稳定的嗜热菌蛋白酶水凝胶的制作方法

稳定的嗜热菌蛋白酶水凝胶的制作方法
【专利说明】稳定的嗜热菌蛋白酶水凝胶
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年11月14日提交的美国临时申请号61/726, 175的权益。所引 用申请的内容以引用方式并入本说明书中。 技术领域
[0003] 本发明大体上涉及可用于用水凝胶处理伤口的方法和组合物，所述水凝胶包含活 性嗜热菌蛋白酶和作为胶凝剂的非离子型纤维素醚。 【背景技术】
[0004] 伤口中存在焦痂和其它坏死组织可阻碍愈合过程，使伤口变成缓慢愈合伤口或 "慢性"伤口。糖尿病性足部溃疡、静脉性腿部溃疡、动脉性腿部溃疡、褥疮性溃疡、淤积性溃 疡、皮肤溃疡、烧伤和压力性溃疡是所述伤口的示例。
[0005] 酶促伤口清创剂可用于消化焦痂和其它坏死组织，由此促进伤口的愈合过程。所 述清创剂是可消化焦痂和其它坏死组织的酶。包含嗜热菌蛋白酶的大多数伤口清创剂在使 所述清创剂不与水接触的环境（例如凝胶、乳膏和软膏）中。其原因是保持清创剂的稳定 性，因为清创剂往往在含水环境中具有有限的稳定性（美国公开2003/0198631)。例如，美 国公开2003/0198631中的所有示例性配方均涉及乳膏和非水凝胶。然而，具有讽刺意味的 是，例如嗜热菌蛋白酶的清创剂在含水环境中活性最高。这解释了使用水包油乳液（例如 乳膏）作为嗜热菌蛋白酶的递送载体。
【发明内容】

[0006] 本发明人已经解决了在含水环境中使用嗜热菌蛋白酶所见到的稳定性问题。具体 来说，本发明人已经发现通过使用非离子型纤维素醚来产生含有嗜热菌蛋白酶的水凝胶来 使嗜热菌蛋白酶在含水环境中稳定的方式。水凝胶是其中水是连续相或连续介质的凝胶。 水凝胶通常呈半固体剂型。纤维素醚/水/嗜热菌蛋白酶的组合产生可用于处理伤口的令 人惊讶的稳定制剂。例如，数据证实所述水凝胶可在室温（约20-25? )下储存24个月并 且仍然保持其嗜热菌蛋白酶原始活性的至少80%或90% (即，嗜热菌蛋白酶的活性不降低 超过20%或10% )。这一稳定性是令人惊讶的，因为预计例如嗜热菌蛋白酶的蛋白酶在例 如水凝胶的含水环境中是高度不稳定的并且快速降解。实际上，这一稳定性甚至高于一些 非水载体、乳膏等，这甚至更加令人惊讶，因为所述载体在传统上被认为向嗜热菌蛋白酶提 供了针对含水环境的额外的稳定性保护。
[0007] 在一种情况下，公开了一种水凝胶，所述水凝胶包含包括非离子型纤维素醚的亲 水性胶凝剂和活性嗜热菌蛋白酶，其中当在室温下储存6个月、12个月、18个月或24个月 时，所述嗜热菌蛋白酶的蛋白水解活性不降低超过20%或超过10% (即，保持其活性的至 少80或90% )。在本说明书通篇中提供了非离子型纤维素醚的非限制性示例一所述示例 包括羟烷基纤维素醚（例如，羟乙基纤维素（HEC)、羟丙基纤维素（HPC)或羟丙基甲基纤 维素（HPMC)或其任一组合或所有的所述纤维素醚）。水凝胶内非离子型纤维素醚的量可 根据需要而变化以实现特定的粘度。在某些情况下，所述量可在〇. 1 % w/w到30% w/w、 或 0· 1 % w/w 到 20 % w/w、或 0· 1 % w/w 到 10 % w/w、或 0· 1 % w/w 到 5 % w/w 的非离子型 纤维素酿的范围，或可包括 〇· 1 % w/w、0. 2% w/w、0. 3% w/w、0. 4% w/w、0. 5% w/w、0. 6% w/w>0. 7% w/w>0. 8% w/w>0. 9% w/w>l% w/w>2% w/w>3% w/w>4% w/w>5% w/w>6% w/ w、7% w/w、8% w/w、9% w/w、10% w/w、15% w/w、20% w/w、25% w/w 或 30% w/w。在一个 实施方案中，水凝胶内轻乙基纤维素的量可在2. 5% w/w到4. 5% w/w的范围。在另一实 施方案中，水凝胶内轻丙基纤维素的量可在〇. 01% w/w到10% w/w的范围。在再一实施 方案中，水凝胶内轻丙基甲基纤维素的量可在1. 5% w/w到2. 5 % w/w的范围。此外，水凝 胶内嗜热菌蛋白酶的量可根据给定伤口的配给量要求而变化。在一些方面，水凝胶内嗜热 菌蛋白酶的量可在〇. 1 % w/w到5 % w/w、或0. 5 % w/w到1 % w/w的范围，或为0. 1 % w/ w>0. 2 % w/w>0. 3 % w/w>0. 4 % w/w>0. 5 % w/w>0. 6 % w/w>0. 7 % w/w>0. 8 % w/w>0. 9 % w/ w、l % w/w、2% w/w、3% w/w、4% w/w或5% w/w。此外，本发明的水凝胶可进一步包含缓 冲液。在某些方面，缓冲液可具有约7. 0到8. 0、或7. 1、7. 2、7. 3、7. 4、7. 5、7. 6、7. 7、7. 8、 7. 9或8的pH范围。在一些实施方案中，缓冲液可具有约7.5的pH范围。水凝胶的粘度 可经修改以满足所需稠度。在一些方面，水凝胶的粘度可在5, OOOcps到100, OOOcps、或 10, OOOcps 到 100, OOOcps、或 15, OOOcps 到 100, 000cps、30, OOOcps 到 80, OOOcps 的范围， 或可为约 5, 000cps、10, 000cps、15, 000cps、20, 000cps、30, 000cps、40, 000cps、50, OOOcps、 60, 000cps、70, 000cps、80, 000cps、90, OOOcps 或 100, OOOcps 或其中的任一范围，如利用 Brookfield RV粘度计（带有小样品接头的转子14)以IOrpm在室温下以30秒读取所测 量。水凝胶还可包含金属盐。金属盐的非限制性示例包括氯化钠和氯化钙。水凝胶可以是 无菌的，或其可通过包含防腐剂来保存。防腐剂的非限制性示例包括对羟基苯甲酸甲酯、对 羟基苯甲酸丙酯和苯氧乙醇。水凝胶还可包含二元醇、三元醇和多元醇。二元醇的非限制 性示例是丙二醇，并且三元醇的非限制性示例是甘油。在一个具体方面，水凝胶可包含氯化 钠、氯化钙、丙二醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯。适用于具有该性质的局部组 合物的其它添加剂可包含于水凝胶中。在一些方面，嗜热菌蛋白酶可悬浮或溶解于水凝胶 内。在其它方面，嗜热菌蛋白酶可部分地悬浮和部分地溶解于水凝胶内。在一些方面，水 凝胶内的一部分嗜热菌蛋白酶可溶解（例如，少于50% w/w、40% w/w、30% w/w、20% w/w、 10% w/w、5% w/w、I % w/w 或 0· 5% w/w 可溶解）。
[0008] 还公开了用本发明的任一种水凝胶对伤口进行清创的方法，其中所述伤口需要清 仓IJ。伤口可为慢性伤口。可被处理的慢性伤口的示例包括糖尿病性足部溃疡、静脉性腿部 溃疡、动脉性腿部溃疡、褥疮性溃疡、淤积性溃疡、皮肤溃疡、烧伤或压力性溃疡。在一些情 况下，伤口可包括坏死组织。坏死组织可为焦痂。
[0009] 在又一实施方案中，公开了用于使嗜热菌蛋白酶稳定的方法，其包括制备本发明 的水凝胶。说明书内的数据证实了嗜热菌蛋白酶在本发明的所述水凝胶内的令人惊讶的稳 定性。
[0010] 除非另外指明，否则本文所表示的数值百分比是重量比重量并且是相对于总组合 物而言的。
[0011] 术语"活性嗜热菌蛋白酶"意指表现蛋白水解活性的嗜热菌蛋白酶。
[0012] 术语"稳定的"意指当在室温下储存6个月时，嗜热菌蛋白酶的蛋白水解活性保持 其活性的至少80%。
[0013] 术语"约"或"大约"如本领域普通技术人员所理解的那样被定义为接近于，并且在 一个非限定性实施方案中，所述术语被定义为在10%之内、优选在5%之内、更优选在1% 之内并且最优选在〇. 5%之内。
[0014] 术语"抑制"、"减少"、"处理"或这些术语的任何变化形式包括实现所需结果的任 何可测量的减少或完全抑制。类似地，术语"有效的"意指足以实现所需的、预期的或想要 的结果。
[0015] 所用的词语"a/an( -）"，当结合术语"包含"使用时，可意指"一"，但它也与"一 或多"、"至少一"和"一或多于一"的含义一致。
[0016] 词语"包含"（和包含的任何形式）、"具有"（和具有的任何形式）、"包括"（和包 括的任何形式）或"含有"（和含有的任何形式）是包括的或开放式的，且不排除额外的、未 述及的要素或方法步骤。
[0017] 组合物和其使用方法可"包含"本说明书通篇内所公开的任何成分或 步骤，"基本 上由其组成"或"由其组成"。关于连接词"基本上由……组成"，在一个非限制性方面，本说 明书中所公开的组合物和方法的基本和新颖的特性包括所述水凝胶的使嗜热菌蛋白酶稳 定的能力。
[0018] 预期本说明书中所讨论的任何实施方案均可针对本发明的任何方法或组合物实 施，反之亦然。此外，本发明的组合物可用于实现本发明的方法。
[0019] 根据下文详细描述将明了本发明的其它目标、特征和优点。然而，应当理解，尽管 【具体实施方式】和具体实施例显示了本发明的具体实施方案，但其仅以举例方式给出，因为 本领域技术人员根据此详细描述将明了属于本发明精神和范围内的各种变化和修改。 【附图说明】
[0020] 图1.显示本发明的水凝胶（HEC)中和不包含非离子型纤维素醚的水凝胶中表示 为靶％的1个月的嗜热菌蛋白酶活性的图。
[0021] 图2.显示当嗜热菌蛋白酶被提供于本发明的含水水凝胶中并且储存在4°C、室温 (20-25°C )和40°C时在24个月里的表示为靶％的嗜热菌蛋白酶活性的图。用于图2中的 制剂提供于表1中。
[0022] 图3.显示在用SANTYL?胶原酶软膏、木瓜蛋白酶/尿素软膏（具有2. 5%木 瓜蛋白酶和10%尿素）、本发明的稀（约50, OOOcps)嗜热菌蛋白酶含水水凝胶和本发明的 稠（约70, OOOcps)嗜热菌蛋白酶含水水凝胶处理后，猪焦痂伤口中随时间的清创百分比的 图。稀水凝胶和稠水凝胶的制剂分别提供于表2和3中。 【具体实施方式】
[0023] 有效的伤口清洗和清创有助于促进愈合过程。伤口床（wound bed)中存在失活组 织是不期望的一它充当细菌生长的储库（reservoir)，含有促进伤口部位慢性炎症的升高 水平的炎症介质，并且损害细胞迀移。4种用于对伤口进行清创的最常见的方法包括手术清 仓1J、自溶清创、酶促清创和机械清创。
[0024] 关于酶促清创，目前的SANTYL?胶原酶软膏是在美国市场唯一被批准的酶促 清创药品。该产品是利用胶原酶作为清创剂的疏水性软膏。尽管他人已经尝试使用不同清 创剂和多种制剂，但所面临的问题之一是其稳定性问题。具体来说，清创剂的不稳定性限制 了它们对伤口进行有效地清创的用途。
[0025] 本发明人已经发现与清创剂嗜热菌蛋白酶密切相关的不稳定性问题的解决方案。 具体来说，本发明人发现通过使用非离子型纤维素醚来产生含有嗜热菌蛋白酶并且使嗜热 菌蛋白酶稳定的水凝胶使嗜热菌蛋白酶在含水环境中稳定的方式。本发明的这些和其它非 限制性方面描述于以下小节中。
[0026] A.水凝胶
[0027] 本发明的组合物被配制成水凝胶，其中所述制剂的连续介质是已用非离子型纤维 素醚胶凝的含水环境。嗜热菌蛋白酶可悬浮或溶解于所述凝胶内。它还可部分地溶解和部 分地悬浮于所述凝胶内。此外，还可将其它添加剂添加到本发明的水凝胶中。
[0028] 1.嗜热菌蛋白酶
[0029] 嗜热菌蛋白酶是在疏水性残基亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、丙氨酸和甲 硫氨酸的N末端切割的热稳定的金属蛋白酶。最佳消化温度范围是40-80°C。嗜热菌蛋白 酶活性在pH 5. 0-8. 5下最佳。术语"活性嗜热菌蛋白酶"意指表现蛋白水解活性的嗜热菌 蛋白酶。Amano Japan是嗜热菌蛋白酶的一个制造商和供应商。从称为六甲嗜热溶蛋白芽 抱杆菌（Bacillus thermoproteolyticus rokko)的菌种获得Amano嗜热菌蛋白酶。嗜热 菌蛋白酶的CAS编号是9073-78-3。用于本说明书的实施例中的嗜热菌蛋白酶来自Amano。
[0030] 2.非离子型纤维素醚
[0031] 非离子型纤维素醚是可通过用烷基或羟烷基替代纤维素的葡萄糖单元中的羟基 的氢原子制得的高分子量化合物。非离子型烷基纤维素醚的非限制性示例包括甲基纤维素 (MC)、乙基纤维素（EC)和乙基甲基纤维素（EMC)。非离子型羟烷基纤维素醚的非限制性示 例包括羟乙基纤维素（HEC)、羟丙基纤维素（HPC)、羟甲基纤维素（HMC)、羟丙基甲基纤维素 (HPMC)、乙基羟乙基纤维素（EHEC)、羟乙基甲基纤维素（HEMC)、甲基羟乙基纤维素（MHEC)、 甲基羟丙基纤维素（MHPC)和羟乙基羧甲基纤维素（HECMC)。这些纤维素醚中的每一种都有 广泛的商业来源（例如，陶氏化学公司（Dow Chemical Company)(美国）、亚什兰（Ashland) (美国）、三星精密化学（Samsung Fine Chemicals)(美国））。这些非离子型纤维素醚的 另外的商业来源可在国际化妆品成分词典和手册（International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook)(第 12 版（2008 年），第 1-3 卷）中找到。
[0032] 3.添加剂
[0033] 除嗜热菌蛋白酶、非离子型纤维素醚和水外，水凝胶还可包含另外的成分。例如， 可使用水溶性溶剂，例如丙二醇或其它二元醇。三元醇和多元醇也可用于水凝胶中。三元 醇的非限制性示例是甘油。所述溶剂的量可在1% w/w到20% w/w的范围，虽然可添加更 多或更少以实现水凝胶的所需结果。可使用例如似(：12或CaCl2的金属盐作为稳定剂。盐 的量可在〇. 01% w/w到1% w/w的范围，虽然可添加更多或更少以实现水凝胶的所需结果。 可使用例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯和苯氧乙醇的防腐剂来保存水凝胶。所 述防腐剂的量可在〇. 01 % w/w到1 % w/w的范围，虽然可添加更多或更少以实现水凝胶的 所需结果。可使用具有适于嗜热菌蛋白酶的pH范围（例如，6. 5到9、或7到8、或约7. 5) 的缓冲液。所述缓冲液的一个示例是Tris缓冲液（lOmM, pH = 7. 5)。水凝胶的水源可来自 缓冲溶液。因此，可添加的缓冲液的量是填满所述制剂的量（例如，适量到100%)。可添 加其它添加剂以实现给定的触觉性质或为水凝胶增加另外的功能方面（例如，可进一步帮 助伤口愈合过程的药剂，例如疗创剂（vulnerary agent)、抗微生物剂、抗炎剂、疼痛缓解剂 等）。
[0034] 4.水凝胶的制备
[0035] 可通过在去离子（DI)水或Tris缓冲液（pH = 7. 5)中在70°C混合丙二醇和防腐剂 (例如，对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯）来制备本发明的水凝胶。在溶解（即，获得 澄清溶液）后，可将溶液冷却到室温（RT)并且可添加胶凝剂（例如，羟乙基纤维素-HEC)。 然后可搅拌所述混合物直到均匀（即，没有可见的胶凝剂HEC粒子），由此形成水凝胶。可 通过在DI水或Tris缓冲液（pH = 7. 5)中以适当浓度混合嗜热菌蛋白酶、NaCl和CaCl^iJ 得活性相。在均质化（将获得白色浆料）后，然后可将活性相添加到水凝胶中（以适当浓 度）。然后可在RT搅拌最终混合物。然后获得乳状水凝胶。
[0036] B.使用水凝胶的方法
[0037] 本发明的水凝胶可用于多种方法中。例如，它们可用于对例如慢性伤口的伤口进 行清创。所述方法包括对伤口施用包含嗜热菌蛋白酶的组合物（例如，通过局部施用）。在 施用后，伤口可被伤口敷料（例如纱布垫）覆盖。可首先将水凝胶施用到敷料（例如纱布 垫）并且随后施用到伤口表面。施用量取决于伤口的严重程度和类型以及个体的性质。
[0038] 在某些方面，水凝胶可根据需要被周期性地（例如，每日一次、每日两次、隔日一 次、一周一次）施用到伤口。可使用治疗方案，所述治疗方案包括周期性地更换敷料，并在 更换之间进行伤口清洗并施用新鲜组合物，直到完成对坏死组织的清除。
[0039] 可用本发明的水凝胶处理众多种伤口。示例包括烧伤、急性伤口或慢性伤口。慢 性伤口的非限制性示例包括糖尿病性足部溃疡、静脉性腿部溃疡、动脉性腿部溃疡，褥疮性 溃疡、淤积性溃疡、皮肤溃疡、烧伤和压力性溃疡。
[0040] α试剂盒
[0041] 还考虑在本发明的某些方面中使用试剂盒。例如，本发明的水凝胶可包含在试剂 盒中。试剂盒可包括容器。容器可包括瓶、金属管、层压管、塑料管、分配器、加压容器、阻隔 容器、包、室或其它类型的容器，例如在其中保留水凝胶的注塑或吹塑塑料容器。试剂盒可 包括其表面上的标记。标记例如可为词语、短语、缩写、图片或符号。
[0042] 容器可分配预定量的组合物。在其它实施方案中，可挤压容器（例如，金属管、层 压管或塑料管）以分配所需量的组合物。组合物可作为喷雾剂、发泡剂（foam)、气溶胶、液 体、流体或半固体分配。容器可具有喷雾、泵送或挤压机构。容器可被设计用于单剂量或多 剂量分配。试剂盒还可包括使用试剂盒和/或组合物的说明书。
[0043] 此外，本发明的水凝胶还可以是无菌的，并且含有所述水凝胶的试剂盒可用于保 存无菌水凝胶。所述水凝胶可通过无菌制造工艺进行灭菌或通过本领域已知的方法在包装 后进行灭菌。
[0044] 实施例
[0045] 包括以下实施例以证明本发明的某些非限制性方面。本领域技术人员应当了解， 以下实施例中所公开的技术代表了由申请人发现的在本发明的实施中良好地起作用的技 术。然而，本领域技术人员根据本公开内容应当了解，可在不脱离本发明精神和范围的前提 下对所公开的具体实施方案作出许多改动，并且仍然获得相同或类似的结果。
[0046] 实施例1
[0047] (示例性制剂）
[0048] 下列各表提供了包含嗜热菌蛋白酶和纤维素醚的多种水凝胶制剂的非限制性示 例。
[0049] 表1-嗜热菌蛋白酶/HEC水凝胶（在图2中）
[0050]
[0051] 过程：所用的HEC是来自亚什兰（美国）的Natrosol? 250Pharm。所用的缓冲液是 Tris缓冲液（10mM，pH 7. 5)。通过在Tris缓冲液中在70°C混合丙二醇和防腐剂（例如， 对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯）来制备水凝胶。在溶解（即，获得澄清溶液）后， 将溶液冷却到室温（RT)并且添加胶凝剂（HEC)。然后搅拌所述混合物直到均匀（即，没有 可见的胶凝剂HEC粒子），形成水凝胶。通过在DI水或Tris缓冲液（pH = 7. 5)中以适当 浓度混合嗜热菌蛋白酶、NaCl和CaCl2制得活性相。在均质化（将获得白色浆料）后，将活 性相添加到水凝胶中（以适当浓度）。将最终混合物在RT搅拌至少2h。获得平均粘度为 54, 876cps (标准偏差为251. 66,并且基于来自同一水凝胶的三个样品的三次单独测量）的 乳状水凝胶，所述平均粘度如在Brookfield粘度计（14号转子）上以IOrpm在RT下以30 秒所测量。嗜热菌蛋白酶在该制剂中在室温和4°C稳定6个月、12个月、18个月和24个月， 如通过酪蛋白消化法所测量。
[0052] 表2-嗜热菌蛋白酶/HEC水凝胶（图3中的"稀凝胶"）
[0053]
[0054] 过程：所用的HEC是来自亚什兰（美国）的Natrosol? 250Pharm。所用的缓冲液 是Tris缓冲液（10mM，pH 7.5)。通过在Tris缓冲液中在70°C混合丙二醇和防腐剂（例 如，对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯）来制备水凝胶。在溶解（即，获得澄清溶液） 后，将溶液冷却到室温（RT)并且添加胶凝剂（HEC)。搅拌所述混合物直到均匀（即，没有 可见的胶凝剂HEC粒子），形成水凝胶。通过在DI水或Tris缓冲液（pH = 7. 5)中以适当 浓度混合嗜热菌蛋白酶、NaCl和CaCl2制得活性相。在均质化（将获得白色浆料）后，将活 性相添加到水凝胶中（以适当浓度）。将最终混合物在RT搅拌至少2h。获得平均粘度为 64, 900cps (标准偏差为173. 21，基于来自同一水凝胶的三个样品的三次单独测量）的乳状 水凝胶，所述平均粘度如在Brookfield粘度计（14号转子）上以IOrpm在RT下以30秒所 测量。
[0055] 表3-嗜热菌蛋白酶/HEC水凝胶（图3中的"稠凝胶"）
[0056]
[0057] 过程：所用的HEC是来自亚什兰（美国）的Natrosol? 250Pharm。所用的缓冲液 是Tris缓冲液（10mM，pH 7.5)。通过在Tris缓冲液中在70°C混合丙二醇和防腐剂（例 如，对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯）来制备水凝胶。在溶解（即，获得澄清溶液） 后，将溶液冷却到室温（RT)并且添加胶凝剂（HEC)。搅拌所述混合物直到均匀（即，没有 可见的胶凝剂HEC粒子），形成水凝胶。通过在DI水或Tris缓冲液（pH = 7. 5)中以适当 浓度混合嗜热菌蛋白酶、NaCl和CaCl2制得活性相。在均质化（将获得白色浆料）后，将活 性相添加到水凝胶中（以适当浓度）。将最终混合物在RT搅拌至少2h。获得平均粘度为 170, 067cps (标准偏差为25, 516,并且基于来自同一水凝胶的三个样品的三次单独测量） 的乳状水凝胶，所述平均粘度如在Brookfield粘度计（14号转子）上以5rpm在RT下以60 秒所测量。
[0058] 表4-嗜热菌蛋白酶/HPMC水凝胶
[0059]
[0061] 过程：所用的HPMC是来自陶氏化学公司（美国）的Methocel K-15M。悬浮介质是 DI水。通过在Tris缓冲液中在70°C混合丙二醇和防腐剂（例如，对羟基苯甲酸甲酯和对 羟基苯甲酸丙酯）来制备水凝胶。在溶解（即，获得澄清溶液）后，将溶液冷却到室温（RT) 并且添加胶凝剂（HPMC)。搅拌所述混合物直到均匀（即，没有可见的胶凝剂HPMC粒子）， 形成水凝胶。通过在DI水中以适当浓度混合嗜热菌蛋白酶制得活性相。在均质化（将获 得白色浆料）后，将活性相添加到水凝胶中（以适当浓度）。将最终混合物在RT搅拌至少 2h。获得平均粘度为9, 400cps (标准偏差为100,并且基于来自同一水凝胶的三个样品的 三次单独测量）的乳状水凝胶，所述平均粘度如在Brookfield粘度计（14号转子）上以 IOrpm在RT下以30秒所测量。嗜热菌蛋白酶在该制剂中在室温和4°C稳定10个月，如通 过酪蛋白消化法所测量。
[0062] 表5-嗜热菌蛋白酶/HPC水凝胶
[0063]
[0064] 过程：所用的HPC(KlUcel?)来自亚什兰公司（美国）。悬浮介质是DI水。通过在 DI水中在RT混合甘油、苯氧乙醇和胶凝剂（HPC)来制备水凝胶。在溶解后形成水凝胶。通 过在DI水中以适当浓度混合嗜热菌蛋白酶和NaCl制得活性相。在均质化（将获得白色浆 料）后，将活性相添加到水凝胶中（以适当浓度）。将最终混合物在RT搅拌至少2h。获得 平均粘度为42, 633cps (标准偏差为1，205. 5,并且基于来自同一水凝胶的三个样品的三次 单独测量）的乳状水凝胶，所述平均粘度如在Brookfield粘度计（14号转子）上以IOrpm 在RT下以30秒所测量。嗜热菌蛋白酶在该制剂中在室温和4°C稳定10个月，如通过酪蛋 白消化法所测量。
[0065] 表6-嗜热菌蛋白酶/卡波普（Carbopol) 940水凝胶
[0066]
[0067] 过程：所用的卡波普940从留勃里佐尔（Lubrizol)(美国）获得。悬浮介质是Tris 缓冲液（10mM，pH = 7. 5)。通过在Tris缓冲液中在RT混合胶凝剂（卡波普940)来制备水 凝胶。在溶解后形成浑浊溶液。在用IM NaOH中和所述溶液后形成水凝胶。通过在Tris 缓冲液中以适当浓度混合嗜热菌蛋白酶制得活性相。将活性相添加到水凝胶中。将最终混 合物在RT搅拌至少2h。获得乳状水凝胶。嗜热菌蛋白酶活性在该制剂中被抑制，如通过酪 蛋白消化法所测量。
[0068] 表7-嗜热菌蛋白酶/聚季按盐（Polyquatemium)-IO水凝胶
[0069]
[0070] 过程：所用聚季铵盐-10 (U-Care Polymer JR-30M)来自陶氏化学公司（美国）。 悬浮介质是Tris缓冲液（lOmM，pH = 7. 5)。通过在Tris缓冲液中在RT混合胶凝剂（聚季 铵盐-10)来制备水凝胶。在溶解后形成水凝胶。通过在Tris缓冲液中以适当浓度混合嗜 热菌蛋白酶制得活性相。将活性相添加到水凝胶中。将最终混合物在RT搅拌至少2h。获 得乳状水凝胶。嗜热菌蛋白酶在该制剂中不稳定。在室温下储存1个月后，通过酪蛋白消 化法测量发现，活性损失约60 %。
[0071] 表8-嗜热菌蛋白酶/Hispagel水凝胶
[0072]
[0073] 过程：所用的Hispagel-200从科宁（Cognis)(美国）获得。悬浮介质是Tris缓 冲液（10mM，pH = 7. 5)。通过在Tris缓冲液中在RT混合胶凝剂（Hispagel-200)来制备水 凝胶。在溶解后形成水凝胶。通过在Tris缓冲液中以适当浓度混合嗜热菌蛋白酶制得活 性相。将活性相添加到水凝胶中。将最终混合物在RT搅拌至少2h。通过IM NaOH和固体 Tris缓冲物调节最终pH。获得乳状水凝胶。嗜热菌蛋白酶活性在该制剂中被抑制，如通过 酪蛋白消化法所测量。
[0074] 表9-嗜热菌蛋白酶/Aristoflex水凝胶
[0075]
[0076] 过程：所用的Aristo flex AVC来自科莱恩（Clariant)(美国）。悬浮介质是Tris 缓冲液（10mM，pH = 7. 5)。通过在Tris缓冲液中在RT混合胶凝剂（Aristoflex AVC)来 制备水凝胶。在溶解后形成水凝胶。通过在Tris缓冲液中以适当浓度混合嗜热菌蛋白酶 制得活性相。将活性相添加到水凝胶中。将最终混合物在RT搅拌至少2h。获得乳状水凝 胶。嗜热菌蛋白酶活性在该制剂中被抑制，如通过酪蛋白消化法所测量。
[0077] 表10-嗜热菌蛋白酶/Ultragel-300水凝胶
[0078]
[0079] 过程：所用的Ultragel-300 (聚季铵盐-37)从科宁（美国）获得。悬浮介质是 Tris缓冲液（lOmM，pH = 7. 5)。通过在Tris缓冲液中在RT混合胶凝剂（Ultragel-300) 来制备水凝胶。在溶解后形成水凝胶。通过在Tris缓冲液中以适当浓度混合嗜热菌蛋白 酶制得活性相。将活性相添加到水凝胶中。将最终混合物在RT搅拌至少2h。获得乳状水 凝胶。嗜热菌蛋白酶在该制剂中不稳定。在室温下储存1个月后，通过酪蛋白消化法测量 发现，活性损失约80%。
[0080] 表11-嗜热菌蛋白酶/结冷胶（Gellan Gum)水凝胶
[0081]
[0082] 过程:所用的结冷胶从斯比凯可（C. P. Kelco)(美国）获得。悬浮介质是Tris缓 冲液（lOmM，pH = 7. 5)。通过在Tris缓冲液中在RT混合胶凝剂（结冷胶）来制备水凝胶。 在溶解后形成水凝胶。通过在Tris缓冲液中以适当浓度混合嗜热菌蛋白酶制得活性相。 将活性相添加到水凝胶中。将最终混合物在RT搅拌至少2h。获得乳状水凝胶。嗜热菌蛋 白酶在该制剂中不稳定。在室温下储存1个月后，通过酪蛋白消化法测量发现，活性损失约 50%〇
[0083] 表12-嗜热菌蛋白酶/Cosmedia Guar水凝胶
[0084]
[0085] 过程：所用的Cosmedia guar (瓜尔轻丙基三甲基氯化按（guar hydroxypropyltrimonium chloride))从科宁（美国）获得。悬浮介质是Tris缓冲液 (IOmM, pH = 7. 5)。通过在Tris缓冲液中在RT混合胶凝剂（Cosmedia Guar)来制备水凝 胶。在溶解后形成水凝胶。通过在Tris缓冲液中以适当浓度混合嗜热菌蛋白酶制得活性 相。将活性相添加到水凝胶中。将最终混合物在RT搅拌至少2h。获得乳状水凝胶。嗜热 菌蛋白酶在该制剂中不稳定。在室温下储存1个月后，通过酪蛋白消化法测量发现，活性损 失约60%。
[0086] 表13-嗜热菌蛋白酶/黄原胶水凝胶
[0087]
[0088] 过程:所用的黄原胶从TIC胶体（TIC Gums)(美国）获得。悬浮介质是Tris缓冲 液（10mM，pH = 7. 5)。通过在Tris缓冲液中在RT混合胶凝剂（黄原胶）来制备水凝胶。 在溶解后形成水凝胶。通过在Tris缓冲液中以适当浓度混合嗜热菌蛋白酶制得活性相。 将活性相添加到水凝胶中。将最终混合物在RT搅拌至少2h。获得乳状水凝胶。嗜热菌蛋 白酶在该制剂中不稳定。在室温下储存1个月后，通过酪蛋白消化法测量发现，活性损失约 70%〇
[0089] 表14-嗜热菌蛋白酶/CMC Ticalose水凝胶
[0090]
[0091] 过程：所用的CMC Ticalose (羧甲基纤维素钠-阴离子型）从TIC胶体（美国） 获得。悬浮介质是Tris缓冲液（lOmM，pH = 7. 5)。通过在Tris缓冲液中在RT混合胶凝剂 (CMC Ticalose)来制备水凝胶。在溶解后形成水凝胶。通过在Tris缓冲液中以适当浓度 混合嗜热菌蛋白酶制得活性相。将活性相添加到水凝胶中。将最终混合物在RT搅拌至少 2h。获得乳状水凝胶。嗜热菌蛋白酶活性在该制剂中受到抑制。
[0092] 表15-嗜热菌蛋白酶/PolyOx WSR水凝胶
[0093]
[0094] 过程：所用的PolyOx (PEG) WSR从TIC胶体（美国）获得。悬浮介质是Tris缓冲 液（10mM，pH = 7. 5)。通过在Tris缓冲液中在RT混合胶凝剂（PolyOx WSR)来制备水凝 胶。在溶解后形成水凝胶/稠液体。通过在Tris缓冲液中以适当浓度混合嗜热菌蛋白酶 制得活性相。将活性相添加到水凝胶中。将最终混合物在RT搅拌至少2h。获得乳状水凝 胶/稠液体。嗜热菌蛋白酶在该制剂中不稳定。
[0095] 在室温下储存1个月后，通过酪蛋白消化法测量发现，活性损失约80%。
[0096] 表16-嗜热菌蛋白酶/水包油乳液乳膏
[0097]
[0098]
[0099] 过程：乳化赌（Polowax)从禾大（Croda)(美国）获得。悬浮介质是KH2PO 4 (I %，w/ w, pH = 7. 5)。通过在缓冲液中在70°C溶解甘油和防腐剂来制备乳膏。在溶解（澄清溶液） 后，添加乳化剂（乳化蜡）和油（肉豆蔻酸异丙酯）。在混合（在70°C Ih)后，将混合物冷 却到RT。获得乳状白色乳膏。发现在室温下4个月后，嗜热菌蛋白酶在该制剂中不稳定，如 通过酪蛋白消化法所测量。
[0100] 表17-嗜热菌蛋白酶/卡波普Aqua SF-I水凝胶
[0101]
[0102] 过程：所用的卡波普Aqua SF-I从留勃里佐尔（美国）获得。悬浮介质是DI水。 通过将胶凝剂（卡波普Aqua SF-1)与防腐剂和甘油一起在70°C混合于DI水中来制备水凝 胶。在溶解后将溶液冷却到RT。在用IM NaOH中和所述溶液后形成水凝胶。通过在DI水 中以适当浓度混合嗜热菌蛋白酶制得活性相。将活性相添加到水凝胶中。将最终混合物在 RT搅拌至少2h。获得半透明水凝胶。嗜热菌蛋白酶活性在该制剂中受到抑制。
[0103] 表18 -嗜热菌蛋白酶/泊洛沙姆-407 (Poloxamer-407)基水凝胶
[0104]
[0105] 过程：所用的泊洛沙姆-407从BASF(美国）获得。悬浮介质是1% KH2POjl冲液。 通过将胶凝剂（泊洛沙姆-407)与防腐剂一起在4°C混合于缓冲液中来制备水凝胶。在溶 解后将溶液平衡到RT。在温度从4°C到RT后形成水凝胶。获得澄清水凝胶。嗜热菌蛋白 酶活性在该制剂中受到抑制。
[0106] 表19 -嗜热菌蛋白酶/泊洛沙姆基亲水性分散液
[0107]
[0108] 过程：所用的泊洛沙姆-407/泊洛沙姆-124和泊洛沙姆-188从BASF (美国）获 得。通过在70°C加热并且混合所述泊洛沙姆直到均匀制得所述分散液。通过将所述酶悬浮 于泊洛沙姆-124中并且将它添加到先前冷却（到RT)的主相中来制备活性相。获得白色 乳膏。嗜热菌蛋白酶被发现在室温下6个月后在该制剂中不稳定，如通过酪蛋白消化法所 测量。
[0109] 实施例2
[0110](嗜热菌蛋白酶稳定性数据）
[0111] 在一个月时期里在室温（20°C到25°C )下储存的同时测试嗜热菌蛋白酶在表1的 嗜热菌蛋白酶/HEC水凝胶中的稳定性。为了比较目的，还利用除非离子型纤维素醚以外的 胶凝剂制备多种嗜热菌蛋白酶水凝胶。所述胶凝剂包括聚季按盐-HKUltragel 300、结冷 胶、cosmedia guar、黄原胶、阴离子型纤维素醚、卡波普、泊洛沙姆、polyox WSR和其它胶凝 剂。另外的水凝胶也被储存在室温（20°C到25°C )下。
[0112] 图1供了稳定性结果的概述。水凝胶（例如，HEC水凝胶）中的嗜热菌蛋白酶活 性可由于制剂赋形剂对酶活性的有利的或不利的影响而略微不同于预期活性。
[0113] 图1中呈现的数据表明，令人惊讶地，表1的嗜热菌蛋白酶/HEC水凝胶的嗜热菌 蛋白酶活性在一个月储存期里保持相同/没有降低。比较起来，不包含非离子型纤维素醚 胶凝剂的水凝胶中的嗜热菌蛋白酶活性在该时期里显著地降低（活性降低超过50%)。不 希望受理论限制，认为作为用于水凝胶的胶凝剂的纤维素醚的非离子结构和弱两亲（即， 纤维素醚的极性部分和非极性部分两者）特征产生有利于嗜热菌蛋白酶的稳定性的环境。
[0114] 对表1、表4和表5中例示的每种水凝胶进行进一步的稳定性研宄并且与多种嗜 热菌蛋白酶制剂进行比较，所述嗜热菌蛋白酶制剂包括乳膏（水包油乳液）、无水凝胶（泊 洛沙姆）、水凝胶（聚丙烯酸酯-卡波普）和多种其它水凝胶基质（例如，聚季铵盐-10)。 该研宄的结果提供于表1和表4-19的描述中。作为 本发明的非限制性水凝胶的表1、4和 5优于所有其它测试的嗜热菌蛋白酶制剂。这些其它制剂的初始活性小于目标量的85%， 并且一些最初甚至是目标量的0%。
[0115] 用于确定表1和表4-19中的水凝胶的嗜热菌蛋白酶活性（稳定性）的方法是 酪蛋白消化法：通过测量消化的酪蛋白片段在消化后相对于参考标准的吸光度增加来确 定嗜热菌蛋白酶活性。将嗜热菌蛋白酶水凝胶（250mg)溶解于25ml的TBS缓冲液（50mM Tris, IOOmM NaCl, 13. 5mM CaCl2, pH = 7. 4)中。在溶解后，使用 TBS 将溶液以 1:10 稀释。 使用嗜热菌蛋白酶原材料和TBS制备标准溶液，制备为一系列的浓度。底物是酪蛋白溶液 (2g于100mL磷酸盐缓冲液50mM Na2HPO4* )。消化程序如下：将2. 5ml酪蛋白溶液、1.0 ml 分析物或标准物在水浴中在37°C孵育30min。在消化后，添加终止溶液I. 5ml三氯乙酸 (TCA，30g于80ml DI水中）。制得如下的空白溶液：2. 5ml酪蛋白溶液、I. 5ml TCA和1.0 ml 分析物或标准物（在TCA后添加）。使样品在37°C保持45分钟，之后通过0. 45 μ m尼龙过 滤器（nylon filter)过滤并且在280nm进行分光光度法分析。
[0116] 通过使用三阶多项式曲线拟合来计算嗜热菌蛋白酶的标准曲线。使用标准曲线计 算嗜热菌蛋白酶在不同的储存条件下在每种制剂中的量。
[0117] 通过以下计算靶％ :
[0118] 靶％=(测试的活性单位/g制剂）*10(V(以mg表示的嗜热菌蛋白酶标准物的测 试的活性单位*制剂中的嗜热菌蛋白酶浓度，mg/g)。
[0119] 图2提供另外的嗜热菌蛋白酶稳定性测定，其中测试了来自表1的水凝胶并且使 其经受包括在4°C、室温（20°C到25°C )和40°C持续6个月、9个月、12个月、18个月和24 个月的储存条件。水凝胶在室温下稳定，如通过活性在6个月、9个月、12个月、18个月和 24个月降低小于20% (即，保持至少80%的活性）所示。类似地，水凝胶在4°C储存后稳 定24个月。当在40°C的升高温度下储存18个月时，大约55-60%的嗜热菌蛋白酶保持稳 定，并且当在40°C的升高温度下储存24个月时，40%的嗜热菌蛋白酶保持稳定一这等同于 水凝胶的长期贮存期/室温储存条件，因为使用升高的温度来证实给定产品在较短测试期 内的贮存期稳定性。这也解释了当在40°C储存时在24个月时稳定性损失的增加。
[0120] 实施例3
[0121] (猪烧伤伤口的体内清创）
[0122] 评价表2和表3中的水凝胶在对猪的烧伤伤口进行清创方面的功效。在该体内 研宄中，在猪的背部上产生烧伤伤口。将猪麻醉，用剪刀和剃刀剃光躯体，并且用vedadine 洗涤。然后进行异丙基冲洗以对手术区域进行灭菌。在每头猪的背部上产生20个2cm伤 口。使用在砂浴中加热到100°C的实心黄铜棒在皮肤上保持45秒来产生伤口。使伤口干 燥5日，给焦痂留出形成时间，在焦痂形成期间每隔一日更换保护性泡沫敷料。在焦痂形成 后，并且对于处理每日地，将伤口用盐水清洗，拍照，根据处理方案进行处理，并且用不粘敷 料（用盐水预先湿润）包扎，所述不粘敷料被Transpore胶带和封闭性第二敷料固定。利 用费雪精确检验（Fisher' s Exact test)来确定完全清创的焦痂数的统计学显著性。
[0123] 在焦痂形成后，用以下中的任一种一日一次地处理所有伤口 ：木瓜蛋白酶/尿素 软膏（具有2. 5 %木瓜蛋白酶和10 %尿素）；SANTYL胶原酶软膏；稀嗜热菌蛋白酶水凝胶 (表2);稠嗜热菌蛋白酶水凝胶（表3);或水凝胶安慰剂（即，缺乏嗜热菌蛋白酶的水凝 胶）。如图3中所示，在用表2和表3的嗜热菌蛋白酶水凝胶处理三日后，20%的伤口被完 全清创。在三日时间点，在用木瓜蛋白酶/尿素软膏或SANTYL胶原酶软膏处理后，没有伤 口被完全清除。在4日或5日后，在用表2和表3的嗜热菌蛋白酶水凝胶处理后，30-35% 的伤口被完全清创，而在用木瓜蛋白酶/尿素软膏处理后，仅5%的伤口被完全清创。在用 SANTYL胶原酶软膏处理5日后，没有伤口被完全清创。
【主权项】
1. 一种水凝胶，其包含： (a) 包括非离子型纤维素醚的亲水性胶凝剂；和 (b) 活性嗜热菌蛋白酶， 其中当在室温下储存6个月时，所述嗜热菌蛋白酶的蛋白水解活性不降低超过20%。2. 根据权利要求1所述的水凝胶，其中当在室温下储存6个月时，所述嗜热菌蛋白酶的 所述蛋白水解活性不降低超过10%。3. 根据权利要求1所述的水凝胶，其中当在室温下储存24个月时，所述嗜热菌蛋白酶 的所述蛋白水解活性不降低超过10%。4. 根据权利要求1-3中任一项所述的水凝胶，其中所述非离子型纤维素醚是羟烷基纤 维素醚。5. 根据权利要求4所述的水凝胶，其中所述羟烷基纤维素醚是羟乙基纤维素、羟丙基 纤维素或羟丙基甲基纤维素或其任一组合。6. 根据权利要求1-5中任一项所述的水凝胶，其包含0. 1 % w/w到10. 0% w/w或0. 1 % w/w到5% w/w的所述非离子型纤维素醚。7. 根据权利要求1所述的水凝胶，其中所述非离子型纤维素醚包含羟乙基纤维素，并 且其中所述水凝胶包含2. 5% w/w到4. 5% w/w的所述羟乙基纤维素。8. 根据权利要求1所述的水凝胶，其中所述非离子型纤维素醚包含羟丙基纤维素，并 且其中所述水凝胶包含〇. 01% w/w到10% w/w的所述羟丙基纤维素。9. 根据权利要求1所述的水凝胶，其中所述非离子型纤维素醚是羟丙基甲基纤维素， 并且其中所述水凝胶包含I. 5w/w到2. 5% w/w的所述羟丙基甲基纤维素。10. 根据权利要求1-9中任一项所述的水凝胶，其包含0. 1 % w/到5% w/w或0. 5% w/ 到1% w/w的所述嗜热菌蛋白酶。11. 根据权利要求1-10中任一项所述的水凝胶，其进一步包含具有7. 0到8. 0或约7. 5 的pH的缓冲液。12. 根据权利要求1-11中任一项所述的水凝胶，其中所述水凝胶具有15, OOOcps到 100, OOOcps的粘度，如利用Brookfield RV粘度计、具有小样品接头的转子14以IOrpm在 室温下以30秒读取所测量。13. 根据权利要求1-12中任一项所述的水凝胶，其中所述水凝胶进一步包含金属盐。14. 根据权利要求13所述的水凝胶，其中所述金属盐是氯化钠或氯化钙或其混合物。15. 根据权利要求1-14中任一项所述的水凝胶，其中所述水凝胶进一步包含防腐剂。16. 根据权利要求15所述的水凝胶，其中所述防腐剂是对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯 甲酸丙酯或苯氧乙醇、或其混合物。17. 根据权利要求1-16中任一项所述的水凝胶，其中所述嗜热菌蛋白酶在所述水凝胶 内溶解。18. 根据权利要求1-16中任一项所述的水凝胶，其中所述嗜热菌蛋白酶悬浮于所述水 凝胶内。19. 根据权利要求1-16中任一项所述的水凝胶，其中所述嗜热菌蛋白酶部分地溶解和 部分地悬浮于所述水凝胶内。20. -种对伤口进行清创的方法，其包括对需要清创的伤口局部施用根据权利要求 1-19中任一项所述的组合物。21. 根据权利要求20所述的方法，其中所述伤口是慢性伤口。22. 根据权利要求21所述的方法，其中所述慢性伤口是糖尿病性足部溃疡、静脉性腿 部溃疡、动脉性腿部溃疡、褥疮性溃疡、淤积性溃疡、皮肤性溃疡、烧伤或压力性溃疡。23. 根据权利要求20-22中任一项所述的方法，其中所述伤口包括坏死组织。24. 根据权利要求23所述的方法，其中所述坏死组织是焦痂。25. -种用于使嗜热菌蛋白酶稳定的方法，其包括制备根据权利要求1-19中任一项所 述的水凝胶。
【专利摘要】本发明公开了一种水凝胶，所述水凝胶包含包括非离子型纤维素醚的亲水性胶凝剂和活性嗜热菌蛋白酶，其中当在室温下储存6个月时，所述嗜热菌蛋白酶的蛋白水解活性不降低超过20％。
【IPC分类】A61K38/48, A61P17/02, A61K47/02, A61K9/06, A61K9/00, A61K33/14, A61K47/38, A61K47/10
【公开号】CN104884079
【申请号】CN201380069305
【发明人】石磊, A·乔瓦诺维奇, D·卡森
【申请人】史密夫和内修公司
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2013年11月14日
【公告号】CA2890757A1, EP2919805A1, US20150283217, WO2014078581A1