人 NSCLC 细胞购自 ATCC (Manassas, VA)，并且培养在具有 10 % (v/v) FBS 的 RPMI 1640培养基中。生长细胞，并且由肿瘤学体内组(Oncology In Vivo Section) (OIVS) 的成员收集。每只小鼠接受在0.2mlPBS(磷酸盐缓冲液)中的7.5xl06个细胞，所述细胞 于8/17/06由OIVS成员皮下植入在右后腰窝处。检测药剂将化合物(1)用0. 2%吐温-80配制为在水中的1. 0% Klucel中的混悬液用于口 服(PO)施用。在停止和施用之前剧烈混合化合物(1)。每周制备配制的化合物和赋形剂， 并且保存在4°C，如下文所述。药物配制 随机化在肿瘤植入后第25天，将动物按照肿瘤体积随机化，从而所有组具有约 100-150mm3的相似的起始平均肿瘤体积。研究设计
剂量组在下述文列出。研究设计7和14天给药的组 21天给药的组 治疗治疗开始于9/12/06 (肿瘤细胞植入后第26天)。在21天时间表的7、14或21天， 使用无菌1 cc注射器和18 口径的管饲针头(0. 2ml/动物)每天一次(qd)或两次(bid) (间隔8小时)将化合物(1)和赋形剂作为混悬液给药。对于给药7天的动物(7+/14-)，治疗于9/19/06 (肿瘤细胞植入后第33天)结束。这些小鼠在第67天再次用相同剂量的化 合物(1)治疗另外7天至第74天。对于给药14天(14+/7-)的动物，治疗于9/26/06 (肿 瘤细胞植入后第40天)结束，并且对于给药21天的动物，治疗于10/3/06 (肿瘤细胞植入 后第47天)结束·病理学/尸体剖检在处死之前2小时对动物注射在Iml无菌水中的Img BrdU (溴脱氧尿苷)来评估 肿瘤细胞增殖。通过用CO2诱导然后断颈而处死动物。收集来自赋形剂处理的组和所选化 合物(1)处理的组的肿瘤，并且在锌-福尔马林中固定过夜，处理，石蜡包埋，并且切片，用 于组织病理学(苏木精和曙红(H & E)染色用于形态学评估，和BrdU染色)。收集脾和胃 肠道部分，福尔马林固定，处理，石蜡包埋，切片，并且用H&E染色，分别用于评估边缘区域B 细胞消耗，和杯形细胞形成，因为这些是Y-分泌酶抑制剂的两种已知的靶标-相关的作 用。结果在下文描述。尸体剖检/病理学总结 每周测量肿瘤和小鼠体重两次。所有的动物分别进行整个实验。计算和统计学分析体重减少使用下式以平均组体重变化百分数绘图表示=((W-Wci)ZX)X 100，其中 ‘W’表示在具体某一天治疗组的平均体重，%’表示同一治疗组在治疗开始时的平均体重。 最大体重减少也使用上式表示，并且表示在关于具体某一组的整个实验过程中的任意时间 观察到的最大体重减少百分数。在给定组中，定义毒性为> 20%的小鼠表现出> 20%的体 重减少和/或死亡率。功效数据以平均肿瘤体积+平均值的标准误差(SEM)绘图表示。治疗组的肿瘤体 积利用下式表示为对照组的肿瘤体积的百分数(％T/c) 100 X(CT-Ttl)/(C-Ctl)),其中T表 示治疗组在实验过程中具体某一天的平均肿瘤体积，T0表示同一治疗组在治疗的第一天的 平均肿瘤体积；C表示对照组在实验过程中具体某一天的平均肿瘤体积，Ctl表示同一治疗组 在治疗的第一天的平均肿瘤体积。使用椭圆体式(ellipsoid formula)计算肿瘤体积(单 位为立方毫米)(D x(d2))/2，其中‘D’表示肿瘤的大直径，‘d’表示小直径。在一些情形 中，使用下式计算肿瘤消退和/或肿瘤体积的百分数改变=(CT-TciVTci)x 100，其中‘T’表 示治疗组在具体某一天的平均肿瘤体积，‘IV表示同一治疗组在开始治疗时的平均肿瘤体 积。通过秩和检验和单向Anova和post-hoc Bonferroni t_检验(SigmaStat，版本2. 0， Jandel Scientif ic，San Francisco, CA)确定统计学分析。当概率值(P)彡0.05时，认为 组间差异是显著的。
药物暴露为了评估长期药物暴露，在最后一次给药后0. 5，1，2，4，8，和24小时从10mg/kg化 合物(1)组(qd χ 21天)收集血液样品，每个时间点2只小鼠。为了评估急性药物暴露， 在研究的最后一天，对首次用于实验的裸鼠组施用单次剂量为10mg/kg的化合物(1)。制备 血浆样品，并且通过LC/MS/MS分析化合物(1)。由2只动物/组/时间点计算平均血浆浓度。将具有低于量化界限(< 12. 5ng/ ml)的浓度的血浆样品设定为零。由平均血浆浓度数据估算药物代谢动力学参数。取样 时间报告为名义上的时间(nominal time)。报告的药物代谢动力学参数为最大血浆浓度 (Cmax)，0-8小时在血浆浓度-时间曲线下的面积(AUCch8J，和剂量标准化的AUC (AUC0_8hr/ 剂量)。Cmax值直接取自在第一时间点的血浆浓度-时间曲线，无需任何外推。AUC利用线 性梯形法则计算。在长期给药的小鼠中，10mg/kg的剂量产生708ng*小时/ml的Cmax和923ng*小 时/ml的AUCup在首次用于实验的小鼠中的单次剂量提供相似的暴露，Cmax和AUCQ_8to 分别为559ng*小时/ml和1279ng*小时/ml，这表明在长期给药时既不存在药物累积也不 存在减少的暴露。结果在下文列出。药物暴露总结使用10mg/kg剂量的平均血浆暴露 结果毒性在先前的最大耐受剂量(MTD)研究中，对首次用于实验的裸鼠每天两次给药 90mg/kg化合物(1) 14天是有毒的，并且导致显著的体重减少，而每天一次给药90mg/kg是 耐受的。在本研究中，每天两次给药60mg/kg化合物(1)超过7天不被耐受，并且每天一次 超过14天不被耐受。当动物被60mg/kg每天两次给药21天或14天时，每个治疗组分别死 亡7只和4只小鼠，大部分动物在死亡前表现出前述体重减少。当动物每天一次给药21天 时，3只小鼠死亡。60mg/kg qd 14天或bid 7天的剂量是很好耐受的，没有可评估的体重 减少或其它临床毒性迹象。每天一次30mg/kg的剂量21天是耐受的，然而，每天两次30mg/kg的剂量21天是 有毒性的，有2只动物死亡。30mg/kg的剂量每天给药一次或两次14天是很好耐受的，没有 可评估的体重减少或其它临床毒性迹象。使用所有的给药时间表，低于30mg/kg(即，IOmg/ kg或3mg/kg)的剂量是很好耐受的，并且没有观察到总体临床毒性迹象。抗肿瘤功效在21天时间表的7天、14天或21天中向携带A549 NSCLC异种移植物的裸鼠每 天一次或两次口服施用化合物(1)，与赋形剂治疗的动物相比较，导致显著的肿瘤生长抑制 (TGI)，生长抑制充分持续至治疗期间之后。在第47天，即21-天治疗组的最后一个治疗日，14-天治疗组(14+/7-)的治疗后7天，或7-天治疗组(7+/14-)的治疗后14天，计算肿瘤 生长抑制百分数。按照14+/7-时间表每天一次或每天两次治疗的所有组导致显著的肿瘤生长抑 制，生长抑制持续至治疗后至多23天(第63天)。当在肿瘤植入后第47天结束21天的 周期时，与赋形剂治疗的动物相比较(P < 0. 001)，每天一次施用的最低剂量3mg/kg化合 物(1)导致66% TGI (ρ < 0. 001)，而每天两次给药相同剂量将得到的TGI增加为83%。每 天一次10mg/kg的剂量产生77% TGI (ρ < 0. 001)，并且每天两次给药相同剂量导致80% TGI (ρ < 0. 001)。在最大耐受剂量60mg/kg qd或30mg/kg bid,分别观察到88%和79% 的TGIs (ρ <0.001)。当给与30mg/kg qd的剂量时，与赋形剂治疗的对照动物相比较，获得 79% 的 TGI (ρ < 0. 001)。当按照7+/14-时间表每天两次用60mg/kg化合物⑴治疗小鼠时，治疗最初引起 建立的A549肿瘤的消退，而在21天周期结束时，即肿瘤植入后第47天，与赋形剂对照小 鼠相比较，肿瘤生长抑制仍为91%。肿瘤生长抑制保持为长久的，并且持续至治疗后34天 (第67天)。在第67天，这些小鼠用相同剂量的化合物(1)再治疗第二个周期(7天)至 第74天。肿瘤生长继续被抑制，直至第90天。当每天一次或两次连续施用化合物(1)21天时，在肿瘤植入后第47天停止治疗， 观察到相似的结果，在治疗21天后，最低剂量3mg/kg每天一次化合物(1)产生76%的 TGI (ρ = 0.002)，而每天两次给药导致83%的TGI (ρ < 0.001)。与14+/7-时间表相似，与 赋形剂治疗的对照相比，对于每天一次和每天两次治疗组，用10mg/kg治疗小鼠21天分别 导致70% (ρ = 0. 004)和72% (ρ = 0. 003)的TGIs。尽管30mg/kg每天两次的剂量是有 毒的，但是每天一次给药是很好耐受的，并且与赋形剂治疗的小鼠相比较，A549肿瘤生长被 抑制66% (p = 0. 009)。对于所有21-天治疗的组，肿瘤生长抑制保持为长久的，并且持续 至治疗后最多16天(第63天)。注意的是，不管按照14+/7-还是完整的21天治疗时间每天一次或每天两次给药 Y-分泌酶抑制剂化合物(1)，关于肿瘤生长抑制观察到普遍的剂量响应缺乏。例如，当化 合物(1)以3或10mg/kg每天一次给药21天时，得到的％TGIs非常相似，并且不是剂量成 比例的，分别具有76%和70%的TGI。当每天两次(每天给与的药物量加倍)给药相同剂 量的化合物(1)21天时，％ TGIs没有成比例增加，相对于76%和70% TGI，分别具有83% 和 72% TGI。增加的临床前证据已经证明通过靶向Y-分泌酶而使Notch途径失活可能是癌症 治疗的一种可行且可信的策略。已经在白血病、T-ALL、成神经管细胞瘤和成胶质细胞瘤、乳 腺癌、头颈癌、胰腺癌和许多其它恶性病中观察到Notch信号传导途径的失调。化合物(1) 最初开发用于阿尔茨海默病作为APP的有效抑制剂，然而，此处我们报道该化合物通过抑 制Y -分泌酶介导的Notch加工和活化对癌症治疗的交叉-治疗应用。在体外向A549 NSCLC细胞中添加化合物(1)导致较少转化的表型和在软琼脂中 生长能力的丧失。为了确定化合物(1)的体内抗肿瘤潜能，使用7+/14-，14+/7_，或完整的
21天治疗时间表，对携带A549 NSCLC异种移植物的裸鼠每天一次或两次口服给药化合物 ⑴。对于每天两次给药，鉴定的最大耐受剂量(MTDs)为60mg/kg 7天，30mg/kg 14天，和10mg/kg 21天。对于每天一次给药，注意到最大耐受剂量为60mg/kg 14天或30mg/kg 21天。上述MTDs的剂量和时间表产生与靶标-相关的胃肠毒性相一致的体重减少和死亡 率。早期使用Y-分泌酶抑制剂治疗的肠陷凹(intestinal crypts)组织学检验揭示杯形 细胞分化的急剧增加，其为靶向Notch信号传导途径的一种已知作用。当使用7+/14-给药时间表，以60mg/kg每天两次给药Y -分泌酶抑制剂化合物 (1)时，开始时观察到肿瘤消退，在21天周期结束时具有91%的TGI，并且生长抑制继续持 续数周。在结束治疗34天后，给药化合物(1)重新开始第二个周期继续抑制肿瘤生长。另 外地，按照14+/7-或完整的21天时间表每天给与一次或两次的所有其它化合物(1)剂量 (3mg/kg，10mg/kg和30mg/kg)导致显著的肿瘤生长抑制，其分别充分持续至治疗结束之 后，即第40天或47天。这些数据表明较短的化合物⑴给药持续时间(即7或14天)可 以与较长的时间间隔(即21天)给药一样有效地抑制A549肿瘤生长。在多种情形中，化合物(1)的最大抗肿瘤作用被延迟，并且在该化合物给药停止 后，更明显。这种临床前抗肿瘤模式非常不同于经典的细胞毒性药剂，其中通常在治疗期间 观察到最大肿瘤生长抑制，并且在治疗停止时肿瘤迅速开始继续生长。已知Notch在正常 和癌症干细胞中表达，并且当靶向癌症干细胞时，本文观察到的延迟的抗肿瘤作用联想到 肿瘤收缩中的理论预测的延迟。由于仅靶向少部分(但是为关键的部分)的肿瘤细胞群 体，一旦肿瘤中的癌症干细胞最终分化或被杀死，其余的细胞缺乏自我更新的能力，并且肿 瘤体积保持为稳定的或逐渐减小。关于肿瘤生长抑制观察到普遍缺少剂量比例性，以3，10，或30mg/kg每天一次给 药21天具有相似的％ TGIs。当在每天两次组中加倍每日剂量时，仅观察到TGI的适度增 加。在本研究结束时，在用10mg/kg化合物(1)急性相对于长期给药的小鼠中血浆暴露的 比较表明相似的暴露，这表示不存在暴露随时间的减少，这可能解释剂量比例性的缺乏。此 外，在裸鼠中的独立的PK研究(PK#1128)表明关于至多30mg/kg剂量的血浆暴露存在极佳 的剂量比例性[18]。因此，关于肿瘤生长抑制缺少剂量比例性不可能是由于血浆暴露的饱 和导致的。这些结果表明％ TGI不与暴露成比例，相反可能反映靶向癌症干细胞而不是快 速增殖细胞的独特性质，或者仅是存在生物学阈值效应。用H & E染色的肿瘤切片的组织学分析没有揭示用化合物⑴治疗的肿瘤细胞表 型的任何差异，然而，与来自赋形剂治疗的小鼠的肿瘤相比较，来自用10mg/kg化合物⑴ 处理21天的小鼠的肿瘤具有增加的坏死面积和细胞基质。本研究的结果揭示，按照14+/7-或21天治疗时间表，每日一次施用化合物(1)与 每日两次治疗一样有效，没有剂量依赖性。此外，较短的给药持续时间(7+/14-或14+/7-) 与完全的21天给药一样有效抑制A549肿瘤生长，并且抗肿瘤效果充分延长至治疗结束后。 这些数据表明通过施用Y-分泌酶抑制剂化合物(1)进行的Notch抑制可能是一种有效的 癌症治疗策略。实施例6非临床药理学总结化合物(1)是Y _分泌酶的有效且选择性的抑制剂，其在肿瘤细胞中产生对Notch 信号传导的抑制活性。化合物(1)产生在停止给药后得到保持的良好的体内抗肿瘤活性， 组织学分析表明与Notch信号传导抑制相一致的独特的肿瘤表型。
33
化合物(1)在细胞和无细胞测定中的IC5tl在低的纳摩尔范围内，关于不同类型 (受体、离子通道、酶)的75种其它结合位点观察到具有>2 log单位的选择性。化合物 (1)的生长抑制活性是复杂的。化合物(1)不阻止肿瘤细胞增殖，也不诱导凋亡，而是产生 较少转化的、更扁平、更缓慢的生长表型。这种机制与Notch抑制相一致，并且排除了选择 标准的EC50值。如通过蛋白质印迹测量ICN表达的减少，化合物(1)减少Notch加工。这 导致转录靶基因产物Hesl减少的表达，其同样通过蛋白质印迹测量。在体内应用中，化合物(1)在口服给药后有活性。按照间断的或每日时间表，在5 种异种移植物中的3种中表现出抗肿瘤活性，没有体重减少。重要的是，在停止给药时功效 得以维持。治疗的A549 NSCLC肿瘤的组织学分析表现出以大面积坏死、增加的胞外基质为 特征的肿瘤表型。这与胶原蛋白V和MFAP5蛋白表达中的改变相一致。这些非临床病理学结果支持在肿瘤学临床研究中进一步评估化合物(1)。初级药效学体外诜择件多种体外测定用来表征化合物(1)的效力和选择性。初级体外测定使用不含细胞 的膜制备物来提供Y-分泌酶的酶复合物作为体外测定。化合物(1)强抑制Y-分泌酶的 酶活性，具有4nM的效力。在基于细胞的报道子测定中，这转化为对淀粉样前体蛋白(APP ； 14ηΜ)和NotCh(5nM)的有力的加工抑制。APP的细胞加工使用基于ELISA的读数测量。已 经改造HEK293细胞来过表达APP。通过A 1-40 γ -分泌酶产物的基于ELISA的量化测量 加工。细胞Notch抑制活性使用稳定表达截短的人Notch 1的HEK293细胞系测量，所述截 短的人Notch 1在其胞内结构域与VP16/Gall4转录激活子融合，所述VP16/Gall4转录激 活子驱动萤火虫萤光酶基因。当通过其化学荧光测定时，抑制Notch加工产生萤光酶报道 子活性的减少。机制研究在由γ -分泌酶分裂Notch受体后形成ICN蛋白是Notch信号传导中的关键步骤。 ICN迁移至核，成为调控包括Hesl的多种靶基因的转录的较大转录复合物的一部分。通过 蛋白质印迹监测肿瘤细胞系中ICN表达和Notch靶基因产物Hesl的减少。在人NSCLC A549 细胞中，在处理5天后，在组织培养物中，化合物(1)抑制ICN的产生，诱导扁平的更少转化 的肿瘤细胞表型。在组织培养物中，用化合物(1)处理产生扁平的、不转化的表型。这一数 据与抑制肿瘤细胞中的Y-分泌酶相一致。没有观察到在化合物处理后出现凋亡表型。在软琼脂中形成群落的能力代表在肿瘤细胞进展中的重要事件。不转化的细胞和 极差致瘤性细胞在接种在软琼脂中时不能生长。相反，高致瘤性细胞在软琼脂条件下快速 生长，产生大的群落。在人乳腺癌细胞系MDA-MB-468中通过测量在软琼脂中的生长潜能， 而评估化合物(1)对转化的表型的作用。化合物(1)以剂量依赖性方式(250nM> IOOnM >对照)减少群落生长。体内评估在数种异种移植物模型中，使用不同剂量和时间表，检测临产前抗肿瘤活性。在 A549 NSCLC模型中，在每天一次治疗21天的裸鼠中，化合物(1)产生统计学显著的肿瘤生 长抑制(70% TGI)(表5)。在功效检测过程中，体重减少用作长期给药后化合物(1)的总 体耐受性的替代。按照10mg/kg的口服每日给药时间表，产生暴露的功效(AUC24/天)约
34为IlOOh. ng/ml，并且不导致体重减少或不表现出临床毒性迹象。在连续每日给药后第1天 和第21天之间没有观察到暴露的减少。在本研究结束时收集的肿瘤的组织学分析揭示大 面积的坏死，胞外基质的增加。在按照每日时间表低于MTD给药21天的裸鼠中，在4种预测是敏感的(基于内源 性Notch信号传导的水平)建立的肿瘤模型中的3种，化合物(1)是口服活性的(表5)。在 预测是不敏感的1种模型中的1种中是无活性的。有效的响应可能与肿瘤N0tchl/N0tch3 表达比例相关。据报道Notch3通过与Notchl ICN竞争核转录因子作用为Notchl的负调 控子。初级数据表明Notch3蛋白在不响应异种移植物细胞系中升高的表达和在敏感细胞 系中减少的表达。化合物(1)在4种预测是敏感的异种移植物模型中的3种中是口服活性的，在1 种预测是不敏感的模型中的1种中是无活性的
H460a NSCLC0000NSCLC =非小细胞肺癌.功效=% TGI彡60且ρ彡0. 05，与赋形剂对照组比较。*当21-天的治疗结束时的最大TGI。t在21天治疗结束后一周(21+/7-)的最大TGI。#在第二轮7天的治疗后(7+/14-/7+)的最大TGI。1在第二轮7天的治疗后5天(7+/14-/7+/5-)的最大TGI。在A549模型中的另外剂量和时间表的研究在21天治疗周期中的7天或14天每 天两次治疗后产生79-91%的统计学上显著的肿瘤生长抑制，没有体重减少。对7天的治 疗组再监测43天。在整个观察期间肿瘤生长保持稳定。在第66天重新开始7天给药，至 第90天产生肿瘤生长抑制。与使用其它癌症治疗观察到的功效模式相比较，在使用化合物 (1)的小鼠中观察到的功效模式是独特的，其中最大功效在治疗停止后有时延长一周或两 周，并且在治疗后还观察到延长的功效。这种类型的响应与Notch抑制相一致。连续的每 日和间断的时间表都是有效的，没有体重减少。化合物(1)适于循环给药。这一数据支持 关于1期提议的间断给药的观念。这样的时间表可以帮助减小在人类中由每日给药预测的 潜在的毒性和CYP3A4影响。按照10mg/kg的口服每日给药时间表，暴露(AUC24h)产生的功效约为1100ng*hr/ mL，并且不导致体重减少，或不表现出临床毒性迹象。在连续每日给药后第1天和第21天
35之间没有观察到暴露的减少，在重复给药后缺乏新陈代谢诱导。在大鼠和狗的研究中，也观 察到在长期给药后暴露缺少改变。体内机制研究γ -分泌酶抑制剂治疗的A549异种移植物肿瘤的微阵列分析揭示RNA表达的改 变，这与胞外基质改变相一致。制备化合物(1)治疗的肿瘤用于蛋白质印迹分析。V型胶原 蛋白表达显著减少，而MFAP5蛋白表达升高。Notch-I蛋白水平和ICN的表达在除最高剂量 组外的所有动物组中减少。V型胶原蛋白和MFAP5是补充胞外基质的结构蛋白。在更加分 化的组织中，V型胶原蛋白表达通常减少，MFAP5表达通常增加。这一数据与A549肿瘤细胞 中的Notch-I抑制导致更加分化的表型的发挥作用假说相一致。实施例7在人胰腺癌异种移植物中的抗肿瘤活性动物雌性(无胸腺nu/nu)裸鼠获自理斯河实验室(Charles River Laboratories) (Wilmington，MA)，而雌性 SCID-beige 小鼠购自 Taconic (Germantown，NY)。使用约为 8-12 周龄(裸鼠)或8-10周龄(SCID-beige)且重约23_25克的小鼠。通过对实验动物的总体 观察和通过分析笼养在共用架台上的岗哨动物的血液样品而每天确定所有动物的健康状 况。在实验应用之前，允许所有动物适应并且由任何运输相关的压力恢复最少72小时。随 意提供高压灭菌的水和照射过的食物[5058-ms Pico chow (小鼠)Purina，Richmond，IN]， 并且保持动物为12小时光照和黑暗的周期。在使用之前将笼、草垫和水瓶高压灭菌，并且 每周更换。肿瘤MiaPaca2, AsPCl 和 BxPC3 人胰腺癌细胞购自 ATCC(Manassas，VA)。BxPC3 和 AsPCl细胞生长在RPMI培养基中，并且MiaPaCa2细胞生长在Dulbecco改良的基本培养基 (Dulbecco' s Modified Essential Medium) (DMEM)中。所有的培养基补充有 10% (ν/ν) FBS和(ν/ν) 200nM L-谷氨酰胺。在1/22/07和3/14/07分别对裸鼠的每只小鼠在右 后腰窝处皮下植入在体积为0. 2ml的PBS中的6xl06 MiaPaca2细胞或5xl06 AsPCl细胞。 于5/22/07对SCID-biege小鼠的每只小鼠在右后腰窝处皮下植入体积为0.2ml的在1 1 matrigel PBS 混合物中的 5xl06 BxPC3 细胞。检测药剂将化合物(1)用0. 2%吐温-80配制为在水中的1. 0% Klucel中的混悬液用于口 服(Po)施用。配制的化合物和赋形剂保存在4°C并且每周制备[表1]。在施用前剧烈混合 该混悬液。用无菌盐水重建吉西他滨(Gemzar ,Eli Lilly and Company, Indianapolis, IN, USA)以产生38mg/ml的储液，用于整个3-4周的研究。在给药当天用无菌盐水进一步 稀释吉西他滨，以产生用于体内施用所需要的浓度。随机化将植入MiaPaCa2或AsPCl异种移植物的裸鼠分别在细胞植入后第17天和第9天 随机化。将携带BxPC3异种移植物的SCID-beige小鼠在植入后8天随机化。所有小鼠按 照肿瘤体积随机化，从而所有组具有约100-150mm3的相似的起始平均肿瘤体积。治疗起始
对于MiaPaCa2研究的治疗于2/8/07 (肿瘤植入后第17天)开始，对于AsPCl于 3/23/07 (肿瘤植入后第9天)开始，并且对于BxPC3研究于5/30/07 (肿瘤植入后第8天) 开始。使用无菌Icc注射器和18 口径的管饲针头(0. 2ml/动物)每天一次(qd)给药口服 赋形剂或化合物(1)混悬液21-28天，或使用间断的时间表(7天给药，14天不给药，7天 给药(7+/7-/7+)，7天给药，7天不给药(7+/7_)，3天给药，4天不给药(3+/4_)，或14天给 药，14天不给药(14+/14-))给药。使用Icc注射器和26 口径的针头将吉西他滨q3d(每3 天)腹膜内(ip)施用给小鼠。对于MiaPaCa2和AsPCl研究，qd化合物(1)混悬液或q3d吉西他滨治疗在肿瘤 细胞植入后第37天结束，而对于BxPC3研究，qd化合物(1)混悬液或q3d吉西他滨治疗在 肿瘤细胞植入后第35天结束。对于在MiaPaCa2研究中使用7+/7_/7+时间表间断给药化合物(1)混悬液，治疗 在第23天结束，在第31天重新开始，并且在第37天结束。在组合组(见表2A，组9和10) 中，使用7+/7-/7+时间表，顺序地给予化合物(1)混悬液与吉西他滨，从而化合物(1)仅在 第一周和第三周每日给药，而吉西他滨仅在第二周q3d给药。对于在AsPCl研究中使用7+/7_时间表x2周期间断给药化合物(1)混悬液，治疗 在第15天结束，在第23天重新开始，并且最后在第29天结束。对于使用3+/4_时间表χ 4周期间断给药，治疗在第11天结束，在第16天重新开始，在第18天结束，在第23天重新 开始，在第25天结束，在第30天重新开始，并且最后在第32天结束。在第一组合组(见表 2Β，组7)，同时给予每日化合物(1)与q3d吉西他滨总共4周。对于其余的组合组，化合物 (1)和吉西他滨顺序地给予而不是同时给予。在组8中(见表2B)，吉西他滨在第1周和第 3周q3d给药，而化合物(1)仅在第2周和第4周每日给予。在组9中，化合物给药的顺序 相反，化合物(1)混悬液在第1周和第3周每日给予，而吉西他滨在第2周和第4周q3d给 予。在组10中(见表2B)，吉西他滨在第1周和第2周q3d给予，而化合物(1)今在第3周 和第4周每日给予。在组11中，化合物给药的顺序相反，化合物(1)在第1周和第2周每 日给予，而吉西他滨在第3周和第4周q3d给予。当终止治疗时，在所有三种研究中，在另外的随访期间用卡钳测量荷瘤小鼠，以评 估肿瘤的再生长。对于MiaPaCa2研究，随访期间持续至第63天(治疗后26天)，对于AsPCl 至第48天(治疗后11天)，并且对于BxPC3至第50天(治疗后15天)。计算和统计学分析体重减少使用下式以平均组体重变化百分数绘图表示=((W-Wci)ZX)XIOO,其中 ‘W’表示在具体某一天治疗组的平均体重，%’表示同一治疗组在治疗开始时的平均体重。 最大体重减少也使用上式表示，并且表示在关于具体某一组的整个实验过程中的任意时间 观察到的最大体重减少百分数。在给定组中，定义毒性为> 20%的小鼠表现出> 20%的体 重减少和/或死亡率。功效数据以平均肿瘤体积+平均值的标准误差(SEM)绘图表示。治疗组的肿瘤体 积利用下式表示为对照组的肿瘤体积的百分数(％T/c) =IOOx(CT-Ttl)/(C-Ctl)),其中T表 示治疗组在实验过程中具体某一天的平均肿瘤体积，T0表示同一治疗组在治疗的第一天的 平均肿瘤体积；C表示对照组在实验过程中具体某一天的平均肿瘤体积，Ctl表示同一治疗 组在治疗的第一天的平均肿瘤体积。使用椭圆体式计算肿瘤体积(单位为立方毫米)(Dx(d2))/2，其中‘D’表示肿瘤的大直径，‘d’表示小直径。在一些情形中，使用下式计算肿 瘤消退和/或肿瘤体积的百分数改变=((T-Ttl)ZTtl)xIOO,其中‘T’表示治疗组在具体某一 天的平均肿瘤体积，‘IV表示同一治疗组在开始治疗时的平均肿瘤体积。通过秩和检验和 单向 Anova 禾口 post-hoc Bonferroni t_ 检验(SigmaStat,版本 2. O, Jandel Scientific, San Francisco, CA)确定统计学分析。当概率值(ρ) ( 0. 05时，认为组间差异是显著的。对于存活评估，结果以存活百分数针对肿瘤植入后的天数绘图(Stat View, SAS Institute, Cary NC)。以100 χ [(治疗组的中值存活天数-对照组的中值存活天数)/对照 组的中值存活天数]计算％ ILS。中值存活使用Kaplan Meier存活分析确定。利用对数排列 检验(log-rank test)比较治疗组的存活与赋形剂组，并且通过Breslow-Gehan-Wilcoxon 检验(Stat View, SAS, Cary, NC)分析组间存活比较。当概率值(P) ( 0. 05时，认为组间 差异是显著的。结果毒件在所有三种研究(MiaPaCa2，AsPCl，和BxPC3)中，所有剂量和时间表的、单独或组 合给予的化合物(1)或吉西他滨得到很好地耐受，其定义为< 20%的动物表现出> 20% 的体重减少、死亡率或死亡。在MiaPaca2研究中，在60mg/kg q3d吉西他滨和30mg/kg 7+/7-/7+化合物(1)组的每一组中各有一只小鼠由于错误给药而死亡。在AsPCl研究中， 在90mg/kg吉西他滨单一药剂组中有一只小鼠在第22天由于> 20%的体重减少而被处死， 由于在一周过程中进展性的体重减少，其被认为是毒性相关的。在BxPC3研究中，10mg/kg qd组中有一只小鼠在研究的最后一天表现出> 20%的体重减少(bwl)，由于该小鼠在研究 的最后几周过程中表现出进展性的体重减少，其也被认为是毒性相关的.当向携带MiaPaCa2人胰腺癌异种移植物的小鼠施用化合物(1)时，不管剂量 或时间表，单独的还是与吉西他滨组合，不能获得生物学显著的肿瘤生长抑制(TGI)(由 NCI ^60% TGI定义)[11]。当与赋形剂治疗的对照相比较时，向携带MiaPaCa2异种移植 物的裸鼠21天连续施用(qd)化合物(1)导致统计学显著的、而非生物学显著的肿瘤生长 抑制(TGI)。在qd组之间，观察到剂量响应，其中与赋形剂治疗相比较，lmg/kg导致39% 的 TGI (ρ = 0. 002)，3mg/kg 产生 42 % 的 TGI (ρ = 0. 002)，并且 10mg/kg 抑制肿瘤生长 53 % (pSO.OOl)。在按照7+/7-/7+天的时间表(第1周和第3周每日给药)间断施用化合物 (1)的组中，所有三种剂量表现出相似的非生物学显著的生长抑制，这表明使用该时间表缺 少剂量响应。最高剂量60mg/kg抑制肿瘤生长48% (ρ彡0.001)，而化合物(1)的10mg/kg 和30mg/kg剂量分别导致51% TGI (ρ ( 0. 001)和58% TGI (ρ ( 0.001)。当吉西他滨以 60mg/kgq3d施用时，与赋形剂治疗的对照相比较，观察到62% TGI (ρ彡0. 001)。在组合组 中，抗肿瘤活性既不是生物学显著性的，也不统计学不同于各自化合物(1)的单一治疗组， 在吉西他滨加化合物(l)10mg/kg或30mg/kg7+/7-/7+组中，具有57%或54%的TGI。在 停止治疗后，在26天的随访期间(至第63天)监测肿瘤生长。在第63天，关于所有组的 TGI值低于第37天的，这表明MiaPaCa2肿瘤在治疗后继续生长。与MiaPaCa2研究相似，当向携带AsPCl人胰腺癌异种移植物的小鼠施用作为单 一治疗的化合物(1)时，不管剂量或时间表，不能获得生物学显著的肿瘤生长抑制。在另一方面，当与吉西他滨组合给予化合物(1)时，在同时给予两种药物时，或在首先给予吉西 他滨两周的顺序给予时，获得生物学显著的肿瘤生长抑制。当与赋形剂治疗的对照相比较 时，向携带AsPCl异种移植物的裸鼠连续28天施用(qd)化合物(1)导致统计学显著的、 而非生物学显著的肿瘤生长抑制(TGI)。与赋形剂治疗的小鼠相比较，以3mg/kg和IOmg/ kg qd 的剂量，分别观察到 49% (ρ = 0. 004)和 58% 的 TGI (ρ = 0. 004)。当间断(3+/4_χ4 周期或7+/7-Χ2周期)给药化合物(1) (10mg/kg)时，与连续每日给药相比较，抗肿瘤活性 降低(TGI分别为32%和41%)。在AsPCl胰腺模型中，与赋形剂对照相比较，以90mg/kg q3d给药的吉西他滨表现出非常少的抗肿瘤活性，TGI仅为39% (ρ = 0. 016)。相反，当 化合物(1)与吉西他滨组合同时施用时，观察到对抗肿瘤活性的增强的作用，具有77%的 TGI (ρ ( 0. 001)。这一结果与吉西他滨单一治疗组相比是生物学显著性和统计学显著性的 (P = 0.005)，但与化合物(1)单一治疗组相比不是(ρ = 0.251)。在每周顺序组合组中， 尽管在化合物(1)之前施用吉西他滨对AsPCl肿瘤生长的抑制优于相反顺序，(58% TGI, P^O. 001相对于37%，ρ = 0. 012)，但是结果都不是生物学显著的。在两周顺序组合组中， 在化合物(1)之前施用吉西他滨对AsPCl肿瘤生长的抑制同样优于相反顺序，然而，在这一 情形中，抗肿瘤活性是生物学显著的，70% TGI (ρ ^ 0. 001)相对于55% TGI (p ^ 0. 001)。 在停止治疗后监测AsPCl肿瘤生长持续11天(至第48天)。在第48天，所有组的TGI值 低于第37天的，这表明AsPCl肿瘤在治疗后继续生长。与在MiaPaCa2和AsPCl胰腺异种移植物模型中缺少由化合物(1)单一治疗引 发的强肿瘤生长抑制相反，BxPC3胰腺异种移植物模型对化合物(1)介导的生长抑制敏 感。与赋形剂对照相比较，施用3mg/kg和10mg/kg的化合物(1)以剂量依赖性方式显著 抑制BxPC3肿瘤生长(生物学和统计学上)，分别具有72% (ρ <0.001)和82%的TGI (ρ <0. 001)。相似地，大部分间断给药组也产生统计学和生物学显著的肿瘤生长抑制，尽管观 察到缺少剂量响应。当化合物(1)使用7+/7_时间表给药时，与赋形剂治疗的对照小鼠相 比较，10mg/kg 和 20mg/kg 的剂量分别产生 74% (ρ ( 0. 001)和 63% 的 TGI (ρ = 0. 002)。 化合物(1)还使用3+/4_时间表给药，其中10mg/kg，23mg/kg，和30mg/kg的剂量分别抑制 肿瘤生长56% (ρ = 0. 002), 64% (ρ < 0. 001)，和50% (ρ = 0. 024)。在治疗停止后监测 BxPC3肿瘤生长持续15天(至第50天)。在第50天，每日给药组的TGI值与第35天的相 似，这表明化合物(1)在BxPC3胰腺模型中引发持续的肿瘤生长抑制。Notch信号传导途径已经参与胰腺癌的发病机理。在本研究中，对携带sc建立的 MiaPaca2，AsPCl或BxPC3胰腺肿瘤的小鼠每日口服施用单独的或与吉西他滨组合的、分 泌酶抑制剂(化合物1)至多4周。在所述三种胰腺肿瘤模型中的一种中，作为单一治疗的 化合物(1)引发生物学显著的抗肿瘤活性(由NCI > 60% TGI定义)。BxPC3模型对化合物 (1)介导的生长抑制敏感，不管化合物是每日施用的还是使用7+/7_或3+/4_时间表间断 施用的。当化合物(1)每日给药时，肿瘤生长抑制的程度取决于剂量，而当以间断时间表给 药时，抗肿瘤活性似乎不依赖于剂量。当比较按照不同给药时间表每月给予的药物总量时， 每日给药产生较好的功效。例如，当总的月剂量280mg/kg分成qd给予10mg/kg、7+/7_给 予10mg/kg、或3+/4_给予23mg/kg的时间表时，每日给药的抗肿瘤活性是较好的(分别为 82%相对于63%或64%的TGI)。在停止治疗后监测BxPC3肿瘤生长持续15天，在这一时 间过程中，每日给药组的TGI值保持稳定，这表明化合物(1)在BxPC3胰腺模型中引发持续的肿瘤生长抑制。尽管化合物(1)作为单一治疗在MiaPaCa2或AsPCl胰腺肿瘤模型中不产生生物 学显著的功效，但是当在AsPCl模型中组合给予时，其的确增强吉西他滨的抗肿瘤活性。 10mg/kg qd化合物(1)加同时q3d给予的90mg/kg吉西他滨的组合产生77%的TGI，而化 合物(1)或吉西他滨单一治疗分别产生58%或39%的TGI。当化合物(1)和吉西他滨组合 顺序给予而不是同时给予时，仅在化合物(1)之前给予吉西他滨的两周顺序组合产生生物 学显著的肿瘤生长抑制，观察到70%的TGI。另一方面，当这两种药物以相反顺序给予时， 仅观察到55%的TGI。尽管BxPC3，MiaPaca2，和AsPCl胰腺肿瘤模型在其Notch受体、配体、和下游靶 标的表达中是不同的，没有明显的区别可能易于与其对Y分泌酶抑制剂的敏感性相关。 例如，所有三种细胞系表达低水平的Notch-1，BxPC3和AsPCl表达低水平的Notch_2，而 MiaPaca2表达非常高水平的Notch_2，并且还是表达Notch 3和4的唯一的细胞系[12]。 所有三种细胞系表达配体Jagged-Ι，其中AsPCl细胞表达最高水平，其次是BxPC3，并且 MiaPaca2表达最低水平。配体Jagged_2和δ-1在BxPC3和MiaPaca2细胞中表达，但不在 AsPCl细胞中表达[12]。尽管在参考文献中存在一些数据表明激活K-Ras中的突变可以与 转化细胞中的Notch协作，但是在本研究中，对g分泌酶介导的生长抑制敏感的唯一的肿瘤 模型关于K-Ras是野生型的(BxPC3)。在本体内研究中，表明化合物(1)在一些胰腺肿瘤模型中作为单一治疗或与吉西 他滨组合可以有效地抑制肿瘤生长，然而，对模型之间不同敏感性的机制的理解还很少。尽管已经描述了多个本发明的实施方案，明显的是，可以在不背离本发明的精神 和范围的条件下改变基本结构，从而提供利用本发明的其它实施方案。所有这样的修改和 改变意欲被包含在本发明的范围内，本发明的范围是在后附的权利要求中限定的，而不是 在通过举例方式描述的具体实施方案中限定的。
权利要求
化合物(1)或其药用盐用于制备治疗癌症特别是实体瘤的药物的应用。FPA00001178459900011.tif
2.根据权利要求1所述的应用，其中所述治疗包括施用约400ng-hr/ml-约 9000ng-hr/ml的治疗有效量的化合物(1)。
3.根据权利要求2所述的应用，其中所述化合物(1)的治疗有效量为约llOOng-hr/ ml-约 4100ng-hr/mlo
4.根据权利要求3所述的应用，其中所述化合物(1)的治疗有效量为约1380ng-hr/ ml-约 2330ng-hr/mlo
5.根据权利要求2所述的应用，其中所述化合物(1)的治疗有效量为约400ng-hr/ ml-约9000ng-hr/ml，其在至多约21天的时期内施用。
6.根据权利要求3所述的应用，其中所述化合物(1)的治疗有效量为约llOOng-hr/ ml-约4100ng-hr/ml，其在至多约21天的时期内施用。
7.根据权利要求4所述的应用，其中所述化合物(1)的治疗有效量为约1380ng-hr/ ml-约2330ng-hr/ml，其在至多约21天的时期内施用。
8.根据权利要求1所述的应用，其中化合物(1)在21天周期中的第1，2，3，8，9和10 天每天施用一次。
9.根据权利要求8所述的应用，其中化合物(1)在21天周期中的第1，2，3，8，9和10 天以约400ng-hr/ml-约9000ng_hr/ml的量每天施用一次。
10.根据权利要求1所述的应用，其中化合物(1)在21天周期中的第1-7天每天施用一次。
11.根据权利要求10所述的应用，其中化合物(1)在21天周期的第1-7天以约 400ng-hr/ml-约 9000ng_hr/ml 的量每天施用一次。
12.根据权利要求1所述的应用，其中化合物(1)以药物口服单位剂型存在。
13.根据权利要求1所述的应用，其包括另外对患者进行放射治疗。
14.式(1)的化合物 或其药用盐用于制备治疗癌症特别是实体瘤的药物的应用，其中所述治疗包括在21 天周期中的第1，2，3，8，9和10天以约400ng-hr/ml-约9000ng_hr/ml的量每天施用化合 物⑴一次。
15.式(1)的化合物 或其药用盐用于制备治疗癌症特别是实体瘤的药物的应用，其中所述治疗包括在21 天周期中的第1-7天以约400ng-hr/ml-约9000ng-hr/ml的量每天施用化合物(1) 一次。
16.用于制备目的是用于治疗癌症特别是实体瘤的药物的方法，所述方法特征在于，以
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述化合物(1)的治疗有效量为约400ng-hr/ ml-约 9000ng-hr/ml。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述化合物(1)的治疗有效量为约llOOng-hr/ ml-约 4100ng-hr/mlo
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述化合物(1)的治疗有效量为约1380ng-hr/ml-约 2330ng-hr/mlo
20.根据权利要求17所述的方法，其中所述化合物(1)的治疗有效量为约400ng-hr/ ml-约9000ng-hr/ml，其在至多约21天的时期内施用。
21.根据权利要求18所述的方法，其中所述化合物(1)的治疗有效量为约llOOng-hr/ ml-约4100ng-hr/ml，其在至多约21天的时期内施用。
22.根据权利要求19所述的方法，其中所述化合物(1)的治疗有效量为约1380ng-hr/ ml-约2330ng-hr/ml，其在至多约21天的时期内施用。
23.根据权利要求16所述的方法，其中化合物(1)在21天的周期中的第1，2，3，8，9和 10天每天施用一次。
24.根据权利要求23所述的方法，其中化合物(1)在21天周期中的第1，2，3，8，9和 10天以约400ng-hr/ml-约9000ng_hr/ml的量每天施用一次。
25.根据权利要求16所述的方法，其中化合物(1)在21天周期中的第1-7天每天施用一次。
26.根据权利要求25所述的方法，其中化合物(1)在21天周期中的第1-7天以约 400ng-hr/ml-约 9000ng_hr/ml 的量每天施用一次。
27.根据权利要求16所述的方法，其中化合物(1)以药物口服单位剂型存在。
28.根据权利要求16所述的方法，其包括另外使患者进行放射治疗。
29.用于制备目的用于治疗癌症特别是实体瘤的药物的方法，其特征在于，式(1)的化合物 或其药用盐，在21天周期中的第1，2，3，8，9和10天以约400ng-hr/ml-约9000ng-hr/ ml的量每天使用一次。
30.用于制备目的用于治疗癌症特别是实体瘤的药物的方法，其特征在于，式(1)的化合物 或其药用盐，在21天周期中的第1-7天以约400ng-hr/ml-约9000ng-hr/ml的量每天使用一次。
31. 一种试剂盒，其包括一种以上口服单位剂型，每一单位包含约3mg-约300mg化合物 (1)，或其药用盐，所述化合物(1)具有下式
32.权利要求31的试剂盒，其中所述口服单位剂型包含足够数量的单位，使得足以可 以在约21天的时期内每天给患者施用约300mg的化合物(1)、或其药用盐。
33.根据权利要求1-30中任一项所述的方法和应用，其中所述化合物(1)与治疗有效 量的吉西他滨组合使用。
34.根据权利要求33所述的方法和应用，其用于治疗胰腺癌。
35.基本如前文所述的新型方法和应用。
全文摘要
本发明提供一种治疗癌症患者的方法，所述方法包括给所述患者施用治疗有效量的化合物(1)，或其药用盐，该化合物(1)具有下式本发明还提供包含上述化合物的试剂盒，以及化合物(1)用于制备治疗癌症的药物的应用，所述药物按照本文具体公开的剂量和时间表治疗癌症。
文档编号A61K31/55GK101909633SQ200980101733
公开日2010年12月8日 申请日期2009年1月5日 优先权日2008年1月11日
发明者凯瑟琳·E·帕克曼, 约翰·弗雷德里克·博伊兰, 莱奥波尔多·拉多里斯·卢斯特罗三世 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司
Y“分泌酶抑制剂用于治疗癌症的应用尽管最近成功使用了为患者提供生存益处的药物，癌症仍然是世界上死亡率和发 病率的主要原因。对于大部分实体瘤，仍然存在与极差的预后相关的高肿瘤复发率和转移 率。目前可用的药物包括细胞毒性化学治疗剂、抗血管生成剂、和靶向药剂。由于发展了耐 药性或可能影响大部分器官的不可耐受的毒性(例如，血液学毒性、肝脏毒性、肾脏毒性、 和神经毒性)，使用大部分目前可用的抗癌药获得的临床益处是有限的。癌症是一种以不可控的增殖为特征的疾病。在对驱动癌症的信号的理解中取得了 进步。在发育和组织重建过程中，多能干细胞作用为分化细胞的来源，以产生非专门增殖的 细胞类型。这些干细胞的特征和肿瘤的快速不可控的增殖之间的联系逐渐变得清楚。一种 主要的发育信号传导轴是Notch途径。Notch信号传导通过在成体多能干细胞的发育和自 我更新过程中介导祖细胞的分化而调控细胞命运。Notch起作用保持祖细胞处于多能快速 增殖状态。Notch途径在造血作用和淋巴细胞增殖的发育分化和进行中起重要作用。在胚 胎发育过程中，其参与造血干细胞的生成、增殖和分化。Notch基因扩增、染色体易位或突变导致升高的Notch信号传导，由此通过将肿瘤 细胞保持在干细胞样增殖状态而给予肿瘤生长的优势。因此，在Notch信号传导途径的突 变和恶性病发病机理之间存在非常强的相关性。由哺乳动物中的4种同系物(Notchl，Notch2，Notch3，和Notch4)所代表的Notch 蛋白与配体δ样1，δ样3，δ样4，Jagged UPJagged 2相互作用。在配体结合后， Notch受体通过系列的蛋白水解分裂事件而被激活，所述蛋白水解分裂事件包括由Y _分 泌酶(Y -secretase)调控的膜内分裂。这样的Y -分泌酶加工的Notch变成有活性的，其 作为一种称为细胞内亚基(ICN)的形式。ICN易位至核，并且形成包括直接改变关键的增 殖_和分化_特异性基因的表达的CSL (CBF-1，秃头的抑制子，Lag)转录调控子的大转录复 合物的一部分。另外，Y _分泌酶参与几种其他蛋白的膜内蛋白水解加工，所述其他蛋白包括淀粉 样前体蛋白[APP]，CD44干细胞标记，和HER4 [ErbB4])。通过、-分泌酶抑制阻断Notch信 号传导在体内在人类癌症细胞中产生较缓慢的生长、较少转化的表型。重要的是，该表型在 不存在进一步给药的条件下保持是稳定的。这种类型的新型治疗途径具有使癌症成为更易 处理的疾病的潜力，而没有传统细胞毒性药物的强副作用。在WO 2005/023772 中公开 2，2- 二 甲基-N_((S)_6-氧代-6，7- 二 氢-5H-二苯并[b，d]氮杂-7-基)-N' _(2，2，3，3，3_五氟-丙基)-丙二酰胺(2，
2-Dimethyl-N-((S)-6-oxo-6,7-dihydro-5H-dibenzo[b,d]azepin-7-yl)-N'-(2,2,3,3,
3-pentafluoro-propyl)-malonamide)(1)有效用于治疗阿尔茨海默病。 因此，需要开发新的药物/化学治疗方案，从而进一步改善可用于癌症患者的治疗。发明概述本发明提供治疗癌症患者的方法，所述方法包括给所述患者施用治疗有效量的化 合物(1)，或其药用盐，该化合物(1)具有下式 本发明还提供治疗癌症患者的方法，所述方法包括给所述患者施用治疗有效量的 化合物(1)，或其药用盐，该化合物(1)具有下式 其中化合物(1)在21天周期的第1，2，3，8，9和10天以约400ng-hr/ml-约 9000ng-hr/ml的量每天施用一次。本发明还提供治疗癌症患者的方法，所述方法包括给所述患者施用治疗有效量的化合物(1)，或其药用盐，该化合物(1)具有下式
其中化合物(1)在21天周期的第1-7天以约400ng-hr/ml-约9000ng_hr/ml的
量每天施用一次。本发明还提供包括一种以上口服单位剂型的试剂盒，每个单位包含约3mg_约 300mg化合物(1)，或其药用盐，该化合物(1)具有下式 本发明还进一步提供上述式(1)的化合物、或其药用盐用于制备治疗癌症特别是 实体瘤的药物的应用，所述实体瘤诸如例如非小细胞肺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、结肠癌、乳 腺癌或前列腺癌。本发明还进一步提供上述式(1)的化合物、或其药用盐用于制备治疗癌症特别是 实体瘤的药物的应用，所述实体瘤诸如例如非小细胞肺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、结肠癌、乳 腺癌或前列腺癌，所述应用包括按照本文所述的具体方法、剂量方案和/或治疗周期中的 任一种施用式(1)的化合物、或其药用盐。本发明另外提供用于制备目的是治疗癌症特别是实体瘤的药物的方法，所述实体 瘤诸如例如非小细胞肺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、结肠癌、乳腺癌或前列腺癌，所述方法的特 征在于使用式(1)的化合物、或其药用盐。本发明另外提供用于制备目的是治疗癌症特别是实体瘤的药物的方法，所述实体 瘤诸如例如非小细胞肺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、结肠癌、乳腺癌或前列腺癌，所述方法的特 征在于，按照本文所示的具体方法、剂量方案和/或治疗周期中的任一种使用式(1)的化合 物、或其药用盐。本发明最后提供本文所示的具体方法和应用，其中化合物(1)与治疗有效量的吉西他滨(gemcitabine)组合使用，优选地用于治疗胰腺癌。发明详述本发明提供治疗癌症患者的新型方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量 的化合物(1)、或其药用盐。化合物(1)是Y-分泌酶的有效且选择性的抑制剂，其在肿瘤 细胞中产生对Notch信号传导的抑制活性。当用于本文时，下述术语具有下文描述的意思。术语“抗肿瘤”意指抑制或防止恶性细胞的发育、成熟或增殖。术语“曲线下面积”(AUC)是在血浆中的药物浓度针对时间绘制的图中曲线下的面 积。AUC表示被机体吸收的药物总量，与吸收速率无关。这有效用于药物的治疗性监测。患 者血浆中药物浓度的测量和AUC的计算有效用于指导该药物的剂量。AUC对于获知在一定 时间间隔的平均浓度AUC/t是有用的。AUC通常表示为(质量*时间/体积)，例如，ng-hr/ ml ο术语“药用的”，诸如药用载体、赋形剂等，意指对于施用特定化合物的受试者是药 学可接受的且基本上无毒。术语“药用盐”指常规的酸加成盐或碱加成盐，其保留本发明化 合物的生物学效用和特性，并且由适当的无毒有机酸或无机酸或有机碱或无机碱形成。样 品酸加成盐包括来源于无机酸的那些和来源于有机酸的那些，所述无机酸诸如盐酸、氢溴 酸、氢碘酸、硫酸、磺酸、磷酸和硝酸，所述有机酸诸如对-甲苯磺酸、水杨酸、甲磺酸、草酸、 琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸等。样品碱加成盐包括来源于铵、钾、钠、和季铵氢氧 化物诸如例如四甲基氢氧化铵的那些。术语化合物的“药用酯”意指具有羧基的常规酯化化 合物，所述酯保留该化合物的生物学效用和特性。将药物化合物(即，药物)化学修饰成盐 是制药化学家获得化合物提高的物理和化学稳定性、亲水性(hydroscopicity)和溶解性 的熟知的技术。参见，例如，H. Ansel 等,Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (药物剂型和药物递送系统)(第6版，1995)，第196和1456-1457页。术语“前体药物”指在表现出其药物作用之前进行转化的化合物。为了克服制药 学问题而对药物进行化学修饰还被称为“药物潜在化”。药物潜在化是对生物活性化合物 进行化学修饰，以形成新化合物，所述新化合物在体内酶攻击时将释放母体化合物。母体化 合物的化学改变是这样的，从而物理化学特性的改变将影响吸收、分布和酶代谢。药物潜在 化的定义还被延伸以包括母体化合物的非酶再生。再生作为水解、解离、和其它不需要酶介 导的反应结果而发生。所述术语，前体药物，潜在化的药物，和生物可逆衍生物可以互换使 用。经过推论，潜在化意指参与在体内产生生物活性母体分子的时间延迟元件(time lag element)或时间成分(time component)。术语前体药物是概括性的，因为其包括潜在化的 药物衍生物以及与受体组合、在施用后转化为实际物质的那些物质。术语前体药物是这样 的药剂的通用术语，所述药剂在表现出其药学活性之前进行生物转化。术语“治疗有效量”意指在施用给患者时有效产生需要的治疗效果的药物量，所述 治疗效果例如阻止癌肿瘤的生长、或导致其收缩。与化合物(1)组合施用的治疗有效量的 吉西他滨优选地意指如在下述实施例7中公开的具体剂量和时间表。术语“与……组合施用”当用于本文时意指同时或顺序地施用。化合物“吉西他滨”意指4-氨基-1-[3，3- 二氟-4-羟基_5_ (羟甲基)-四氢呋 喃-2-基]-IH-嘧啶-2-酮(4-Amino-l-[3，3-dif luor-4-hydroxy-5- (hydroxymethyl) _tetrahydrofuran-2-yl] -1 H-pyrimidin-2-on)，并且例如以 Gemzar 市售。术语“治疗指数”是选择临床试验用抗癌药剂的重要参数。治疗指数考虑抗癌药 剂的功效、药物代谢动力学、代谢和生物利用度。参见，例如，J. Natl. Cancer Inst.(国家 癌症研究杂志)81 (13) 988-94 (1989年7月5日)。术语“肿瘤控制”意指从最后测量其可测量的损伤的垂直直径没有增加25%以 上。参见,例如，World Health Organization (世界卫生组织)(〃 WHO" ) Handbook for Reporting Results of Cancer Treatment, Geneva(曰内瓦 艮告癌症治疗结果的手册) (1979)。术语“实体瘤”意指非小细胞肺癌(NSCLC)，结肠直肠癌，胰腺癌，结肠癌，乳腺癌， 前列腺癌等。当用在整个说明书和权利要求书中时，“化合物⑴，，的意思包括下式的具体化合 物及其药用盐 本发明提供用于治疗癌症患者的方法，其包括给所述患者施用治疗有效量的化合 物(1)，或其药用盐，所述化合物(1)具有下式 化合物(1)是Y-分泌酶的有效且选择性的抑制剂，Y-分泌酶是负责分裂和 激活Notch受体的关键酶。由于基因扩增、染色体易位、或突变导致的Notch信号传导 失调已经参与多种类型的癌症，包括白血病(Leukemia)，成神经管细胞瘤和成胶质细胞 瘤(medullo-and glioblastoma),乳腺癌(breadcarcinoma)，头颈癌(head and neck cancer)，和胰腺癌(pancreatic carcinoma)。临床前的证据已经表明通过抑制γ-分泌酶 的蛋白水解活性阻断Notch信号传导在小鼠异种移植模型中导致对肿瘤生长的阻止。化合物(1)的治疗有效量是在施用给患者时有效产生需要的治疗效果从而阻止癌肿瘤的生长、或导致其收缩的量。优选地，化合物(1)的治疗有效量为约400ng-hr/ml-约 9000ng-hr/ml,更优选地约 1100ng-hr/ml-约 4100ng_hr/ml，且最优选地约 1380ng_hr/ ml-约 2330ng-hr/mlo在一个实施方案中，化合物(1)的治疗有效量为约400ng-hr/ml-约9000ng-hr/ ml,更优选地约 1100ng-hr/ml-约 4100ng-hr/ml,且最优选地约 1380ng-hr/ml-约 2330ng-hr/ml，在至多约21天的时间阶段中施用。在另一个实施方案中，化合物(1)在21天周期中的第1，2，3，8，9和10天每天施 用一次。在一个优选的实施方案中，化合物(1)在21天周期中的第1，2，3，8，9和10天以 约400ng-hr/ml-约9000ng_hr/ml的量每天施用一次。在另一个实施方案中，化合物(1)在21天周期中的第1-7天每天施用一次。在 一个优选的实施方案中，化合物(1)在21天周期中的第1-7天以约400ng-hr/ml-约 9000ng-hr/ml的量每天施用一次。优选地，化合物(1)以药物口服单位剂型存在。本方法还包括另外对患者进行放 射治疗。在一个具体实施方案中，本发明提供用于治疗癌症患者的方法，其包括给所述患 者施用治疗有效量的化合物(1)，或其药用盐，所述化合物(1)具有下式 其中化合物(1)在21天周期中的第1，2，3，8，9和10天以约400ng-hr/ml-约 9000ng-hr/ml的量每天施用一次，只要癌症保持为得到控制就重复进行。在另一个具体实施方案中，本发明提供用于治疗癌症患者的方法，其包括给所述 患者施用治疗有效量的化合物(1)，或其药用盐，所述化合物(1)具有下式 其中化合物(1)在21天周期中的第1-7天以约400ng-hr/ml-约9000ng_hr/ml的量每天施用一次，只要癌症保持为得到控制就重复进行。在另一个具体实施方案中，本发明提供化合物(1) 或其药用盐用于制备治疗癌症特别是实体瘤的药物的应用。在另一个具体实施方案中，本发明提供上述化合物(1)的应用，其中所述治疗包 括施用约400ng-hr/ml-约9000ng-hr/ml治疗有效量的化合物(1)。在另一个具体实施方案中，本发明提供上述化合物(1)的应用，其中治疗有效量 的化合物(1)为约 1100ng-hr/ml-约 4100ng-hr/ml。在另一个具体实施方案中，本发明提供上述化合物(1)的应用，其中治疗有效量 的化合物(1)为约 1380ng-hr/ml-约 2330ng-hr/ml。在另一个具体实施方案中，本发明提供上述化合物(1)的应用，其中治疗有效量 的化合物(1)为约400ng-hr/ml-约9000ng-hr/ml，其在至多约21天的时期内施用。在另一个具体实施方案中，本发明提供上述化合物(1)的应用，其中治疗有效量 的化合物(1)为约llOOng-hr/ml-约4100ng-hr/ml，其在至多约21天的时期内施用。在另一个具体实施方案中，本发明提供上述化合物(1)的应用，其中治疗有效量 的化合物(1)为约1380ng-hr/ml-约2330ng-hr/ml，其在至多约21天的时期内施用。在另一个具体实施方案中，本发明提供上述化合物(1)的应用，其中化合物(1)在 21天周期中的第1，2，3，8，9和10天每天施用一次。在另一个具体实施方案中，本发明提供上述化合物⑴的应用，其中化合物⑴在 21天周期中的第1，2，3，8，9和10天以约400ng-hr/ml_约9000ng_hr/ml的量每天施用一次。在另一个具体实施方案中，本发明提供上述化合物(1)的应用，其中化合物(1)在 21天周期中的第1-7天每天施用一次。在另一个具体实施方案中，本发明提供上述化合物(1)的应用，其中化合物(1)在 21天周期中的第1-7天以约400ng-hr/ml-约9000ng-hr/ml的量每天施用一次。在另一个具体实施方案中，本发明提供上述化合物(1)的应用，其中化合物(1)以 药物口服单位剂型存在。在另一个具体实施方案中，本发明提供上述化合物(1)的应用，其包括另外使患 者进行放射治疗。在另一个具体实施方案中，本发明提供化合物(1)
或其药用盐用于制备治疗癌症特别是实体瘤的药物的应用，其中所述治疗包括在 21天周期中的第1，2，3，8，9和10天以约400ng-hr/ml_约9000ng_hr/ml的量每天施用化 合物⑴一次。在另一个具体实施方案中，本发明提供化合物(1) 或其药用盐用于制备治疗癌症特别是实体瘤的药物的应用，其中所述治疗包括在 21天周期中的第1-7天以约400ng-hr/ml-约9000ng-hr/ml的量每天施用化合物(1) 一次。在另一个具体实施方案中，本发明提供制备目的是用于治疗癌症特别是实体瘤的 药物的方法，所述方法特征在于，以治疗有效量使用式(1)的化合物 在另一个具体实施方案中，本发明提供上述方法，其中化合物(1)的治疗有效量 为约 400ng-hr/ml-约 9000ng-hr/ml。在另一个具体实施方案中，本发明提供上述方法，其中化合物(1)的治疗有效量为约 1100ng-hr/ml-约 4100ng_hr/ml。在另一个具体实施方案中，本发明提供上述方法，其中化合物(1)的治疗有效量 为约 1380ng-hr/ml-约 2330ng_hr/ml。在另一个具体实施方案中，本发明提供上述方法，其中化合物(1)的治疗有效量 为约400ng-hr/ml-约9000ng_hr/ml，其在至多约21天的时期内施用。在另一个具体实施方案中，本发明提供上述方法，其中化合物(1)的治疗有效量 为约1100ng-hr/ml-约4100ng_hr/ml，其在至多约21天的时期内施用。在另一个具体实施方案中，本发明提供上述方法，其中化合物(1)的治疗有效量 为约1380ng-hr/ml-约2330ng-hr/ml，其在至多约21天的时期内施用。在另一个具体实施方案中，本发明提供上述方法，其中化合物(1)在21天的周期 中的第1，2，3，8，9和10天每天施用一次。在另一个具体实施方案中，本发明提供上述方法，其中化合物(1)在21天周期中 的第1，2，3，8，9和10天以约400ng-hr/ml-约9000ng_hr/ml的量每天施用一次。在另一个具体实施方案中，本发明提供上述方法，其中化合物(1)在21天周期中 的第1-7天每天施用一次。在另一个具体实施方案中，本发明提供上述方法，其中化合物(1)在21天周期中 的第1-7天以约400ng-hr/ml-约9000ng_hr/ml的量每天施用一次。在另一个具体实施方案中，本发明提供上述方法，其中化合物(1)以药物口服单 位剂型存在。在另一个具体实施方案中，本发明提供上述方法，其包括另外使患者进行放射治疗。在另一个具体实施方案中，本发明提供制备目的用于治疗癌症特别是实体瘤的药 物的方法，其特征在于，式(1)的化合物 或其药用盐，在21天周期中的第1，2，3，8，9和10天以约400ng-hr/ml-约 9000ng-hr/ml的量每天使用一次。在另一个具体实施方案中，本发明提供制备目的用于治疗癌症特别是实体瘤的药 物的方法，其特征在于，式(1)的化合物 或其药用盐，在21天周期中的第1-7天以约400ng-hr/ml-约9000ng-hr/ml的量
每天使用一次。在另一个具体实施方案中，本发明提供上述方法和应用，其中化合物(1)与有效 量的吉西他滨组合施用。在这一实施方案中，化合物(1)和吉西他滨的组合优选地用于制备治疗胰腺癌的 药物。在另一个具体实施方案中，本发明提供一种试剂盒，其包括一种以上口服单位剂 型，每一单位包含约3mg-约300mg化合物(1)，或其药用盐，所述化合物(1)具有下式 在这一实施方案中，所述试剂盒可以包括包含足够数量的单位足以可以在约21 天的时期内每天给患者施用约300mg的化合物(1)、或其药用盐的口服单位剂型。在这一实施方案中，所述试剂盒还可以包括包含有效量的吉西他滨的单位剂型。医师可以根据患者的需要、以及患者对治疗的反应而改变每种组分的剂量水平至 低于或高于本文所述的剂量水平。剂量可以按照由医师根据患者需要确定的任意给药时间 表施用。例如，两种组分中每一种的剂量可以在数天的时期内以单次给药或分开给药施用、 或改变日常时间表施用。优选地，每21天、或只要由毒性恢复所允许就重复治疗时间表，条件是肿瘤得到 控制且患者耐受治疗方案或肿瘤消退。优选地，这些治疗周期重复总共至多约8个周期。本发明的方法可以按照下文所述的实施例进行准备。所述实施例以证明而不是限 制本发明的化合物和组合物的制备的目的进行描述。实施例实施例1在裸鼠中人肿瘤异种移植中每天口服施用一次化合物(1)的抗肿瘤活性的广度。在先前的抗肿瘤功效研究中，当给携带A549非小细胞肺癌(NSCLC)异种移植物的 小鼠口服施用化合物⑴时，与赋形剂处理的对照动物相比较，以3，10，或30mg/kg的剂量 每天给药一次或两次持续14(14+/7_)或21天导致显著且持续不变的肿瘤生长抑制，肿瘤 生长抑制(TGIs) %在66-83%范围内。使用14+/7-或21天的治疗时间表每天施用化合物 (1) 一次与每天两次治疗一样有效，没有剂量依赖性。此外，较短的给药持续时间(14+/7-) 与完整的21天给药一样有效地抑制A549肿瘤生长。为了研究化合物(1)的抗肿瘤活性的广度，在两个结肠直肠癌(Lovo和HCT116) 和两个非小细胞肺癌(NSCLC) (Calu-6和H460a)异种移植模型中进行4种另外的功效研 究。尽管可能驱动功效的参数是未知的，认为Notch下游靶标Hes-I和Hey-I的表达表示活 性Notch信号传导途径。此外，已经报道Ras癌基因的表达在Notch激活中起作用。基于 Notch配体、受体、和下游靶标的内部基因表达模式，预测L0V0，HCT116，和Calu_6肿瘤模型 对化合物(1)介导的生长抑制敏感，而预测H460a模型是不敏感的。例如，Lovo结肠直肠癌 细胞系具有与已经表明对化合物(1)介导的肿瘤生长抑制敏感的A549异种移植模型相似 的基因表达，具有Notch配体Jag 1和DNER，Notch受体1，2，和3，以及下游靶标Hes-I和 Hey-I的表达。NSCLC细胞系Calu_6和H460a具有相似的配体和受体基因模式，具有Notch 1和Notch 3的高表达。这两种细胞系还具有升高的Hes-I，Hey-I和NUMB的表达。此外， 所有这些细胞系均具有突变的K-ras。在目前的研究中，在至多三周内给携带确定的皮下(sc)L0V0，Calu-6, HCT116，或 H460a肿瘤的小鼠口服施用化合物(1)。化合物(1)以每天3mg/kg和10mg/kg(qd)给药21 天，或按照间断的时间表(7天给药，14天不给药，然后7天给药(7+/14-/7+))以30mg/kg 和60mg/kg给药。材料和方法_使用获自查理斯河实验室(CharlesRiver Laboratories) (Wilmington,ΜΑ)的雌 性裸鼠(10只/组)，此时它们约为13-14周龄，并且重约23-25克。通过对实验动物的总体 观察和通过分析笼养在共用架台上的sentinel动物的血液样品而每天确定所有动物的健 康。在实验应用之前，允许所有动物适应并且由任何运输相关的压力恢复最少72小时。随 意提供高压灭菌的水和照射过的食物[5058-ms Pico chow (小鼠)Purina，Richmond，IN]， 并且保持动物为12小时光照和黑暗的周期。在使用之前将笼、草垫和水瓶高压灭菌，并且 每周更换。IiSLovo 人结肠直肠，Calu-6 NSCLC，和 HCTl 16 结肠直肠细胞购自 ATCC (Manassas， VA)。H460a NSCLC细胞为德克萨斯州休斯顿MD安德森医学中心(MD Anderson Medical Center, Houston, TX) Jack Roth 博士的馈赠。Lovo 细胞在 F12K 培养基中培养，Calu-6 和 H460a 在 Dulbecco 改良的基本培养基(Dulbecco' s Modified Essential Medium) (DMEM) 中生长，并且HCT116细胞在McCoy’ s 5A培养基中生长。所有的培养基补充有10% (ν/ν)FBS 和 (ν/ν) 200nM L-谷氨酰胺。在 9/22/06，9/22/06，9/26/06 和 9/29/06 分别对小鼠 在右后腰窝处皮下(sc)植入处于0. 2ml PBS体积中的5xl06 Lovo,3xl06 Calu-6或HCT116， 或IxlO7 H460a细胞/小鼠。检测药剂按下述，将化合物(1)用0. 2%吐温-80配制为在水中的1. 0% Klucel中的混悬 液用于口服(Po)施用。药物配制 将配制的化合物和赋形剂保存在4°C，并且每周制备。在施用前强烈混合化合物 ⑴。随机化在植入后第19天，将植入Lovo和Calu-6异种移植物的小鼠随机化，并且在第20 天将植入HCT116异种移植物的小鼠随机化，，而植入H460a异种移植物的小鼠在植入后第 12天进行随机化。所有小鼠按照肿瘤体积随机化，从而所有组具有约IOO-ISOmm3的相似的 起始平均肿瘤体积。研究设计在该报道中用于所有4种体内研究的研究设计是相同的。剂量组在下述文列出。研究设计 *除了 H460a功效研究之外，接受两轮7天的治疗，所述H460a功效研究早已停止i^x对于Lovo和Calu-6肿瘤研究的治疗于10/11/06 (肿瘤细胞植入后第19天)开 始，对于HCTl 16的研究于10/16/06 (肿瘤细胞植入后第20天)开始，并且对于H460a研究于10/11/06 (肿瘤细胞植入后第12天)开始。使用无菌Icc注射器和18 口径的管饲针头 (0. 2ml/动物)每天一次(qd)给药赋形剂或化合物(1)混悬液共21天，或使用间断的时间 表(7天给药，14天不给药，然后7天给药(7+/14-/7+))给药。对于Lovo和Calu_6研究， 21天的给药在肿瘤细胞植入后第40天结束。对于间断给药，治疗在第26天结束，在第40 天重新开始，并且在第47天结束。对于HCT116研究，21天的给药在肿瘤细胞植入后第42 天结束。间断给药在第27天结束，在第42天重新开始，并且在第49天结束。对于H460a 研究，21天的给药早在肿瘤细胞植入后第27天结束，而对于间断给药，治疗在第19天结束， 并且没有重新开始(由于缺乏功效)。病理学/尸体剖检在研究结束时，对于Eff#l 137 (Lovo)，Eff#1147 (HCT116)，和 Eff#1148 (H460a) 进行尸体剖检。在处死之前2小时对动物注射在Iml无菌水中的Img BrdU(溴脱氧尿苷 (bromodeoxyuridine))来评估肿瘤细胞增殖。通过用CO2诱导然后断颈而处死动物。收集 来自赋形剂处理的组和所选化合物(1)处理的组的肿瘤，并且在锌-福尔马林中固定过夜， 处理，石蜡包埋，并且切片，用于组织病理学(苏木精和曙红(H&E)染色用于形态学评估，和 BrdU染色)，如下文所述。尸体剖检/病理学总结 厕每周测量肿瘤和小鼠体重两次。所有的动物分别进行整个实验。计算和统计学分析体重减少使用下式以平均组体重变化百分数绘图表示((W-W0) /W0) xlOO其中W表示在具体某一天治疗组的平均体重，Wtl表示同一治疗组在治疗开始时的 平均体重。最大体重减少也使用上式表示，并且表示在关于具体某一组的整个实验过程中 的任意时间观察到的最大体重减少百分数。功效数据以平均肿瘤体积士平均值的标准误差(SEM)绘图表示。治疗组的肿瘤 体积利用下式表示为对照组的肿瘤体积的百分数(％ T/C)
IOOx ((T-T0)/(C-C0))其中T表示治疗组在实验过程中具体某一天的平均肿瘤体积，T0表示同一治疗 组在治疗的第一天的平均肿瘤体积；C表示对照组在实验过程中具体某一天的平均肿瘤体 积，C0表示同一治疗组在治疗的第一天的平均肿瘤体积。使用椭圆体式计算肿瘤体积(单位为立方毫米)(Dx(d2))/2其中D表示肿瘤的大直径，d表示小直径。在一些情形中，使用下式计算肿瘤消退和/或肿瘤体积的百分数改变((T-T0) /T0) XlOO其中T表示治疗组在具体某一天的平均肿瘤体积，T0表示同一治疗组在开始治疗 时的平均肿瘤体积。通过秩禾口检验(rank sum test)禾口单向 Anova 禾口 post—hoc Bonferroni t_ 检验 (SigmaStat，版本 2. 0，Jandel Scientific, San Francisco，CA)确定统计学分析。当概率 值(ρ) ( 0. 05时，认为组间差异是显著的。MM先前发现在本研究设置中所检测的化合物(1)的剂量和方案在裸鼠中是很好耐 受的。如预测的，在本研究中没有观察到体重减少或其它临床毒性迹象。在本研究设置中，化合物(1)以每日3和10mg/kg 21天，或按照间断的时间表(7 天给药，14天不给药，然后7天给药(7+/14-/7+))以30和60mg/kg进行检测。当按照21天 或7+/14-/7+时间表用化合物(1)治疗携带Lovo结肠直肠异种移植物的裸鼠时，肿瘤生长 被显著抑制，在第47天，即在21-天治疗组最后一天后7天(21+/7-)，或在第二轮7天治疗 结束时(7+/14-/7+)，鉴定了最大的肿瘤生长抑制。与赋形剂治疗的对照相比较，3和IOmg/ kg qd χ 21天的化合物(1)剂量分别导致40% (ρ = 0. 136)和83% (ρ彡0. 001) TGI，而间 断给药 30 和 60mg/kg 剂量的化合物(1)产生 59% (ρ = 0. 021)和 85% (ρ = 0. 001)TGI。与化合物(1)在Lovo结肠直肠肿瘤模型中的抗肿瘤活性相比，在Calu-6 NSCLC 模型中，肿瘤生长抑制减弱。在第47天，即在21-天治疗组(21+/7-)最后一天后7天，或 在第二轮7天治疗结束时(7+/14-/7+)，获得最大肿瘤生长抑制。在最低剂量3mg/kg发现 最大抗肿瘤效果，其抑制肿瘤生长59%，(ρ = 0.011)，而10mg/kg仅具有42%的TGI，并且 与赋形剂治疗的对照小鼠相比较不是统计学显著的(P = 0. 083)。在两个7天治疗周期后， 30mg/kg的剂量没有显著抑制Calu-6肿瘤生长(34% TGI,p = 0. 179)，而将该剂量加倍至 60mg/kg 化合物(1)导致 52% TGI (ρ = 0. 035)。化合物(1)在HCT116结肠直肠模型中介导的肿瘤生长抑制与在Lovo结肠直肠 模型中介导的肿瘤生长抑制非常相似，使用所有的剂量和时间表均鉴定了显著的抗肿瘤活 性。对于21天方案在第42天(21天治疗结束时)，对于7+/14-/7+方案在第53天(第二 个7天治疗结束后3天)，观察到最大抗肿瘤活性。与赋形剂对照相比较，在每天用3mg/kg 化合物(1)连续治疗21天结束时，HCTl 16结肠直肠肿瘤生长被抑制85% (ρ彡0. 001)，并 且每天10mg/kg的剂量产生76% (ρ = 0. 003) TGI。使用30mg/kg和60mg/kg化合物(1)进 行两轮7天的治疗分别产生63% (ρ = 0. 016)和90% (ρ彡0. 001)的TGIs。证明H460aNSCLC模型完全抗化合物(1)介导的肿瘤生长抑制。由于在所有剂量均缺少功效，很早(仅 2周后)终止对携带H460异种移植物的小鼠的治疗。与A549 NSCLC异种移植物模型中先前的功效研究相似，在本研究中，值得注意的 是关于肿瘤生长抑制一般缺少对每日给药的剂量响应。例如，当对HCT116荷瘤小鼠以3或 10mg/kg给药化合物(1)21天时，获得的％ TGIs不与剂量成比例，分别具有85%和76%的 TGI0当对Calu-6荷瘤小鼠施用相同剂量的化合物(1) 21天时，较高剂量的％ TGI小于较 低剂量的％ TGI (42% TGI相对于59% TGI)。通过对携带建立的肿瘤的裸鼠口服施用Y-分泌酶抑制剂化合物(1)引起的 Notch信号传导中断产生了抗肿瘤功效。较早的发现已经表明化合物(1)对于植入裸鼠中 的A549 NSCLC肿瘤的延长且持久的抑制是有效的。开始进行另外的体内研究，来研究化合 物(1)抗肿瘤功效的广度。基于内源性Notch信号传导的事实，在体内异种移植物研究中， 选择Lovo结肠直肠癌，Calu-6 NSCLC，HCT116结肠直肠癌和H460a NSCLC进行检测。在所 述4种肿瘤模型中的3种中，化合物(1)是有效的，并且显著抑制肿瘤生长，而无毒性。在本功效研究设置中，以两种不同的方案检测两种剂量的化合物(1)中的每一 种3和10mg/kg qd 21天，或30和60mg/kg间断给与(7+/14-7+)。预先检测这些剂量和 时间表，并且发现在裸鼠中是很好耐受的。化合物(1)在两种结肠直肠模型Lovo和HCTl 16 中表现出最大的抗肿瘤活性。在给药21天后，与赋形剂治疗的对照相比，3和10mg/kg的化 合物(1)剂量分别导致40%和83% TGI，而30和60mg/kg的化合物(1)剂量产生59%和 85% TGI0在HCT116模型中，最低的3mg/kg剂量甚至更有活性(TGI = 85% )，并且IOmg/ kg的剂量同样有效，与赋形剂治疗的对照相比较，具有76% TGI。使用30mg/kg和60mg/kg 化合物(1)进行两轮7天的治疗分别产生63%和90%的TGIs。针对检测的两种NSCLC异种移植物模型(Calu-6和H460a)，化合物(1)较不有效。 在Calu-6模型中，以最低剂量3mg/kg每天给药21天获得最大生长抑制(与赋形剂相比较， 59% TGI)，而所有的其它剂量和方案证明是较不有效的。对于化合物(1)的抗肿瘤作用， H460a模型是完全难治愈的。尽管到目前数据组较小，总共仅检测了 4种肿瘤模型，但是所观察到的体内抗肿 瘤反应似乎与细胞系Notch 1/Notch 3的表达比例相关。已经表明Notch 3在由γ.-分 泌酶加工和蛋白水解分裂后作用为胞内Notch 1 (ICN)的负调控子。Notch 3在核易位后与 ICN竞争，并且结合转录因子。内部数据揭示H460a细胞中升高的Notch 3蛋白表达，和在 敏感细胞系(即，Lovo，HCT116，和A549)中减少的或低的表达。如先前使用化合物(1)的体内研究所示，当小鼠每天给药21天后，关于肿瘤生长 抑制，此处观察到一般缺少剂量比例性。另一方面，关于按照间断(7+/14-/7+)时间表给药 的较高剂量，似乎确实存在剂量响应。所认知到的剂量响应的缺少不能完全由药物暴露解 释。在用10mg/kg化合物(1)急性相对于长期给药的小鼠中的血浆暴露的比较表明相似的 暴露，这表明不存在暴露随时间的减少，这可能解释剂量比例性抗肿瘤响应的缺乏。此外， 裸鼠中的另一个药物代谢动力学研究揭示关于至多30mg/kg剂量的血浆暴露的杰出剂量 比例性。因此，关于TGI缺少剂量比例性响应不是由于血浆暴露药物饱和。同样地，这些研 究验证了％ TGI不总是与暴露成比例，并且暗示生物学阈值效应。来自本文所述的体内研究的结果表明Y.-分泌酶抑制剂化合物的抗肿瘤活性的广度。每天口服施用或间断(S卩，两个周期)给药可以有效抑制肿瘤生长而没有毒性。在4 种异种移植物模型中的3种中，化合物(1)是口服活性的。这些数据表明通过施用Y-分 泌酶抑制剂即化合物(1)产生的Notch抑制可能是一种有效的癌症治疗策略。Mrk化合物(1)是γ-分泌酶的一种有效的抑制剂，其阻断肿瘤细胞中Notch信号 传导的激活。在先前的研究中，对A549荷瘤小鼠口服施用化合物(1)导致持续的抗肿瘤 反应。为了进一步评估化合物⑴的抗肿瘤活性广度，在Lovo和HCT116人结肠直肠，与 Calu-6和H460a NSCLC异种移植物模型中进行4种功效研究。两种剂量(3和10mg/kg)每 天给药21天，而30和60mg/kg使用间断时间表给药(7天给药，14天不给药，然后7天给药 (7+/14-/7+))。在两种结肠直肠模型Lovo和HCTl 16中，化合物(1)表现出最大抗肿瘤活 性。在给药21天后，与赋形剂治疗的对照相比较，10mg/kg的化合物⑴剂量导致83%的肿 瘤生长抑制(TGI)，而30和60mg/kg的化合物(1)剂量产生59%和85%的TGI。在HCTl 16 模型中，低如3mg/kg的剂量是有效的，与赋形剂对照相比较，具有85% TGI，并且10mg/kg 的剂量同样是有效的。用30mg/kg和60mg/kg化合物(1)进行两轮7天的治疗分别产生 63%和90%的TGIS。对于两种所检测的NSCLC异种移植物模型Calu_6和H460a，化合物 (1)是较不有效的。在Calu-6模型中，仅在以3mg/kg的最低剂量每天给药21天获得显著 的生长抑制(与赋形剂相比较，59% TGI)，而所有其它剂量和方案证明是较不有效的。对于 化合物(1)的抗肿瘤作用，H460a模型是完全难治愈的。所观察到的抗肿瘤活性模式似乎 与细胞系N0tchl/N0tch3表达比例相关，然而，数据组较小，并且对于驱动功效的因素仍然 理解很少。这些数据表明通过施用Y-分泌酶抑制剂化合物(1)产生的Notch抑制可能是 一种有效的癌症治疗策略。实施例2化合物(1)在A549 NSCLC肿瘤细胞中的细胞活性化合物(1)在细胞和无细胞测定中的IC5tl在低的纳摩尔范围内，关于不同类型 (受体、离子通道、酶)的75种其它结合位点观察到具有>2 log单位的选择性。化合物 (1)的生长抑制活性是复杂的。化合物(1)不阻止肿瘤细胞增殖，也不诱导凋亡，而是产生 较少转化的、更扁平、更缓慢的生长表型。这种机制与Notch抑制相一致，并且排除了收集 标准(collecting standard)的EC50值。如通过蛋白质印迹测量ICN表达的减少，化合物 (1)减少Notch加工。这导致转录靶基因产物Hesl减少的表达，其同样通过蛋白质印迹测
Mo在发育和组织重建过程中，多能干细胞作为分化细胞的来源，以产生非专门增殖 的细胞类型。这些干细胞的特征和肿瘤的快速不可控增殖之间的联系逐渐变得清楚。一种 主要的发育信号传导轴是Notch途径。Notch信号传导通过在成体多能干细胞的发育和自 我更新过程中介导祖细胞的分化而调控细胞命运。Notch起作用保持祖细胞处于多能快速 增殖状态。Notch基因扩增、染色体易位或突变导致升高的Notch信号传导，由此通过将肿 瘤细胞保持在干细胞样增殖状态而给予肿瘤生长的优势。膜内加工是膜受体激活和信号传导的发生主题。Y -分泌酶是包括Notch的几种 信号传导受体(其它由Y-分泌酶加工的蛋白的实例为淀粉样前体蛋白[APP]，CD44干细 胞标记，和HER4[ErbB4])膜内蛋白水解加工中的关键酶。Notch的Y -分泌酶加工产生称
21为ICN的活性形式。该蛋白易位至核，并且形成包括直接改变关键的增殖-和分化_特异性 基因的表达的CSL转录调控子的大转录复合物的一部分。通过Y-分泌酶抑制阻断Notch 信号传导在体内在人类癌症细胞中产生较缓慢的生长、较少转化的表型。这种类型的新型 治疗途径具有使癌症成为更易处理的疾病的潜力，而没有传统细胞毒性药物的强副作用。材料和方法细胞系和培养A549 细胞系获自美国组织培养物中心(American Tissue CultureCollection) (ATCC)，ManassasVA并且保持在Ham培养基中，所述Ham培养基补充了 10%热灭活的胎牛 血清(HI-FBS ；GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD)和 2mM L-谷氨酰胺(GIBC0/BRL)。将 IxlO6 A549细胞接种在IOcm3板中用于FACS分析，并且将3xl05细胞/孔接种在6孔板中用于蛋 白质印迹分析。允许细胞附着24小时，然后用化合物(1)以下述浓度0. 1,0. 25,0.5,1,2.5 和5 μ M处理。将细胞温育72或120小时，并且收集用于FACS分析。检测套装将测试化合物(1)以IOmM溶解在100% 二甲亚砜(DMSO) (Sigma(西格玛))中，并 且在玻璃小瓶中在_20°C保存。5-点给药和蛋白质印迹分析通过用冷PBS洗涤板并且直接向板添加样品缓冲液(1 1水2X含有5%2-β 巯基乙醇的Tris-甘氨酸SDS样品缓冲液(Invitrogen，Carlsbad, CA))而收集A549细胞。 所用的裂解缓冲液的体积约为ΙΟΟμΙ/ΙΧΙΟ5个细胞。通过煮沸5分钟变性蛋白，通过使用 4-20% Tris-甘氨酸凝胶(Invitrogen)进行的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并且电转 到0.45μπι硝基纤维素膜(Invitrogen)上。将膜在室温下在封闭缓冲液(PBS/0. 吐温 20中的5%牛奶)中封闭1小时，然后用一级抗体在4°C温育过夜。洗涤膜，并用二级抗体 在室温下温育30分钟。使用增强的化学发光(ECL Plus, Amersham Pharmacia Biotech (安 玛西亚法玛西亚生物技术)，Piscataway，NJ)进行免疫检测。对于蛋白质印迹，使用处于 1 1000稀释的来自细胞信号传导(Cell Signaling)的分裂的Notch-I (vall744)抗体 (#2421)检测总ICN，使用处于1 1000稀释的来自US Biological (美国生物学)的Hesl 抗体(#H2034-35)检测Hesl，并且使用处于1 10，000稀释的来自Sigma (西格玛)的肌 动蛋白抗体(#5316)检测肌动蛋白。细胞周期分析将细胞用化合物(1)温育72或120小时，通过刮擦收集，在磷酸盐缓冲液(PBS)中 洗涤两次，以1.5xl03rpm离心，并且用70%乙醇在_20°C固定过夜。然后，使用MPM2-FITC 和碘化丙啶(PI)双重染色(Becton Dickinson, San Jose, CA)分析细胞。简言之，将细 胞用冰冷的包含0. 05%吐温-20的PBS(PBST)洗涤两次，用抗-磷Ser/Thr MPM2抗体 (#05-368,Upstate/Mi 11 ipore,BulIerica,ΜΑ)温育 2 小时，再次用 PBST 洗涤，在暗处用二 级 IgG-FITC 抗体(#AP308F，Chemicon, Temecula, CA)温育，用 PBST 洗涤并再用 PI/RNA 酶 溶液(Becton Dickinson, San Jose, CA)在 37°C温育另外 30 分钟。在装配有488nm氩离子激光的FACScan流式细胞计数仪(Becton Dickinson, San Jose, CA)上分析样品。使用对数放大用530/30nm通带滤光片(bandpass filter)收集绿 色荧光素异硫氰酸盐(FITC)荧光，并且使用线性放大通过585/42nm通带滤光片滤过来自碘化丙啶(PI)的橙色发射。每份样品最少收集20，000个事件。使用Flowjo软件(Tree Star Inc.(三星公司)，Ashland, OR)进行DNA柱状图的细胞周期分析。Notch加工的蛋白质印迹分析通过Y-分泌酶进行Notch受体分裂后的ICN蛋白形成是Notch信号传导中的关 键步骤。ICN迁移至核，成为调控包括Hesl的各种靶基因的转录的较大转录复合物的一部 分。通过蛋白质印迹监测肿瘤细胞系中ICN表达和Notch靶基因产物Hesl的减少。在人 NSCLC A549细胞中在处理5天后的组织培养物中，化合物(1)抑制ICN产生，所述ICN诱导 扁平且更少转化的肿瘤细胞表型。这种形态与在组织培养物中生长的非转化原代支气管上 皮细胞相似。由Clonetics网站获得用于视觉比较的比较。这一数据与抑制肿瘤细胞中的 Y“分泌酶相一致。没有观察到在化合物处理后的凋亡表型的出现。细胞周期分析利用FACS分析获得对化合物(1)处理后的细胞周期抑制作用的理解。用增加浓 度的化合物⑴处理A549细胞72和120小时。FACS分析表明对细胞周期进展的非常小的 作用，在72和120小时使用5μ M具有中等细胞周期减缓，如下文所述。FACS分析的量化
化合物(1)，μΜ时间，hrssubGl，%Gl, %G2/M, %05.260.123.50.106.563.123.30.25725.964.820.30.504.366.619.41.06.66421.55.08.464.92007.258.2590.106.859.024.10.251206.761.123.80.509.658.623.31.08.060.919.85.013.758.718.3化合物(1)不阻断肿瘤细胞增殖，也不诱导凋亡，而是相反产生较少转化的、更扁 平的且更缓慢的生长表型。这一机制与Notch抑制相一致。如通过蛋白质印迹测量ICN表 达的减少，化合物(1)减少Notch加工。这导致转录靶基因产物Hesl减少的表达，其同样 通过蛋白质印迹测量。
23
实施例3在化合物(1)给药后的A549异种移植物蛋白质印迹分析化合物(1)是Y-分泌酶的有效且选择性的抑制剂，其在肿瘤细胞中对Notch信 号传导产生抑制活性(1)。化合物(1)在细胞和不含细胞的测定中的IC5tl在低的纳摩尔范 围内，关于不同类型(受体、离子通道、酶)的75种其它结合位点观察到具有>2 log单位 的选择性。化合物(1)的生长抑制活性是复杂的。化合物(1)不阻止肿瘤细胞增殖，也不诱 导凋亡，而是产生较少转化的、更扁平、更缓慢的生长表型。这种机制与Notch抑制相一致。 化合物(1)治疗的肿瘤具有降低的胞外基质蛋白5型胶原蛋白水平和升高的MFAP5水平。 另外，如通过ICN和Notch-I受体表达的减少测量的，肿瘤细胞中的Notch加工被抑制。当 对携带A549异种移植物的小鼠每天给药化合物(1)至多60mg/kg时，ICN和Notch-I是变 化的。这可能是由于在功效研究过程中重复给药后暴露的减少或在肿瘤内极差的化合物分 布。在发育和组织重建过程中，多能干细胞作为分化细胞的来源，以产生非专门增殖 的细胞类型。这些干细胞的特征和肿瘤的快速不可控增殖之间的联系逐渐变得清楚。一种 主要的发育信号传导轴是Notch途径。Notch信号传导通过在成体多能干细胞的发育和自 我更新过程中介导祖细胞的分化而调控细胞命运。Notch起作用保持祖细胞处于多能快速 增殖状态。Notch基因扩增、染色体易位或突变导致升高的Notch信号传导，由此通过将肿 瘤细胞保持在干细胞样增殖状态而给予肿瘤生长的优势。膜内加工是膜受体激活和信号传导的发生主题。Y -分泌酶是包括Notch的几种 信号传导受体(其它由Y-分泌酶加工的蛋白的实例为淀粉样前体蛋白[APP]，CD44干细 胞标记，和HER4[ErbB4])膜内蛋白水解加工中的关键酶。Notch的Y -分泌酶加工产生称 为ICN的活性形式。该蛋白易位至核，并且形成包括直接改变关键的增殖-和分化_特异性 基因的表达的CSL转录调控子的大转录复合物的一部分。通过Y-分泌酶抑制阻断Notch 信号传导在体内在人类癌症细胞中产生较缓慢的生长、较少转化的表型。这种类型的新型 治疗途径具有使癌症成为更易处理的疾病的潜力，而没有传统细胞毒性药物的强副作用。材料和方法检测套装将测试化合物(1)以IOmM溶解在100% 二甲亚砜(DMSO) (Sigma(西格玛))中，并 且在玻璃小瓶中在_20°C保存。肿瘤收集和蛋白质印迹分析对携带A549肿瘤的裸鼠按照每日口服时间表以指定剂量给药21天。在尸体剖 检时收集来自每组的三种A549肿瘤，并且急速冷冻。通过向肿瘤中直接添加样品缓冲液 (1 1水2X含有5% 2-β巯基乙醇的Tris-甘氨酸SDS样品缓冲液(Invitrogen， Carlsbad, CA))并且利用印pendorf研棒分解而制备蛋白提取物。所用的裂解缓冲液的体 积约为100 μ 1/1Χ106个细胞。通过煮沸5分钟变性蛋白，通过使用4-20% Tris-甘氨酸凝 胶(Invitrogen)进行的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并且电转到0. 45 μ m硝基纤维素 膜(Invitrogen)上。将膜在室温下在封闭缓冲液(PBS/0. 吐温20中的5%牛奶)中封 闭1小时，然后用一级抗体在4°C温育过夜。洗涤膜，并用二级抗体在室温下温育30分钟。 使用增强的化学发光(ECL Plus,Amersham Pharmacia Biotech(安玛西亚法玛西亚生物技术)，PiSCataWay，NJ)进行免疫检测。对于蛋白质印迹，使用处于1 1000稀释的来自细 胞信号传导(Cell Signaling)的分裂的Notch-1 (vall744)抗体(#2421)检测总ICN，使用 处于 1 1000 稀释的来自 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz 生物技术)的 Notch-1 C-20抗体(#SC-6014)检测总Notch-1，使用处于1 1000稀释的来自US Biological (美 国生物学)的Hesl抗体(#H2034-35)检测Hesl，使用处于1 1000稀释的来自Sigma (西 格玛)的肌动蛋白抗体(#5316)检测肌动蛋白，使用处于1 1000稀释的来自Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz生物技术)的H-200抗体(#20648)检测V型胶原蛋白，并且使 用处于1 1000稀释的来自Abnova的MFAP5抗体(#H00008076_A01)检测MFAP5。异种移棺物蛋白质印迹分析γ -分泌酶抑制剂处理的A549异种移植物肿瘤的微阵列分析揭示RNA表达变化 与胞外基质改变一致。制备化合物(1)处理的肿瘤用于蛋白质印迹分析。V胶原蛋白表达 显著减少，而MFAP5蛋白表达增加。Notch-I蛋白水平和ICN的表达在除最高剂量组外的 所有动物组中减少。V型胶原蛋白和MFAP5是补充胞外基质的结构蛋白。在更加分化的组 织中，V型胶原蛋白表达通常减少，MFAP5表达通常增加。这一数据与A549肿瘤细胞中的 Notch-I抑制导致更加分化的表型的发挥作用假说相一致。Mrk化合物(1)处理的肿瘤具有减少的胞外基质蛋白5型胶原蛋白水平和升高的 MFAP5水平。另外，如通过ICN和Notch-I受体表达减少测量的，肿瘤细胞中的Notch加工 被抑制。当对携带A549异种移植物的小鼠每天给药化合物(1)至多60mg/kg时，ICN和 Notch-I是变化的。这可能是由于在功效研究过程中重复给药后暴露的减少或在肿瘤内极 差的化合物分布。实施例4在化合物(1)给药后，MDA-MB-468乳腺肿瘤细胞中软琼脂生长潜能的丧失化合物(1)是Y-分泌酶的有效且选择性的抑制剂，其在肿瘤细胞中对Notch信 号传导产生抑制活性。化合物(1)在细胞和不含细胞的测定中的IC5tl在低的纳摩尔范围 内，关于不同类型(受体、离子通道、酶)的75种其它结合位点观察到具有>2 log单位的 选择性。化合物(1)的生长抑制活性是复杂的。化合物(1)不阻止肿瘤细胞增殖，也不诱 导凋亡，而是产生较少转化的、更扁平、更缓慢的生长表型。这种机制与Notch抑制相一致， 并且排除收集标准的EC5tl值。在软琼脂中，化合物(1)减小MDA-MB-468群落的尺寸。在发育和组织重建过程中，多能干细胞作为分化细胞的来源，以产生非专门增殖 的细胞类型。这些干细胞的特征和肿瘤的快速不可控增殖之间的联系逐渐变得清楚。一种 主要的发育信号传导轴是Notch途径。Notch信号传导通过在成体多能干细胞的发育和自 我更新过程中介导祖细胞的分化而调控细胞命运。Notch起作用保持祖细胞处于多能快速 增殖状态。Notch基因扩增、染色体易位或突变导致升高的Notch信号传导，由此通过将肿 瘤细胞保持在干细胞样增殖状态而给予肿瘤生长的优势。膜内加工是膜受体激活和信号传导的发生主题。Y -分泌酶是包括Notch的几种 信号传导受体(其它由Y-分泌酶加工的蛋白的实例为淀粉样前体蛋白[APP]，CD44干细 胞标记，和HER4[ErbB4])膜内蛋白水解加工中的关键酶。Notch的Y -分泌酶加工产生称 为ICN的活性形式。该蛋白易位至核，并且形成包括直接改变关键的增殖-和分化_特异性基因的表达的CSL转录调控子的大转录复合物的一部分。通过Y-分泌酶抑制阻断Notch 信号传导在体内在人类癌症细胞中产生较缓慢的生长、较少转化的表型。这种类型的新型 治疗途径具有使癌症成为更易处理的疾病的潜力，而没有传统细胞毒性药物的强副作用。材料和方法细胞系和培养MDA-MB-468细胞系获自美国组织培养物中心(American Tissue Culture Collection) (ATCC)，Manassas, VA并且保持在RPMI培养基中，所述RPMI培养基补充 7 10%热灭活的胎牛血清(HI-FBS ；GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD)和 2mM L-谷氨酰胺 (GIBC0/BRL)。检测套装将测试化合物(1)以IOmM溶解在100% 二甲亚砜(DMSO) (Sigma(西格玛))中，并 且在玻璃小瓶中在_20°C保存。软琼脂群落形成测定对于不依赖锚定性生长测定，向6孔板的每个孔中倾倒2ml包含0. 5%低熔点 SeaPlaque琼脂糖(#50100，Cambrex, Rockland, ME)的细胞型特异性完全培养基(补充了 20%胎牛血清(FBS)，1%青霉素/链霉素，丙酮酸钠，HEPES的RPMI培养基)的底 层。待琼脂培养基在室温下固化后，加入处于0. 5ml如上述包含0. 3% SeaPlaque琼脂糖 的完全培养基中的3xl03个细胞/孔。次日，向每个孔中加入包含0，100，或250nM化合物 (1)的Iml培养基。温育细胞4周，以允许群落形成，包含化合物的培养基每周更换两次。软琼脂生长化合物(1)是Y-分泌酶的有效且选择性的抑制剂，其在肿瘤细胞中对Notch信 号传导产生抑制活性(1)。化合物(1)的生长抑制活性是复杂的。化合物(1)不阻止肿瘤 细胞增殖，也不诱导凋亡，而是产生较少转化的、更扁平、更缓慢的生长表型。在软琼脂中形 成群落的能力表示肿瘤细胞进展中的重要事件。不转化的细胞和极差致瘤性的细胞在接种 在软琼脂中时不能生长。相反，高致瘤性细胞在软琼脂条件下快速生长，产生大的群落。在 人乳腺癌细胞系MDA-MB-468中通过测量在软琼脂中的生长潜能，而评估化合物(1)对转化 的表型的作用。化合物(1)以剂量依赖性方式(250nM> 100nM>对照)减少群落生长。Mrk化合物(1)不阻止肿瘤细胞增殖，而是减小MDA-MB-468群落在软琼脂中的尺寸。 这与化合物(1)在MDA-MB-468乳腺肿瘤细胞中诱导较少转化的表型相一致。实施例5在携带A549非小细胞肺癌异种移植物的裸鼠中每天一次或两次口服施用γ-分 泌酶抑制剂化合物(1)的耐受性和功效化合物(1)是Y-分泌酶的有效且高度选择性的抑制剂，其最初用于治疗阿尔茨 海默病。在体外，化合物(1)以纳摩尔浓度抑制Notch激活和加工，并且向培养物中的肿瘤 细胞添加化合物(1)诱导较少转化的表型，并且阻止在软琼脂中的生长。在体内，化合物 (1)在啮齿动物、狗和人类中具有良好的口服生物利用度和有利的药物代谢动力学模式。在 本研究中，将携带A549非小细胞肺癌(NSCLC)异种移植物的裸鼠在21天治疗周期中的7、 14或21天口服每日或每日两次(qd or bid)给药化合物(1)。对于每日两次(bid)给药，
26鉴定最大耐受剂量(MTDs)为60mg/kg 7天，30mg/kg 14天，和10mg/kg 21天。对于每日 (qd)给药，注意到最大耐受剂量为60mg/kg 14天或30mg/kg 21天。当仅在21天周期中的 7天(7+/14-)施用60mg/kg的化合物(1)时，开始时观察到肿瘤消退，并且在不进行治疗的 14天后，％肿瘤生长抑制(TGI)与赋形剂治疗的对照动物相比仍然为91%。另外，每日给 药一次或两次较低剂量的化合物(1) (3mg/kg, 10mg/kg和30mg/kg) 14(14+/7_)或21天在 21天周期结束时导致显著且持续的肿瘤生长抑制，％ TGIs在66-83%范围内。每天施用 化合物(1) 一次与使用14+/7-或21天治疗时间表每天两次治疗一样有效，具有剂量依赖 性。此外，较短的给药持续时间(7+/14-或14+/7-)与完整的21天给药一样有效抑制A549 肿瘤生长。这一数据支持通过施用Y分泌酶抑制剂化合物(1)进行的Notch抑制可能是 治疗癌症的一种有效的临床治疗法的观点。Notch信号传导途径在发育过程中通过调控祖细胞和多能干细胞的分化、增殖和 凋亡而参与决定细胞的命运。由于基因扩增、染色体易位或突变导致的Notch信号传导元 件的失调参与多种类型的恶性病，包括白血病(Leukemia)，成神经管细胞瘤和成胶质细胞
(medullo-and glioblastoma), ？L (breast carcinoma)，Lf^ (head and neck cancer)，和胰腺癌(pancreatic carcinoma)。例如，Notch在造血系统中起决定细胞世系 的作用，并且已表明激活Notch-I突变负责所有T细胞ALLs (急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia))中的大约一半。Notch信号传导途径由Notch受体(Notch受 体1-4)构成，其在与配体(δ -样-1，-3，-4，Jagged-I和_2)结合并且通过蛋白水解分裂 激活时，易位至核，在核中它们作用为靶基因的转录激活剂。γ -分泌酶是负责Notch受体分裂和激活的两种重要酶中的一种，并且已经提议 其为癌症治疗的靶标。由Y-分泌酶酶促分解胞内Notch(ICN)允许ICN易位至核，导致 下游致癌性靶标的转录，所述下游致癌性靶标包括Hes，Hes相关的bHLH受体，Hey, HERP, 细胞周期调控子(P21，细胞周期蛋白A，细胞周期蛋白D1)，SKP2，NF-kB的转录因子，AKT， PI-3K，erbB2, β -联蛋白和凋亡过程的调控剂。Ras癌基因可以激活野生型Notch信号传 导，其是Ras-介导的向恶性病转化的明显需要。最近的证据表明来自肿瘤细胞的Notch信 号传导可以引发邻近的内皮细胞的Notch激活，因此促进肿瘤发生和血管生成。因此，靶向 Notch活性的Y-分泌酶抑制剂可能在不同癌症类型中具有多效性作用。除了加工Notch，Y-分泌酶还负责加工β-淀粉样前体肽(APP)，其是阿尔茨海 默病治疗中的靶标。已经表明靶向Y-分泌酶的小分子在某种选择性程度上能够相对于 Notch阻断APP的加工。当前临床前沿，开发化合物(1)用于阿尔茨海默病，但是相对于 Y-分泌酶缺乏抑制APP的充分的特异性。认为靶向正常细胞中的Notch的后果不适于阿尔 茨海默病适应征，但是对于肿瘤学是可接受的。例如，在给药Y-分泌酶抑制剂的Fischer 大鼠中的毒性研究揭示Notch途径激活的阻断导致粘膜分泌的杯形细胞尺寸和数量的增 加。化合物⑴是高度选择性且有效的Y -分泌酶抑制剂(ICsi = 4nM)。认识到联系 Notch信号传导途径的失调和癌症的mounting数据，利用一种交叉治疗策略将Y -分泌酶 抑制剂用作癌症治疗。在细胞报告子测定(IC5tl = 5nM)中，化合物(1)以纳摩尔范围抑制 人Αβ蛋白生产(IC5tl = 4-14ηΜ)，和Notch活性/加工。化合物(1)在小鼠中具有有利的 药物代谢动力学，具有中等至高的口服生物利用度。
在本研究中，针对裸鼠中的A549 NSCLC人异种移植物模型，评估化合物(1)的抗 肿瘤活性。由于表达受体、配体和下游效应子如Hes-I和Hey-I (如通过基于PCR的基因表 达模式评估)，A549细胞似乎具有功能性Notch信号传导途径。A549细胞在Notch途径中 具有至少一种可以确认的缺陷；负调控子Numb仅以低水平表达。在体外，nM浓度的化合物 (1)在Α549细胞中诱导较少转化的表型以及MDA-MB-468乳腺肿瘤细胞失去在软琼脂中的 生长，这与Notch激活的机制性抑制相一致。为了检验化合物(1)的体内抗肿瘤作用，在 本研究中，在21天的时间表中的7，14或21天向携带A549异种移植物的雌性无胸腺nu/ nu(裸)小鼠每天一次(qd)或两次(bid)施用化合物(1)。材料和方法使用获自查理斯河实验室(CharlesRiver Laboratories) (Wilmington,ΜΑ)的雌 性裸鼠(10只/组)，此时它们约为13-14周龄，并且重约23-25克。通过对实验动物的总 体观察和通过分析笼养在共用架台上的岗哨动物(sentinel animal)的血液样品而每天确 定所有动物的健康状况。在实验应用之前，允许所有动物适应并且由任何运输相关的压力 恢复最少72小时。随意提供高压灭菌的水和照射过的食物[5058-ms Pico chow(小鼠) Purina, Richmond, IN]，并且保持动物为12小时光照和黑暗的周期。在使用之前将笼、草垫 和水瓶高压灭菌，并且每周更换。肿瘤A549 人 NSCLC 细胞购自 ATCC (Manassas, VA)，并且培养在具有 10 % (v/v) FBS 的 RPMI 1640培养基中。生长细胞，并且由肿瘤学体内组(Oncology In Vivo Section) (OIVS) 的成员收集。每只小鼠接受在0.2mlPBS(磷酸盐缓冲液)中的7.5xl06个细胞，所述细胞 于8/17/06由OIVS成员皮下植入在右后腰窝处。检测药剂将化合物(1)用0. 2%吐温-80配制为在水中的1. 0% Klucel中的混悬液用于口 服(PO)施用。在停止和施用之前剧烈混合化合物(1)。每周制备配制的化合物和赋形剂， 并且保存在4°C，如下文所述。药物配制 随机化在肿瘤植入后第25天，将动物按照肿瘤体积随机化，从而所有组具有约 100-150mm3的相似的起始平均肿瘤体积。研究设计
剂量组在下述文列出。研究设计7和14天给药的组 21天给药的组 治疗治疗开始于9/12/06 (肿瘤细胞植入后第26天)。在21天时间表的7、14或21天， 使用无菌1 cc注射器和18 口径的管饲针头(0. 2ml/动物)每天一次(qd)或两次(bid) (间隔8小时)将化合物(1)和赋形剂作为混悬液给药。对于给药7天的动物(7+/14-)，治疗于9/19/06 (肿瘤细胞植入后第33天)结束。这些小鼠在第67天再次用相同剂量的化 合物(1)治疗另外7天至第74天。对于给药14天(14+/7-)的动物，治疗于9/26/06 (肿 瘤细胞植入后第40天)结束，并且对于给药21天的动物，治疗于10/3/06 (肿瘤细胞植入 后第47天)结束·病理学/尸体剖检在处死之前2小时对动物注射在Iml无菌水中的Img BrdU (溴脱氧尿苷)来评估 肿瘤细胞增殖。通过用CO2诱导然后断颈而处死动物。收集来自赋形剂处理的组和所选化 合物(1)处理的组的肿瘤，并且在锌-福尔马林中固定过夜，处理，石蜡包埋，并且切片，用 于组织病理学(苏木精和曙红(H & E)染色用于形态学评估，和BrdU染色)。收集脾和胃 肠道部分，福尔马林固定，处理，石蜡包埋，切片，并且用H&E染色，分别用于评估边缘区域B 细胞消耗，和杯形细胞形成，因为这些是Y-分泌酶抑制剂的两种已知的靶标-相关的作 用。结果在下文描述。尸体剖检/病理学总结 每周测量肿瘤和小鼠体重两次。所有的动物分别进行整个实验。计算和统计学分析体重减少使用下式以平均组体重变化百分数绘图表示=((W-Wci)ZX)X 100，其中 ‘W’表示在具体某一天治疗组的平均体重，%’表示同一治疗组在治疗开始时的平均体重。 最大体重减少也使用上式表示，并且表示在关于具体某一组的整个实验过程中的任意时间 观察到的最大体重减少百分数。在给定组中，定义毒性为> 20%的小鼠表现出> 20%的体 重减少和/或死亡率。功效数据以平均肿瘤体积+平均值的标准误差(SEM)绘图表示。治疗组的肿瘤体 积利用下式表示为对照组的肿瘤体积的百分数(％T/c) 100 X(CT-Ttl)/(C-Ctl)),其中T表 示治疗组在实验过程中具体某一天的平均肿瘤体积，T0表示同一治疗组在治疗的第一天的 平均肿瘤体积；C表示对照组在实验过程中具体某一天的平均肿瘤体积，Ctl表示同一治疗组 在治疗的第一天的平均肿瘤体积。使用椭圆体式(ellipsoid formula)计算肿瘤体积(单 位为立方毫米)(D x(d2))/2，其中‘D’表示肿瘤的大直径，‘d’表示小直径。在一些情形 中，使用下式计算肿瘤消退和/或肿瘤体积的百分数改变=(CT-TciVTci)x 100，其中‘T’表 示治疗组在具体某一天的平均肿瘤体积，‘IV表示同一治疗组在开始治疗时的平均肿瘤体 积。通过秩和检验和单向Anova和post-hoc Bonferroni t_检验(SigmaStat，版本2. 0， Jandel Scientif ic，San Francisco, CA)确定统计学分析。当概率值(P)彡0.05时，认为 组间差异是显著的。
药物暴露为了评估长期药物暴露，在最后一次给药后0. 5，1，2，4，8，和24小时从10mg/kg化 合物(1)组(qd χ 21天)收集血液样品，每个时间点2只小鼠。为了评估急性药物暴露， 在研究的最后一天，对首次用于实验的裸鼠组施用单次剂量为10mg/kg的化合物(1)。制备 血浆样品，并且通过LC/MS/MS分析化合物(1)。由2只动物/组/时间点计算平均血浆浓度。将具有低于量化界限(< 12. 5ng/ ml)的浓度的血浆样品设定为零。由平均血浆浓度数据估算药物代谢动力学参数。取样 时间报告为名义上的时间(nominal time)。报告的药物代谢动力学参数为最大血浆浓度 (Cmax)，0-8小时在血浆浓度-时间曲线下的面积(AUCch8J，和剂量标准化的AUC (AUC0_8hr/ 剂量)。Cmax值直接取自在第一时间点的血浆浓度-时间曲线，无需任何外推。AUC利用线 性梯形法则计算。在长期给药的小鼠中，10mg/kg的剂量产生708ng*小时/ml的Cmax和923ng*小 时/ml的AUCup在首次用于实验的小鼠中的单次剂量提供相似的暴露，Cmax和AUCQ_8to 分别为559ng*小时/ml和1279ng*小时/ml，这表明在长期给药时既不存在药物累积也不 存在减少的暴露。结果在下文列出。药物暴露总结使用10mg/kg剂量的平均血浆暴露 结果毒性在先前的最大耐受剂量(MTD)研究中，对首次用于实验的裸鼠每天两次给药 90mg/kg化合物(1) 14天是有毒的，并且导致显著的体重减少，而每天一次给药90mg/kg是 耐受的。在本研究中，每天两次给药60mg/kg化合物(1)超过7天不被耐受，并且每天一次 超过14天不被耐受。当动物被60mg/kg每天两次给药21天或14天时，每个治疗组分别死 亡7只和4只小鼠，大部分动物在死亡前表现出前述体重减少。当动物每天一次给药21天 时，3只小鼠死亡。60mg/kg qd 14天或bid 7天的剂量是很好耐受的，没有可评估的体重 减少或其它临床毒性迹象。每天一次30mg/kg的剂量21天是耐受的，然而，每天两次30mg/kg的剂量21天是 有毒性的，有2只动物死亡。30mg/kg的剂量每天给药一次或两次14天是很好耐受的，没有 可评估的体重减少或其它临床毒性迹象。使用所有的给药时间表，低于30mg/kg(即，IOmg/ kg或3mg/kg)的剂量是很好耐受的，并且没有观察到总体临床毒性迹象。抗肿瘤功效在21天时间表的7天、14天或21天中向携带A549 NSCLC异种移植物的裸鼠每 天一次或两次口服施用化合物(1)，与赋形剂治疗的动物相比较，导致显著的肿瘤生长抑制 (TGI)，生长抑制充分持续至治疗期间之后。在第47天，即21-天治疗组的最后一个治疗日，14-天治疗组(14+/7-)的治疗后7天，或7-天治疗组(7+/14-)的治疗后14天，计算肿瘤 生长抑制百分数。按照14+/7-时间表每天一次或每天两次治疗的所有组导致显著的肿瘤生长抑 制，生长抑制持续至治疗后至多23天(第63天)。当在肿瘤植入后第47天结束21天的 周期时，与赋形剂治疗的动物相比较(P < 0. 001)，每天一次施用的最低剂量3mg/kg化合 物(1)导致66% TGI (ρ < 0. 001)，而每天两次给药相同剂量将得到的TGI增加为83%。每 天一次10mg/kg的剂量产生77% TGI (ρ < 0. 001)，并且每天两次给药相同剂量导致80% TGI (ρ < 0. 001)。在最大耐受剂量60mg/kg qd或30mg/kg bid,分别观察到88%和79% 的TGIs (ρ <0.001)。当给与30mg/kg qd的剂量时，与赋形剂治疗的对照动物相比较，获得 79% 的 TGI (ρ < 0. 001)。当按照7+/14-时间表每天两次用60mg/kg化合物⑴治疗小鼠时，治疗最初引起 建立的A549肿瘤的消退，而在21天周期结束时，即肿瘤植入后第47天，与赋形剂对照小 鼠相比较，肿瘤生长抑制仍为91%。肿瘤生长抑制保持为长久的，并且持续至治疗后34天 (第67天)。在第67天，这些小鼠用相同剂量的化合物(1)再治疗第二个周期(7天)至 第74天。肿瘤生长继续被抑制，直至第90天。当每天一次或两次连续施用化合物(1)21天时，在肿瘤植入后第47天停止治疗， 观察到相似的结果，在治疗21天后，最低剂量3mg/kg每天一次化合物(1)产生76%的 TGI (ρ = 0.002)，而每天两次给药导致83%的TGI (ρ < 0.001)。与14+/7-时间表相似，与 赋形剂治疗的对照相比，对于每天一次和每天两次治疗组，用10mg/kg治疗小鼠21天分别 导致70% (ρ = 0. 004)和72% (ρ = 0. 003)的TGIs。尽管30mg/kg每天两次的剂量是有 毒的，但是每天一次给药是很好耐受的，并且与赋形剂治疗的小鼠相比较，A549肿瘤生长被 抑制66% (p = 0. 009)。对于所有21-天治疗的组，肿瘤生长抑制保持为长久的，并且持续 至治疗后最多16天(第63天)。注意的是，不管按照14+/7-还是完整的21天治疗时间每天一次或每天两次给药 Y-分泌酶抑制剂化合物(1)，关于肿瘤生长抑制观察到普遍的剂量响应缺乏。例如，当化 合物(1)以3或10mg/kg每天一次给药21天时，得到的％TGIs非常相似，并且不是剂量成 比例的，分别具有76%和70%的TGI。当每天两次(每天给与的药物量加倍)给药相同剂 量的化合物(1)21天时，％ TGIs没有成比例增加，相对于76%和70% TGI，分别具有83% 和 72% TGI。增加的临床前证据已经证明通过靶向Y-分泌酶而使Notch途径失活可能是癌症 治疗的一种可行且可信的策略。已经在白血病、T-ALL、成神经管细胞瘤和成胶质细胞瘤、乳 腺癌、头颈癌、胰腺癌和许多其它恶性病中观察到Notch信号传导途径的失调。化合物(1) 最初开发用于阿尔茨海默病作为APP的有效抑制剂，然而，此处我们报道该化合物通过抑 制Y -分泌酶介导的Notch加工和活化对癌症治疗的交叉-治疗应用。在体外向A549 NSCLC细胞中添加化合物(1)导致较少转化的表型和在软琼脂中 生长能力的丧失。为了确定化合物(1)的体内抗肿瘤潜能，使用7+/14-，14+/7_，或完整的
21天治疗时间表，对携带A549 NSCLC异种移植物的裸鼠每天一次或两次口服给药化合物 ⑴。对于每天两次给药，鉴定的最大耐受剂量(MTDs)为60mg/kg 7天，30mg/kg 14天，和10mg/kg 21天。对于每天一次给药，注意到最大耐受剂量为60mg/kg 14天或30mg/kg 21天。上述MTDs的剂量和时间表产生与靶标-相关的胃肠毒性相一致的体重减少和死亡 率。早期使用Y-分泌酶抑制剂治疗的肠陷凹(intestinal crypts)组织学检验揭示杯形 细胞分化的急剧增加，其为靶向Notch信号传导途径的一种已知作用。当使用7+/14-给药时间表，以60mg/kg每天两次给药Y -分泌酶抑制剂化合物 (1)时，开始时观察到肿瘤消退，在21天周期结束时具有91%的TGI，并且生长抑制继续持 续数周。在结束治疗34天后，给药化合物(1)重新开始第二个周期继续抑制肿瘤生长。另 外地，按照14+/7-或完整的21天时间表每天给与一次或两次的所有其它化合物(1)剂量 (3mg/kg，10mg/kg和30mg/kg)导致显著的肿瘤生长抑制，其分别充分持续至治疗结束之 后，即第40天或47天。这些数据表明较短的化合物⑴给药持续时间(即7或14天)可 以与较长的时间间隔(即21天)给药一样有效地抑制A549肿瘤生长。在多种情形中，化合物(1)的最大抗肿瘤作用被延迟，并且在该化合物给药停止 后，更明显。这种临床前抗肿瘤模式非常不同于经典的细胞毒性药剂，其中通常在治疗期间 观察到最大肿瘤生长抑制，并且在治疗停止时肿瘤迅速开始继续生长。已知Notch在正常 和癌症干细胞中表达，并且当靶向癌症干细胞时，本文观察到的延迟的抗肿瘤作用联想到 肿瘤收缩中的理论预测的延迟。由于仅靶向少部分(但是为关键的部分)的肿瘤细胞群 体，一旦肿瘤中的癌症干细胞最终分化或被杀死，其余的细胞缺乏自我更新的能力，并且肿 瘤体积保持为稳定的或逐渐减小。关于肿瘤生长抑制观察到普遍缺少剂量比例性，以3，10，或30mg/kg每天一次给 药21天具有相似的％ TGIs。当在每天两次组中加倍每日剂量时，仅观察到TGI的适度增 加。在本研究结束时，在用10mg/kg化合物(1)急性相对于长期给药的小鼠中血浆暴露的 比较表明相似的暴露，这表示不存在暴露随时间的减少，这可能解释剂量比例性的缺乏。此 外，在裸鼠中的独立的PK研究(PK#1128)表明关于至多30mg/kg剂量的血浆暴露存在极佳 的剂量比例性[18]。因此，关于肿瘤生长抑制缺少剂量比例性不可能是由于血浆暴露的饱 和导致的。这些结果表明％ TGI不与暴露成比例，相反可能反映靶向癌症干细胞而不是快 速增殖细胞的独特性质，或者仅是存在生物学阈值效应。用H & E染色的肿瘤切片的组织学分析没有揭示用化合物⑴治疗的肿瘤细胞表 型的任何差异，然而，与来自赋形剂治疗的小鼠的肿瘤相比较，来自用10mg/kg化合物⑴ 处理21天的小鼠的肿瘤具有增加的坏死面积和细胞基质。本研究的结果揭示，按照14+/7-或21天治疗时间表，每日一次施用化合物(1)与 每日两次治疗一样有效，没有剂量依赖性。此外，较短的给药持续时间(7+/14-或14+/7-) 与完全的21天给药一样有效抑制A549肿瘤生长，并且抗肿瘤效果充分延长至治疗结束后。 这些数据表明通过施用Y-分泌酶抑制剂化合物(1)进行的Notch抑制可能是一种有效的 癌症治疗策略。实施例6非临床药理学总结化合物(1)是Y _分泌酶的有效且选择性的抑制剂，其在肿瘤细胞中产生对Notch 信号传导的抑制活性。化合物(1)产生在停止给药后得到保持的良好的体内抗肿瘤活性， 组织学分析表明与Notch信号传导抑制相一致的独特的肿瘤表型。
33
化合物(1)在细胞和无细胞测定中的IC5tl在低的纳摩尔范围内，关于不同类型 (受体、离子通道、酶)的75种其它结合位点观察到具有>2 log单位的选择性。化合物 (1)的生长抑制活性是复杂的。化合物(1)不阻止肿瘤细胞增殖，也不诱导凋亡，而是产生 较少转化的、更扁平、更缓慢的生长表型。这种机制与Notch抑制相一致，并且排除了选择 标准的EC50值。如通过蛋白质印迹测量ICN表达的减少，化合物(1)减少Notch加工。这 导致转录靶基因产物Hesl减少的表达，其同样通过蛋白质印迹测量。在体内应用中，化合物(1)在口服给药后有活性。按照间断的或每日时间表，在5 种异种移植物中的3种中表现出抗肿瘤活性，没有体重减少。重要的是，在停止给药时功效 得以维持。治疗的A549 NSCLC肿瘤的组织学分析表现出以大面积坏死、增加的胞外基质为 特征的肿瘤表型。这与胶原蛋白V和MFAP5蛋白表达中的改变相一致。这些非临床病理学结果支持在肿瘤学临床研究中进一步评估化合物(1)。初级药效学体外诜择件多种体外测定用来表征化合物(1)的效力和选择性。初级体外测定使用不含细胞 的膜制备物来提供Y-分泌酶的酶复合物作为体外测定。化合物(1)强抑制Y-分泌酶的 酶活性，具有4nM的效力。在基于细胞的报道子测定中，这转化为对淀粉样前体蛋白(APP ； 14ηΜ)和NotCh(5nM)的有力的加工抑制。APP的细胞加工使用基于ELISA的读数测量。已 经改造HEK293细胞来过表达APP。通过A 1-40 γ -分泌酶产物的基于ELISA的量化测量 加工。细胞Notch抑制活性使用稳定表达截短的人Notch 1的HEK293细胞系测量，所述截 短的人Notch 1在其胞内结构域与VP16/Gall4转录激活子融合，所述VP16/Gall4转录激 活子驱动萤火虫萤光酶基因。当通过其化学荧光测定时，抑制Notch加工产生萤光酶报道 子活性的减少。机制研究在由γ -分泌酶分裂Notch受体后形成ICN蛋白是Notch信号传导中的关键步骤。 ICN迁移至核，成为调控包括Hesl的多种靶基因的转录的较大转录复合物的一部分。通过 蛋白质印迹监测肿瘤细胞系中ICN表达和Notch靶基因产物Hesl的减少。在人NSCLC A549 细胞中，在处理5天后，在组织培养物中，化合物(1)抑制ICN的产生，诱导扁平的更少转化 的肿瘤细胞表型。在组织培养物中，用化合物(1)处理产生扁平的、不转化的表型。这一数 据与抑制肿瘤细胞中的Y-分泌酶相一致。没有观察到在化合物处理后出现凋亡表型。在软琼脂中形成群落的能力代表在肿瘤细胞进展中的重要事件。不转化的细胞和 极差致瘤性细胞在接种在软琼脂中时不能生长。相反，高致瘤性细胞在软琼脂条件下快速 生长，产生大的群落。在人乳腺癌细胞系MDA-MB-468中通过测量在软琼脂中的生长潜能， 而评估化合物(1)对转化的表型的作用。化合物(1)以剂量依赖性方式(250nM> IOOnM >对照)减少群落生长。体内评估在数种异种移植物模型中，使用不同剂量和时间表，检测临产前抗肿瘤活性。在 A549 NSCLC模型中，在每天一次治疗21天的裸鼠中，化合物(1)产生统计学显著的肿瘤生 长抑制(70% TGI)(表5)。在功效检测过程中，体重减少用作长期给药后化合物(1)的总 体耐受性的替代。按照10mg/kg的口服每日给药时间表，产生暴露的功效(AUC24/天)约
34为IlOOh. ng/ml，并且不导致体重减少或不表现出临床毒性迹象。在连续每日给药后第1天 和第21天之间没有观察到暴露的减少。在本研究结束时收集的肿瘤的组织学分析揭示大 面积的坏死，胞外基质的增加。在按照每日时间表低于MTD给药21天的裸鼠中，在4种预测是敏感的(基于内源 性Notch信号传导的水平)建立的肿瘤模型中的3种，化合物(1)是口服活性的(表5)。在 预测是不敏感的1种模型中的1种中是无活性的。有效的响应可能与肿瘤N0tchl/N0tch3 表达比例相关。据报道Notch3通过与Notchl ICN竞争核转录因子作用为Notchl的负调 控子。初级数据表明Notch3蛋白在不响应异种移植物细胞系中升高的表达和在敏感细胞 系中减少的表达。化合物(1)在4种预测是敏感的异种移植物模型中的3种中是口服活性的，在1 种预测是不敏感的模型中的1种中是无活性的
H460a NSCLC0000NSCLC =非小细胞肺癌.功效=% TGI彡60且ρ彡0. 05，与赋形剂对照组比较。*当21-天的治疗结束时的最大TGI。t在21天治疗结束后一周(21+/7-)的最大TGI。#在第二轮7天的治疗后(7+/14-/7+)的最大TGI。1在第二轮7天的治疗后5天(7+/14-/7+/5-)的最大TGI。在A549模型中的另外剂量和时间表的研究在21天治疗周期中的7天或14天每 天两次治疗后产生79-91%的统计学上显著的肿瘤生长抑制，没有体重减少。对7天的治 疗组再监测43天。在整个观察期间肿瘤生长保持稳定。在第66天重新开始7天给药，至 第90天产生肿瘤生长抑制。与使用其它癌症治疗观察到的功效模式相比较，在使用化合物 (1)的小鼠中观察到的功效模式是独特的，其中最大功效在治疗停止后有时延长一周或两 周，并且在治疗后还观察到延长的功效。这种类型的响应与Notch抑制相一致。连续的每 日和间断的时间表都是有效的，没有体重减少。化合物(1)适于循环给药。这一数据支持 关于1期提议的间断给药的观念。这样的时间表可以帮助减小在人类中由每日给药预测的 潜在的毒性和CYP3A4影响。按照10mg/kg的口服每日给药时间表，暴露(AUC24h)产生的功效约为1100ng*hr/ mL，并且不导致体重减少，或不表现出临床毒性迹象。在连续每日给药后第1天和第21天
35之间没有观察到暴露的减少，在重复给药后缺乏新陈代谢诱导。在大鼠和狗的研究中，也观 察到在长期给药后暴露缺少改变。体内机制研究γ -分泌酶抑制剂治疗的A549异种移植物肿瘤的微阵列分析揭示RNA表达的改 变，这与胞外基质改变相一致。制备化合物(1)治疗的肿瘤用于蛋白质印迹分析。V型胶原 蛋白表达显著减少，而MFAP5蛋白表达升高。Notch-I蛋白水平和ICN的表达在除最高剂量 组外的所有动物组中减少。V型胶原蛋白和MFAP5是补充胞外基质的结构蛋白。在更加分 化的组织中，V型胶原蛋白表达通常减少，MFAP5表达通常增加。这一数据与A549肿瘤细胞 中的Notch-I抑制导致更加分化的表型的发挥作用假说相一致。实施例7在人胰腺癌异种移植物中的抗肿瘤活性动物雌性(无胸腺nu/nu)裸鼠获自理斯河实验室(Charles River Laboratories) (Wilmington，MA)，而雌性 SCID-beige 小鼠购自 Taconic (Germantown，NY)。使用约为 8-12 周龄(裸鼠)或8-10周龄(SCID-beige)且重约23_25克的小鼠。通过对实验动物的总体 观察和通过分析笼养在共用架台上的岗哨动物的血液样品而每天确定所有动物的健康状 况。在实验应用之前，允许所有动物适应并且由任何运输相关的压力恢复最少72小时。随 意提供高压灭菌的水和照射过的食物[5058-ms Pico chow (小鼠)Purina，Richmond，IN]， 并且保持动物为12小时光照和黑暗的周期。在使用之前将笼、草垫和水瓶高压灭菌，并且 每周更换。肿瘤MiaPaca2, AsPCl 和 BxPC3 人胰腺癌细胞购自 ATCC(Manassas，VA)。BxPC3 和 AsPCl细胞生长在RPMI培养基中，并且MiaPaCa2细胞生长在Dulbecco改良的基本培养基 (Dulbecco' s Modified Essential Medium) (DMEM)中。所有的培养基补充有 10% (ν/ν) FBS和(ν/ν) 200nM L-谷氨酰胺。在1/22/07和3/14/07分别对裸鼠的每只小鼠在右 后腰窝处皮下植入在体积为0. 2ml的PBS中的6xl06 MiaPaca2细胞或5xl06 AsPCl细胞。 于5/22/07对SCID-biege小鼠的每只小鼠在右后腰窝处皮下植入体积为0.2ml的在1 1 matrigel PBS 混合物中的 5xl06 BxPC3 细胞。检测药剂将化合物(1)用0. 2%吐温-80配制为在水中的1. 0% Klucel中的混悬液用于口 服(Po)施用。配制的化合物和赋形剂保存在4°C并且每周制备[表1]。在施用前剧烈混合 该混悬液。用无菌盐水重建吉西他滨(Gemzar ,Eli Lilly and Company, Indianapolis, IN, USA)以产生38mg/ml的储液，用于整个3-4周的研究。在给药当天用无菌盐水进一步 稀释吉西他滨，以产生用于体内施用所需要的浓度。随机化将植入MiaPaCa2或AsPCl异种移植物的裸鼠分别在细胞植入后第17天和第9天 随机化。将携带BxPC3异种移植物的SCID-beige小鼠在植入后8天随机化。所有小鼠按 照肿瘤体积随机化，从而所有组具有约100-150mm3的相似的起始平均肿瘤体积。治疗起始
对于MiaPaCa2研究的治疗于2/8/07 (肿瘤植入后第17天)开始，对于AsPCl于 3/23/07 (肿瘤植入后第9天)开始，并且对于BxPC3研究于5/30/07 (肿瘤植入后第8天) 开始。使用无菌Icc注射器和18 口径的管饲针头(0. 2ml/动物)每天一次(qd)给药口服 赋形剂或化合物(1)混悬液21-28天，或使用间断的时间表(7天给药，14天不给药，7天 给药(7+/7-/7+)，7天给药，7天不给药(7+/7_)，3天给药，4天不给药(3+/4_)，或14天给 药，14天不给药(14+/14-))给药。使用Icc注射器和26 口径的针头将吉西他滨q3d(每3 天)腹膜内(ip)施用给小鼠。对于MiaPaCa2和AsPCl研究，qd化合物(1)混悬液或q3d吉西他滨治疗在肿瘤 细胞植入后第37天结束，而对于BxPC3研究，qd化合物(1)混悬液或q3d吉西他滨治疗在 肿瘤细胞植入后第35天结束。对于在MiaPaCa2研究中使用7+/7_/7+时间表间断给药化合物(1)混悬液，治疗 在第23天结束，在第31天重新开始，并且在第37天结束。在组合组(见表2A，组9和10) 中，使用7+/7-/7+时间表，顺序地给予化合物(1)混悬液与吉西他滨，从而化合物(1)仅在 第一周和第三周每日给药，而吉西他滨仅在第二周q3d给药。对于在AsPCl研究中使用7+/7_时间表x2周期间断给药化合物(1)混悬液，治疗 在第15天结束，在第23天重新开始，并且最后在第29天结束。对于使用3+/4_时间表χ 4周期间断给药，治疗在第11天结束，在第16天重新开始，在第18天结束，在第23天重新 开始，在第25天结束，在第30天重新开始，并且最后在第32天结束。在第一组合组(见表 2Β，组7)，同时给予每日化合物(1)与q3d吉西他滨总共4周。对于其余的组合组，化合物 (1)和吉西他滨顺序地给予而不是同时给予。在组8中(见表2B)，吉西他滨在第1周和第 3周q3d给药，而化合物(1)仅在第2周和第4周每日给予。在组9中，化合物给药的顺序 相反，化合物(1)混悬液在第1周和第3周每日给予，而吉西他滨在第2周和第4周q3d给 予。在组10中(见表2B)，吉西他滨在第1周和第2周q3d给予，而化合物(1)今在第3周 和第4周每日给予。在组11中，化合物给药的顺序相反，化合物(1)在第1周和第2周每 日给予，而吉西他滨在第3周和第4周q3d给予。当终止治疗时，在所有三种研究中，在另外的随访期间用卡钳测量荷瘤小鼠，以评 估肿瘤的再生长。对于MiaPaCa2研究，随访期间持续至第63天(治疗后26天)，对于AsPCl 至第48天(治疗后11天)，并且对于BxPC3至第50天(治疗后15天)。计算和统计学分析体重减少使用下式以平均组体重变化百分数绘图表示=((W-Wci)ZX)XIOO,其中 ‘W’表示在具体某一天治疗组的平均体重，%’表示同一治疗组在治疗开始时的平均体重。 最大体重减少也使用上式表示，并且表示在关于具体某一组的整个实验过程中的任意时间 观察到的最大体重减少百分数。在给定组中，定义毒性为> 20%的小鼠表现出> 20%的体 重减少和/或死亡率。功效数据以平均肿瘤体积+平均值的标准误差(SEM)绘图表示。治疗组的肿瘤体 积利用下式表示为对照组的肿瘤体积的百分数(％T/c) =IOOx(CT-Ttl)/(C-Ctl)),其中T表 示治疗组在实验过程中具体某一天的平均肿瘤体积，T0表示同一治疗组在治疗的第一天的 平均肿瘤体积；C表示对照组在实验过程中具体某一天的平均肿瘤体积，Ctl表示同一治疗 组在治疗的第一天的平均肿瘤体积。使用椭圆体式计算肿瘤体积(单位为立方毫米)(Dx(d2))/2，其中‘D’表示肿瘤的大直径，‘d’表示小直径。在一些情形中，使用下式计算肿 瘤消退和/或肿瘤体积的百分数改变=((T-Ttl)ZTtl)xIOO,其中‘T’表示治疗组在具体某一 天的平均肿瘤体积，‘IV表示同一治疗组在开始治疗时的平均肿瘤体积。通过秩和检验和 单向 Anova 禾口 post-hoc Bonferroni t_ 检验(SigmaStat,版本 2. O, Jandel Scientific, San Francisco, CA)确定统计学分析。当概率值(ρ) ( 0. 05时，认为组间差异是显著的。对于存活评估，结果以存活百分数针对肿瘤植入后的天数绘图(Stat View, SAS Institute, Cary NC)。以100 χ [(治疗组的中值存活天数-对照组的中值存活天数)/对照 组的中值存活天数]计算％ ILS。中值存活使用Kaplan Meier存活分析确定。利用对数排列 检验(log-rank test)比较治疗组的存活与赋形剂组，并且通过Breslow-Gehan-Wilcoxon 检验(Stat View, SAS, Cary, NC)分析组间存活比较。当概率值(P) ( 0. 05时，认为组间 差异是显著的。结果毒件在所有三种研究(MiaPaCa2，AsPCl，和BxPC3)中，所有剂量和时间表的、单独或组 合给予的化合物(1)或吉西他滨得到很好地耐受，其定义为< 20%的动物表现出> 20% 的体重减少、死亡率或死亡。在MiaPaca2研究中，在60mg/kg q3d吉西他滨和30mg/kg 7+/7-/7+化合物(1)组的每一组中各有一只小鼠由于错误给药而死亡。在AsPCl研究中， 在90mg/kg吉西他滨单一药剂组中有一只小鼠在第22天由于> 20%的体重减少而被处死， 由于在一周过程中进展性的体重减少，其被认为是毒性相关的。在BxPC3研究中，10mg/kg qd组中有一只小鼠在研究的最后一天表现出> 20%的体重减少(bwl)，由于该小鼠在研究 的最后几周过程中表现出进展性的体重减少，其也被认为是毒性相关的.当向携带MiaPaCa2人胰腺癌异种移植物的小鼠施用化合物(1)时，不管剂量 或时间表，单独的还是与吉西他滨组合，不能获得生物学显著的肿瘤生长抑制(TGI)(由 NCI ^60% TGI定义)[11]。当与赋形剂治疗的对照相比较时，向携带MiaPaCa2异种移植 物的裸鼠21天连续施用(qd)化合物(1)导致统计学显著的、而非生物学显著的肿瘤生长 抑制(TGI)。在qd组之间，观察到剂量响应，其中与赋形剂治疗相比较，lmg/kg导致39% 的 TGI (ρ = 0. 002)，3mg/kg 产生 42 % 的 TGI (ρ = 0. 002)，并且 10mg/kg 抑制肿瘤生长 53 % (pSO.OOl)。在按照7+/7-/7+天的时间表(第1周和第3周每日给药)间断施用化合物 (1)的组中，所有三种剂量表现出相似的非生物学显著的生长抑制，这表明使用该时间表缺 少剂量响应。最高剂量60mg/kg抑制肿瘤生长48% (ρ彡0.001)，而化合物(1)的10mg/kg 和30mg/kg剂量分别导致51% TGI (ρ ( 0. 001)和58% TGI (ρ ( 0.001)。当吉西他滨以 60mg/kgq3d施用时，与赋形剂治疗的对照相比较，观察到62% TGI (ρ彡0. 001)。在组合组 中，抗肿瘤活性既不是生物学显著性的，也不统计学不同于各自化合物(1)的单一治疗组， 在吉西他滨加化合物(l)10mg/kg或30mg/kg7+/7-/7+组中，具有57%或54%的TGI。在 停止治疗后，在26天的随访期间(至第63天)监测肿瘤生长。在第63天，关于所有组的 TGI值低于第37天的，这表明MiaPaCa2肿瘤在治疗后继续生长。与MiaPaCa2研究相似，当向携带AsPCl人胰腺癌异种移植物的小鼠施用作为单 一治疗的化合物(1)时，不管剂量或时间表，不能获得生物学显著的肿瘤生长抑制。在另一方面，当与吉西他滨组合给予化合物(1)时，在同时给予两种药物时，或在首先给予吉西 他滨两周的顺序给予时，获得生物学显著的肿瘤生长抑制。当与赋形剂治疗的对照相比较 时，向携带AsPCl异种移植物的裸鼠连续28天施用(qd)化合物(1)导致统计学显著的、 而非生物学显著的肿瘤生长抑制(TGI)。与赋形剂治疗的小鼠相比较，以3mg/kg和IOmg/ kg qd 的剂量，分别观察到 49% (ρ = 0. 004)和 58% 的 TGI (ρ = 0. 004)。当间断(3+/4_χ4 周期或7+/7-Χ2周期)给药化合物(1) (10mg/kg)时，与连续每日给药相比较，抗肿瘤活性 降低(TGI分别为32%和41%)。在AsPCl胰腺模型中，与赋形剂对照相比较，以90mg/kg q3d给药的吉西他滨表现出非常少的抗肿瘤活性，TGI仅为39% (ρ = 0. 016)。相反，当 化合物(1)与吉西他滨组合同时施用时，观察到对抗肿瘤活性的增强的作用，具有77%的 TGI (ρ ( 0. 001)。这一结果与吉西他滨单一治疗组相比是生物学显著性和统计学显著性的 (P = 0.005)，但与化合物(1)单一治疗组相比不是(ρ = 0.251)。在每周顺序组合组中， 尽管在化合物(1)之前施用吉西他滨对AsPCl肿瘤生长的抑制优于相反顺序，(58% TGI, P^O. 001相对于37%，ρ = 0. 012)，但是结果都不是生物学显著的。在两周顺序组合组中， 在化合物(1)之前施用吉西他滨对AsPCl肿瘤生长的抑制同样优于相反顺序，然而，在这一 情形中，抗肿瘤活性是生物学显著的，70% TGI (ρ ^ 0. 001)相对于55% TGI (p ^ 0. 001)。 在停止治疗后监测AsPCl肿瘤生长持续11天(至第48天)。在第48天，所有组的TGI值 低于第37天的，这表明AsPCl肿瘤在治疗后继续生长。与在MiaPaCa2和AsPCl胰腺异种移植物模型中缺少由化合物(1)单一治疗引 发的强肿瘤生长抑制相反，BxPC3胰腺异种移植物模型对化合物(1)介导的生长抑制敏 感。与赋形剂对照相比较，施用3mg/kg和10mg/kg的化合物(1)以剂量依赖性方式显著 抑制BxPC3肿瘤生长(生物学和统计学上)，分别具有72% (ρ <0.001)和82%的TGI (ρ <0. 001)。相似地，大部分间断给药组也产生统计学和生物学显著的肿瘤生长抑制，尽管观 察到缺少剂量响应。当化合物(1)使用7+/7_时间表给药时，与赋形剂治疗的对照小鼠相 比较，10mg/kg 和 20mg/kg 的剂量分别产生 74% (ρ ( 0. 001)和 63% 的 TGI (ρ = 0. 002)。 化合物(1)还使用3+/4_时间表给药，其中10mg/kg，23mg/kg，和30mg/kg的剂量分别抑制 肿瘤生长56% (ρ = 0. 002), 64% (ρ < 0. 001)，和50% (ρ = 0. 024)。在治疗停止后监测 BxPC3肿瘤生长持续15天(至第50天)。在第50天，每日给药组的TGI值与第35天的相 似，这表明化合物(1)在BxPC3胰腺模型中引发持续的肿瘤生长抑制。Notch信号传导途径已经参与胰腺癌的发病机理。在本研究中，对携带sc建立的 MiaPaca2，AsPCl或BxPC3胰腺肿瘤的小鼠每日口服施用单独的或与吉西他滨组合的、分 泌酶抑制剂(化合物1)至多4周。在所述三种胰腺肿瘤模型中的一种中，作为单一治疗的 化合物(1)引发生物学显著的抗肿瘤活性(由NCI > 60% TGI定义)。BxPC3模型对化合物 (1)介导的生长抑制敏感，不管化合物是每日施用的还是使用7+/7_或3+/4_时间表间断 施用的。当化合物(1)每日给药时，肿瘤生长抑制的程度取决于剂量，而当以间断时间表给 药时，抗肿瘤活性似乎不依赖于剂量。当比较按照不同给药时间表每月给予的药物总量时， 每日给药产生较好的功效。例如，当总的月剂量280mg/kg分成qd给予10mg/kg、7+/7_给 予10mg/kg、或3+/4_给予23mg/kg的时间表时，每日给药的抗肿瘤活性是较好的(分别为 82%相对于63%或64%的TGI)。在停止治疗后监测BxPC3肿瘤生长持续15天，在这一时 间过程中，每日给药组的TGI值保持稳定，这表明化合物(1)在BxPC3胰腺模型中引发持续的肿瘤生长抑制。尽管化合物(1)作为单一治疗在MiaPaCa2或AsPCl胰腺肿瘤模型中不产生生物 学显著的功效，但是当在AsPCl模型中组合给予时，其的确增强吉西他滨的抗肿瘤活性。 10mg/kg qd化合物(1)加同时q3d给予的90mg/kg吉西他滨的组合产生77%的TGI，而化 合物(1)或吉西他滨单一治疗分别产生58%或39%的TGI。当化合物(1)和吉西他滨组合 顺序给予而不是同时给予时，仅在化合物(1)之前给予吉西他滨的两周顺序组合产生生物 学显著的肿瘤生长抑制，观察到70%的TGI。另一方面，当这两种药物以相反顺序给予时， 仅观察到55%的TGI。尽管BxPC3，MiaPaca2，和AsPCl胰腺肿瘤模型在其Notch受体、配体、和下游靶 标的表达中是不同的，没有明显的区别可能易于与其对Y分泌酶抑制剂的敏感性相关。 例如，所有三种细胞系表达低水平的Notch-1，BxPC3和AsPCl表达低水平的Notch_2，而 MiaPaca2表达非常高水平的Notch_2，并且还是表达Notch 3和4的唯一的细胞系[12]。 所有三种细胞系表达配体Jagged-Ι，其中AsPCl细胞表达最高水平，其次是BxPC3，并且 MiaPaca2表达最低水平。配体Jagged_2和δ-1在BxPC3和MiaPaca2细胞中表达，但不在 AsPCl细胞中表达[12]。尽管在参考文献中存在一些数据表明激活K-Ras中的突变可以与 转化细胞中的Notch协作，但是在本研究中，对g分泌酶介导的生长抑制敏感的唯一的肿瘤 模型关于K-Ras是野生型的(BxPC3)。在本体内研究中，表明化合物(1)在一些胰腺肿瘤模型中作为单一治疗或与吉西 他滨组合可以有效地抑制肿瘤生长，然而，对模型之间不同敏感性的机制的理解还很少。尽管已经描述了多个本发明的实施方案，明显的是，可以在不背离本发明的精神 和范围的条件下改变基本结构，从而提供利用本发明的其它实施方案。所有这样的修改和 改变意欲被包含在本发明的范围内，本发明的范围是在后附的权利要求中限定的，而不是 在通过举例方式描述的具体实施方案中限定的。
权利要求
化合物(1)或其药用盐用于制备治疗癌症特别是实体瘤的药物的应用。FPA00001178459900011.tif
2.根据权利要求1所述的应用，其中所述治疗包括施用约400ng-hr/ml-约 9000ng-hr/ml的治疗有效量的化合物(1)。
3.根据权利要求2所述的应用，其中所述化合物(1)的治疗有效量为约llOOng-hr/ ml-约 4100ng-hr/mlo
4.根据权利要求3所述的应用，其中所述化合物(1)的治疗有效量为约1380ng-hr/ ml-约 2330ng-hr/mlo
5.根据权利要求2所述的应用，其中所述化合物(1)的治疗有效量为约400ng-hr/ ml-约9000ng-hr/ml，其在至多约21天的时期内施用。
6.根据权利要求3所述的应用，其中所述化合物(1)的治疗有效量为约llOOng-hr/ ml-约4100ng-hr/ml，其在至多约21天的时期内施用。
7.根据权利要求4所述的应用，其中所述化合物(1)的治疗有效量为约1380ng-hr/ ml-约2330ng-hr/ml，其在至多约21天的时期内施用。
8.根据权利要求1所述的应用，其中化合物(1)在21天周期中的第1，2，3，8，9和10 天每天施用一次。
9.根据权利要求8所述的应用，其中化合物(1)在21天周期中的第1，2，3，8，9和10 天以约400ng-hr/ml-约9000ng_hr/ml的量每天施用一次。
10.根据权利要求1所述的应用，其中化合物(1)在21天周期中的第1-7天每天施用一次。
11.根据权利要求10所述的应用，其中化合物(1)在21天周期的第1-7天以约 400ng-hr/ml-约 9000ng_hr/ml 的量每天施用一次。
12.根据权利要求1所述的应用，其中化合物(1)以药物口服单位剂型存在。
13.根据权利要求1所述的应用，其包括另外对患者进行放射治疗。
14.式(1)的化合物 或其药用盐用于制备治疗癌症特别是实体瘤的药物的应用，其中所述治疗包括在21 天周期中的第1，2，3，8，9和10天以约400ng-hr/ml-约9000ng_hr/ml的量每天施用化合 物⑴一次。
15.式(1)的化合物 或其药用盐用于制备治疗癌症特别是实体瘤的药物的应用，其中所述治疗包括在21 天周期中的第1-7天以约400ng-hr/ml-约9000ng-hr/ml的量每天施用化合物(1) 一次。
16.用于制备目的是用于治疗癌症特别是实体瘤的药物的方法，所述方法特征在于，以
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述化合物(1)的治疗有效量为约400ng-hr/ ml-约 9000ng-hr/ml。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述化合物(1)的治疗有效量为约llOOng-hr/ ml-约 4100ng-hr/mlo
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述化合物(1)的治疗有效量为约1380ng-hr/ml-约 2330ng-hr/mlo
20.根据权利要求17所述的方法，其中所述化合物(1)的治疗有效量为约400ng-hr/ ml-约9000ng-hr/ml，其在至多约21天的时期内施用。
21.根据权利要求18所述的方法，其中所述化合物(1)的治疗有效量为约llOOng-hr/ ml-约4100ng-hr/ml，其在至多约21天的时期内施用。
22.根据权利要求19所述的方法，其中所述化合物(1)的治疗有效量为约1380ng-hr/ ml-约2330ng-hr/ml，其在至多约21天的时期内施用。
23.根据权利要求16所述的方法，其中化合物(1)在21天的周期中的第1，2，3，8，9和 10天每天施用一次。
24.根据权利要求23所述的方法，其中化合物(1)在21天周期中的第1，2，3，8，9和 10天以约400ng-hr/ml-约9000ng_hr/ml的量每天施用一次。
25.根据权利要求16所述的方法，其中化合物(1)在21天周期中的第1-7天每天施用一次。
26.根据权利要求25所述的方法，其中化合物(1)在21天周期中的第1-7天以约 400ng-hr/ml-约 9000ng_hr/ml 的量每天施用一次。
27.根据权利要求16所述的方法，其中化合物(1)以药物口服单位剂型存在。
28.根据权利要求16所述的方法，其包括另外使患者进行放射治疗。
29.用于制备目的用于治疗癌症特别是实体瘤的药物的方法，其特征在于，式(1)的化合物 或其药用盐，在21天周期中的第1，2，3，8，9和10天以约400ng-hr/ml-约9000ng-hr/ ml的量每天使用一次。
30.用于制备目的用于治疗癌症特别是实体瘤的药物的方法，其特征在于，式(1)的化合物 或其药用盐，在21天周期中的第1-7天以约400ng-hr/ml-约9000ng-hr/ml的量每天使用一次。
31. 一种试剂盒，其包括一种以上口服单位剂型，每一单位包含约3mg-约300mg化合物 (1)，或其药用盐，所述化合物(1)具有下式
32.权利要求31的试剂盒，其中所述口服单位剂型包含足够数量的单位，使得足以可 以在约21天的时期内每天给患者施用约300mg的化合物(1)、或其药用盐。
33.根据权利要求1-30中任一项所述的方法和应用，其中所述化合物(1)与治疗有效 量的吉西他滨组合使用。
34.根据权利要求33所述的方法和应用，其用于治疗胰腺癌。
35.基本如前文所述的新型方法和应用。
全文摘要
本发明提供一种治疗癌症患者的方法，所述方法包括给所述患者施用治疗有效量的化合物(1)，或其药用盐，该化合物(1)具有下式本发明还提供包含上述化合物的试剂盒，以及化合物(1)用于制备治疗癌症的药物的应用，所述药物按照本文具体公开的剂量和时间表治疗癌症。
文档编号A61K31/55GK101909633SQ200980101733
公开日2010年12月8日 申请日期2009年1月5日 优先权日2008年1月11日
发明者凯瑟琳·E·帕克曼, 约翰·弗雷德里克·博伊兰, 莱奥波尔多·拉多里斯·卢斯特罗三世 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司
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