多醣类、含有多醣类的组合物、以及免疫赋活剂的制作方法

多醣类、含有多醣类的组合物、以及免疫赋活剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及来源于昆虫且具有免疫赋活作用的多醣类、含有该多醣类的组合物、 以及以该多醣类作为有效成分的免疫赋活剂。
【背景技术】
[0002] 迄今为止已发现多种具有免疫赋活作用的多醣类。作为具有免疫赋活作用的多醣 的相关技术，例如有酸性粘多醣（参照专利文献1)、脂多糖及β-葡聚糖（参照专利文献 2)、来源于厚叶解曼藻（Kjellmaniella crassifolia)的粘性多醣类（参照专利文献3)、除 了 L-岩藻糖和D-木糖之外还以D-葡萄糖醛酸作为主要组成成分的硫酸多醣即岩衣藻蛋 白（ascophyllan)(参照专利文献4)、具有β-1，3-键的甘露聚糖（参照专利文献5)等。 但是，具有免疫赋活作用的多醣大多数都是来源于菌类或来源于植物，并未发现来源于动 物的多醣。
[0003] 另一方面，昆虫作为易于人工生产的动物性蛋白质而受到重视，也尝试将昆虫的 幼虫或蛹作为畜产用或水产用的饲料原料使用（参照专利文献6和专利文献7)。
[0004] 现有技术文献 专利文献 专利文献1 :日本特开2012-031089号公报 专利文献2 :日本特开2012-082156号公报 专利文献3 :日本特开2009-227618号公报 专利文献4 :日本特开2008-120707号公报 专利文献5 :日本特开2006-060288号公报 专利文献6 :国际公开第2011/007867号小册子 专利文献7 :日本特开2003-210071号公报。

【发明内容】

[0005] 发明要解决的问题 迄今为止，具有免疫赋活作用的多醣类可作为药物或健康食品、畜产用或水产用的饲 料添加物使用，但是显示出充分的免疫赋活效果的多醣类很少。因此，需要开发成本低而免 疫赋活效果强的组合物。
[0006] 用于解决问题的手段 即，本发明是一种来源于昆虫且具有免疫赋活作用的多醣类、以及含有该多醣类的组 合物。另外，在本发明的其他方面，具有免疫赋活作用的多醣类至少含有鼠李糖作为组成 糖。
[0007] 本发明的其他方面是来源于选自双翅目、鳞翅目、鞘翅目、膜翅目、半翅目、直翅目 和蜻蜓目中的一种或多种的昆虫的多糖类。另外，本发明的其他方面是来源于选自双翅目、 鳞翅目和鞘翅目中的一种或多种的昆虫的多糖类。进而，本发明的其他方面涉及的多醣类 来源于至少对植物表现出食性的昆虫。
[0008] 进而，本发明的其他方面中的具有免疫赋活作用的多醣类具有耐热性或耐高温高 压特性。在该情况下，即使在制造或加工阶段对本发明的多醣类实施热处理或高温高压处 理的情况下，免疫赋活作用也不会消失，较为优选。
[0009] 进而，本发明的其他方面中的具有免疫赋活作用的多醣类的平均分子量为约 1.0 X 105~约1.0 X 107。另外，多醣类的免疫赋活作用至少可经由Toll样受体4 (Toll-like Receptor 4)实现。
[0010] 另外，本发明的其他方面是一种含有来源于昆虫且具有免疫赋活作用的多糖类的 组合物。并且，本发明的组合物可以为选自昆虫的卵、幼虫、蛹和成虫中的一种或多种的粉 末；从选自昆虫的卵、幼虫、蛹和成虫中的一种或多种中提取出的提取物；或者从选自昆虫 的卵、幼虫、蛹和成虫中的一种或多种中所得的醇不溶性固形物。
[0011] 进而，本发明提供以来源于昆虫且具有免疫赋活作用的多糖类作为有效成分的免 疫赋活剂。
[0012] 发明的效果 本发明是一种来源于昆虫的具有免疫赋活作用的多醣类、含有该多醣类的组合物、以 及将该多醣类作为有效成分的免疫赋活剂。通过向人或畜产动物、水产动物、宠物等给药本 发明，能够得到较高的免疫赋活作用。另外，由于昆虫作为食用或饲料用的动物性资源价值 很高，因此能够作为具有免疫赋活作用的健康食品、或具有免疫赋活作用的畜产用或水产 用饲料原料使用。
【附图说明】
[0013] 图1是表示从昆虫中得到的上清部分㈧、甲醇提取部分（B)、以及水提取部分（C) 的免疫赋活作用的图。
[0014] 图2是表示从昆虫中得到的上清部分（A)的免疫赋活作用在蛋白酶K处理下未发 生变化的图。
[0015] 图3是表示自属于双翅目的昆虫中得到的水提取部分的阴离子交换色谱分析结 果的图。
[0016] 图4是表示利用凝胶过滤色谱法对来源于属于双翅目的昆虫的多醣类进行纯化 的图。
[0017] 图5是表示利用高效液相色谱法对来源于属于双翅目的昆虫的多醣类的分子量 进行测定的图。
[0018] 图6是表示来源于属于双翅目的昆虫的多醣的组成糖分析中的总离子色谱图。
[0019] 图7是表示利用凝胶过滤色谱法对来源于属于双翅目的昆虫的多醣类进行纯化 的图。
[0020] 图8是表示自属于鳞翅目的昆虫中得到的水提取部分的阴离子交换色谱分析结 果（总糖量和氯化钠洗脱浓度）的图。
[0021] 图9是表示自属于鳞翅目的昆虫中得到的水提取部分的阴离子交换色谱分析结 果（总糖量及免疫赋活作用）的图。
[0022] 图10是表示利用凝胶过滤色谱法对来源于属于鳞翅目的昆虫的多醣类进行纯化 的图。
[0023] 图11是表示利用高效液相色谱法对来源于属于鳞翅目的昆虫的多醣类的分子量 进行测定的图。
[0024] 图12是表示来源于属于鳞翅目的昆虫的多醣的组成糖分析中的总离子色谱图。
[0025] 图13是表示自属于鳞翅目的昆虫中得到的水提取部分的阴离子交换色谱分析结 果（总糖量和氯化钠洗脱浓度）的图。
[0026] 图14是表示自属于鳞翅目的昆虫中得到的水提取部分的阴离子交换色谱分析结 果（总糖量和免疫赋活作用）的图。
[0027] 图15是表示利用凝胶过滤色谱法对来源于属于鳞翅目的昆虫的多醣类进行纯化 的图。
[0028] 图16是表示自属于鞘翅目的昆虫中得到的上清部分的免疫赋活作用的图。
[0029] 图17是来源于属于双翅目的昆虫的多醣的免疫赋活作用与脂多糖比较的图。
[0030] 图18是表示本发明的多醣类的耐热性的图。
[0031] 图19是表示本发明的多醣类所具有的免疫赋活作用在昆虫的变态阶段中的变化 的图。
[0032] 图20是表示在抗TLR2抗体或抗TLR4抗体的存在下本发明的多醣类的免疫赋活 作用的图。
[0033] 图21是表示通过本发明的多醣类的免疫赋活作用使得真鯛的抗病性提高的图。
【具体实施方式】
[0034] 本发明提供来源于昆虫且具有免疫赋活作用的多醣类、含有多醣类的组合物、以 及将多醣类作为有效成分的免疫赋活剂。
[0035] 本发明的多醣类来源于昆虫。本发明人发现了属于多个种别的昆虫含有具免疫赋 活作用的多醣类，从而完成了本发明。进而，明确了属于非常广范围种别的昆虫含有具免疫 赋活作用的多醣。只要是含有具免疫赋活作用的多醣类的昆虫，即可用于本发明。
[0036] 昆虫在动物界中属于节肢动物门（Arthropoda)，是被分类为昆虫纲（Insecta)的 生物的总称。昆虫纲（Insecta)分类为无翅亚纲（Apterygota)和有翅亚纲（Pterygota)。无 翅亚纲（Apterygota)分类为弹尾目（Collembola)、原尾目（Protura)、缨尾目（Thysanura) 等。另外，有翅亚纲（Pterygota)分类为蛘峨目（Ephemeroptera)、櫝翅目（Plecoptera)、 蜻蜓目（Odonata)、纺脚目（Embioptera)、直翅目（Orthoptera)、革翅目（Dermaptera)、等 翅目（白蚁目）（Isoptera)、纺足目（拟白蚁目）（Empioptera)、嗤虫目（Psocoptera)、食 毛目（Mallophaga)、風目（Anoplura)、缕翅目（Thysanoptera)、半翅目（Hemiptera)、膜翅 目（Hymenoptera)、捻翅目（Strepsiptera)、鞘翅目（Coleoptera)、脉翅目（Neuroptera)、 长翅目（Mecoptera)、毛翅目（Trichoptera)、鱗翅目（Lepidoptera)、双翅目（Diptera)、隐 翅目（Aphaniptera)等。
[0037] 在上述分类中，对蜻蜓目、网翅目（Dictyoptera)、直翅目、半翅目、脉翅目、膜翅 目、鞘翅目、双翅目以及鳞翅目进一步进行详细说明。
[0038] 作为属于蜻蜓目的昆虫，可以列举出蜻蜓等。蜻蜓目进一步分类为珈 總科（Calopterygidae)、幽總科（Euphaeidae)、细總科（Coenagrionidae)、螨 總科（Megapodagrionidae)、丝總科（Lestidae)、琵總科（Platycnemididae)、 春蜓科（Gomphidae)、總蜓科（Epiophlebiidae)、古蜓科（Petaluridae)、钩蜓 科（Cordulegasteridae)、晏蜓科（Aeschnidae)、弓蜓科（Corduliidae)、山蜻蛉科 (Macromiidae)、蜻蜓科（Libellulidae)等。
[0039] 作为属于网翅目的昆虫，可以列举出螳螂和蟑螂等。螳螂亚目（Mantodea)进一 步分类为幢螂科（Mantidae)、姬幢螂科（Acromantidae)等，蜚蠊目（Blattodea)进一步 分类为幢螂科（Blattidae)、光蠊科（Epilampridae)、薦蠊科（Pycnoscelidae)、姬蠊科 (Blattellidae)、硬蜚臟科（Panesthiidae)等。
[0040] 作为属于直翅目的昆虫，可以列举出蝗虫、螽斯、蟋蟀、蝼蛄、骆驼蟋蟀 等D直翅目进一步分类为穴蟲科（Rhaphidophoridae)、螺蟲科（Gryl Iacridae)、蟲 蟹科（Tettigoniidae)、螺蟀科（Gryllidae)、蚁螺科（Myrmecophilidae)、蚤蝼科 (Tridactylidae)、蝼蛄科（Gryllotalpidae)、菱幢科（Tetrigidae)、幢虫科（Locustidae) 等。
[0041] 作为属于半翅目的昆虫，可以列举出蝽、田鳖、水黾、蝉、浮尘子、蚜虫等。半翅 目异翅亚目（Heteroptera)进一步分类为土蝽科（Cydnidae)、龟蝽科（Plataspidae)、 畴科（Pentatomidae)、同畴科（Acanthosomatidae)、异畴科（Urostylidae)、缘畴科 (Coreidae)、长畴科（Lygaeidae)、大红畴科（Largidae)、红畴科（Pyrrhocoridae)、锤角畴 科（Berytidae)、扁畴科（Aradidae)、姬畴科（Nabidae)、猎畴科（Reduviidae)、小钱虫科 (Naucoridae)、负畴科（Belostomatidae)、竭畴科（Nepidae)、奇畴科（Enicocephalidae)、 网畴科（Tingidae)、花畴科（Anthocoridae)、臭虫科（Cimicidae)、盲畴科（Miridae)、邑畴 科（Gerridae)、尺畴科（Hydrometridae)、宽肩畴科（Veliidae)、膜畴科（Hebridae)、水畴 科（Mesoveliidae)、鞭畴科（Dipsocoridae)、跳畴科（Saldidae)、餘畴科（Octheridae)、 盖畴科（Aphelocheiridae)、仰畴科（Notonectidae)、固头畴科（Pleidae)、圣畴科 (Helotrephidae)、划畴科（Corixidae)等D
[0042] 半翅目同翅亚目（Homoptera)分类为?单科（Cicadidae)、角?单科（Membracidae)、 沫轉科（Cercopidae)、广胸漠轉科（Tomaspididae)、刺沫轉科（Machaerotidae)、 耳叶?单 科（Ledridae)、大叶轉科（TettigelIidae)、横脊叶轉科（Evacanthidae)、隐脉叶?单科 (Nirvanidae/Paraboloponidae)、乌叶轉科（Penthimiidae)、浮尘子科(Jassidae)、广头叶 ?单科（Macropsidae)、圆顶叶?单科（Agalliidae)、黄胸槽腔叶?单科（Drabescidae)、片角叶 轉科（Idioceridae)、小眼叶轉科（Xestocephalidae)、叶轉科（Cicadellidae)、缘脊叶?单 科（Aphrodidae)、长头叶轉科（Hecalidae)、叉突纤细叶轉科（Errhomenellidae)、角顶叶 ?单科（Deltocephalidae)、蚁錯峰科（Tettigometridae)、搞飞風科（Meenoplidae)、錯?单科 (Fulgoridae)、长翅飞風科（Derbidae)、小头飞風科（Achilidae)、稻風科（Delphacidae)、 象錯轉科（Dictyopharidae)、菱飞虱科（Cisiidae)、军配飞虱科（Tropiduchidae)、 青翅飞虱科（Flatidae)、圆飞虱科（Issidae)、广翅錯轉科（Ricaniidae)、木虱科 (PsylIidae)、粉虱科（Aleyrodidae)、赐虱科（Aphididae)、绵蚁科（Margarodidae)、粉 介壳虫科（Eriococcidae)、介壳虫科（Coccidae)、蜂蚁科（Beesoniidae)、盾介壳虫科 (Diaspididae)等。
[0043] 脉翅目进一步分类为盲蛇蛉科（Inocellidae)、泥蛉科（Sialidae)、鱼蛉科 (Corydalidae)、幢蛉科（Mantispidae)、长角蛉科（Ascalaphidae)、翼蛉科（Osmylidae)、 草蛉科（Chrysopidae)、姬蛉科（Hemerobiidae)、蚁蛉科（Myrmeleontidae)等。
[0044] 作为属于膜翅目的昆虫，可以列举出蜂和蚂蚁等。膜翅目进一步分类为鞘 蜂科（Xyelidae)、寄生树蜂科（Orussidae)、四节叶蜂科（Blasticotomidae)、树蜂科 (Siricidae)、垄蜂科（Cephidae)、扁叶蜂科（Pamphiliidae)、叶蜂科（Tenthredinidae)、 松叶蜂科（Diprionidae)、三节叶蜂科（Argidae)、锤角叶蜂科（Cimbicidae)、苗蜂科 (Braconidae)、赐苗蜂科（Aphidiidae)、姬蜂科（Ichneumonidae)、格小蜂科（Agaonidae)、 小蜂科（Chalcididae)、糟翅小蜂科（Leucospidae)、蚁小蜂科（Eucharitidae)、长 尾小蜂科（Torymidae)、广肩小蜂科（Eurytomidae)、金小蜂科（Pteromalidae)、跳 小蜂科（Encyrtidae)、扁股小蜂科（Elasmidae)、釉小蜂科（Eulophidae)、赤眼蜂科 (Trichogrammatidae)、纟婴小蜂科（Mymaridae)、细蜂科（Proctotrupidae)、分盾细蜂科 (Ceraphronidae)、广腹细蜂科（Platygasteridae)、缘腹细蜂科（Scelionidae)、蚁科 (Formicidae)、癭蜂科（Cynipidae)、钩腹蜂科（Trigonalidae)、螯蜂科（Dryinidae)、小 土蜂科（Tiphiidae)、糟翅姬蜂科（Gasteruptionidae)、蚁蜂科（Mutillidae)、蚁形蜂科 (Bethylidae)、青蜂科（Chrysididae)、尖胸青蜂科（Cleptidae)、蛛蜂科（Pompilidae)、土 蜂科（Scoliidae)、胡蜂科（Vespidae)、细腰蜂科（Sphecidae)、地花蜂科（Andrenidae)、 拟蜜蜂科（Colletidae)、毛脚花蜂科（Melittidae)、切叶蜂科（Megachilidae)、隧蜂科 (Halictidae)、条蜂科（Anthophoridae)、蜜蜂科（Apidae)等。
[0045] 鞘翅目也称为甲虫类。作为属于鞘翅目的昆虫，可以列举出甲虫、锹形虫、长角甲 虫、龙虱、金龟子、花金龟、铜花金龟子、步行虫、萤火虫、瓢虫、象鼻虫、步甲虫、伪步行虫等。
[0046] 鞘翅目进一步分类为长扁甲科（Cupedidae)、背条虫科（Rhysodidae)、粗角 步行虫科（Paussidae)、斑螯科（Cicindelidae)、步行虫科（Carabidae)、瓢箪尘虫 科（Scaritidae)、芥虫科（Harpalidae)、细颈步行虫科（Brachinidae)、小头水虫科 (Haliplidae)、方胸龙虱科（Noteridae)、龙虱科（Dytiscidae)、鼓甲科（Gyrinidae)、 牙虫科（Hydrophilidae)、长阎甲科（Synteliidae)、阎魔虫科（Histeridae)、脊 球蕈甲科（Catopidae)、埋葬虫科（Silphidae)、突尾蕈虫科（Scaphidiidae)、 隐翅虫科（Staphylinidae)、揪形虫科（Lucanidae)、黑艳虫科（Passalidae)、 皮金龟科（Trogidae)、粪金龟科（Geotrupidae)、金龟子科（Scarabaeidae)、 圆花蚤科（Helodidae)、丸甲科（Byrrhidae)、扁泥虫科（Psephenidae)、长花蚤 科（Ptilodactylidae)、泥虫科（Dryopidae)、长角泥虫科（Elmidae)、?单寄甲科 (Rhipiceridae)、吉 丁虫科（Buprestidae)、叩头虫科（Elateridae)、伪叩头虫 科（Eucnemidae)、拟萤科（Drilidae)、萤科（Lampyridae)、菊虎科（Cantharidae)、 红萤科（Lycidae)、姬刺虫科（Nosodendridae)、纏节虫科（Dermestidae)、食骸 虫科（Anobiidae)、标本蠢科（Ptinidae)、长蠢虫科（Bostrychidae)、扁蠢虫科 (Lyctidae)、谷盗虫科（Trogositidae)、郭公虫科（Cleridae)、姬萤科（Melyridae)、 筒蠢虫科（Lymexylidae)、出尾虫科（Nitidulidae)、拟出尾虫科（Rhizophagidae)、 扁甲科（Cucujidae)、细扁甲科（Silvanidae)、大吸木甲科（Helotidae)、吸木虫 科（Cryptophagidae)、拟吸木虫科（Byturidae)、长菌虫科（Languriidae)、大蕈虫 科（Erotylidae)、瓢虫科（Coccinellidae)、拟瓢虫科（Endomychidae)、小蕈虫科 (Mycetophagidae)、细坚虫科（Colydiidae)、拟步行虫科（Tenebrionidae)、伪叶甲 科（Lagriidae)、朽木虫科（Alleculidae)、瘤拟步行虫科（Zopheridae)、盘胸甲科 (Boridae)、方胸甲科（Elacatidae)、树皮甲科（Pythidae)、赤翅萤科（Pyrochroidae)、 伪章甲科（Tetratomidae)、长朽木虫科（Melandryidae)、花圣科（Mordellidae)、大 花蚤科（Rhipiphoridae)、长颈虫科（Cephaloidae)、地胆科（Meloidae)、拟天牛科 (Oedemeridae)、蚁形虫科（Anthicidae)、天牛科（Cerambycidae)、显象科（Bruchidae)、金 花虫科（Chrysomelidae)、长角象鼻虫科（Anthribidae)、卷叶象鼻虫科（Attelabidae)、三 锥象鼻虫科（Brenthidae)、象鼻虫科（Curculionidae)、小蠢虫科（Scolytidae)、长小蠢虫 科（Platypodidae)等。
[0047] 作为属于双翅目的昆虫，可以列举出蚊子、大蚊、蝇、虻、蚋，进一步可以列举出苍 蝇、果蝇、实蝇、水虻等。
[0048] 双翅目进一步分类为蚊蚋科（Anisopodidae)、春蚊科（Cramptonomyiidae)、粗 脉蚋科（Pachyneuridae)、朽木蚋科（Axymyiidae)、棒足毛蚊科（Hyperoscelidae)、蕈 蚋科（Mycetophilidae)、蕈柄蚊科（Bolitophilidae)、扁角蚊科（Ceroplatidae)、粘蚊 科（Sciophilidae)、大角章蚊科（Macroceridae)、瘦納科（Cecidomyiidae)、黑翅章納科 (Sciaridae)、毛納科（Bibionidae)、长角蚊科（Hesperinidae)、伪毛納科（Scatopsidae)、 蛾蚋科（Psychodidae)、伪蚊科（Tanyderidae)、细腰大蚊科（Ptychopteridae)、冬大 蚊科（Trichoceridae)、维大蚊科（Cylindrotomidae)、大蚊科（Tipulidae)、亮大蚊科 (Limnoniidae)、蚊科（Culicidae)、细蚊科（Dixidae)、幽蚊科（Chaoboridae)、摇蚊科 (Chironomidae)、山蚋科（Thaumaleidae)、螺科（Ceratopogonidae)、蚋科（Simuliidae)、 网蚊科（Blepharoceridae)、水虫亡科（Stratiomyiidae)、臭蚊科（Coenomyiidae)、流虫亡科 (Athericidae)、鹬蛇科（Rhagionidae)、剑蛇科（Therevidae)、窗蛇科（Scenopinidae)、食 虫虫亡科（Asilidae)、食木蛇科（Xylophagidae)、拟树蛇科（Solvidae)、蛇科（Tabanidae)、 蜂虫亡科（Bombyliidae)、小头蛇科（Acroceridae)、拟长吻蛇科（Nemestrinidae)、舞虫亡 科（Empididae)、长足蛇科（Dolichopodidae)、枪绳科（Lonchopteridae)、扁角绳科 (Platypezidae)、蚤绳科（Phoridae)、头绳科（Pipunculidae)、食赐绳科（Syrphidae)、 长脚绳科（Neriidae)、微脚绳科（Micropezidae)、细绳科（Megamerinidae)、眼绳科 (Conopidae)、嫌绳科（Pyrgotidae)、折翅绳科（Psilidae)、甲绳科（Sciomyzidae)、 海滨绳科（Coelopidae)、广 口绳科（Platystomatidae)、鳖绳科（Dryomyzidae)、艳 细绳科（Sepsidae)、果实绳科（Tephritidae)、赐小绳科（Chamaemyiidae)、縞绳科 (Lauxaniidae)、黑艳绳科（Lonchaeidae)、酪绳科（Piophilidae)、潜绳科（Agromyzidae)、 阳绳科（Heleomyzidae)、隐毛绳科（Cryptochaetidae)、果绳科（Drosophilidae)、水绳科 (Ephydridae)、小果绳科（Diastatidae)、禾绳科（Opomyzidae)、杆绳科（Chloropidae)、 澳绳科（Clusiidae)、类绳科（Scatophagidae)、花绳科（Anthomyiidae)、家绳科 (Muscidae)、寄生绳科（Tachinidae)、裸寄绳科（Phasiidae)、_ 绳科（Calliphoridae)、 肉绳科（Sarcophagidae)、虱绳科（Hippoboscidae)、蝙蝠绳科（Streblidae)、蛛绳科 (Nycteribiidae)等。
[0049] 作为属于果实绳科（Tephritidae)的昆虫，具体可以列举出蜜柑大实绳 (Tetradacus tsuneonis)、东方果实绳（Strumeta dorsalis)、瓜实绳（Bac trocera cucurbitae/Zeugodacus cucurbitae)、南瓜实绳(Paradacus depressus)、红景天 实绳（Urophora sachalinensis)、日本突鞘实绳（Oedaspis japonica)、日本樓桃 实绳（Rhacochlaena japonica)、普通纹实绳（Anomoia vulgaris)、黑漆尖带实绳 (Acrotaeniostola scutellaris)、日本拟腹带实绳（Paragastrozona japonica)、背赤 翅斑绳（Hemilea infuscata)、平山长唇实绳（Campiglossa hirayamae)、黄色毛深实绳 (Xyphosia punctigera)、蓟毛深果实绳（Tephritis majuscula)、松绮曲吻果实绳（Ensina sonchi)、爪斑实绳（Sphaeniscus atilia)、星棒毛实绳（Rhabdochaeta asteria)等D
[0050] 作为属于家绳科（Muscidae)的昆虫，具体可以列举出苍绳（Musca domestica)、 市绳（Musca sorbens)、刺绳（Stomoxys calcitrans)等。
[0051] 作为属于鳞翅目的昆虫，包括称为蝴蝶的昆虫和称为蛾的昆虫。鳞翅目进一步分 类为小翅蛾科（Micropterygidae)、毛顶蛾科（Eriocraniidae)、編幅蛾科（Hepialidae)、 穿孔蛾科（Incurvariidae)、长角蛾科（Adelidae)、微蛾科（Stigmellidae)、日蛾科 (Heliozelidae)、冠潜蛾科（Tischeriidae)、章蛾科（Tineidae)、養蛾科（Psychidae)、 莱氏蛾科（Lyonetiidae)、菜蛾科（Plutellidae)、巢蛾科（Hyponomeutidae)、絹 蛾科（Scythridae)、紹蛾科（Epermeniidae)、草潜蛾科（Elachistidae)、细蛾科 (Gracillariidae)、鞘蛾科（Coleophoridae)、拟卷叶蛾科（Glyphipterygidae)、日 逐蛾科（Heliodinidae)、透翅蛾科（Aegeriidae)、尖细蛾科（Cosmopterygidae)、 旋蛾科（Gelechiidae)、木蛾科（Xyloryetidae)、癒蛾科（Blastobasidae)、织蛾 科（Oecophoridae)、木蠢蛾科（Cossidae)、果姓蛾科（Carposinidae)、小卷叶 蛾科（Eucosmidae)、卷蛾科（Tortricidae)、细卷蛾科（Phaloniidae)、网蛾科 (Thyrididae)、螟蛾科（Pyralidae)、羽蛾科（Pterophoridae)、翼蛾科（Alucitidae)、 斑蛾科（Zygaenidae)、轉寄蛾科（Epipyropidae)、刺蛾科（Heterogeneidae)、燕蛾科 (Uraniidae)、蛛蛾科（Epiplemidae)、拟凤蝶蛾科（Epicopeidae)、尺蛾科（Geometridae)、 钩蛾科（Drepanidae)、尖翅蛾科（Thyatiridae)、错纹蛾科（Callidulidae)、香蛾 科（Bombycidae)、带蛾科（Eupterotidae)、枯叶蛾科（Lasiocampidae)、毒蛾科 (Lymantriidae)、舟蛾科（Notodontidae)、夜蛾科（Noctuidae)、虎蛾科（Agaristidae)、 灯蛾科（Arctiidae)、拟灯蛾科（Aganaidae)、瘤蛾科（Nolidae)、鹿蛾科（Amatidae)、 箩纹蛾科（Brahmaeidae)、天香蛾科（Saturniidae)、天蛾科（Sphingidae)、弄蝶科 (Hesperiidae)、眼蝶科（Satyridae)、蛱蝶科（Nymphalidae)、斑蝶科（Danaidae)、长须蝶 科（Libytheidae)、灰蝶科（Lycaenidae)、粉蝶科（Pieridae)、凤蝶科（Papilionidae)等D
[0052] 作为属于蚕蛾科（Bombycidae)的昆虫，具体可以列举出蚕（Bombyx mori)、华家 香（Bombyx mandarina)、大拟桑香蛾（Oberthueria falcigera)、拟钩翅蛾（Pseudandraca gracilis)、透香（Prismosticta hyalinata)等。
[0053] 天蚕蛾科（Saturniidae)进一步分类为蛇头蛾属（Attacus)、眉纹天蚕蛾属 (Samia)、目天蚕蛾属（Antheraea)、天蚕蛾属（Saturnia)、银目天蚕蛾属（Rhodinia)、长尾 水青蛾属（Actias)、小字蚕属（Cricula)、天蚕蛾科（Gonimbrasia)属。
[0054] 作为属于天蚕蛾科（Saturniidae)的昆虫，具体可以列举出曲缘尾大蚕蛾 (Actias artemis aliena)、蓖麻香（Samia Cynthia ricini)、日得香（Samia Cynthia pryeri)、柞香（Antheraea pernyi)、棒香（也称为天香、野香）（Antheraea yamamai)、天 香蛾（Rhodinia fugax fugax)、黑天香蛾（Rhodinia jankowskii hattoriae)、奸夷四目 蛾（Aglia tau microtau)、银杏大香蛾（Dictyoploca japonica japonica)、绿目天香蛾 (Caligula boisduvalii jonasii)、与那国香（Attacus atlas ryukyuensis)、莫桑比虫 (Gonimbrasia belina)、小字大香蛾（Cricula trifenestrata)等。
[0055] 本发明中的昆虫的种类并未限定，只要是含有具免疫赋活作用的多醣类的昆虫， 即可用于本发明。另外，优选本发明中的昆虫为至少对植物表现出食性的昆虫。如后所述， 优选本发明的组合物中所含的多醣类至少含有鼠李糖作为组成糖。这是因为鼠李糖富含于 植物中，因此只要是植食性昆虫、或者杂食性或粪食性且对植物也表现出食性的昆虫，即可 容易地摄入鼠李糖。
[0056] 由于昆虫在成虫和幼虫阶段食性会发生变化，因此在将幼虫或蛹利用于本发明的 情况下，优选幼虫至少对植物表现出食性的昆虫。作为幼虫为植食性的昆虫，具体可以列举 出属于果实幡科（Tephritidae)、蚕蛾科（Bombycidae)、天蚕蛾科（Saturniidae)、金龟子 科（Scarabaeidae)的昆虫等。另外，作为幼虫为粪食性且对植物也表现出食性的昆虫，可 以列举出属于家幡科（Muscidae)的昆虫等。
[0057] 本发明中的昆虫只要含有具免疫赋活作用的多醣类即可，并不限定于卵、幼虫、蛹 或成虫的各变态阶段。为了制造含有具免疫赋活作用的多醣类的组合物，适合使用昆虫的 幼虫或蛹，优选为蛹。这是因为幼虫的消化道内含有大量未消化的物质，有时需要将这些物 质分离。
[0058] 另外，本发明的多醣类的分子量并未限定，优选为约1.0 X 104~约1.0 X 108,更优 选为约I. 0 X 1〇5~约I. 0 X 1〇7,进一步优选为约3. 0 X 105~约2. 0 X 106。
[0059] 本发明的多醣类含有单糖及其衍生物作为组成糖。以下，对本发明的多醣类中可 含有的单糖及其衍生物进行详细说明。
[0060] 单糖也称为中性糖，分为醛糖和酮糖两类，根据所含的碳原子数，称为三碳糖 (Triose)、四碳糖（Tetrose)、五碳糖（Pentose)、六碳糖（Hexose)、七碳糖（Heptose)、八 碳糖（Octulose)等。作为三丙糖的具体例，可以列举出甘油醛（glyceraldehyde)、二轻 丙酮（dihydroxyacetone)等。作为四碳糖的具体例，可以列举出赤藻糖（erythrose)、异 赤藻糖（threose)、赤藻酮糖（erythrulose)等。作为五碳糖的具体例，可以列举出核糖 (ribose)、来苏塘（Iyxose)、木糖（xylose)、阿拉伯糖（arabinose)、序菜糖（apiose)、核酮 糖（ribulose)、木酮糖（xylulose)等。作为六碳糖的具体例，可以列举出阿洛糖（allose)、 塔罗糖（talose)、古罗糖（gulose)、葡萄糖（glucose)、阿卓糖（altrose)、甘露糖 (mannose)、半乳糖（Galactose)、艾杜糖（idose)、阿洛酮糖（psicose)、果糖（fructose)、 山梨糖（sorbose)、塔格糖（tagatose)等。作为七碳糖的具体例，可以列举出景天庚酮糖 (sedoheptulose)、马桑糖（coriose)等。
[0061] 进而，作为糖的衍生物，可以列举出脱氧糖（Deoxy sugar)、糖醛酸（uronic acid)、酸糖酸（aldonic acid)、糖二酸（aldaric acid)、氨基糖（amino sugar)等。作为 脱氧糖的具体例，可以列举出脱氧核糖（deoxyribose)、脱氧葡萄糖（deoxyglucose)、奎诺 糖（quinovose)、黄夹竹桃糖（thevetose)、鼠李糖（rhamnose)、鼠李树胶糖（rhamnulose)、 岩藻糖（fucose)、2_脱氧毛地黄糖（diginose)、毛地黄糖（digitalose)、毛地黄毒糖 (digitoxose)、磁麻糖（cymarose)、阿比可糖（abequose)、蛔糖（ascarylose)、可立糖 (colitose)、泊雷糖（paratose)、泰威糖（tyvelose)等。另外，作为糖醛酸的具体例， 可以列举出葡糖醛酸（glucuronic acid)、古罗糖醛酸（guluronic acid)、甘露糖醛酸 (mannuronic acid)、半乳糖酸酸（galacturonic acid)、艾杜糖酸酸（iduronic acid)等。 另外，作为醛糖酸的具体例，可以列举出古洛糖酸（gulonic acid)、葡萄糖酸（gluconic acid)等。另外，作为糖二酸的具体例，可以列举出葡糖二酸（glucaric acid)、半乳糖二酸 (galactaric acid)、甘露糖二酸（mannaric acid)等。另外，作为氨基糖的具体例，可以列 举出葡糖胺（glucosamine)、氨基半乳糖（galactosamine)、唾液酸（sialic acid)、氨基糖 醛酸（aminouronic acid)、胞壁酸（muramic acid)等。含有大量糖醛酸、醛糖酸或糖二酸 的多醣类显现出酸性，被称为酸性多醣类。
[0062] 另外，上述单糖及其衍生物有时会有光学异构体。在该情况下，单糖及其衍生物可 以为D型、L型中的任意一种光学异构体。
[0063] 对于本发明的多醣类，作为其组成糖，可以包含单糖（中性糖）、氨基糖、糖 醛酸、醛糖酸、糖二酸、脱氧糖。更具体而言，优选本发明的多醣类包含选自D-葡萄糖 (D-Glc)、D-半乳糖（D-Gal)、D-甘露糖（D-Man)、D-核糖（D-Rib)、N-乙酰-D-氨基葡萄 糖（D-GlcNAc)、N-乙酰-D-氨基半乳糖（D-GalNAc)、D-葡糖醛酸（D-GlcA)、L-鼠李糖 (L-Rha)、L-岩藻糖（L-Fuc)、D-甘露糖醛酸（D-ManA)、以及L-古罗糖醛酸（L-GulA)中的 一种或多种。
[0064] 进而，优选本发明的多醣类至少含有鼠李糖作为其组成糖。鼠李糖是脱氧糖的一 种，具有甘露糖的6位羟基被氢原子取代的结构。另外，鼠李糖天然存在L型的L-鼠李糖 (L-Rha)。鼠李糖的合成路径仅限于植物或细菌中，至今为止在包括昆虫在内的动物中并未 发现鼠李糖的合成路径（参照非专利文献1和非专利文献2)。鼠李糖在本发明的多醣类中 作为组成糖含量为约5摩尔％-约50摩尔％，优... 选含量为约10摩尔％-约25摩尔％。
[0065] 非专利文献 I :MF Giraud，JH Naismith. "The rhamnose pathway" Current opinion in structural biology (2000). 非专利文献 2 :M Maki，R Renkonen. "Biosynthesis of 6-deoxyhexose glycans in bacteria" Soc Glycobiology (2004). 多醣类的组成糖的分析采用气相色谱质谱联用仪（GC/MS)进行。可以对由气相色谱 质谱联用仪得到的总离子色谱图（TIC)的峰面积和标准品进行比较，计算出组成糖的含 量和百分含量。具体而言，可以利用三氟乙酸（TFA)将多醣类水解，进行衍生物化，使其 干燥固化，然后利用气相色谱质谱联用仪（GC/MS)进行分析，由此得到总离子色谱图。此 处的衍生物化是指公知的进行二乙基缩硫醛（diethyl dithioacetal)化和三甲基娃基 (trimethylsilyl)化的方法。优选本发明的多醣类利用气相色谱质谱联用仪（GC/MS)得到 的总离子色谱图中与L-鼠李糖对应的峰面积占整个峰面积的约5%~约50%，更优选为占整 个峰面积的约1〇%~约25%。
[0066] 另外，优选本发明的多醣类具有耐热性。在多醣类具有耐热性的情况下，即使对 多醣类进行热处理，多醣类的免疫赋活作用也会保持。热处理的温度没有限制，例如为 80°C ~300°C，优选为90°C ~200°C，更优选为100°C ~150°C。另外，热处理的时间没有限制， 为1分钟~2小时，优选为5分钟~30分钟。经确认，本发明的多醣类至少在进行100°C、30 分钟的热处理后免疫赋活作用不会消失。
[0067] 另外，优选本发明的多醣类具有耐高温高压特性。在多醣类具有耐高温高压特性 的情况下，即使对多醣类进行高温高压处理，多醣类的免疫赋活作用也不会消失。高温高压 处理是指进行高温且高压的处理。高温高压处理的压力没有限制，例如为0. lMPa~1000MPa， 优选为〇. 2MPa~100MPa。高温高压处理的温度没有限制，例如为80 °C ~300 °C，优选为 90°C ~200°C，更优选为 100°C ~150°C。
[0068] 高温高压处理包括利用挤压机进行的处理。挤压机也称为混练挤压机（kneading extruder)，用于食品或饲料的加工中。优选本发明的多醣类为即使利用挤压机进行的处理 也不会失去免疫赋活作用的多醣类。挤压机具备单轴型或多轴型的螺杆。具体而言，在挤 压机内利用螺杆将含有本发明的多醣类的组合物或其他原料捏合，边实施高温高压处理边 从冲模中挤出。
[0069] 另外，本发明提供含有来源于昆虫且具有免疫赋活作用多醣类的组合物。本发明 的组合物以含有具免疫赋活作用的多醣的昆虫的卵、幼虫、蛹或成虫为原料制成。只要含有 具免疫赋活作用的多醣，则昆虫的变态阶段没有限制，但是适合使用昆虫的幼虫或蛹。优选 为蛹。这是因为幼虫的消化道内含有大量未消化物，可能会混入组合物中。本发明的组合 物能够以昆虫的蛹为原料，通过实施热处理、高温高压处理、干燥处理、粉碎处理等处理而 制成。
[0070] 优选本发明的组合物为对选自昆虫的卵、幼虫、蛹及成虫中的一种或多种进行粉 碎处理而得到的粉末或糊剂，更优选为粉末。通过将本发明的组合物形成为粉末或糊剂，促 进了供给了本发明组合物的人或动物对于多醣类的吸收。另外，通过将本发明的组合物形 成为粉末，该组合物的保存也变得容易。
[0071] 另外，本发明的其他组合物为通过从昆虫中提取具有免疫赋活作用的多醣类而制 成。由于本发明的多醣类可溶于水，因此，在多醣类的提取中使用水作为溶剂。提取的温度、 压力没有限制，也可以进行加热提取、减压提取或加压提取。即，本发明的组合物为选自昆 虫的卵、幼虫、蛹及成虫中的一种或多种中提取的提取物，优选为水提取物。该提取物中含 有具免疫赋活作用的多醣类。
[0072] 另外，本发明的组合物中所含的多醣类可溶于水，且不溶于甲醇、乙醇、丙醇、丙 酮、己烷等极性低的溶剂。因此，优选本发明的组合物为使用低极性溶剂除去昆虫中所含的 杂质后得到的物质。即，本发明的组合物可以为由选自昆虫的卵、幼虫、蛹及成虫中的一种 或多种制备的、对多醣类不溶性溶剂具不溶性的固形物。
[0073] 具体而言，通过将昆虫的卵、幼虫、蛹或成虫、优选为昆虫的卵、幼虫、蛹或成虫的 粉末与多醣类不溶性溶剂混合，然后利用离心分离或抽滤等方法除去多醣类不溶性溶剂， 由此能够得到不溶性固形物。多醣类不溶性溶剂，是指多醣类不会溶于其中的溶剂，可以列 举出甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、丙酮、己烷、乙酸乙酯及它们的混合溶剂等低极性溶剂。本工序 可以仅进行一次，但通过重复多次本工序，能够提高组合物中多醣类的百分含量。
[0074] 作为多醣类不溶性溶剂，优选为使用醇或醇水溶液。醇水溶液可以使用约 50V% (体积百分比）以上，具体而言约60V%以上、约70V%以上、约80V%以上、约90V%以上 的醇水溶液。即，本发明的组合物可以为由选自昆虫的卵、幼虫、蛹及成虫中的一种或多种 制备的醇不溶性固形物。
[0075] 本发明的组合物能够作为免疫赋活组合物使用。即，可以作为以上述多醣为有效 成分的免疫赋活剂，提供用作药物或健康食品、功能食品、动物用药物、饲料、饲料添加剂、 饲料原料，不仅能够用于人，也能够用于猪、牛、羊、山羊、鸡等畜产，狗、猫等宠物，真鯛、蛳 鱼红甘鰺、石斑鱼、河豚、鲔鱼、鳗麵鱼、虾、蟹等的水产养殖业。
[0076] (实施例） 进而，使用实施例对本发明进行更详细的说明，但是本发明并不限于实施例。
[0077] 1.来源于属于双翅目的昆虫且具有免疫赋活作用的物质的鉴定 1.1.来源于属于果实幡科（Tephritidae)的昆虫且具有免疫赋活作用的物质的鉴定 对属于双翅目的昆虫所含有且具有免疫赋活作用的物质进行鉴定。对于昆虫，使 用了 属于果实幡科（Tephritidae)的瓜实幡（Bactrocera cucurbitae / Zeugodacus cucurbitae)的蛹。将瓜实幡的蛹粉碎形成糊状，离心分离得到上清部分（A) (supernatant fraction)。进而，利用旋转蒸发仪进行减压浓缩，添加四倍量的甲醇并搅拌，离心得到甲醇 提取部分（B)。另外，对作为沉淀物得到的醇（甲醇）不溶性固形物进行水提取，得到水提 取部分（C)。
[0078] 在小鼠巨噬细胞株（RAW264细胞）的培养液中添加上述部分（A)、⑶及（C)，对 产生的一氧化氮量进行测量。已知活化后的巨噬细胞会产生一氧化氮，将其作为免疫赋活 的指标。另外，使用已知具有免疫赋活作用的脂多糖（LPS)作为阳性对照组。如图1所示， 由于分别在IO4倍稀释、10 3倍稀释、10 2倍稀释的上清部分（A)和水提取部分（C)中确认了 一氧化氮的产生，因此可知其中含有具免疫赋活作用的物质。
[0079] 对上清部分（A)经蛋白水解酶即蛋白酶K处理后是否能保持其免疫赋活作用进行 研宄。如图2所示，利用SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）确认了在37°C 和55°C处理下，蛋白质经蛋白酶K处理而被分解。另一方面，由于巨噬细胞的一氧化氮的产 量未发生变化，因此可知具有免疫赋活作用的物质不是蛋白质，而是多醣类。
[0080] 进而，使用DE52弱阴离子交换柱（Whatman公司制），依次用0M、0. 2M、0. 5M以及IM 的氯化钠水溶液对水提取部分（C)进行洗脱。采用苯酚-硫酸法对各洗脱部分中所含的总 糖量进行测定。另外，将洗脱部分稀释，将由小鼠巨噬细胞株产生的一氧化氮作为指标，对 各洗脱部分的免疫赋活作用进行研宄。如图3所示，0. 2M的氯化钠水溶液洗脱部分表现出 了较强的免疫赋活作用。由于吸附于阴离子交换柱，并使用0. 2M氯化钠水溶液进行洗脱， 因此可知具有免疫赋活作用的物质为酸性。
[0081] 进而，利用凝胶过滤色谱法对0. 2M的氯化钠水溶液洗脱部分进行纯化。色谱柱 使用 Superose 6 10/300 GL(分离范围 5X103-5X IO6) (GE Healthcare 公司制）。采用苯 酚-硫酸法对各洗脱部分中所含的总糖量进行测定。另外，将洗脱部分进行稀释并以由小 鼠巨噬细胞株产生的一氧化氮作为指标，对各洗脱部分的免疫赋活作用进行研宄。如图4 所示，分子量大的部分显示出了较强的免疫赋活作用。
[0082] 将利用凝胶过滤色谱法认定有免疫赋活作用的洗脱部分倒入高效液相色谱仪中， 对分子量进行测定。色谱柱使用分离范围为5亿至1万的Showdex(注册商标）SB-807 HQ(昭和电工株式会社制）。如图5所示，可知具有免疫赋活作用的物质为分子量约100万 (约1.0 X IO6)的多醣类。从1.0 kg的瓜实蝇的蛹中提纯了 22. 7mg的具有免疫赋活能的多 醣类。
[0083] 进而，将提纯出的多醣类在2M三氟乙酸（TFA)中、100°C下、水解16小时，对水解 所得的单糖及其衍生物进行二乙基缩硫醛化以及三甲基硅基化，进而吹氮气干燥固化后溶 解于水中，用己烧进行提取。使用HP-5柱（Agilent Technologies Japan，LTD.制）利用 气相色谱-质谱联用仪（GC/MS)对上述多醣的组成糖进行分析，得到图6所示的图谱的总 离子色谱图（TIC)。计算出与总离子色谱图的峰对应的单糖及其衍生物的面积比，进而使用 标准品计算出单糖及其衍生物的重量比和组成比（摩尔％)。
[0084] 标准品使用D-阿拉伯糖（D-Ara)、D-木糖（D-Xyl)、L-鼠李糖（L-Rha)、L-岩藻 糖（L-Fuc)、D-核糖（D-Rib)、D-葡萄糖（D-Glc)、D-半乳糖（D-Gal)、D-甘露糖（D-Man)、 D-果糖（D-Fru)、D-葡萄糖醛酸（D-GlcA)、D-半乳糖醛酸（D-GalUA)、N-乙酰-D-氨基葡 萄糖（D-GlcNAc)、N-乙酰-D-氨基半乳糖（D-GalNAc)、以及N-乙酰神经氨酸（NANA)。因 此，表1中的"不明（1)"~ "不明（3)"与所有上述标准品均不同。另外，多醣类的组成糖的 重量比和组成比，以相对于与标准品一致的单糖及其衍生物之比来表示。
[0085] 【表1】
以上结果表明，来源于瓜实蝇的多醣类可溶于水而不溶于约80V%(体积百分比）的 甲醛水溶液，且为酸性多醣类，平均分子量为约100万（约LOXlO3 kDa)，至少含有选自 N-乙酰-D-氨基葡萄糖（D-GlcNAc)、N-乙酰-D-氨基半乳糖（D-GalNAc)、D-葡萄糖醛酸 (D-GlcA)、L-鼠李糖（L-Rha)、L-岩藻糖（L-Fuc)、D-葡萄糖（D-Glc)、D-半乳糖（D-Gal)、 D-甘露糖（D-Man)以及D-核糖（D-Rib)中的一种或多种作为组成糖。另外还表明，以总离 子色谱图的峰面积比计，L-鼠李糖含量为约22. 8%。
[0086] 1. 2.来源于属于家幡科（Muscidae)的昆虫且具有免疫赋活作用的物质的鉴定 对属于双翅目的昆虫所含有的具免疫赋活能的多醣进行鉴定。昆虫使用属于家蝇科 (Muscidae)的苍幡（Musca domestica)的蛹。采用与I. 1.同样的方法制备水提取部分。
[0087] 采用凝胶过滤色谱法对水提取部分进行纯化。色谱柱使用Hiprep 26/60 Sephacryl S500(分离范围4X104-2X IO7) (GE Healthcare公司制）。采用苯酷-硫酸法 对各洗脱部分中所含的总糖量进行测定。另外，将洗脱部分稀释，以由小鼠巨噬细胞株产生 的一氧化氮作为指标，对各洗脱部分的免疫赋活作用进行研宄。如图7所示，得到表现出免 疫赋活作用的部分。由此可知，苍蝇含有大量表现出免疫赋活作用的多醣类。由凝胶过滤 色谱的结果可以预测，苍蝇中所含的多醣类的分子量为约180万（1.8X IO6)(洗脱部分13~ 洗脱部分17)、以及约30万（3. 0 X IO5)(洗脱部分23~洗脱部分27)。[0088] 由以上结果可知，属于双翅目的昆虫中含有具免疫赋活作用的多醣类。
[0089] 2.来源于属于鳞翅目的昆虫且具有免疫赋活作用的物质的鉴定 2. 1.来源于属于天蚕蛾科的昆虫且具有免疫赋活作用的物质的鉴定 对属于鳞翅目的昆虫所含有的具免疫赋活能的多醣进行鉴定。昆虫使用属于天蚕蛾科 (Saturniidae)的樟蚕（Antheraea yamamai)的蛹。采用与I. 1.同样的方法制备了水提取 部分。
[0090] 将水提取部分加入DEAE阴离子交换柱（Hipr印DEAE FF 16/10、GE Healthcare 公司制）中，利用0M~0.6M的氯化钠浓度梯度对水提取部分进行洗脱。采用苯酚-硫酸法 对各洗脱部分中所含的总糖量进行测定。另外，将洗脱部分稀释，以由小鼠巨噬细胞株产生 的一氧化氮作为指标，对各洗脱部分的免疫赋活作用进行研宄。表示总糖量和氯化钠浓度 的图表如图8所不，表不总糖量和免疫赋活作用的图表如图9所不。确认了具有强免疫赋 活作用的洗脱部分。由于吸附于阴离子交换柱且利用0M~0. 6M的氯化钠水溶液进行洗脱， 因此可知具有免疫赋活作用的物质为酸性。
[0091] 进而，采用凝胶过滤色谱法对具有免疫赋活作用的洗脱部分进行纯化。色谱柱使 用Hiprep 26/60 Sephacryl S500(分离范围 4 X104-2 XlO7) (GE Healthcare公司制）。米 用苯酚-硫酸法对各洗脱部分中所含的总糖量进行测定。另外，将洗脱部分稀释，以由小鼠 巨噬细胞株产生的一氧化氮作为指标，对各洗脱部分的免疫赋活作用进行研宄。如图10所 示，分子量大的部分显示出免疫赋活作用。
[0092] 进而，将经凝胶过滤色谱法确认具有免疫赋活作用的洗脱部分加入高效液相色谱 仪中，对分子量进行测定。色谱柱使用分离范围为5亿至1万的Showdex (注册商标）SB-807 HQ(昭和电工株式会社制）。如图11所示，可知具有免疫赋活作用的物质为平均分子量约 31万（约3. IXlO5)的多醣类。
[0093] 进而，采用与I. 1.同样的方法，利用气相色谱-质谱联用仪（GC/MS)对该多醣类 的组成糖进行分析后，得到了图12所示的图谱的总离子色谱图（TIC)。计算出与总离子色 谱图的峰对应的单糖及其衍生物的面积比。
[0094] 标准品使用D-阿拉伯糖（D-Ara)、D-木糖（D-Xyl)、L-鼠李糖（L-Rha)、L-岩藻 糖（L-Fuc)、D-核糖（D-Rib)、D-葡萄糖（D-Glc)、D-半乳糖（D-Gal)、D-甘露糖（D-Man)、 D-果糖（D-Fru)、D-葡萄糖醛酸（D-GlcA)、D-半乳糖醛酸（D-GalUA)、N-乙酰-D-氨基葡 萄糖（D-GlcNAc)、N-乙酰-D-氨基半乳糖（D-GalNAc)、以及N-乙酰神经氨酸（NANA)。因 此，表2中的"不明（1)"~ "不明（6)"与上述所有标准品均不同。
[0095] 【表2】
由以上结果可知，来源于天蚕的多醣类可溶于水而不溶于约80V%(体积百分比）的甲 醛水溶液，且为酸性多醣，平均分子量为约31万（约3. 10 X IO5)，至少含有选自D-甘露糖 醛酸（D-ManA)、L-古罗糖醛酸（L-GulA)、L-鼠李糖（L-Rha)、L-岩藻糖（L-Fuc)、D-半乳 糖（D-Gal)、D-葡萄糖（D-Glc)以及D-甘露糖中的一种或多种作为组成糖。另外还表明， 以总离子色谱图的峰面积比计，L-鼠李糖含量为约12. 9%。
[0096] 2.2.来源于属于蚕蛾科的昆虫且具有免疫赋活作用的物质的鉴定 对属于鳞翅目的昆虫所含有的具免疫赋活能的多醣进行鉴定。昆虫使用属于蚕蛾科 (Bombycidae)的蚕（Bombyx mori)的蛹。采用与I. 1.同样的方法制备水提取部分。
[0097] 将水提取部分加入DEAE阴离子交换柱（Hipr印DEAE FF 16/10、GE Healthcare 公司制）中，利用〇M~l. OM的氯化钠浓度梯度对水提取部分进行洗脱。采用苯酚-硫酸法 对各洗脱部分中所含的总糖量进行测定。另外，将洗脱部分稀释，以由小鼠巨噬细胞株产生 的一氧化氮作为指标，对各洗脱部分的免疫赋活作用进行研宄。表示总糖量和氯化钠浓度 的图表如图13所示，表示总糖量和免疫赋活作用的图表如图14所示。可确认具有强免疫赋 活作用的洗脱部分。由于吸附于阴离子交换柱且利用〇M~l. OM的氯化钠水溶液进行洗脱， 因此可知具有免疫赋活作用的物质为酸性。
[0098] 进而，采用凝胶过滤色谱法对具有免疫赋活作用的洗脱部分进行纯化。色谱柱使 用Hiprep 26/60 Sephacryl S500(分离范围 4 X104-2 XlO7) (GE Healthcare公司制）。米 用苯酚-硫酸法对各洗脱部分中所含的总糖量进行测定。另外，将洗脱部分稀释，以由小鼠 巨噬细胞株产生的一氧化氮作为指标，对各洗脱部分的免疫赋活作用进行研宄。如图15所 示，分子量大的部分表现出了免疫赋活作用。
[0099] 另外，可以预测经凝胶过滤色谱法确认具有免疫赋活作用的部分与2. 1.中的经 凝胶过滤色谱法确认具有免疫赋活作用的部分相同。因此，明确了蚕中也含有具免疫赋活 作用的多醣类，并且该多醣类的分子量为约31万（约3. IOX IO5)。
[0100] 以上结果表明，在属于鳞翅目的昆虫中也含有具免疫赋活作用的多醣类。
[0101] 3.属于鞘翅目的昆虫所具有的免疫赋活作用的验证 为了验证属于其他分类的昆虫中是否也含有本发明的具有免疫赋活作用的多 醣类，使用属于鞘翅目的昆虫对免疫赋活作用进行研宄。使用了属于鞘翅目（甲 虫目）（Coleoptera)多食亚目（Polyphaga)金龟总科（Scarabaeoidea)金龟子科 (Scarabaeidae)的独角仙（Trypoxylus dichotomus)的蛹。采用与1.相同的方法制备上 清部分并以由小鼠巨噬细胞株产生的一氧化氮作为指标对稀释的上清部分中的免疫赋活 作用进行研宄后，如图16所示确认了免疫赋活作用。因此认为与属于双翅目的昆虫或属于 鳞翅目的昆虫相同，属于鞘翅目的昆虫也含有具免疫赋活作用的多醣类。
[0102] 4.免疫赋活作用的验证 将本发明的多醣类所具有的免疫赋活作用与已知具有免疫赋活作用的脂多糖进行比 较。利用上述方法从瓜实蝇中提纯出本发明的多醣类，并将小鼠巨噬细胞株的一氧化氮的 产量与脂多糖进行比较。结果如图17所示。在lOOpg/mL的脂多糖中基本未观察到巨噬细 胞产生一氧化氮，而另一方面，从瓜实幡中提纯的多醣即使在lOOpg/mL的浓度也会引起一 氧化氮的产生。因此，认为本发明的多醣类具有非常强的免疫赋活作用。
[0103] 5.本发明的组合物的耐热性验证 对本发明的多醣类的耐热性进行了验证。将从瓜实蝇的蛹得到的上清部分在l〇〇°C下 热处理0分钟~30分钟，对由小鼠巨噬细胞株产生的一氧化氮的量进行测定。如图18所 示，即使在100°C下热处理了 30分钟，本发明的多醣类的免疫赋活作用也不会消失，因此可 知本发明的多醣类具有高耐热性。
[0104] 6.昆虫变态阶段中免疫赋活作用的变化 对本发明的多醣类的免疫赋活作用在不同的昆虫变态阶段如何变化这一情况进行研 宄。将瓜实蝇的第三日、第四日、第五日、第六日的幼虫、蛹化第一日、第二日、第三日、第四 日的蛹分别粉碎成糊状，通过离心分离得到上清部分，将上清部分以10倍稀释、100倍稀 释、或1000倍稀释的方式添加到小鼠巨噬细胞株中，并对一氧化氮的产量进行测定。如图 19所示，尤其在初期的幼虫和后期的蛹中出现了强免疫赋活作用，但在幼虫~蛹的整个时 期内均出现了免疫赋活作用，因此认为昆虫在这些时期含有具免疫赋活作用的多醣类。
[0105] 7.由本发明的多醣类产生的免疫赋活作用机制的分析 对本发明的多醣类所具有的免疫赋活作用是由动物的巨噬细胞的哪一个受体产生的 进行了研宄。利用针对Toll样受体2 (Tol 1-1 ike Receptor 2)的抗体（anti_mTLR2)、或针 对Toll样受体4(Toll_like Receptor 4)的抗体（anti_mTLR4)对巨细胞进行处理，添 加来源于瓜实蝇的多醣或LPS(脂多糖）使其浓度达到lng/ml，对一氧化氮的产量进行测 定。结果如图20所示。由于在利用针对Toll样受体4(Toll-like Receptor 4)的抗体处 理后的巨噬细胞中一氧化氮的产量有意（非偶然）地下降，因此，表示由本发明的多醣类产 生的免疫赋活作用至少经由Toll样受体4(Toll-like Receptor 4)实现。
[0106] 8.使用含有本发明的多醣类的饲料进行的真鯛饲养试验 对使用含有本发明的多醣类的饲料是否会提高真鯛的抗病性进行了研宄。在每个水槽 中放入十二条尾叉长约10cm、鱼体重约25g的真鯛。将来源于瓜实蝇的多醣制成饲料，使其 浓度分别达到0. 001ug/g、0. 01ug/g、0. lug/g、lug/g，并供给真鯛。在饲养四周后，在真鯛 的腹腔内接种5. OX 105/cell引起爱德华氏症的革兰氏阴性菌即iart/a(爱 德华氏菌）使其强制感染，对存活数量进行计测。结果如图21所示。与对照组（control group)相比，含有来源于瓜实蝇的多醣的饲料饲养下的真鯛的生存率较高。因此，认为通过 来源于瓜实幡的多醣所具有的的免疫赋活作用，真鯛获得了对iart/a(爱德 华氏菌）的抗病性。
【主权项】
1. 一种多醣类，其来源于昆虫且具有免疫赋活作用。2. 根据权利要求1所述的多醣类，其中， 所述多醣类至少含有鼠李糖作为组成糖。3. 根据权利要求1或2所述的多醣类，其中， 所述昆虫为选自双翅目、鳞翅目、鞘翅目、膜翅目、半翅目、直翅目和蜻蜓目中的一种或 多种。4. 根据权利要求1或2所述的多醣类，其中， 所述昆虫选自双翅目、鳞翅目和鞘翅目中的一种或多种。5. 根据权利要求1至4中任一项所述的多醣类，其中， 所述昆虫至少对植物表现出食性。6. 根据权利要求1至5中任一项所述的多醣类，其中， 所述多醣类具有耐热性。7. 根据权利要求1至6中任一项所述的多醣类，其中， 所述多醣类具有耐高温高压特性。8. 根据权利要求1至7中任一项所述的多醣类，其中， 所述多醣类的平均分子量为1. 〇 X 105~1. O X 107。9. 根据权利要求1至8中任一项所述的多醣类，其中， 所述免疫赋活作用经由Toll样受体4进行。10. -种组合物，其含有权利要求1至9中任一项所述的多醣类。11. 根据权利要求10所述的组合物，其中， 所述组合物为选自昆虫的卵、幼虫、蛹和成虫中的一种或多种的粉末。12. 根据权利要求10所述的组合物，其中， 所述组合物为从选自昆虫的卵、幼虫、蛹和成虫中的一种或多种中提取出的提取物。13. 根据权利要求10所述的组合物，其中， 所述组合物为从选自昆虫的卵、幼虫、蛹和成虫中的一种或多种中所得的醇不溶性固 形物。14. 一种免疫赋活剂，其以所述多醣类为有效成分，含有权利要求10至13中任一项所 述的组合物。
【专利摘要】本发明提供一种多醣类、含有多醣类的组合物、以及免疫赋活剂。迄今为止，具有免疫赋活能的多醣可作为药物或健康食品、畜产用或水产用的饲料添加物使用，但是显示出充分的免疫赋活效果的多醣很少，因此需要开发成本低而免疫赋活效果强的组合物。本发明提供来源于昆虫且具有免疫赋活作用的多醣类、含有该多醣类的组合物、以及以该多醣类作为有效成分的免疫赋活剂。本发明的多醣类的组成糖优选至少含有鼠李糖。
【IPC分类】A61P37/04, C08B37/00, A61K35/64, A61K31/715
【公开号】CN104884068
【申请号】CN201380039774
【发明人】三浦·猛, 三浦·智惠美, 太田·史, 岩井·俊治, 高桥·隆行
【申请人】株式会社爱南自由
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2013年7月22日
【公告号】WO2014017451A1