治疗糖尿病患者心力衰竭的组份和方法

治疗糖尿病患者心力衰竭的组份和方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及纽兰格林蛋白在制备用于预防、治疗或延缓人类心力衰竭的药物中的 应用，以及所述用于预防、治疗或延缓人类心力衰竭的药物的使用方法。特别地，本发明提 供了预防、治疗或延缓糖尿病患者心力衰竭的方法，该方法是对患有心脏并发症或有心脏 并发症高风险的糖尿病患者使用包含纽兰格林蛋白的药物。
[0002] 发明背景
[0003] 近年来，糖尿病特别是2型糖尿病的患病率显著升高。最新数据显示，如果没有采 取紧急行动，预计2030年，糖尿病患者的数量有望从2011年的3. 66亿上升至5. 52亿。糖 尿病患者发病率和死亡率的主要原因是心脏并发症或心血管疾病，特别是冠心病，占2型 糖尿病病人死亡数的75%。糖尿病患者最常见的心脏症状为冠心病，而冠心病易发展为心 力衰竭，因此糖尿病也同样表现出与心力衰竭有密切关联。大约15 - 25%的心衰病人为糖 尿病患者。因此很多糖尿病患者患有心脏并发症尤其是心衰。
[0004] 糖尿病与心脏并发症特别是心力衰竭有关，可能基于以下机制：由于相关的合并 症，通过易变异的冠状动脉粥样硬化的发展，钙处理受损或通过一种特定的糖尿病心肌病 等。
[0005] 相关的合并症或危险因素可能会在一定程度上导致糖尿病病人患心衰的风险增 加。这些心脏危险因素如血脂异常、高血压、血凝过快、肥胖、炎症等是胰岛素耐受性综合征 的一部分，并且至少一定程度上由核过氧化物酶增殖激活受体（PPARs)所调控。激活PPAR- γ能够提高胰岛素敏感度和内皮功能，减轻炎症，降低血压。根据美国费明翰的群组研宄， 糖尿病患者相比非糖尿病人，血压更高，更加肥胖。据报道，在心衰患者中也有同样的观察 结果。
[0006] 糖尿病病人患动脉粥样硬化风险增加也可能导致心衰风险的增加。糖尿病与冠状 动脉疾病风险的显著增加有关，而冠状动脉疾病是导致心衰的根本原因。高血糖症引起血 管组织内的显著变化，可能加速动脉粥样硬化的形成。
[0007] 糖尿病患者中发现了孤立的舒张期功能障碍的高发率。这可能是由于糖尿病患者 钙处理损伤所致。在一个糖尿病的慢性模型中，心肌细胞舒张期肌浆网Ca2+重吸收受到抑 制，这与动作电位的延长、细胞水平的后去极化和器官水平受损的心室舒张有关。这些肌浆 网Ca2+重吸收受损的机制似乎是孤立的亚临床舒张期功能障碍的原因，而该早期病理学事 件可能发展为舒张性心力衰竭。
[0008] 有数据表明一种特定的糖尿病心肌症也会导致糖尿病易发展为心衰。糖尿病可能 引起心衰而不依赖于心外膜冠状动脉疾病的准确机制尚未明确，但是已发展了一些假说， 包括微血管病，新陈代谢因素，纤维化等。
[0009] 另外，肾素-血管紧张素系统不受糖尿病的调控，血管紧张素 II可能导致局部氧 化性损伤，启动心肌细胞死亡。糖尿病的特征是肌细胞、内皮细胞、纤维母细胞的凋亡各呈 85倍、61倍、26倍的增长。并且，糖尿病和高血压使肌细胞和内皮细胞的坏死增加。肌细胞 的凋亡和坏死可能引起肥大肌病的发展，最终导致心衰。
[0010] 一种有前景的疗法涉及对患有或有心脏并发症（尤其是心衰）高风险的患者施用 纽兰格林蛋白（下文称为NRG)。纽兰格林能够预防、治疗或延迟糖尿病患者的心脏并发症， 这是通过其改善心肌结构、提高心肌细胞存活、促进钙稳态、抗动脉粥样硬化等功能来实现 的（糖尿病患者的这些功能已有损伤）。
[0011] NRGs属于表皮生长因子样（EGF-Iike)家族，是一类结构上相似的生长分化因子， 包括NRG1、NRG2、NRG3和NRG4及其异构体。NRGs涉及一系列生物学反应：刺激乳腺癌细胞 分化和分泌乳汁蛋白；诱导神经嵴细胞分化成Schwann细胞；刺激骨骼肌细胞合成乙酰胆 碱受体；并且促进心肌细胞存活和DNA合成。用纽兰格林基因严重缺陷的纯合子小鼠胚胎 做活体研宄证明纽兰格林对于心脏和神经发育是必须的。
[0012] NRGs与EFG受体家族的成员结合，该受体家族包括EGFR、ErbB2、ErbB3和ErbB4， 其中每一个受体在多种细胞功能中都发挥重要的作用，包括细胞生长、分化和存活。它们都 是蛋白酪氨酸激酶受体，由一个胞外配体结合域、跨膜激酶域和胞浆的酪氨酸激酶结构域 组成。NRG结合至ErbB3或ErbB4的细胞外结构域后，能够诱导构象改变从而引起ErbB3、 ErbB4和ErbB2之间形成异二聚体，或者ErbB4自身形成同源二聚体，这样就会导致受体细 胞内C -末端结构域的磷酸化。然后磷酸化的胞内结构域与细胞内其他的信号蛋白结合，活 化相应的下游AKT或ERK信号传导途径，并诱导一系列的细胞反应，比如刺激或抑制细胞增 殖、细胞分化、细胞凋亡、细胞迀移或细胞粘附。在这些受体中，ErbB2和ErbB4主要在心脏 表达。
[0013] 已有研宄表明NRG - 1的EGF类似区，约50至64个氨基酸，足以结合并活化这些 受体。以前的研宄表明纽兰格林-1 β (NRG - 1 β )能以高亲和力直接结合ErbB3和ErbB4。 孤儿受体ErbB2能与ErbB3或ErbB4形成异源二聚体并且其亲和力比ErbB3或ErbB4同源 二聚体要高。神经发育的研宄结果提示交感神经系统的形成需要完整的NRG - 1 β、ErbB2 和ErbB3信号传导系统。靶向破坏NRG - 1 β、或ErbB2或ErbB4后由于心脏发育缺陷而导 致胚胎致死。最近的研宄也突显了 NRG - 1 β、ErbB2和ErbB4在心血管发育以及维持成年 正常心脏功能方面具有重要作用。研宄表明NRG- 1β能增强成年心肌细胞的肌小节的组 织结构。施用一种重组的NRG -1 β EGF类似区能显著改善或防止不同心衰动物模型的心肌 功能的恶化，而且在临床试验中也有同样效果。这些效应使得NRG -1有望成为一种治疗心 衰的先导化合物。本发明提供了更多证据证明NRG - 1治疗能为患有或有心脏并发症高风 险的糖尿病人提供更多预防或治疗的益处。
[0014] 发明概述
[0015] 在纽兰格林治疗人心力衰竭的临床试验中，发明人发现心衰同时患糖尿病的患者 经纽兰格林治疗后将获得更显著的疗效。该疗效包括死亡率显著降低。
[0016] 发明人已经发现NRG能够增强心肌细胞分化、肌小节和细胞骨架结构组建和细胞 粘附。在不同的心衰动物模型和临床试验中，发明人也发现NRG能够显著提高或防御心肌 功能的退化。纽兰格林能够有效改善心肌结构、提高心肌细胞存活、促进钙稳态和抗动脉粥 样硬化（糖尿病患者的这些功能已有损伤）。本发明的保护范围包括纽兰格林蛋白，纽兰格 林多肽，纽兰格林衍生物或具有纽兰格林类似活性的组合物。
[0017] 因此，本发明的一方面，提供了一种预防、治疗或延迟糖尿病患者心脏并发症的方 法，该方法包括为患者施用一种包含有效剂量纽兰格林的药物组合物。在一些实施例中，心 脏并发症是心衰。在一些实施例中，药物组合物通过静脉注射或皮下注射施用于患者。在 一些实施例中，药物组分通过导入疗程施用于患者。在一些优选的实施例中，导入疗程给药 方案包括施用药物组合物至少持续3, 5, 7或10天。在一些优选的实施例中，导入疗程给药 方案结束后，在维持疗程施用该药物组分至少6个月。在一些优选的实施例中，维持疗程给 药方案包括每3, 5, 7或10天施用该药物组分。
[0018] 本发明的另一方面，本发明提供了一种预防、治疗或延迟心力衰竭方法，该方法包 括为患者施用一种包含有效剂量纽兰格林的药物组合物。在一些实施例中，患者是糖尿病 病人。在一些实施例中，药物组合物通过静脉注射或皮下注射施用于患者。在一些实施例 中，药物组分通过导入疗程施用于患者。在一些优选的实施例中，导入疗程给药方案包括施 用药物组合物至少持续3, 5, 7或10天。在一些优选的实施例中，导入疗程给药方案结束后， 在维持疗程施用该药物组分至少6个月。在一些优选的实施例中，维持疗程给药方案包括 每3, 5, 7或10天施用该药物组分。
[0019] 本发明的另一方面，提供了一种包含有效剂量纽兰格林的药物组合物，该组合物 能够预防、治疗或延迟糖尿病患者的心脏并发症。在一些实施例中，心脏并发症是心力衰 竭。在一些实施例中，疗效是死亡率显著下降。在一些实施例中，疗效是再入院治疗显著减 少。在一些实施例中，疗效是表征慢性心力衰竭改善的生物标记物水平改善。在一些实施 例中，心脏并发症是心力衰竭。
[0020] 本发明的另一方面，提供了一种组合，该组合包含有效剂量的纽兰格林和有效剂 量的预防或治疗糖尿病的药剂。
[0021] 本发明的另一方面，提供了一种提高慢性心衰病人存活率或减少死亡率的方法， 包括为慢性心衰病人施用包含有效剂量纽兰格林的药物组合物。在某个实施例中，慢性心 衰患者是糖尿病病人。在一些实施例中，药物组合物通过静脉注射或皮下注射施用于患者。 在一些实施例中，药物组分通过导入疗程施用于患者。在一些优选的实施例中，导入疗程给 药方案包括施用药物组合物至少持续3, 5, 7或10天。在一些优选的实施例中，导入疗程给 药方案结束后，在维持疗程施用该药物组分至少6个月。在一些优选的实施例中，维持疗程 给药方案包括每3, 5, 7或10天施用该药物组分。
[0022] 本发明的另一方面，提供了纽兰格林蛋白在药物制备方面的应用。该药物能使慢 性心衰病人长期受益。在一些实施例中，慢性心衰病人是糖尿病患者。在一些实施例中，长 期受益是提高生存率。在一些实施例中，在一些实施例中，长期受益是减少再入院治疗。在 一些实施例中，疗效是表征慢性心力衰竭长期预后的生物标记物水平改善。
[0023] 发明详述
[0024] 为了充分公开而不是为了限定，此后的详述部分分为若干部分。所有在此提到的 公开出版物通过引用完整的整合在此，公开和描述该出版物中引用的方法和/或材料。
[0025] 定义
[0026] 除另有定义，这里使用的所有科技术语与本发明所属技术领域的普通技术人员理 解含义相同。所有专利文献、专利申请文献、公开的专利文献和其它出版物均作为参考。如 本节阐述的定义与上述参考文献所述的定义不一致或相反时，以本节阐述的定义为准。
[0027] 除非在上下文中明确表明，否则此处所用的单数形式"一个"、"一种"和"该"与"至 少一个"或"一个或多余一个"意思相同。
[0028] 此处所用"神经调节蛋白"或"neuregulin"或"NRG"是指能够结合并激活ErbB2、 ErbB3、ErbB4或其异源或同源二聚体的蛋白或多肽，包括 但不限于所用神经调节蛋白的异 构体、神经调节蛋白的EGF类似区、包含神经调节蛋白EGF类似区的多肽、神经调节蛋白的 突变体或衍生物以及其它能够激活上述受体（下文将具体描述）的神经调节蛋白样的基因 产物。神经调节蛋白还包括NRG-1，NRG-2, NRG-3和NRG-4蛋白、多肽、片段以及具有NRG 样功能的复合物。本发明所用神经调节蛋白可以激活上述ErbB受体并调节它们的生物学 功能，比如刺激骨骼肌细胞合成乙酰胆碱受体；促进心肌细胞的分化、存活以及DNA合成。 神经调节蛋白还包括那些具有并不实质性影响生物学功能的保守氨基酸置换的神经调节 蛋白突变体。本技术领域中普通技术人员熟知，非关键区域的单个氨基酸的突变一般不会 引起该蛋白或多肽的生物学功能的改变（参见Watson等人，Molecular Biology of the Gene，4th Edition，1987，The Bejacmin/Cummings Pub.co.，p.224)。优选的，神经调节蛋白 是可以结合并激活ErbB2/ErbB4或ErbB2/ErbB3异源二聚体的蛋白或多肽。作为例子，但并 非为了限制的目的，本发明的神经调节蛋白是NRG-I β 2异构体的一个片段，包含177-237 位氨基酸片段，该片段的氨基酸序列为：
[0029] SHLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCPNEFTCDRCQNYVMASFYKAEELYQ(SEQ ID NO: 1)。这些包括NRG-I β 2异构体177-237位氨基酸片段的多肽包含EGF类似区，该区已 被证明足以结合并活化受体。
[0030] 此处所用"表皮生长因子样功能域"或"EGF样类似区"或"EGF样功能域"是 指由neuregulin基因所编码的可以结合并激活ErbB2、ErbB3、ErbB4或其异源或同 源二聚体的多肽片段，并且与下述参考文献中描述的EGF受体结合区域具有结构相似 性：WO 00/64400 ;Holmes 等，Science, 256:1205-1210 (1992);美国专利 5, 530, 109 和 5, 716, 930 ;Hijazi 等，Int. J. Oncol. ,13:1061-1067 (1998) ;Chang 等，Nature， 387:509-512 (1997) ;Carraway 等，Nature，387:512_516 (1997) ;Higashiyama 等， J.Biochem. ,122:675-680(1997);以及 WO 97/09425。在某些实施方案中，EGF 类似区结 合并激活ErbB2/ErbB4或ErbB2/ErbB3异源二聚体。在某些实施方案中，EGF类似区包含 NRG-I的受体结合区氨基酸。在某些实施方案中，EGF类似区是指NRG-I的第177-226位、 177-237位或177-240位氨基酸。在某些实施方案中，EGF类似区包含NRG-2的受体结合区 氨基酸。在某些实施方案中，EGF类似区包含NRG-3的受体结合区氨基酸。在某些实施方 案中，EGF类似区包含NRG-4的受体结合区氨基酸。在某些实施方案中，EGF类似区包含美 国专利 5, 834, 229 中描述的氛基酸序列：Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro。
[0031] 纽兰格林蛋白的剂型、剂量和给药途径、更好的药物组合物形式，能够根 据本领域已知的方法来确定（参见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro (Editor)Mack Publishing Company, 1997.4 ； Therapeutic Peptides and Proteins: Formulation, Processing, and Delivery Systems, Banga,1999 ；Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, Hovgaard and Frkjr(Ed. ), Taylor&Francis, Inc. , 2000 ；Medical Applications of Liposomes, Lasic and Papahadjopoulos(Ed. ), Elsevier Science, 1998 ；Textbook of Gene Therapy,Jain, Hogrefe&Huber Publishers, 1998 ；Adenoviruses: Basic Biology to Gene Therapy, Vol. 15, Seth, Landes Bioscience, 1999 ；Biopharmaceutical Drug Design and Development, Wu-Pong 和 Rojanasakul(Ed. ), Humana Press,1999 ； Therapeutic Angiogenesis:From Basic Science to the Clinic, Vol. 28,Dole 等 (Ed.), Springer-Verlag New York, 1999)〇
[0032] 纽兰格林蛋白，可被制成口服给药、直肠给药、局部给药、吸入给药、口腔给药（如 舌下给药）、非肠道给药（如皮下注射、肌肉注射、皮内注射或静脉注射）、经皮给药或者其 他合适的给药方式的剂型。在所有给药方式中，最合适的给药途径取决于治疗状况的性质 和严重程度，以及所使用特殊纽兰格林蛋白的性质。纽兰格林蛋白可以单独给药。或者更 适宜的，纽兰格林蛋白可以与一些药物可接受的载体或赋形剂共同给药。任何适宜的药物 可接受载体或赋形剂能够用于目前的方法（参见如Remington:The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro(Editor)Mack Publishing Company, April 1997)。
[0033] 根据本发明，单独的纽兰格林蛋白或其与其他介质、载体、赋形剂结合所制成的不 同制剂，适用于各种适当的给药途径，例如海绵窦内注射，皮下注射，静脉注射，肌肉注射， 皮内注射，口服或口腔给药。方法可采用单位剂型的注射剂，装在安瓶或多剂量容器中，添 加防腐剂。剂型可采用混悬液、溶液、在水或油介质中的乳剂，并且可包含悬浮剂、稳定剂和 /或分散剂。或者，活性成分可以为粉末状，在使用前用一种合适的介质，如无菌无热源水或 其他溶剂溶解。本发明中局部给药可以制成泡沫，凝胶，药膏，透皮贴剂或糊剂等。
[0034] 本发明所采用的药物可接受组分和相应的给药方式包括但不限于美国专利 5, 736, 154 ;6, 197, 801B1 ;5, 741，511 ;5, 886, 039 ;5, 941，868 ;6, 258, 374B1 ;和 5, 686, 102 所公布的内容。
[0035] 用于治疗或预防的药物剂量大小会由于患者的严重程度和给药途径的不同而不 同。给药剂量，或给药频率，也因每个病人的年龄、体重、条件和反应不同而不同。
[0036] 需要注意的是，主治医生应该知道如何及何时根据毒性或不良反应去终止、中断 或调整治疗剂量至低剂量。相反的，如果临床反应不足（排除毒副作用），医生也应该知道 如何及何时去调整治疗至高水平。
[0037] 任何适合的给药途径都能够被使用。剂型包括片剂，锭剂，扁囊剂，分散剂，混悬 剂，溶液，胶囊，贴剂等等，参见《Remington' s Pharmaceutical Sciences》。在实际应用 中，单独的纽兰格林蛋白作为活性物质或其与其他药物载体、赋形剂，如β -环糊精，2-羟 基-丙基-β -环糊精，按照常见的药物配制技术组合成混合物。根据给药途径不同，局部 给药或非胃肠道用药，所需要的载体形式也不同。在制备非胃肠道给药剂型中，如静脉注射 或灌注，可采用本领域技术人员所熟知的药物媒介，如水，乙二醇，油，缓冲液，糖，防腐剂， 脂质体等。类似的非胃肠道组分包括，但不限于5% w/v葡萄糖，生理盐水或其他溶液。单 独的纽兰格林蛋白，或其与其他物质形成的组合物，被制成静脉注射液盛于药瓶中，容量范 围从Iml到2000ml不等。稀释液的容量将根据给药的总剂量不同而不用。
[0038] 本发明也提供了一种药盒来实施本发明的给药方案。这种药盒包括一个或多个含 有效治疗剂量纽兰格林蛋白的容器，其中所含蛋白可为单独的纽兰格林蛋白，或与其他药 物可接受物质形成组合物。优选的药物形式可与无菌生理盐水、葡萄糖溶液、缓冲溶液或其 他药物可接受的无菌溶液结合。作为一种选择，组合物可被冻干或干燥。在这种情况下，药 盒可视情况进一步包含一种药物可接受的溶液，最好为无菌溶液，当需要注射时，与组合物 配成溶液。典型的药物可接受溶液是生理盐水和葡萄糖溶液。
[0039] 在另一个实施例中，本发明的药盒进一步包括一个针头或注射器，其最好为无菌 包装，用于注射，和/或有一个包装好的酒精棉块。说明书可视情况包括医生或病人使用该 药物组份的方法。
[0040] 此处所用的"治疗"或"处理"是指可以使不适、紊乱或疾病的症状改善或向好的 方向改变的任何方式。其效果可以是预防性的，完全或部分防止某一疾病或其症状发生，也 可以是治疗性的，部分或完全治愈某一疾病和/或该疾病引起的不利影响。治疗还包括此 处所述组合物的任何药物用途。
[0041] 此处所用"心力衰竭"是指一种心脏功能的异常，在这种情况下，心脏不能按照组 织代谢的需要进行供血。心力衰竭包括多种疾病状态比如充血性心力衰竭，心肌梗死，心律 失常，家族性肥厚性心肌病，缺血性心脏病，特发性心肌病和心肌炎等之类的。心力衰竭可 由多种因素导致，包括但不限于缺血性，先天性，风湿性，病毒性、毒性或特发性心力衰竭。 慢性心脏肥大是一种显著的充血性心力衰竭前期的疾病状态，其可以引起心脏停搏。
[0042] 除上下文另有说明，此处所用"蛋白"与"多肽"、"肽段"含义一致。
[0043] 除上下文另有说明，此处所用"血浆"与"血清"含义一致。
[0044] 此处所用"长期疗效"是指短期内可能无法观察到的由治疗或干预所引起的疗效。 对于慢性心力衰竭患者而言，长期疗效可能是提高生存率，减少入院再治疗率，或是表征长 期预后的生物 标记物改善。在一些实施例中，观察疗效的时间期限约为6个月。在一些实 施例中，观察疗效的时间期限约为1年。在一些实施例中，观察疗效的时间期限约为2年。 在其他的实施例中，观察疗效的时间期限约为3年，5年，10年或更长。
[0045] 此处所用"存活"是指机体保持活力或生存的时间或几率，可以用生存时间或生存 率来表达。生存时间是指从诊断或治疗开始到生命结束的时间期限。生存率是指在诊断或 治疗的一段时间期限内存活下来的患者百分比。对于单个个体来说，经治疗或干预后延长 生存时间可被视为疗效。对于一组个体或大量人群来说，延长平均生存时间或提高生存率 被视为疗效。
[0046] 此处所用"再入院治疗"是指在一定时期内病人需要去医院治疗的次数或频率。入 院可能是由各种条件引起的，或者仅由正在治疗中的同样条件引起的。对于每个个体来说， 在一定时期内减少再入院治疗的次数可被认为是疗效。对于一组个体或大量人群来说，减 少再入院治疗的总次数或平均时间被视为疗效。
[0047] 在疑似或确定心衰的日常处理中，测定BNP和NT-proBNT的血浆水平是非常有前 景的手段。大多数有关BNP和NT-proBNP在临床上的应用提出了它们的诊断特性，并有越 来越多的证据可以支持BNP和NT-proBNP的预后价值。由于NT-proBNP在血液中的半衰期 是BNP的6倍，所以它是使用更广泛的心衰诊断或预后指标。血浆中的NT-proBNP水平可 以由商业化药盒分析。为了举例说明而非限制，商业化药盒来自Roche或Biomedica公司。 在本发明的例子中，NT-proBNP水平是由Biomedica公司（奥地利）的药盒检测的。
[0048] BNP和NT-proBNP在血浆中的水平都可以用作筛选、诊断心衰，并且对建立心衰的 预后非常有用，这是由于这两种标记物在病情恶化的患者身上典型升高。并且，本发明发现 BNP或NT-proBNP水平可以指示适合用纽兰格林治疗心衰的患者。事实上，任何心衰的诊断 或预后标记物都可以用于确定患者是否适合用纽兰格林治疗。关于筛选能通过纽兰格林治 疗获得显著治疗效果的患者的方法，本发明所指认的NT-proBNP的血浆水平是作为指导而 非限定。例如，血浆水平为5000fmol/ml的心衰患者经纽兰格林治疗后能取得疗效，但是其 中的一些病人所取得的疗效并不是很显著。
[0049] 此处所用"活性单位"或"EU"或"U"是指能诱导50%最大活性反应的标准产品的 用量。换句话说，为了测定某一活性制剂的活性单位，必须测定EC50。例如，如果某一产品 的EC50是0. 1 μ g，则这个量就是1个单位。进一步讲，如果使用了 1 μ g该产品，就是使用 了 10EU(l/0. 1)。可以用本领域已知的任何方法来测定EC50,包括下面的实施例中发明人 所使用的方法。活性单位的测定对于基因工程产品和临床使用药物的质量控制是重要的， 这样可以使不同药品和/或不同批次的产品以同样的标准来定量。
[0050] 以下简要描述本发明中所采用的一种快速、敏感、高通量并定量的检测NRG-I 生物活性的方法，其主要利用NRG可以结合并激活细胞表面的ErbB3和ErbB4受体， 并间接导致ErbB2受体磷酸化的特性（参见Michael D. Sadick等，1996, Analytical Biochemistry, 235:207-214 以及 W003/099300)。
[0051] 简而言之，该方法名为激酶受体活化酶联免疫吸附试验（kinase receptor activation enzyme-linked immunosorbant assay，KIRA-ELISA)，其主要包括两块分开的 微孔板。其中一块微孔板进行细胞培养、配体刺激、细胞裂解和受体溶解。而另一微孔板则 进行受体捕获和磷酸化ELISA检测。该方法用于检测NRG蛋白诱导的贴壁的乳腺癌细胞系 MCF-7的ErbB2受体活化水平。用Triton-XlOO裂解液来溶解膜蛋白，其中游离的ErbB2受 体被包被在ELISA孔中的与ErbB3或ErbB4无交叉反应的ErbB2特异性抗体捕获，并通过 抗磷酸酪氨酸ELISA检测所捕获的ErbB2受体的磷酸化水平。制出有重复性的标准曲线， heregulin^ 1(177-244)的EC50值大约为360pM。当相同的样品分别用KIRA-ELISA法和 定量的抗磷酸酪氨酸Western Blot法检测ErbB2受体的磷酸化水平时，可以发现这两种方 法所测的结果具有非常紧密的关联性。此处所描述的分析方法可具体地量化ErbB2酪氨酸 磷酸化水平，该磷酸化是HRG蛋白同ErbB3和/或ErbB4受体作用的结果。
[0052] 由于大多数基因工程药物是蛋白质或多肽类，它们的活性可通过其氨基酸序列或 空间结构组成的活性中心所决定。蛋白质或多肽类的活性效价与它们的绝对量并不一致， 所以不能像化学药物一样用重量单位来计量。然而，基因工程药物的生物活性一般同药效 学和效价确定方法一致，该方法可以通过给定的生物活性确定其效价单位。因此，确定生物 活性是定量活性物质过程的一部分，同时也是基因工程产物的质量控制的重要组成部分。 生物活性标准的建立对于基因工程产物和临床用药的质量控制是相当重要的。
[0053] 能引起最大反应50%的标准品的用量被定义为1个活性单位（IEU)。因此，不同 的药物或不同批次的产品能用统一的标准来定量。
【附图说明】
[0054] 图1 :糖尿病人给药rhNRG-Ι (重组人纽兰格林-1)和安慰剂第11，30和90天的 结果
[0055] 实施例
[0056] 实施例1 :不同途径施用Neucardin ?对慢性心衰大鼠生存率的影响
[0057] 本研宄采用冠状动脉结扎模型（CAL)模拟糖尿病人心肌梗死来探宄微量注射泵 静脉滴注和皮下注射两种给药方式施用Neucardin?对存活率和心脏血流动力学的影响 (给药后的第120天，CAL术后4周）。采用超声心电图和心脏重构的指标来确定心脏功能 和CAL术后恢复情况。
[0058] 2.方法
[0059] 2. 1试验动物
[0060] 品种，来源：Wistar大鼠，购自上海斯莱克实验动物有限公司；体重，200±10g，雄 性；
[0061] 2. 2试验样品
[0062] 2. 2. INeucardinTM
[0063] 标识：注射用重组人纽兰格林-I (rhNRG-1，Neucardin?)
[0064] 批号：200607009
[0065] 制造商：上海泽生科技开发有限公司
[0066] 剂型：冻干粉
[0067] 外观：白色或类白色块状
[0068] rhNRG-Ι 标示量：25〇 μ g/ 支
[0069] 比活性：4897U/ 支
[0070] 储存条件：2~8°C
[0071] 2. 2. 2 安慰剂
[0072] 标识：重组人纽兰格林-1安慰剂
[0073] 剂型：冻干粉
[0074] 外观：白色或类白色块状
[0075] 成份：人血清白蛋白，甘露醇，磷酸盐，NaCl
[0076] 储存条件：2~8°C
[0077] 2. 3 步骤
[0078] 2. 3. 1建立大鼠充血性心力衰竭模型：
[0079] 将大鼠的冠状动脉左前降支（left anterior descending coronary artery, LAD) 做结扎术。简要来说，大鼠腹腔注射盐酸氯胺酮lOOmg/kg麻醉后，胸部去毛并消毒。大鼠气 管插管，连接小动物呼吸机（频率60次/分钟，潮气量约20ml)。在第4、5肋间隙进行左胸 廓切开手术，皮肤沿着左胸骨边缘切口。剪断靠近胸骨附近的第4肋骨，穿过围心囊，暴露 心脏。用6/0医用无损伤缝合线在距动脉起点约2_处结扎左冠状动脉前降支。用力挤压 胸部以排气，再缝合胸部（肋骨，肌肉，皮肤）。观察呼吸情况，看到有自主呼吸后去除呼吸 机，放回笼内饲养。大鼠被饲养4周后，做超声心动图检查。如果大鼠的EF%值在30-45% 范围内，可进入正式研宄之列。每笼饲养5只，大鼠自由摄食及饮水。饲养环境温度保持在 21 ± I °C，12/12小时明暗交替。
[0080] 2. 3. 2微量注射泵静脉滴注：
[0081] 静脉滴注安慰剂或Neucardin?都是通过尾静脉注射给药。此过程中，需要根据动 物的体重使用合适的大鼠固定架。将大鼠放在固定架附近并将其轻放入装置中。一般大鼠 不需特别帮助就能进入固定架。紧接着用酒精蘸过的纱布擦拭大鼠尾部，以加速尾静脉血 液流动和软化皮肤角质层。针头斜面朝上且尽量平行于静脉血管，插入两侧尾部静脉，插入 尾部2-3cm处静脉，深度2mm。针管有血吸出证明针头成功插入尾部静脉。用医用胶带在尾 部固定针头。之后可以开始通过微量注射泵注射药或安慰剂，调整合适流速（0.2-0. 4ml/ h) 〇
[0082] 2. 3. 3皮下注射
[0083] 皮下注射安慰剂或Neucardin?都是从背部给药。此过程中，需要根据动物的体重 使用合适的大鼠固定架。用酒精蘸过的纱布擦拭大鼠背部消毒。针头斜面朝上且尽量平行 于皮肤，插入背部皮下3-4cm处。用医用胶带在背部固定针头并将输液管与针头连接。之 后将大鼠放在固定架附近并将其放入装置中。一般大鼠不需特别帮助就能进入固定架。将 大鼠固定好后，可以开始一次性注射。
[0084] 2. 3. 4实验组和注射用药
[0085] 心梗大鼠按EF%值随机分为4组，如下所示：
[0086] A组（阴性对照）静脉滴注和皮下注射，η = 58 :微量注射泵静脉滴注安慰剂，流 速为0. 2ml/h，每天8h，连续10天，之后皮下注射安慰剂（体积同Neucardin?)，每5天一 次直到第120天；
[0087] B组（皮下注射Neucardin?组），η = 58 :微量注射泵静脉滴注安慰剂，流速为 0. 2ml/h，每天8h，连续10天，之后皮下注射Neucardin?(10 μ g/kg)，每5天一次直到第120 天；
[0088] C组（静脉滴注Neucardin?组），η = 57 :微量注射泵静脉滴注 Neucardin?(0. 625 μ g/kg/h)，流速为0. 2ml/h，每天8h，连续10天，之后皮下注射安慰剂 (体积同Neucardin?)，每5天一次直 到第120天；
[0089] D组（静脉滴注和皮下注射Neucardin?组），η = 57 :微量注射泵静脉滴注 Neucardin?(0. 625 μ g/kg/h)，流速为 0. 2ml/h，每天 8h，连续 10 天，第 1、6、11 天皮下注射 安慰剂（体积同Neucardin?)，第16天起到结束每5天一次性皮下注射Neucardin?(10 μ g/ kg) 〇
[0090] 2· 3· 5数据采集
[0091] 存活率，超声心动图参数，血液动力学参数
[0092] 3.结果
[0093] 3. 1存活率
[0094] 表1描述了各组存活率的状况。A组、B组、C组和D组大鼠的存活率分别为48. 3%， 62. 1%，64. 9%和82. 5%。相比于A组，B组、C组、D组的存活率和平均存活时间都有所改 善或延迟，D组的疗效最佳。
[0095] 表1 :四组的死亡数，存活率和平均存活时间
[0096]
[0097] 3· 2超声心电图指标：
[0098] 超声心电图结果见表2。CAL术后4周，给药之前，心衰大鼠依照EF%值随机分为 4组。如表2所示，治疗之前（BT)各组间数值无统计学差异。给药后第120天，A组、B组、 C 组和 D 组的 EF%值分别为 30. 7±3· 1，32· 9±4· 1，33· 5±3· 4,36· 2±4· 8%。治疗后 B 组、 C组和D组的EF %值及FS %值与A组相比，都明显增加。
[0099] 表2 :四组的超声心电图参数
[0100]
[0101] BT :治疗前；AT :治疗后
[0102] 3. 3血流动力学指标：
[0103] 表3所示为第121天4组大鼠麻醉后测量MAP，HR，± dp/dt，LVEDP和LVSP值。单一 方式给药的13组（皮下注射他11〇31(1;[111￥组）和(]组（滴注他11〇31(1;[11111组）的+(^)/(11:和-(1卩/ dt值相比A组（滴注和一次性注射安慰剂组）均有较大提升，B组的增幅分别为19. 6% 和27. 1%，C组的增幅分别为22. 5%和29. 8%。D组（静脉滴注和皮下注射Neucardin? 组）的平均动脉压（mean arterial pressure, MAP, 112. 3 ±5. 5mmHg)，左心室收缩压（left ventricular systolic pressure, LVSP，139. 4±9· 8mmHg)，+dp/dt (7012. I ±903. OmmHg/ s)，-dp/dt (-4353. 2±847. 6mmHg/s)值均比A组（安慰剂组）的各值有显著增加。D组的 MAP，LVSP，+dp/dt，-dp/dt 值对应 A 组各值的增幅分别为 10. 6%，9. 2%，38. 5%，37. 8%。 结果表明，B组、C组和D组的血液动力学参数均好于A组，D组的疗效最佳。
[0104] 表3 :四组的血液动力学参数
[0105]
[0107] 4.结论
[0108] 同安慰剂组相比，静脉滴注和皮下注射的联合给药方式组或是单一方式施用纽兰 格林多肽药物的组都能使CAL术诱导的心衰大鼠的存活率更高，并且提高心脏功能的指 标。
[0109] 实施例2 ::随机、双盲、多中心、标准治疗基础上的安慰剂并行对照评价重组人纽 兰格林-1对慢性心力衰竭患者疗效与安全性的研宄
[0110] 为了评价注射用重组人纽兰格林-1对慢性心力衰竭患者包括患慢性心衰的糖尿 病病人的疗效，在中国多个临床中心开展了双盲、多中心、标准治疗基础上安慰剂并行对照 的II期临床试验。共有195位NYHA心功能分级为II或III级的慢性心衰患者包括21名 糖尿病患者入组，随机分为3组：安慰剂组，0. 6 μ g/kg剂量组，1. 2 μ g/kg剂量组。有13 名糖尿病患者在Neucardin组（5个在0· 6 μ g/kg/day剂量组，8个在L 2 μ g/kg/day剂量 组）。各组间在统计学或背景治疗方面无显著差异。根据安排，病人首先在医院连续10天 施用该药品，第11天后允许出院。随后在第30天和第90天再次入院施用该药物。一年后 进行电话随访。
[0111] 受试药物：
[0112] 规格：Neucardin ?，61个氨基酸构成Neuregulin-I β 2异构体的EGF类似功能 域，分子量为 7054Dal (1 μ g = 0· 14nmol)。250 μ g (5000EU) / 支（1 μ g = 20EU)
[0113] 制备：注射用
[0114] 给药方式：静脉滴注
[0115] 存储：置于安全处，避光，3_8°C下保存
[0116] 安慰剂：
[0117] 规格：Neucardin ?的赋形剂（250 μ g/支，不含重组人纽兰格林-1蛋白活性成 分）
[0118] 给药方案：
[0119]
[0120] 研宄步骤
[0121] 病人被随机分为3组，分别用安慰剂或rhNRG-1 (0. 6或1. 2 μ g/kg/day)连续治疗 10天，第11天允许出院。随后在第30天和第90天再次入院施用该药物。分别采集病人治 疗前、第11天、第30天和第90天的血样。血衆NT-proBNP水平在核心实验室里检测（试 剂盒来自Biomedica) 〇
[0122] 关于糖尿病病人（5个在0· 6 μ g/kg组，8个在L 2 μ g/kg/day组，9个在安慰剂 组），如图1所示，可观察到经Neucardin?治疗的病人在30天和90天的NT-proBNP水平降 低，表明长期预后改善。对于第11天的增长水平，经临床前研宄证实，是由于Neucardin? 刺激，心肌细胞直接分泌BNP所致。
[0123] 这些结果表明rhNRG-Ι治疗能够减少NT-proBNP血浆水平，这可能预示rhNRG-1 能够为患有慢性心衰的糖尿病病人提供长期疗效。
[0124] 实施例3 :随机、双盲、多中心、标准治疗基础上的安慰剂并行对照评价重组人纽 兰格林对慢性心力衰竭患者的生存研宄
[0125] 为了评价注射用重组人纽兰格林-1对慢性心力衰竭、包括患慢性心衰的糖尿病 病人的疗效，在中国的多个临床中心进行了双盲、多中心、标准治疗基础上的安慰剂并行对 照的Π 期临床试验。共有351位心功能为NYHA III或IV级的慢性心力衰竭入组，并被随 机分为安慰组或rhNRG组（0. 6 μ g/kg)。351人中有68名是糖尿病病人，35人在安慰剂组， 33名在Neucardin?组。各组之间在统计学和背景治疗方面无显著性差异。按照计划，病 人在医院连续10天施用药物，第11天允许出院。从第3周到第25周做为门诊病人每周用 药一次。采集病人治疗前（基线）和每次用药后的血样。在该研宄的第52周采集生存信 息。
[0126] 受试药物：
[0127] 规格：Neucardin ?，61个氨基酸构成Neuregulin-I β 2异构体的EGF类似功能 域，分子量为 7054Dal (1 μ g = 0· 14nmol)。250 μ g (5000EU) / 支（1 μ g = 20EU)
[0128] 制备：注射用
[0129] 给药方式：静脉滴注或输注
[0130] 存储：置于安全处，避光，3_8°C下保存
[0131] 安慰剂：
[0132] 规格：Neucardin ?的赋形剂（250 μ g/支，不含重组人纽兰格林-1蛋白活性成 分）
[0133] 给药方案：
[0134]
[0135] 安慰剂组的糖尿病病人在第52周的全因死亡率为20%，35人中死亡7人。而在 rhNRG-Ι组中，该死亡率为9. 1%，33人中3人死亡。因此从结果中可以发现，即使安慰剂组 维持先前慢性心衰的标准治疗，rhNRG-Ι治疗组的死亡率与安慰剂组相比，下降了 55%。
[0136] 本研宄的结果表明rhNRG-Ι能够显著降低患有心脏并发症尤其是心衰的糖尿病 病人的死亡率。
【主权项】
1. 一种预防、治疗或延缓糖尿病病人心脏并发症的方法，该方法包括为病人施用含有 效剂量纽兰格林的药物组合物。2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述心脏并发症是心力衰竭。3. 根据权利要求1所述的方法，其中所述纽兰格林是NRG-I。4. 根据权利要求1所述的方法，其中所述纽兰格林包括neuregulin-113的EGF类似 区。5. 根据权利要求1所述的方法，其中所述纽兰格林包括SEQ ID NO: 1。6. 根据权利要求1所述的方法，其中所述药物组合物通过静脉或皮下注射施用于病 人。7. 根据权利要求1所述的方法，其中所述药物组合物在导入疗程施用于病人。8. 根据权利要求7所述的方法，其中所述导入疗程包括至少连续3, 5, 7或10天施用药 物组合物。9. 根据权利要求7所述的方法，其中所述药物组合物在导入疗程之后的维持疗程施用 于病人。10. 根据权利要求9所述的方法，其中所述维持疗程包括每隔3, 5, 7或10天施用药物 组合物。11. 纽兰格林在制备用于预防、治疗或延缓糖尿病病人心脏并发症的药物方面的用途。12. 根据权利要求11所述的用途，其中所述纽兰格林是NRG-1。13. 根据权利要求11所述的用途，其中所述纽兰格林蛋白包括neuregulin-113的EGF 类似区。14. 根据权利要求11所述的用途，其中所述纽兰格林包括SEQ ID NO: 1。
【专利摘要】本发明涉及纽兰格林蛋白在制备用于预防、治疗或延缓人类心力衰竭的药物中的应用，以及所述用于预防、治疗或延缓人类心力衰竭的药物的使用方法。特别的，本发明提供对患心衰的糖尿病病人施用包含纽兰格林蛋白的药物来预防、治疗或延缓心力衰竭的方法。
【IPC分类】A61P9/04, A61K38/18
【公开号】CN104884077
【申请号】CN201280076130
【发明人】周明东
【申请人】上海泽生科技开发有限公司
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2012年10月8日
【公告号】CA2884051A1, EP2903632A1, US20150284440, WO2014056121A1