综合微生物的培养方法

综合微生物的培养方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物生态学领域，具体涉及一种用于污泥处理的综合微生物的培养方法。
【背景技术】
[0002]综合微生物是由大自然中萃取而出，具有强力分解有机物质的特性，不会受到环境的影响，也不影响环境。氨气、硫化氢、甲基硫醇等造成恶臭的物质皆会被微生物吸收分解。适用温度范围广，且可以抑制病原性大肠菌增加的功效也已经获得公共设施的认可。综合微生物的作用原理是:综合微生物内含有多种微生物群，针对有机废弃物有强烈的分解消化能力，可以将有机物分解成二氧化碳、水和各种无机盐。另外，综合微生物会交互作用将造成环境恶臭的因子分解成其他没有异味的物质，因此不仅可以有效的分解有机废弃物同时也可以消除环境恶臭。
[0003]因此，现在需要开发一种能够快速稳定繁殖综合微生物的培养方法。

【发明内容】

[0004]本发明要解决的技术问题是是，提供一种极短的时间内，可培养出大量的污水和污泥等处理过程中所需要的微生物，且所培养的微生物菌类稳定并使处理效果达到最好综合微生物的培养方法。
[0005]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是:该综合微生物的培养方法，包括以下步骤:
(O前期准备:
(A)灭菌处理:分别对实验操作空间、操作者衣着和手进行清洁和消毒；对培养桶槽和培养皿进行灭菌处理；
(B)制备B1lite水:取大于预定培菌体积的自来水置入干净桶槽内；在所述桶槽内加入B1lite丝光细粉；于所述桶槽内导入曝气，曝气方式为连续曝气，曝气时间为不小于24h;曝气完成后静置3~5天，并测定水中的金属离子的含量，直至水中的金属离子含量为零后待用；
(C)检查设备和材料:观察培菌桶槽的外观是否完整无破损，排水孔洞的盖子是否旋紧；检查曝气设备是否安装完成，曝气设备以及其阀门是否正常工作；检查培菌所需的材料的种类和数量是否正确；
(2)按比例配制培养材料，所述培养材料包括MOLT原生菌液、SOFT生菌粉体、B1lite丝光细粉、光合成菌液GPB、B1lite水和有机营养物；
(3)导入曝气，进行繁殖培养:将步骤(2)中的培养材料放入培养桶槽，并在培养桶内加入营养物质，所述营养物质包括碳源、氮源、无机盐类及水源；培养基的PH值为6~10，培菌室的温度为0~60°C ;曝气方式为连续曝气和微曝气，首先进行连续曝气，连续曝气的时间至少为7天；连续曝气完成后，再进行微曝气，微曝气时间至少24h ;后续培养的过程中，可以根据菌种繁殖的状况进行连续曝气与微曝气轮换曝气；从而得到繁殖的MOLT菌液；
(4)取液观察:
(a)取液:取出所述步骤(3)中得到的繁殖的MOLT菌液，待用；
(b)稀释菌液:将步骤(a)中所取出的待用的MOLT菌液，分别取出等量的3份，分别加入生理盐水稀释为1000倍、10000倍和100000倍，得到三种不同比例的稀释菌液；
(c)平板培养:将步骤(b)中的三种不同比例的稀释菌液用针筒分别取出等量的稀释菌液放入3个具有培养基的培养皿中，将接种环在酒精灯火焰上灼烧直至烧红，在酒精灯火焰旁冷却接种环，将接种环伸入平板内，按“之”字形划线，使菌液均匀分布，盖上培养皿盖，不要划破培养基；将平板倒置放在培养箱中，培养温度为30~40°C，培养时间至少为24h ;观察并拍摄照片记录不同培养时间下的各种菌的菌种和菌相；
(5)分离并检测:同时将步骤(3)中得到的繁殖的MOLT菌液采用DGGE电泳设备进行分离并检测，并分析图谱；
(6)取液储存:当观察发现步骤(3)中的菌液中菌数达到标准，取出培养桶槽内菌液总重量的6~8%的菌液进行放置保存，然后在按比例添加培养材料至培养桶槽内，使菌液总重量维持不变；同时将曝气方式改为连续曝气，连续曝气时间至少为24h，连续曝气完成后，再进行微曝气，并重复步骤(4)和步骤(5)，直至观察发现菌液中菌数达到标准，则重复步骤(6)的上述操作。
[0006]MOLT (综合微生物菌):从大自然中无污染的深层土壤中提取出的，经过特殊的筛选，驯化、培育方式得到现在的综合微生物菌。SOFT生菌粉体(辅助材料，有机载体):内含腐殖质等物质。B1lite粉(辅助材料，无机载体):有很强的吸附作用，由沸石和其他材料制成。采用上述技术方案，B1lite粉具有强的吸附作用，可以吸附对微生物生理活性具有抑制作用的某些无机物和吸附臭味；在培养过程中主要观测重金属离子(如锌、铜、镍、铅、铬等)，防止重金属离子进入菌液中；在培菌时需要加入水，采用B1lite粉调制自来水制成B1lite水，在使用前要用仪器检测水体中是否含有重金属离子；由于B1lite粉具有强的吸附作用，能将金属离子吸附，因此若检测出水体中含有金属离子，则再添加B1lite粉进行吸附，从而获得对综合微生物最有利的培养环境；通过曝气设备，曝气设备中含有粗泡散气盘组，可以为微生物由下而上提供空气供养，可以使得微生物更好更快地繁殖并处理污泥；轮换式微曝气是为了让厌氧微生物进行繁殖，保持总菌相中好氧菌和厌氧菌的比例；培养室的温度为恒温的，可以使微生物更好的快速稳定的繁殖；在使用菌液或进行下一步培养前需进行取液观察，观察菌桶槽中的菌数，同时进行基因突变检测；最后通过稀释观察微生物的繁殖状况，以及同时采用DGGE电泳设备测试繁殖后的MOLT菌液有无基因突变情况，如果检测发现没有基因突变则继续进行培养；其次在培养过程中，有机营养物的提供也非常重要；在微生物菌的生命活动过程中，需要不断吸收必须的营养物质，包括:碳源、氮源、无机盐类及其他生长素等；而本发明中添加的有机物以畜牧业的固液废弃物为主，猪粪尿类中的碳源较多，沼液类中的氮源较多，综合后提供给微生物营养，既可培育微生物又可处理废液。因此在培育过程中，每周定期做培养皿观察菌数变化，如果微生物连续两周持续下降，则表示营养源不足，已经开始衰亡。根据我们的经验，加足了营养成分后，大概可以持续维持72?75天左右(微曝气的情况下);一般来说，菌数的最高峰在45?55天的时间段；而营养过多，有可能会分解不完全；一般在正常的培养过程中，不会有臭味产生；但若是添加的营养过多，曝气不充分时，会产生臭味。当培菌期间突然出现臭味时，由于Do长期过低，此时要曝气全开，连续曝气2小时后改为微曝气；微生物菌适应的PH范围是6~10，要让好氧菌和厌氧菌在比例左右共同繁殖；改为当测定的PH大于10时，此时主要是厌氧菌对营养物质的分解吸收，要加大曝气使好氧菌繁殖；当PH小于6时，此时主要是好氧菌的活动，要减小曝气。此外，观察菌液并计数生长菌落，必要时可用功放大镜辅助观察；若一般生菌数多200CFU，放线菌多200CFU，出血性d大肠杆菌无生长则表示可以取液保存；若未达到标准则继续培养；若有疑似出血性大肠杆菌的菌落产生，则须作进一步的检查以及紧急处理；取液储存主要是为了增加菌液，从而可以使繁殖后的菌液的重量在短时间内增加，可以缩短微生物培养时间，节约成本，提高培养效率。
[0007]本发明进一步的改进在于，所述步骤(I)中的(A)步骤的灭菌方法为化学药剂消毒法，即采用75%的无水乙醇消毒后再采用紫外线消毒法，在紫外线照射下消毒至少lh，以达到灭菌的目的。微生物培养成功的关键在于无菌操作，如果培养器具和培养基不能彻底灭菌、培养的过程中有杂菌污染是很容易失败的，因此采用紫外线消毒可以进一步更好灭菌；同时为了避免周围微生物的污染，操作培养的过程中需要在酒精灯火焰旁操作。
[0008]本发明进一步的改进在于，所述步骤(I)中的(B)步骤中加入B1lite丝光细粉的量为自来水重量的0.5%~0.8%ο根据B1lite水的作用通过大量的实验证实，B1lite丝光细粉加入量为0.5%~0.8%，可以很好地将自来水中的金属离子吸附。
[0009]本发明进一步的改进在于，当培养方式为原代培养时，所述步骤(2)中的培养材料的体积比例为:M0LT原生菌液占总体积的63%~68%，SOFT生菌粉体占总体积的1%~3%，B1lite丝光细粉占总体积的0.05%~0.15%，光合成菌液GPB占总体积的0.5%~1.0%，B1lite水占总体积的30%~35%，有机营养物占总体积的0.5%~1%。原代培养也称初代培养，严格地说即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，但实际上，通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养；一般持续1~4周；此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。初代培养细胞与体内原组织在形态结构 和功能活动上相似性大。细胞群是异质的(Heterogeneous)，也即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存性强。如把这种细胞群稀释分散成单细胞，在软琼脂培养基中进行培养时，细胞克隆形成率(CloningEfficiency)很低，即细胞独立生存性差。克隆形成率即细胞群被稀释分散成单个细胞进行培养时，形成细胞小群(克隆)的百分数。初代培养细胞多呈二倍体核型；由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大，是检测药物很好的实验对象；原代培养可以更快更好地繁殖与最初微生物相同的微生物，从而使处理污泥的效果达到更佳。
[0010]本发明进一步的改进在于，当培养方式为分代培养时，所述步骤(2)中的培养材料的体积比例为:M0LT原生菌液占总体积的30%~35%，SOFT生菌粉体占总体积的1%~3%，B1l ite丝光细粉占总体积的0.05%~0.15%，光合成菌液GPB占总体积的0.5%~1.0%，B1lite水占总体积的63%~68%，有机营养物占总体积的0.5%~1%。
[0011]本发明进一步的改进在于，所述步骤(4)中的(b)步骤中所取出的等量的3份待用的MOLT原生菌液均为Iml或2ml。该体积大小方便观察。
[0012]本发明进一步的改进在于，所述步骤(4)中的(C)步骤中所取出的等量的3份稀释菌液均为0.1ml或0.2ml。该体积大小方便观察。
[0013]作为本发明的优选方案，所述MOLT原生菌液由MOLT原生菌配制而成；所述MOLT原生菌为从大自然中无污染的深层土壤中提取并经过筛选、驯化、培育所得；所述MOLT原生菌中包括好氧菌和厌氧菌，所述好氧菌与所述厌氧菌的比例为8~12:1，溶解氧Do的值不小于0.2mg/Lo在使用该MOLT原生菌液时也可以对其先取样观察，看看该MOLT原生菌液是否符合标准；符合标准才进行下一步培养；其中取样观察的方法同培养中取样观察的方法。
[0014]作为本发明的优选方案，所述步骤(2)中培养室的温度为16~30°C。
作为本发明的优选方案，所述步骤(4)的(c)步骤中观察并拍摄照片记录不同培养时间为24h、48h和72h。通过24h的时间间隔，可以很好地观察出菌数的生长情况以及变化情况，同时总结出菌数的生长规律。
[0015]本发明所培养的综合微生物用于畜牧业、农业、工业、设施、服务业、家庭公寓住宅等地方。目前主要的应用领域是:土壤改良增加施肥效果；畜牧业污泥减量与环境除臭；城市下水污泥减量与循环再利用；消除油脂恶臭与减少水中油脂；消除环境恶臭与整治民生污水。
[0016]土壤:
土壤的钙化、盐碱化、酸碱度不平衡等问题导致有机质缺乏，不利于作物的生长。土壤有机质具有增加土壤团粒构造、改善土壤物理性质，进而使土壤松软及稳定土壤而促进通气及排水等功能。土壤有机质还具有增加土壤保水能力，缓慢释出营养元素、螯合微量营养元素、提高营养元素溶解度、增加土壤缓衡能力、缓和土壤酸碱性、提高施肥效果及肥料利用效率与增进有益微生物之活性，及使土壤微生物能抵抗大量病菌发生等功效。
[0017]微生物酵素是使用综合微生物农业培养包所生产出来的微生物酵素。在培养过程中，微生物会大量增值，同时将放入农作物剩余资材分解成细微营养分子，可有效增加土壤中有机质含量。
[0018]农业微生物酵素内含有多种微生物菌群，土壤被活化后，作物自然能从土壤中吸收足够的养分健康成长，提高产量。
[0019]农业微生物酵素会渗入土壤改善土质提高有机质，其本身不能当做肥料使用，配合有机肥料施用，至少可减少有机肥量的50%，目的是改善土壤活化土地。
[0020]畜牧业:
我国是畜牧业养殖大国，畜牧废水量非常庞大，清洗、饮用、排泄等产生的废水导致养殖业废水被视为河川污染的主因之一。在有限的土地要大幅提高生产，且要保护环境，那就要从根本上解决问题，将污泥分解减量。
[0021]畜牧场及堆肥厂的臭味，主要来自腐败饲料、畜禽体臭、粪便及堆置场所等，主要成分包括硫化物、氮化物及含氧碳氢化合物等，多以氨气、硫化氢及甲基硫醇等挥发性物质为主。氨气、硫化氢、甲基硫醇等造成恶臭的物质皆会被微生物吸收分解。
[0022]油脂:
公共污水下水道最大问题是来自餐厅、商家或工厂等所排出之含油脂污水，油脂含量过高就会造成污水管线阻塞。另外，餐厅厨房排出之含油脂污水，即便是有装设油脂截留器，含油脂污水也很容易通过。
[0023]当油脂与碱性物质相遇，就会产生皂化作用，也就是肥皂。肥皂可溶于水，但当水中存在钙盐或镁盐时(硬水)，钠盐被替代，就会形成「皂化油脂」。再加上，市售高效率之清洁剂使油脂乳化后，水中油脂FOG (Fats, Oils and Greases)就会保持悬浮状态而无法上浮去除，这会让油脂造成之问题加剧。因此，如何有效去除含油脂污水，就是目前公共污水下水道之最大问题。
[0024]污水回流和阻塞会引来昆虫和害虫，并且造成健康危害。FOG最终将堵塞餐馆的侧向污水管，导致管路回流。污水管道回流造成物业损坏，污水管道堵塞可导致污水溢出，未经处理的污物会流入到江河之中。
[0025]从水槽和地面排水管道冲下来的脂肪、油类和油脂(FOG)日积月累，最终会引起餐馆下水道以及城市污水管道系统的阻塞。将FOG造成的阻塞清理出私人和公共物业会增加餐馆和城市污水管道维护以及污水处厂的费用。
[0026]综合微生物的使用可以有效消除油脂截留槽常年累积所散发出的环境恶臭；有效控制新增油脂之快速皂化堆积结块现象；有效降低排放污水的FOG值。
[0027]环境臭味:
臭味物质大多是气相污染物，主要由碳、氢、氧、氮、硫、卤素等元素构成。此外，颗粒状污染物的金属燻烟及油烟多带异味，也可能含臭味物质。
[0028]就化学结构而言，臭味物质分子多因具剩余电子，而有刺激人类嗅觉的特性。因此不饱和烃(如丁二烯、苯乙烯)、氮化物(如氨、甲基胺、粪臭素)、硫化物(如硫化氢、硫化甲基)、氯烃(如氯仿)、含氧烃(如丙酮)、植物精油(如樟脑油)等化合物，都具有特殊味道。其中硫化甲基、硫醇、甲基胺等三类具特异性臭味，为多数人厌恶，被环保署列为恶臭污染物。
[0029]臭味物质来源颇为广泛，就产生机制而言，分为生物分解、化学反应、物理作用等三类；就人类活动而言，则分成生活、农业、工业、商业等四类。
[0030]有机物的生物分解主要是藉微生物及其产生的酵素，在缺氧状况下，把有机物分解成有机酸、醇、酮及含还原态硫(如硫化氢)、氮(如氨、粪臭素)等臭味物质。
[0031]就生活方面，主要臭味源是生活污水及垃圾，主要成分是还原态硫及氮化物(如硫化氢、氨)、含氧碳氢化合物(如乙醛、丙酮)等，多数是有机物分解所产生。在农业方面，主要臭味源是养猪场、养鸡场、堆肥场等，主要成分与生活污水及垃圾相似，堆肥场尚含粪臭素等成分。
[0032]民生问题:
排水孔、管线臭味或堵塞问题；马桶管线臭味或堵塞问题；化粪池臭味或失效问题等。
[0033]与现有技术相比，该技术方案的有益效果是:通过该综合微生物培养方法简单可操作性强，培养的综合微生物均在3代以内，菌类稳定不发生突变，且繁殖快速。
【具体实施方式】
[0034]下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细的解释，但不对本发明具有限定作用。
[0035]实施例1:该综合微生物的培养方法，MOLT原生菌液由MOLT原生菌配制而成；MOLT原生菌为从大自然中无污染的深层土壤中提取并经过筛选、驯化、培育所得；M0LT原生菌中包括好氧菌和厌氧菌，好氧菌与厌氧菌的比例为10:1，溶解氧Do的值不小于0.2mg/L ;培养方式为原代培养，具体培养方法包括以下步骤:
(O前期准备: (A)灭菌处理:分别对实验操作空间、操作者衣着和手进行清洁和消毒；对培养桶槽和培养皿进行灭菌处理；灭菌方法为化学药剂消毒法，即采用75%的无水乙醇消毒后再采用紫外线消毒法，在紫外线照射下消毒lh，以达到灭菌的目的；
(B)制备B1lite水:取大于预定培菌体积的自来水置入干净桶槽内；在所述桶槽内加AB1lite丝光细粉，加入B1lite丝光细粉的量为自来水重量的0.6%。于所述桶槽内导入曝气，曝气方式为连续曝气，曝气时间为24h ;曝气完成后静置3天，并测定水中的金属离子的含量，直至水中的金属离子含量为零后待用；
(C)检查设备和材料:观察培菌桶槽的外观是否完 整无破损，排水孔洞的盖子是否旋紧；检查曝气设备是否安装完成，曝气设备以及其阀门是否正常工作；检查培菌所需的材料的种类和数量是否正确；
(2)按比例配制培养材料，并将培养材料加入培养桶槽:所述培养材料包括MOLT原生菌液、SOFT生菌粉体、B1lite丝光细粉、光合成菌液GPB、B1lite水和有机营养物；培养材料的体积比例为:M0LT原生菌液占总体积的65.6%，SOFT生菌粉体占总体积的2%，B1lite丝光细粉占总体积的0.1%，光合成菌液GPB占总体积的0.8%,B1lite水占总体积的32.8%，有机营养物占总体积的0.8% ；
(3)导入曝气，进行繁殖培养:将步骤(2)中的培养材料放入培养桶槽，并在培养桶内加入营养物质，所述营养物质包括碳源、氮源、无机盐类及水源；将步骤(2)中的培养材料放入培养桶槽，并在培养桶内加入营养物质，所述营养物质包括碳源、氮源、无机盐类及水源；培养基的PH值为6~10，培菌室的温度为25 °C;曝气方式为连续曝气和微曝气，首先进行连续曝气，连续曝气的时间为7天；连续曝气完成后，再进行微曝气，微曝气时间40h ;后续培养的过程中，可以根据菌种繁殖的状况进行连续曝气与微曝气轮换曝气；当培菌期间突然出现臭味时，由于Do长期过低，此时要曝气全开，连续曝气2小时后改为微曝气；综合微生物菌适应的PH范围是6~10，要让好氧菌和厌氧菌在比例左右共同繁殖；当测定的PH大于10时，要加大曝气，采用连续曝气；此时主要是厌氧菌对营养物质的分解吸收；当PH小于6时，要减小曝气，采用微曝气，此时主要是好氧菌的活动；从而得到繁殖的MOLT菌液；
(4)取液观察:
(a)取液:取出所述步骤(3)中得到的繁殖的MOLT菌液，待用；
(b)稀释菌液:将步骤(a)中所取出的待用的MOLT菌液，分别取出Iml的3份，分别加入生理盐水稀释为1000倍、10000倍和100000倍，得到三种不同比例的稀释菌液；
(c)平板培养:将步骤(b)中的三种不同比例的稀释菌液用针筒分别取出0.1ml的稀释菌液放入3个具有培养基的培养皿中，将接种环在酒精灯火焰上灼烧直至烧红，在酒精灯火焰旁冷却接种环，将接种环伸入平板内，按“之”字形划线，使菌液均匀分布，盖上培养皿盖，不要划破培养基；将平板倒置放在培养箱中，培养温度为35°C，培养时间为80h ;选取培养时间为24h、48h和72h时的各种菌的菌种和菌相进行观察并拍摄照片记录；观察菌液并计数生长菌落，必要时可用功放大镜辅助观察；若一般生菌数多200CFU，放线菌多200CFU，出血性d大肠杆菌无生长则表示可以取液储存；若未达到标准则继续培养；若有疑似出血性大肠杆菌的菌落产生，则须作进一步的检查以及紧急处理；
(5)分离并检测:同时将步骤(3)中得到的繁殖的MOLT菌液采用DGGE电泳设备进行分离并检测，并分析图谱； (6)取液储存:当观察发现步骤(3)中的菌液中菌数达到标准，取出培养桶槽内菌液总重量的7.5%的菌液进行放置保存，然后在按比例添加培养材料至培养桶槽内，使菌液总重量维持不变；同时将曝气方式改为连续曝气，连续曝气时间为30h，连续曝气完成后，再进行微曝气，并重复步骤(4)和步骤(5)，直至观察发现菌液中菌数达到标准，则重复步骤(6)的上述操作。
[0036]实施例2:该综合微生物的培养方法，MOLT原生菌液由MOLT原生菌配制而成；MOLT原生菌为从大自然中无污染的深层土壤中提取并经过筛选、驯化、培育所得；M0LT原生菌中包括好氧菌和厌氧菌，好氧菌与厌氧菌的比例为10:1，溶解氧Do的值不小于0.2mg/L ;培养方式为分代培养，具体培养方法包括以下步骤:
(O前期准备:
(A)灭菌处理:分别对实验操作空间、操作者衣着和手进行清洁和消毒；对培养桶槽和培养皿进行灭菌处理；灭菌方法为化学药剂消毒法，即采用75%的无水乙醇消毒后再采用紫外线消毒法，在紫外线照射下消毒lh，以达到灭菌的目的；
(B)制备B1lite水:取大于预定培菌体积的自来水置入干净桶槽内；在所述桶槽内加AB1lite丝光细粉，加入B1lite丝光细粉的量为自来水重量的0.6%。于所述桶槽内导入曝气，曝气方式为连续曝气，曝气时间为24h ;曝气完成后静置3天，并测定水中的金属离子的含量，直至水中的金属离子含量为零后待用；
(C)检查设备和材料:观察培菌桶槽的外观是否完整无破损，排水孔洞的盖子是否旋紧；检查曝气设备是否安装完成，曝气设备以及其阀门是否正常工作；检查培菌所需的材料的种类和数量是否正确；
(2)按比例配制培养材料，并将培养材料加入培养桶槽:所述培养材料包括MOLT原生菌液、SOFT生菌粉体、B1lite丝光细粉、光合成菌液GPB、B1lite水和有机营养物；培养材料的体积比例为:M0LT原生菌液占总体积的32.8%，SOFT生菌粉体占总体积的2%，B1lite丝光细粉占总体积的0.1%，光合成菌液GPB占总体积的0.8%,B1lite水占总体积的65.6%，有机营养物占总体积的0.8% ；
(3)导入曝气，进行繁殖培养:将步骤(2)中的培养材料放入培养桶槽，并在培养桶内加入营养物质，所述营养物质包括碳源、氮源、无机盐类及水源；培养基的PH值为6~10，培菌室的温度为25°C ;曝气方式为连续曝气和微曝气，首先进行连续曝气，连续曝气的时间8天；连续曝气完成后，再进行微曝气，微曝气时间50h ;;后续培养的过程中，可以根据菌种繁殖的状况进行连续曝气与微曝气轮换曝气；当培菌期间突然出现臭味时，由于Do长期过低，此时要曝气全开，连续曝气2小时后改为微曝气；微生物菌适应的PH范围是6~10，要让好氧菌和厌氧菌在比例左右共同繁殖；当测定的PH大于10时，要加大曝气，采用连续曝气；此时主要是厌氧菌对营养物质的分解吸收；当PH小于6时，要减小曝气，采用微曝气，此时主要是好氧菌的活动；从而得到繁殖的MOLT菌液；
(4)取液观察:
(a)取液:取出所述步骤(3)中得到的繁殖的MOLT菌液，待用；
(b)稀释菌液:将步骤(a)中所取出的待用的MOLT菌液，分别取出Iml的3份，分别加入生理盐水稀释为1000倍、10000倍和100000倍，得到三种不同比例的稀释菌液；
(c)平板培养:将步骤(b)中的三种不同比例的稀释菌液用针筒分别取出0.1ml的稀释菌液放入3个具有培养基的培养皿中，将接种环在酒精灯火焰上灼烧直至烧红，在酒精灯火焰旁冷却接种环，将接种环伸入平板内，按“之”字形划线，使菌液均匀分布，盖上培养皿盖，不要划破培养基；将平板倒置放在培养箱中，培养温度为35°C，培养时间为80h ；选取培养时间为24h、48h和72h时的各种菌的菌种和菌相进行观察并拍摄照片记录；观察菌液并计数生长菌落，必要时可用功放大镜辅助观察；若一般生菌数多200CFU，放线菌^ 200CFU，出血性d大肠杆菌无生长则表示可以取液保存；若未达到标准则继续培养；若有疑似出血性大肠杆菌的菌落产生，则须作进一步的检查以及紧急处理；
(5)分离并检测:同时将步骤(3)中得到的繁殖的MOLT菌液采用DGGE电泳设备进行分离并检测，并分析图谱；
(6)取液储存:当观察发现步骤(3)中的菌液中菌数达到标准，取出培养桶槽内菌液总重量的7%的菌液进行放置保存，然后在按比例添加培养材料至培养桶槽内，使菌液总重量维持不变；同时将曝气方式改为连续曝气，连续曝气时间为35h，连续曝气完成后，再进行微曝气，并重复步骤(4)和步骤(5)，直至观察发现菌液中菌数达到标准，则重复步骤(6)的上述操作。
[0037]上述实施例1和实施例2通过DGGE电泳设备对繁殖的MOLT菌液进行分离并检测的方法为:
1.将海绵垫固定在制胶架上，把类似‘三明治’结构的制胶板系统垂直放在海绵上方，用分布在制胶架两侧的偏心轮固定好制胶板系统，注意一定是短玻璃的一面正对着自己；
2.共有三根聚乙烯细管，其中两根较长的为15.5cm，短的那根长9cm。将短的那根与Y形管相连，两根长的则与小套管相连，并连在30ml的注射器上。
[0038]3.在两个注射器上分别标记‘高浓度’与‘低浓度’，并安装上相关的配件，调整梯度传送系统的刻度到适当的位置；
4.反时针方向旋转凸轮到起始位置:为设置理想的传送体积，旋松体积调整旋纽。将体积设置显示装置固定在注射器上并调整到目标体积设置，旋紧体积调整旋纽。例如16*16cm ge ls (lmm thick):设体积调整装置到 14.5 ；
5.配制两种变性浓度的丙烯酰胺溶液到两个离心管中；
6.每管加入18μ? TEMED，80 μ? 10%APS，迅速盖上并旋紧帽后上下颠倒数次混匀；用连有聚乙烯管标有‘高浓度’的注射器吸取所有高浓度的胶，对于低浓度的胶操作同上；
7.通过推动注射器推动杆小心赶走气泡并轻柔地晃动注射器，推动溶液到聚丙烯管的末端；注意不要将胶液推出管外，因为这样会造成溶液的损失，导致最后凝胶体积不够；
8.分别将高浓度、低浓度注射器放在梯度传送系统的正确一侧固定好，注意这里一定要把位置放正确；再将注射器的聚丙烯管同Y形管相连；
9.轻柔并稳定地旋转凸轮来传送溶液，在这个步骤中最关键的是要保持恒定匀速且缓慢地推动凸轮，以使溶液恒速的被灌入到三明治式的凝胶板中；
10.小心插入梳子，让凝胶聚合大约一个小时。并把电泳控制装置打开，预热电泳缓冲液到60 °C ；
11.迅速清洗用完的设备；
12.聚合完毕后拔走梳子，将胶放入到电泳槽内，清洗点样孔，盖上温度控制装置使温度上升到60 °C ；
13.用注射针点样(预先准备好的活性污泥16SrDNA V3区PCR扩增产物，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化);
14.电泳条件为电压200V，时间为5h；
15.电泳完毕后，先拨开一块玻璃板，然后将胶放入盘中。用去离子水冲洗，使胶和玻璃板脱离；
16.倒掉去离子水，加入250ml固定液(10%乙醇，0.5%冰醋酸)中，放置15min ；
17.倒掉固定液，用去离子水冲洗两次，倒掉后加入250ml银染液(0.2% AgN03，用之前加入200μ1甲醛)中，放置在摇床上摇荡，染色15min ；
18.倒掉银染液，用去离子水冲洗两次，倒掉后加入250ml显色液(1.5% NaOH, 0.5%甲醛)显色；
19.待条带出现后拍照；
20.分析图谱。
[0039]结果分析，实施I和实施例2中的综合微生物均在3代以内，菌种稳定没有发生基因突变。
[0040]最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形，例如将培养桶槽更换为其它培养器具或者更改培养时间等；本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种综合微生物的培养方法，包括以下步骤: (O前期准备: (A)灭菌处理:分别对实验操作空间、操作者衣着和手进行清洁和消毒；对培养桶槽和培养皿进行灭菌处理； (B)制备B1lite水:取大于预定培菌体积的自来水置入干净桶槽内；在所述桶槽内加入B1lite丝光细粉；于所述桶槽内导入曝气，曝气方式为连续曝气，曝气时间为不小于24h;曝气完成后静置3~5天，并测定水中的金属离子的含量，直至水中的金属离子含量为零后待用； (C)检查设备和材料:观察培菌桶槽的外观是否完整无破损，排水孔洞的盖子是否旋紧；检查曝气设备是否安装完成，曝气设备以及其阀门是否正常工作；检查培菌所需的材料的种类和数量是否正确； (2)按比例配制培养材料，并将培养材料加入培养桶槽:所述培养材料包括MOLT原生菌液、SOFT生菌粉体、B1lite丝光细粉、光合成菌液GPB、B1lite水和有机营养物； (3)导入曝气，进行繁殖培养:将步骤(2)中的培养材料放入培养桶槽，并在培养桶内加入营养物质，所述营养物质包括碳源、氮源、无机盐类以及水源；培养基的PH值为6~10，培菌室的温度为0~60°C ;曝气方式为连续曝气和微曝气，首先进行连续曝气，连续曝气的时间至少为7天；连续曝气完成后，再进行微曝气，微曝气时间至少24h ;后续培养的过程中，可以根据菌种繁殖的状况进行连续曝气与微曝气轮换曝气；从而得到繁殖的MOLT菌液； (4)取液观察: (a)取液:取出所述步骤(3)中得到的繁殖的MOLT菌液，待用； (b)稀释菌液:将步骤(a)中所取出的待用的MOLT菌液，分别取出等量的3份，分别加入生理盐水稀释为1000倍、10000倍和100000倍，得到三种不同比例的稀释菌液； (c)平板培养:将步骤(b)中的三种不同比例的稀释菌液用针筒分别取出等量的稀释菌液放入3个具有培养基的培养皿中，将接种环在酒精灯火焰上灼烧直至烧红，在酒精灯火焰旁冷却接种环，将接种环伸入平板内，按“之”字形划线，使菌液均匀分布，盖上培养皿盖，不要划破培养基；将平板倒置放在培养箱中，培养温度为30~40°C，培养时间至少为24h ;观察并拍摄照片记录不同培养时间下的各种菌的菌种和菌相； (5)分离并检测:同时将步骤(3)中得到的繁殖的MOLT菌液采用DGGE电泳设备进行分离并检测，并分析图谱； (6)取液储存:当观察发现步骤(3)中的菌液中菌数达到标准后，取出培养桶槽内菌液总重量的6~8%的菌液进行放置保存，然后在按比例添加培养材料至培养桶槽内，使菌液总重量维持不变；同时将曝气方式改为连续曝气，连续曝气时间至少为24h，连续曝气完成后，再进行微曝气，并重复步骤(4)和步骤(5)，直至观察发现菌液中菌数达到标准，则重复步骤(6)的上述操作。2.如权利要求1所述的综合微生物的培养方法，其特征在于，所述步骤(I)中的(A)步骤的灭菌方法为化学药剂消毒法，即采用75%的无水乙醇消毒后再采用紫外线消毒法，在紫外线照射下消毒至少lh，以达到灭菌的目的。3.如权利要求2所述的综合微生物的培养方法，其特征在于，所述步骤(I)中的(B)步骤中加入B1lite丝光细粉的量为自来水重量的0.5%~0.8%。4.如权利要求3所述的综合微生物的培养方法，其特征在于，当培养方式为原代培养时，所述步骤(2)中的培养材料的体积比例为:MOLT原生菌液占总体积的63%~68%，S0FT生菌粉体占总体积的1%~3%，B1lite丝光细粉占总体积的0.05%~0.15%，光合成菌液GPB占总体积的0.5%~1.0%，B1lite水占总体积的30%~35%，有机营养物占总体积的0.5%~1%。5.如权利要求3所述的综合微生物的培养方法，其特征在于，当培养方式为分代培养时，所述步骤(2)中的培养材料的体积比例为:M0LT原生菌液占总体积的30%~35%，S0FT生菌粉体占总体积的1%~3%，B1lite丝光细粉占总体积的0.05%~0.15%，光合成菌液GPB占总体积的0.5%~1.0%，B1lite水占总体积的63%~68%，有机营养物占总体积的0.5%~1%。6.如权利要求4或5所述的综合微生物的培养方法，其特征在于，所述步骤(4)中的(b)步骤中所取出的等量的3份待用的MOLT原生菌液均为Iml或2ml。7.如权利要求6所述的综合微生物的培养方法，其特征在于，所述步骤(4)中的(c)步骤中所取出的等量的3份稀释菌液均为0.1ml或0.2ml。8.如权利要求7所述的综合微生物的培养方法，其特征在于，所述MOLT原生菌液由MOLT原生菌配制而成；所述MOLT原生菌为从大自然中无污染的深层土壤中提取并经过筛选、驯化、培育所得；所述MOLT原生菌中包括好氧菌和厌氧菌，所述好氧菌与所述厌氧菌的比例为8~12:1，溶解氧Do的值不小于0.2mg/Lo9.如权利要求8所述的综合微生物的培养方法，其特征在于，所述步骤(2)中培养室的温度为16~30°C。10.如权利要求9所述的综合微生物的培养方法，其特征在于，所述步骤(4)的(c)步骤中观察并拍摄照片记录不同培养时间为24h、48h和72h。
【专利摘要】本发明公开了一种综合微生物的培养方法，包括以下步骤：（1）前期准备：（A）灭菌处理；（B）制备Biolite水；（C）检查设备和材料：（2）按比例配制培养材料；（3）导入曝气，进行繁殖培养；（4）取液观察；（a）取液；（b）稀释菌液；（c）平板培养；（5）分离并检测；（6）取液储存；通过该综合微生物培养方法简单可操作性强，培养的综合微生物均在3代以内，菌类稳定不发生突变，且繁殖快速。
【IPC分类】C09K101/00, C02F3/30, C09K17/00, C12N1/00, C02F11/02
【公开号】CN104893977
【申请号】CN201510241971
【发明人】辜正隆
【申请人】江苏恒丰科技有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月13日