包含单一可变域和甲磺酸卡莫司他(cm)的组合物的制作方法

包含单一可变域和甲磺酸卡莫司他(cm)的组合物的制作方法
【专利说明】包含单一可变域和甲磺酸卡莫司他（CM)的组合物
【背景技术】
[0001] 绝大多数生物药物（尤其是治疗性抗体及其片段）通过胃肠外途径（例如静脉或 皮下注射）进行给药。这些给药途径通常是不方便且痛苦的，这降低了患者的顺应性，尤其 是当需要每日多次注射时。对于保健医疗提供者而言，在工作人员的时间、储存和设备方 面，这些生物药物也是花费巨大的。
[0002] 口服给药生物药物将克服许多的这些缺点，但也具有其自身的问题。具体地，这些 分子易在胃和肠的蛋白酶富集的环境中发生蛋白降解。
[0003] 重点是，对治疗胃肠（GI)道疾病的口服药物存在需求。尤其是对以低剂量使用的 药物存在需求，以降低系统毒性的风险。
[0004] 因此，迫切地需要稳定蛋白以便使它们抵御胃肠道的蛋白酶富集的环境，从而促 成成功口服给药生物药物。
[0005] 发明概沐
[0006] 本发明提供了组合物（任选地药物组合物），其包含甲磺酸卡莫司他（camostat mesylate)和单一可变域。
[0007] 提供了用作药物的本发明的组合物。还提供了本发明的组合物在制备药物中的用 途。尤其是所述组合物是口服给药的。
[0008] 本发明提供了治疗胃肠道病症的方法，其包括以下步骤：向有此需要的患者给药 (任选地口服给药）本发明的组合物。
[0009] 本发明还提供了稳定在蛋白酶富集的溶液中的单一可变域的方法，其包括将该单 一可变域配制于包含甲磺酸卡莫司他的组合物中，在该组合物暴露于蛋白酶富集的溶液之 刖。
【附图说明】
[0010] 图1显示了在模拟肠液（SIF)中培养的一组具有不同转变中点（transition midpoint) (Tm)的 dAb(TM)的半衰期。
[0011] 图2显示了在SIF中培养的一组高Tm的dAb(TM)的半衰期。
[0012] 图3显示了在存在或不存在CM的模拟肠液（SIF)中培养的一组具有不同转变中 点（Tm)的dAb(TM)的半衰期。
[0013] 图4显示了在存在或不存在CM的SIF中培养的一组高Tm的dAb(TM)的半衰期。
[0014] 图5显示了具有相同的预期胰蛋白酶切割位点但是不同Tm的两个dAb(TM)的半衰 期。将该dAb(TM)用存在和不存在CM时的胰蛋白酶培养。
[0015] 图6显示了在不存在（a)和存在（b)CM的十二指肠内给药后的不同时间点，从肠 组织回收的dAb(TM)D0M101的量。结果表示为纳克/克组织。
[0016] 图7显示了在存在和不存在CM的结肠内给药后，从大肠回收的dAb(tm)D0M101的 量。结果表示为纳克/克组织。
[0017] 发明详沐
[0018] 本发明提供了对上述问题的解决方法。本发明提供了稳定单一可变域的方法。提 供了包含单一可变域和甲磺酸卡莫司他的组合物（尤其是药物组合物），以及所述组合物 作为药物和在治疗方法中的用途。本文的实施例表明，甲磺酸卡莫司他（CM)可用于在禁食 的模拟肠液以及在小肠和大肠中稳定单一可变域（例如域抗体(TM)或dAb (TM))，并因此支持 了 CM在口服递送生物药物以局部治疗GI病症（例如克罗恩病或溃疡性结肠炎）以及直接 作用于肠黏膜免疫系统中的用途。
[0019] 甲磺酸卡莫司他（CAS号：59721-29-8)的化学名为4-[[4_[(氨基亚氨基甲基） 氨基]苯甲酰基]氧基]苯乙酸2-(二甲基氨基）-2-氧代乙基酯甲磺酸盐且其可从例 如Sequoia Research Products获得。甲磺酸卡莫司他（CM)是有口服活性的丝氨酸蛋 白酶抑制剂，其在日本和韩国被批准用于治疗胰腺炎和术后食道反流（Foipan Product information sheet ；Takasugi 等人，Digestion 1982,24:36 - 41 ;Kono 等人，Am J Surg. 2005S印，190(3) :412-7)。CM具有广谱抑制，包括胰蛋白酶、凝血酶、激肽释放酶和纤 溶酶（Tamura 等人，1977, Biochimica et Biophysica Acta 484,417 - 422)。CM 在肠内的 代谢尚不明确，但是CM的代谢产物GBPA本身是有活性的（Beckh等人，Res Exp Med，1987， 187:401-406)。
[0020] 术语"单一可变域"是指折叠的多肽域，其包含以抗体可变域为特征的序列。因此， 其包括完整的抗体可变域（例如VH、VHH和VL)和经修饰的抗体可变域（例如，抗体可变域 中的一个或多个环被不是以抗体可变域为特征的序列代替，或者抗体可变域已被截短或包 含N-或C-端延长），以及可变域片段，其至少保留了全长结构域的结合活性和特异性。单 一可变域能够独立地结合不同可变区或可变域的抗原或表位。"域抗体?"或"dAb(TM) "可被 认为与"单一可变域"相同。单一可变域可为人单一可变域，但也包括源自其他物种（例如 啮齿类动物（例如，如WO 00/29004所公开）、铰口鲨和骆驼科动物的VHH dAb?)的单一可 变域。骆驼科动物的VHH是免疫球蛋白单一可变域，其衍生自以下物种，包括：骆驼、美洲驼 羊、羊驼、单峰骆驼和大羊驼，其产生天然缺乏轻链的重链抗体。可根据本领域可用的标准 技术将该VHH结构域人源化，且这种结构域被认为是"单一可变域"。本文所用的VH包括骆 驼科动物的VHH结构域。
[0021] 抗祀点（anti-target)单一可变域，例如抗-TNFa单一可变域，是指结合至所述 靶点（例如TNF a)的单一可变域。所述靶点可为任意合适的靶点。在一个实施方式中，本 发明的单一可变域靶向以下的任一种：TNF a、IL-23、LAG-3、IL-6、IL-13、IL-18、TSLP、CD3 或前述任一个的受体，例如TNF a受体（例如TNFR a RI或TNFR a RH)、IL-23受体、LAG-3 受体、IL-6受体、IL-13受体、IL-18受体、TSLP受体或CD3受体。在一个实施方式中，本发 明的单一可变域靶向趋化因子或趋化因子受体，例如谷氨酸-亮氨酸-精氨酸受体，即ELR 受体（例如包含SEQ ID NO : 12和19-22所示的氨基酸序列的受体）。
[0022] 亲和力是一个分子（例如本发明的单一可变域）与另一个分子（例如其靶点）在 单一结合位点处结合的力。单一可变域与其靶点的结合亲和力可通过平衡方法（例如酶联 免疫吸附测定（ELISA)或放射免疫测定（RIA))或动力学（例如BIAC0RE?分析）进行测 定。
[0023] 在一个实施方式中，所述单一可变域-靶点间的相互作用的平衡解离常数（KD)为 IOOnM或更小、IOnM或更小、2nM或更小或InM或更小。或者，该KD可在5至IOnM之间；或 1至2nM之间。该KD可在IpM至500pM之间；或500pM至InM之间。本领域技术人员将理 解，KD数值越小，结合越强。KD的倒数（即1/KD)为具有单位M4的平衡结合常数（KA)。本 领域技术人员将理解，KA数值越大，结合越强。
[0024] 解离速率常数（kd)或"解离速率（off-rate) "描述了单一可变域-靶点复合物 的稳定性，即每秒发生衰变的复合物的比例。例如，〇. OlsH的kd等于每秒有1 %的复合物 发生衰变。在一个实施方式中，该解离速率常数（kd)为IxKT3iT1或更小、1x10 ΛΓ1或更小、 ΙχΙΟ?或更小，或1x10 Λ-1或更小。该kd可在1x10-Υ1至1x10 Λ-1之间；或1x10 ΛΓ1至 1x10 3S 1 之间。
[0025] 在整个申请中所用的术语"中和"是指，在存在本文所述的单一可变域的情况下， 靶点的生物 活性相比于不存在该单一可变域的靶点的生物活性有所降低，无论是在体外还 是体内。中和可归因于以下的一种或多种：阻断所述靶点与其受体结合、防止靶点激活其受 体、下调该靶点或其受体，或影响效应器的功能。在一个实施方式中，本发明的单一可变域 中和其靶点。
[0026] "转变中点"或"Tm"是指这样的温度，其中50%该单一可变域处于其天然构象而 另外50%是变性的。在一个实施方式中，所述单一可变域具有高Tm。具体地，该Tm大于或 等于约66°C。单一可变域的热稳定性（包括Tm)可使用差示扫描量热法（DSC)进行测定。
[0027] 本文所用的"口服给药"是指经口给药本文公开的组合物。本发明的组合物通常 经吞咽并进入到其发挥作用的胃肠（GI)道。有少量可被吸收穿过肠粘膜进入循环系统用 于全身作用。吸收可从口（口腔）和胃开始，但是通常发生在小肠中。
[0028] "胃肠（GI)道"包括上消化道（upper GI tract) : 口、咽、食道和胃；和下消化道 (lower GI tract):小肠、十二指肠、空肠、回肠、大肠（盲肠、结肠，包括升结肠、横结肠、降 结肠和乙状结肠）、直肠和肛门；以及胆、肝和胰。本发明的组合物可靶向任一或多个上述 GI道区域。在一个实施方式中，组合物革El向小肠。在一个实施方式中，组合物革El向大肠。
[0029] 本文所公开的药物组合物可治疗任一或多种本文所描述的人疾病。在一个实施 方式中，所述药物组合物包含单一可变域，其任选地与一种或多种药学上可接受的载体和/ 或赋形剂组合。
[0030] 这样的组合物包含药学上可接受的载体，该载体是已知的且符合可接受的药 学实践的要求，参见例如 Remingtons Pharmaceutical Sciences，第 16 版（1980)Mack Publishing Co.。制备这样的药物组合物的方法是本领域技术人员熟知的。
[0031] 在一个实施方式中，本发明的药物组合物是口服给药的。包括多种剂型，包括液体 (溶液、混悬液（水性或油性）和乳液）、半固体（糊剂）、薄膜和固体（片剂、锭剂、胶囊、粉 剂、晶体和颗粒）。
[0032] 用于口服给药的液体分散剂可以是糖浆、乳液和混悬液。所述糖浆可包含作为载 体的，例如，蔗糖或蔗糖与甘油和/或甘露醇和/或山梨糖醇。
[0033] 混悬液和乳液可包含作为载体的，例如天然树胶、琼脂、海藻酸钠、果胶、甲基纤维 素、羧甲基纤维素或聚乙烯醇。
[0034] 药物组合物，尤其是固体组合物（例如片剂和胶囊），可为肠溶包衣的。用 于肠溶包衣的材料包括脂肪酸、蜡、虫胶、塑料和植物纤维。合适的肠溶包衣公开于 EURDAGIT? Application Guidelines(第 11版，09/2009)中。
[0035] 给药所述单一可变域的有效剂量和治疗方案可取决于各种因素，例如患者的年 龄、体重和健康状况，以及待治疗的疾病。这些因素是在主治医师的认识范围之内的。对于 选择合适剂量的指导可见于例如Smith等人（1977)Antibodies in human diagnosis and therapy，Raven Press，New York。
[0036] 单一可变域与甲磺酸卡莫司他在本发明的组合物中的比例可约为1:0. 1、1:1、 1:10、1:25、1:50或1:100。在一个实施方式中，单一可变域与甲磺酸卡莫司他在本发明的 组合物中的比例约为1:100。在一个实施方式中，单一可变域与甲磺酸卡莫司他在本发明的 组合物中的比例约为1:10。
[0037] 所述药物组合物可包括所述单一可变域以及其他药物的试剂盒，任选地附有使用 说明。为了方便起见，所述试剂盒可包含预定量的试剂以及使用说明。
[0038] 本发明提供了治疗本文所公开的疾病的方法，其包括以下步骤：向有此需要的患 者给药本发明的组合物。
[0039] 本发明还提供了本文所描述的组合物在制备治疗本文所列疾病和病症的药物中 的用途。可用本发明的组合物治疗的疾病和病症包括胃肠道病症。
[0040] "胃肠道病症"是影响GI道的病症，且其包括肠炎、直肠炎、炎性肠病（IBD)(包括 克罗恩病）、结肠炎（包括溃疡性结肠炎）、乳糜泻、贝赫切特综合征（Behet' s syndrome) 和口腔粘膜炎。在一个实施方式中，所述胃肠道病症为IBD。在一个实施方式中，所述胃肠 道病症为克罗恩病。在一个实施方式中，所述胃肠道病症为溃疡性结肠炎。
[0041] 任何可通过靶向GI道进行治疗的其他疾病均涵盖在通过本公开的方法所治疗的 疾病中。例如，本发明的单一可变域（其结合GI道内的靶点）可能会造成超越GI道的效 果，从而治疗系统疾病。
[0042] 术语"个体"、"受试者"和"患者"在本文中可互换使用。所述受试者通常为人。所 述受试者也可为哺乳动物，例如小鼠、大鼠或灵长类动物（例如狨猴或猴）。所述受试者可 以是非人动物。
[0043] 治疗可以使治疗性的、预防性的（prophylactic)或防范性的（preventative)。所 述受试者将是需要此治疗的个体。需要治疗的那些个体，除了可能在将来发展成特定医学 疾病的个体，可包括已经患有所述疾病的个体。治疗有效量的本文所描述的单一可变域是 有效地改善或减轻该疾病的一种或多种病症或者预防或治愈该疾病的量。
[0044] 提供了稳定在蛋白酶富集的溶液中的单一可变域的方法。该方法包括将该单一可 变域配制于包含甲磺酸卡莫司他的组合物中，在该组合物暴露于蛋白酶富集的溶液之前。
[0045] "蛋白酶富集的"溶液是指包含例如生理学量的蛋白酶（尤其是GI道可见的蛋白 酶）的溶液。蛋白酶是指通过水解多肽链上的一个或多个肽键进行蛋白质水解的酶。两 餐之间，人体内的胰蛋白酶的生理学量为20-50U/ml。餐后消化初期，人体内的胰蛋白酶 的生理学量为60-100U/ml。餐后消化末期，人体内的胰蛋白酶的生理学量为500-1500U/ ml (McConnell 等人，International Journal of Pharmaceutics 364:213_226(2008))〇 在一个实施方式中，在蛋白酶富集的溶液中的胰蛋白酶的量可为任意上述范围。在一个实 施方式中，所述蛋白酶富集的溶液包含大于以下量中的任一个量的胰蛋白酶：20U/ml、30U/ ml、40U/ml、50U/ml、60U/ml、70U/ml、80U/ml、90U/ml、100U/ml、200U/ml、300U/ml、400U/ml、 500U/ml、600U/ml、700U/ml、800U/ml、900U/ml、lOOOU/ml、IlOOU/ml、1200U/ml、1300U/ml、 1400U/ml或1500U/ml。在一个实施方式中，所述蛋白酶富集的溶液可还包含糜蛋白酶和/ 或胰酶。在一个实施方式中，所述蛋白酶富集的溶液包含胰蛋白酶、糜蛋白酶和/或胰酶。 在一个实施方式中，所述蛋白酶富集的溶液为模拟肠液（SIF)。SIF包含胆汁、胰酶和胰蛋 白酶。SIF还可包含氯化钠、氯化钾和氯化钙。在一个实施方式中，所述SIF如实施例中所 述，例如包含实施例1中特定量的蛋白酶。
[0046] 参考实施方式，本发明的说明书以使其清楚和简明的方法进行了描述。其旨在并 应被理解为，实施方式可在不脱离本发明的情况下，随意组合或拆分。 实施例
[0047] 实施例1 :一组域丰片体1111在樽丰以肠、液（SIF)中的固有稳、定十生
[0048] 模拟肠液（SIF)是基于ΤΝ〇-??Μ(τμ)肠模型系统使用的配方进行配制的，但是体积 基本上按比例缩小，如下详述。
[0049] 樽拟肠液（SIF)的制各：
[0050] 胆汁溶液是通过如下制备的：伴随着持续搅拌，缓慢添加2. 0g(+/_0. 02g)胆粉 至 250g (+/-5g)的纯净水中，直至得到澄清溶液。
[0051] 胰酶溶液是通过如下制备的：将2. lg(+/-〇. 2g)的胰酶粉加至150g(+/-3g)的纯 净水中。使用搅拌器，并小心处理以将泡沫减至最少。一旦得到均匀混合物，则将该溶液以 3500rpm离心20分钟，然后将上清液在冰上储存。
[0052] 小肠电解质溶液（SIES)25% (浓缩的）是通过如下制成的：将纯净水加至 250g(+/-5g)氯化钠、30g(+/-0. 5g)氯化钾和15g(+/-0. 3g)无水氯化钙中，从而制成2174g 的总量。一旦所述盐溶解了，用IM氢氧化钠将pH调整至pH7. 0 (+/-0. 5)。
[0053] 然后制备稀释的SIES :使用浓的43. 5 (+/-lg) SIES，加至纯净水中，使总重为 1000 g0
[0054] 胰蛋白酶溶液是通过如下制备的：将200mg(+/-5mg)胰蛋白酶溶于100g(+/-2g) 稀释的SIES中。然后将这个溶液吸取至L 5ml微量离心管（印pendorf tubes)中（每管 Iml)并在-20 °C冷冻。
[0055] 然后制备所述SIF :将25g(+/-0· 3g)的胆汁溶液、12. 5g(+/-0· 3g)胰酶溶液和 12. 5g (+/-0. 5g)的稀释的SIES (胆汁/胰酶/稀释的SIES的比例为2:1:1)混合。然后在 即将使用该溶液前加入1ml的胰蛋白酶溶液。
[0056] 域抗体M的制各
[0057] 使用Vivaspin(?)5003kD MWCO柱将研宄中的域抗体（?) (dAb(?))浓缩至约20mg/ ml。该柱在使用前用PBS进行预清洗，从而将样品回收最大化。浓度通过Nanodrop?确 定，其使用的是摩尔消光系数和分子量选项。
[0058] 反应组成
[0059] dAb?在SIF中的培养是在250 μ 1的最终体积中进行的。掺入该混合物中的dAb ? 的体积使得到lmg/ml的最终浓度。
[0060] 立即取出25 μ 1的等份，并将其储存于干冰中（在0小时时间点）。将反应混合 物在37°C培养，并振荡（IOOrpm)。随后在以下时间点取出25 μ 1的等份：0. 25小时、0. 5小 时、1小时、2小时、4小时、6小时及过夜。将样品在干冰中急冻并在分析前储存于-80°C。
[0061] SDS-PAGE 分析
[0062] 在各时间点，残留于SIF中的dAb(TM)的量是通过SDS-PAGE和光密度测定法测量 的。简而言之，将样品在水和加样缓冲液混合物中稀释至1/10并加热至80°C，持续5min。 将样品迅速冷却，然后将10 μ 1该样品连同制备好的标准品（dAb(TM)的水溶液）和分子量 标记物一起加样至4-12% Novex(?)bis-tris凝胶。将该凝胶以恒定150V在lx MES缓冲 液中运行45分钟，并用Instant Blue(TM)染色过夜，将该蛋白条带可视化。使用Odyssey Li-Cor(TM)凝胶成像系统和相对于Oh时间点的条带的密度（起始量）计算的dAb (TM)的存在 量，进行所得条带的光密度测定。制成时间与dAb(TM)起始量的百分比的指数曲线，并将50% 的dAb(TM)起始量出现的时间设定为其半衰期。
[0063] 使用上述方法，将一组具有不同转变中点（Tm)的dAb(TM)(如表1所示）在SIF中 培养并用SDS-PAGE和光密度测定法分析。对于这些实施例，高Tm dAb(TM)是指具有彡66°C 的Tm的dAb(?)，而低Tm dAb(?)是指具有彡56°C的Tm的dAb (TM)。
[0064] 表1 :具有不同Tm的ClAblal组
[0065]
[0066] 结果如图1所示。这个图是在三个单独天中进行的SIF研宄的组合。具有最高Tm 的dAb(TM)的D0M4显然比所研宄的其他dAb (TM)稳定得多。为了验证是否这是一种趋势，使 用上述方法研宄了另外4种高Tm dAb(TM)，如表2所示。
[0067] 表 2 :高 Tm ClAblal组
[0068]
[0069] 高Tm dAb(TM)组的结果如图2所示。
[0070] 另一 dAb(TM)，D0M8,在SIF中极其稳定。另外三种dAb(TM)就没有那么稳定了。但 是，所测试的五种高Tm dAb(TM)中的四种均比具有低于66°C Tm的dAb(TM)稳定。两种最稳 定的dAb(TM) (D0M4和D0M8)均具有V κ骨架。但是，DOMll也具有V κ骨架，但是要不稳定 得多，因此该骨架可能对于稳定性没那么重要。将DOMll在SIF中培养，该DOMll是在与其 他三种高Tm dAb(TM)不同的条件下培养的。
[0071] 实施例2 :使用甲磺酸卡莫司他对体外域抗体11讲行稳定
[0072] 将在实施例1中所研宄的那组dAb(TM)也在含有甲磺酸卡莫司他（CM，Sequoia Research Products)的SIF中进行培养，以测定是否抑制蛋白酶将提高dAb(TM)的稳定性。 将CM加至上文所述的电解质溶液中，使浓度为350mg/ml (CM是高浓度的，但低于饱和点）， 并温热至50°C使其溶解。将CM加至该SIF/dAb(TM)中，使最终浓度为10mg/ml。所使用的时 间点和后续分析按实施例1所述进行。
[0073] 该结果示于实施例1的结果旁边，用以比较图3和4。添加 CM至该SIF/dAb混合 物中增加了所有（除一个之外）所研宄的dAb(TM)的半衰期。该半衰期延长在所有测试分子 中不是相同的，意味着dAb(TM)的固有性质决定了它们被稳定的能力。此外，尽管高Tm dAb(TM)具有不同的半衰期，但是它们似乎本身更易于用CM进行稳定，因为所有测试的高Tm dAb(TM)的半衰期均延长至超过24小时。
[0074] 实施例3 :对dAb1?1稳定性建樽以及.Tm对域抗体爐固有稳定性的重要性
[0075] 编写perl脚本来扫描胰蛋白酶和糜蛋白酶（存在于胰酶）切割位点的蛋白序列。 然后将半衰期与预期切割位点以及与Tm相关联。
[0076] 在Tm和半衰期之间观察到微弱的正相关（Spearman，0. 58 ;Pearson，0. 31)。但是， 当存在CM时，使用这两种相关测量，在Tm和半衰期之间观察到很强的正相关（Spearman， 0.78;Pearson，(X90)。这表明，Tm越高，该dAb(TM)越易于用CM进行稳定。存在或不存在CM 时，在预期切割位点和半衰期之间未观测到明显的相关性。
[0077] 在建模过程中，观察到两种V κ骨架dAb(TM)均具有相同的预期胰蛋白酶切割位点， 但是在SIF中具有不同的半衰期和不同的Tm。它们是D0M4(半衰期6. 1小时，Tm 72. 8°C ) 和DOMl (半衰期0. 1小时，Tm 55°C )。将这两种dAb(TM)用胰蛋白酶进行培养，该胰蛋白酶 的浓度与在SIF中所使用的浓度相同，但是不含胆盐或胰酶。然后将任何可见的半衰期的 不同均归因于Tm。也将CM添加至该胰蛋白酶/dAb(TM)混合物中。按前述计算半衰期，且结 果如图5所示。
[0078] 在仅存在胰蛋白酶的情况下，D0M4的半衰期比DOMl的半衰期要长得多。在这种 情况下，Tm的差异有可能解释了该分子稳定性的增加。
[0079] 实施例4 :伸用甲磺酸卡草司他来稳宙TNFRl特异件dAb^DOMioi (SEQ ID N0:6)， 其言接给药至禁畲的Han Wistar大鼠的十二指肠中
[0080] 向Han Wistar大鼠给药Img D0M101 (含有或不含IOOmg CM)，以测定在胃肠道中 CM是否能保留dAb(TM)。将 大鼠用异氟烷麻醉剂进行短暂麻醉并进行腹中线切口（midline abdominal incision)以帮助定位十二指肠，用以直接十二指肠内注射（500 μ 1)该剂量制 剂。给药后，缝合该腹部切口，并在该大鼠恢复后，将其送回试验笼。直接给药至十二指肠 绕过了胃中胃液的酸性条件，使得可以直接分析肠道的药代动力学。
[0081] 将动物在以下时间点处死：0. 5、1. 5、3、5、7和18小时（每组三只动物）。
[0082] 取血样，并将肠道解剖出并切成以下组成部分：十二指肠（x2)、空肠（x6)、回肠、 盲肠、结肠（x2)、直肠。
[0083] 将肠的样品使用GentleMACS?解离器在含有清洁剂和蛋白酶抑制剂的裂解缓 冲液中均化。将样品使用TNFRl-特异性MSD(tm)测定筛选D0M101。简而言之，将MSD板用 TNFRl-Fc包被。将板洗涤并用牛血清白蛋白封闭。将组织样品稀释并与标准曲线的dAb(TM)一起添加至该板中，然后在室温培养使之结合。将板洗涤并将硫代-标记-缀合的抗-Vh抗 体添加至孔中。培养完毕之后，将该板洗涤并用MSD读取缓冲液（read buffer)培养。将 所得电化学发光信号在Sector Imager 6000上读取。
[0084] 结果以纳克/克组织描述于图6中。
[0085] 在不含CM的图6(a)中，在十二指肠内仅在0. 5h可检测到dAb(TM)，且在空肠内仅 在长达I. 5h可检测到dAb(TM)。在空肠中检测到了最大量，且在回肠中仅可检测到少量。
[0086] 在含CM的图6(b)中，在整个GI道在给药后的7h内检测到了 dAb(TM)。在稍后的 时间点仅在回肠、盲肠、结肠和直肠中可检测到该dAb(TM)。和之前一样，最大量的dAb(TM)是 在空肠中回收的。尽管可能有肠转移，但是在7h在十二指肠和空肠内可检测到dAb(TM)，这 表明dAb(TM)已穿透肠组织。十二指肠内给药后，在血浆中可检测到低水平的D0M101(小于 总剂量的〇. 1% )，其证实dAb(TM)可穿透组织，数据未显示。
[0087] 实施例5 :伸用甲磺酸卡草司他来稳宙TNFRl特异件dAb^DOMioKsEQ ID N0:6)， 其言接给药至禁畲的Han Wistar大鼠的结肠中
[0088] 向Han Wistar大鼠给药Img D0M101 (含有或不含CM)，以测定在大肠道中甲磺酸 卡莫司他是否也能保留dAb(TM)。简而言之，将大鼠用异氟烷麻醉剂进行麻醉，进行腹中线切 口以帮助定位结肠并将500ul剂量的该剂量制剂直接注射至所述结肠中。给药后，松松地 缝合该腹部切口并将该大鼠保持在异氟烷麻醉剂中并在试验持续过程中进行监控。在这个 实施例中，研宄了两个剂量的CM - IOOmg(按照实施例4)和IOmg/动物。
[0089] 将动物在0.5和3小时处死（每组三只动物）。取血样，并将肠道解剖出并切成以 下组成部分：盲肠、结肠（x2)、直肠。
[0090] 将样品按实施例4所述进行均化和筛选。结果以纳克/克组织表示于图7中。
[0091] 在0· 5h，含有或不含CM时，在盲肠、结肠和直肠（除了 IOmg卡莫司他组）中可检 测到高水平的dAb(TM)。这也解释了为什么在GI道下部分存在低水平的消化酶。在IOmg卡 莫司他组的0. 5h，dAb(TM)在直肠中的缺乏可能是归因于盲肠在这些动物中更高的湿重（数 据未显示）-因此dAb(TM)可在此部分滞留。但是，到3h，相比于在两个CM组中所观测到的， 不含CM的dAb(TM)水平显著降低，尤其是在盲肠和直肠中。低剂量的CM(IOmg)比高剂量的 CM在保留大GI道中的dAb(TM)的方面表现得更为有效。
[0092] 实施例1-5的总结
[0093] 这些实施例证明，甲磺酸卡莫司他与域抗体(TM)的共同给药可用作口服递送这些 分子的新平台。通过加入CM，11个体外研宄的dAb(TM)中的10个均在不同程度上得到稳定。 当通过电脑模拟建模时，存在CM时的半衰期和Tm之间观测到了极强的相关性，意味着Tm 越高，dAb(TM)更易于用CM进行稳定。两种具有相同预期胰蛋白酶切割位点的dAb (TM)的比较 也显示了 Tm对dAb(TM)在SIF中的固有稳定性的重要性。
[0094] 体内研宄也支持了该体外结果，在该体内研宄中，共同给药甲磺酸卡莫司他和 D0M101显著地增加了可从GI道回收的dAb(TM)的量，无论是递送至十二指肠还是结肠。添 加 CM至制剂中使得能够局部递送dAb(TM)至十二指肠或结肠以治疗胃肠道病症，例如克罗恩 病或溃疡性结肠炎。
[0095] 序列用语索引（所有的序列均是氨基酸序列）
[0096]
[0097]
【主权项】
1. 包含甲磺酸卡莫司他和单一可变域的组合物。2. 如权利要求1的组合物，其中所述组合物为药物组合物。3. 如权利要求1或权利要求2的组合物，其中所述组合物是口服给药的。4. 如前述权利要求中任一项的组合物，其中所述单一可变域是抗靶点单一可变域，其 中所述靶点为 TNFa、IL-23、LAG-3、IL-6、IL-13、IL-18、TSLP、CD3、前述任一个的受体或 ELR受体。5. 如前述权利要求中任一项的组合物，其中所述单一可变域中和TNFa、IL-23、 LAG-3、IL-6、IL-13、IL-18、TSLP 或 CD3。6. 如前述权利要求中任一项的组合物，其中所述单一可变域具有大于或等于约66°C 的转变中点（Tm)。7. 如前述权利要求中任一项的组合物，其中所述单一可变域与甲磺酸卡莫司他的比例 约为 1:0. 1、1:1、1:10、1:25、1:50 或 1:100。8. 如前述权利要求中任一项的组合物，其中所述组合物为肠溶包衣的。9. 如前述权利要求中任一项的组合物，其用作药物。10. 如前述权利要求中任一项的组合物在制备药物中的用途。11. 如权利要求9的组合物或如权利要求10的用途，其中所述药物用于治疗胃肠道病 症。12. 如权利要求11的组合物或用途，其中所述胃肠道病症为克罗恩病、结肠炎包括溃 疡性结肠炎、乳糜泻、贝赫切特综合征和口腔粘膜炎。13. 治疗胃肠道病症的方法，其包括以下步骤：向有此需要的患者给药如权利要求1-8 中任一项的组合物。14. 稳定在蛋白酶富集的溶液中的单一可变域的方法，该方法包括将该单一可变域配 制于包含甲磺酸卡莫司他的组合物中，在该组合物暴露于蛋白酶富集的溶液之前。15. 如权利要求14的方法，其中所述单一可变域与甲磺酸卡莫司他的比例约为1:0. 1、 1:1、1:10、1:25、1:50 或 1:100。16. 如权利要求14或15的方法，其中所述蛋白酶富集的溶液为禁食的模拟肠液。17. 如权利要求14或15的方法，其中所述蛋白酶富集的溶液为包含胰蛋白酶、糜蛋白 酶和/或胰酶的溶液。
【专利摘要】本发明提供了稳定单一可变域的方法，尤其是在蛋白酶富集的环境(例如胃和肠)中。提供了包含单一可变域和甲磺酸卡莫司他的组合物(尤其是药物组合物)，以及所述组合物作为药物和在治疗方法中的用途。本发明的组合物尤其用于胃肠道病症(例如克罗恩病或溃疡性结肠炎)的局部治疗，或直接作用于肠黏膜免疫系统。
【IPC分类】A61K39/00, A61K45/00
【公开号】CN104884089
【申请号】CN201380044476
【发明人】S.M.克利夫兰, S.萨洛蒙, C.范克林克斯
【申请人】葛兰素集团有限公司
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2013年8月21日
【公告号】CA2882684A1, EP2887960A2, US20150306058, WO2014030049A2, WO2014030049A3