利用了hmgb1片段的新型心肌梗塞的治疗方法

利用了hmgb1片段的新型心肌梗塞的治疗方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及含有HMGBl的片段肽的心肌梗塞的新型治疗用药物组合物及其用途。
【背景技术】
[0002] 因冠状动脉的闭塞导致心肌坏死的急性心肌梗塞是预后不良的疾病，是日本作为 第2位死亡原因的心脏病的主要基础疾病。目前的治疗方法即急性期导管插入治疗、冠状 动脉搭桥手术虽然有助于减轻心肌损害、降低死亡率，但存在着因中断的冠脉血流再通时 产生的心肌损害（缺血再灌注损害）等问题，因此期待开发出进一步的治疗方法。
[0003] 近年来，使用了动物模型的基础实验中报告了骨髄间充质干细胞移植通过移植细 胞向心肌构成细胞直接分化引起的心肌再生、产生的细胞因子的旁分泌效应引起的左室重 塑抑制来抑制心肌梗塞的发展，目前进行了各种施用途径下的自体细胞移植的临床试验。 但是，作为自体细胞移植的问题，在细胞采集时对身体的负担、细胞培养中的费用/人手的 问题、细胞移植之前需要时间方面等还有很多今后需要克服的课题。另一方面，近年来确认 了，损伤组织将骨髄多能干细胞动员因子释放到血中、诱导损伤部组织再生的机制。利用了 施用骨髄干细胞诱导因子所引起的生物体内损伤组织再生诱导机制的组织再生是以往没 有的再生医疗的新概念，与使用了干细胞的细胞治疗相比，认为具有不需要人手且能够稳 定供给，并且能够在损伤初期施用的优点。
[0004] 在以前的研宄中，本发明者们鉴定了 HMGBl蛋白是一种新的骨髄多能干细胞动员 因子。并确认了 HMGBl是非组蛋白核蛋白的主要成分，同时从聚集于损伤部位的树状细胞、 吞噬细胞或者坏死细胞被释放到细胞外而与各种疾病的关联。
[0005] 现有技术文献
[0006] 专利文献
[0007] 专利文献 I :W02008/053892
[0008] 专利文献 2 :TO2007/015546
[0009] 专利文献 3 :W02009/133939
[0010] 专利文献 4 :W02009/133940
[0011] 专利文献 5 :W02009/133940
[0012] 专利文献 6 :W02004/004763
[0013] 专利文献 7 :W02002/074337
[0014] 非专利文献
[0015] 非专利文献 I :Bustin 等、Mol Cell Biol、19 :5237-5246、1999 年
[0016] 非专利文献 2 :Hori 等、J. Biol. Chem.、270、25752-25761、1995 年
[0017] 非专利文献 3 :Wang 等、Science、285 :248-251、1999 年
[0018] 非专利文献 4 :Muller 等、EMBO J、20 :4337-4340、2001 年
[0019] 非专利文献 5 :Wang 等、Science、285 :248-251、1999 年
[0020] 非专利文献 6 :Germani 等、J Leukoc Biol.、81 (1) :41-5、2007 年
[0021] 非专利文献 7 :Palumbo 等、J.Cell Biol.、164 :441-449、2004 年
[0022] 非专利文献 8 :Merenmies 等、J. Biol. Chem.、266 :16722-16729、1991 年
[0023] 非专利文献 9 :Wu Y 等、Stem cells、25 :2648-2659、2007 年
[0024] 非专利文献 10 :Tamai 等、Proc Natl Acad Sci U S A.、108(16) :6609-6614、2011 年
[0025] 非专利文献 11 :Yang 等、J Leukoc Biol.、81 (1) :59-66、2007 年

【发明内容】

[0026] 发明所要解决的课题
[0027] 近年来，在脑梗塞等疾病中确认了，存在损伤的组织将骨髄多能干细胞动员因子 释放到血中、由此来诱导该损伤部的组织再生这样的机制，并且该机制有助于防止损伤的 进一步扩大。因此，本发明者们将开发使用了被鉴定为新的骨髄多能干细胞动员因子的 HMGBl蛋白来源的片段肽的心肌梗塞的新型治疗剂作为本发明的课题。
[0028] 用于解决课题的手段
[0029] 本发明者们在心肌梗塞模型中，初次阐明了通过制作具有细胞游走活性的 HMGBl蛋白的片段肽（1-44)、并将该片段肽全身施用，由此能够在梗塞部位及其附近促进 TOGFRa阳性细胞的聚集。此外还清楚了，在该片段肽（1-44)施用组的心肌梗塞动物模型 中，具有改善长期的心脏功能的效果。这些发现启示，利用该片段肽（1-44)，诱导了利用生 物体内的损伤组织再生诱导机制的组织再生，并能够抑制急性心肌梗塞的发展。因此，本发 明的片段肽显示了可制成对预后不良的人急性心肌梗塞有用的治疗剂的可能性。
[0030] 本发明中公开了含有HMGBl的片段肽的心肌梗塞的新型治疗用药物组合物及其 用途。
[0031] 具体而言，本发明者们通过肽合成制作了由HMGBl蛋白的第1~44个氨基酸构成 的肽（序列号3)。将所制作的各HMGBl片段施用给能够评价心肌梗塞的治疗效果的小鼠模 型，从而确认了该片段对心肌梗塞的治疗效果。
[0032] 本申请基于该认识提供以下的发明。
[0033] [1] 一种用于治疗心肌梗塞的药物组合物，其含有HMGBl片段肽。
[0034] [2]根据[1]的药物组合物，其中，所述HMGBl片段肽是包含序列号3的氨基酸序 列的肽。
[0035] [3]根据[1]的药物组合物，其中，所述HMGBl片段肽是由序列号3的氨基酸序列 构成的肽。
[0036] [4] 一种心肌梗塞的治疗方法，其包含施用HMGBl片段肽的工序。
[0037] [5]根据[4]的方法，其中，所述HMGBl片段肽是包含序列号3的氨基酸序列的肽。
[0038] [6]根据[4]的方法，其中，所述HMGBl片段肽是由序列号3的氨基酸序列构成的 肽。
[0039] [7] -种HMGBl片段肽，其用于治疗心肌梗塞。
[0040] [8]根据[7]的HMGBl片段肽，其中，所述HMGBl片段肽是包含序列号3的氨基酸 序列的狀。
[0041] [9]根据[7]的HMGBl片段肽，其中，所述HMGBl片段肽是由序列号3的氨基酸序 列构成的肽。
[0042] [10]HMGB1片段肽在制造用于治疗心肌梗塞的药物中的用途。
[0043] [11]根据[10]的用途，其中，所述HMGBl片段肽是包含序列号3的氨基酸序列的 肽。
[0044] [12]根据[10]的用途，其中，所述HMGBl片段肽是由序列号3的氨基酸序列构成 的肽。
【附图说明】
[0045] 图IA为表示心肌梗塞制作7日后的梗塞部（INFARCT)、边界部（BORDER)、非梗塞 部（REMOTE)的TOGFRa阳性骨髄间充质干细胞数的图。片段肽（1-44)施用组（1-44 ;N = 4)与阴性对照组（对照组；N = 4)相比，TOGFRa阳性骨髄间充质干细胞在梗塞、边界、非 梗塞部的全部区域中显著性地被动员（1-WAY AN0VA，相对于1-44 :*P〈0. 05)。
[0046] 图IB为片段肽（1-44)施用小鼠的边界部处的荧光免疫染色图像。绿色荧光阳性 细胞为GFP阳性的骨髄来源细胞、且红色荧光阳性细胞标记有TOGFR a表达细胞。GFP阳性 且TOGFR a阳性细胞用箭头示出。
[0047] 图IC为表示心肌梗塞制作7、56日后的梗塞部（INFARCT)、边界部（BORDER)、非梗 塞部（REMOTE)的炎症性细胞因子TNFa的mRNA水平的图。片段肽（1-44)施用组（1-44 ; N = 4)与阴性对照组（对照组；N = 4)相比，非梗塞部的炎症性细胞因子（TNF a，IL-I β ) 显著性地为低值（1-WAY ANOVA，1-44相对于对照组：#Ρ〈0. 05)。
[0048] 图ID为表示心肌梗塞制作7、56日后的梗塞部（INFARCT)、边界部（BORDER)、非梗 塞部（REMOTE)的炎症性细胞因子IL-I β的mRNA水平的图。片段肽（1-44)施用组（1-44 ; N = 4)与阴性对照组（对照组；N = 4)相比，非梗塞部的炎症性细胞因子（TNF a，IL-I β ) 显著性地为低值（1-WAY ANOVA，1-44相对于对照组：#Ρ〈0. 05)。
[0049] 图IE为表示心肌梗塞制作56日后的阴性对照组与片段肽（1-44)施用组的左室 射血分数（EF)、左室舒张末期直径（DD)、左室收缩末期直径（DS)的图。
【具体实施方式】
[0050] 本发明提供一种含有具有细胞游走刺激活性的HMGBl片段肽的用于治疗心肌梗 塞的药物组合物。本发明的用于治疗心肌梗塞的药物组合物在本说明书也表述为药物、药 剂或药学组合物。
[0051] 本发明中，细胞游走刺激活性是指刺激细胞游走的活性。本说明书中，细胞游走刺 激活性也表述为细胞游走诱导活性或细胞诱导活性。
[0052] 本发明的药物组合物对施用、添加部位没有限定。即，该组合物施用给需要再生的 心肌梗塞部位、与该梗塞部位不同的部位、血中等的任意部位，均能够发挥其效果。例如，通 过施用、添加该组合物，细胞被动员到施用、添加部位或其附近的部位，诱导或促进损伤的 再生。又例如，通过将该组合物施用、添加到梗塞部位或其附近，细胞被动员到该梗塞部位， 诱导或促进梗塞部位的再生。再例如，通过将该组合物施用、添加到与需要再生的组织不同 的组织，骨髄细胞被从骨髄通过末梢循环动员到需要再生的部位，诱导或促进再生。这里， "末梢循环"也称为"血液循环"、"末梢循环血流"。
[0053] 施用到与需要再生的组织不同的组织是指，施用到除需要再生的部位以外的部位 (与需要再生的部位不同的部位）。因此，"与需要再生的组织不同的组织"也可表述为与需 要再生的组织不同的部位、与需要再生的部位不同的部位、远离需要再生的组织的部位、远 离需要再生的部位的部位、位于需要再生的部位的远端的部位、位于需要再生的组织的远 端的组织、远端部、远端组织。即，本发明的组合物可有效用于使难以从体外直接施用药剂 的组织再生。另外，作为与需要再生的组织不同的组织，可例示出血液组织、肌肉组织、皮下 组织、皮内组织、腹腔等。
[0054] 另外，本发明中，作为被刺激游走的细胞或被从骨髄动员到末梢血中的细胞，可以 列举未分化的细胞、处于各分化阶段的细胞，但不限定于这些。另外，本发明中，作为被刺激 游走的细胞或被从骨髄动员到末梢血中的细胞，可以列举干细胞、非干细胞等，但不限定于 这些。干细胞包括循环性的干细胞或非循环性的干细胞。作为非循环性的干细胞，可以例 示常驻在组织中的组织干细胞。作为循环性的干细胞，可以例示血中循环性的干细胞。
[0055] 另外，作为被刺激游走的细胞或被从骨髄动员到末梢血中的细胞，可以列举骨髄 来源的细胞或造血系干细胞，但不限定于此。本说明书中，"造血系干细胞"为能够分化成 中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞等白细胞、以及 红细胞、血小板、肥大细胞、树突细胞等血细胞系细胞的干细胞，作为标记物，已知对于人而 言为CD34阳性、CD133阳性，对于小鼠而言为CD34阴性、c-Kit阳性、Sca-I阳性、Lineage marker阴性。另外，造血系干细胞的特征在于，在培养皿中培养的情况下，难以单独培养，需 要与基质细胞共培养。
[0056] 本说明书中，"骨髄细胞"是指存在于骨髄内的细胞，另一方面，"骨髄来源的细胞" 是指从骨髄动员到骨髄外的"骨髄细胞"。"骨髄细胞"包括包含存在于骨髄中的组织前体 细胞集团的细胞。另外，"骨髄来源的细胞"可以是包括成血管干细胞（mesoangioblast)的 细胞，也可以是除成血管干细胞以外的细胞。
[0057] 组织前体细胞被定义为具有向血液系以外的特定组织细胞分化的单向分化能力 的未分化细胞，包括具有向上述的间充质系组织、上皮系组织、神经组织、实体器官、血管内 皮分化的能力的未分化细胞。
[0058] "骨髄细胞"、"骨髄来源的细胞"是以造血系干细胞和来源于造血系干细胞的白细 胞、红细胞、血小板、成骨细胞、纤维细胞等分化细胞或者迄今为止被称为骨髄间充质干细 胞或骨髄间质多能干细胞或骨髄多能干细胞的细胞为代表的干细胞。本说明书中，"骨髄干 细胞"是指存在于骨髄内的干细胞，另一方面，"骨髄来源的干细胞"是指从骨髄动员到骨髄 外的"骨髄干细胞"。本发明中，作为被刺激游走的细胞或被从骨髄动员到末梢血中的细胞， 可以列举"骨髄来源的干细胞"，但不限定于此。"骨髄细胞"、"骨髄来源的细胞"可以通过 骨髄采集（骨髄细胞采集）或末梢血采血来分离。造血系干细胞为非贴壁细胞，但"骨髄细 胞"、"骨髄来源的细胞"的一部分通过由骨髄采集（骨髄细胞采集）、末梢血采血得到的血 液中的单核细胞级分细胞培养，能够以贴壁细胞的形式获得。
[0059] 另外，"骨髄细胞"、"骨髄来源的细胞"包括间充质干细胞，优选具有向成骨细胞 (诱导分化时可以通过确认钙的沉积来确定）、软骨细胞（可以通过阿尔新蓝染色阳性、番 红-0染色阳性等来确定）、脂肪细胞（可以通过苏丹III染色阳性来确定）以及成纤维细 胞、平滑肌细胞、基质细胞、腱细胞等间充质系细胞、以及神经细胞、上皮细胞（例如表皮角 化细胞、肠道上皮细胞表达细胞角蛋白家族）、血管内皮细胞分化的能力。分化后的细胞不 限定于上述细胞，也包括向肝脏、肾脏、胰腺等实体器官细胞分化的能力。
[0060] 本说明书中，"骨髄间充质干细胞"、"骨髄间质多能细胞"、或"骨髄多能干细胞"为 存在于骨髄内的细胞，是具有如下特征的细胞：从骨髄中直接采集或从其他组织（血液或 皮肤、脂肪、其他组织）间接地采集，能够作为附着到培养皿（塑料或玻璃制）上的贴壁细 胞进行培养、增殖，且具有向骨、软骨、脂肪等间充质系组织（间充质干细胞）或骨骼肌、心 肌以及神经组织、上皮组织（多能干细胞）分化的能力，并是可以通过骨髄细胞采集而获得 的细胞。
[0061 ] 另外，从骨髄动员到骨髄外的"骨髄来源的骨髄间充质干细胞"、"骨髄来源的骨髄 间质多能细胞"或"骨髄来源的骨髄多能干细胞"是可以通过从梢血采血以及从脂肪等间充 质组织、皮肤等上皮组织、脑等神经组织采集而获得的细胞。
[0062] 另外，这些细胞具有如下特征：通过采集后直接施用或者将暂时附着到培养皿上 的细胞施用到生物体的损伤部，还具有向例如构成皮肤的角化细胞等上皮系组织、构成脑 的神经 系的组织分化的能力。
[0063] 骨髄间充质干细胞、骨髄间质多能干细胞、骨髄多能干细胞、或从骨髄动员到骨髄 外的这些细胞优选除了具有向成骨细胞（诱导分化时可以通过确认钙的沉积来确定）、软 骨细胞（可以通过阿尔新蓝染色阳性、番红-〇染色阳性等来确定）、脂肪细胞（可以通过苏 丹III染色阳性来确定）分化的能力外，还具有例如向成纤维细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细 胞、基质细胞、腱细胞等间充质系细胞、神经细胞、色素细胞、表皮细胞、毛囊细胞（表达细 胞角蛋白家族、毛发角蛋白家族等）、上皮系细胞（例如表皮角化细胞、肠道上皮细胞表达 细胞角蛋白家族）、内皮细胞、以及肝脏、肾脏、胰腺等实体器官细胞分化的能力，但分化后 的细胞并不限定于上述细胞。
[0064] 作为人骨髄细胞、人骨髄来源的细胞，可以例示通过骨髄采集（骨髄细胞采集）、 末梢血采血、脂肪采集而获得、能够通过直接培养或在分离单核细胞级分后进行培养而以 贴壁细胞的形式获得的细胞，但并不限定于此。作为人骨髄细胞、人骨髄来源的细胞的标记 物，可以例示：PDGFRa阳性、Lin阴性、⑶45阴性、⑶44阳性、⑶90阳性、⑶29阳性、Flk-I 阴性、⑶105阳性、⑶73阳性、⑶90阳性、⑶71阳性、Stro-I阳性、⑶106阳性、⑶166阳性、 ⑶31阴性中的全部或一部分，但并不限定于这些。
[0065] 另外，作为小鼠骨髄细胞、小鼠骨髄来源的细胞，可以例示能够通过骨髄采集（骨 髄细胞采集）、末梢血采血、脂肪采集而获得、通过直接培养或在分离单核细胞级分后进行 培养而以贴壁细胞的形式获得的细胞，但并不限定于此。作为小鼠骨髄细胞、小鼠骨髄来源 的细胞的标记物，可以例示：CD44阳性、PDGFR a阳性、PDGFR β阳性、⑶45阴性、Lin阴性、 Sca-I阳性、c-kit阴性、⑶90阳性、⑶29阳性、Flk-I阴性中的全部或一部分，但并不限定 于这些。
[0066] 本发明中，作为被刺激游走的细胞，可以列举TOGFRa阳性细胞，但不限定于此。 另外，对被刺激游走的I3DGFR a阳性细胞没有特别限制，优选为骨髄来源的TOGFR a阳性细 胞。另外，作为除^)6?1?€1以外的标记物，可以例示仰29阳性、〇)44阳性、〇)90阳性、〇)271 阳性、⑶Ilb阴性、Flk-I阴性中的全部或一部分，但并不限定于这些。作为TOGFRa阳性细 胞，可以例示：PDGFRa阳性的骨髄来源的细胞、TOGFRa阳性的骨髄来源的骨髄间充质干 细胞、常驻在roGFR α阳性的组织内的组织细胞（例如可以例示成纤维细胞等）、TOGFR α 阳性的骨髄来源的细胞等能够通过由骨髄采集（骨髄细胞采集）、末梢血采血得到的血液 中的单核细胞级分细胞培养以贴壁细胞的形式得到的细胞等，但并不限定于这些。
[0067] 作为本发明中的HMGBl蛋白，可以例示：作为人来源的HMGBl蛋白的包含序列号1 所示的氨基酸序列的蛋白、作为编码该蛋白的DNA的包含序列号2所示的碱基序列的DNA， 但并不限定于这些。
[0068] 本发明中的"具有细胞游走刺激活性的HMGBl片段肽"是指具有细胞游走刺激活 性的由HMGBl蛋白的一部分构成的肽。本发明的由HMGBl蛋白的一部分构成的片段肽只要 具有细胞游走刺激活性，则没有特别限制，优选为由本发明者们通过实验确认的具有细胞 游走刺激活性的片段中最小的肽片段、即至少包含HMGBl蛋白的第17~25个氨基酸序列 (序列号3)的HMGBl片段肽。
[0069] 本发明中，作为具有细胞游走刺激活性的HMGBl片段肽，可例示出以下的片段，但 并不限定于这些。
[0070] 本发明中，作为具有细胞游走刺激活性的HMGBl片段肽，可列举出包含序列号3的 氨基酸序列的肽，即具有细胞游走刺激活性的HMGBl片段肽。作为这些片段肽，可列举出例 如至少包含HMGBl片段肽（1-44)、且以不包括HMGBl蛋白全长在内的任意HMGBl来源的片 段肽为其上限的肽，但并不限定于这些。
[0071] 本发明中，作为具有细胞游走刺激活性的HMGBl片段肽，可列举出HMGBl片段肽 (1-44)〇
[0072] 本发明的组合物的施用方法可列举出经口施用或非经口施用，作为非经口施用方 法，具体而言，可列举出注射施用、经鼻施用、经肺施用、经皮施用等，但并不限定于这些。作 为注射施用的例子，例如可通过静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等将本发 明的组合物施用到全身或局部（例如皮下、皮内、皮肤表面、眼球或者眼睑结膜、鼻腔粘膜、 口腔内和消化道粘膜、阴道/子宫内粘膜或损伤部位等）。
[0073] 另外，作为本发明的组合物的施用方法，可例示出例如血管内施用（动脉内施用、 静脉内施用等）、血液内施用、肌肉内施用、皮下施用、皮内施用、腹腔内施用，但并不限定于 这些。
[0074] 另外，对施用部位没有限制，可例示出需要再生的组织部位或其附近、与需要再生 的组织不同的部位、或相对于需要再生的组织为远端且不同位置的部位。可列举出例如血 中（动脉内、静脉内等）、肌肉、皮下、皮内、腹腔内，但并不限定于这些。
[0075] 另外，可以根据患者的年龄、症状适当选择施用方法。在施用本发明的肽的情况 下，例如可以在1次施用以每Ikg体重计为〇.〇〇〇〇〇〇Img至1000 mg的范围内选择施用量。 或者，例如可以在每一位患者为〇. 00001至100000mg/b〇dy的范围内选择施用量。在施用 分泌本发明的肽的细胞或插入有编码该肽的DNA的基因治疗用载体的情况下，也可以以使 该肽的量在上述范围内的方式施用。但是，本发明的药物组合物并不限定于这些施用量。
[0076] 本发明的HMGBl片段肽可通过将编码该肽的DNA组入适当的表达体系、制备基因 重组体（recombinant)来得到，或者也可以人工合成。另外，本发明的药物组合物可以按照 常规方法制成制剂（例如 Remington' s Pharmaceutical Science，latest edition，Mark Publishing Company，Easton，U.S.A)，可以同时含有药物上容许的载体、添加物。可以列 举例如：表面活性剂、赋形剂、着色剂、香料、防腐剂、稳定剂、缓冲剂、助悬剂、等渗剂、粘合 剂、崩解剂、润滑剂、流动性促进剂、矫味剂等，但不限定于这些，可以适当使用其他常用的 载体。具体而言，可以列举：轻质硅酸酐、乳糖、微晶纤维素、甘露醇、淀粉、羧甲基纤维素 钙、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯醇缩醛二乙基氨基乙酸酯、 聚乙烯基吡咯烷酮、明胶、中链脂肪酸甘油三酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、白糖、羧甲基纤维 素、玉米淀粉、无机盐类等。
[0077] 另外，本说明书中引用的所有现有技术文献作为参考并入本说明书中。
[0078] 通过以下的实施例对本发明进行进一步例示，但本发明并不限定于下述的实施 例。
[0079] 实施例1
[0080] (目的）
[0081] 使用小鼠急性期心肌梗塞模型、利用心脏生理学/病理组织学/分子生物学的方 法概括性地评价HMGBl蛋白的片段肽（1-44)全身施用所产生的治疗效果。
[0082] (材料和方法）
[0083] 通过从3周龄的小鼠（C57BL6-CAG-GFP转基因小鼠）的大腿/下腿骨采集骨髄 细胞，将骨髄细胞悬浮液尾静脉施用（300ML/小鼠）至放射线照射后（10GY)的6周龄小 鼠（C57BL6)来制作骨髄... 嵌合小鼠。在骨髄移植后60日，在全身麻醉下以仰卧位进行左第 4肋间开胸，将冠状动脉左前降枝近位部结扎，制作宽范围心肌梗塞模型（冠状动脉左前降 枝/回旋枝闭塞模型）。进行HMGBl蛋白的低分子化时，在考虑保持骨髄间充质干细胞动 员活性的基础上，开发了 HMGBl蛋白的片段肽（1-44)。梗塞制作6、24、48、72、96h后从尾 静脉施用5次HMGBl蛋白的片段肽（1-44) 5 μ g/300 μ 1、和PBS 300 μ 1 (阴性对照组）。施 用过量的氯胺酮和赛拉嗪使其安乐死，然后采集心脏。将组织包埋到OTC化合物中，制成厚 度为5 μπι的冷冻切片。使用抗小鼠 F1DGFRa抗体如下进行免疫组织研宄。1次抗体使用 PDGFRa兔抗PDGF受体a抗体（Abeam公司制AB 61219)。2次抗体使用Alexa 555山羊 抗兔抗体（Molecular Probes)、核染色使用4, 6-二氨基-2-苯基吲噪（DAPI，Molecular Probes)。摄影使用共聚焦激光显微鏡（FV300,01ympUS公司制）。对于聚集于组织的骨髄 来源间充质干细胞的数量，测量存在于随机选择的5个切片的整个区域的GFP和TOGFRa 两者为阳性的细胞数，算出平均值。另外，使用RNeasy KiUQiagen公司制），从心肌组织 提取RNA，使用Omniscript Reverse Transcriptase(Qiagen公司制）进行逆转录反应，得 到 cDNA。使用 Gene Amp(R)PCR System 9700(Life Technologies Japan 公司制）、以上 述cDNA为模板进行实时PCR，以与GAPDH的mRNA量之比的方式对TNFa和IL-Ιβ的mRNA 量进行定量。心功能的改善评价通过使用Vivid 7 echocardiography system和12-MHZ transducer (General Electric 公司制）测量 LVDd (Dd :左室舒张末期直径）、LVDs (Ds :左 室收缩末期直径）、LVEF (EF :左室射血分数）来进行。
[0084] 通过HMGBl蛋白的片段肽（1-44)的全身施用，PDGFRa阳性骨髄来源间充质系细 胞在梗塞制作第7日的非梗塞部和边界、梗塞部的全部区域被显著性地动员（非梗塞部： HMGBI蛋白的部分片段（1-44肽），52± 11#* ;阴性对照，32±9CELLS/MM2, N = 4每组，相对 于阴性对照组：#P〈〇. 05)(图1A)。另外，HMGBl蛋白的片段肽（1-44)中，非梗塞部的炎症性 细胞因子（TNFa、IL-Ιβ)显著性地为低值（TNFa 蛋白的片段肽（1-44)，4±2#* ; 阴性对照，11±3 GAPDH ;N = 4每组，相对于阴性对照组：#P〈0. 05)、（IL-1 β 蛋白 的部分片段（1-44肽），2± 1#* ;阴性对照，6± IGAPDH ;N = 4每组，相对于阴性对照组： #P〈0. 05)(图1C，D)。第56日的心脏超声检查结果，HMGBl蛋白的片段肽（1-44)组中，心 肌梗塞后的左室收缩功能损害显著性地被抑制（EF 蛋白的片段肽（1-44) (N = 8)， 26±4#* ;阴性对照组（N = 16)，20±4%，相对于阴性对照组：#P〈0. 05)。另外，HMGBl蛋白 的片段肽（1-44)组中，左室扩大显著性地被抑制（DD 蛋白的片段肽（1-44) (N = 8)， 5. 8±0. 2#*，阴性对照组（N = 16)，6. 3±0. 2MM，相对于阴性对照组：#P〈0. 05)(图1E)。
[0085] 本研宄中证明了，通过HMGBl蛋白的片段肽（1-44)的5日施用，TOGFRa阳性骨 髄间充质干细胞被动员到梗塞制作后急性期（第7日）的梗塞部位及其附近区域（图1A、 B)。特别是显示，通过施用片段肽（1-44)，促进了 TOGFRa阳性间充质干细胞向非梗塞部心 肌组织的动员。骨髄间充质干细胞已知具有炎症抑制作用、组织再生作用，在本实施例中， 还确认了抑制炎症反应的作用（图1C、D)。另外确认了，HMGBl片段肽（1-44)的施用显著 性地抑制了左室收缩功能的恶化、左室扩大和左室重塑，在心肌功能方面也确认了显著的 长期改善效果（图1E)。
[0086] 产业上的可利用性
[0087] 通过本发明，提供了一种用于治疗心肌梗塞的维持了 TOGFRa阳性细胞的动员活 性的HMGBl片段肽的新用途。本发明的HMGBl片段肽包含相对于由全长215个氨基酸构成 的HMGBl蛋白、分子量为约20%的片段肽。这样的片段肽由于能够通过使用了肽合成机的 化学合成来生产，因此在将肽制造成药品的情况下，可期待精制纯度的提高、稳定生产、成 本降低。
[0088] 另外已知，全长的HMGBl具有与作为内毒素之一的LPS (脂多糖）结合的活性，当 药品中即使少量混入LPS时，也会引起发热等，并常常与严重的副作用相关联，因此严格限 制LPS在药品中的混入。HMGBl由于与LPS具有亲和性，因此难以将药品中混入的LPS完全 除去。但是通过肽化会与LPS的亲和性降低，因此预计药品中LPS的混入也减少。因此，通 过使用本发明中确定的包含I3DGFRa阳性细胞动员部分的HMGBl片段，能够开发出更安全 的心肌梗塞治疗用药物组合物。
[0089] 通过将本发明的HMGBl片段肽直接施用到需要再生的心肌梗塞部位或其附近部 位，能够诱导或促进该梗塞或由该梗塞导致的组织损伤的再生。此外，在静脉内施用等的方 法中，通过将本发明的HMGBl片段肽施用到与需要再生的部位不同的部位，还能够诱导或 促进心肌梗塞的再生。如此，本发明中，能够通过在一般诊疗中广泛施行的静脉施用进行心 肌梗塞的治疗，因此能够将治疗剂以任意的次数、任意的浓度安全且简便地进行施用。与以 往的治疗方法相比，该情况是本申请发明极其优异的方面之一。
[0090] 另外，在目前的再生医疗或细胞治疗的现场，在生物体外培养患者来源的稀少的 骨髄多能干细胞、在使其增殖后用于治疗，但该培养过程有伴随着细胞劣化（癌化或细菌、 病毒等的污染）的危险，因此需要充分的安全管理。与此相对，基于本发明的治疗剂由于不 包含将细胞取出到体外的工序、或增加人工操作的工序，因此考虑安全性较高。与以往的治 疗方法相比，该情况也是本申请发明优异的方面之一。
【主权项】
1. 一种用于治疗心肌梗塞的药物组合物，其含有HMGBl片段肽。2. 根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述HMGBl片段肽是包含序列号3所示的 氨基酸序列的肽。3. 根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述HMGBl片段肽是由序列号3所示的氨 基酸序列构成的肽。
【专利摘要】本发明合成了由HMGB1蛋白的一部分构成的具有适当长度的片段肽，并确认了该肽显示心肌梗塞治疗效果。
【IPC分类】C07K14/52, A61K38/16, A61P9/10
【公开号】CN104884076
【申请号】CN201380067948
【发明人】玉井克人, 镰田创吉, 金田安史, 宫川繁, 泽芳树, 山崎尊彦
【申请人】吉诺米克斯股份有限公司, 国立大学法人大阪大学
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2013年10月24日
【公告号】CA2889275A1, EP2913058A1, US20150273017, WO2014065347A1