用于改善大脑的合生素组合物的制作方法

用于改善大脑的合生素组合物的制作方法
【专利说明】用于改善大脑的合生素组合物 发明领域
[0001] 本发明涉及包含合生素的营养组合物，用于改善大脑和认知表现，特别是社会互 动和空间记忆表现。本发明特别适合年龄为6个月或低于6个月的婴儿、早产婴儿，以及适 合患炎症、过敏反应或特应性疾病（atopic disease)的婴儿或幼儿。
[0002] 发明背景
[0003] 消化道与大脑之间的关系和营养在此关系中所起的作用引起越来越多的关注。一 个复杂的、双向的交流系统存在于消化道与大脑之间，其确保胃肠道稳态和保持消化作用， 且其反过来可影响认知功能和行为以及心理功能和行为。在一些个体中，消化道与大脑的 这种关系被破坏，造成肠道炎症与增加的焦虑、抑郁、疼痛敏感度改变和/或降低的认知表 现的并发症（co-morbidity)。
[0004] 特别是在婴儿和幼儿中，这样的并发症是不想要的，因为在婴儿期，认知系统 仍在发育，且这种发育的干扰可能具有长期的持续影响。围产期大脑可塑性（brain plasticity)提高了对早期压力条件（如重复的疼痛、或炎症）下的易损性，这可能造成异 常的认知发育和行为。
[0005] 母乳喂养是喂养婴儿的优选方法。但是，也有不能进行或不希望进行母乳喂养的 情况。在这些情况下，婴儿配方物是一种良好的替代品。调节现代婴儿配方物的组成以满 足快速生长和发育的婴儿的许多特殊营养需求。仍可进行进一步的改善。本发明涉及婴儿 的营养组合物，特别是婴儿配方物，其包含用于改善认知表现和行为的特定成分。
[0006] WO 2012/092160和US2012/0171165公开了包括可给予个体的人乳寡糖的营养组 合物，所述个体包括早产婴儿、婴儿、幼儿和儿童，用于改善肠胃功能和耐受性和有益细菌 的成长。还公开了使用包括人乳寡糖的营养组合物的另外的合适方法。WO 2011/051482 公开了婴儿和/或儿童营养组合物，其包含乳铁蛋白（Iactoferrin)和益生菌。WO 2008/111832公开了一种针对婴儿的语言和/或社交能力的疗法，所述疗法通过给予刺激 健康的肠道菌群发育的组分实现。
[0007] WO 20011/047107和US 2011/086809公开了支持新生儿视网膜、肠和/或神经系 统发育的方法，提供精氨酸-谷氨酰胺二肽。列出了许多作为可用于给予所述二肽的婴儿 配方物的一部分的其他成分。实施例所支持的效果是预防氧诱导视网膜病的小鼠模型中视 网膜病的早熟，及在小鼠模型中监测细胞凋亡蛋白酶-3活性和"肠损伤分值"预防高氧症 (hyperoxia)诱发的肠道和大脑损伤。
[0008] US 2007/207132公开了包含短双歧杆菌和不可消化的碳水化合物的混合物的制 剂，用于非母乳喂养婴儿或部分母乳喂养婴儿，及其用于预防非母乳喂养婴儿或部分母乳 喂养婴儿免疫紊乱的治疗的用途。
[0009] 根据摘要，JP19950099779公开了一种改善学习能力的组合物，其包含含唾液酸的 寡糖衍生物。
[0010] Olubukunola 等的"Intestinal perforation in very low birth weight infants: growth and neurodevelopment at !year of age?, J. Perinatology vol.25，no. 9(2005)583 - 589[XP002704986]，在存活的患坏死性小肠结肠炎 (enterocolitis)引起的肠穿孔与患自发性肠穿孔的极低出生体重儿中比较了婴儿的生长 和神经发育。没有公开介入治疗。
[0011] Field 等的 "A comparison of symptoms used by mothers and nurses to identify an infant with colic"Int. J. Nursing Studies vol.31, no.2(1994)201 - 215[XP022870583]，用多种因素论述家长认为鉴定疝气的方法，包括饮食行为、母亲的焦 虑、婴儿的和母亲的饮食以及婴儿的压力。没有公开介入治疗。
[0012] US 2011/208153记载了用于向要求小量营养支持的受试者，如早产婴儿，递送水 溶性和脂溶性营养物的配方物和方法，用于预防或纠正营养不足。包含脂肪酸如DHA和/ 或ARA、氨基酸如精氨酸和谷氨酰胺和其它营养物的营养配方物适于通过鼻胃管、胃内喂养 和幽门给予的递送。在许多其它成分中，益生菌仅仅作为其他成分提及。在各种成分中没 有提及短双歧杆菌，并且，根据其背景描述，谷氨酰胺可为作为快速分裂的细胞（如肠道肠 上皮细胞和淋巴细胞）的主要燃料的成分。
[0013] De Kieviet 等的 "Effects of glutamine of brain development in very preterm children at school age"Pediatrics vol. 130,no.5 (2012)1121 - 1127[SP009168039]，研宄了在出生后第一个月内向非常早产婴儿短期给予谷氨酰胺对以 后（学龄期）大脑发育的影响。类似的研宄在De Kieviet等的"Effects of neonatal enteral glutamine supplementation on cognitive, motor and behavioral outcomes in very preterm and/or very low birth weight children at school age?,British J. Nutrition vol 108, no. 12 (2012) 2215 - 2220中报道。基于其中使用的行为结果测试，推 断出在生命第3天和30天之间补充谷氨酰胺对非常早产婴儿的和/或VLBW儿童在学龄时 的长期认知、运动和行为结果既不具有有益效果也不具有不利效果，但接受了谷氨酰胺的 儿童的视觉运动能力更低。

【发明内容】

[0014] 发明人意外地发现，当使用以短双歧杆菌结合不可消化的寡糖（优选地还结合谷 氨酰胺）为膳食补充的动物模型时，引起改善的认知和行为表现。特别是，发现降低了焦虑 水平，改善了空间记忆。在一个优选实施方案中，特别是极大地和/或显著地改善了空间记 忆。在另一个优选实施方案中，还极大地和/或显著地改善了社交互动。
[0015] 另外，发明人发现，作为食物过敏症或先天性过敏症模型，小鼠对卵白蛋白（OVA) 敏感，与对照小鼠相比，之前暴露于过敏原的小鼠表现更高焦虑水平和受损的空间记忆，即 使在测试期间其本身没有被施加过敏原暴露。此外，在之前暴露于过敏原的小鼠中，海马 体中的脑衍生神经营养因子（BDNF)信使RNA(mRNA)与P-糖蛋白的表达增加。这些动物 的均质化海马细胞的FACS分析揭示OVA诱发的⑶11〇卞4/80+0068_巨噬细胞的增加。在对 OVA-过敏的小鼠大脑中观察到的提高的巨噬细胞水平源自循环：这与观察到的脑血屏障 的降低结合，暗示了外周驱动的单核细胞在诱发在过敏的小鼠中观察到的大脑功能降低中 的作用。当前的数据显示，过敏症-或先天性过敏症-依赖的外周炎症改变大脑炎症性状 态，并且抑制动物的认知能力，说明过敏在如认知和行为异常的神经疾病和神经炎症的发 展和/或演进中起作用。因此，据我们所知，这是第一次证明患过敏症或先天性过敏症的受 试者具有与受损的肠脑轴类似的症状。
[0016] 已发现，当用短双歧杆菌结合不可消化的寡糖（合生素）进行膳食补充时，OVA-诱 发的异常认知的、行为的和分子的改变恢复到不过敏的对照小鼠中观察到的水平，显示在 过敏的小鼠中，这种饮食干预导致认知和行为功能的甚至更显著的改善。另外，提高的 OVA-诱发的⑶11C+F4/80+⑶68_巨噬细胞的效力被合生素处理降低。合生素处理引起增加 的 CDllb+CD68+F4/80低细胞。
[0017] 使用以葡聚糖硫酸钠（DSS)诱发肠炎的小鼠模型，发现暴露于DSS的小鼠表现出 更高的焦虑水平和受损的空间记忆，而自发活动不受影响。与基于合生素的单独的抗炎症 作用预估程度相比，合生素的介入在更大的程度上减弱这些影响。而且，该数据说明，合生 素组合物比单独的短双歧杆菌或不可消化的寡糖更有效。
[0018] 因此，短双歧杆菌结合不可消化的寡糖的使用特别适合改善婴儿和幼儿的认知和 行为表现，特别是年龄为6个月或小于6个月的婴儿、早产婴儿、相对胎龄而言身材较小 (SGA)的婴儿、通过剖腹生产术出生的婴儿、患过敏症或有患过敏症风险的婴儿和幼儿以及 患肠炎的婴儿和幼儿。
[0019] 而且，本发明人发现，牛乳过敏症（CM)模型与紊乱的社会互动和受损的空间记 忆有关，与非过敏性的对照小鼠相比，之前对乳清蛋白敏感的小鼠显示较少的社会互动和 更少的空间记忆。这些观察强调如在上述模型中研宄的过敏症在认知和行为表现上的影 响。对于已补充了短双歧杆菌、不可消化的寡糖（合生素）和谷氨酰胺的小鼠，社交互动 和交替或空间记忆的水平被改善至相当于非过敏性小鼠的水平。因此，短双歧杆菌与不可 消化的寡糖和谷氨酰胺一起使用特别适合于在婴儿和幼儿，特别是年龄在6个月或小于6 个月的婴儿、早产婴儿、相对胎龄而言身材较小（SGA)的婴儿、经剖腹生产术出生的婴儿、 患过敏症或有患过敏症风险的婴儿和幼儿以及患肠炎的婴儿和幼儿中，改善认知和行为表 现，特别是改善空间记忆和/或社交互动。
[0020] 此外，本文呈现的数据还有趣地显示，用有或没有谷氨酰胺的包含短双歧杆菌、不 可消化的寡糖（合生素）的饮食对正常、非过敏性小鼠进行膳食补充，导致社会互动方面的 改善，并且用短双歧杆菌、不可消化的寡糖（合生素）和谷氨酰胺的饮食进行补充导致显著 改善的空间记忆表现。
[0021] 本发明还涉及适于喂养早产婴儿的试剂盒，其包括以下构件或由以下构件组成： 两个、三个、四个或五个不同容器和使用说明书，说明所述试剂盒包括以下构件或由以下构 件组成：包含谷氨酰胺、果糖寡糖（FOS)和半乳糖寡糖（GOS)的第一容器和包含短双歧杆菌 的第二容器。优选地，所述试剂盒还包含一个或多个额外的容器，所述容器包含蛋白质补充 物、人乳增强剂和/或早产婴儿配方物。所述试剂盒优选包含用于喂养早产婴儿的试剂盒 的使用说明书。
【具体实施方式】
[0022] 因此，本发明涉及改善婴儿或幼儿的认知表现、认知发育、行为表现、行为发育和/ 或社会互动的方法，包括向所述婴儿或幼儿给予包含短双歧杆菌且包含至少一种不可消化 的寡糖的营养组合物，所述不可消化的寡糖选自果糖寡糖（fructo-oligosaccharides)、半 乳糖寡糖（galacto-oligosaccharides)、葡萄糖寡糖（gluco-oligosaccharides)、阿拉伯 糖寡糖（arabino-oligosaccharides)、甘露糖寡糖（mannan-oligosaccharides)、木糖寡糖 (xylo-oligosaccharides)、岩藻糖寡糖（fuco-oligosaccharides)、阿拉伯半乳糖寡糖（ar abinogalacto-oligosaccharides)、葡萄甘露糖寡糖（glucomanno-oligosaccharides)、半 乳甘露糖寡糖（galactomanno-oligosaccharides)、包含唾液酸的寡糖和糖醛酸寡糖。
[0023] 本发明还可被表述为短双歧杆菌与至少一种不可消化的寡糖或者包含短双歧杆 菌与所述至少一种不可消化的寡糖的组合物用于生产用于在婴儿或幼儿中改善认知表现、 认知发育、行为表现、行为发育和/或社会互动的营养组合物的用途，所述至少一种不可消 化的寡糖选自果糖寡糖、半乳糖寡糖、葡萄糖寡糖、阿拉伯糖寡糖、甘露糖寡糖、木糖寡糖、 岩藻糖寡糖、阿拉伯半乳糖寡糖、葡萄甘露糖寡糖、半乳甘露糖寡糖、包含唾液酸的寡糖和 糖醛酸寡糖。在一个方面，本发明特别涉及改善认知表现，优选涉及记忆表现，优选空间记 忆表现。而且，本发明特别涉及改善社会互动。
[0024] 本发明还可被表述为包含短双歧杆菌且包含至少一种不可消化的寡糖的营养组 合物，用于在婴儿或幼儿中改善认知表现、认知发育、行为表现、行为发育和/或社会互动， 所述不可消化的寡糖选自果糖寡糖、半乳糖寡糖、葡萄糖寡糖、阿拉伯糖寡糖、甘露糖寡糖、 木糖寡糖、岩藻糖寡糖、阿拉伯半乳糖寡糖、葡萄甘露糖寡糖、半乳甘露糖寡糖、包含唾液酸 的寡糖和糖醛酸寡糖。在一个方面，本发明特别涉及改善认知表现，优选涉及记忆表现，优 选空间记忆表现。而且，本发明特别涉及改善社会互动。
[0025] 在本发明方法或用途的优选实施方案中，所述婴儿或幼儿选自年龄为6个月或低 于6个月的婴儿、早产婴儿、相对胎龄而言身材较小（SGA)的婴儿、经剖腹生产术出生的婴 儿、患过敏症的婴儿或幼儿或有患过敏症风险的婴儿或幼儿以及患肠炎的婴儿或幼儿。在 本发明方法或用途的优选实施方案中，为所述婴儿或幼儿提供营养。
[0026] 本发明还涉及在婴儿或幼儿中治疗或预防认知表现降低、认知发育降低、行为表 现降低、行为发育降低、社会互动降低和/或神经炎症，优选认知表现降低，优选记忆表现 降低，优选空间记忆表现降低和优选社会互动降低的方法，所述婴儿或幼儿选自患过敏症 的婴儿或幼儿、有患过敏症风险的婴儿或幼儿、患肠炎的婴儿或幼儿、和早产婴儿，所述方 法包括向所述婴儿或幼儿给予包含短双歧杆菌和包含至少一种不可消化的寡糖的营养组 合物，所述不可消化的寡糖选自果糖寡糖、半乳糖寡糖、葡萄糖寡糖、阿拉伯糖寡糖、甘露糖 寡糖、木糖寡糖、岩藻糖寡糖、阿拉伯半乳糖寡糖、葡萄甘露糖寡糖、半乳甘露糖寡糖、包含 唾液酸的寡糖和糖醛酸寡糖。
[0027] 本发明还可被表述为短双歧杆菌和至少一种不可消化的寡糖或包含短双歧杆菌 和所述至少一种不可消化的寡糖的组合物用于生产营养组合物的用途，所述不可消化的寡 糖选自果糖寡糖、半乳糖寡糖、葡萄糖寡糖、阿拉伯糖寡糖、甘露糖寡糖、木糖寡糖、岩藻糖 寡糖、阿拉伯半乳糖寡糖、葡萄甘露糖寡糖、半乳甘露糖寡糖、包含唾液酸的寡糖和糖醛酸 寡糖，所述营养组合物用于在年龄为6个月或低于6个月的婴儿、早产婴 儿、相对胎龄而言 身材较小（SGA)的婴儿、经剖腹生产术出生的婴儿、患过敏症的婴儿或幼儿或有患过敏症 风险的婴儿或幼儿及患肠炎的婴儿或幼儿中治疗或预防认知表现降低、认知发育降低、行 为表现降低、行为发育降低、社会互动降低和/或神经炎症，优选认知表现降低，优选记忆 表现降低，优选空间记忆表现降低，优选社会互动降低。
[0028] 本发明还可被表述为包含短双歧杆菌和包含至少一种不可消化的寡糖的营养组 合物，用于在婴儿或幼儿中治疗或预防认知表现降低、认知发育降低、行为表现降低、行为 发育降低、社会互动降低和/或神经炎症，优选认知表现降低，优选记忆表现降低，优选空 间记忆表现降低，优选社会互动降低，所述不可消化的寡糖选自果糖寡糖、半乳糖寡糖、葡 萄糖寡糖、阿拉伯糖寡糖、甘露糖寡糖、木糖寡糖、岩藻糖寡糖、阿拉伯半乳糖寡糖、葡萄甘 露糖寡糖、半乳甘露糖寡糖、包含唾液酸的寡糖和糖醛酸寡糖，所述婴儿或幼儿选自年龄为 6个月或低于6个月的婴儿、早产婴儿、相对胎龄而言身材较小（SGA)的婴儿、经剖腹生产术 出生的婴儿、患过敏症的婴儿或幼儿或有患过敏症风险的婴儿或幼儿及患肠炎的婴儿或幼 儿。
[0029] 在本发明方法或用途的优选实施方案中，向婴儿或幼儿提供营养，所述婴儿或幼 儿选自年龄为6个月或低于6个月的婴儿、早产婴儿、相对胎龄而言身材较小（SGA)的婴 儿、经剖腹生产术出生的婴儿、患过敏症的婴儿或幼儿或有患过敏症风险的婴儿或幼儿及 患肠炎的婴儿或幼儿。
[0030] 本发明还涉及喂养方法或向婴儿或幼儿提供营养的方法，所述婴儿或幼儿选自年 龄为6个月或低于6个月的婴儿、早产婴儿、相对胎龄而言身材较小（SGA)的婴儿、经剖腹 生产术出生的婴儿、患过敏症的婴儿或幼儿或有患过敏症风险的婴儿或幼儿及患肠炎的婴 儿或幼儿，所述方法包括给予一种营养组合物，其包含a)短双歧杆菌，b)至少一种不可消 化的寡糖，其选自果糖寡糖、半乳糖寡糖、葡萄糖寡糖、阿拉伯糖寡糖、甘露糖寡糖、木糖寡 糖、岩藻糖寡糖、阿拉伯半乳糖寡糖、葡萄甘露糖寡糖、半乳甘露糖寡糖、包含唾液酸的寡糖 和糖醛酸寡糖，c)游离氨基酸和/或含谷氨酰胺的二肽和/或含谷氨酰胺的三肽形式的 谷氨酰胺和优选d)花生四稀酸和/或二十二碳六稀酸（docosahexaenoic acid)形式的 LC-PUFA0
[0031] 换句话说，本发明涉及一种营养组合物用于向婴儿或幼儿提供营养的用途，所述 营养组合物包含a)短双歧杆菌，b)至少一种不可消化的寡糖，其选自果糖寡糖、半乳糖寡 糖、葡萄糖寡糖、阿拉伯糖寡糖、甘露糖寡糖、木糖寡糖、岩藻糖寡糖、阿拉伯半乳糖寡糖、葡 萄甘露糖寡糖、半乳甘露糖寡糖、包含唾液酸的寡糖和糖醛酸寡糖，c)游离氨基酸和/或含 谷氨酰胺的二肽和/或含谷氨酰胺的三肽形式的谷氨酰胺和d)花生四烯酸和/或二十二 碳六烯酸形式的LC-PUFA，所述婴儿或幼儿选自年龄为6个月或低于6个月的婴儿、早产婴 儿、相对胎龄而言身材较小（SGA)的婴儿、经剖腹生产术出生的婴儿、患过敏症的婴儿或幼 儿或有患过敏症风险的婴儿或幼儿及患肠炎的婴儿或幼儿。
[0032] 本发明还可被表述为一种用于向婴儿或幼儿提供营养的营养组合物，所述营养组 合物包含a)短双歧杆菌，b)至少一种不可消化的寡糖，其选自果糖寡糖、半乳糖寡糖、葡萄 糖寡糖、阿拉伯糖寡糖、甘露糖寡糖、木糖寡糖、岩藻糖寡糖、阿拉伯半乳糖寡糖、葡萄甘露 糖寡糖、半乳甘露糖寡糖、包含唾液酸的寡糖和糖醛酸寡糖，c)游离氨基酸和/或含谷氨酰 胺的二肽和/或含谷氨酰胺的三肽形式的谷氨酰胺和优选d)花生四烯酸和/或二十二碳 六烯酸形式的LC-PUFA，所述婴儿或幼儿选自年龄为6个月或低于6个月的婴儿、早产婴儿、 相对胎龄而言身材较小（SGA)的婴儿、经剖腹生产术出生的婴儿、患过敏症的婴儿或幼儿 或有患过敏症风险的婴儿或幼儿及患肠炎的婴儿或幼儿。
[0033] 优选地，所述组合物包含
[0034] a)短双歧杆菌，其量为102-1013cfu/g营养组合物干重，
[0035] b)至少一种选自果糖寡糖、半乳糖寡糖的不可消化的寡糖，基于所述营养组合物 的干重计，其量为0. 5_20重量％，
[0036] c)游离氨基酸和/或含谷氨酰胺的二肽和/或含谷氨酰胺的三肽形式的谷氨酰 胺，基于所述营养组合物的干重计，其量为至少1. 5重量％，和优选地
[0037] d)花生四烯酸和/或二十二碳六烯酸形式的LC-PUFA。
[0038] 而且，本发明涉及一种营养组合物，其包含蛋白质、脂肪和可消化的碳水化合物， 而且还包含
[0039] a)短双歧杆菌，其量为102-1013cfu/g营养组合物干重，
[0040] b)至少一种选自果糖寡糖、半乳糖寡糖的不可消化的寡糖，基于所述营养组合物 的干重计，其量为0. 5_20重量％，
[0041] c)游离氨基酸和/或含谷氨酰胺的二肽和/或含谷氨酰胺的三肽形式的谷氨酰 胺，基于所述营养组合物的干重计，其量为至少1. 5重量％，和优选地
[0042] d)花生四烯酸和/或二十二碳六烯酸形式的LC-PUFA。
[0043] 短双歧杆菌
[0044] 本发明组合物包含短双歧杆菌。短双歧杆菌是革兰氏阳性的、厌氧的、分枝的杆 状细菌。当与模式菌株短双歧杆菌ATCC 15700比较时，该短双歧杆菌的16S rRNA序列优 选具有至少95%的同一性，更优选至少97%的同一性（Stackebrandt&Goebel，1994，Int· J. Syst. Bacteriol. 44:846-849)。优选的短双歧杆菌菌株是分离自健康人乳喂养的婴 儿的粪便的那些菌株。典型地，其可商购自乳酸菌的生产者，但其亦可从粪便直接分离、 鉴别、表征和生产。根据一个优选的实施方案，本发明组合物包含至少一种短双歧杆菌， 选自：短双歧杆菌Bb_03 (Rhodia/Danisco)、短双歧杆菌M-16V (Morinaga)、短双歧杆菌 R0070 (Institute Rosell, Lallemand)、短双歧杆菌BR03 (Probiotical)、短双歧杆菌 BR92) (Cell Biotech)、DSM 20091、LMG 11613、YIT4065、FERM BP-6223 和 CNCM 1-2219。最优选 地，所述短双歧杆菌选自短双歧杆菌M-16V和短双歧杆菌CNCM 1-2219,最优选M-16V。短 双歧杆菌 1_2219 记载于 W02004/093899，由 Compagnie Gervais Danone 于 1999 年 5 月 31日保藏在国立微生物保藏中心，巴斯德研宄所，巴黎，法国（Collection Nationale de Cultures de Microorganisms, Institute Pasteur, Paris, France) 〇 短双歧杆菌 M-16V 被 保藏为 BCCM/LMG23729,且可商购自 Morinaga Milk Industry Co. ,Ltd。
[0045] 本发明组合物优选含有IO2-IO13菌落形成单位（cfu)短双歧杆菌/g本发明组合 物干重，优选1〇4-1〇12,更优选1〇5-1〇1(1，最优选IO 5-IxlO8Cfu短双歧杆菌/g本发明组合物干 重。本发明的短双歧杆菌的剂量优选以102-1013,更优选105-10 12,最优选107-5X IO9菌落形 成单位（Cfu)的每日剂量给予。优选地，所述组合物包含IO3-IO13Cfu短双歧杆菌/100ml， 更优选IO6-IO11Cfu短双歧杆菌/100ml，最优选IO7-IO 9Cfu短双歧杆菌/100ml。
[0046] 本发明组合物优选包含活短双歧杆菌。或者，本发明组合物优选包含等价于上述 cfu量的无活性短双歧杆菌。通过用公开于W02005/039319的短双歧杆菌探针和引物在包 含无活性短双歧杆菌的产品（即婴儿配方物）中进行5'核酸酶分析，并将其与从类似产品 (如标准婴儿配方物）获得的校准曲线比较来判断等价的cfu，所述类似产品中添加了已知 cfu量的活（优选干燥的）短双歧杆菌。如上所述，所述干燥的活双歧杆菌是可商购的。可 通过本领域已知的方法将短双歧杆菌细胞制成失活的，包括热处理步骤（包括杀菌、巴氏 消毒法、UHT处理）、辐射（UV)、用氧气处理、用杀菌剂如乙醇处理、超声、超高压应用、高压 匀质和使用细胞粉碎机。优选地，所述短双歧杆菌被加热灭活。无活性的短双歧杆菌的存 在有利地提供许多产品技术成效，包括延长保质期、降低细菌污染发生率、减少产品的后酸 化作用、改善剂量控制和改善复溶的便利性。消耗灭活的短双歧杆菌还显示了减少过敏和 炎症方面的有益效果。
[0047] 不可消化的寡糖
[0048] 本发明组合物包含不可消化的寡糖（NDO)。如本发明使用的术语"寡糖"优选指 聚合度（DP)为2-250的糖，优选DP为2-100,更优选2-60。可以理解，在本发明上下文中， DP在某个范围的糖可包括具有不同平均DP的糖的混合物，例如，如果本发明组合物包括一 种具有DP为2-100的寡糖，这可包括含平均DP为2-5、平均DP为50-70和平均DP为7-60 的寡糖的组合物。如本发明使用的术语"不可消化的寡糖"指不能或只部分地在肠中通过 存在于人上消化道（小肠和胃）中的酸或消化酶的作用而消化，而是由人肠道微生物群发 酵的寡糖。例如，蔗糖、乳糖、麦芽糖和麦芽糖糊精被认为可消化的。例如，半乳糖寡糖、果 糖寡糖被认为是不可消化的寡糖。
[0049] 不可消化的寡糖选自果糖寡糖（如菊粉）、半乳糖寡糖（如反式半乳糖寡糖或 β-半乳糖寡糖）、葡萄糖寡糖（如龙胆糖寡糖、黑曲霉寡糖（nigero-oligosaccharide)和 环糊精寡糖）、阿拉伯糖寡糖、甘露糖寡糖、木糖寡糖、岩藻糖寡糖、阿拉伯半乳糖寡糖、葡萄 甘露糖寡糖、半乳甘露糖寡糖、包含唾液酸的寡糖和糖醛酸寡糖。在一个实施方案中，本发 明营养组合物包含0. 5-20重量％不可消化的寡糖/g营养组合物干重。
[0050] 优选地，本发明组合物包含果糖寡糖和/或半乳糖寡糖，更优选半乳糖寡糖，最优 选反式半乳糖寡糖。在一个优选实施方案中，所述组合物包含反式半乳糖寡糖和果糖寡糖 的混合物。优选地，本发明组合物包含DP为2-10,优选平均DP为2-10的半乳糖寡糖，和 /或DP为2-60,优选平均DP为2-60,优选平均DP为10-60,优选平均DP为20-60的果糖 寡糖。在一个实施方案中，本发明组合物包含DP为2-10,优选平均DP为2-10的半乳糖寡 糖，和/或DP为2-10,优选平均DP为2-10的果糖寡糖。优选地，所述组合物包含重量比为 20:0. 5的半乳糖寡糖与果糖寡糖，更优选20:1，最优选12:2。
[0051] 所述半乳糖寡糖优选选自反式半乳糖寡糖、乳-N-四糖（LNT)、乳-N-新四糖 (新-LNT)、岩藻糖基-乳糖、岩藻糖基化的LNT和岩藻糖基化的新-LNT。在一个特别优选 的实施方案中，本发明方法包括给予反式半乳糖寡糖（[半乳糖]n-葡萄糖；其中η是1-60 的整数，即2、3、4、5、6、···.、59、60 ;优选η选自2、3、4、5、6、7、8、9或10)。例如，反式半乳 糖寡糖（TOS)以商标 Vivinal?(Borculo Domo Ingredients, Netherlands)出售。优选地， 反式半乳糖寡糖的糖是β连接的。
[0052] 在一个实施方案中，本发明组合物优选包含果糖寡糖。如本文使用的术语"果 糖寡糖"指不可消化的多糖，其包含至少2个β连接的果糖单元的链，该多糖的DP为 2-250,优选7-100,更优选20-60。在一个实施方案中，优选使用菊粉。例如，菊粉可由商标 "Raftilin HP? "，（Orafti)获得。本发明果糖寡糖的平均DP优选至少7,更优选至少10， 优选低于100。所用的果糖寡糖优选具有（大部分的）以β (2 - 1)键连接的果糖单元。 果糖寡糖的其它术语包括菊粉、果多糖、多聚果糖、果聚糖和低聚果糖。本发明组合物优选 包含DP为2-200,优选7-100,更优选20-60的果糖寡糖。在一个实施方案中，本发明营养 组合物优选包含2个不同的果糖寡糖部分，一部分的平均DP为2-20而第二部分的平均DP 为20-60,或一部分的平均DP为2-10而第二部分的平均DP为10-60。
[0053] 优选地，所述组合物包含80mg-2g/100ml的不可消化的寡糖，更优选 150mg-l. 50g，甚至更优选300mg-lg/100ml。基于干重计，所述组合物优选包含0. 25重 量％ -20重量％，更优选0.5重量％ -10重量％，甚至更优选1.5重量％ -7. 5重量％的不 可消化的寡糖。优选地，基于干重计，所述组合物包含IO2-IO13Cfu短双歧杆菌/g和0. 25 重量％ -20重量％不可消化的寡糖，更优选地，基于干重计，IO5-IOltlCfu短双歧杆菌/g和 〇. 5重量％ -10重量％不可消化的寡糖。优选地，所述组合物包含IO3-IO13Cfu短双歧杆菌 和80mg-2g不可消化的寡糖/100ml，更优选地，IO6-IO11Cfu短双歧杆菌和300mg-lg不可消 化的寡糖/l〇〇ml。
[0054] 优选地，所述营养组合物包含i) I X IO5Cfu-I X IOltlCfu短双歧杆菌/g干重，更优 选I X IO6Cfu-I X IOltlCfu ;和ii)基于干重计，0. 5-20重量％半乳糖寡糖，更优选地，0. 5-10 重量％半乳糖寡糖或iii)基于干重计，0.05-2%果糖寡糖，更优选0. 1-1重量％果糖寡糖 或同时包含ii)和iii)。
[0055] 谷氨酰胺
[0056] 本发明的营养组合物优选包含谷氨酰胺。在本说明书通篇，此亦被称为包含谷氨 酰胺的营养组合物或富含谷氨酰胺的营养组合物。本发明中的谷氨酰胺指L-谷氨酰胺。 谷氨酰胺是血浆和人乳中最丰富的氨基酸之一，被认为是早产婴儿条件必需的。在所有快 速分裂细胞例如肠道组织和某些免疫细胞中，谷氨酰胺作为能量来源和核苷酸合成原料使 用。在大脑中，谷氨酰胺是神经递质的底物，也是神经系统重要的能量来源。谷氨酰胺与短 双歧杆菌和不可消化的寡糖一起，有利地对认知表现、行为、 过敏症、神经炎症和/或肠炎 的预防具有进一步改善或协同效果。年龄为6个月或低于6个月的婴儿、早产婴儿、相对胎 龄而言身材较小（SGA)的婴儿、经剖腹生产术出生的婴儿、患过敏症的婴儿或幼儿或有患 过敏症风险的婴儿或幼儿及患肠炎的婴儿或幼儿可能对谷氨酰胺耗尽特别敏感，这是因为 出生后最初的几周内谷氨酰胺的营养供应有限。此外，这些婴儿利用谷氨酸盐合成谷氨酰 胺的内在能力受损，特别地，这些能力在早产婴儿和SGA婴儿中并未完全发育。
[0057] 谷氨酰胺优选以易于吸收的形式存在。由于所述SGA和/或早产婴儿的肠道不成 熟，以完整蛋白质形式存在的谷氨酰胺较不易被吸收。因此，所述谷氨酰胺优选以游离氨基 酸和/或包含谷氨酰胺的二肽和三肽的形式存在，最优选包含谷氨酰胺的二肽和/或游离 谷氨酰胺。游离谷氨酰胺和包含谷氨酰胺的二肽和包含谷氨酰胺的三肽是可商购的，例如 在Ajinomoto, USA购得。在一个实施方案中，当本发明的营养组合物处于液体形式时，所述 组合物包含少于0. 3g/l的精氨酸-谷氨酰胺二肽，或基于所述组合物的干重计，少于2. 5 重量％，优选少于1. 5重量％，更优选少于1重量％，甚至更优选少于0. 5重量％精氨酸-谷 氨酰胺二肽。在一个实施方案中，本发明的营养组合物不包含精氨酸-谷氨酰胺二肽。
[0058] 本发明的营养组合物优选包含比正常存在于人乳蛋白质或基于来自牛乳的蛋白 质的标准早产婴儿配方物中的谷氨酰胺水平更高的谷氨酰胺水平。优选地，基于总蛋白质 计，本发明的营养组合物包含至少12重量％，更优选至少15重量％，甚至更优选至少30 重量％的谷氨酰胺。优选地，基于所述营养组合物的干重计，本发明的营养组合物包含至 少L 5重量％，更优选至少2重量％，甚至更优选至少4重量％的谷氨酰胺。优选地，基于 IOOkcal计，本发明的营养组合物包含至少0. 3g，更优选至少0. 5g，甚至更优选至少Ig谷氨 酰胺。优选地，本发明的营养组合物每100mL包含至少0. 4g，更优选至少0. 6g，甚至更优选 至少I. 25g谷氨酰胺。优选地，基于总蛋白质计，本发明的营养组合物包含至少12重量％， 更优选至少15重量％，甚至更优选至少30重量％谷氨酰胺，以游离氨基酸和，如果存在，以 包含谷氨酰胺的二肽和包含谷氨酰胺的三肽的形式。优选地，基于所述营养组合物的干重 计，本发明的营养组合物包含至少1. 5重量％，更优选至少2重量％，甚至更优选至少4重 量％谷氨酰胺，以游离氨基酸和，如果存在，以包含谷氨酰胺的二肽和包含谷氨酰胺的三肽 的形式。优选地，基于IOOkcal计，本发明的营养组合物包含至少0. 3g，更优选至少0. 5g， 甚至更优选至少Ig谷氨酰胺，以游离氨基酸和，如果存在，以包含谷氨酰胺的二肽和包含 谷氨酰胺的三肽的形式。
[0059] 优选地，包含谷氨酰胺的本发明营养组合物为干燥形式，优选是粉末。此粉末适于 用水或其它水相复溶。当谷氨酰胺为粉末形式，其有利地具有更好的保质期。谷氨酰胺，特 别是游离谷氨酰胺和谷氨酰胺二肽，当以干燥形式储存时更稳定。
[0060] LC-PUFA
[0061] 优选地，本发明组合物包含长链多不饱和脂肪酸（LC-PUFA)，更优选n-3和 n-6LC-PUFA，甚至更优选花生四烯酸（ARA)和二十二碳六烯酸（DHA)。LC-PUFA是脑膜的脂 肪酰基链组成的重要部分，因此有利地改善认知的和行为的表现或发育和预防神经炎症。 LC-PUFA，特别是ARA和DHA的存在，与短双歧杆菌和不可消化的寡糖一起将具有进一步改 善的或甚至协同的有益效果。n-3LC-PUFA(特别是二十二碳六烯酸（DHA))是脑膜的脂肪 酰基链组成的重要部分，并且有利地改善认知的和行为的表现或发育。更优选地，本发明 组合物包括n-3LC-PUFA，甚至更优选DHA。由于低浓度的DHA已有效，本发明组合物中的 n-3LC-PUFA的含量，优选不超过总脂肪酸含量的15重量％，优选不超过10重量％，甚至更 优选不超过5重量％。优选地，本发明组合物包含总脂肪酸含量的至少0. 2重量％、优选至 少〇. 5重量％、更优选至少0. 75重量％的n-3LC-PUFA。DHA含量优选不超过总脂肪酸含量 的5重量％，更优选不超过1重量％，但是优选至少0. 1重量％。优选地，作为n-3LC-PUFA 单细胞油的来源，优选使用海藻油、真菌油和/或微生物油，因为这些油来源具有低EPA/ DHA比例，这导致对大脑的改善作用。更优选地，本发明组合物包含鱼油，更优选金枪鱼油。
[0062] n-6LC-PUFA，特别是花生四烯酸（ARA)是脑膜的脂肪酰基链组成的重要部分，有 利地改善认知的和行为的表现或发育。本发明组合物优选包含相对低含量的ARA。基于总 脂肪酸计，n-6LC-PUFA含量优选不超过5重量％，更优选不超过0. 8重量％，更优选不超过 0. 75重量％，甚至更优选不超过0. 5重量％。由于ARA对于婴儿的最佳功能膜，特别是神经 组织的膜是重要的，基于总脂肪酸计，n-6LC-PUFA含量优选至少0. 02重量％，更优选至少 〇. 05重量％，甚至更优选至少0. 1重量％，更优选至少0. 25重量％。
[0063] 本发明婴儿营养物中n-6LC-PUFA/n-3LC-PUFA的重量比，特别是ARA/DHA的重量 比优选为3-0. 5,更优选2-1。优选地，所述重量比大于1。这些比例确保最佳的大脑功能。
[0064] 优选以游离脂肪酸、甘油三酸酯形式、甘油二酸酯形式、甘油单酸酯形式、磷脂形 式或上述一种或多种的混合物的形式提供LC-PUFA。优选地，本发明组合物包含甘油三酸酯 和/或磷脂形式的LC-PUFA，甚至更优选磷脂形式，因为磷脂形式的LC-PUFA能更好地并入 膜中。因此，当与以甘油三酸酯形式给予相比，磷脂形式的LC-PUFA膳食来源将对大脑具有 进一步的改善作用。因此，LC-PUFA的优选来源是蛋黄磷脂。磷脂丰富且在所述磷脂分子 中含有花生四烯脂肪酰基链和二十二碳六烯的脂肪酰基链的蛋黄油的商业来源是已知的。
[0065] 组合物
[0066] 有利地，本发明涉及一种组合物，其中脂质提供总热量的5-50%，蛋白质提供总热 量的5-50%，碳水化合物提供总热量的15-90%。优选地，在本发明组合物中，脂质提供总 热量的35-50%，蛋白质提供总热量的7. 5-12. 5%，碳水化合物提供总热量的40-55%。对 于计算蛋白质成分占总热量的％，需要考虑由蛋白质、肽和氨基酸提供的总能量。
[0067] 本发明组合物优选包含至少一种脂质，其选自动物脂质（不包括人脂质）和植物 脂质。优选地，本发明组合物包含植物脂质和至少一种油的组合，所述油选自鱼油、动物油、 海藻油、真菌油和细菌油。含不可消化的寡糖和短双歧杆菌的本发明组合物不含人乳。
[0068] 本发明组合物优选包含蛋白质。用于营养制剂的蛋白质成分优选选自非人的动物 蛋白质（优选乳类蛋白质，优选来自牛乳的蛋白质）、植物蛋白质（优选大豆蛋白质和/或 米蛋白）、游离氨基酸和其混合物。本发明组合物优选包含酪蛋白、乳清蛋白、水解酪蛋白和 /或水解乳清蛋白。优选地，所述蛋白质包含完整蛋白质，更优选完整的牛乳清蛋白和/或 完整的牛酪蛋白。由于本发明组合物优选适用于患过敏症或有患过敏症风险的婴儿，所述 蛋白质优选选自水解的乳蛋白，更优选水解的乳清蛋白。由于本发明组合物优选适用于早 产婴儿或SGA婴儿，所述蛋白质优选选自水解的乳蛋白，更优选选自水解的乳清蛋白和水 解的酪蛋白。
[0069] 本发明组合物优选包含可消化的碳水化合物。本发明组合物优选包含可消化的碳 水化合物成分，其中至少35重量％、更优选至少50重量％、更优选至少75重量％、甚至更 优选至少90重量％、最优选至少95重量％是乳糖。本发明组合物优选包含至少25g乳糖 /100g本发明组合物干重，优选至少40g乳糖/100g。
[0070] 所述液体营养组合物优选具有热量密度为0. 1-2. 5kcal/ml，甚至更优选热量密度 为0. 5-1. 5kcal/ml，最优选热量密度为0. 6-0. 8kcal/ml。每天给予营养组合物的量优选为 50-2000ml，更优选 200-1500,最优选 400-1000ml。
[0071] 在一个实施方案中，本发明营养组合物是早产婴儿配方物。所述早产婴儿配方物 包含早产婴儿或SGA婴儿所需的所有大量和微量营养物，从而实现类似于具有令人满意的 功能发育以及胎儿成长的生长。
[0072] 在一个优选实施方案中，基于早产婴儿配方物的干重计，所述早产婴儿配方物包 含5-25重量％蛋白质，优选9-20重量％，更优选13-18重量％蛋白质。在一个优选实施 方案中，优选地，每100mL所述早产婴儿配方物包含1.8-3. Og蛋白质，优选2. 0-3. 0g，优选 2. 5g-2. 6g 蛋白质。
[0073] 优选地，基于总蛋白质计，本发明的早产婴儿配方物包含至少12重量％、更优选 至少15重量％、甚至更优选至少30重量％谷氨酰胺。优选地，基于总蛋白质计，本发明的 早产婴儿配方物包含不超过80重量％、更优选不超过50重量％谷氨酰胺。优选地，基于早 产婴儿配方物的干重计，本发明的早产婴儿配方物包含至少1. 5重量％、更优选至少2重 量％、甚至更优选至少4重量％谷氨酰胺。优选地，基于早产婴儿配方物的干重计，本发明 的早产婴儿配方物包含不超过20重量％、更优选不超过10重量％谷氨酰胺。优选地，基于 IOOkcal早产婴儿配方物计，本发明的营养组合物包含至少0. 3g、更优选至少0. 5g、甚至更 优选至少Ig谷氨酰胺。优选地，基于IOOkcal早产婴儿配方物计，本发明的早产婴儿配方 物包含不超过5g、甚至更优选不超过2g谷氨酰胺。
[0074] 在一个优选实施方案中，每100mL的立即可饮用形式的本发明的早产婴儿配方物 具有约 70-90kcal，优选 75-85kcal。
[0075] 优选地，所述早产婴儿配方物的渗透性低于450m0sm〇l/l，更优选低于400,甚至 更优选低于350。特别在早产婴儿中，太高的渗透性是不利的。
[0076] 在一个实施方案中，本发明涉及一种补充物，适于强化人乳，适于强化用标准人乳 强化剂强化的人乳或适于强化标准早产婴儿配方物。在本发明的上下文中，补充物不包含 早产婴儿所需的所有大量和微量营养物，从而实现类似于具有令人满意的功能发育以及胎 儿成长的生长。
[0077] 在一个实施方案中，本发明的营养组合物是出院后配方物（post discharge formula)。该后释放配方物包含早产婴儿所需的所有大量和微量营养物，从而实现类似于 具有令人满意的功能发育以及胎儿成长的生长。
[0078] 因此，在一个实施方案中，本发明或用于本发明用途的营养组合物包含蛋白质、月旨 肪和/或可消化的碳水化合物，且选自婴儿起始配方物、婴儿后续配方物、幼儿乳、早产婴 儿配方物、后释放配方物和人乳强化剂。
[0079] 在一个具体实施方案中，本发明涉及适于和意在用于喂养早产婴儿的试剂盒，其 包括或由最高达五个不同的容器和使用说明构成，各容器具有不同的内容物。所述试剂盒 包含或由包含谷氨酰胺和至少一种不可消化的寡糖的第一容器和包含短双歧杆菌的第二 容器构成，所述谷氨酰胺优选为游离氨基酸、二肽和/或三肽形式，所述至少一种不可消化 的寡糖选自果糖寡糖、半乳糖寡糖、葡萄糖寡糖、阿拉伯糖寡糖、甘露糖寡糖、木糖寡糖、岩 藻糖寡糖、阿拉伯半乳糖寡糖、葡萄甘露糖寡糖、半乳甘露糖寡糖、包含唾液酸的寡糖和糖 醛酸寡糖，更优选至少果糖寡糖（FOS)和半乳糖寡糖（GOS)的组合。
[0080] 优选地，所述试剂盒也包括一个或多个包含（蛋白质）补充物的容器，所述补充物 适于强化人乳、适于强化用标准人乳强化剂强化的人乳或适于强化标准早产婴儿配方物。 这样的补充物不包含早产婴儿所需的所有大量和微量营养物，从而实现类似于具有令人满 意的功能发育以及胎儿成长的生长。
[0081] 在优选实施方案中，所述试剂盒的第一容器包含游离氨基酸形式、谷氨酰胺二肽、 谷氨酰胺三肽和/或精氨酸-谷氨酰胺二肽的谷氨酰胺，并且存在果糖寡糖（F0S或IcFOS) 和半乳糖寡糖（G0S或scGOS)。GOS和FOS可如说明书其他地方描述使用。谷氨酰胺与不可 消化的寡糖GOS和FOS总和的重量比优选为2:1-1:4,更优选为1:1-1:3,最优选为约1: 2。 优选地，所述容器是小袋（或有2-100个独立小袋的一捆）或锡罐。优选地，所述谷氨酰胺 /G0S/F0S以干燥形式存在，优选为粉末形式。在一个实施方案中，所述第一容器包含灭菌液 体形式的谷氨酰胺/G0S/F0S，更优选以浓缩形式或作为每日单位剂量以防止腐坏。
[0082] 在一个优选实施方案中，所述试剂盒包含其中含短双歧杆菌M16V的容器，优选如 在标题"短双歧杆菌"下所述的。优选地，所述容器是小袋，或有2-100个独立小袋的一捆。 优选地，所述短双歧杆菌以干燥形式存在，优选粉末形式。所述容器优选包含作为每日单位 剂量的短双歧杆菌以防止腐坏。该容器优选包含〇. 5 X IO9Cfu-I XlOltl,优选以每日剂量为 I X 109-5 X IO9Cfu提供。在一个实施方案中，该容器优选包含0. 5 X IO9Cfu-I X 101(1，优选 lX 109-5X 109cfu/g 粉末。
[0083] 在优选实施方案中，试剂盒中包括含蛋白质补充物的容器，基于所述蛋白质补充 物的总热量计，所述蛋白质补充物包含至少50%蛋白质，和/或基于所述蛋白质补充物的 干重计，至少50重量％蛋白质。优选地，基于所述蛋白质补充物的总热量计或基于所述蛋 白质补充物的干重计，所述蛋白质补充物包含至少50%重量％蛋白质，更优选至少60重 量％或至少70重量％，甚至更优选至少80重量％蛋白质。所述蛋白质补充物的蛋白质优 选包含或（广泛地）由水解的乳清蛋白和/或水解的酪蛋白组成。所述蛋白质补充物优选 以干燥形式如干燥粉末提供，或作为无菌液体提供。优选以每日单位剂量提供以防止腐坏 或在锡罐中提供，锡罐的容量为50-400g，更优选100-300g。当作为无菌液体存在时，优选 其存在于体积为4-100mL的容器中。
[0084] 人乳无法总是向早产婴儿提供所有所需的营养物，因为人 乳意在被足月婴儿消 耗，而早产婴儿具有提高的营养需求。因此，在优选实施方案中，在所述试剂盒中包括一 个容器，该容器包括用于人乳的强化剂，即人乳强化剂（HMF)。所述HMF可以干燥形式提 供，如干燥的粉末。优选地，所述HMF的热量密度为250-425kcal/100g粉末，更优选地， 300-375kcal/100g粉末。优选地，所述HMF的蛋白质含量为20-40En%，优选包含酪蛋白和 /或乳清蛋白，且优选碳水化合物含量为50-80En %，更优选60-75En %。所述HMF优选在小 袋或在一捆小袋中提供，如2-100个小袋或25-75个小袋，容量为l-5g。优选以每日单位剂 量提供以防止腐坏。
[0085] 所述试剂盒的任选的使用说明优选含有以g/kg/天或g/100mL立即可饲喂产品的 形式使用谷氨酰胺、G0S/F0S和短双歧杆菌的使用说明，例如：
[0086] a) 0· 05-0. 5g/100mL，优选 0· 1-0. 3g/100mL L-谷氨酰胺，和 0· 1-1. 0g/100mL，优 选0. 2-0. 6g/100mL的G0S/F0S (优选重量比为9:1)，和/或，
[0087] b)以0. 1-0. 6g/kg/天的剂量提供，优选以0. 2-0. 4g/kg/天的剂量提供的L-谷 氨酰胺，和以〇. 2-1. 2g/kg/天的剂量提供，优选以0. 4-0. 8g/kg/天的剂量提供的GOS/ FOS (优选重量比为9:1)，
[0088] 和
[0089] c)以0· 5*109cfu-l*101Q的每日剂量提供，优选以lX109cfu-5X10 9cfu的每日剂 量提供的短双歧杆菌。优选地，在一天内给予的所有独立喂养剂量中平均分配每日剂量。
[0090] 在一个实施方案中，本发明涉及上述试剂盒用于向早产婴儿提供营养的用途，特 别是实现以上讨论的和实施例支持的效果。
[0091] 应用
[0092] 本发明方法或用途具体地意在用于婴儿和/或幼儿。婴儿的年龄在0-12个月，幼 儿的年龄在12-36个月。
[0093] 本发明组合物优选经肠内给予，更优选经口给予。本发明组合物优选是营养配方 物，优选婴儿配方物。本发明组合物可有利地作为婴儿的完全营养物使用。本发明组合物优 选包含脂质、蛋白质和碳水化合物，且优选以液体形式给予。本发明包括干燥的组合物（如 粉末），其伴有将所述干燥的组合物（特别是营养配方物）与合适的液体（如水）混合的说 明。
[0094] 本发明优选涉及喂养婴儿的方法，所述婴儿选自早产（=不成熟的）婴儿和非常 不成熟的婴儿。早产婴儿在孕期第37周结束之前出生。非常早产婴儿在孕期第32周结束 之前出生。SGA婴儿是那些出生体重位于该胎龄的婴儿体重第10百分位数以下的婴儿。他 们通常是子宫内生长受限（IUGR)的个体。不成熟的婴儿和/或SGA婴儿包括低出生体重 婴儿（LBW婴儿）、极低出生体重婴儿（VLBW婴儿）和超低出生体重婴儿（ELBW婴儿）。LBW 婴儿被定义为体重低于2500g的婴儿。VLBW婴儿被定义为体重低于1500g的婴儿，而ELBW 婴儿被定义为体重低于1000 g的婴儿。
[0095] 本发明涉及改善婴儿或幼儿的认知表现、认知发育、行为表现和/或行为发育。在 优选的实施方案中，认知表现或认知发育是记忆表现或记忆发育，包括空间记忆表现。在一 个优选实施方案中，本发明涉及改善社会互动或改善社会互动行为。在一个方面，在给予时 立即观察到上述效果，优选在24个月内，更优选在12个月内，更优选在6个月内，最优选在 3个月内。在又一实施方案中，在以后生活中，当所述人受试者年龄为36个月以上的时候， 观察到对认知表现和/或行为表现和/或神经炎症的效果。优选在5岁以上的时候。然而， 在一个方面，这样的铭记效应（imprinting effect)不是本发明的一部分。
[0096] 此外，本发明涉及治疗或预防（或降低风险）婴儿或幼儿中降低的认知表现、降低 的认知发育、降低的行为表现、降低的行为发育和/或神经炎症，所述婴儿或幼儿选自患过 敏症的婴儿或幼儿、有患过敏症风险的婴儿或幼儿、患肠炎的婴儿或幼儿和早产婴儿。在特 别优选的实施方案中，本发明涉及治疗或预防（或降低风险）婴儿或幼儿中降低的社交互 动、降低的空间记忆和行为发育，或改善社交互动、空间记忆和/或行为发育，所述婴儿或 幼儿选自患过敏症的婴儿或幼儿、有患过敏症风险的婴儿或幼儿、患肠炎的婴儿或幼儿和 早产婴儿。
[0097] 因此，本发明提供了向人婴儿和/或幼儿提供营养的方法，所述方法包括向所述 婴儿和/或幼儿给予本发明组合物。优选地，所述婴儿和/或幼儿的年龄在0-36个月，更 优选0-18个月，甚至更优选0-12个月，最优选）-6个月。
[0098] 实施例
[0099] 实施例1 :短双歧杆菌和不可消化的寡糖的饮食干预降低焦虑并且可改善认知表 现。
[0100] C57B1/6小鼠，被喂以对照膳食，Morinaga的短双歧杆菌M-16V(2% wt:wt 2xl090卩11/^;益生菌）、6?(1%￥1::￥1:，9:18。603:1。？03;益生元&代13；[01:;[(3))或两者（6?/1313)的 组合。605来源^￥丨仙1-605，10?05来源：1^^丨1丨11册。分别用这些膳食喂养小鼠约3周。
[0101] 在第19天和20天，在250X250X200mm的活动场所评估动物的自发运动。底面 的光强是201ux。评估一般的自发运动以确定动物的身体不受DSS或OVA处理的影响。自 动追踪动物的运动（TSE系统，德国）。花费在开放区域中央的时间被看作是焦虑的度量并 被自动追踪。其也可被认为是探索活动的度量。将各动物置于开放区域的中央，允许其探 索5分钟，之后将其返回其居住笼。
[0102] 使用T-迷宫范例（T-maze paradigm)在19天和20天评估空间工作记忆。此程 序改编自Deacon and Rawlins, 2006。实验由两轮组成，两轮时间间隔2分钟。从起始臂 释放小鼠后，该动物在两个目标臂中自由选择。一旦所述动物进入一个目标臂时，另一个目 标臂立刻关闭，其中通过降低该目标臂的门将该动物禁闭30秒。然后将该动物返回其居住 笼。在用70%乙醇完全清洁T-迷宫后，该鼠被放回起始臂然后自由选择其中一个目标臂。 主要度量是变化率，其被定义为发生变化的实验比例（先去左臂然后去右臂，反之亦然）， 除以实验的总量。用变化比例乘以100%来计算自发变化的百分比。一天进行总计4次实 验。
[0103] 在接受对照膳食的小鼠中，在T-迷宫模型中测量的认知表现（空间记忆）为约 78%，以自发变化的平均％表示。在接受GF/Bb的健康小鼠中，观察到轻微的提高，达到约 80%〇
[0104] 对于行为表现（焦虑，用以s计的在开放区域中央花费的平均时间表示），在对照 膳食喂养的小鼠中为约95s。出人意料地，与对照组相比，在接受GF/Bb的健康小鼠中观察 到明显升高（至约121s)。
[0105] 实施例2 :短双歧杆菌和不可消化的寡糖的饮食干预预防过敏症诱发的降低的认 知表现、焦虑和神经炎症。
[0106] 在对卵白蛋白（OVA ;Sigma) 口服敏化作用的两周前及其期间，用对照膳食或用短 双歧杆菌M-16V (2% wt: wt，2xl09 CFU/g)和 scGOS/lcFOS (1 % wt: wt，9: IscGOS: IcFOS ;GF/ Bb膳食）补充的膳食饲喂三至四周大的雌性无特定病原体的Balb/c小鼠 （Charles River Laboratories, Maastricht, The Netherlands)。通过每次口 服管饲（oral gavage)给予 0· 5mL 含 20ug/mL 霍乱毒素（CT)的无菌 PBS 或 0· 5mL 含 20ug/mL CT 和 40mg/mL OVA 的 无菌PBS，使小鼠敏化。连续五周，每周一次，使小鼠敏化。敏化后，一些小鼠在耳廓（ear pinnae)通过皮内注射（i. d.)接受IOug 0VA/100uL无菌PBS，以评估给药后1小时的急性 皮肤变态反应，所述评估通过使用数字测微计（Mitutoyo, Veenendaal，The Netherlands) 一式两份地测量耳朵厚度进行。在注射前进行基础耳厚度的耳肿胀度校正。通过口服管饲 给予IOOmg 0VA/0. 5mL无菌PBS攻击小鼠。攻击后15-30分钟收集粪便并评估水含量。
[0107] 如实施例1中所述，用T迷宫和开放区域实验测试认知和行为表现。此外，还测 试筑巢行为。已显示，筑巢行为取决于完整的海马体功能。为评估0VA/DSS动物的海马体 功能的完整性，进行筑巢建筑范例（nesting building paradigm)。在巢建筑能力方面，评 估0VA/DSS及相应处理（即合生素）的效果。简而言之，向动物提供两份纸塔过夜。次日 上午（12小时后）在4分系统中为纸塔巢建筑评分：(0)无筑巢：没有显著证据表明材料被 触碰过；（1)少量筑巢：部分材料被使用或散落在笼中，但仍未形成巢位；（2) -般筑巢：所 有的筑巢材料已被用于筑巢，但巢是平的一一不存在侧壁；（3)有效筑巢；形成巢杯（nest cup)，但是侧壁没有完全提高；(4)完美筑巢；完全形成巢位，具有围绕巢洞的高且紧凑的 侧壁。
[0108] 经口攻击后18小时处死小鼠，将血液收集到Minicollect? Z Serum S印管 (Greiner)中。将血液在14000x g下离心30分钟，并将血清保存在-20°C。
[0109] 从右半脑分离海马体并称重后，用RNAeasy试剂盒（Qiagen，Germantown，MD USA) 从海马体分离RNA，随后，用iScript cDNA合成试剂盒（BioRad，Hercules，CA USA)将 其逆转录为cDNA。使用具有CFX 96实时系统（BioRad，Hercules，CA USA)的iQ SYBR Green超级混合试剂盒（BioRad，Hercules，CA USA)进行实时PCR。用GAPDH使表达水 平标准化，并用3-6(^方法计算。所用引物为64?0!1引物$:604了0^6040^0^4(^6， R:ACGCCACAGCTTTCCAGAGG)和 BDNF 引物(F:GAAGGCTGCAGGGGCATAGAC ； R:TACACAGGAAGTGTCTATCCTTAT)。每个感兴趣的基因的各样品一式两份地进行实验。
[0110] 如本领域公知地测定OVA-特异性血清免疫球蛋白。用IOOmL 20ug/mL碳酸盐/碳 酸氢盐缓冲液（〇. 05M，pH = 9. 6)中的OVA包被Microlon板（Greiner)。将该板用PBS/5% BSA封闭1小时。之后，将样品多重稀释并孵育2小时，之后与生物素化大鼠抗-小鼠 IgE、 IgGl或IgG2a(lug/mL ;BD Biosciences) -起孵育90分钟。接着，将板与抗生物素蛋白链 菌素-辣根过氧化物酶（horse radish peroxidase) (0· 5ug/mL ;Sanquin) -起孵育 I 小 时，用邻苯二胺显影。用2M H2SOjS止反应，在酶标仪（Bio-Rad)中测定490nm的光密度。
[0111] 收集细胞并将其置于 PBS/2 % FCS 中。用 CD16-PE(3G8 ;BD Biosciences)、 DC-SIGN-FITC(120507)、CX3CIU-FITC(528728;均来自 R&D Systems)、 CD14-PerCp-Cy5(61D3)、 CD40-FITC(5C3)、 CD80-PE(2D10.4)、 CD83-PE(HB15e)、 CD86-PE(1T2. 2)、CD103-APC(B-Ly7)、HLA-DR-PE(LN3)或 CD103-Alexa Fluor?. 647(B-Ly7) (eBioscience)抗体表征 MoDC。用 CD4-PerCP-Cy5. 5(0KT-4)和 CD25-Alexa Fluor 488(BC96)抗体对⑶4+T细胞进行胞外染色，随后根据制造者的方案用Foxp3染色缓 冲组（eBioscience)固定化和透性化。用Foxp3_PE(PCH101，eBioscience)抗体对T细胞 进行胞内染色。使用FITC-标记的小鼠 IgG2b、PE-标记的小鼠 IgG2b、PerCP-Cy5. 5-标记 的小鼠 IgGl和CFluorei6SO-标记的小鼠 IgGl抗体作为同型对照（eBioscience)。染色 后，将moDC置于PBS/2% FCS中，用2%多聚甲醛固定并测量平均荧光强度。用同型背景染 色校正平均荧光强度。
[0112] 统计：所有结果以平均值土标准误差（SEM)表示，并且，如果p值等于或小于 〇.〇5，平均值间的差异被认为是显著的。使用非参数的统计（&1181?11-1 &11&检验）分 析被动回避延迟次数（passive avoidance latency times)、T-迷宫自发改变和筑巢分 值，随后用Dunn' s多次比较检验（multiple comparison test)进行事后分析（post-hoc analysis)。使用双因子变异数分析（two-way AN0VA)分析开放区域的所有活动、组织学的、 分子的和免疫组织化学数据，之后进行Bonferonni校正的事后分析。
[0113] MM.
[0114] 如可从耳肿胀效果和血浆中OVA-特异性IgE水平推断出，卵白蛋白过敏症诱导的 方案是有效的。对照小鼠的耳肿胀为约50um，而在OVA敏化小鼠中时明显更高，约150um〇 消耗GF/Bb膳食的OVA敏化小鼠显示约IOOum的明显降低的耳肿胀。
[0115] 在对OVA不敏感的小鼠中不存在OVA特异性IgE。在接受对照膳食的OVA敏化小 鼠中，观察到OVA特异性IgE (0D 490nm约为0. 91)，而接受GF/Bb膳食的小鼠中，该值明显 更低，约为0. 33。
[0116] 腹泻样症状，由粪便中的水分判断，在非过敏小鼠及消耗GF/Bb 膳食的OVA过敏小 鼠中为约55%，而在消耗对照膳食的OVA过敏小鼠中，粪便明显地含更多水分（约63% )。
[0117] 与对照小鼠相比，OVA攻击对T-迷宫或开放区域延迟没有影响，表明空间记忆损 伤不依赖于任何潜在的令人厌恶的身体不适。
[0118] 如可从表1示出的结果推断，所述GF/Bb处理以统计学显著的方式减弱OVA诱导 的降低的认知表现。应该注意到，该实验在敏化作用一周后进行，这实际上使当急性变态反 应已经消失时的任何潜在的不利影响最小化。而且，在接受GF/Bb膳食的健康小鼠中观察 到非常少的改善效果。
[0119] 表1 :T诛宮试骀，夺化％
[0120]
[0121] 如可从表2示出的结果推断，所述GF/Bb处理以统计学显著的方式在5次攻击中 减弱了 OVA诱导的提高的焦虑水平。应该注意到，也是在敏化后48小时的时间点进行开放 区域测试，这实际上使当急性变态反应已经消失时的任何潜在的不利影响最小化。而且，在 接受GF/Bb膳食的健康小鼠中观察到显著的提高效果。
[0122] 表2 :在中央的开放R域时间（s)
[0123]
[0124] 如可从表3示出的结果推断，所述GF/Bb处理以统计学显著的方式减弱OVA诱导 的下降的筑巢行为。
[0125] 表3:筑巢分数
[0126]
[0127] 暴露于过敏源的小鼠表现出更高的焦虑水平、受损的空间记忆和扰乱的筑巢行 为，其可通过消耗GF/Bb膳食预防和/或治疗。
[0128] 这些不足与脑源性神经营养因子（BDNF)信使RNA (mRNA)和海马体中P-糖蛋白的 降低的表达同时发生。重要的是，如表4所示，合生素标准化的OVA-诱导的异常认知和分 子变化。降低的P-糖蛋白mRNA水平表明被扰乱的血脑屏障。Foxp3的mRNA水平也被OVA 敏化作用降低，但这一效果被本发明的膳食减弱。F0Xp3是调节性T-细胞的转录因子，其抑 制炎症反应。BDNF在正常神经发育中起重要作用，并对突触可塑性（synaptic plasticity) 和学习和记忆非常重要。小鼠中的降低的BDNF水平预示大脑和感觉神经系统的发育缺陷。
[0129] 在对照膳食的对照小鼠中，P-糖蛋白的水平被设定为1。在接受GF/Bb膳食的对 照小鼠中没有观察到显著差异。在接受对照膳食的OVA过敏小鼠中，P-糖蛋白水平显著降 低至约0. 5。在接受GF/Bb膳食的OVA过敏小鼠中，该值为0. 9 (且与健康对照组没有显著 差异）。
[0130] 在对照膳食的对照小鼠中，BDNF的水平被设定为1。在接受GF/Bb膳食的对照小 鼠中没有观察到显著差异。在接受对照膳食的OVA过敏小鼠中，该值明显降低至约0. 45。 在接受GF/Bb膳食的OVA过敏小鼠中，该值为0. 93 (且与对照组没有显著差异）。在接受 GF/Bb膳食的对照小鼠中没有观察到显著差异。
[0131 ] 在对照膳食的对照小鼠中，Foxp3的水平被设定为1。在接受GF/Bb膳食的对照小 鼠中没有观察到显著差异。在接受对照膳食的OVA过敏小鼠中，该值明显降低至约0. 44。 在接受GF/Bb膳食的OVA过敏小鼠中，该值为I. 0 (且与对照组没有差异）。
[0132] 另外，匀质化海马体细胞的FACS分析揭示了 OVA-诱导的⑶llc+F4/80+CD68_巨噬 细胞的显著增加，其被合生元处理降低至对照水平。合生素增加了⑶Ilb+⑶68+F4/80is细 胞。
[0133] 暴露于过敏源的小鼠显示更高的焦虑水平和受损的空间记忆。这些缺陷与脑源性 神经营养因子（BDNF)信使RNA(mRNA)和海马体中P-糖蛋白的降低的表达同时发生。在 OVA-过敏小鼠的大脑中观察到的提高的巨噬细胞水平可能源自循环，其与观察到的脑血 屏障的降低一起，揭示外周-驱动的单核细胞在诱导在过敏小鼠中观察到的有力的大脑功 能降低中为潜在的关键因素。当前数据支持这样的观点：过敏症-依赖的外周感染影响大 脑炎症状态并抑制动物的认知能力，说明过敏症可能在神经疾病的发展和/或演进中起作 用，以及含GF/Bb的膳食可对其进行预防和/或治疗。
[0134] 重要地，含GF/Bb的膳食使所有这些OVA-诱导的异常认知和分子变化正常化。
[0135] 实施例3 :含短双歧杆菌和不可消化的寡糖的饮食干预改善认知和行为表现，特 别地减弱小鼠中DSS诱发的胃肠炎症和相关的认知和行为缺陷。
[0136] 用对照膳食，短双歧杆菌M-16V(2% wt:wt 2X109 CFU/g;益生菌）、GF(1% ￥七^9:18〇605:1〇?05;益生元）或上述两者（6?/^3)的组合物喂养实施例1的05781/6 小鼠。在诱发结肠炎之前2周和期间，用相应膳食饲喂小鼠6天。通过向饮用水中添加 1.5%葡聚糖硫酸钠（DSS)诱发结肠炎。从向饮用水添加 DSS的时间点开始监测粪便密实 度（feces consistency)(分值0 =正常，1 =软但有形，2 =腹泻）、排泄物中发现血液（分 值〇 =无血，1 =试验阳性，2 =排泄物中可见新鲜血液；结肠-直肠试剂盒，Axon Lab AG， Stuttgart，Germany)和体重。在其它动物的组中，没有用DSS诱发结肠炎。
[0137] 分别在DSS处理的第5天和第6天，使用实施例1中描述的试验，用T-迷宫和开 放区域范例评估接受GF/Bb或对照膳食的组的动物行为和认知变化。
[0138] 在IOOum细胞滤网（cell trainer)上捣碎组织，从派伊尔结（Peyer' s patch， PP)和肠系膜淋巴结（MLN)收集淋巴细胞。将从PP、MLN分离的细胞收集到PBS/2%FCS中。 用 10ug/mL CD16/CD32 抗体封闭 Fc γ -受体，随后用 CDllc-FITC、CD40-FITC、CD80-APC、 CD86-APC、CD103-APC、CD4-FITC 和 CD69-PerCP-Cy5. 5 抗体（全部来自 eBioscience)进 行胞外染色。用0. 5%多聚甲醛固定细胞，或随后根据制造者的胞内染色方案用Foxp3染 色缓冲组（eBioscience)进行固定化和透性化。使用Foxp3_APC、ROR-γΤ-ΡΕ、T-bet-PE 和GATA3_eFluor660抗体（全部来自eBioscience)进行胞内染色。使用FACSCantoII和 FACSDiVa软件（BD Biosciences)进行流式细胞分析。
[0139]
[0140] 使用GF或GF/Bb的饮食干预改善粪便密实度得分，推迟在排泄物中发现血液的发 生。在所有DSS处理组的第6天，分数在1.5以上。浏览第6天排泄物分数的总AUC，GF、 Bb和GF/Bb减少排泄物中血液的得分，观察到GF/Bb组的效果最好，其分数为约2. 7 (而对 照组中，观察到的为约4. 2，Bb组为约3. 0，GF组为约3. 7)。没有用DSS诱发结肠炎的动物 中，此分数为约0。
[0141] 在健康小鼠中，用短双歧杆菌M-16V、GF和特别是GF/Bb的饮食干预通过MLN中 的⑶Ilc+细胞增加了⑶80和⑶86的表达。DSS处理提高⑶80和⑶86的表达，但被MLN 中的CDllc+细胞抑制CD40的表达。在这些DSS-处理的小鼠中，用GF和GF/Bb的饮食干 预通过MLN中的⑶Ilc+细胞抑制⑶80和⑶86的表达。另外，DSS处理导致MLN中更低的 CDllc+CD103+细胞百分率，而短双歧杆菌M-16V、GF或特别是GF/Bb的饮食干预提高这些细 胞在MLN中的出现率。
[0142] 由于饮食干预增加⑶llc+CD103+细胞在MLN中的相对数量，短双歧杆菌M-16V、GF 或GF/Bb的饮食干预影响T细胞的极化。因此，用FACS分析⑶4+T细胞的表型一一表征为 活化的 T 细胞（CD4+CD69+)、ThI 细胞（CD4+T-bet+GATA-3〇、Th2 细胞（CD4+T-bet-GATA-3+)、 活化的 Th17 细胞（CD4+Ror- γ T+Foxp3〇 或 Treg细胞（CD4 +Ror- γ ΤΤοχρ3+)。MLN 中，当与 对照小鼠比较时，在DSS处理动物中观察到的趋势是活化T细胞百分比提高。短双歧杆菌 M-16V、GF或最大程度上的GF/Bb饮食干预倾向于降低MLN中活化T细胞的百分比。与MLN 中增加的⑶11C+⑶103+百分比一致，在喂以GF/Bb的DSS处理的小鼠中，在MLN中观察到 1?8细胞增加。当用短双歧杆菌M-16V或GF饲喂小鼠时，观察到类似的趋势（但到较少程 度）。另外，观察到MLN中Th17细胞减少的趋势。令人惊讶地，这些观察结果也同样在健康 小鼠中出现。
[0143] 简而言之，这表明与单一成分相比，使用GF/Bb的饮食干预最大程度上减弱 DSS-诱导的结肠炎及炎症，但是在所有组中，炎症在第5和6天较高的程度地出现。
[0144] 关于对认知和行为表现的效果，观察到4组（对照饮食或GF/Bb、DSS或无 DSS处 理）之间的自发活动没有差异，如在T迷宫和开放区域试验中的总活动（m)表现的。
[0145] 在接受对照饮食的小鼠中，如在T迷宫模型中测量的，DSS干预对认知表现的有害 效果是显著的（空间记忆，以自发变化的平均％表示）；从约78%降至约50%。在接受GF/ Bb饮食的DSS处理小鼠中，没有观察到这些DSS处理的有害作用，为约74%，明显高于对照 DSS组。在接受GF/Bb的健康小鼠中，可观察到轻微的提高（约80% )。
[0146] 对于行为表现（焦虑，以花费在开放区域中央的平均时间表示，单位为s)，在健康 对照小鼠中，为约95s。在接受对照饮食的DSS处理小鼠中，其显著降低至约55s。在接受 GF/Bb饮食的DSS组中，没有观察到减少，为约135s，且明显地高于对照DSS组。在接受GF/ Bb饮食的健康小鼠中，与健康对照组相比，观察到明显的提高（约121s)。
[0147] 急性DSS-处理导致肠炎、焦虑增加和空间记忆受损。所有参数被合生菌干预标准 化。现在的数据支持这个观点：即肠炎能导致认知和行为缺陷，而且合生素补充可能对患肠 炎的受试者的认知和行为表现有治疗的潜能。
[0148] 实施例4 :在小鼠的牛乳过敏模型中，用短双歧杆菌、不可消化的寡糖和谷氨酰胺 的饮食干预改善社会互动、认知表现和行为表现。
[0149] 繁殖并用牛乳的无蛋白质饮食（Special Diet Services, Witham, UK)喂养无病 原体、雄性C3H/HeOuJ小鼠（4周龄，Charles River Laboratories)，让其居住在12小 时光-暗循环的环境中，环境中有任意取用食物和水的入口。根据荷兰动物实验委员会 (Dutch Committee of Animal Experiments)指南进行所有动物程序。让小鼠口服0· 5mL 勾质的乳清蛋白（40mg/mL PBS)和霍乱毒素（CT，20 μ g/mL PBS，Quadratech Diagnostics) 作为佐剂使小鼠致敏；假致敏小鼠只接受CT。每周一次、连续5周，通过口服增强小鼠。最 后一次敏化作用的一周后，口服0. 5mL乳清（lOOmg/mL PBS)攻击小鼠。
[0150] 用对照饮食，或短双歧杆菌M-16V(2% wt:wt 2xl09 CFU/g ;益生菌）、GF(1% wt:wt，9: IscGOS: IcFOS ;益生元）和谷氨酰胺（5重量％ )的组合物[GF/Bb/Gln]饲喂小 鼠。605来源：￥"丨仙1-605，1〇?05来源：1^代丨1丨11册。谷氨酰胺来源 ：5丨8111&。在第一次敏 化作用前两周开始饮食直到试验结束。
[0151] 最后，使小鼠进行社会互动和空间记忆测试。牛乳过敏症与紊乱的社会互动和受 损的空间记忆有关，因此适于研宄此处的饮食干预效果。
[0152] 社会互动测试
[0153] 口服激发试验的次日上午，将小鼠暴露于社会互动测试。将小鼠置于45X45cm的 开放区域，将一个小的多孔有机玻璃笼子靠着一面墙壁放置，以允许视觉、嗅觉和最小程度 的触觉互动。在适应期，允许小鼠在室内探索5分钟。在互动期，在笼中引入一只年龄-和 性别-匹配的不熟悉目标小鼠，持续另外5分钟。通过使用视频跟踪软件（EthoVision 3. 1. 16, Noldus)，通过数字计算确定笼的互动区域。测量花费在互动区域的时间及在选定 时间期间进入互动区域的频率。
[0154] T诛宮苧间记忆表现试骀
[0155] T迷宫自发性改变是测量动物的探索行为和空间记忆表现行为的实验，特别是 CNS疾病的啮齿动物模型。此实验基于啮齿动物探索新环境的意愿，即较喜欢访问迷宫的 新臂而非熟悉的臂。大脑的许多部分--包括海马体、隔膜（septum)、基底前脑（basal forebrain)及前额皮质（prefrontal cortex)--都与此任务有关。
[0156] 首先将受试者置于T迷宫的起始臂。在离开起始臂时，受试者在进入左目标臂或 右目标臂之间选择。随着重复的实验，动物应表现出更低的进入之前访问过的臂的趋势。记 录变化的百分比（在各目标臂中的次数）及总实验持续时间。本试验用于对小鼠的转基因 品系的认知障碍进行定量，并评估新的化合物对认知的效果。在口服激发实验的当天评估 社会互动后，在T迷宫配置中测试自发改变。将各小鼠置于起始臂，并允许其探索T迷宫直 到其选择了一个目标臂。然后，让动物返回其居住笼，进行总计5次实验。实验之间用70% 乙醇将T迷宫完全清洁。改变比例被定义为其中动物改变的实验次数除以总实验次数。
[0157] 将关于社会互动和T改变的结果与在没有进行饮食干预的未致敏小鼠中观察到 的结果比较。
[0158]
[0159] 牛乳过敏模型示出了以不同方法研宄社会互动的良好模型。在表4中，对于致敏 小鼠，在互动区域的时间显著降低（对照-致敏小鼠 vs.对照-未致敏小鼠）。对于所有受 试饮食，由敏化作用诱发的降低的社会互动效果减少，但对于用GF/Bb饲喂的小鼠则明显 减少。使用非成对t-检验（unpaired t-test) vs CMA敏化对照产生表4提及的样品的统 计数据，以计算P值。与对照CMA小鼠相比，CMA GF/Bb得到明显改善（p = 0. 05)。
[0160] 表4.在互动区花费的时间（秒）
[0161]
[0162] 而且，出人意料地，以GF/Bb/Gln饮食饲喂的未敏化的小鼠（因此未使用CMA模型 研宄）与以对照饮食饲喂的未敏化的小鼠相比，在寻求更长时间的社会互动方面（由在互 动区花费的时间度量）显示了统计学证明的趋势（P〈〇. 10) (141+/-23. 6秒vs 199+/-21. 7 秒，p = 0. 08)。在此未敏化的、不过敏的健康背景下，GF/Bb/Gln的饮食补充的效果也超过 GF/Bb的补充的效果。
[0163] 用于测量社会互动的第二个参数是动物在预设时间间隔期间进入互动区域的频 率。出人意料地，对于以GF/Bb和GF/Bb/Gln饮食饲喂的CMA敏化小鼠，动物进入互动区域 的频率显著改善（对照CMA vs CMA GF/Bb与对照CMA vs GF/Bb/Gln的测定的p值分别为 p 0. 032和p0. 0095)，该频率暗示其寻求与年龄和性别匹配的不熟悉的目标鼠的互动。使 用非成对t-检验vs CM敏化对照产生表5提及的样品的统计数据，以计算p值。
[0164] 表5.进入互动区域的频率
[0165]
[0166] 牛乳过敏模型还示出了用T-迷宫自发改变行为测试研宄空间记忆的良好模型。 在表6中，与对照CM-小鼠观察到的状况相比，由敏化作用诱发的T-迷宫测试中减少变化 的效果在用补充了 GF/Bb饮食（p = 0. 06)以及补充了 GF/Bb/Gln的饮食（p = 0. 0005)饲 喂的小鼠中明显改善。使用非成对t-检验vs CM敏化的对照产生表6提及的样品的统计 数据，以计算P值。
[0167] 表6.空间记忆试验中的改变％
[0168]
[0169] 出人意料地，在健康的、未敏化的小鼠中也观察到GF/Bb、GF/Bb/Gln的饮食补充 对于没有补充的对照饮食相比，对空间记忆的有益效果。与对照饮食相比，以GF/Bb补充饮 食饲喂的不过敏、未受攻击的健康小鼠的空间记忆表现显示20%的增涨（p 0. 03，n = 12)。 对于GF/Bb/Gln补充的小鼠，此提高以17%的增涨显示了明确的统计学趋势（p = 0. 10, η =12) 〇
[0170] 实施例5 :含短双歧杆菌和不可消化的寡糖的早产婴儿配方物
[0171] 每100g粉末形式的早产婴儿配方物包含474kcal、15. 6g蛋白质、49. 8g可消化的 碳水化合物（主要是乳糖和麦芽糖糊精）、22. 9g脂肪和4. 7g不可消化的寡糖。基于总蛋 白质计，所述蛋白质包含约92. 5重量％的牛乳酪蛋白和乳清蛋白，重量比为1:1. 5。约7. 5 重量％的蛋白是游离L-谷氨酰胺。不可消化的寡糖是半乳糖寡糖（来源Vivinal GOS， Borculo Domo)和多聚果糖（来源RaftilinHP，Orafti)，其重量比为9:1。由于EU条例， GOS中的不可消化的二糖不能作为膳食纤维。因此纤维含量被标记为3. 3g/100g粉末。每 g粉末中存在IO7Cfu的短双歧杆菌M-16V(Morinaga)。脂肪主要源自植物，金枪鱼油（DHA 来源）、海藻油（ARA来源）、花生四烯酸（ARASCO, Martek)及卵脂质（DHA和ARA来源）作 为LC-PUFA的来源存在，产生基于总脂肪酰基链计，0. 52重量％ ARA，基于总脂肪酰基链计， 0. 40重量％ DHA。此外，如本领域已知并根据早产婴儿指南，所述组合物包含矿物质、微量 元素、维生素和其它微量营养物。对于即饮配方物，说明书为将16. 9g粉末（3汤匙）用水 稀释至最终体积为l〇〇ml。
[0172] 实施例6 :富含谷氨酰胺的营养补充物。
[0173] 粉末形式的人乳强化剂，包装在含2. Ig的小袋中。基于100g粉末计，所述组合物 包含25. 2g蛋白质、52. 2g可消化的碳水化合物（主要是麦芽糖糊精）、2g如实施例4的不 可消化的寡糖、LlO9Cfu短双歧杆菌M16-V，其余的为矿物质、微量元素和维生素。基于总 蛋白质计，所述蛋白质包含50重量％乳清蛋白水解物和酪蛋白水解物，其重量比为1/1，以 及50重量％的游离L-谷氨酰胺。还存在IOg富含ARA和DHA的脂肪成分。
[0174] 实施例7 :出院后用于未成熟婴儿或相对胎龄身材较小的婴儿的出院后配方物
[0175] 市售出院后配方物用于未成熟婴儿或相对胎龄身材较小的婴儿出院后或当到达 校正的成熟年龄（terme age)后，直到6个月校正龄。粉末形式的每100g该配方物包含 约491kcal、13. 4g蛋白质、49. Ig可消化的碳水化合物（主要是乳糖和麦芽糖糊精）、26g 脂肪和5. 2g不可消化的寡糖。基于总蛋白质计，所述蛋白质包含约92. 5重量％来自牛乳 的酪蛋白和乳清蛋白，其重量比为1:1. 5。约7. 5重量％的蛋白质是游离L-谷氨酰胺。所 述不可消化的寡糖是半乳糖寡糖（来源Vivinal GOS, Borculo Domo)和多聚果糖（来源 RaftilinHP, Orafti)，其重量比为9:1。由于EU条例，GOS中的不可消化的二糖不能作为 膳食纤维。因此纤维含量标记为3. 7g/100g粉末。每g粉末中存在5. IO7Cfu的短双歧杆 菌M-16V (Morinaga)。脂肪主要源自植物，鱼油、海藻油及卵脂质也作为LC-PUFA的来源存 在，产生基于总脂肪酰基链计，0. 44重量％ ARA，基于总脂肪酰基链计，0. 33重量％ DHA。此 外，如本领域已知并根据早产婴儿指南，所述组合物包含矿物质、微量元素、维生素、左旋肉 碱（L-carnitine)、胆碱、肌醇（myo-inositol)和牛磺酸和核苷酸。作为即饮配方物，说明 书为将15. 3g粉末（3汤匙）用水稀释至最终体积为100ml。
[0176] 实施例8 :用于过敏婴儿的婴儿配方物
[0177] 粉末形式的每100g包含约493kcal、ll. 6g蛋白质、52g可消化的碳水化合物（主 要是乳糖和麦芽糖糊精）、25. 6g脂肪和5. 9g不可消化的寡糖。所述蛋白质包含彻底水解 的乳清蛋白且约5重量％的蛋白质是添加的游离L-谷氨酰胺。所述不可消化的寡糖是半 乳糖寡糖（来源 Vivinal GOS, Borculo Domo)和多聚果糖（来源 RaftilinHP, Orafti)，其 重量比为9:1。由于EU条例，GOS中的不可消化的二糖不能作为膳食纤维。因此标记的纤 维含量为4. lg/100g粉末。每g粉末中存在5. IO8Cfu的短双歧杆菌M-16V(Morinaga)。脂 肪主要源自植物，其它脂质来源也作为LC-PUFA来源存在，产生基于总脂肪酰基链计，0. 2 重量％ ARA，基于总脂肪酰基链计，0.2重量％ DHA。此外，如本领域已知，所述组合物包含矿 物质、微量元素、维生素、左旋肉碱、胆碱、肌醇和牛磺酸和核苷酸。作为即饮配方物，说明书 为将13. 6g粉末（3汤匙）用水稀释至最终体积为100ml。
[0178] 实施例9 :用于早产婴儿的试剂盒
[0179] -个包装中有20个装有粉末的小袋，所述粉末包含游离氨基酸形式的谷氨酰胺 和不可消化的寡糖。所述不可消化的寡糖是半乳糖寡糖（来源Vivinal GOS, Borculo Domo) 和多聚果糖（来源RaftilinHP，Orafti)，其重量比为9:1。谷氨酰胺与不可消化的寡糖GOS 和FOS总和的重量比为约1:2。该包装还包含第二组的20个小袋，每个小袋中每g粉末具 有3 X IO9Cfu短双歧杆菌M-16V (Morinaga)。该包装附有用于早产婴儿的小袋的使用说明， 其中所述说明表述为g/l〇〇mL即喂产品（对于早产婴儿，每日剂量150ml) :0. 2g/100mL谷 氨酰胺和4g/100mL G0S/F0S，及Ig短双歧杆菌。
【主权项】
1. 短双歧杆菌和至少一种不可消化的寡糖在生产营养组合物中的用途，所述不可消化 的寡糖选自：果糖寡糖、半乳糖寡糖、葡萄糖寡糖、阿拉伯糖寡糖、甘露糖寡糖、木糖寡糖、岩 藻糖寡糖、阿拉伯半乳糖寡糖、葡萄甘露糖寡糖、半乳甘露糖寡糖、包含唾液酸的寡糖和糖 醛酸寡糖，所述营养组合物用于在婴儿或幼儿中改善认知表现、认知发育、行为表现、行为 发育和/或社会互动，和/或在婴儿或幼儿中治疗或预防降低的认知表现、降低的认知发 育、降低的行为表现、降低的行为发育、降低的社会互动和/或神经炎症。2. 权利要求1的用途，其中所述婴儿或幼儿选自年龄为6个月或低于6个月的婴儿、早 产婴儿、相对胎龄而言身材较小（SGA)的婴儿、通过剖腹生产术出生的婴儿、患过敏症的婴 儿或幼儿或有患过敏症风险的婴儿或幼儿和患肠炎的婴儿或幼儿。3. 前述权利要求中任一项的用途，其中所述短双歧杆菌是短双歧杆菌M-16V。4. 前述权利要求中任一项的用途，其中不可消化的寡糖包括半乳糖寡糖和/或果糖寡 糖。5. 前述权利要求中任一项的用途，其中所述营养组合物还包含谷氨酰胺，所述谷氨酰 胺优选为游离氨基酸、二肽和/或三肽的形式。6. 前述权利要求中任一项的用途，其中所述营养组合物还包含花生四烯酸和/或 二十二碳六烯酸。7. 前述权利要求中任一项的用途，其中所述营养组合物包含蛋白质、脂肪和/或可消 化的碳水化合物，且选自婴儿起始配方物、婴儿后续配方物、幼儿乳、早产婴儿配方物、出院 后配方物和人乳强化剂。8. 前述权利要求中任一项的用途，其中所述短双歧杆菌以10 2-1013cfu/g干重的量存 在，或为非复制型时，以与之等价的量存在。9. 前述权利要求中任一项的用途，其中基于所述营养组合物的干重计，所述营养组合 物包含0. 5-20重量％不可消化的寡糖。10. 用于前述权利要求中任一项的用途的营养组合物，其中认知表现或认知发育是记 忆表现或记忆发育，优选涉及空间表现。 11. a.短双歧杆菌和 b. 至少一种不可消化的寡糖，其选自果糖寡糖、半乳糖寡糖、葡萄糖寡糖、阿拉伯糖寡 糖、甘露糖寡糖、木糖寡糖、岩藻糖寡糖、阿拉伯半乳糖寡糖、葡萄甘露糖寡糖、半乳甘露糖 寡糖、包含唾液酸的寡糖， c. 游离氨基酸和/或含谷氨酰胺的二肽和/或含谷氨酰胺的三肽形式的谷氨酰胺，及 任选地 d. 花生四烯酸和/或二十二碳六烯酸形式的LC-PUFA， 在生产用于向婴儿或幼儿提供营养的营养组合物中的用途，所述婴儿或幼儿选自年龄 为6个月或低于6个月的婴儿、早产婴儿、相对胎龄而言身材较小（SGA)的婴儿、经剖腹生 产术出生的婴儿、患过敏症的婴儿或幼儿或有患过敏症风险的婴儿或幼儿及患肠炎的婴儿 或幼儿。12. 权利要求11的用途，其中 a) 短双歧杆菌以102-1013cfu/g营养组合物干重的量存在， b) 至少一种不可消化的寡糖选自果糖寡糖、半乳糖寡糖，基于该营养组合物的干重计， 其量为0. 5-20重量％， c) 谷氨酰胺为游离氨基酸和/或含谷氨酰胺的二肽和/或含谷氨酰胺的三肽的形式， 基于营养组合物的干重计，其量为至少1. 5重量％， d) LC-PUFA为花生四烯酸和/或二十二碳六烯酸的形式。13. -种试剂盒，其包括包含谷氨酰胺和至少一种不可消化的寡糖的第一容器和包含 短双歧杆菌的第二容器，所述谷氨酰胺优选为游离氨基酸、二肽和/或三肽形式，所述不可 消化的寡糖选自果糖寡糖、半乳糖寡糖、葡萄糖寡糖、阿拉伯糖寡糖、甘露糖寡糖、木糖寡 糖、岩藻糖寡糖、阿拉伯半乳糖寡糖、葡萄甘露糖寡糖、半乳甘露糖寡糖、包含唾液酸的寡糖 和糖醛酸寡糖。14. 权利要求13的试剂盒，其中谷氨酰胺与果糖寡糖和半乳糖寡糖以谷氨酰胺与果糖 寡糖和半乳糖寡糖总和的重量比为2:1-1:4存在，更优选为1:1-1:3,最优选为约1: 2。15. -种营养组合物，其包含蛋白质、脂肪和可消化的碳水化合物，而且还包含 a) 短双歧杆菌，其量为102_1013cfu/g该营养组合物干重， b) 至少一种选自果糖寡糖、半乳糖寡糖的不可消化的寡糖，基于所述营养组合物的干 重计，其量为〇. 5-20重量％， c) 游离氨基酸和/或含谷氨酰胺的二肽和/或含谷氨酰胺的三肽形式的谷氨酰胺，基 于所述营养组合物的干重计，其量为至少1. 5重量％，和 d) 花生四烯酸和/或二十二碳六烯酸形式的LC-PUFA。16. 权利要求15的营养组合物，还包含谷氨酰胺，优选为游离氨基酸、二肽和/或三肽 形式。17. -种营养组合物，其包含短双歧杆菌并包含至少一种不可消化的寡糖，所述不可消 化的寡糖选自果糖寡糖、半乳糖寡糖、葡萄糖寡糖、阿拉伯糖寡糖、甘露糖寡糖、木糖寡糖、 岩藻糖寡糖、阿拉伯半乳糖寡糖、葡萄甘露糖寡糖、半乳甘露糖寡糖、包含唾液酸的寡糖和 糖醛酸寡糖，用于在婴儿或幼儿中改善认知表现、认知发育、行为表现、行为发育、空间记忆 和/或社会互动。
【专利摘要】本发明涉及含短双歧杆菌和不可消化的寡糖的营养组合物，用于在婴儿或幼儿中改善认知或行为表现、认知或行为发育、社会互动和/或神经炎症，所述不可消化的寡糖选自果糖寡糖、半乳糖寡糖、葡萄糖寡糖、阿拉伯糖寡糖、甘露糖寡糖、木糖寡糖、岩藻糖寡糖、阿拉伯半乳糖寡糖、葡萄甘露糖寡糖、半乳甘露糖寡糖、包含唾液酸的寡糖和糖醛酸寡糖。还要求保护一种营养组合物的用途，该营养组合物包括短双歧杆菌、至少一种不可消化的寡糖、游离氨基酸和/或含谷氨酰胺的二肽和/或含谷氨酰胺的三肽形式的谷氨酰胺以及花生四烯酸和/或二十二碳六烯酸形式的LC-PUTA。还要求保护一种试剂盒，其包括包含谷氨酰胺和不可消化的寡糖的第一容器和包含短双歧杆菌的第二容器。
【IPC分类】A23L1/305, A23L1/30, A61K31/702, A23L1/29, A61K35/74
【公开号】CN104883908
【申请号】CN201380069118
【发明人】J·加森, R·范埃尔堡, N·巴特克, A·D·格拉内费尔德
【申请人】N·V·努特里奇亚
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2013年11月4日
【公告号】EP2914136A2, WO2014070016A2, WO2014070016A3