经鼻流感疫苗组合物的制作方法

经鼻流感疫苗组合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种经鼻粘膜喷雾给药型流感疫苗组合物。
【背景技术】
[0002] 流感为由流感病毒引起的急性呼吸器传染病，尤其在冬季，每年均会流行。另外， 有时成为世界性的大流行，因而重症化而至死亡的情况也不少。对于流感，已知有通过接种 流感疫苗而具有一定的预防效果，在流行时期之前广泛地进行其接种。
[0003] 在日本，流感疫苗仅皮下接种流感病毒抗原的灭活蛋白质成分的流感疫苗被认 可，目前，该裂解疫苗被用作季节性流感疫苗。这样的皮下接种型疫苗在肺炎等的流感的 重症化预防方面有效性高，但作为流感病毒的感染部位的上呼吸道粘膜中的抗体诱导能力 低，感染防御效果不能说充分。另外，也存在观察到注射给药导致的疼痛或接种局部的炎症 等导致的副作用的问题点。
[0004] 从这样的问题点出发，迄今为止，从多种多样的侧面进行了许多尝试，作为新的疫 苗接种方法，经鼻给药型疫苗备受瞩目。但是，报道有：在将目前被通用的裂解疫苗照原样 经鼻给药的情况下，在实验动物及人中无法诱导对流感病毒的良好的免疫应答。
[0005] 其中，将大肠杆菌易热性毒素用于佐剂的世界上最早的裂解疫苗的经鼻给药型流 感疫苗在瑞士获得认可，从2000年10月开始出售[Berna Biotech社（瑞士）制、商品名 Nasalflu]，但由于佐剂的毒性，在2004年2月临床使用被中止。另外，在专利文献1中也 公开有含有佐剂的经鼻给药型流感疫苗，虽显示通过含有佐剂而提高免疫诱导能力，但在 面临实用化时，担心使用的佐剂的毒性。
[0006] 另外，在经鼻给药时，对于复杂的鼻腔内的构造，谋求使流感疫苗广范围地遍及并 长久展布及滞留，必须以专利文献2所示的基剂中的喷雾方式进行给药等。
[0007] 如上所述，迫切期望从皮下或肌肉内等接种的现有的流感疫苗出发，进行作为新 一代流感疫苗的经鼻给药型疫苗的开发和实用化，但如何抑制为了提高免疫诱导能力而使 用的佐剂的毒性等，在面临实用化方面存在各种问题。
[0008] 现有技术文献
[0009] 专利文献
[0010] 专利文献 1:TO2010/114169
[0011] 专利文献 2:W02007/123193

【发明内容】

[0012] 本发明的目的在于，提供一种使用以前被认可并使用的流感病毒灭活全粒子疫苗 作为抗原、不使用佐剂、以更少的抗原量的有效且副作用反应小的经鼻粘膜喷雾给药型流 感疫苗组合物及其制造方法以及流感的预防方法。
[0013] 本发明人等鉴于上述问题点，进行了潜心研宄，结果发现，通过将含有羧基乙烯基 聚合物的经鼻粘膜喷雾给药凝胶基剂与流感病毒灭活全粒子疫苗组合，可不使用佐剂而提 高对人类的免疫诱导能力，其中该经鼻粘膜喷雾给药凝胶基剂为了附加喷雾性能而从外部 赋予剪切力进行了处理，直至完成本发明。即，本申请发明如下所示。
[0014] [1] -种经鼻粘膜喷雾给药型流感疫苗组合物，其特征在于，包含：
[0015] ⑴流感病毒灭活全粒子、以及
[0016] (ii)为了附加喷雾性能而从外部赋予剪切力处理后的含有羧基乙烯基聚合物的 凝胶基剂，
[0017] 并且所述流感疫苗组合物不含有佐剂。
[0018] [2]根据[1]所述的经鼻粘膜喷雾给药型流感疫苗组合物，其中，（i)的流感病毒 灭活全粒子，每1种疫苗病毒株为1~500 μ gHA/mL。
[0019] [3]根据[1]或[2]所述的经鼻粘膜喷雾给药型流感疫苗组合物，其中，含有 0. lw/v%~1.0 w/v%的羧基乙烯基聚合物。
[0020] [4]根据[1]~[3]中任一项所述的经鼻粘膜喷雾给药型流感疫苗组合物，其中， 其使用为了附加下述喷雾性能而从外部赋予剪切力进行了处理的含有羧基乙烯基聚合物 的喷雾给药凝胶基剂：（1)制剂粒度分布范围、（2)喷雾密度均匀性、和/或（3)喷射角度控 制。
[0021] [5]根据[1]~[4]中任一项所述的经鼻粘膜喷雾给药型流感疫苗组合物，其中， 其使用〇. 5w/v%~2. Ow/v%的含有羧基乙烯基聚合物的凝胶基剂，为了附加作为喷雾性 能的（1)制剂粒度分布范围、（2)喷雾密度均匀性、和/或（3)喷射角度控制，从外部赋予 剪切力进行处理，得到喷雾给药凝胶基剂之后，与含有流感病毒灭活全粒子的病毒原液在 不赋予应力的条件下在短时间内均匀地混合而得到。
[0022] [6]根据[1]~[5]中任一项所述的经鼻粘膜喷雾给药型流感疫苗组合物，其中， 其使用对含有羧基乙烯基聚合物的基剂从外部赋予剪切力而附加有下述喷雾性能的喷雾 给药凝胶基剂而制造：（1)在制剂粒度分布中，制剂平均粒径在30 μπι~80 μπι的范围，粒 度分布为80%以上在IOym~IOOym的范围，（2)喷雾密度成为没有偏斜的均等的全锥 形，（3)喷射角度控制在30°~70°的范围。
[0023] [7]根据[1]~[5]中任一项所述的经鼻粘膜喷雾给药型流感疫苗组合物，其中， 其使用对含有羧基乙烯基聚合物的基剂从外部赋予剪切力而附加有下述喷雾性能的喷雾 给药凝胶基剂而制造：（1)在制剂粒度分布中，制剂平均粒径在40 μπι~70 μπι的范围，粒 度分布为90%以上在IOym~IOOym的范围，（2)喷雾密度成为没有偏斜的均等的全锥 形，（3)喷射角度控制在40°~60°的范围。
[0024] [8]根据[1]~[7]中任一项所述的经鼻粘膜喷雾给药型流感疫苗组合物，其中， 其为了能够使用不具有泵功能的可喷雾的设备进行喷雾给药，而使用含有羧基乙烯基聚合 物的喷雾给药凝胶基剂，
[0025] 该喷雾给药凝胶基剂为了附加下述喷雾性能而被从外部赋予剪切力进行了处理： (1)制剂粒度分布范围、（2)喷雾密度均匀性、（3)喷射角度控制。
[0026] [9] 一种流感的预防方法，其包括使用可将粘稠的制剂从各鼻孔喷雾至鼻腔内粘 膜的设备，将[1]~[8]中任一项所述的经鼻粘膜喷雾给药型流感疫苗组合物给药至需要 该组合物的对象。
[0027] [10] [1]~[8]中任一项所述的经鼻粘膜喷雾给药型流感疫苗组合物用于预防流 感的用途。
[0028] 根据本发明，可以提供一种以流感病毒灭活全粒子作为有效成分、且不使用佐剂、 以更少的抗原量诱导有效的免疫应答、且由于不使用佐剂、因此副作用小的经鼻粘膜喷雾 给药型流感疫苗组合物，可以可靠地对付流感的流行。
[0029] 本发明的经鼻粘膜喷雾给药型流感疫苗组合物由于含有为了附加喷雾性能而从 外部赋予剪切力进行了处理的包含羧基乙烯基聚合物的经鼻粘膜喷雾给药凝胶基剂，因 此，通过广泛且长久地展布、滞留于鼻腔粘膜，可以以更少的抗原量诱导有效的免疫应答。
[0030] 根据本发明的经鼻粘膜喷雾给药型流感疫苗组合物的制造方法，可以提供一种经 鼻粘膜喷雾给药型流感疫苗组合物，其由于可不赋予应力且在短时间内处理，因此，可以良 好地维持病毒灭活全粒子的抗原性，诱导有效的免疫应答，且副作用小。
[0031] 予以说明，在本发明中，虽不含有作为免疫增强剂的佐剂，但可以提供与包含流感 病毒疫苗和佐剂的组合物同等、或更强的上呼吸道粘膜及全身的免疫诱导。
【具体实施方式】
[0032] 本发明提供一种经鼻粘膜喷雾给药型流感疫苗组合物，其特征在于，含有为了附 加喷雾性能而从外部赋予剪切力进行处理的包含羧基乙烯基聚合物的经鼻粘膜喷雾给药 凝胶基剂和流感病毒灭活全粒子，且不使用佐剂。
[0033] 本发明中使用的"为了附加喷雾性能而从外部赋予剪切力进行处理的含有羧基乙 烯基聚合物的凝胶基剂"是指例如在W02007/123193中所公开的"含有皮肤、粘膜附着剂的 凝胶基剂"，为含有羧基乙烯基聚合物、适当含有结冷胶（Gellan Gum)、从外部赋予剪切力 而调整了粘度的基剂。所述的基剂的特征在于，可以通过从外部赋予剪切力而调整为各种 粘度，可以以适合目的的方式控制从喷雾容器的喷射角度、喷射密度。另外，作为对发展中 国家的多人数的接种及对大流行病的防备，通过使用W02007/123193及W02007/123207中 所记载的、作为多次剂量喷雾容器的上方排压无空气式喷雾容器，喷雾容器的给药在任一 角度或角度的范围都可以没有容器内残量地使用，可以实现其目的。在本发明中，通过使用 所述的喷雾给药凝胶基剂，流感病毒灭活全粒子的鼻腔粘膜中的展布性广范围地长时间提 高，由此可提高疫苗的免疫原性。
[0034] 成为经鼻粘膜喷雾给药用基剂的原料的羧基乙烯基聚合物为以丙烯酸为主成分 聚合而得到的亲水性聚合物，为了制备水性凝胶剂，可以没有限定地使用通常使用的医药 品添加物。
[0035] 为了附加喷雾性能而从外部赋予剪切力进行处理的含有羧基乙烯基聚合物的凝 胶基剂的含量，换算成羧基乙烯基聚合物的含量，为〇. 1~l.Ow/v%，优选为0. 3~0. 7w/ v% 〇
[0036] 本发明的疫苗的特征在于，含有流感病毒灭活抗原粒子作为抗原。本发明中使用 的流感病毒灭活全粒子是指：从培养流感病毒而得到的病毒浮游液，保持病毒的形态地精 制的病毒粒子。因此，本发明的流感疫苗是指：除含有亚病毒体（subvirion)的裂解疫苗、 及含有精制HA或NA的亚单位疫苗之外的疫苗，也被称为全粒子疫苗。
[0037] 所述流感病毒灭活全粒子优选为在不存在表面活性剂及醚类的条件下从病毒浮 游液精制的流感病毒灭活全粒子。将包含为了与经鼻粘膜喷雾给药凝胶基剂的混合而被精 制或浓缩的灭活流感病毒全粒子的病毒液称为病毒原液。本发明的疫苗的流感病毒灭活全 粒子的浓度优选每1种疫苗病毒株为1~500 μ gHA/mL (HA换算），更优选20~250 μ gHA/ mL (HA换算）。所述浓度通过测定HA蛋白质的浓度来得到。
[0038] 在本发明中，流感病毒也包含目前已知的全部类型及亚型、及将来被分离、鉴定的 类型及亚型。此外，迄今为止，没有观察到在人类中的流行，从有效地防止今后对人的感染 的观点出发，优选包含选自除流感病毒A型的Hl及H3之外的Hl~16 (即H2及H4~16) 中的亚型和选自Nl~9中的亚型的组合的亚型。这些亚型也被称为新型流感病毒。所述 亚型更优选选自H5、7及9中的亚型和选自Nl~9中的亚型的组合。流感病毒可以为属于 相同的亚型的1种株，也可以为属于相同的亚型的2种以上的株，还可以为属于不同的亚型 的2种以上的株。
[0039] 另外，流感病毒可以为从感染动物或患者中分离的株，也可以为以基因工程的方 式在培养细胞中构建的重组病毒。就流感病毒的培养方法而言，可以将病毒接种于鸡蛋的 尿膜腔内而培养，也可以使培养细胞感染而培养。
[0040] 佐剂是指具有免疫应答的强化或抑制等调节活性的物质的总称，是为了提高抗原 的免疫原性而在疫苗中添加的免疫增强剂，迄今为止研宄了多种物质。另一方面，通过使用 佐剂而提高疫苗的免疫效果，相反，也存在可产生炎症等副作用的缺点。当然，作为经鼻给 药型疫苗的佐剂，虽可列举几个候选者，但由于没有广泛地确认安全性的佐剂，因此，含 有 有效性、安全性被确立的佐剂的经鼻给药型疫苗还没有被认可。
[0041] 如上所述，本发明人发现：通过将具有优异的喷雾性能的鼻腔粘膜展布率高的经 鼻粘膜喷雾给药凝胶基剂相对于所述全粒子疫苗使用，可得到在不使用佐剂下以更少的抗 原量的有效且副作用小的疫苗，通过与即使为粘稠性高的凝胶基剂也可喷雾的设备组合， 所喷雾的制剂平均粒径在30μηι~80μηι的范围（优选、40μηι~70μηι的范围）的适当 的范围、粒度分布80%以上在10 μπι~100 μπι的范围（优选90%在10 μπι~100 μπι的范 围）、以可以给药至鼻腔内的需要的部位的方式使从设备的喷射角度为30°~70°的范围 (优选40°~60°的范围）、并可使喷射密度为全锥形均等地向鼻腔内喷雾给药的经鼻粘 膜喷雾给药型流感疫苗组合物，发现其制作方法以及使用其的预防方法，由此直至本发明。
[0042] 本发明的疫苗除流感病毒灭活全粒子及经鼻粘膜喷雾给药凝胶基剂以外，可以进 而含有作为医药品可允许的载体。作为所述载体，可以使用通常用于疫苗及鼻腔内给药型 制剂的制造的载体，具体而言，可列举食盐水、缓冲化食盐水、右旋糖、水、甘油、等渗水性缓 冲液及它们的组合。另外，其中适当配合保存剂（例如硫汞撒）、等渗剂、PH调整剂、表面活 性剂及灭活剂（例如福尔马林）等。
[0043] 本发明的疫苗为向鼻腔内喷雾给药的疫苗。
[0044] 使用本发明的疫苗，可以预防流感或减轻其症状。
[0045] 作为疫苗的给药方法，可以使用多次剂量喷雾点鼻容器或对两鼻孔不具有泵功能 的可喷雾的设备，一般而言，可以使用不具有泵功能的可喷雾的一次性设备。
[0046] 就给药量而言，考虑对象的年龄、性别、体重等而确定，但作为抗原，每1种疫苗病 毒株通常为可将1~150 μ g HA、优选5~50 μ g HA给药1次或2次以上。优选为多次的 给药，该情况下，优选空出1~4周的间隔进行给药。
[0047] 实施例
[0048] 以下，通过实施例详细地说明本发明，但本发明并不受这些实施例任何限定。
[0049] 用以下所示的方法制备凝胶基剂及3种病毒原液，将两者如以下方式混合，作为 实施例，制备流感疫苗组合物。
[0050] [凝胶基剂的制造]
[0051] 凝胶基剂例1
[0052]
[0053] [含有灭活流感病毒全粒子的病毒原液的制造]
[0054] 病毒原液例1
[0055]
[0056] 病毒原液例2
[0057]
[0058] 病毒原液例3
[0059]
[0060] [凝胶基剂与病毒原液的混合]
[0061] 将上述的凝胶基剂例1和病毒原液例1~3分别以（1 :1)的比率进行混合搅拌， 得到均质的流感疫苗组合物实施例1、实施例2及实施例3。将各实施例中得到的组合物的 组成及其物性值/喷雾性能示于下表。该混合搅拌对病毒灭活全粒子抗原不赋予应力，且 可以通过缓慢的混合搅拌在短时间实现。示出得到的流感疫苗组合物的成分份量及物性值 以及使用适当的设备喷雾时所附加的喷雾性能。
[0062] 实施例1
[0063]
[0064] 实施例2
[0065]
[0066] 实施例3
[0067]
[0068] 适当使用上述实施例中所使用的灭活全粒子抗原，以下表所示的组成制备不含有 凝胶基剂的流感疫苗组合物，制成比较例1~4。
[0069] 比较例1
[0070]
[0071] 比较例2
[0072]
[0073] 比较例3
[0074]
[0075] 比较例4
[0076]
[0077] 免疫应答的分析试验（I)
[0078] 用适当的一次性设备将实施例1及比较例1中制备的流感疫苗组合物分别对4名 成人志愿者，每鼻孔以0. 25mL(两鼻孔合计为45 μ gHA)的量进行2次经鼻喷雾接种，每次 相隔3周。
[0079] 连续地进行采血和鼻腔清洗液的回收，测定对疫苗株的中和抗体值并进行评价。 关于实施例1的结果示于表1，关于比较例1的结果示于表2。
[0080] [表 1]
[0081]
[0082] [表 2]
[0083]
[0084] 将实施例1疫苗（病毒原液+喷雾给药凝胶基剂）和比较例1疫苗（不含有凝胶 基剂的灭活裂解流感病毒抗原组合物）进行比较时，在比较例1疫苗中，血清中和抗体值在 3/4中没有看到抗体值的上升，但在实施例1疫苗中，在4/4中看到抗体值的上升，其程度也 显示为显著。鼻腔清洗液的中和抗体值的上升，在实施例1和比较例1中，在全例中均可看 到，但可以确认其程度以实施例1的一方大。
[0085] 免疫应答的分析试验（2)
[0086] 用适当的一次性设备将实施例2及比较例2中制备的流感疫苗组合物分别对成人 志愿者（实施例2 :25名、比较例2 :24名），以每鼻孔0· 25mL(两鼻孔合计为45 μ gHA)的 量每次相隔3周进行2次，约半年后再追加1次，总计3次经鼻喷雾接种。
[0087] 在接种3次的3周后，进行采血和鼻腔清洗液的回收，测定对疫苗株的中和抗体值 并进行评价。将结果示于表3。
[0088] [表 3]
[0089]
[0090] 将实施例2疫苗（病毒原液+喷雾给药凝胶基剂）和比较例2疫苗（仅病毒原 液）进行比较时，含有喷雾给药凝胶基剂的实施例2疫苗与比较例2疫苗相比，其应答上看 到明显高的上升率。
[0091] 可以认为，处于初次与流感病毒抗原接触的初始的状态（Naive State)的人类 (幼儿?小儿）的免疫应答难以被诱导，在初始的个体中的免疫应答可以通过研宄对没有与 多数健康成人接触、且为高病原性的禽流感病毒（H5N1株）的疫苗的抗体应答来推定。
[0092] 如上述结果所示，发现：即使为初始的被检者，通过进行3次实施例2疫苗（病毒 原液+喷雾给药凝胶基剂）的经鼻接种，在血清及鼻腔清洗液中诱导高水平的中和抗体值。
[0093] 免疫应答的分析试验（3)
[0094] 用适当的一次性设备及皮下接种将实施例3、比较例3及比较例4中制备的流感疫 苗组合物分别对成人志愿者，实施例3-经鼻接种：26名、比较例3-经鼻接种：25名，以每 鼻孔0. 25mL(两鼻孔合计为15 μ gHA/株/0. 5mL)的量进行2次经鼻喷雾接种，每次相隔3 周，以及比较例4 (现行疫苗）-皮下接种：38名，以0. 5mL (15 μ gHA/株/0. 5mL)的量皮下 接种1次。
[0095] 在1次接种或2次接种3周后，进行采血和鼻腔清洗液的回收，测定对疫苗株的中 和抗体值，并进行评价。将结果示于表4。
[0096] [表 4]
[0097]
[0098] 将实施例3疫苗（病毒原液+喷雾给药凝胶基剂）的经鼻接种和比较例3疫苗 (仅病毒原液）的经鼻接种及比较例4疫苗（目前在日本所使用的皮下接种疫苗）的皮下 接种进行比较时，含有喷雾给药凝胶基剂的实施例3疫苗的经鼻接种与比较例3疫苗的经 鼻接种及比较例4疫苗的皮下接种（现行疫苗）相比，其应答上看到明显高的上升率。
【主权项】
1. 一种经鼻粘膜喷雾给药型流感疫苗组合物，其特征在于，包含： (i) 流感病毒灭活全粒子、以及 (ii) 为了附加喷雾性能而从外部赋予剪切力处理后的含有羧基乙烯基聚合物的凝胶 基剂， 并且所述流感疫苗组合物不含有佐剂。2. 根据权利要求1所述的经鼻粘膜喷雾给药型流感疫苗组合物，其中，（i)的流感病毒 灭活全粒子按照每1种疫苗病毒株为1~500 y gHA/mL。3. 根据权利要求1或2所述的经鼻粘膜喷雾给药型流感疫苗组合物，其中，含有0.1 w/ v%~1.0 w/v%的羧基乙烯基聚合物。4. 根据权利要求1~3中任一项所述的经鼻粘膜喷雾给药型流感疫苗组合物，其中， 其使用为了附加下述喷雾性能而从外部赋予剪切力进行了处理的含有羧基乙烯基聚合物 的喷雾给药凝胶基剂：（1)制剂粒度分布范围、（2)喷雾密度均匀性、和/或（3)喷射角度控 制。5. 根据权利要求1~4中任一项所述的经鼻粘膜喷雾给药型流感疫苗组合物，其中，其 使用含有〇. 5w/v%~2. Ow/v%的羧基乙烯基聚合物的凝胶基剂，为了附加作为喷雾性能 的（1)制剂粒度分布范围、（2)喷雾密度均匀性、和/或（3)喷射角度控制，从外部赋予剪 切力进行处理，得到喷雾给药凝胶基剂之后，与含有流感病毒灭活全粒子的病毒原液在不 赋予应力的条件下在短时间内均匀地混合而得到。6. 根据权利要求1~5中任一项所述的经鼻粘膜喷雾给药型流感疫苗组合物，其中，其 使用对含有羧基乙烯基聚合物的基剂从外部赋予剪切力而附加有下述喷雾性能的喷雾给 药凝胶基剂而制造：（1)在制剂粒度分布中，制剂平均粒径在30 ym~80 ym的范围，粒度 分布为80%以上在IOym~IOOym的范围，（2)喷雾密度成为没有偏斜的均等的全锥形， (3)喷射角度控制在30°~70°的范围。7. 根据权利要求1~5中任一项所述的经鼻粘膜喷雾给药型流感疫苗组合物，其中，其 使用对含有羧基乙烯基聚合物的基剂从外部赋予剪切力而附加有下述喷雾性能的喷雾给 药凝胶基剂而制造：（1)在制剂粒度分布中，制剂平均粒径在40 ym~70 ym的范围，粒度 分布为90%以上在IOym~IOOym的范围，（2)喷雾密度成为没有偏斜的均等的全锥形， (3)喷射角度控制在40°~60°的范围。8. 根据权利要求1~7中任一项所述的经鼻粘膜喷雾给药型流感疫苗组合物，其中，其 为了能够使用不具有泵功能的可喷雾的设备进行喷雾给药，而使用含有羧基乙烯基聚合物 的喷雾给药凝胶基剂， 该喷雾给药凝胶基剂为了附加下述喷雾性能而被从外部赋予剪切力进行了处理：（1) 制剂粒度分布范围、（2)喷雾密度均匀性、（3)喷射角度控制。9. 一种流感的预防方法，其包括使用可将粘稠的制剂从各鼻孔喷雾至鼻腔内粘膜的设 备，将权利要求1~8中任一项所述的经鼻粘膜喷雾给药型流感疫苗组合物给药至需要该 组合物的对象。10. 权利要求1~8中任一项所述的经鼻粘膜喷雾给药型流感疫苗组合物用于预防流 感的用途。
【专利摘要】本发明涉及一种经鼻粘膜喷雾给药型流感疫苗组合物，其特征在于，包含流感病毒灭活全粒子抗原及含有羧基乙烯基聚合物的凝胶基剂，且不含有佐剂。
【IPC分类】A61K39/145, A61P31/16, A61K9/06, A61K9/72, A61K47/32
【公开号】CN104884086
【申请号】CN201380068031
【发明人】长谷川秀树, 铃木忠树, 相内章, 上下泰造, 宫崎隆
【申请人】日本国立感染症研究所, 东兴药品工业株式会社
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2013年10月23日
【公告号】CA2894223A1, EP2939692A1, WO2014103488A1