一种使用自溶工艺生产好氧型单细胞蛋白的方法

一种使用自溶工艺生产好氧型单细胞蛋白的方法
【专利说明】一种使用自溶工艺生产好氧型单细胞蛋白的方法
[技术领域]
[0001] 本发明涉及单细胞蛋白加工技术领域，特别是涉及一种使用自溶工艺生产好氧型 单细胞蛋白的方法。
[【背景技术】]
[0002] 单细胞蛋白（Single cell protein简称SCP)又称微生物蛋白或菌体蛋白，是利 用工业废水、废气、天然气、石油烷烃类、农副加工产品以及有机废弃物等作为培养基，培养 酵母、非病源性细菌、微型菌、真菌等单细胞生物体，然后经过净化干燥处理后制成，是食品 工业和饲料工业重要的蛋白质来源。单细胞蛋白产品含有丰富的蛋白质，氨基酸的种类齐 全比例适当。单细胞蛋白还含有丰富的脂肪、碳水化合物、核酸、维生素和无机盐，并含有 钙、磷、钾、铁、镁、钠、锰等矿物质元素，还含有多种酶。酵母、酵母水解物在动物饲料中已成 功用于鱼粉蛋白的替代、动物免疫增强、饲料口感的改善等作用。单细胞蛋白中核苷酸及其 衍生物具有非常重要的生理生化功能，主要的功能有：作为RNA和DNA合成的原料；作为代 谢的调节物质；作为辅酶的成分，如辅酶A ;激活糖原和糖蛋白合成的重要中介物，也是磷 脂合成的中介物，活化中间产物；参与遗传信息传递；ATP是生命过程的直接能；AMP调节平 滑肌的收缩性并可调节血流量；核苷酸还可以作为甲基的供体等。
[0003] 由于有害微生物、有害化学物质、重金属等对产品质量安全造成危害的考虑。目前 已经或正在进行产业化开发的单细胞蛋白产品的品种较少，主要集中于安全风险低、来自 于食品工业的产品或副产品作为原料进行单细胞蛋白的培养及生产。如啤酒酵母及酶解啤 酒酵母作为饲料原料在动物上的使用，啤酒在生产时需要达到严格的食品安全标准，由其 产生的有机质副产物和酵母蛋白的生物、化学、物理危害都达到最低，从而为饲料工业的应 用提供可靠的安全保证。
[0004] 发明专利W02009059163A1提供了一种培养单细胞蛋白的方法，培养出来的单细 胞蛋白可用于动物饲料中优质的蛋白源，该技术使用食品或饮料加工厂如啤酒厂产生的废 水作为菌体培养的液体培养基。饮料废水中具有丰富的有机质、氮磷等营养物质，且没有有 害微生物、有毒化学品的污染，虽然对于饮料工厂来说这些废水没有价值，且处理含有机质 和氮磷的废水会付出较大的成本，从微生物培养角度看，废水中的营养物质可以成为营养 丰富的培养基，可以用来生产特定的单细胞蛋白。发明专利W02009059163A1通过调节废水 中各种营养物质的比例、使用经基因改良的细菌可生产出蛋白含量较高、营养价值高的单 细胞蛋白产品，该单细胞蛋白是一种细菌的混合物，主要含有微球菌、芽孢杆菌、硝化细菌、 产碱杆菌属等好氧型细菌。同时，饮料废水在培养微生物后营养物质含量会降低，这降低了 水质污染的程度，该专利技术可以实现高质量蛋白的生产也能将废水中有机物浓度降低至 法定标准以下，从而具有经济和环境保护的双重价值，因此该技术具有非常良好的产业化 前景。由于细菌的生长周期短、养料利用效率高，单细胞蛋白培养的产量非常高，这为产业 化开发提供经济上的保证，但是由于细菌生长的特点，培养时固形物的含量很低，一般会低 于4000mg/L。如果要将单细胞蛋白加工成产品，就需要考虑如何将单细胞蛋白从水中提取 出来并低成本的加工成低水分含量的干品。基于发明专利W02009059163A1中描述的单细 胞蛋白的特性，目前的加工技术具有以下缺陷：
[0005] 1)加工工艺只是将单细胞蛋白当作普通蛋白原料进行生产，只是集中于蛋白的脱 水、干燥、灭菌，是以生产蛋白为目标，未考虑到发明专利W02009059163A1中的细菌可通过 进一步的加工方法生产出高质量的产品；
[0006] 2)发明专利W02009059163A1技术培养出的单细胞蛋白经过研宄发现含有大量内 源酶，具体包括核酸酶、蛋白酶及溶菌酶。这些酶可以分解大分子营养物质，因此使用自溶 技术可以酶解出多种的活性物质，如游离氨基酸、核苷酸、单糖等。但现有的工艺在脱水后 直接干燥及微波灭菌，这就破坏了大部分的内源酶，因此也就不会产生活性物质；
[0007] 3)现有的加工工艺的蛋白质消化率仍然不高，仍有进一步提升的空间；
[0008] 4)单细胞蛋白具有较高含量的核酸，普通工艺干燥处理并未将核酸分解为核苷酸 且仍处于细胞内，而通过一定方法将核酸分解为核苷酸可以使单细胞蛋白应用于动物饲料 时具有诱食及免疫这两个明显的效果，现有工艺没有考虑如何将核酸分解为高价值的核苷 酸。
[0009] 专利号为201410055658. 2的中国专利公开了一种利用生物泥制备单细胞蛋白粉 的方法，是利用生物泥来生产单细胞蛋白（SCP)的资源化回收方法，将生物养殖系统沉淀 排出的生物泥浓缩后，经过离心脱水、热风瞬间烘干、气流快速冷却、微波灭菌后，即可获得 单细胞粗蛋白粉。该专利为本司的在先申请，但由于缺少自溶工序，细胞蛋白利用效率较 低。自溶是指菌体利用自身的内源酶（蛋白酶、核酸酶、溶菌酶等）将菌体内的高分子物质 水解为氨基酸、核苷酸、当糖等小分子的过程。自溶过程是一个较复杂的过程，受多种因素 影响，如细菌种类、水分含量、温度、时间、内源酶种类等。更重要的是在自然条件下，自溶并 不是单一的过程，是生物体在死亡后腐败的前一过程，大分子物质经自溶分解为氨基酸、核 苷酸等营养物质，这为腐败微生物生长提供了重要的营养来源。因此，自溶的结果也因微生 物种类、自溶条件、目标产物等有较大差别，并且自溶失败会导致腐败产物如氨、硫化氢、三 甲胺等产生。
[0010] 专利号为2008800240991及2011102810796两个中国专利公开了将酵母使用自溶 工艺进行处理，生产酵母自溶物，用以提高产品风味。但这两项专利并不适合本专利，该专 利申请采用的原料为厌氧菌，细菌特性与好氧菌差别较大，自溶的方式也有很大差别，比如 厌氧菌自溶的时间更长，需要外添加酶进行促进自溶，厌氧菌自溶对于反应容器、含水率、 PH、温度等都有较多限制，并且产物难以控制，容易产生较高含量的腐败产物。
[
【发明内容】
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[0011] 本发明的目的在于弥补上述的制备单细胞蛋白的不足及缺陷，提供一种高质量、 富含活性成分的使用自溶工艺生产好氧型单细胞蛋白的方法。
[0012] 为了实现上述目的，设计一种使用自溶工艺生产好氧型单细胞蛋白的方法，包括 沉淀浓缩步骤、离心脱水步骤、干燥步骤、灭菌步骤和粉碎包装步骤，将离心脱水步骤后获 得的78%~85%含水率的物料，经过自溶步骤后进行干燥步骤，所述的自溶步骤如下：
[0013] a)自溶设备通过向双螺杆空心桨叶供热进行升温，达到自溶的温度要求，通过设 计及调节与进料速度配套的腔体容积，来达到自溶的时间要求；
[0014] b)所述自溶设备的双螺杆空心桨叶前1/4至1/2分段为加热段，目的是将物料加 热至自溶所需温度，剩余分段为保温段，保持物料自溶温度；
[0015] c)自溶的温度要求为：加热后的物料温度保持在65%~95°C ;
[0016] d)自溶的时间要求为：加热段将物料升温至目标温度的时间应小于30分钟，保温 段的自溶时间应在30分钟~360分钟；
[0017] 所述自溶的物料水分要求为：自溶后物料水分含量应不低于70% ;
[0018] 所述的灭菌步骤采用微波灭菌。
[0019] 所述的加热后的物料温度保持在65%~80°C，自溶时间为1~3小时。
[0020] 所述的具体方法步骤的顺序如下：
[0021] (1).沉淀浓缩：将生物反应器产生的菌体蛋白通过管道排入沉淀浓缩池，菌体蛋 白在锥形的浓缩池底部沉淀，底部物料含水率降低至97%以下，可进行后续脱水工序；
[0022] (2).使用抽料泵将浓缩池底部物料输送至离心脱水设备；
[0023] (3).离心脱水：使用螺旋卧式离心设备进行固液分离，离心后物料含水率降低至 78%~85%，物料呈湿泥状；离心所脱去的水分为菌体蛋白的细胞外水分，胞内水分仍存 留在细胞内，这为细胞内的内源酶进行自溶创造了条件，离心后78%~85%含水率的物料 能进行自溶作用；
[0024] (4).自溶：将离心脱去细胞外水分的物料输送至自溶设备进行自溶处理；
[0025] a)自溶设备通过向双螺杆空心桨叶供热进行升温，达到自溶的温度要求，通过设 计及调节与进料速度配套的腔体容积，来达到自溶的时间要求；
[0026] b)所述自溶设备使用导热油或蒸汽对空心桨叶进行供热；
[0027] c)所述自溶设备的两根双螺杆空心桨叶前1/4至1/2分段为加热段，目的是将物 料加热至自溶所需温度，剩余分段为保温段，保持物料自溶温度；
[0028] d)自溶的温度要求为：加热后的物料温度保持在 65%~95°C ;
[0029] e)自溶的时间要求为：加热段将物料升温至目标温度的时间应小于30分钟，保温 段的自溶时间应在30分钟~360分钟；
[0030] f)所述自溶的物料水分要求为：自溶后物料水分含量应不低于70% ;
[0031] (5).干燥：自溶后的物料通过蛟龙喂料机输送至气流闪蒸干燥设备进行干燥；所 述闪蒸干燥的物料接触温度应低于100°c，所述干燥后的物料的含水率应在10%~40% ;
[0032] (6).灭菌：经干燥后的物料通过气流提升设备输送至隧道式微波干燥灭菌设备 进行灭菌；所述微波灭菌后物料含水率为5%~10% ;
[0033] (7).粉碎包装：灭菌后的物料经粉碎后包装成成品。
[0034] 所述的自溶设备包括：带轮、减速机、传动齿轮、盖板、进料口、加热空心桨叶、保温 空心桨叶、溢流板、排料口、蒸汽进出口、电动机、主机壳体和传动主轴，主机壳体顶部设有 盖板，主机壳体内设有传动主轴，传动主轴上设有双螺杆空心桨叶，盖板上设有进料口，主 机壳体底部设有出料口，主机壳体内靠近出料口设有溢流板，传动主轴一端连接传动齿轮， 传动齿轮与减速机输出端齿轮啮合，减速机输入端通过带轮连接电机输出端，传动主轴另 一端连接蒸汽或导热油进出口，所述的双螺杆空心桨叶前1/4至1/2分段为加热段，剩余分 段为保温段。主机壳体内设有两根传动主轴和两根双螺杆空心桨叶。
[0035] -种采用上述的方法制得的好氧型单细胞蛋白，采用蛋白含量为33% -60%的菌 体蛋白制得的好氧型单细胞蛋白水份含量5. 0% -10. 0% ;蛋白含量33. 0% -60. 0% ;单位 蛋白的游离核苷酸不低于1. 40% ;单位蛋白的游离碱基不高于0. 90% -;游离碱基与游离 核苷酸比值范围应在〇-〇. 60。
[0036] 本发明同现有技术相比，工艺及其制成的产品具有以下优点：
[0037] 1)体现了单细胞蛋白具有内源酶这一情况，充分利用了现有技术中的菌体蛋白中 具有核酸酶、蛋白酶、溶菌酶；
[0038] 2)使用了自溶工艺，自溶过程中自溶酶充分分解大分子营养物及细胞壁，通过自 溶可以产生较高含量的游离氨基酸、游离核苷酸，同时使得细胞壁多糖被分解，使细胞产生 通透性从而确保活性物质可以流出细胞外，从而可以被动物直接吸收利用；
[0039] 3)自溶工艺可不需要菌体蛋白的细胞外水分，内源酶在细胞内的微环境中即可发 挥作用，因此，采用了离心脱水后进行自溶，即可确保自溶的高效率，也可减少在自溶后的 干燥工艺所需去除的水分含量，从而减少了干燥成本；
[0040] 4)使用的自溶设备的升温快、温度易于控制、物料在设备内的停留时间可控，可以 确保菌体蛋白在最适的参数条件下进行自溶；
[0041] 5)使用自溶工艺的产品的消化率进一步提高，干物质表观消化率可从57. 7%提 高到76. 9%，蛋白表观消化率可从66. 4%提高至89. 1% ;
[0042] 6)制成的产品不仅蛋白质量高、且具有多种活性成分、具有多种生理功能的功能 性蛋白饲料原料，生理功能包括：诱食和提高采食量、口感、气味的改善，免疫功能，保肝护 肝，抗应激，防止腹泻，高质量、高效化率的蛋白；在动物生长试验中比未自溶的菌体蛋白具 有更好的表现性能。
[0043] 7)使用新的生产工艺进一步降低了生产的能耗，原因是：a)自溶对干燥前的物料 进行了预加热，提高了干燥前的温度；b)自溶后的菌体蛋白的细胞壁通透性增强，水分及 胞内物质更易流出胞外，干燥难度进一步降低。
[【附图说明】]
[0044] 图1是本发明的步骤示意图；
[0045] 图2是本发明中实施例1中游离核苷酸标准品的色谱图；
[0046] 图3是本发明中实施例1中游离碱基标准品的色谱图；
[0047] 图4是本发明中实施例2中的60°C自溶碱基及核苷酸的计量测定图；
[0048] 图5是本发明中自溶设备的正视图；
[0049] 图6是本发明中自溶设备的侧视图；
[0050] 图7是本发明中自溶设备的俯视图；
[0051] 图中：1.带轮2.减速机3.传动齿轮4.盖板5.进料口 6.加热空心桨叶7.保 温空心桨叶8.溢流板9.排料口 10.蒸汽进出口 11.电动机12.主机壳体13.传动主 轴；
[0052] 指定图1作为本发明的摘要附图。
[【具体实施方式】]
[0053] 下面结合附图对本发明作进一步说明，这种方法的原理和采用的设备对本专业的 人来说是非常清楚的。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于 限定本发明。
[0054] 实施例1 :游离核苷酸及游离碱基检测方法的建立
[0055] 使用游离核苷酸和游离碱基作为自溶工艺参数调整和产品自溶前后对比的主要 指标。原理是：酵母、菌体蛋白等原料经过自溶或者酶解会含有游离的核苷酸与碱基，经水 溶液提取后的试样进入高效液相色谱分析，经C18柱，紫外检测器、缓冲盐作流动相，可使 用外标法对5种核苷酸、5种核苷和5种碱基作定量测定。
[0056] 游离核苷酸是指5种核苷酸及5种核苷的总和，包括胞苷酸、尿苷酸、鸟苷酸、肌苷 酸、腺苷酸、胞苷、尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷。游离碱基是指5种核酸碱基的总和，具体包括胞 嘧啶、尿嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤。
[0057] 单细胞蛋白产品含有丰富的核苷酸，市场上酵母类的产品是饲料工业主要的核苷 酸提供者。由于工艺特点的原因，自溶酵母、酶解酵母、水解酵母等产品含有较多游离态的 核酸水解物，研宄发现现有很多酵母产品既含有游离核苷酸，也含有较高含量的碱基。游离 核苷酸能被动物快速吸收，发挥重要生理功能，碱基则会对动物肝脏肾脏造成不良影响。碱 基含量过多意味着生产过程当中有重要营养价值的核苷酸被酶解、水解或微生物代谢。这 会造成酵母产品的质量下降，提供的核苷酸含量降低，进而能为动物提供免疫功能的作用 减少，同时增加的碱基如腺嘌呤则会对动物造成毒性。判断单细胞蛋白的生产工艺对核苷 酸的破坏程度，使用既能反应工艺条件的优劣又能为产品质量控制提供科学的、反映营养 价值的评估方法就变得极为重要。游离核苷酸代表了自溶的程度，数值越高说明代表内源 酶分解核酸为核苷酸的程度越高。游离碱基是细菌代谢的产物，含量越高说明腐败微生物 生长越多，作为查看自溶后产品腐败程度的指标。
[0058] 试剂和溶液：
[0059] 除非另有说明，本法所用试剂均为分析纯，水为去离子水，符合GB/T 6682二级水 的规定。
[0060] 磷酸二氢钾：分析纯。
[0061] 氢氧化钾：分析纯。
[0062] 甲醇：色谱纯。
[0063] 乙腈：色谱纯。
[0064] 20% w/v氢氧化钾溶液：称取氢氧化钾100克，溶解于500ml水中，保存于容量瓶 内。
[0065] 流动相A :0.1 M磷酸二氢钾溶液，称取磷酸二氢钾27. 2克，溶解于1000 ml水中，添 加20%氢氧化钾溶液I. 0ml，加水定容至2升。0. 45um水系滤膜过滤后备用。
[0066] 流动相B :25%甲醇溶液，量取甲醇250ml溶解于750ml水中，搅拌混匀后0. 45um 有机系滤膜过滤后备用。
[0067] 腺苷酸 AMP :sigma#A2252。
[0068] 胞苷酸 CMP :sigma#C1131。
[0069] 肌苷酸 MP :sigma#I2897。
[0070] 鸟苷酸二钠 GMP :sigma#G8377。
[0071] 尿苷酸 UMP :sigma#U1752。
[0072] 腺昔 Adenosine :sigma#A9251 〇
[0073] 胞苷 Cytidine :sigma#C122106〇
[0074] 鸟苷 Guanosine :sigma#V900311〇
[0075] 肌苷 Inosine :sigma#I4125〇
[0076] 尿苷 Uridine :sigma#V900421。
[0077] 制备核苷酸混合标准液：依次使用尿苷酸、腺苷酸、鸟苷酸二钠、胞苷酸、肌苷 酸、鸟苷、腺苷、尿苷、肌苷、胞苷配制混合标准液，各核苷酸浓度依次为20. 000ug/ml、 20. 000ug/mK20. 000ug/mK20. 000ug/mK20.0 Oug/mKIO. OOOug/mKIO. OOOug/mK 10. 000ug/ml、10. 000ug/ml、10.0 OOug/ml 分装至 0· 5ml 冻存管内，-20°C保存，有效期一年。
[0078] 胞喃啶 Cyt osine :sigma#V9〇0462〇
[0079] 尿喃啶 Uracil :sigma#V900439〇
[0080] 鸟嗓呤 Guanine :sigma#V9〇〇473〇
[0081] 胸腺喃啶 Thymine :sigma#V900437。
[0082] 腺嗓呤 Adenine :sigma#V900471 〇
[0083] 制备碱基混合标准液：依次使用胞嘧啶、尿嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤配制混 合标准液，混合标准液碱基的浓度依此为16. 00ug/ml、16. 00ug/ml、20. 00ug/ml、16. OOug/ ml、16. 00ug/ml。分装至0· 5ml冻存管内，-20°C保存，有效期一年。
[0084] 仪器与设备：
[0085] 高效液相色谱仪系统（梯度洗脱、紫外检测、可控柱温）；色谱柱：Athena C18， 4. 6X 150mm ;分析天平；离心机；超声清洗器；ImL -次性注射器；0. 45um -次性水相过滤 器；0. 5ml离心管；IOOrnl容量瓶；250ml容量瓶；40ml带盖螺盖玻璃管；1000 ul移液器； 5000ul移液器；15mL塑料离心管。
[0086] 测定步骤：
[0087] 样品处理：
[0088] (1)称取0. 1000克样品至于40ml玻璃管内。每个待测样品重复取样至少两组。
[0089] (2)加水15ml (溶解体积，V)，漩涡震荡3次，每次lmin，每次间隔20min。
[0090] (3)震荡后超声20min。再次漩涡震荡。
[0091] (4)从玻璃管内取试液3ml至5ml离心管内。12000g高速离心15min。
[0092] (5)取上清液2ml至5ml离心管内，加水2ml，稀释一倍。混匀后保存过滤上机测 定。
[0093] 用高效液相色谱法对样品进行测定，采用以下色谱条件：
[0096] 洗脱程序如下表1 :
[0097] 表 1
[0098]
[0099] 如图2、图3所示，上述步骤能将这几种游离的核苷酸、碱基很好的分离。
[0100] 结果计算：
[0101] 使用外标法测定出样品中游离碱基、核苷酸的含量。
[0102] 试样中碱基、核苷、核苷酸含量ω,以质量分数标识，数值以％表示，按公式计算：
[0105]式中：
[0106] A一一样品核苷酸、碱基的色谱峰面积
[0107] Ast一一标准品的色谱峰面积
[0108] Cst 标准品的浓度
[0109] X--某一核苷酸、或核苷，或碱基
[0110] C--核苷酸浓度ug/ml;
[0111] V--溶解体积ml;
[0112] m--样品重量（g);
[0113] ω χ--含量 ％ ；
[0114] 测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留2位有效数字。
[0115] 精密度：
[0116] 重复以上检测，使获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10%〇
[0117] 使用上述测定方法测得的自溶工艺产品的游离核苷酸及游离碱基的含量见下表 2,表中可以看出产品在自溶后可以产生较高含量的核苷酸，且要高于市售的酵母产品。
[0118] 表 2
[0119]
[0121] 实施例2 :自溶生产工艺及产品
[0122] 本发明开发的自溶生产工艺及产品是利用发明专利W02009059163A1的培养技术 制成的单细胞蛋白产品，但不限于此，也适用于与该发明类似的好氧型单细胞蛋白产品的 加工，具体包含以下操作步骤：
[0123] 1)沉淀浓缩：定期将生物反应器产生的菌体蛋白通过管道排入沉淀浓缩池，菌体 蛋白在锥形的浓缩池底部沉淀，底部物料含水率降低至97%以下，可进行后续脱水工序。
[0124] a)本实施例中的池体直径：15米，深度：3. 5米，有效容积：477立方米。
[0125] 2)使用容积式单螺杆泵将浓缩池底部物料输送至离心脱水设备。
[0126] 3)离心脱水：使用螺旋卧式离心设备进行固液分离。离心后物料含水率降低至 78 %~82 %，物料呈湿泥状。
[0127] a)本实施例中的离心机的物料处理能力为10-30立方/小时，工作转速为 2000-3200转/分钟，出料量为1. 5吨/小时，进料含固率为3. 0-5. 0%。上清液的含固率 < 0. 2%，物料回收率彡95%。
[0128] 4)自溶：将离心脱去细胞外水分的物料输送至自溶设备进行自溶处理。
[0129] a)本实施例自溶设备是由双螺杆空心桨叶干燥机改进而来，通过向空心桨叶供热 进行升温，达到自溶的温度要求，设备的腔体容积为5. 5立方米，有效容积在3~5. 0立方 米，使用溢流板高度调节控制有效容积。
[0130] b)本实施例自溶设备的两根双螺杆空心桨叶前1/3分段为加热段，使用 0. 5-0. 6Mpa压力的蒸汽进行升温。剩余分段为保温段，使用0.1 Mpa低压蒸汽和前段加热后 的蒸汽冷凝水进行保温，以达到维持自溶温度的作用。
[0131] c)本实施例自溶的温度要求为：加热后的物料温度保持在68%~80°C，优选的自 溶温度为：70°C。
[0132] d)本实施例自溶的时间要求为：加热段将物料升温至目标温度的时间应小于20 分钟。保温段的自溶时间应在160~200分钟。
[0133] e)本实施例自溶的物料水分要求为：自溶后物料水分含量应不低于70%。
[0134] 上述最适自溶温度范围通过梯度试验获得，试验参数为：菌体蛋白的蛋白含量 35. 00%，自溶设备为恒温水浴锅，物料含水率为82%，自溶时间共120分钟，自溶温度见下 表梯度范围，自溶后物料经微波灭菌、烘干后_20°C冰箱保存备测。
[0135] 从下表3可以看出，自溶温度高于65°C时，在60分钟内即可自溶产生较高含量的 游离核苷酸，在60分钟内65°C~70°C时产生游离核苷酸含量较高，120分钟时仍以70°C条 件产生的游离核苷酸含量最高。
[0136] 表 3
[0137]
[0138] 从下表4可以看出，65°C以上自溶时，60分钟可产生较低含量的游离碱基，说明腐 败微生物没有大规模生长。在60°C时产生的游离含量最高，同时游离核苷酸含量也不高，说 明此温度下产生的游离核苷酸被腐败微生物利用，从而降低了自溶的效果。
[0139] 表 4
[0140]
[0141] 从下表5及图4的时间梯度试验数据可以看出，在60°C自溶时会持续产生碱基，说 明腐败微生物会持续生长，在180分钟~240分钟时游离碱基含量超过了游离核苷酸的含 量，气味上已经出现腐臭的味道，说明此温度自溶作用差，主要发生了腐败变质。
[0142] 表 5
[0143]
[0144] 从上述试验数据看出，合适的自溶温度对于产品的质量有较大的影响。
[0145] 5)干燥：自溶后的物料通过蛟龙喂料机输送至气流闪蒸干燥设备进行干燥。
[0146] a)本实施例闪蒸干燥的物料接触温度应低于100°C。
[0147] b)本实施例干燥后的物料的含水率应在15 %~30%。
[0148] 6)灭菌：经干燥后的物料通过气流提升设备输送至隧道式微波干燥灭菌设备进 行灭菌。
[0149] a)本实施例微波灭菌后的物料的霉菌总数、细菌总数符合〈GB 13078-2001饲料 卫生标准。
[0150] b)所述微波灭菌后物料含水率为5 %~10 %。
[0151] 7)粉碎包装：灭菌后的物料经粉碎后包装成成品。经上述生产工艺制成的单细胞 蛋白应同时具有以下质量指标：
[0152] a)单位蛋白的游离核苷酸含量应高于1. 40%
[0153] b)单位蛋白的游离碱基含量应低于0. 90 %
[0154] c)游离碱基与游离核苷酸的比值应在0~0. 60范围内。
[0155] 蛋白含量为35%的菌体蛋白经过上述加工方法的加工后所获得的产品的关键指 标见下表6 :
[0156] 表 6
[0157]
[0158] 实施例3:消化率试验
[0159] 通过动物试验评估了使用自溶工艺的菌体蛋白与普通菌体蛋白在表观消化率上 的差异。
[0160] 消化率是动物所摄取的饲料成分中，可消化养分占食入饲料养分的百分率。指示 剂法就是用饲料中存在的或人工均匀掺入的指示 剂。饲喂鱼后从单位饲料和粪中所含单位 指示剂的量求算消化率。以饲料原料营养素的可消化值为依据进行配方编制，对于提高配 合饲料的消化利用率、减少饲料物质对养殖水环境的污染具有重要意义。
[0161] 试验方案：
[0162] 评估原料：将蛋白含量为50%的菌体蛋白按照实施例二的方法进行自溶生产，普 通未自溶蛋白含量同为50%的同批次单细胞蛋白。
[0163] 试验饲料由"70 %基础饲料+30 %待测原料"组成。试验饲料中加入0. 01 %氧化 钇作为指示剂，采用逐级扩散法均匀混合于饲料粉料中。配制试验饲料时，所有原料均过40 目，用制粒机制成粒径3mm的颗粒饲料。
[0164] 试验在145升塑料水族箱中进行，水源为曝气自来水，水族箱使用充氧泵充气， 每个水族箱使用加热棒控温。每天换水2/3,保持水质清洁。试验期间水温15±1°C， pH6. 5-7. 5,溶氧> 4. Omg/1。试验鱼为虹鳟鱼。
[0165] 基础饲料及2种试验饲料共3个试验组，每组3个重复，共9个水族箱。每箱放50 尾鱼。
[0166] 试验鱼投入水族箱驯化7天后，投喂试验饲料，7天后开始正式试验。试验期间，每 天饱食投喂2次（8:30 ; 15:30)，每次投饵0. 5小时后用虹吸管将残饵吸出。每天在试验鱼 排粪高峰期收集粪便，每次用密抄网将粪便及时捞出，然后用镊子将包膜完整的粪便颗粒 挑于培养皿中，于70°C烘箱中烘干至恒重，然后将粪便放入干燥器中待以分析，直至粪便够 检测为止。
[0167] 结果计算：
[0168] 试验饲料和基础饲料干物质、蛋白质表观消化率的计算公式为：
[0169] 干物质表观消化率（％ ) = 100X (1 - B/B'）
[0170] 营养成分表观消化率（％ ) = [1_(A' /A) X (B/B'）] X 100
[0171] 其中，A、B分别为饲料中某营养成分和氧化纪含量，A'、B'分别为奠便中某相应营 养成分和氧化钇含量。
[0172] 原料干物质、蛋白质及氨基酸的表观消化率计算公式为[1'2'3]:
[0173] 嘗_《七%驗DT - riDR 1......j·
[0174] 式中：DT和DR分别为试验饲料和基础饲料营养成分的消化率
[0175]
[0176] 结果：
[0177] 从下表7可以看出，使用自溶工艺的单细胞蛋白的干物质及蛋白消化率得到了显 著提高，说明在自溶后细菌的细胞壁得到充分破壁，核苷酸、蛋白等营养物质游离到细胞 外，从而更易被动物所吸收。
[0178] 表 7
[0179]
[0180] 实施例五：采食量试验
[0181] 通过仔猪的双料槽偏好性试验评估使用自溶工艺的菌体蛋白与普通菌体蛋白在 诱食及采食量方面的差异。仔猪的双料槽模型试验可以测定仔猪对特定原料风味的偏好， 对于仔猪来说采食其偏好的饲料可以提高采食量，进而提高生长速度。
[0182] 试验方案：
[0183] 评估原料：蛋白为50%的自溶单细胞蛋白，普通未自溶蛋白含量同为50%的单细 胞蛋白。试验饲料，基础日粮为市售断奶仔猪饲料，试验饲料配比见下表8。
[0184] 试验动物：选择断奶日龄、体重接近，采食正常、健康的断奶仔猪45头，随机分成3 组。
[0185] 表 8
[0186]
[0187] 试验方法：
[0188] 在同一栏内放入料位和规格型号相同的料槽2个（要求每个料槽的料位必须与试 验猪数量一致），分别在料槽内加入一定数量的试验饲料（要求饲料的数量必须充足，保证 2小时内不会出现饲料不够的情况），A料槽加 A料，B料槽加 B料，让猪自由采食2小时后 收集料槽中剩余的饲料并计量，然后在A料槽中加 B料，B料槽中加 A料进行上述相同的试 验。
[0189] 在试验期间观察两个料槽采食饲料猪的数量，并用摄像机和照相机跟踪拍摄两个 料槽猪采食情况和猪数量变化情况。要求：试验连续进行3~4次，每次3~4个重复。共 3~5天，或某一饲料采食结束为止。
[0190] 结果计算：
[0191] 测定指标：采食量和偏嗜指数：
[0192] A日粮偏食指数=A组总采食量/B组总采食量
[0193]
[0194] 试验结果显示，在实施例试验条件下，断奶仔猪对于自溶单细胞蛋白具有偏好性， 对于含有其成本饲料采食量更高，自溶出的游离核苷酸表现出了诱食效果。
【主权项】
1. 一种使用自溶工艺生产好氧型单细胞蛋白的方法，包括沉淀浓缩步骤、离心脱水 步骤、干燥步骤、灭菌步骤和粉碎包装步骤，其特征在于将离心脱水步骤后获得的78%~ 85 %含水率的物料，经过自溶步骤后进行干燥步骤，所述的自溶步骤如下： a) 自溶设备通过向双螺杆空心桨叶供热进行升温，达到自溶的温度要求，通过设计及 调节与进料速度配套的腔体容积，来达到自溶的时间要求； b) 所述自溶设备的双螺杆空心桨叶前1/4至1/2分段为加热段，目的是将物料加热至 自溶所需温度，剩余分段为保温段，保持物料自溶温度； c) 自溶的温度要求为：加热后的物料温度保持在65%~95°C; d) 自溶的时间要求为：加热段将物料升温至目标温度的时间应小于30分钟，保温段的 自溶时间应在30分钟~360分钟； 所述自溶的物料水分要求为：自溶后物料水分含量应不低于70% ; 所述的灭菌步骤采用微波灭菌。2. 如权利要求1所述的一种使用自溶工艺生产好氧型单细胞蛋白的方法，其特征在于 所述的加热后的物料温度保持在65%~80°C，自溶时间为60~180分钟。3. 如权利要求1所述的一种使用自溶工艺生产好氧型单细胞蛋白的方法，其特征在于 所述的具体方法步骤的顺序如下： (1) .沉淀浓缩：将生物反应器产生的菌体蛋白通过管道排入沉淀浓缩池，菌体蛋白在 锥形的浓缩池底部沉淀，底部物料含水率降低至97%以下，可进行后续脱水工序； (2) .使用抽料泵将浓缩池底部物料输送至离心脱水设备； (3) .离心脱水：使用螺旋卧式离心设备进行固液分离，离心后物料含水率降低至 78%~85%，物料呈湿泥状；离心所脱去的水分为菌体蛋白的细胞外水分，胞内水分仍存 留在细胞内，这为细胞内的内源酶进行自溶创造了条件，离心后78%~85%含水率的物料 能进行自溶作用； (4) .自溶：将离心脱去细胞外水分的物料输送至自溶设备进行自溶处理； a) 自溶设备通过向双螺杆空心桨叶供热进行升温，达到自溶的温度要求，通过设计及 调节与进料速度配套的腔体容积，来达到自溶的时间要求； b) 所述自溶设备使用导热油或蒸汽对空心桨叶进行供热； c) 所述自溶设备的两根双螺杆空心桨叶前1/4至1/2分段为加热段，目的是将物料加 热至自溶所需温度，剩余分段为保温段，保持物料自溶温度； d) 自溶的温度要求为：加热后的物料温度保持在65%~95°C; e) 自溶的时间要求为：加热段将物料升温至目标温度的时间应小于30分钟，保温段的 自溶时间应在30分钟~360分钟； f) 所述自溶的物料水分要求为：自溶后物料水分含量应不低于70% ; (5) .干燥：自溶后的物料通过蛟龙喂料机输送至气流闪蒸干燥设备进行干燥；所述闪 蒸干燥的物料接触温度应低于l〇〇°C，所述干燥后的物料的含水率应在10%~40% ; (6) .灭菌：经干燥后的物料通过气流提升设备输送至隧道式微波干燥灭菌设备进行 灭菌；所述微波灭菌后物料含水率为5%~10% ; (7) .粉碎包装：灭菌后的物料经粉碎后包装成成品。4. 一种采用权利要求1所述的方法制得的好氧型单细胞蛋白，其特征在于采用蛋白含
【专利摘要】本发明涉及单细胞蛋白加工技术领域，特别是涉及一种使用自溶工艺生产好氧型单细胞蛋白的方法，包括沉淀浓缩步骤、离心脱水步骤、干燥步骤、灭菌步骤和粉碎包装步骤，将离心脱水步骤后获得的78％～85％含水率的物料，经过自溶步骤后进行干燥步骤。本发明工艺及其制成的产品使用了自溶工艺，自溶过程中自溶酶充分分解大分子营养物及细胞壁，通过自溶可以产生较高含量的游离氨基酸、游离核苷酸，同时使得细胞壁多糖被分解，使细胞产生通透性从而确保活性物质可以流出细胞外，从而可以被动物直接吸收利用；采用了离心脱水后进行自溶，即可确保自溶的高效率，也可减少在自溶后的干燥工艺所需去除的水分含量，从而减少了干燥成本。
【IPC分类】C12N1/00, C12N1/06
【公开号】CN104893976
【申请号】CN201510148741
【发明人】许建刚, 宋建华, 赵维韦, 张鑫杰
【申请人】台州艾希尔生物科技有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年3月31日