基于微流控芯片的贴壁细胞划痕制作及迁移观测方法

基于微流控芯片的贴壁细胞划痕制作及迁移观测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于微流控芯片的贴壁细胞划痕制作及迀移观测方法，该贴壁细胞典型地是血管平滑肌细胞。
【背景技术】
[0002]在动脉粥样硬化以及医源性血管损伤(血管成形术、支架植入、器官移植等)并发症形成过程中，血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，简称VSMC)增殖并向内膜迀移是核心机制之一。影响VSMC迀移的因素很多，包括各种生长因子、趋化因子、流体应力等。为探索多因素介导VSMC迀移的机制，重复性好、可信度高的研宄方法是十分必要的。
[0003]传统研宄VSMC迀移主要依赖于细胞趋化小室(Boyden Chamber)和细胞划痕法等经典技术。
[0004]对于细胞趋化小室技术，是以8 μπι孔径滤膜为界，将VSMC接种至上层小室，下室加入不同诱导物，于不同时间点取出滤膜用棉拭子擦掉膜正面的细胞后，膜用甲醇固定，苏木精染色，在显微镜下计数膜背面视野中的细胞数。同时可以在电镜下观察VSMC跨过膜孔的过程。
[0005]对于细胞划痕技术，是在孔板上，当VSMC生长形成融合性的单层时用无菌移液枪头或刀片刮除一定范围的细胞，观察细胞向刮除细胞区的迀移运动。一般以某一细胞群的最大迀移距离为参数表征VSMC迀移能力，同时计数迀移的细胞数。
[0006]然而，在实现本发明的过程中，申请人发现上述VSMS迀移技术存在如下技术缺陷:
[0007](I)现有的VSMC迀移环境，细胞趋化小室技术中，趋化小室的孔径约为1_ ;细胞划痕技术中，实验在多孔板上操作，最小孔径也是毫米级。在这两种技术中，细胞所处的环境都是开放的，而且相对于体内血管壁的微小尺寸和营养物质的代谢形式，差异十分明显，客观上难以真实反映生理状态VSMC的生物学特征。因此需要能更好地模拟活体血管壁微环境的细胞迀移装置；
[0008](2)上述细胞趋化小室技术，不能直接观察细胞的形态及位移，丢失迀移机制的细节，同时不能区分不同干预之间细胞贴壁、铺展、迀移的差异；
[0009](3)上述细胞划痕技术，其划痕速度和尺寸一致性较差；其次在划痕过程中，细胞受到机械性损伤，并释放细胞内容物于周围环境，由于细胞损伤程度不可控，导致迀移结果呈现多样性。

【发明内容】

[0010](一)要解决的技术问题
[0011]鉴于上述技术问题，本发明提供了一种基于微流控芯片的贴壁细胞划痕制作及迀移观测方法，以更好的模拟活体血管壁微环境，更准确的观察细胞的迀移情况。
[0012](二)技术方案
[0013]根据本发明的一个方面，提供了一种基于微流控芯片的贴壁细胞划痕制作方法。该微流控芯片中具有“Y”型结构的微沟道，包括:一主沟道；以及位于该主沟道的一侧并与该主沟道连通的两从沟道，其中，主沟道一侧连接至细胞入口，两从沟道分别连接至第一液滴入口和第二液滴入口，且细胞入口、第一液滴入口和第二液滴入口均高于微沟道所在位置。该贴壁细胞划痕制作方法包括:步骤A:在微流控芯片的微沟道内采用该贴壁细胞对应的完全培养基进行片上贴壁细胞培养；步骤B:将微流控芯片的细胞入口、第一液滴入口和第二液滴入口的溶液全部吸净；步骤C:向微流控芯片的第一液滴入口和第二液滴入口同时、分别注入该贴壁细胞对应的完全培养基和胰蛋白酶溶液；步骤D:静置预设时间；以及步骤E:按顺序从细胞入口、第二液滴入口、第一液滴入口吸净溶液，从而在微流控芯片微沟道的底壁上形成划痕。
[0014]根据本发明的另一个方面，还提供了一种贴壁细胞划痕制作方法的贴壁细胞迀移观测方法。该贴壁细胞迀移观测方法包括:对微流控芯片的微沟道进行表面修饰，以使该微沟道适宜贴壁细胞生长；在微流控芯片的微沟道内进行片上贴壁细胞接种；在微流控芯片的微沟道内进行片上贴壁细胞培养及同步化处理；采用上述的贴壁细胞划痕制作方法制作划痕；在细胞入口和两液滴入口任意其中之一加入含有细胞迀移因子的DMEM，然后把微流控芯片放回培养箱；以及在预设时间之后，对微流控芯片的微沟道内的贴壁细胞进行片上染色，以表征迀移细胞和未迀移细胞。
[0015](三)有益效果
[0016]从上述技术方案可以看出，本发明基于微流控芯片的贴壁细胞划痕制作及迀移观测方法具有以下有益效果:
[0017](I)将微流控技术与传统VSMC迀移技术相结合，在微米级的沟道中实现衬底修饰、VSMC片上培养、VSMC划痕迀移和VSMC染色，为VSMC体外迀移提供更接近生理环境的方法，同时降低了实验成本；
[0018](2)与已经报道依赖于细胞趋化小室的方法相比，本发明可以通过显微镜直观细胞迀移，示踪单细胞，以及量化迀移参数后进行染色，获得的信息量更全面；
[0019](3)与已经报道的传统划痕方法相比，基于重力作用实现细胞划痕，规范了操作标准，减少人为误差，提高了划痕尺寸及细胞受损情况的可重复性、一致性，使结果可比拟。
【附图说明】
[0020]图1为本发明实施例中所设计的微流控芯片形成划痕的原理图；
[0021]图2A和图2B分别为根据本发明实施例贴壁细胞划痕制作方法所采用的微流控芯片的俯视图及侧视图；
[0022]图3为根据本发明实施例中所采用的微流控芯片的制作过程的示意图；
[0023]图4为根据本发明实施例贴壁细胞划痕制作方法的流程图；
[0024]图5为根据本发明实施例贴壁细胞迀移观测方法的流程图；
[0025]图6为培养至微沟道内充满单层VSMC后微沟道内细胞状态的示意图和真实显微图像；
[0026]图7为制作划痕和记录划痕状态后微沟道内细胞状态的示意图和真实显微图像；
[0027]图8为染色步骤后微沟道内细胞状态的示意图和真实显微图像。
【具体实施方式】
[0028]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。需要说明的是，在附图或说明书描述中，相似或相同的部分都使用相同的图号。附图中未绘示或描述的实现方式，为所属技术领域中普通技术人员所知的形式。另外，虽然本文可提供包含特定值的参数的示范，但应了解，参数无需确切等于相应的值，而是可在可接受的误差容限或设计约束内近似于相应的值。实施例中提到的方向用语，例如“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”等，仅是参考附图的方向。因此，使用的方向用语是用来说明并非用来限制本发明的保护范围。
[0029]本发明将微流控技术与传统贴壁细胞迀移技术相结合，在微流控技术中实现基于重力作用的衬底修饰、贴壁细胞片上培养、染色，以及基于层流原理的划痕制作，并利用显微镜观察迀移。所谓的层流是指管道内流速较低时流体呈层状流动的一种流动状态。
[0030]图1为本发明实施例中所设计的微流控芯片形成划痕的原理图。如图1所示，在一个Y型沟道里，若在两个入口注入不同的溶液，只要液体流速够低，主沟道内的两种液体就不会发生混合，而是分层流动。利用这个原理，在两个入口分别通入Trypsin和含有血清的培养基，即可在主沟道内Trypsin流经的区域形成划痕。
[0031]在本发明的一个示例性实施例中，提供了一种基于微流控芯片的贴壁细胞划痕制作方法。首先，对本实施例所采用的微流控芯片进行详细说明。
[0032]图2A和图2B分别为根据本发明实施例贴壁细胞划痕制作方法所采用的微流控芯片的俯视图及主视图。请参照图2A和图2B，该微流控芯片中的微沟道呈Y型结构，包括一主沟道；以及位于该主沟道的一侧并与该主沟道连通的两从沟道。其中，主沟道的长度为3mm，宽度为800 μ m。两从沟道的长度为4mm，宽度为400 μ m。该主沟道和从沟道的横截面形状均为矩形，高度约为100 μ m。每个沟道端口各有一个开口，主沟道一侧连接至细胞入口，从沟道一侧连接至两液滴入口 -第一液滴入口和第二液滴入口，各个入口孔径为5mm。并且，该细胞入口、第一液滴入口和第二液滴入口均高出主沟道和两从沟道顶部约8_。
[0033]以下简单介绍该微流控芯片的制作过程。如图3所示，该微流控芯片的制作过程如下:
[0034]步骤S202:光刻胶SU8-5制作种子层:
[0035]载玻片在丙酮、乙醇和去离子水中依次清洗，烘干后表面均匀旋转涂敷一层SU
8-5，曝光形成种子层，见图3中子图A。
[0036]步骤S204:光刻胶SU8-2100制作阳模:
[0037]种子层上再均匀旋转涂敷一层SU 8-2100，放上掩模版曝光，见图3中子图B ;显影、坚膜得到细胞迀移微沟道阳模，见图3中子图C。
[00 38]步骤S206:PDMS的浇注、翻模、键合柱子、打孔并与玻璃基底键合:
[0039]细胞迀移微沟道阳模饶注聚二甲基娃氧烧(polydimethylsiloxane，简称PDMS)固化、翻模得到细胞迀移微沟道的PDMS翻模，见图3中子图D、E ;与PDMS柱子键合，见图3中子图F ;在细胞迀移微沟道两端打孔后，见图3中子图G ;键合PDMS与玻璃基底，完成芯片制作，见图3中子图H。
[0040]如图4所示，基于上述的微流控芯片，本实施例贴壁细胞划痕制作方法包括:
[0041]步骤S302:在微流控芯片的微沟道内采用完全培养墓DMEM进行片上VSMC培养；
[0042]该完全培养基中含杜尔伯科改良伊戈尔培养基(Dulbecco Modified EagleMedium，简称DMEM) 90 %，含胎牛血清10 %，下文中将完全培养基简称为DMEM。
[0043]步骤S304:用移液枪把细胞入口和两个液滴入口的溶液全部吸净；
[0044]步骤S306:用多道移液枪中的两移液通道分别吸取120 μ I DMEM溶液和120 μ I胰蛋白酶(Trypsin)溶液，对准微流控芯片的两个液滴入口，分别并同时注入两种溶液，其中，第一液滴入口注入DMEM溶液，第二液滴入口注入Trypsin溶液；
[0045]其中，注入微流控芯片的两个液滴入口的DMEM和Trypsin需要满足一定的温度，这就需要将从冰箱中取出新鲜DMEM和0.25%胰蛋白酶(Trypsin)采用水浴锅进行预热。
[0046]本实施例中，贴壁细胞为VSMC，因此，注入两个液滴入口的为DMEM和Trypsin溶液，而对于其他的贴壁细胞而言，注入液滴入口的应当为其他细胞所用的完全培养基和Trypsin 溶液。
[0047]步骤S308:静置等待2min ；
[0048]其中，静置的时间可以根据微沟道尺寸和液体流速等因素设定。本实施例中，鉴于上文提及的微沟道，利用重力使液体在微沟道内流动，形成稳定的层流的时间约为5min。因此，本步骤中的静置时间一般不超过5min。
[0049]步骤S310:按顺序从细胞入口、第二液滴入口、第一液滴入口吸净溶液，至此在微流控芯片微沟道的底壁上，便可形成划痕。
[0050]采用本实施例方法制作的划痕的示意图如图7中子图A所示，显微镜图如图7中子图B所示。可见，采用本实施例方法很好地形成了划痕。
[0051]需要说明的是，若经过上述S304、S306、S308、S310步骤后，没有形成清晰地划痕，可以重复这四个步骤，直至划痕清晰为止。
[0052]至此，本实施例贴壁细胞划痕制作方法介绍完毕。
[0053]在本发明的另一个示例性实施例中，还提供了一种基于上述实施例贴壁细胞划痕制作方法的贴壁细胞迀移观测方法。如图5所示，本实施例贴壁细胞迀移观测方法包括:
[0054]步骤S402:对微流控芯片的微沟道进行表面修饰，以使该微沟道适宜VSMC生长；
[0055]该对微流控芯片的微沟道进行表面修饰的步骤具体包括:
[0056]子步骤S402a:对微流控芯片进行紫外照射灭菌；
[0057]子步骤S402b:用移液枪对准微沟道的细胞入口，向微沟道内打满磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，简称PBS)，再用PBS填满细胞入口和两个液滴入口，使微沟道和各个入口被完全浸润；
[0058]为了保证后续加入其他试剂时，试剂会依靠重力作用流入沟道，本实施例加入PBS后会静置至少I小时，使微沟道内亲水性能良好。
[0059]子步骤S402c:将细胞入口、两液滴入口中PBS全部吸出；
[0060]子步骤S402d:用多道移液枪中的两移液通道分别同时吸取120 μ I含有修饰分子的溶液，分别对准两个液滴入口，打出溶液，使溶液依靠重力作用流入微沟道；根据实验需要，静置一段时间，使溶液中的修饰分子沉降于微沟道底面，形成修饰层。
[0061]子步骤S402e:再利用上述子步骤S402c?S402d同样的方法，将微沟道内修饰溶液更换为DMEM，静置过夜，以便于后期VSMC的接种。
[0062]步骤S404:在微流控芯片的微沟道内进行片上VSMC接种；
[0063]将贴壁细胞悬液调整浓度至5 X 16个/ml，吸出细胞入口和两个液滴入口的DMEM，用两把移液枪-细胞入口侧用普通移液枪，液滴入口侧用多道移液枪，分别吸取VSMC悬液，液滴入口侧25 μ I，细胞入口侧30 μ 1，同时注入VSMC悬液，静置5min，直至各个入口液面平衡。平衡后将芯片放于显微镜下观察记录接种的密度和均匀程度等情况。
[0064]步骤S406:在微流控芯片的微沟道内进行片上VSMC培养及同步化处理；
[0065]本实施例中，每间隔24小时，就用移液枪吸出细胞入口和每个液滴入口处的DMEM，并用移液枪在各个入口 -细胞入口和两液滴入口，同时滴入60 μ I新鲜DMEM，为VSMC提供必要的营养物质。同时加入相同液量DMEM的目的是消除微沟道两端液面差，保证微沟道内没有液体流动，即VSMC不会被流体剪切力作用而影响生长。
[0066]培养至微沟道内充满单层VSMC后，细胞状态示意图见图6中子图A所示，显微图像见图6中子图B所示。细胞长满微沟道后，改用无血清DMEM培养24小时以期对VSMC同步化处理。
[0067]步骤S408:在微流控芯片的微沟道内进行片上VSMC划痕制作；
[0068]该片上VSMC划痕迀移的方法与上一实施例的相关内容相同，具体包括:
[0069]子步骤S408a:在微流控芯片的微沟道内采用完全培养基DMEM进行片上VSMC培养;
[0070]该完全培养基中含杜尔伯科改良伊戈尔培养基(Dulbecco Modified EagleMedium，简称DMEM) 90 %，含胎牛血清10 %，下文中将完全培养基简称为DMEM。
[0071]子步骤S408b:用移液枪把细胞入口和两个液滴入口的溶液全部吸净；
[0072]子步骤S408c:用多道移液枪中的两移液通道分别同时吸取120 μ I DMEM溶液和120μ1胰蛋白酶(Trypsin)溶液，对准微流控芯片的两个液滴入口，分别并同时注入两种溶液，其中，第一液滴入口注入DMEM溶液，第二液滴入口注入Trypsin溶液；
[0073]其中，注入微流控芯片的两个液滴入口的DMEM和Trypsin需要满足一定的温度，这就需要将从冰箱中取出新鲜DMEM和0.25%胰蛋白酶(Trypsin)采用水浴锅进行预热。
[0074]本实施例中，贴壁细胞为VSMC，因此，注入两个液滴入口的为DMEM和Trypsin溶液，而对于其他的贴壁细胞而言，注入液滴入口的应当为其他细胞所用的完全培养基和Trypsin 溶液。
[0075]步骤S408d:静置等待2min ；
[0076]其中，静置的时间可以根据微沟道尺寸和液体流速等因素设定。本实施例中，鉴于上文提及的微沟道，该静置时间一般不超过5min。
[0077]步骤S408e，按顺序从细胞入口、第二液滴入口、第一液滴入口吸净溶液，从而在微流控芯片微沟道的底壁上形成划痕。
[0078]采用本实施例方法制作的划痕的示意图如图7中子图A所示，显微镜图如图7中子图B所示。可见，采用本实施例方法很好地形成了划痕。
[0079]步骤S410:在细胞入口和两液滴入口任意其中之一加入含有细胞迀移因子的DMEM，然后把微流控芯片放回培养箱。
[0080]按实验需要，拍照记录细胞迀移的状态(示意图见图7中子图C，显微图见图7中子图D)。
[0081]由于细胞迀移结果的记录，使用显微镜拍照记录的。所以实验者可以在任意想观察迀移的时间节点，把芯片从培养箱中取出进行拍照观察。并且，对于所记录的实验结果，还可以用传统方法所用的图像处理等任何方法进行分析处理。
[0082]步骤S412，在微流控芯片的微沟道内的进行片上VSMC染色，以表征迀移细胞和未迀移细胞。
[0083]该片上VSMS染色具体为:划痕后24小时，对微沟道内的VSMC进行α肌动蛋白(α-actin)的细胞免疫染色，以表征迀移细胞和未迀移细胞。
[0084]a -actin是鉴别平滑肌细胞的特异蛋白，在处于合成型的平滑肌细胞内表达量要高于收缩型的平滑肌细胞。而正在迀移的平滑肌细胞正是合成型细胞，未迀移的平滑肌细胞是收缩型细胞。所以，a-actin染色可以用来表征迀移与未迀移的细胞，其染色步骤与参数包括:
[0085]染色子步骤S410a:4%多 聚甲醛固定15min ；
[0086]染色子步骤S410b:用甲醇配置3%的过氧化氢封闭液，封闭15min ;
[0087]染色子步骤S410c:用PBS配置0.3%的曲拉通X-100透膜液透膜15min ；
[0088]染色子步骤S410d:用PBS配置10%山羊血清，37°C孵育60min ；
[0089]染色子步骤S410e:—抗:PBS = 1: 100，37°C孵育一抗 60min ；
[0090]染色子步骤S410f:37°C孵育二抗60min ；
[0091]染色子步骤S410g:二氨基联苯胺四盐酸显色5min。
[0092]上述染色子步骤S410a_S410g，本有以下两点关键说明:
[0093]说明1:上述每一染色子步骤均依靠重力作用实现。每一染色子步骤换液时的方法为:先吸出细胞入口和两个液滴出入口中所有溶液，再用多道移液枪吸取目标溶液20 μ I对准两个液滴入口，普通移液枪吸取目标溶液40 μ I对准细胞入口，同时滴入并稳定2min，如图8中子图A所示。再重复上述步骤，吸出孔内溶液复加一次。，其中染色子步骤5复加两次，保证所加试剂的浓度不被稀释。染色后VSMC细胞的显微镜图如图8中子图B所不O
[0094]说明2:除染色子步骤5之外，其他每一染色子步骤进行之前均用PBS溶液冲洗。其中染色子步骤6之前冲洗3次，其余冲洗2次。冲洗方法是用说明I中所述换液方法，每次冲洗静置5min。
[0095]免疫染色是细胞染色中较为复杂的染色方法，VSMC在染色前和染色后形态上基本没有变化，因此，本实施例还可以用在有关VSMC的其他很多种染色。
[0096]本实施例中，细胞划痕后，进行a-actin免疫染色，可以观察到迀移VSMC与未迀移VSMC显色程度不同。
[0097]至此，已经结合附图对本实施例进行了详细描述。依据以上描述，本领域技术人员应当对本发明基于微流控芯片的贴壁细胞划痕制作及迀移观测方法有了清楚的认识。
[0098]此外，上述对各元件和方法的定义并不仅限于实施例中提到的各种具体结构、形状或方式，本领域普通技术人员可对其进行简单地更改或替换，例如:
[0099](I)细胞迀移微沟道剖面矩形的宽度可以介于数百微米至数个毫米之内，高度可以介于数十微米至数百微米之内；
[0100](2)细胞接种的密度不局限于5X 16个/ml，可以用任意实验需求的细胞密度来代替；
[0101](3) VSMC培养过程中，换液时间不局限于24小时，可以为实验需要的任意时间间隔；
[0102](4)细胞划痕后，从液滴入口处还可以加入其他干预因素，以观察其对细胞迀移的影响，例如，无血清DMEM、血小板衍生生长因子、肿瘤坏因子-α、转化生长因子-β等；
[0103](5)迀移与未迀移VSMC的区别染色可以用其他任何实验需要的染色来代替a -actin的细胞免疫染色，如:骨桥蛋白免疫染色、calponin染色等；
[0104](6)上述实施例均以VSMC为例进行说明，但本发明并不以此为限，任何贴壁细胞，均可以采用本发明的方法进行划痕迀移，此处不再重述。
[0105]综上所述，本发明将微流控芯片技术与传统VSMC迀移技术结合，在体外一定程度上模拟VSMC的微环境。此外，本发明不需要使用注射泵和导管，基于重力法完成片上VSMC划痕的全过程，规范了实验操作，降低了实验成本。
[0106]以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种基于微流控芯片的贴壁细胞划痕制作方法，其特征在于: 所述微流控芯片中具有“Y”型结构的微沟道，包括:一主沟道；以及位于该主沟道的一侧并与该主沟道连通的两从沟道，其中，主沟道连接至细胞入口，两从沟道分别连接至第一液滴入口和第二液滴入口，且细胞入口、第一液滴入口和第二液滴入口均高于所述微沟道所在位置； 该贴壁细胞划痕制作方法包括: 步骤A:在微流控芯片的微沟道内采用该贴壁细胞对应的完全培养基进行片上贴壁细胞培养； 步骤B:将微流控芯片的细胞入口、第一液滴入口和第二液滴入口的溶液全部吸净；步骤C:向微流控芯片的第一液滴入口和第二液滴入口同时、分别注入该贴壁细胞对应的完全培养基和胰蛋白酶溶液； 步骤D:静置预设时间；以及 步骤E:按顺序从细胞入口、第二液滴入口、第一液滴入口吸净溶液，从而在微流控芯片微沟道的底壁上形成划痕。2.根据权利要求1所述的贴壁细胞划痕制作方法，其特征在于，所述步骤E中，从细胞入口、第二液滴入口、第一液滴入口吸净溶液的操作时间小于层流维持时间。3.根据权利要求1所述的贴壁细胞划痕制作方法，其特征在于，所述步骤C包括: 采用多道移液枪中的两移液通道分别吸取该贴壁细胞对应的完全培养基和胰蛋白酶溶液； 将多道移液枪中的两移液通道分别对准微流控芯片的第一液滴入口和第二液滴入口，分别并同时注入该贴壁细胞对应的完全培养基和胰蛋白酶溶液。4.根据权利要求1所述的贴壁细胞划痕制作方法，其特征在于，所述步骤B中，采用移液枪将微流控芯片的细胞入口、第一液滴入口和第二液滴入口的溶液全部吸净。5.根据权利要求1所述的贴壁细胞划痕制作方法，其特征在于，所述贴壁细胞为血管平滑肌细胞，该血管平滑肌细胞对应的完全培养基为DMEM溶液。6.根据权利要求1所述的贴壁细胞划痕制作方法，其特征在于，所述微流控芯片由聚二甲基硅氧烷和玻璃基底制备； 所述微流控芯片中，主沟道的长度为3_，所述两从沟道的长度为4_ ;所述主沟道和从沟道的横截面均为矩形；所述主沟道的宽度为800 μ m，高度为100 μ m ;所述从沟道的宽度为400 μ m，高度为100 μ m ;并且，所述细胞入口、第一液滴入口和第二液滴入口的孔径均为5mm，三者高出所述微沟道顶部8mm。7.根据权利要求6所述的贴壁细胞划痕制作方法，其特征在于，所述步骤D中，静置的预设时间不超过5min。8.一种基于权利要求1至7中任一项所述的贴壁细胞划痕制作方法的贴壁细胞迀移观测方法，其特征在于，包括: 对微流控芯片的微沟道进行表面修饰，以使该微沟道适宜所述贴壁细胞生长； 在微流控芯片的微沟道内进行片上贴壁细胞接种； 在微流控芯片的微沟道内进行片上贴壁细胞培养及同步化处理； 采用权利要求1至8中任一项所述的贴壁细胞划痕制作方法制作划痕； 在细胞入口和两液滴入口任意其中之一加入含有细胞迀移因子的DMEM，然后把微流控芯片放回培养箱；以及 在预设时间之后，对微流控芯片的微沟道内的贴壁细胞进行片上染色，以表征迀移细胞和未迀移细胞。9.根据权利要求8所述的贴壁细胞迀移观测方法，其特征在于，所述在微流控芯片的微沟道内进行片上贴壁细胞接种包括: 将贴壁细胞悬液调整至预设浓度； 吸出细胞入口、第一液滴入口和第二液滴入口的该贴壁细胞对应的完全培养基； 同时向细胞入口、第一液滴入口和第二液滴入口注入贴壁细胞悬液，并静置直至细胞入口、第一液滴入口和第二液滴入口的液面平衡。10.根据权利要求8所述的贴壁细胞迀移观测方法，其特征在于，在微流控芯片的微沟道内进行片上贴壁细胞培养包括: 每隔预设时间，吸出细胞入口、第一液滴入口和第二液滴入口的贴壁细胞的完全培养基溶液； 同时向细胞入口、第一液滴入口和第二液滴入口注入等液量新鲜的贴壁细胞的完全培养基溶液，以向贴壁细胞提供营养物质。
【专利摘要】本发明提供了一种基于微流控芯片的贴壁细胞划痕制作及迁移观测方法。该微流控芯片中具有“Y”型结构的微沟道，包括：连通的主沟道和两从沟道，主沟道连接至细胞入口，两从沟道连接至两液滴入口。该贴壁细胞划痕制作包括：在微流控芯片的微沟道内采用该贴壁细胞对应的完全培养基进行片上贴壁细胞培养；将微流控芯片的细胞入口、两液滴入口的溶液全部吸净；向微流控芯片的两液滴入口同时、分别注入该贴壁细胞对应的完全培养基和胰蛋白酶溶液；静置预设时间；按顺序从细胞入口、两液滴入口吸净溶液，从而在微流控芯片微沟道的底壁上形成划痕。本发明为贴壁细胞体外迁移提供更接近生理环境的方法，同时降低了实验成本。
【IPC分类】C12Q1/02, C12M1/00
【公开号】CN104893953
【申请号】CN201510050047
【发明人】陈健, 卫元晨, 陈 峰, 张韬, 陈德勇, 贾鑫, 王军波, 郭伟
【申请人】中国科学院电子学研究所, 中国人民解放军总医院, 北京大学人民医院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年1月30日