组织再生促进剂的制作方法

组织再生促进剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及包含选自由活化星状细胞、活化星状细胞分解物、MMP14、经MMP14处 理的胶原和活化星状细胞分泌物构成的组中的成分、且用于组织再生促进、细胞分化促进 和/或细胞增殖促进的组合物、包含MMP14抑制物质且用于抑制细胞增殖的组合物、及包含 经MMP14处理的胶原的细胞培养基材等。
【背景技术】
[0002] 生物体的组织如果受到损伤，则会进行再生以修复损伤部分，并恢复其功能。例 如，已知肝脏即使切除一半以上，也会在短时间内再生，恢复大致原本的大小和功能。关于 组织再生的研宄以往重点对肝脏进行，且报告了各种见解，但关于组织再生的详细机制仍 有多个不明之处。认为组织的再生中有多种细胞的复杂参与，但关于这些细胞中的哪一个 承担主要作用，并未得出决定性的见解。
[0003] 通过对利用组织染色或细胞染色等的损伤组织的经时变化、或各种生理活性物 质对组织再生造成的影响等进行解析，组织再生机制逐渐得以阐明。例如，非专利文献 1中示出了如下假说：在小鼠肝部分切除模型中，特定的表型的肝窦内皮细胞提供介由 VEGFR2(血管内皮生长因子-A受体-2)的内皮细胞特异性转录因子Idl的向上调节而引起 肝细胞增殖，接着通过内皮细胞自身增殖，由此进行肝脏的再生。
[0004] 然而，尽管进行了悉心研宄，但组织再生的机制仍仅有极少的部分得以明确，需要 进一步的研宄努力。
[0005] 现有技术文献
[0006] 非专利文献
[0007] 非专利文献 I :Ding et al. ,Nature. 2010Nov 11 ;468 (7321) :310-5

【发明内容】

[0008] 发明要解决的技术问题
[0009] 本发明的目的在于提供一种新型的组织再生促进剂和组织再生促进方法。
[0010] 用于解决技术问题的手段
[0011] 本发明人们为了解决上述课题进行了深入研宄，在此过程中发现活化星状细胞对 于组织的再生发挥了重要的作用、活化星状细胞的分泌物会诱导成为组织再生的核心的干 细胞的增殖和分化、受到活化星状细胞所表达的MMP14的作用的胶原会诱导组织实质细胞 的增殖、以及胶原中存在的RGD序列参与该增殖的诱导，从而完成了本发明。
[0012] SP，本发明涉及以下内容。
[0013] (1) 一种用于促进组织再生的组合物，其包含选自由活化星状细胞、活化星状细胞 分解物、MMP14、经MMP14处理的胶原和活化星状细胞分泌物构成的组中的成分。
[0014] (2)根据（1)所述的组合物，其中，组织再生在损害组织或移植组织中发生。
[0015] (3)根据⑵所述的组合物，其是在从受到损害或移植之日起4天以内被投予。
[0016] (4)根据⑵所述的组合物，其是在从受到损害或移植之日起1天以内被投予。
[0017] (5)根据（2)~（4)中任一项所述的组合物，其中，损害选自由组织破坏、炎症、坏 死、纤维化、手术侵袭、器官衰竭构成的组。
[0018] (6)根据（1)~（5)中任一项所述的组合物，其中，组织再生伴有组织干细胞的分 化和/或增殖。
[0019] (7)根据（1)~（6)中任一项所述的组合物，其中，组织再生伴有组织实质细胞的 增殖。
[0020] (8)根据⑴~（7)中任一项所述的组合物，其中，活化星状细胞被实施了使选自 由HGF、EGF、MMP14构成的组中的蛋白质的表达增大的处置。
[0021] (9)根据（1)~（8)中任一项所述的组合物，其是针对具有组织再生受到抑制的状 态的对象来使用。
[0022] (10)根据（9)所述的组合物，其中，组织再生受到抑制的状态是选自由炎症、坏 死、纤维化、器官衰竭、血小板数量减少、基因异常、去甲肾上腺素减少构成的组。
[0023] (11) 一种促进对象的组织再生的方法，其包括将（1)~（10)中任一项所述的组合 物投予至需要其的对象的工序。
[0024] (12) -种用于干细胞分化和/或增殖的组合物，其包含选自由活化星状细胞、活 化星状细胞分解物、MMP14、经MMP14处理的胶原和活化星状细胞分泌物构成的组中的成 分。
[0025] (13) -种使组织干细胞分化和/或增殖的方法，其包括使选自由活化星状细胞、 活化星状细胞分解物、MMP14、经MMP14处理的胶原和活化星状细胞分泌物构成的组中的成 分与干细胞接触的工序。
[0026] (14) 一种用于促进细胞增殖的组合物，其包含选自由活化星状细胞、活化星状细 胞分解物、MMP14、经MMP14处理的胶原和活化星状细胞分泌物构成的组中的成分。
[0027] (15) -种使细胞增殖促进的方法，其包括使选自由活化星状细胞、活化星状细胞 分解物、MMP14、经MMP14处理的胶原和活化星状细胞分泌物构成的组中的成分与细胞接触 的工序。
[0028] (16) -种用于抑制细胞增殖的组合物，其包含抑制MMP14的物质。
[0029] (17)根据（16)所述的组合物，其中，抑制MMP14的物质所作用的细胞是CAF和/ 或肿瘤细胞。
[0030] (18) -种细胞培养基材，其包含经MMP14处理的胶原。
[0031] (19) 一种细胞培养容器，其由经MMP14处理的胶原被覆。
[0032] 发明的效果
[0033] 根据本发明，不仅能促进生物体内的组织再生，而且还能促进生物体外的组织形 成，因此可期待对生物学、医学作出巨大的贡献。
[0034] 而且，本发明的组织再生的促进在组织再生受到抑制的状况、例如伴有纤维症等 疾病的状况等下尤其有用。
【附图说明】
[0035] 图1是表示对肝部分切除大鼠的处置的流程的图。
[0036] 图2是表示将肝部分切除后第5天和第10天采集的各组的肝脏的外观与肝部分 切除前和刚切除后的肝脏进行比较的图。
[0037] 图3是表示所采集的各组的肝重量的推移的图表。
[0038] 图4是表示肝部分切除后第5天采集的肝组织经FITC-TUNEL、a -SMA和DAPI共 染色后所得的荧光显微镜像的图。
[0039] 图5是表示肝部分切除后第5天采集的肝组织经FITC-TUNEL、a -SMA和DAPI共 染色后所得的荧光显微镜像中的a -SM阳性TUNEL阳性细胞的数量的图。
[0040] 图6是表示肝部分切除后第5天采集的肝组织经Ki67和DAPI共染色后所得的荧 光显微镜像的图。
[0041] 图7是表示肝部分切除后第5天采集的肝组织经Ki67和DAPI共染色后所得的荧 光显微镜像中的Ki67阳性细胞数量的图。
[0042] 图8是表示肝部分切除后第5天采集的肝组织经⑶133和DAPI共染色后所得的 荧光显微镜像的图。
[0043] 图9是表示对例3的各组实施的处置的概要的图。
[0044] 图10是表示将所采集的各组的肝脏的外观与刚进行肝部分切除后（第0天）的 肝脏进行比较的图。
[0045] 图11是表示将所采集的各组的肝脏的重量与刚进行肝部分切除后（第0天）的 肝脏进行比较的图表。
[0046] 图12是表示肝部分切除后的肝组织中的a -SM阳性细胞的经时变化的图。
[0047] 图13是表示肝部分切除后的肝组织中的a -SMA阳性细胞数量的经时变化的图 表。
[0048] 图14是表示静止型肝星状细胞（上图）和活性型肝星状细胞（下图）的显微镜 像的图。
[0049] 图15是表示干细胞与星状细胞的接触共培养中的GFP/白蛋白两阳性群落的显微 镜像的图。
[0050] 图16是表示在干细胞与星状细胞的接触共培养中添加了 EGF和HGF时的GFP/白 蛋白两阳性群落的显微镜像的图。
[0051] 图17是表示干细胞与星状细胞的接触共培养中的GFP/白蛋白两阳性群落数量的 图表。
[0052] 图18是表示干细胞与星状细胞的接触共培养中的GFP/白蛋白两阳性群落的面积 的图表。
[0053] 图19是表示干细胞与星状细胞的非接触共培养中的GFP/白蛋白两阳性群落的面 积的图表。
[0054] 图20是以吸光度表示干细胞与星状细胞的非接触共培养中的GFP/白蛋白两阳性 细胞数量的增殖的图表。
[0055] 图21是表示肝部分切除后的肝组织中的DNA合成的经时变化的显微镜像。
[0056] 图22是表示肝部分切除后的肝组织中的BrdU阳性细胞的比例的经时变化的图 表。
[0057] 图23是表示肝部分切除后的肝组织中的DNA合成的经时变化的显微镜像。
[0058] 图24是表示肝部分切除后的肝组织中的BrdU阳性细胞的比例的经时变化的图 表。
[0059] 图25是表示共培养肝细胞与星状细胞时的BrdU阳性肝细胞的显微镜像。
[0060] 图26是表示共培养肝细胞与星状细胞时的BrdU阳性肝细胞的比例的图表。
[0061] 图27是表示在实施了各种处理的胶原上培养肝细胞时的BrdU阳性细胞的显微镜 像。
[0062] 图28是表示在实施了各种处理的胶原上培养肝细胞时的BrdU阳性细胞的比例的 图表。
[0063] 图29是表示共培养肝细胞与已敲减MMP14和/或HGF的星状细胞时的BrdU阳性 肝细胞的显微镜像。
[0064] 图30是表示共培养肝细胞与已敲减MMP14和/或HGF的星状细胞时的BrdU阳性 肝细胞的比例的图表。
[0065] 图31是表示在MMP14处理胶原上、在存在R⑶肽的条件下培养肝细胞时的BrdU 阳性细胞的显微镜像。
[0066] 图32是表示在MMP14处理胶原上、在存在R⑶肽的条件下培养肝细胞时的BrdU 阳性细胞的比例的图表。
【具体实施方式】
[0067] 本发明的一个方面涉及一种用于促进组织再生的组合物，其包含选自由活化星状 细胞、活化星状细胞分解物、MMP14、经MMP14处理的胶原和活化星状细胞分泌物构成的组 中的成分。
[0068] 活化星状细胞可以通过传代培养从生物体分离出的星状细胞而获得。已知星状细 胞存在于肝脏、胰腺、肾脏、肠道、肺等各种组织中（Zhao and Burt, J Mol Histol. 2007Mar; 38(1) :53-64)，可以利用其中的任一种。星状细胞的分离可以使用已知的任意方法来进行。 肝星状细胞的分离方法的具体例例示于后述的例5(1)中。活化星状细胞的特征在于a SM 的表达，可以将其作为标记物进行分选。
[0069] 活化星状细胞可以被实施了使选自由HGF、EGF、MMP14构成的组中的蛋白质的表 达增大的处置。作为这样处置，并无限定，例如可以列举出将编码所述蛋白质的基因导入活 化星状细胞。编码HGF、EGF和MMP14的基因是已知的，而且基因的导入法也是本技术领域 所熟知的。
[0070] 活化星状细胞分解物可通过利用包含物理性和/或化学性方法的各种方法对活 化星状细胞进行分解而获得。关于分解，可以使用将细胞分解的已知的任意的方法，例如 渗透压冲击法、冷冻熔解法、表面活性剂的使用、酶消化法、超声波处理、弗氏细胞压碎器、 利用研钵的粉碎、利用均化器的破碎、利用玻璃珠的破碎等。分解方法优选不会使蛋白质变 性、或变性程度轻的方法。通过使用这样的方法，可获得在细胞膜上表达的MMP14而不会损 及其功能。而且，活化星状细胞分解物优选含有细胞膜成分。
[0071] MMP14(也称为MT1-MMP)是在细胞膜上表达的MMP。MMP14可以作用于胶原I。通 过本发明人可知，MMP14对胶原I的作用与细胞的增殖有很深的关系。
[0072] 本发明的MMP14不仅包括在细胞膜上表达的MMP14,而且还包括已从细胞膜游离 出的MMP14。MMP14可以天然存在，也可以人工制作。因此，MMP14包括重组MMP14。游离型 的 MMP14 是已知的（例如 Jo et al.，Biochem J.2000Feb l;345Pt 3:511-9 等），也已市 售（例如 R&D Systems, Cat No. 918-MP-0KK918-MPN-010 等）。MMP14 的氨基酸和对其进 行编码的碱基序列是已知的（例如人MM P14的碱基序列已登记为基因银行注册号（GenBank accession number) NM_004995,氨基酸序列已登记为基因银行注册号NP_004986)。
[0073] 本发明的MMP14还包括其功能性突变体。MMP14的功能性突变体并无限定，例如可 列举出：（i)该蛋白质的氨基酸序列中具有1个或2个以上、典型的是1个或几个突变、但具 有与该蛋白质同等功能的突变体；（ii)由具有编码该蛋白质的基因的碱基序列的核酸、或 在与该核酸相同的编码多肽的核酸的碱基序列中具有1个或2个以上、典型的是1个或几 个突变的核酸编码、且具有与该蛋白质同等功能的突变体；（iii)由具有编码该蛋白质的 基因的碱基序列的核酸、与该核酸相同的编码多肽的核酸或编码（ii)的突变体的核酸的 互补链、或者其片段中在严格的条件下杂交的核酸编码、且具有与该蛋白质同等功能的突 变体；（iv)包含与该蛋白质的氨基酸序列具有60 %以上、优选70 %以上、更优选80 %以上、 进一步优选90%以上、尤其优选95%以上的同源性的氨基酸序列、且具有与该蛋白质同等 功能的突变体；（V)由与编码该蛋白质的基因的喊基序列具有60%以上、优选70%以上、更 优选80%以上、进一步优选90%以上、尤其优选95%以上的同源性的核酸编码、且具有与 该蛋白质同等功能的突变体等。
[0074] 本领域技术人员可以根据MMP14的序列信息、通过已知的任意的方法、例如化学 合成、利用限制性酶的核酸的切断或插入、部位特异性突变导入、放射线或紫外线的照射等 来适当制作上述功能性突变体。
[0075] 某突变体是否具有与MMP14同等的功能可以通过下述方法评价：利用已知的任意 的方法对该突变体就MMP14的已知的功能、并无限定地例如胶原分解能力等进行解析，与 适当的阴性对照、或作为阳性对照的MMP14进行比较，由此进行评价。例如对于某突变体， 在所述功能比阴性对照优异时，例如优异10%以上、25 %以上、50 %以上、75 %以上、甚至 100%以上时，和/或该功能为CSABP的1/100以上、1/50以上、1/25以上、1/10以上、1/5 以上、甚至1/2以上时，该突变体包括在MMP14的功能性突变体中。
[0076] 本说明书中所用的"严格的条件"的用语是本技术领域众所周知的参数，记载于 标准实验指南集、例如 Sambrook et al·，Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3d ed. , Cold Spring Harbor Press (2001)、 或 Ausubel et al. , Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates(1992)等。
[0077] 本发明中的严格的条件例如是指利用65°C下的由3.5XSSC(0. 15M氯化钠 /0. 15M柠檬酸钠、pH7)、葡聚糖0.02%、聚乙烯吡咯烷酮0.02%、牛血清白蛋白0.02%、 NaH2P0425mM (pH7)、SDS 0. 05 %、EDTA2mM构成的杂交缓冲液进行的杂交。杂交后， 移入了 DNA的膜用2XSSC在室温下洗涤，接着用0. 1~0. 5XSSC/0.1 XSDS在直至 68°C为止的温度下洗绦。或者，严格的杂交也可以使用ExpressHyb(R)Hybridization Solution(Clontech公司）等的市售的杂交缓冲液、在由制造者记载的杂交和洗绦条件下 进行。
[0078] 虽然存在达到产生同等程度的严格的结果的可使用的其他条件、试剂等，但认为 本领域技术人员是知晓这样的条件的，因此对此，本说明书中并不特别记载。然而，为了可 以明确地鉴定出将蛋白质的突变体编码的核酸，可以对条件进行操作。
[0079] 本发明的MMP14和/或其功能性突变体除了该蛋白质自身或其功能性突变体外， 也包括将该蛋白质或其功能性突变体编码的核酸。
[0080] 经MMP14处理的胶原可以通过利用MMP14对胶原进行处理而获得。作为胶原，例 如可以使用胶原I。处理所用的MMP14除了上述MMP14(包括MMP14的功能性突变体）外， 还可以是表达MMP14的细胞本身、或包含MMP14的上述细胞的分解物。作为利用MMP14的 处理时间，例如在MMP14可以作用的温度下，可以为1~120小时、3~60小时、6~48小 时、12~36小时等。经MMP14处理的胶原优选成为RGD序列可以与细胞相互作用的状态。
[0081] 活化星状细胞分泌物可以从活化星状细胞的培养上清等中获得。培养上清可以直 接使用，也可以通过透析或冷冻干燥等进行浓缩后使用。由于活化星状细胞分泌物中包含 各种蛋白质，因此优选以蛋白质不发生变性的方式进行处理。
[0082] 利用本发明的组合物促进再生的组织并无特别限定，包括全身的各种组织。作为 这样的组织，并无限定，例如可以列举出存在星状细胞的组织、产生纤维化的组织、存在干 细胞的组织等。具体来说，并无限定，例如可以列举出肝脏、胰腺、肾脏、肠道、肺、脾脏、心 脏、骨髓、声带、皮肤、腹膜、眼、脉管等。
[0083] 本发明的组合物对于在损害组织或移植组织中发生的组织再生是有用的。损害组 织包括受到组织破坏、炎症、坏死、纤维化、手术侵袭、器官衰竭等的组织。本发明的组合物 的投予时期并无特别限定，优选在从受到损害或移植之日起4天以内、或从受到损害或移 植之日起1天以内将其投予。
[0084] 利用本发明的组合物的组织再生也可以伴有干细胞的分化和/或增殖。而且，利 用本发明的组合物的组织再生还可以伴有组织实质细胞的增殖。干细胞的分化例如可以 通过针对分化细胞的特异性细胞标记物的检测、分化细胞所表现出的功能的检测等进行评 价。细胞的增殖可以通过各种已知的方法、例如经时的活细胞数量的计数、组织的大小、体 积或重量的测定、DNA合成量的测定、WST-I法、BrdU (溴脱氧尿苷）法、3H胸苷导入法等进 行评价。
[0085] 本发明的组合物可以针对具有组织再生受到抑制的状态的对象来使用。作为组织 再生受到抑制的状态，并无限定，例如包括炎症、坏死、纤维化、器官衰竭、血小板数量减少、 基因异常、去甲肾上腺素减少等。
[0086] 本发明的组合物中的有效成分的配合量是在投予了组合物时可促进组织再生的 量。而且，优选不会产生超过因投予引起的益处的不良影响的量。这也的量是公知的，或者 是可以通过使用了培养细胞等的体外试验、或小鼠、大鼠、狗或猪等模型动物的试验来适当 决定，这样的试验方法是本领域技术人员所熟知的。组织再生的促进可以通过使用了生物 化学检查、X光、超声波、MRI、CT、内窥镜等的图像诊断等对组织的功能、重量、大小等的恢复 进行评价。有效成分的配合量可以根据组合物的投药形态而变化。例如在1次投予中使用 几个单位的组合物时，1个单位组合物中所配合的有效成分的量可以设为1次投予所需的 有效成分的量的几分之一。本领域技术人员可以适当进行这样的配合量调整。
[0087] 本发明还涉及包括配合选自由活化星状细胞、活化星状细胞分解物、MMP14、经 MMP14处理的胶原和活化星状细胞分泌物构成的组中的成分的制造用于促进组织再生的组 合物的方法；所述成分在用于促进组织再生的组合物的制造中的使用；以及组织再生促进 中所用的所述成分。
[0088] 关于所述制造方法或使用中的各成分或其配合量，如前所述。各成分的配合可以 按照已知的任意的方法进行。
[0089] 本发明还涉及一种促进对象的组织再生的方法，其包括将所述组合物投予至需要 其的对象的工序。本方法中的对象可以是组织受到损害，也可以是受到组织移植。损害并 无限定，例如包括组织破坏、炎症、坏死、纤维化、手术侵袭、器官衰竭等。组合物的投予例如 可以在从受到损害或移植之日起4天以内投予，也可以在从受到损害或移植之日起1天以 内投予。
[0090] 本发明还涉及包含选自由活化星状细胞、活化星状细胞分解物、MMP14、经MMP14 处理的胶原和活化星状细胞分泌物构成的组中的成分的用于干细胞的分化和/或增殖的 组合物；包括配合所述成分的制造用于干细胞的分化和/或增殖的组合物的方法；所述成 分在用于干细胞的分化和/或增殖的组合物的制造中的使用；干细胞的分化和/或增殖中 所用的所述成分；以及包括使所述成分与干细胞接触的工序的使干细胞分化和/或增殖的 方法。
[0091] 干细胞并无特别限定，例如包括组织干细胞（体性干细胞、成体干细胞）、胚胎干 细胞、iPS细胞等。干细胞可以为全能性、万能性、多能性或单能性。作为组织干细胞，并无 限定，例如可以列举出神经干细胞、造血干细胞、间质系干细胞、肝干细胞、胰腺干细胞、皮 肤干细胞、肌肉干细胞、生殖干细胞等。干细胞可以是自身来源的，也可以是同种的其他个 体或不同种的个体的干细胞。经分化和/或增殖的干细胞可以移植到需要其的对象。
[0092] 上述方法可以以体外、体内或经活体进行。关于上述组合物、方法或使用中的各成 分或其配合量，如前所述。各成分的配合可以按照已知的任意的方法进行。在使用MMP14 作为上述组合物、方法或使用中的有效成分时，优选在成为增殖促进的对象的细胞的周围 存在胶原（尤其是胶原I)。
[0093] 本发明还涉及包含选自由活化星状细胞、活化星状细胞分解物、MMP14、经MMP14 处理的胶原和活化星状细胞分泌物构成的组中的成分的用于促进细胞增殖的组合物；包括 配合所述成分的制造用于促进细胞增殖的组合物的方法；所述成分在用于促进细胞增殖的 组合物的制造中的使用；细胞增殖的促进中所用的所述成分；以及包括使所述成分与细胞 接触的工序的使细胞增殖促进的方法。
[0094] 促进增殖的细胞并无限定，例如可以列举出肝脏、胰腺、肾脏、肠道、肺、脾脏、心 脏、骨髓、声带、皮肤、腹膜、眼、脉管等的细胞。细胞可以是自身来源的，也可以为同种的其 他个体或不同种的个体的细胞。经分化和/或增殖的细胞可以移植到需要其的对象。
[0095] 所述方法可以以体外、体内或经活体进行。关于上述组合物、方法或使用中的各成 分或其配合量，如前所述。各成分的配合可以按照已知的任意的方法进行。在使用MMP14 作为所述组合物、方法或使用中的有效成分时，优选在成为增殖促进的对象的细胞的周围 存在胶原（尤其是胶原I)。
[0096] 本发明还涉及包含抑制MMP14的物质的用于抑制细胞增殖的组合物；包括配合所 述物质的制造用于抑制细胞增殖的组合物的方法；所述物质在用于抑制细胞增殖的组合物 的制造中的使用；细胞增殖的抑制中所用的所述物质；以及包括使所述物质与细胞接触的 工序的抑制细胞增殖的方法。
[0097] 本发明还涉及包含抑制MMP14的物质的用于处置细胞增殖性疾病的组合物；包括 配合所述物质的制造用于处置细胞增殖性疾病的组合物的方法；所述物质在用于处置细胞 增殖性疾病的组合物的制造中的使用；细胞增殖性疾病的处置中所用的所述物质；以及包 括将所述物质的治疗有效量投予至需要其的对象的用于处置细胞增殖性疾病的方法。
[0098] 作为抑制MMP14的物质，并无限定，例如包括抑制MMP14的产生和/或活性的药 物、或促进MMP14的分解和/或灭活的药物等。作为抑制MMP14的产生的药物，并无限定， 例如可以列举出针对编码MMP14的DNA的RNAi分子、核酶、反义核酸、DNA/RNA嵌合多核苷 酸和表达这些物质的载体等。
[0099] MMP14的抑制可以通过与不使MMP14抑制物质发生作用的情况相比、细胞中MMP14 的表达或活性受到了抑制来确定。MMP14的表达可以通过已知的任意的方法来评价，并无 限定，例如可以通过利用了抗MMP14抗体的免疫沉降法、EIA、ELISA、IRA、IRMA、蛋白质印迹 法、免疫组织化学法、免疫细胞化学法、流式细胞仪法、利用了编码MMP14的核酸或其特异 性片段或该核酸的转录产物（例如mRNA)或在剪接产物中特异性地杂交的核酸的各种杂交 法、Northern印迹法、Southern印迹法、各种PCR法等进行评价。
[0100] 在本说明书中使用时，RNAi分子是指带来RNA干扰的任意的分子，并无限定，包括 siRNA (小干扰RNA)、miRNA (微 RNA)、shRNA (短发夹 RNA)、ddRNA (DNA指向 RNA)、piRNA (Piwi 相互作用RNA)、rasiRNA (重复相关siRNA)等双链RNA及它们的改性体等。这些RNAi分子 已有市售，或者可以根据已知的序列信息等进行设计、制作。
[010 1] 而且，在本说明书中使用时，反义核酸包括1?隱、0嫩、？嫩、或它们的复合物。
[0102] 在本说明书中使用时，DNA/RNA嵌合多核苷酸并无限定，例如包括日本特开 2003-219893中记载的由抑制靶基因的表达的DNA和RNA构成的双链多核苷酸。
[0103] 作为抑制增殖的细胞，并无限定，例如可以列举出该增殖造成不良影响的细胞、该 增殖与疾病有关的细胞等。具体来说，例如可以列举出肿瘤细胞、癌细胞、活化星状细胞等。 抑制MMP14的物质可以投予至这些细胞，但也可以投予至辅助这些细胞的增殖的MMP14表 达细胞、例如CAF(癌相关成纤维细胞）等。
[0104] 作为细胞增殖性疾病，并无限定，例如可以列举出良性或恶性肿瘤、增生症、瘢痕 瘤、柯兴氏综合症、原发性醛固酮症、粘膜红斑病、真性红细胞增多症、粘膜白斑病、增生性 瘢痕、扁平苔藓及着色斑病等。
[0105] 本说明书中所记载的本发明的各种组合物、方法等中的有效成分为核酸、例如 RNAi分子、核酶、反义核酸、DNA/RNA嵌合多核苷酸等时，这些成分也能以裸的核酸直接利 用，但也可以载持在各种载体上。作为载体，可以利用质粒载体、噬菌体载体、噬菌粒载体、 粘粒载体、病毒载体等公知的任意的载体。载体优选至少包含使所载持的核酸的表达增强 的启动子，此时，该核酸优选以可动作的方式与该启动子连接。所谓核酸以可动作的方式与 启动子连接是指通过启动子的作用、按照该核酸所编码的蛋白质适当地产生的方式配置该 核酸与启动子。载体可以在宿主细胞内复制，也可以不在宿主细胞内复制，而且，基因的转 录可以在宿主细胞的核外进行，也可以在核内进行。在后者的情况下，核酸可以并入宿主细 胞的基因组中。
[0106] 另外，有效成分也可以载持在各种非病毒性脂质或蛋白质载体上。作为这样的载 体，并无限定，例如可以列举出胆固醇、脂质体、抗体原体、环糊精纳米粒子、融合肽、适体、 生物降解性聚乳酸共聚物、聚合物等，可以提高在细胞内的导入效率（例如参照Pirollo and Chang, Cancer Res. 2008 ;68 (5) : 1247-50等）。尤其阳离子性脂质体或聚合物（例如 聚乙烯亚胺等）是有用的。作为可用作该载体的聚合物的进一步的例子，例如可以列举出 US2008/0207553、US 2008/0312174 等中记载的聚合物等。
[0107] 本说明书中所记载的本发明的各种组合物可以用于生物体内的组织再生、疾病的 处置等医疗用途。因此，本发明的各种组合物可以制成医药组合物。在医药组合物中，只要 不妨碍有效成分的效果，则可以将有效成分与其他任意成分组合。作为这样的任意成分，例 如可以列举出其他化学治疗剂、药理学上可允许的载体、赋形剂、稀释剂等。而且，根据投予 路径或药物释放模式等，用适当的材料、例如肠溶性包衣或定时崩解性材料将上述组合物 被覆，还可组装到适当的药物释放系统中。
[0108] 本说明书中所记载的本发明的各种组合物（包括各种医药组合物）可以通过包 含经口和非经口这两者在内的各种路径投予，例如可以并无限定地通过经口、静脉内、肌肉 内、皮下、局部、肿瘤内、直肠、动脉内、门静脉内、心室内、经粘膜、经皮、鼻内、腹腔内、肺内 和子宫内等路径进行投予，还可制成适于各投予路径的剂型。这样的剂型和制剂方法可以 适当采用任意的公知的剂型和制剂方法（例如参照标准药剂学，渡边喜照等编，南江堂， 2003年等）。
[0109] 例如作为适于经口投予的剂型，并无限定，可以列举出散剂、颗粒剂、片剂、胶囊 剂、液剂、混悬剂、乳剂、凝胶剂、糖浆剂等，另外作为适于非经口投予的剂型，可列举出溶液 性注射剂、混悬性注射剂、乳浊性注射剂、用时调制型注射剂等注射剂。非经口投予用制剂 可以是移植片、水性或非水性的等渗性无菌溶液或混悬液的形态。
[0110] 本说明书中所记载的本发明的各种组合物（包括各种医药组合物）可以在特定 的组织或细胞中被靶向化。靶向化可以通过已知的任意的方法达成。在想要送达至癌时， 并无限定，例如可以使用：通过将制剂制成适合于EPR(增强渗透阻滞）效果的表达的直 径为50~200 μ m、尤其是75~150 μ m等大小的被动靶向化；或将⑶19、HER2、转铁蛋白 受体、叶酸受体、VIP 受体、EGFR(Torchilin, AAPS J. 2007 ;9 (2) :E128-47)、RAAGlO (日本 特表 2005-532050)、PIPA (日本特表 2006-506071)、KID3 (日本特表 2007-529197)等配 体、或具有 RGD 基序或 NGR 基序的肽、F3、LyP-I (Ruoslahti et al·，J Cell Bioh 2010; 188(6):759-68)等作为靶向化剂的主动靶向化等方法。而且也已知类视黄醇或其衍生物 作为针对癌细胞或CAF的靶向化剂是有用的（W0 2008/120815)，因此也可以利用包含类视 黄醇作为靶向化剂的载体。这样的载体除了上述文献以外，还记载于WO 2009/036368、WO 2010/014117、W0 2012/170952 等中。
[0111] 本说明书中所记载的本发明的各种组合物（包括各种医药组合物）可以以任一种 形态供给，但从保存稳定性的观点出发，可以以能够用时调制的形态、例如在医疗现场或其 附近可由医师和/或药剂师、护士或其他的辅助医务人员等调制的形态来提供。该形态在 本发明的组合物包含脂质或蛋白质、核酸等难以稳定保存的成分时尤其有用。此时，本发明 的组合物以在其中含有至少1个必需构成要素的1个或2个以上的容器的形式提供，在使 用前、例如24小时前以内、优选3小时前以内、更优选在马上要使用前进行调制。在调制时， 可适当使用在进行调制的场所处通常可获得的试剂、溶剂、调剂器具等。
[0112] 因此，本发明还涉及包含单独或组合含有本发明的各种组合物中可含有的有效成 分的1个或2个以上容器的组合物的调制试剂盒、以及以这种试剂盒的形态提供的各种组 合物的必要构成要素。本发明的试剂盒除了上述之外，还可含有记载了本发明的各种组合 物的调制方法或投予方法等的指示、例如说明书或CD、DVD等电子记录介质等。另外，本发 明的试剂盒可含有用于完成本发明的各种组合物的所有构成要素，但并非必须含有所有的 构成要素。因此，本发明的试剂盒也可不含在医疗现场或实验设施等中可通常获得的试剂 或溶剂、例如无菌水或生理盐水、葡萄糖溶液等。
[0113] 本说明书中所记载的本发明的各种方法中的有效量是指，例如关于组织的再生， 可以为促进组织的再生、或解除组织再生的延缓的量，关于疾病的处置，可以为减轻疾病的 症状、或者延缓或停止疾病的发展的量，优选为抑制疾病、或治愈疾病的量。而且，优选不产 生超越因投予带来的益处的不良影响的量。这样的量可以通过使用了培养细胞等的体外试 验、或小鼠、大鼠、狗或猪等模型动物中的试验来适当确定，这样的试验方法是本领域技术 人员所熟知的。而且，本发明的处置方法中所用的药物的用量是本领域技术人员所公知的、 或者可以通过上述的试验等适当决定。
[0114] 本说明书中所记载的本发明的处置方法中所投予的有效成分的具体的用量可以 考虑关于需要处置的对象的各种条件、例如抑制再生的状态的有无、症状的严重程度、对象 的一般健康状态、年龄、体重、对象的性别、饮食、投予的时期和频率、并用的医药、对治疗的 反应性、剂型及对治疗的依从性等来决定。
[0115] 作为投予路径，包括包含经口和非经口这两者的各种路径、例如经口、静脉内、肌 肉内、皮下、局部、肿瘤内、直肠、动脉内、门静脉内、心室内、经粘膜、经皮、鼻内、腹腔内、肺 内及子宫内等路径。
[0116] 投予频率根据所用制剂或组合物的性状或包括上述的对象条件的不同而不同，例 如可以为1天多次（即1天2、3、4次或5次以上）、1天1次、数天1次（即每2、3、4、5、6、 7天1次等）、每周1次、每数周1次（即每2、3、4周1次等）。
[0117] 本说明书中使用时，用语"对象"是指任意的生物个体，优选动物、更优选哺乳动 物、进一步优选人的个体。本发明中，对象可以健康，也可以患有任一疾病，在想要实施特定 疾病的处置时，典型地是指患有此种疾病、或存在患病风险的对象。
[0118] 而且，本说明书中使用时，用语"处置"包括以疾病的治愈、暂时缓解或预防等目 的、在医学上可允许的所有种类的预防性和/或治疗性的介入。例如，"处置"这一用语包括 包含疾病发展的延缓或停止、病变的消退或消失、发病的预防或复发的防止等各种目的的 医学上可允许的介入。
[0119] 本发明还涉及一种包含经MMP14处理的胶原的细胞培养基材。对于经MMP14处理 的胶原，关于各种组合物等如前所述。
[0120] 本发明的细胞培养基材成为细胞生长的立脚点，可以采取膜状、凝胶状等各种形 态。细胞培养基材优选是无菌的，但也可以以非无菌状态提供，在使用时进行灭菌。本发明 的细胞培养基材也可以用于被覆细胞培养容器。被覆浓度并无限定，例如以胶原的浓度计 可以为 〇· 01 ~1000 l·1 g/cm2、0. 1 ~100 μ g/cm2、l ~50 μ g/cm2、5 ~25 μ g/cm2。
[0121] 而且，本发明还涉及一种包含经MMP14处理的胶原、或包含MMP14和胶原的细胞培 养基材制作试剂盒。该试剂盒还可以包括：包含用于使用经MMP14处理的胶原作为细胞培 养基材的信息、或用于利用MMP14对胶原进行处理的信息等的指示、例如说明书或CD、DVD 等电子记录介质等。
[0122] 本发明还涉及一种由经MMP14处理的胶原被覆的细胞培养容器。细胞培养容器可 以使用已知的任意的细胞培养容器。本发明的细胞培养容器可以将经MMP14处理的胶原被 覆在细胞培养容器上来制造，也可以利用MMP14对预先被覆在细胞培养容器上的胶原进行 处理来制造。处理中所用的MMP14可以附着在细胞膜上，也可以从细胞膜游离。因此，胶原 的处理可以包括在被覆了胶原的细胞培养容器中培养活化星状细胞等表达MMP14的细胞。 胶原的处理所使用的表达MMP14的细胞可以在处理后除去，也可以原样残留在细胞培养容 器中，在其中添加增殖的细胞。该细胞培养容器的细胞增殖能力优异，可以用于促进细胞培 养。而且，星状细胞可以诱导干细胞的分化，因此进一步包含星状细胞的细胞培养容器也可 以用于干细胞的分化诱导。胶原的被覆浓度并无限定，例如可以为〇. 01~1000 μ g/cm2、 0· 1 ~100 μ g/cm2、1 ~50 μ g/cm2、5 ~25 μ g/cm2〇
[0123] 而且，本发明还涉及一种包含经ΜΜΡ14处理的胶原、或包含ΜΜΡ14和胶原的、由经 MMP14处理的胶原被覆的细胞培养容器的制作试剂盒。该试剂盒可以包括：包含用于由经 MMP14处理的胶原被覆细胞培养容器的信息、或用于利用MMP14对被覆在细胞培养容器的 胶原进行处理的信息等的指示、例如说明书或CD、DVD等电子记录介质等。本发明的试剂盒 可以包含细胞培养容器，但也可以另外准备市售的细胞培养容器来使用。
[0124] 本发明进一步涉及一种包括由经MMP14处理的胶原被覆细胞培养容器的工序、或 利用MMP14对被覆在细胞培养容器的胶原进行处理的工序的、被覆了经MMP14处理的胶原 的细胞培养容器的制造方法。处理所用的MMP14可以附着在细胞膜上，也可以从细胞膜游 离。因此，利用MMP14对被覆在细胞培养容器的胶原进行处理的工序包括：在被覆了胶原的 细胞培养容器中培养活化星状细胞等表达MMP14的细胞；或者使被覆在细胞培养容器的胶 原与表达MMP14的细胞的分解物接触。
[0125] [实施例]
[0126] 通过以下的例子对本发明进行更详细的说明，但这些只不过为例示，绝不是用来 限定本发明。
[0127] 例 IVA-Iip siRNA 的调制
[0128] (l)siRNA 的调制
[0129] 以作为胶原（I~IV型）的通用分子伴侣的人HSP47的大鼠同源物、gp46(基因银 行注册号M69246、序列号1)的碱基序列为革E的siRNA(北海道System Science，Sapporo， Japan)的正义链和反义链使用以下的链。
[0130] A :GUUCCACCAUAAGAUGGUAGACAACAG (从gp46的碱基序列上的第757个碱基开始的 正义链siRNA、序列号2)
[0131] B :⑶UGUCUACCAUCUUAUGGUGGAACAU(反义链 siRNA、序列号 3)
[01 32] 作为 siRNArandom(siRNA 随机组，有时也称作 siRNAscramble (siRNA 零乱对照 组）），使用以下者。
[0133] C :CGAUUCGCUAGACCGGCUUCAUUGCAG(正义链 siRNA、序列号 4)
[0134] D :GCAAUGAAGCCGGUCUAGCGAAUCGAU(反义链 siRNA、序列号 5)
[0135] 在有几个实验中，使用了 6'-羧基荧光素（6-FAM)或异硫氰酸荧光素（FITC)结合 在5'末端的正义链。这些序列经确认，在BLAST检索中与已知的其他大鼠 mRNA没有同源 性。
[0136] (2) VA-Iip siRNA 的调制
[0137] 作为阳离子性脂质，从北海道System Science (Sapporo, Japan)购入以4 :3 :3的 摩尔比含有-双十四酰基-Ν_(α-三甲基铵基乙酰基）二乙醇胺氯化物（DC-6-14)、 胆固醇和二油酰基磷脂酰乙醇胺（DOPE)的阳离子性脂质体（Lipotrust)。脂质体在 使用前通过在搅拌条件下在经冷冻干燥的脂质混合物中添加重蒸水（DDW)而调制成 lmM(DC-6-14)的浓度。为了调制VA结合脂质体，将溶解于DMSO的200nmol的维生素 A(视 黄醇、Sigma, USA)与脂质体混悬液（以DC-6-14计为IOOnmol)在I. 5ml管中一边搅拌一 边在25°C下混合。为了调制载持siRNAgp46的VA结合脂质体（VA-lip-siRNAgp46)，将 siRNAgp46溶液（DDW中为580pmol/ μ 1) -边搅拌一边在室温下添加至视黄醇结合脂质体 溶液。siRNA与DC-6-14的摩尔比为I :11. 5,而且，维生素 A、DC-6-14和siRNA的摩尔比 为11. 5 :11. 5 :1。为了获得在体外的使用中理想的用量，用磷酸缓冲生理盐水（PBS)再次 构成 VA-Iip siRNA。
[0138] 例2通讨对肝部分切除大鼠投予VA-Iip siRNAgp46而对肝再牛产牛的影晌
[0139] (1)肝部分切除大鼠的制作和处置
[0140] 肝部分切除大鼠通过将相当于雄性SD大鼠（150~200g) (Slc Japan, Shizuoka, Japan)的整个肝脏的约70%的肝左叶和中叶切除来制作。对该肝部分切 除大鼠，以300 μ 1/次的容量、每隔1天合计5次（即肝部分切除后第1、3、5、7和9天）地 尾静脉投予例 1 中所制作的 VA-Iip siRNAgp46(组 I)、VA_lip siRNAscramble(mock 对照、 组II)、或5%葡萄糖（不含有siRNA的对照、组111)(图Un = 6)。另外，各siRNA是相 对于大鼠体重以0. 75mg/kg使用。
[0141] (2)采集组织的评价
[0142] 在第3次和第5次投予结束的24小时后（即肝部分切除后第5天和第10天），采 集肝部分切除大鼠的肝脏。所采集的肝脏在观察外观、测定重量后，使用OCT复合物进行封 埋，制作冷冻切片。用4%对甲醛（PFA)固定所得的切片，接着用含有5%山羊血清的PBS 实施封闭，用PBS洗涤后，使用Cy3标记抗α平滑肌肌动蛋白（α-SM)抗体（Sigma)、抗 Ki-67抗体（Dako)或抗CD133抗体在4°C下反应一晚。用PBS洗涤后，使用Alexa488标记 山羊抗小鼠抗体（Invitrogen)在室温下反应60分钟。用PBS洗绦后，用ProLongwGold with DAPI(Invitrogen)进行封片，利用荧光显微镜进行观察。而且，所采集的肝冷冻切片 的Tunel染色是使用原位细胞凋亡检测试剂盒（Takara Bio, Japan)按照制造者的指示进 行的。a -SM与Tunel的共染色使用了 FITC-TUNEL抗体和Cy3标记抗a -SM抗体。阳性 细胞数量是算出5个视野（倍率为200倍）的平均值。
[0143] (3)结果
[0144] 图2表示肝部分切除后第5天和第10天采集的各组的肝脏的外观与肝部分切 除前和刚切除后的肝脏的比较。而且，图3表示所采集的各组的肝重量的推移。根据两 图可知，组II和III中肝脏在第5天已恢复切除前的大小和重量，但在投予了 VA-Iip siRNAgp46的组I中，即使在切除后经过10天肝脏的大小和重量也未恢复。
[0145] 接着，利用FITC-TUNEL、a -SMA和DAPI将切除后第5天采集的肝组织进行共染 色，结果可知，在组I中，a -SM阳性细胞中的TUNEL阳性细胞的数量与其他组相比显著增 多（图4和图5)。这种情况表示活化肝星状细胞等a-SM阳性细胞由于VA-Iip siRNAgp46 所导致的gp46的抑制而引起大量凋亡。
[0146] 接着，利用Ki67和DAPI对切除后第5天采集的肝组织进行共染色，结果可知，组 I中的Ki67阳性细胞与同样进行了肝部分切除的其他组（组II和组III)相比显著减少 (图6和图7)。另外，组II和组III中的Ki67阳性细胞的数量与未进行肝部分切除的正 常肝组织相比显著增多，由于Ki67为细胞增殖的标记物，因此表明在肝部分切除后在肝组 织中产生了旺盛的细胞增殖。
[0147] 而且，利用⑶133和DAPI对切除后第5天采集的肝组织进行共染色，结果可知，组 I中的⑶133阳性细胞与同样进行了肝部分切除的其他组（组II和组III)相比显著减少 (图8)。由于⑶133为干细胞标记物，因此所述结果表示干细胞的增殖被VA-Iip siRNAgp46 显著地抑制。
[0148] 综合考虑后，上述各染色结果表示由于a -SMA阳性细胞的凋亡而抑制了肝组织 中包括干细胞的细胞的增殖，反过来说，a -SM阳性细胞对于肝部分切除后指向组织再生 的肝组织中的细胞增殖、尤其是干细胞的增殖是不可或缺的。
[0149] 例3对肝部分切除大鼠投予VA-Iip siRNAgp46的投予时期对肝再牛的影晌
[0150] (1)肝部分切除大鼠的制作和处置
[0151] 以与例2相同的方式制作肝部分切除大鼠。对该肝部分切除大鼠实施以下的处置 (图 9)。
[0152] A组：无处置（无处置对照组）
[0153] B组：5%葡萄糖（溶剂对照组）
[0154] C^Ji:VA-lipsiRNAscramble(mock^tB、^ii)
[0155] 0组：/7\-]^811?敵区卩46(试验组）
[0156] E组：VA-lipsiRNAgp46(延缓投予组）
[0157] (各组均为η = 4)
[0158] VA-lip siRNAgp46 和 VA-lip siRNAscramble 是使用例 1 中所制作者。B ~D 组 是以300 μ 1/次的容量、每隔1天合计6次（即肝部分切除后第0、2、4、6、8和10天）地尾 静脉投予各投予物，E组是合计4次（即肝部分切除后第4、6、8和10天）进行尾静脉投予。 另外，各siRNA是相对于大鼠体重以0. 75mg/kg使用。
[0159] (2)采集组织的评价
[0160] 在第6次（对于E组为第4次）的投予结束的24小时后（即肝部分切除后第11 天），采集肝部分切除大鼠的肝脏。所采集的肝脏在观察外观、测定重量后，使用OCT复合物 进行封埋，制作冷冻切片。用4%对甲醛固定所得的切片，接着用含有5%山羊血清的PBS实 施封闭，用PBS洗涤后，使用Cy3标记抗α平滑肌肌动蛋白（a -SM)抗体（Sigma)在4°C 下反应一晚。用PBS洗绦后，用ProLongwGold with DAPI(Invitrogen)进行封片，利用焚 光显微镜进行观察。
[0161] (3)结果
[0162] 图10和图11分别表示（2)中所采集的各组的肝脏的外观和重量与刚进行肝部分 切除后（第〇天）的肝脏的比较。根据两图可知，在A~C和E组中肝脏恢复切除前的大 小和重量，但在从第〇天起投予VA-lip siRNAgp46的D组中，即使切除后经过11天肝脏的 大小和重量也未恢复。而且，在从第4天起投予相同用量的VA-Iip siRNAgp46的E组中可 见肝脏的大小和重量的恢复，因此可知，VA-Iip siRNAgp46应在组织再生的早期阶段投予。
[0163] 例4肝部分切除后的肝组织中的a -SMA阳件细朐数量的经时夺化
[0164] (1)肝部分切除大鼠的制作和采集组织的评价
[0165] 以与例2相同的方式制作肝部分切除大鼠。在肝部分切除后第0、1、2、3、4、5或6 天从肝部分切除大鼠采集肝脏。使用OCT复合物封埋所采集的肝组织，制作冷冻切片。用 4%对甲醛固定所得的切片，接着用含有5%山羊血清的PBS实施封闭，用PBS洗涤后，使用 Cy3标记抗α平滑肌肌动蛋白（Ct-SM)抗体（Sigma)在4°C下反应一晚。用PBS洗涤后， 用ProLong?Gold with DAPI(Invitrogen)进行封片，利用焚光显微镜进行观察。
[0166] (2)结果
[0167] 根据图12和图13所示的结果可知，a -SM阳性细胞的数量在肝部分切除后第3 天急剧地增加，然后缓慢减少。当考虑到例2~3的结果和星状细胞若活化则会表达a -SM 时，上述结果暗示，在组织再生的早期阶段存在于组织中的星状细胞会活化，从而引起指向 组织再生的细胞增殖。
[0168] 例5星状细朐对干细朐的分化的参与
[0169] (1)细胞的调制
[0170] 作为星状细胞，使用从SD大鼠肝脏采集的肝星状细胞。即，首先向SD大鼠灌 流EGTA溶液和胶原酶溶液后，采集肝脏，将所采集的肝脏切碎后，用细胞筛网（孔径为 100μπι)过滤。在所得的细胞混悬液中添加 HBSS+0.25% BSA(牛血清白蛋白）溶液，在 4°C、500rpm下离心2分钟。采集上清，在4°C、1300rpm下离心5分钟。除去上清后，添加 HBSS+0. 25% BSA溶液，以Nycodenz的浓度达到13. 2%的方式添加28. 7% Nycodenz溶液 (Axis Shield，Oslo，Norway)进行混合。叠置 HBSS+0.25%BSA 溶液后，在 4°C、1400Xg 下离心20分钟。离心结束后，采集中间层，使用DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's mediunO+lO%胎牛血清（FBS)培养基进行培养。将培养第1天的细胞设为静止型肝星状细 胞（qHSC)，而且，在培养第5天进行传代，将接着培养了 2天的细胞设为活性型肝星状细胞 (aHSC)(图 14)。
[0171] 作为干细胞，使用从4周龄的GFP转基因大鼠 （Sic Japan)的肝脏采集的肝干 细胞。首先，向GFP转基因大鼠灌流EGTA溶液和胶原酶溶液后，采集肝脏，将所采集的肝 脏切碎后，用细胞筛网（孔径为100 μm)过滤。在所得的细胞混悬液中添加 Hanks平衡盐 液（HBSS) +0. 25%牛血清白蛋白（BSA)溶液，在4°C、500rpm下离心2分钟。采集上清，在 4°C、1300rpm下离心5分钟。除去上清后，对沉淀添加 MACS? (Magnetic Activating Cell Sorting)缓冲液（Miltenyi Biotec, Auburn, CA, USA)进行混合。对细胞数量进行计数后， 使用FITC结合小鼠抗CD45抗体（BD Pharmingen)、兔多克隆抗CD133抗体（Abeam)和小鼠 单克隆抗EpCAM抗体（Santa Cruz)进行MACS?，采集CD133阳性、EpCAM阳性、CD45阴性 细胞，作为大鼠肝干细胞用于本实验。
[0172] (2)干细胞与星状细胞的接触共培养
[0173] 在放有用I型胶原被覆的盖玻片（IWAKI，Tokyo, Japan)的6孔板中，以5X IO4个/ 孔的密度接种上述（1)中所得的aHSC，在培养箱内在37°C、5% CO2下培养48小时。在aHSC 接种的2天后，以3X IO4个/孔的密度在孔内的aHSC上接种上述⑴所得的肝干细胞，在 培养箱内在37°0、5%〇)2下共培养9天（作为培养基，使用DME/F12(Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient F_12Ham)+10% FBS+ITS(10mg/l 膜岛素、5. 5mg/l 转铁蛋白、 0. 67 μ g/1硒）+0 . 1 μ M地塞米松+IOmM烟碱酰胺+50 μ g/ml β -巯基乙醇+2mM L-谷氨酰 胺+5mM Hepes)。根据条件，在共培养开始时添加20ng/ml的EGF和/或50ng/ml的HGF。 而且，作为对照，在没有aHSC的状态下同样地仅培养肝干细胞。
[0174] 在共培养第9天，用针对作为肝细胞标记物的白蛋白的抗体（兔多克隆、MP Biomedicals)进行免疫染色，使用倒置显微镜（Nikon)以100倍的倍率拍摄GFP/白蛋 白两阳性群落，根据所得的图像对GFP/白蛋白两阳性群落的数量进行计数，并且使用 NIS-Elements software(Nikon)算出面积（图 15 ~18) 〇
[0175] (3)干细胞与星状细胞的非接触共培养
[0176] 在细胞培养小室（孔径为 0.4 μπκ BD Falcon, Franklin Lakes, NJ, USA)上以 5X104个/孔的密度接种上述（I)中所得的aHSC，在培养箱内在37°C、5% CO2下使用 DMEM+10 % FBS培养48小时。在aHSC接种的2天后，在放有用I型胶原被覆的盖玻片 (IWAKI，Tokyo, Japan)的24孔板（BD Falcon)中，以IX IO4个/孔的密度接种上述（1) 中所得的肝干细胞。接着，将包含aHSC的所述细胞培养小室插入至24孔板的孔中，在培 养箱内在37°0、5%〇)2下共培养10天（作为培养基，使用DME/F12(Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient F_12Ham)+10% FBS+ITS(10mg/l 膜岛素、5. 5mg/l 转铁蛋白、 0. 67 μ g/1硒）+0. 1 μ M地塞米松+IOmM烟碱酰胺+50 μ g/ml β -巯基乙醇+2mM L-谷氨酰 胺+5mM Hepes)。而且，作为对照，在没有aHSC的状态下同样地仅培养肝干细胞。
[0177] 在共培养第10天用抗白蛋白抗体（兔多克隆、MP Biomedicals)进行免疫染色， 使用倒置显微镜（Nikon)以100倍的倍率拍摄白蛋白阳性群落，根据所得的图像，使用 NIS-Elements software(Nikon)算出白蛋白阳性群落的面积（图19)。
[0178] 在另外的实验中，在共培养第10天使用Premix WST-lCell Proliferation Assay System(Takara, Tokyo, Japan)，使用酶标仪（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)进 行细胞增殖的测定（图20)。
[0179] (4)结果
[0180] 根据图15~18所示的接触共培养实验的结果可知，通过将肝干细胞与活性型肝 星状细胞共培养，发生了肝干细胞向肝细胞的分化和增殖。而且可知，肝干细胞向肝细胞的 分化和增殖通过添加 EGF和HGF而得到显著地促进。
[0181] 根据图19和图20所示的非接触共培养实验的结果可知，活性型肝星状细胞即使 在不与肝干细胞接触的状态下也可以诱导肝干细胞向肝细胞的分化和增殖。
[0182] 这些结果表示由活性型肝星状细胞分泌的液性因子会诱导肝干细胞向肝细胞的 分化和增殖。
[0183] 例6肝部分切除后的肝组织中的DNA合成的经时夺化
[0184] (I)BrdU阳性细胞的经时变化
[0185] 以与例2相同的方式制作肝部分切除大鼠。为了调查肝部分切除后的肝脏内的 DNA合成的经时变化，以100 μ g/g体重的浓度对大鼠腹腔内注射BrdU。在BrdU投予后第 3小时采集肝脏组织。所采集的肝脏组织用10%福尔马林固定，并进行石蜡包埋。经石蜡 包埋的肝脏组织切成5 μ m厚的切片，使用IOmM柠檬酸缓冲液，在120°C下进行20分钟活化 后，使用5%山羊血清进行封闭。封闭后，使小鼠单克隆抗BrdU抗体（MBL)在37°C下反应 60分钟。用PBS洗绦切片后，使Alexa488标记山羊抗小鼠 IgG(Invitrogen)在37°C下反 应60分钟。用PBS洗涤后，使用包含DAPI的封片剂进行封片，观察肝脏组织内的BrdU的 并入。将结果示于图21。
[0186] 为了测定在大鼠肝部分切除后的肝组织内进行DNA合成的细胞的比例，以 100 μ g/g体重的浓度对实施了肝部分切除的大鼠腹腔内注射BrdU。在BrdU投予后第3小 时，从门静脉灌流0.03%胶原酶溶液后，采集肝脏组织进行切碎而获得细胞混悬液。用包含 0. 25% BSA的Hanks溶液（Invitrogen)，以细胞浓度达到I X IO7个/100 μ 1的方式调整该 细胞混悬液，添加 APC标记小鼠单克隆抗BrdU抗体（BioLegends)，在37°C下反应60分钟。 反应结束后，使用流式细胞仪，测量BrdU阳性细胞数量。将结果示于图22。图中，大鼠肝部 分切除后的肝脏内的BrdU阳性细胞的比例是以将BrdU阳性细胞数量除以用流式细胞仪解 析的全部细胞数量而得到的值来表示。
[0187] 根据图21和图22所示的结果可知，在肝部分切除后，肝组织内的DNA合成呈现二 峰性增加。即，在切除的1天后出现第一个峰值，在2天后稍稳定，但在3天后再次增加，在 4天后以后缓慢降下来。
[0188] (2) BrdU阳性肝细胞的经时变化
[0189] 以与例2相同的方式制作肝部分切除大鼠。为了调查肝部分切除后的肝脏内的肝 细胞中的DNA合成的经时变化，以100 μ g/g体重的浓度对大鼠腹腔内注射BrdU。在BrdU 投予后第3小时采集肝脏组织。所采集的肝脏组织用10%福尔马林固定，并进行石蜡包埋。 经石蜡包埋的肝脏组织切成5 μ m厚的切片，使用IOmM柠檬酸缓冲液，在120°C下进行20 分钟活化后，使用5%山羊血清进行封闭。在封闭后，使APC标记小鼠单克隆抗BrdU抗体 (BioLegends)和山羊抗HNF4a抗体（Santa Cruz)在37°C下反应60分钟。用PBS洗绦切 片后，使Alexa488标记羊抗山羊IgG(Invitrogen)在37°C下反应60分钟。用PBS洗绦后， 使用包含DAPI的封片剂进行封片，观察肝脏组织内的肝细胞的BrdU的并入。将结果示于 图23。
[0190] 为了测定在大鼠肝部分切除后的肝组织内进行DNA合成的肝细胞的比例，以 100 μ g/g体重的浓度对实施了肝部分切除的大鼠腹腔内注射BrdU。在BrdU投予后第3 小时，从门静脉灌流〇. 03%胶原酶溶液后，采集肝脏组织进行切碎而获得细胞混悬液。用 包含0· 25 % BSA的Hanks溶液（Invitrogen)，以细胞浓度达到I X IO7个/100 μ 1的方式 调整该细胞混悬液，添加 APC标记小鼠单克隆抗BrdU抗体（BioLegends)和山羊抗HNF4 α 抗体（Santa Cruz)，在37 °C下反应60分钟。用PBS洗绦后，使Alexa488标记羊抗山羊 IgG(Invitrogen)在37°C下反应60分钟。反应结束后，使用流式细胞仪，测量BrdU阳性 HNF4a阳性细胞数量。将结果表示于图24。图中，大鼠肝部分切除后的肝脏内的BrdU阳 性肝细胞的比例是以将BrdU阳性肝细胞数量除以用流式细胞仪解析的全部肝细胞数量而 得到的值表示。
[0191] 根据图23和图24所示的结果可知，肝细胞的增殖在肝部分切除的1天后出现峰 值后缓慢减少。包含肝细胞的肝脏中所存在的全部细胞的增殖如图21和图22所示，在肝 部分切除的1天后与3天后出现2个峰值，结果认为，1天后的第一个峰是由肝细胞的增殖 为主体引起的，3天后的第2个峰值是由肝细胞以外的细胞、例如干细胞等的增殖引起的。
[0192] 例7星状细朐对肝细朐的增葙的参与
[0193] (1)肝细胞与星状细胞的共培养
[0194] 为了评价星状细胞对肝细胞的增殖的影响，进行肝细胞与星状细胞的共培养。在 60mm培养皿中以IX IO5个的浓度接种例5中所得的aHSC，使用添加了 10% FBS的DMEM， 在37°C、5% CO2下培养24小时。在培养第24小时除去培养基，添加 Opti-MEM I reducing medium(Invitrogen)，在siRNA的转染的准备完成之前进行预培养。以最终浓度达到IOnM 的方式将siRNA与RNAiMX (Invitrogen)混合，在室温下静置15分钟而获得siRNA复合体。 所使用的siRNA如以下所述。
[0195] GFP siRNA(Ambion、Silencer GFP siRNA、Cat. No. AM4626)
[0196] Scramble siRNA :例 I 中所记载者
[0197] gp46siRNA :例1中所记载者
[0198] 在经预培养的aHSC中添加 siRNA复合体，在37°C、5% CO2下培养5小时。在培养 第5小时，将培养基更换为添加了 10% FBS的DMEM，在37°C、5% CO2下培养48小时。在培 养第48小时，除去培养基，添加 Opti-MEM I reducing medium，在siRNA的转染的准备完 成之前进行预培养。以最终浓度达到IOnM的方式将siRNA (GFP siRNA、Scramble siRNA、 gp46siRNA)与RNAiMAX混合，在室温下静置15分钟。在经预培养的aHSC中添加 siRNA复 合体，在37°C、5% CO2下培养5小时。在培养第5小时除去培养基，用PBS洗涤后，使用胰 蛋白酶-EDTA溶液回收HSC。
[0199] 对事先从GFP转基因大鼠肝脏采集、在用胶原I被覆的35mm培养皿中以5X IO4个的浓度接种的肝细胞，以5X104个/培养皿的浓度添加所回收的HSC，在37°C、5% 0)2下 培养48小时。在培养第48小时，将培养基更换为包含IOmM BrdU和10% FBS的DME/F12 培养基，在37°C、5% 0)2下再培养24小时。在培养第24小时除去培养基，用PBS洗涤后， 添加4% PFA，在室温下固定30分钟。在固定后用PBS洗涤，添加包含0.2N HCl和0.1% Triton X-100的PBS进行透过处理。
[0200] (2)焚光显微镜下的观察
[0201] 用PBS将上述（1)中进行了透过处理的细胞洗涤后，用5%山羊血清进行封闭， 添加小鼠单克隆抗BrdU抗体（MBL)和兔多克隆抗GFP抗体（Invitrogen)在37°C下进 行60分钟的一次抗体反应。在一次抗体反应后用PBS洗绦，添加 Alexa488标记山羊抗兔 IgG (Invitrogen)和Alexa555标记山羊抗小鼠 IgG (Invitrogen)，在37°C下进行60分钟的 二次抗体反应。在二次抗体反应后用PBS洗涤，使用包含DAPI的封片剂将细胞进行封片。 将荧光显微镜像示于图25。
[0202] ⑶ FACS 解析
[0203] 为了测定BrdU阳性GFP阳性肝细胞的比例，用PBS将上述（1)中进行了透过处理 的细胞洗涤后，添加 APC标记小鼠单克隆抗BrdU抗体和FITC标记兔多克隆抗GFP抗体，在 37°C下进行60分钟的抗体反应。在抗体反应结束后用PBS洗涤细胞，通过FACS解析测定 BrdU阳性GFP阳性肝细胞的比例。将结果示于图26。BrdU阳性细胞的比例是以将BrdU阳 性细胞数量除以用流式细胞仪解析的全部细胞数量而得到的值表示。
[0204] 根据图25和图26所示的结果可知，将肝细胞与aHSC共培养时，与单独培养肝细 胞时相比，肝细胞的增殖提高，但使gp46siRNA作用于aHSC时，该效果被抑制。这些结果表 示aHSC参与了肝细胞的增殖。
[0205] 例8实施了各种处理的胶原对肝细朐的增葙诰成的影晌 [0206] (1)在实施了各种处理的胶原上的肝细胞的培养
[0207] 以10 μ g/cm2的浓度在60mm培养皿中被覆来自大鼠尾的胶原I (Sigma)。变性胶 原I是将来自大鼠尾的胶原I在60°C下进行30分钟处理，以10 μ g/cm2的浓度被覆在60mm 培养皿中。MMP14处理胶原I是使用包含活性型MMP14(R&D System)的反应液（0.1 μg/ml 膜蛋白酶 3(Recombinant Human Active Trypsin3、R&D systems、Cat. No. 3714_SE)、50mM Tris、0.15M NaCl、10m M CaCl2、5yM ZnCl2、0.05% (v/v)Brij35、pH7.5)、使来自大鼠尾的 胶原I在室温下反应20小时而得到的。在反应结束后，以10 μ g/cm2的浓度在60mm培养 皿中被覆MMP14处理胶原I。肝细胞从大鼠肝脏采集，以2X IO5个/培养皿的浓度接种，在 37°C、5% CO2下培养48小时。在培养第48小时，将培养基更换成包含10 μ M BrdU和10% FBS的DME/F12培养基，在37°C、5% 0)2下再培养24小时。在培养第24小时，除去培养基， 用PBS洗涤后，添加4% PFA，在室温下固定30分钟。在固定后用PBS洗涤，添加包含0. 2N HCl和0· 1% Triton X-100的PBS进行透过处理。
[0208] (2)焚光显微镜下的观察
[0209] 用PBS将上述（1)中进行了透过处理的细胞洗涤后，用5%山羊血清进行封闭， 添加小鼠单克隆抗BrdU抗体（MBL)和兔多克隆抗GFP抗体（Invitrogen)，在37 °C下进 行60分钟的一次抗体反应。在一次抗体反应后用PBS洗绦，添加 Alexa488标记山羊抗兔 IgG (Invitrogen)和Alexa555标记山羊抗小鼠 IgG (Invitrogen)，在37°C下进行60分钟的 二次抗体反应。在二次抗体反应后用PBS洗涤，使用包含DAPI的封片剂将细胞进行封片。 将荧光显微镜像示于图27。
[0210] (3) FACS 解析
[0211] 为了测定BrdU阳性肝细胞的比例，用PBS将上述（1)中进行了透过处理的细胞洗 绦后，添加 APC标记小鼠单克隆抗BrdU抗体，在4°C下进行30分钟的抗体反应。在抗体反 应结束后用PBS将细胞洗涤，通过FACS解析测定BrdU阳性肝细胞的比例。将结果示于图 28。BrdU阳性细胞的比例是以将BrdU阳性细胞数量除以用流式细胞仪解析的全部细胞数 量（3 X IO4个）而得到的值表示。
[0212] 根据图27和图28所示的结果可知，在用变性胶原I和MMP14处理胶原I被覆的 培养皿中，与用未处理的胶原I被覆的培养皿相比，肝细胞的增殖被促进。在HSC中，具有 胶原酶活性的MMP14发生了表达，因此上述结果暗示，作为利用HSC促进肝细胞的增殖的一 个原因，HSC所表达的MMP14对胶原的作用有所参与。
[0213] 例9aHSC中的MMP14的表汰对肝细朐的增葙的影晌
[0214] (1)肝细胞与星状细胞的共培养
[0215] 为了评价星状细胞对肝细胞的增殖的影响，进行了肝细胞与星状细胞的共培养。 在60mm培养皿中以I X IO5个的浓度接种例5中所得的aHSC，使用添加了 10% FBS的DMEM， 在37°C、5% CO2下培养24小时。在培养第24小时除去培养基，添加 Opti-MEM I reducing medium(Invitrogen)，在siRNA的转染准备完成之前进行预培养。以最终浓度达到IOnM的 方式将siRNA与RNAiMX(Invitrogen)混合，在室温下静置15分钟而获得siRNA复合体。 所使用的siRNA如以下所述。
[0216] GFP siRNA(Ambion、Silencer GFP siRNA、Cat. No. AM4626)
[0217] MMPHsiRNA ：
[0218] 正义链：5' -GCUCAUUCAUGGGUAGCGATT-3'（序列号 6)
[0219] 反义链：5' -UCGCUACCCAUGAAUGAGCCT-3'（序列号 7)
[0220] HGF siRNA :
[0221] 正义链：5' -AUAUCUUUCCGGCAAGAAUUUGUGC-3'（序列号 8)
[0222] 反义链：5' -GCACAAAUUCUUGCCGGAAAGAUAU-3'（序列号 9)
[0223] 将siRNA复合体添加至经预培养的aHSC中，在37°C、5% CO2下培养5小时。在 培养第5小时，将培养基更换成添加了 10% FBS的DMEM，在37°C、5% CO2下培养48小时。 在培养第48小时除去培养基，添加 Opti-MEM I reducing medium，在siRNA的转染准备完 成之前进行预培养。以最终浓度达到IOnM的方式将siRNA(GFP siRNA、MMP14siRNA、HGF siRNA)与RNAiMX混合，在室温下静置15分钟。将siRNA复合体添加至经预培养的aHSC 中，在37°C、5% CO2下培养5小时。在培养第5小时除去培养基，用PBS洗涤后，使用胰蛋 白酶-EDTA溶液回收HSC。
[0224] 对事先从GFP转基因大鼠肝脏采集、在用胶原I被覆的35mm培养皿中以5X IO4个的浓度接种的肝细胞，以5X104个/培养皿的浓度添加所回收的HSC，在37°C、5% 0)2下 培养48小时。在培养第48小时，将培养基更换成包含IOmM BrdU和10% FBS的DME/F12 培养基，在37°C、5% 0)2下再培养24小时。在培养第24小时除去培养基，用PBS洗涤后， 添加4% PFA，在室温下固定30分钟。在固定后用PBS洗涤，添加包含0.2N HCl和0.1% Triton X-100的PBS进行透过处理。
[0225] ⑵焚光显微镜下的观察
[0226] 用PBS将上述（1)中进行了透过处理的细胞洗涤后，用5%山羊血清进行封闭， 添加小鼠单克隆抗BrdU抗体（MBL)和兔多克隆抗GFP抗体（Invitrogen)，在37 °C下进 行60分钟的一次抗体反应。在一次抗体反应后用PBS洗绦，添加 Alexa488标记山羊抗兔 IgG (Invitrogen)和Alexa555标记山羊抗小鼠 IgG (Invitrogen)，在37°C下进行60分钟的 二次抗体反应。在二次抗体反应后用PBS洗涤，使用包含DAPI的封片剂将细胞进行封片。 将荧光显微镜像示于图29。
[0227] (3) FACS 解析
[0228] 为了测定BrdU阳性GFP阳性肝细胞的比例，用PBS将上述（1)中进行了透过处理 的细胞洗涤后，添加 APC标记小鼠单克隆抗BrdU抗体和FITC标记兔多克隆抗GFP抗体，在 4°C下进行30分钟的抗体反应。在抗体反应结束后用PBS将细胞进行洗绦，通过FACS解析 测定BrdU阳性GFP阳性肝细胞的比例。将结果示于图30。BrdU阳性细胞的比例是以将 BrdU阳性细胞数量除以用流式细胞仪解析的全部细胞数量而得到的值表示。
[0229] 根据图29和图30所示的结果可知，aHSC所表达的MMP14参与利用aHSC所导致 的肝细胞的增殖促进，其贡献度超过已知作为肝细胞的增殖促进的关键因素的HGF。
[0230] 例10MMP14处理胶原h.的RGD序列对肝细朐的增葙诰成的影晌
[0231] 以2X IO5个/ml的浓度在DME/F12培养基中接种从GFP转基因大鼠肝脏采集 的大鼠肝细胞，添加不同浓度的肽（对照肽（H-Gly-Arg-Gly-Glu-Glu-Ser-〇H、Peptides International、Cat. No. PFA-3907-PI) :500 μ g/ml、GRGDS 肽（肽研宄所、Cat. No. 4189-v): 100 μ g/ml、200 μ g/ml、500 μ g/ml)，在37 °C下反应30分钟。在被覆了经MMP14处理的胶 原I的35mm培养皿中，以5X IO4个/培养皿的浓度接种反应结束后的大鼠肝细胞，在包含 IOmM BrdU和10%胎牛血清的DME/F12培养基中，在37°C、5%C02下培养72小时。在培养 结束后除去培养基，用PBS洗涤后，添加4% PFA，在室温下固定30分钟。在固定后用PBS 洗涤，添加包含0. 2N HCl和0. 1% Triton X-100的PBS进行透过处理。
[0232] 用PBS洗涤后，用5%山羊血清进行封闭，添加小鼠单克隆抗BrdU抗体（MBL)和兔 多克隆抗GFP抗体（Invitrogen)，在37°C下进行60分钟的一次抗体反应。在一次抗体反 应后用PBS洗绦，添加 Alexa488标记山羊抗兔IgG(Invitrogen)和Alexa555标记山羊抗 小鼠 IgG(Invitrogen)，在37°C下进行60分钟的二次抗体反应。在二次抗体反应后用PBS 洗涤，使用包含DAPI的封片剂将细胞进行封片。将荧光显微镜像示于图31。增殖细胞的比 例是以将BrdU阳性细胞数量除以所计数的全部细胞数量而得到的值表示（图32)。
[0233] 根据图31和图32所示的结果可知，RGD序列参与了利用aHSC所导致的肝细胞的 增殖促进。由此暗示，通过aHSC所表达的MMP14的作用而露出的胶原I的RGD序列参与了 肝细胞的增殖促进。
【主权项】
1. 一种用于促进组织再生的组合物，其包含选自由活化星状细胞、活化星状细胞分解 物、MMP14、经MMP14处理的胶原和活化星状细胞分泌物构成的组中的成分。2. 根据权利要求1所述的组合物，其中，组织再生在损害组织或移植组织中发生。3. 根据权利要求2所述的组合物，其是在从受到损害或移植之日起4天以内被投予。4. 根据权利要求2所述的组合物，其是在从受到损害或移植之日起1天以内被投予。5. 根据权利要求2~4中任一项所述的组合物，其中，损害选自由组织破坏、炎症、坏 死、纤维化、手术侵袭、器官衰竭构成的组。6. 根据权利要求1~5中任一项所述的组合物，其中，组织再生伴有组织干细胞的分化 和/或增殖。7. 根据权利要求1~6中任一项所述的组合物，其中，组织再生伴有组织实质细胞的增 殖。8. 根据权利要求1~7中任一项所述的组合物，其中，活化星状细胞被实施了使选自由 HGF、EGF、MMP14构成的组中的蛋白质的表达增大的处置。9. 根据权利要求1~8中任一项所述的组合物，其是针对具有组织再生受到抑制的状 态的对象来使用。10. 根据权利要求9所述的组合物，其中，组织再生受到抑制的状态是选自由炎症、坏 死、纤维化、器官衰竭、血小板数量减少、基因异常、去甲肾上腺素减少构成的组。11. 一种促进对象的组织再生的方法，其包括将权利要求1~10中任一项所述的组合 物投予至需要其的对象的工序。12. -种用于使干细胞分化和/或增殖的组合物，其包含选自由活化星状细胞、活化星 状细胞分解物、MMP14、经MMP14处理的胶原和活化星状细胞分泌物构成的组中的成分。13. -种使组织干细胞分化和/或增殖的方法，其包括使选自由活化星状细胞、活化星 状细胞分解物、MMP14、经MMP14处理的胶原和活化星状细胞分泌物构成的组中的成分与干 细胞接触的工序。14. 一种用于促进细胞增殖的组合物，其包含选自由活化星状细胞、活化星状细胞分解 物、MMP14、经MMP14处理的胶原和活化星状细胞分泌物构成的组中的成分。15. -种使细胞增殖促进的方法，其包括使选自由活化星状细胞、活化星状细胞分解 物、MMP14、经MMP14处理的胶原和活化星状细胞分泌物构成的组中的成分与细胞接触的工 序。16. -种用于抑制细胞增殖的组合物，其包含抑制MMP14的物质。17. 根据权利要求16所述的组合物，其中，抑制MMP14的物质所作用的细胞是CAF和/ 或肿瘤细胞。18. -种细胞培养基材，其包含经MMP14处理的胶原。19. 一种细胞培养容器，其由经MMP14处理的胶原被覆。
【专利摘要】本发明的目的在于提供一种新型的组织再生促进剂和组织再生促进方法。本发明涉及包含选自由活化星状细胞、活化星状细胞分解物、MMP14、经MMP14处理的胶原和活化星状细胞分泌物构成的组中的成分的、用于促进组织再生、促进细胞分化和/或促进细胞增殖的组合物、包含MMP14抑制物质的用于抑制细胞增殖的组合物、及包含经MMP14处理的胶原的细胞培养基材等。
【IPC分类】C12M1/00, A61K38/43, A61K35/12, A61P43/00, A61K35/407, A61K38/17, A61K38/00
【公开号】CN104884072
【申请号】CN201380066850
【发明人】新津洋司郎, 米田明弘
【申请人】日东电工株式会社
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2013年12月20日
【公告号】CA2895483A1, EP2937090A1, US20150297686, WO2014098211A1