Cart19用于耗减正常b细胞以诱导耐受的用图

Cart19用于耗减正常b细胞以诱导耐受的用图
【专利说明】CART19用于耗减正常B细胞以诱导耐受的用途
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2012年7月13日提交的美国临时申请号61/671，508的优先权，其内容通过引用整体并入于此。
[0003]发明背景
[0004]使用基因转移技术，T细胞可被遗传改造以在其表面稳定表达赋予独立于主要组织相容性复合物(MHC)的新的抗原特异性的抗体结合域。嵌合抗原受体(CAR)是此方法的应用，该方法将特异性抗体的抗原识别域与CD3-Z链或FcgRI蛋白的胞内域组合成单个嵌合蛋白(格罗斯(Gross)等人，1989《美国科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.)86:10024 - 10028 ;欧文(Irving)等人，1991《细胞》(Cell)64:891 - 901)。目前正在多个学院的医学中心进行测试CAR的临床试验(科恩(Kohn)等人，2011《分子疗法》(Mol.Ther.) 19:432 - 438;耶拿(Jena)等人，2010《血液》(Blood) 116:1035 - 1044)。在大部分癌症中，尚未明确限定肿瘤特异性抗原，但在B细胞恶性肿瘤中，CD19是一种有吸引力的肿瘤靶标。CD19的表达限制于正常的和恶性的B细胞(Uckun等人，1988《血液》(Blood) 71:13 - 29)，CD19是一种广泛认可的用于安全地测试CAR的靶标。尽管CAR能以一种类似于内源T细胞受体的方式引发T细胞活化，到目前为止这种技术的临床应用的主要障碍是CAR+T细胞有限的体内扩增、注射后细胞快速消失和令人失望的临床活性(耶拿(Jena)等人，2010《血液》(Blood) 116:1035 - 1044 ;萨德兰(Sadelain)等人，2009《免疫学新见》(Curr.0pin.1mmunol.)21:215 - 223)。
[0005]CAR介导的T细胞应答可通过增加共刺激域进一步增强。在临床前模型中，发现加入⑶137(4-1BB)信号传导域比只加入⑶3-z链显著增加CAR的抗肿瘤活性和体内留存(米洛内(Milone)等人，2009《分子疗法》(Mol.Ther.) 17，1453 - 1464 ;卡本托尼(Carpenito)等人，2009《美国科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.) 106:3360-3365)。为评估经基因改造以表达此类CAR的T细胞的继承性转移的安全性和可行性，进行了使用多个表达同时包含⑶3-z和4-1BB共刺激域的抗⑶19CAR的自体T细胞(CART19细胞)靶向⑶19+恶性肿瘤的试验性临床试验。三位患者按此方案被治疗。来自这些患者之一的部分发现在(波特(Porter)等人，2011《新英格兰医学杂志》(N.Engl.J.Med.) 365:8)中得以描述，后者报道了此治疗导致肿瘤消退、CART19细胞存留以及延迟性肿瘤细胞溶解综合征的意外出现。也观察到，在被治疗的全部三位患者中，CART19细胞介导了有效的临床抗肿瘤效果。平均每个注射的CAR T细胞和/或其后代在罹患晚期化疗抵抗性慢性淋巴细胞白血病(CLL)的患者体内消除了超过1000个白血病细胞。CART19细胞经历健壮的体内T细胞增殖，在血液和骨髓(BM)中以高水平维持至少6个月，在具有记忆表型的细胞上持续表达功能受体，并维持体内抗CD19效应子功能。然而，仍然不清楚CART19细胞如何避开人宿主的排斥，鉴于CAR19构建物包含鼠序列(抗体决定簇)和CAR19构建物的不同组分之间独特的连接片段。
[0006]因此，本领域仍存在关于CART19细胞的长期留存和这些细胞为何不被人宿主排斥的机制的需求。本发明解决了这种需求。
[0007]发明概述
[0008]本发明提供了一种耗减受试者中B细胞的方法。在实施方式中，该方法包括向受试者给予有效量的经遗传改造以表达CAR的细胞，其中该CAR包含抗原结合域、共刺激信号传导区和CD3 ζ信号传导域，其中该抗原结合域靶向B细胞表面标志物，从而耗减受试者中的B细胞。
[0009]本发明提供了一种促进受试者中耐受的方法。在一个实施方式中，该方法包括向受试者给予有效量的经遗传改造以表达CAR的细胞，其中该CAR包含抗原结合域、共刺激信号传导区和CD3 ζ信号传导域，其中该抗原结合域靶向B细胞表面标志物，从而促进受试者中的耐受。
[0010]在一个实施方式中，该耐受是对移植的组织的移植耐受。
[0011]在一个实施方式中，该经遗传改造的细胞耗减B细胞。
[0012]在一个实施方式中，该经遗传改造的细胞与该移植的组织同时给予。
[0013]在一个实施方式中，该经遗传改造的细胞在该移植的组织给予前给予。
[0014]在一个实施方式中，该经遗传改造的细胞在移植的组织给予后给予。
[0015]本发明提供一种治疗移植物抗宿主病(GVHD)的方法。在一个实施方式中，该方法包括向需要的受试者给予经遗传改造以表达CAR的细胞，其中该CAR包含抗原结合域、共刺激信号传导区和CD3 ζ信号传导域，其中该抗原结合域靶向B细胞表面标志物，从而治疗受试者中的GVHD。
[0016]在一个实施方式中，该经遗传改造的细胞耗减B细胞。
[0017]在一个实施方式中，该经遗传改造的细胞与移植的组织同时给予。
[0018]在一个实施方式中，该经遗传改造的细胞在该移植的组织给予前给予。
[0019]在一个实施方式中，该经遗传改造的细胞在该移植的组织给予后给予。
[0020]附图简述
[0021]以下本发明的优选的实施方式的详细说明在结合附图阅读时将会被更好地理解。为说明本发明的目的，在附图中说明了目前优选的实施方式。然而，应当理解，本发明不限于附图中说明的实施方式的精确安排和机构。
[0022]图1，包括图1A至图1F，是证明CART19细胞持续的体内增殖以及在血液和骨髓中留存的一系列图像。如图1A至IC所示从全血，或如图1D至IF所示从骨髓分离的DNA，如图1A和ID所示从UPN 01获得，如图1B和IE所示从UPN 02获得和如图1C和IF所示从UPN 03获得的样品进行大量Q-PCR分析，用适当的测定以检测和定量CART19序列。每个数据点代表对100-200ng基因组DNA的三次测量的平均值，其中最大％ CV小于1.56%。该测定的合格/不合格参数包括预先确定的斜率和扩展效率的范围，以及参考样品的扩增。用标准曲线范围建立的该测定的定量下限是2个拷贝转基因/微克基因组DNA;如果至少2/3的重复产生具有15%值的％ CV的Ct值，低于此数的样品值被视为估计并呈现。CART19细胞在第0、1和2天向UPN 01和UPN 03注射，在第0、1、2和11天向UPN 02注射。
[0023]图2，包括图2A至图2D，是说明体内延长的表面CART19表达和功能记忆CAR的建立的一系列图像。图2A描述了在外周和骨髓中检测到表达CAR的CD3+淋巴细胞以及B细胞不存在。用流式细胞术评估新鲜处理的在CART19细胞注射后第169天从UPN 03获得的外周血或骨髓单核细胞的CAR19(顶部)表面表达或B细胞(底部)的存在；从健康供体ND365获得的PBMC被染色作为对照。为了评估⑶3+淋巴细胞中的CAR19表达，用⑶14_PE_Cy7和⑶16-PE-Cy7 (废液通道)以及⑶3-FITC抗体共染色样品，在⑶3+阳性分门，并通过用⑶8a-PE和与Alexa-647结合的抗CAR19独特型抗体共染色评估⑶8+和⑶8-淋巴细胞区域中的CAR19表达。图中的数据是在废液通道-阴性/⑶3-阳性的细胞群体上分门的。为了评估B细胞的存在，用⑶14-APC和⑶3-FITC(废液通道)抗体共染色样品并通过用⑶20-PE和⑶19-PE-Cy-7抗体共染色评估废液通道-阴性部分中B细胞的存在。在所有情况下，阴性分门象限是用如图2B和2C所描述的非染色对照建立的。表明了 CD4+(图2B)和⑶8+(图2C) T细胞亚群的T细胞免疫表型。将在T细胞注射后第56和169天通过分离采血获得的来自UPN 03的冷冻外周血样品在没有添加因子的培养基中静置过夜，冲洗，并进行对T细胞记忆、活化和耗减的标志物表达的多参数免疫表型。如图6中所描述的分门策略包括对废液通道(⑶14、⑶16、活/死水性)-阴性和⑶3-阳性细胞的初步分门，然后对⑶4+和CD8+细胞阳性分门。门和象限是用FMO对照(CAR、CD45RA、PD-1、CD25、CD127、CCR7)或通过对阳性细胞群(⑶3、⑶4、⑶8)和明显限定的亚群(⑶27、⑶28、⑶57)分门建立的；数据在双指数变换后展示以客观呈现结果。图2D描述了留存的CAR细胞的功能活性。将在T细胞注射后第56和169天通过分离采血获得的来自UPN 03的冷冻外周血样品在没有添加因子的培养基中静置过夜，冲洗，并用CD107脱粒测定直接离体评估识别表达CD19的靶标细胞的能力。在抗⑶28、抗⑶49d和⑶107-FITC存在下温育2小时后，收集细胞混合物，冲洗并进行多参数流式细胞分析以评估CART19细胞应答表达CD19的靶标脱粒的能力。分门策略包括对废液通道(CD14-PE-Cy7、CD16-PE_Cy7、活/死水性)-阴性和CD3-PE-阳性细胞的初步分门，然后对CD8-PE-TexaS Red-阳性细胞阳性分门；展示的数据用于CD8+分门的细胞群。在所有情况下，阴性分门象限是用非染色对照建立的。
[0024]图3，包括图3A至3C，是说明评估注射CART19细胞后临床应答的实验结果的一系列图像。图3A说明UPN 02用两轮利妥昔单抗和苯达莫司汀以最小应答治疗(R/B，箭头)。在只给予苯达莫司汀(B，箭头)后的前4天注射CART19细胞。如绝对淋巴细胞计数(ALC)在注射18天内从60，600/ μ I至200/ μ I的下降所指示，利妥昔单抗和苯达莫司汀抗性白血病被迅速从血液中清除。由于不适和非感染性发热综合征，在注射后第18天开始皮质类固醇治疗。参考线(虚线)指示ALC的正常上限。图3Β说明了对来自患者UPN 01和03的连续骨髓活体检查或凝块样品染色的CD20的示例实验的结果。在两个患者中都存在的白血病预处理渗透在治疗后的样品中消失，伴随细胞构成和三系造血的正常化。在UPN 01的骨髓或血液中不具有任何由流式细胞术、细胞遗传学以及荧光原位杂交评估而检测到的CLL细胞，或者任何由流式细胞术检测到的正常B细胞。在第+23天，UPN 03具有5%残留的正常由流式细胞术确定的CD5-阴性B细胞，也显示这些细胞是多克隆的；在第+176天未检测到正常的B细胞。图3C说明了使用连续CT成像以评估化疗抗性全身性淋巴结病的快速消退的实验结果。双侧腋肿块在注射后83天(UPN 01)和31天(UPN 03)消退，如箭头和圆圈所指不。
[0025]图4，包括图4Α至4C，是说明UPN 01、02、03的绝对淋巴细胞计数和循环的总CART19+细胞的一系列图像。对全部三位患者的淋巴细胞总数(总正常和CLL细胞)针对循环的总CART19+细胞画图，使用来自CBC值的绝对淋巴细胞计数，假设血液体积为5.0L。循环的CART19细胞总数是用串联CBC值和如图1中所描述的绝对淋巴细胞计数和Q-PCR标志值计算的，如本文其他部分所描述，将拷贝数/ μ g DNA转化为平均％标志。发现Q-PCR%标志与注射产品的流式细胞特征以及与来自可获得伴随的流式细胞术数据以用染色直接计数CART19细胞的样品的数据密切相关(〈2倍变异)。
[0026]图5，包括图5A至是说明涉及在T细胞注射后71天直接离体检测UPN-OIPMBC中CART19-阳性细胞的实验的一系列图像。将在注射后第71天新鲜分离采血收集的，或在为制备T细胞产品(基线)分离采血时冷冻的并在染色前可活地融化的UPN-OIPBMC进行流式细胞分析以检测在表面表达CAR19分子的CART19细胞的存在。为评估淋巴细胞中CAR19的表达，样品用⑶3-PE和与Alexa-647结合的抗CAR19独特型抗体共染色，或只用⑶3-PE单独共染色(FM0代表CAR19)。图5A说明了基于前向和侧向散射(FSC vs.SSC)建立的初始淋巴细胞分门，然后对CD3+细胞分门。图5B说明了 CD3+淋巴细胞分门；图5C说明了CAR独特型染色；图说明了 CAR独特型FMO。CAR19-阳性分门是在CAR19 FMO样品上建立的。
[0027]图6，包括图6A至6C，是说明了用多色流式细胞术在UPN 03血液样品中识别CART19表达的分门策略的一系列图像。图6C的分门策略用于展示UPN 03第56天样品，代表了用在UPN 03第169天样品的策略。图6A说明了初级分门:废液(⑶14、⑶1 6、活/死水性)阴性，⑶3-阳性。图6B说明了次级分门:⑶4-阳性，⑶8-阳性。图6C说明了三级分门:CAR19-阳性和CAR19-阴性，建立在CAR FMO样品(最右侧)。
[0028]图7是总结患者人口统计资料和应答的图像。
[0029]图8是说明CART19长期表达的图像。
[0030]图9，包括图9A和9B，是说明深度B细胞发育不良的一系列图像。
[0031]图10是展示全部三位患者中血浆细胞减少的图像。
[0032]发明详述
[0033]本发明部分基于表达包含⑶3z和4-1BB共刺激域的抗⑶19CAR的T细胞(CART19细胞)在哺乳动物宿主中留存长时间的惊讶发现。例如，到目前为止观察到CAR19 T细胞注射后，表达表面CAR19的细胞在哺乳动物宿主中已经存在超过21个月。因此，本发明提供一种通过向需要的哺乳动物给予靶向B细胞的CAR耗减该哺乳动物中正常B细胞，以诱导该哺乳动物细胞中的耐受的方法。
[0034]本发明涉及用于耗减B细胞，因而诱导耐受的多种组合物和方法。本发明涉及一种被转导为表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的过继细胞转移方法。CAR是组合基于抗体的对靶向抗原(例如B细胞抗原)的特异性和T细胞受体活化胞内域，以产生表现特异性抗-B细胞细胞免疫活性的嵌合蛋白的分子。
[0035]在一个实施方式中，本发明的CAR包含具有靶向B细胞抗原的抗原识别域的胞外域、跨膜域和胞质域。
[0036]在一个实施方式中，本发明的CAR T细胞可通过引入包含所需的CAR的慢病毒载体而产生。本发明的CAR T细胞能在体内复制，造成能导致持续的B细胞耗减和耐受的长期留存。
[0037]在一个实施方式中，本发明涉及给予遗传改造的表达CAR的T细胞以有效降低移植物抗宿主病(GVHD)、排斥事件或移植后淋巴增殖障碍的发病率、严重性或持续时间。
[0038]定义
[0039]除非另有限定，本文所用的全部技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同意义。尽管与本文描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料可用于测试本发明的实践，本文描述了优选的材料和方法。在说明本发明和要求权利时，将使用以下术语。
[0040]也应当理解，本文所用的术语仅用于说明【具体实施方式】的目的，并且不意欲限制。
[0041]本文中使用的冠词“一个”(a和an)指的是一个或多于一个(例如至少一个)该冠词的语法宾语。例如，“一个元件”表示一个元件或多于一个元件。
[0042]如本文所用的“约”在涉及可测量值例如量、持续时间等时表示包含从说明的值±20%或±10%，一些情况下±5%，一些情况下±1%，一些情况下±0.1%的变异，因为此类变异适于进行被披露的方法。
[0043]如本文所用的“活化”指的是被足够地刺激以诱导可检测的细胞增殖的T细胞的状态。活化也可与诱导的细胞因子产生以及可检测的效应子功能相关。术语“活化的T细胞”指的是除了别的之外在进行细胞分裂的T细胞。
[0044]如本文所用的术语“抗体”指的是特异性结合抗原的免疫球蛋白分子。抗体可是源自天然来源或重组来源的完整的免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应部分。抗体通常是免疫球蛋白分子的四聚体。本发明中的抗体可以多种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)2，以及单链抗体和人源化抗体(哈洛(Harlow)等人，1999，《使用抗体:实验室手册》，冷泉港实验室出版社，纽约(Using Antibodies:ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY)；哈洛(Harlow)等人，1989，《抗体:实验室手册》，冷泉港实验室出版社，纽约(Antibodies:A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor, New York);休斯顿(Houston)等人，1988，《美国科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA) 85:5879-5883 ;伯德(Bird)等人，1988，《科学》(Science) 242:423-426)ο
[0045]术语“抗体片段”指的是完整抗体的一部分，并且指的是完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的示例包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段、线性抗体、scFv抗体和从抗体片段形成的多特异性抗体。
[0046]如本文所用的术语“抗原”或“Ag”限定为引起免疫应答的分子。免疫应答可涉及抗体产生和特异性免疫功能性细胞的活化两者之一或两者。本领域技术人员将理解，任何大分子，实质上包括全部蛋白质或肽，可作为抗原。此外，抗原可源自重组或基因组DNA。本领域技术人员将理解，任何包含编码引起免疫应答的蛋白的核苷酸序列或部分核苷酸序列的DNA因此编码如本文所用的术语“抗原”。此外，本领域技术人员将理解，抗原不需要只被基因的全长核苷酸序列编码。显而易见，本发明包括但不限于多于一个基因的部分核苷酸序列的用途，并且这些核苷酸序列以多种组合排列以引起所需的免疫应答。此外，本领域技术人员将理解，抗原完全不需要被“基因”编码。显而易见，抗原可合成地产生或可源自生物样品。此类生物样品可包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或生物流体。
[0047]根据本发明，术语“自体抗原”意思是任何被免疫系统识别为异源的自身抗原。自体抗原包括但不限于细胞蛋白、磷酸蛋白、细胞表面蛋白、细胞脂质、核酸、糖蛋白，包括表面受体。
[0048]如本文所用的术语“自身免疫疾病”限定为自身免疫应答导致的病症。自身免疫疾病是对自身抗原的不适当和过度响应的结果。自身免疫疾病的示例包括但不限于爱迪生氏病(Addis1n’ s disease)、斑秀(alopecia greata)、强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis)、自体免疫性肝炎(autoimmune hepatitis)、自体免疫性聰腺炎(autoimmune parotitis)、克罗恩氏病(Crohn’ s disease)、糖尿病(I 型)、营养不良性大疱性表皮松解症(dystrophic epidermolysis bullosa)、附睾炎(epididymitis)、肾小球肾炎(glomerulonephritis)、格雷夫氏病(Graves’ disease)、格-巴二氏综合征(Guillain-Barr syndrome)、桥本氏病(Hashimoto，s disease)、溶血性贫血(hemolyticanemia)、全身性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus)、多发性硬化症(multiplesclerosis)、重症肌无力(myasthenia gravis)、寻常型天疱疮(pemphigus vulgaris)、银肩癣(psoriasis)、风湿热(rheumatic fever)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、结节病(sarcoidosis)、硬皮病(scleroderma)、斯耶格伦氏综合征(Sjogren’ ssyndrome)、脊椎关节炎(spondyloarthropathies)、甲状腺炎(thyroiditis)、脉管炎(vasculitis)、白癫风(vitiligo)、黏液腺瘤(myxedema)、恶性贫血(pernic1usanemia)、溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)等。
[0049]如本文所用，术语“自体的”意欲指的是任何源自其随后待被重新引入的个体本身的材料。
[0050]“同种异体的”指的是源自相同物种不同动物的移植物。
[0051 ] “异种的”指的是源自不同物种动物的移植物。
[0052]如本文所用的“B细胞表面标志物”是在B细胞表面表达的抗原，该B细胞可以靶向结合于其的药剂。示例性B细胞表面标志物包括⑶10、⑶19、⑶20、⑶21、⑶22、⑶23、CD24、CD25、CD37、CD53、CD72、CD73、CD74、CD75、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、⑶83、⑶84、⑶85和⑶86淋巴细胞表面标志物。与哺乳动物的其他非B细胞组织相比，具有特别益处的B细胞表面标志物优选地在B细胞上表达，并且可在前体B细胞和成熟B细胞上都表达。在一个实施方式中，优选的标志物是⑶19，⑶19被发现贯穿从pro/pre B细胞阶段经过末端分化的血浆细胞阶段的细胞系分化存在于B细胞上。
[0053]如本文所用，“B细胞耗减”指的是药物、细胞或抗体治疗后动物或人中B细胞水平与治疗前的水平相比降低。B细胞水平可用众所周知的测定测量，例如通过获得全血计数、通过FACS分析染色已知的B细胞标志物以及通过本文其他部分描述的方法。B细胞耗减可以是部分的或完全的。在一个实施方式中，B细胞的耗减是25%或更多。
[0054]本文所用的术语“耗减”(deplete和deplet1n)涉及B细胞，并且为本说明书和权利要求书的用途，指以下一项或多项:阻断B细胞功能出细胞的功能失活；B细胞的细胞溶解；抑制B细胞增殖；抑制B细胞至血浆细胞的分化；引起导致治疗益处的B细胞机能障碍；抑制抗脱落抗原抗体的产生；减少B细胞的数量；由被脱落抗原引导或活化的B细胞的失活；阻断由被脱落抗原引导或活化的B细胞的一个或多个功能；由被脱落抗原引导或活化的B细胞的细胞溶解；以及减少由被脱落抗原引导或活化的B细胞的数量。B细胞耗减可以是一个或多个机制的结果，这些机制包括但不限于克隆失活、细胞凋亡、抗体依赖性细胞毒性、补体介导的细胞毒性以及信号通路介导的失活、机能障碍或细胞死亡。
[0055]如本文所用的术语“癌症”限定为特征为异常细胞快速和不受控的生长的疾病。癌症细胞可以局部扩散或通过血流流动和淋巴系统向身体其他部分扩散。多种癌症的示例包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。
[0056]“⑶19”抗原指的是约90kDa的抗原，该抗原可被例如HD237或B4抗体识别(基泽尔(Kiesel)等人，1987《白血病研宄》(Leukemia Research) II，12:1119)。CD19 被发现贯穿从干细胞阶段经过末端分化为血浆细胞的B细胞系分化存在于细胞上，包括但不限于前体B细胞、B细胞(包括原初B细胞、抗原激活的B细胞、记忆B细胞、血浆细胞和B淋巴细胞)和滤泡树突状细胞。CD19也被发现存在于人类胎儿组织中的B细胞上。在优选的实施方式中，被本发明的抗体靶向的CD19抗原是人类CD19抗原。
[0057]如本文所用的“协同激活配体”包括抗原呈递细胞(例如aAPC、树突状细胞、B细胞等)上的分子，其特异性结合T细胞上的同源协同激活分子，从而提供信号，该信号与由例如TCR/CD3复合物与携带肽的MHC分子的结合提供的初级信号一起介导T细胞应答，包括但不限于增殖、活化、分化等。协同激活配体可以包括但不限于⑶7、B7-1 (⑶80)、B7-2(CD86)、PD-Ll、PD_L2、4_1BBL、0X40L、可诱导共刺激配体(ICOS-L)、胞间粘着分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA_G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素 β 受体、3/TR6、ILT3、11^4、讯^11、结合1'011配体受体的激动剂或抗体以及特异性结合87-!13的配体。协同激活配体也包含例如特异性结合T细胞上存在的协同激活分子，例如但不限于⑶27、⑶28、4-1ΒΒ、0X40、CD30、CD40、PD-1、IC0S、淋巴细胞功能相关抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3的抗体以及特异性结合CD83的配体。
[0058]“协同激活分子”指的是T细胞上的同源结合伴侣，该T细胞与协同激活配体特异性结合，从而介导T细胞的协同激活应答，例如但不限于增殖。协同激活分子包括但不限于MHC I类分子、BTLA以及Toll配体受体。
[0059]如本文所用的“协同激活信号”指的是信号，其与初级信号例如TCR/CD3结合组合，导致T细胞增殖和/或关键分子的上调或下调。
[0060]“疾病”是动物的一种健康状态，其中该动物不能维持内稳态，并且其中如果疾病不被减轻，则该动物的健康持续恶化。相反，动物中的“病症”是一种健康状态，其中该动物能够维持内稳态，但其中该动物的健康状态不如该病症不存在时良好。不进行治疗，病症不一定导致该动物的健康状态进一步降低。
[0061]如本文所用的“有效量”意思是提供治疗或预防益处的量。
[0062]如本文所用的“内源的”指的是任何源自或产生在生物体、细胞 、组织或系统内的材料。
[0063]如本文所用，术语“外源的”指的是任何引入生物体、细胞、组织或系统，在该生物体、细胞、组织或系统外产生的材料。
[0064]如本文所用的术语“表达”限定为特定核苷酸序列被其启动子驱动的转录和/或翻译。
[0065]“表达载体”指的是包含含有与待表达的核苷酸序列有效连接的表达控制序列的重组多核苷酸的载体。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；其他用于表达的元件可由宿主细胞或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的全部载体，例如结合该重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如裸露的或包含于脂质体中)以及病毒(例如慢病毒、反转录病毒、腺病毒和腺病毒相关病毒)。
[0066]“同源的”指的是两个多肽或两个核酸分子之间的序列相似性或序列一致性。如果两个被比较的序列中的位点被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据，例如两个DNA分子中的每一个的位点都被腺嘌呤占据，则这些分子在该位点同源。两个序列之间的同源百分比是两个序列共有的匹配或同源位点的数量除以比较的位点的数量X 100的函数。例如，两个序列中1个位点中的6个匹配或同源，则这两个序列是60 %同源的。例如，DNA序列ATTGCC和TATGGC共有50%的同源性。通常，比较是在两个序列对齐后进行的以获得最大同源性。
[0067]如本文所用的术语“免疫球蛋白”或“Ig”限定为一类起到抗体作用的蛋白。由B细胞表达的抗体有时指的是BCR(B细胞受体)或抗原受体。该类蛋白的5个成员是IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。IgA是存在于身体分泌物例如唾液、眼泪、母乳、胃肠道分泌物以及呼吸道和泌尿生殖道的粘液分泌物中的主要抗体。IgG是最常见的循环抗体。IgM是大部分受试者中初级免疫应答中产生的主要免疫球蛋白。它是凝集、补体固定以及其他抗体应答中最有效的免疫球蛋白，在防御细菌和病毒中很重要。IgD是没有已知抗体功能的免疫球蛋白，但可作为抗原受体。IgE是在暴露于过敏原时导致从肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放介质以介导立即性过敏的免疫球蛋白。
[0068]如本文所用，术语“免疫应答”包括T细胞介导的和/或B细胞介导的免疫应答。示例性免疫应答包括T细胞应答，例如细胞因子的产生和细胞毒性。此外，术语免疫应答包括被T细胞活化间接影响的免疫应答，例如抗体的产生(体液应答)以及细胞因子响应性细胞例如巨噬细胞的活化。参与免疫应答的免疫细胞包括淋巴细胞例如B细胞和T细胞(CD4+、CD8+、Thl和Th2细胞)；抗原呈递细胞(例如专门的抗原呈递细胞例如树突状细胞、巨噬细胞、B淋巴细胞、郎格汉氏细胞、以及非专门抗原呈递细胞例如角质细胞、内皮细胞、星细胞、成纤维细胞和寡树突胶质细胞)、天然杀伤细胞；骨髓细胞例如巨噬细胞、嗜伊红细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞以及粒细胞。
[0069]如本文所用的术语“免疫耐受”指的是对部分被治疗的受试者采用的方法与未被治疗的受试者相比:a)特异性免疫应答(被认为至少部分地由抗原特异性效应T淋巴细胞、B淋巴细胞、抗体或它们的等同物介导)水平降低；b)特异性免疫应答的起始或进展延迟；或c)特异性免疫应答的起始或进展的风险降低。如果与其他抗原相比，免疫耐受优选地针对某些抗原被引起，则发生“特异性”免疫耐受。
[0070]如本文所用的“教材”包括可用于交流本发明的组合物和方法的有效性的出版物、录像、图表或任何其他表达媒介。本发明的试剂盒的教材可以，例如附于装有本发明的核酸、肽和/或组合物的容器上，或与装有本发明的核酸、肽和/或组合物的容器一起被运送。可选地，该教材可与该容器单独运送，目的在于该教材和该组合物可被接受者配合使用。
[0071]“分离”意思是从天然状态中改变或移除。例如，天然地存在于活体动物中的核酸或肽未被“分离”，但从其天然状态共存的材料中部分或完全地分开的相同的核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白可以以实质上纯化的形式存在，或者可以在非天然环境例如宿主细胞中存在。
[0072]如本文所用的“慢病毒”指的是逆转录病毒科(Retroviridae)的属。慢病毒在逆转录病毒中是独特的，能够感染非分裂细胞；它们可将大量遗传信息运送到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因运送载体最有效的方法之一。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的示例。源自慢病毒的载体提供实现显著水平的体内基因转移的手段。
[0073]如本文所用的术语“调控”意思是与没有治疗或组合物的受试者中的应答水平相比，和/或与其他相同的但未被治疗的受试者中的应答水平相比，介导受试者中的应答水平可检测的升高或降低。该术语包含扰乱和/或影响受试者，优选地人类中的天然信号或应答，从而介导有益的治疗应答。
[0074]免疫原性组合物的“肠外”给予包括例如皮下(s.c.)、静脉内(1.v.)、肌肉内(1.m.)或胸内注射或注入技术。
[0075]术语“患者”、“受试者”、“个体”等在本文中可互换地使用，并且指的是可用本文描述的方法处理的任何动物或其在体外或在原位的细胞。在一些非限制性实施方式中，患者、受试者或个体是人类。
[0076]术语“排斥”指的是移植的器官或组织不被受体的身体接受的状态。排斥是受体的免疫系统攻击移植的器官或组织造成的。排斥可在移植后数天至数周(急性)或数月至数年(慢性)发生。
[0077]如本文所用的关于抗体的术语“特异性结合”指的是识别特异性抗原，但实质上不识别或结合样品中其他分子的抗体。例如，特异性结合来自物种的抗原的抗体也可以结合来自一个或多个物种的该抗原。但是，此类跨物种反应性本身不改变抗体特异性的分类。在另示例中，特异性结合抗原的抗体也可以结合该抗原的不同等位基因型。然而，此类交叉反应性本身不改变抗体特异性的分类。在一些情况下，术语“特异性结合”(specific binding或者specifically binding)可用于指抗体、蛋白或肽与第二化学物质的相互作用，意思是该相互作用依赖于该化学物质上特定结构(例如抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体识别并结合特异性蛋白结构，而不是普遍的蛋白。如果抗体特异于表位“A”，在含有经标记的“A”和抗体的反应中，含有表位A(或游离的、未被标记的A)的分子的存在将降低结合于该抗体的经标记的A的量。
[0078]术语“激活”意思是由激活性分子(例如TCR/⑶3复合物)与其同源配体结合从而介导信号转导事件诱导的初级应答，例如但不限于通过TCR/CD3复合物的信号转导。激活可介导某些分子改变的表达，例如下调TGF-β和/或识别细胞骨架结构等。
[0079]如本文所用的术语“激活分子”意思是与抗原呈递细胞上存在的同源激活配体特异性结合的T细胞上的分子。
[0080]如本文所用的“激活配体”意思是当存在于抗原呈递细胞(例如aAPC、树突状细胞、B细胞等)上时，可与T细胞上的同源结合伴侣(本文中称为“激活分子”)特异性结合，从而介导T细胞的初级应答，包括但不限于活化、免疫应答起始、增殖等的配体。本领域熟知激活配体，包含例如携带肽的MHC I类分子、抗CD3抗体、超级激动剂抗-CD28抗体以及超级激动剂抗-CD2抗体。
[0081]术语“受试者”意欲包含其中可诱导免疫应答的活体生物(例如哺乳动物)。受试者的示例包括人类、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因种类。
[0082]如本文所用的“实质上纯化的”细胞是基本不含其他细胞类型的细胞。实质上纯化的细胞也指的是与在其天然存在状态下其通常相关的其它细胞类型分离的细胞。在一些情况下，实质上纯化的细胞群指的是同质细胞群。在其他情况下，此术语只指与在其天然状态下其自然相关的其它细胞分离的细胞。在一些实施方式中，这些细胞在体外培养。在其他实施方式中，这些细胞不在体外培养。
[0083]如本文所用的术语“治疗”意思是治疗和/或预防。治疗效果通过抑制、减轻或根除疾病状态获得。
[0084]术语“治疗有效量”指的是会在组织、系统或受试者中引起研宄者、兽医、医生或其他临床人员寻求的生物或医学响应的受试者组合物的量。术语“治疗有效量”包括当给予时足以防止正被治疗的病症或疾病的一个或多个病征或症状发展或减轻至一定程度的组合物的量。治疗有效量将根据组合物、疾病及其严重程度以及待治疗的受试者的年龄、体重等变化。
[0085]如本文所用的“移植物”指的是引入个体的细胞、组织或器官。移植的材料的源可以是培养的细胞、来自其他个体的细胞或来自同一个体的细胞(例如将该细胞体外培养后)。示例性器官移植物是肾、肝、心、肺以及胰腺。
[0086]如本文所用的术语“治疗”疾病意思是降低受试者罹患的疾病或病症的至少一个病征或症状的频率或严重程度。
[0087]如本文所用的术语“转染”或“转化”或“转导”指的是外源核酸被转移或引入宿主细胞的过程。“转染”或“转化”或“转导”的细胞是被用外源核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括初级受试者细胞及其后代。
[0088]术语“耐受”指的是对特异性抗原或抗原群体具有降低或不存在免疫应答的个体。在本发明的背景中，如果个体不排斥(例如引起显著的针对性免疫应答)移植的细胞，则其被认为耐受。在一些情况下，即使没有免疫抑制治疗，耐受个体也不排斥移植的细胞。在本发明的背景中，如果个体排斥移植的细胞，其被认为“不耐受”。不耐受个体包括使用免疫抑制治疗(例如标准免疫抑制)控制排斥的个体和正在经历对移植的细胞活性免疫应答的个体。
[0089]如本文所用的“体内耐受”指的是基本没有特异于外源组织的免疫应答。免疫应答可源自引起对外源组织的免疫应答的受体受试者，或者反过来，免疫应答可源引起对受体受试者(例如GVHD)免疫应答的外源组织。测量体内耐受的方法在本领域众所周知。
[0090]范围:贯穿在本披露，本发明的多个方面可以以范围格式呈现。应当理解，范围格式的说明仅是为了方便和简洁，并且不应被解释为对本发明的范围的僵化的限制。因此，范围的说明应被理解为具体披露了所有可能的子范围以及在该范围内的单个数值。例如，范围的说明例如从I至6应当理解为具体披露了子范围例如从I至3、从I至4、从I至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及在该范围内的单个数值例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。不论范围宽度如何，这都适用。
[0091]描沭
[0092]本发明提供用于耗减哺乳动物中正常B细胞的多种组合物和方法。在一个实施方式中，用本发明的CAR耗减B细胞诱导该哺乳动物中的耐受。
[0093]在一个实施方式中，本发明提供诱导对移植的外源组织的体内耐受的方法。在一些实施方式中，该方法部分地可用于防止和/或治疗移植组织的排斥。一般而言，该方法包括向暴露于移植的外源组织的受试者给予本发明的CAR T细胞。如本文所用的术语“外源组织”可包含骨髓移植物、器官移植物、输血或有意地引入受试者中的任何其他组织或细胞。
[0094]在另一个实施方式中，该方法部分地可用于防止和/或治疗移植物抗宿主病(GVHD) ο 一般而言，该方法包括向暴露于移植的外源组织的受试者给予本发明的CAR T细胞。如本文所用的术语“外源组织”可包含骨髓移植物、器官移植物、输血或有意地引入受试者中的任何其他组织或细胞。
[0095]在一个实施方式中，本发明的CAR可被改造为包含具有靶向与该T细胞抗原受体复合物ζ链(例如CD3G)的胞内信号传导域融合的B细胞抗原的抗原结合域的胞外域。示例性B细胞抗原是⑶19，因为此抗原在恶性B细胞上表达。然而，本发明不限于靶向⑶19。相反，本发明包含与B细胞同源抗原结合的任何B细胞抗原结合部分。该抗原结合部分优选地与来自一个或多个共刺激分子的胞内域以及ζ链融合。优选地，抗原结合部分与选自⑶137(4-1ΒΒ)信号传导域、⑶28信号传导域、⑶3 ζ信号传导域及其任意组合的一个或多个胞内域融合。
[0096]在一个实施方式中，本发明的CAR包括⑶137 (4-1ΒΒ)信号传导域。这是因为本发明部分地基于CAR介导的T细胞应答可通过增加共刺激域进一步增强这一发现。例如，与其他相同但未被改造表达CD137(4-1BB)的CAR T细胞相比，包含CD137 (4-1BB)信号传导域显著增加了 CAR T细胞的CAR介导的活性和体内留存。然而，本发明不限于具体CAR。相反，任何靶向B细胞的CAR可用于本发明。多种制备CAR的组合物和方法在PCT/US 11/64191中已经被描述，其全文通过引用并入于此。
[0097]Tffe
[0098]本发明涉及使用本发明的CAR和CAR T细胞耗减B细胞以促进耐受的多种方法。在一个实施方式中，该方法包括促进患者中的移植耐受(例如器官或组织移植物的)。在另一个实施方式中，该方法包括防止和/或治疗GVHD。在一个【具体实施方式】中，本发明的CAR靶向B细胞上的⑶19。
[0099]在一个实施方式中，诱导 持续的供体体液耐受的能力是实现强大的移植耐受和/或防止或治疗GVHD的关键。本发明包含通过向动物，优选哺乳动物，最优选人类患者给予该CAR T细胞以耗减B细胞并且诱导耐受，用于治疗一种或多种与器官或组织移植物相关的疾病、病症、综合征或症状(例如移植物排斥、GVHD和/或与其相关的症状)的本发明的CAR T细胞的用途。
[0100]器官排斥由宿主免疫细胞通过免疫应答破坏移移植的组织发生。类似地，GVHD中也涉及免疫应答，但在此情况下，外源移植的免疫细胞破坏宿主组织。例如，器官排斥和/或GVHD可在心脏、心瓣膜、肺、肾、肝、胰腺、肠、皮肤血管、骨髓、干细胞、骨或胰岛细胞移植后发生。然而，本发明不限于具体的移植类型。作为非限制性示例，可进行胰岛细胞移植以防止糖尿病发生或作为糖尿病的治疗。给予抑制免疫应答，特别是B细胞的增殖、分化或存活的本发明的CAR T细胞是防止器官和/或组织排斥或GVHD的有效治疗。给予本发明的CAR T细胞也可用于在器官和/或组织移植后促进移植耐受。
[0101]本发明的CAR T细胞也可用于促进移植耐受；治疗、降低、抑制和/或防止器官和/或组织移植物的排斥；和/或降低接受器官或组织移植物的患者中的抗体滴度。在一个实施方式中，本发明的CAR T细胞可通过向患者给予有效量的本发明的CAR T细胞，从而防止或延迟移植物排斥，用于促进患者中的移植耐受。在另一个实施方式中，本发明的CAR T细胞可通过向患者给予有效量的本发明的CAR T细胞，从而防止或延迟移植器官或组织排斥，用于治疗患者中的器官或移植物排斥。在另一个实施方式中，本发明的CAR T细胞可通过向患者给予有效量的本发明的CAR T细胞，从而降低抗体滴度，用于降低接受或即将接受器官或组织移植物的患者中的抗体滴度。
[0102]在一个实施方式中，本发明提供促进患者中的移植耐受的方法，包括向患者给予有效量的本发明的CAR T细胞，从而防止或延迟患者中移植物排斥。
[0103]在另一个实施方式中，本发明提供治疗患者中移植器官或组织排斥的方法，包括向患者给予有效量的本发明的CAR T细胞，从而抑制患者中移植器官或组织排斥。
[0104]在另一个实施方式中，本发明提供降低接受或即将接受器官或组织移植物的患者中的抗体滴度的方法，包括向患者给予有效量的本发明的CAR T细胞，从而降低患者中抗体滴度。
[0105]在一个实施方式中，本发明提供抑制或降低患者中免疫球蛋白产生的方法，包括向患者给予有效量的本发明的CAR T细胞。
[0106]在一个实施方式中，本发明的CAR T细胞降低或抑制B细胞功能。在另一个实施方式中，本发明的CAR T细胞从受试者耗减或消除B细胞。例如，本发明的CAR T细胞可被改造以靶向B细胞表面抗原，以允许该T细胞展示对B细胞的效应子功能。
[0107]抑制移植后不良免疫应答的治疗
[0108]本发明包含使用本发明的CAR T细胞作为治疗以抑制移植后的GVHD或移植物排斥的方法。因此，本发明包含在将移植物移植到受体内之前、同时或之后使供体移植物，例如生物相容性晶格或供体组织、器官或细胞与本发明的CAR T细胞接触的方法。本发明的CAR T细胞起到减轻、抑制或降低供体移植物对受体的不良响应的作用，从而防止或治疗GVHD0
[0109]如本文其他部分所讨论的，T细胞可从任何源获得，例如从组织供体、移植物受体或其他无关的源(不同的个体或物种)用于产生用于消除或降低移植物对移植物受体的不希望的免疫应答的本发明的CAR T细胞。因此，本发明的CAR T细胞对组织供体、移植物受体或其他无关源可是自体的、同种异体的或异种的。
[0110]在本发明的一个实施方式中，在将移植物移植到供体内之前，同时或之后将该移植物暴露于本发明的CAR T细胞。在此情况下，由任何同种反应性受体细胞导致的针对移植物的免疫应答将被存在于移植物中的本发明的CAR T细胞抑制，因为CAR T细胞可耗减B细胞并诱导耐受。
[0111]在本发明的另一个实施方式中，供体移植物可通过在移植到受体内之前处理该移植物被“预调整”或“预处理”以降低移植物对受体的免疫原性，从而降低和/或防止GVHD或移植物排斥。移植物可在移植前与来自受体的细胞或组织接触，以活化可能与移植物相关的T细胞。在用来自受体的细胞或组织处理移植物后，该细胞或组织可从该移植物中移除。该经处理的移植物然后进一步与本发明的CAR T细胞接触以降低、抑制或消除被来自受体的组织或细胞的处理活化的T和/或B细胞的活性。在用本发明的CAR T细胞处理该移植物后，该CAR T细胞可在移植到受体内之前从该移植物中移除。然而，一些CAR T细胞可粘着于该移植物，并且因此可与移植物一起被引入受体。在此情况下，引入受体的CAR T细胞可抑制由任何与移植物相关的细胞造成的针对受体的免疫应答。不意欲受限于任何具体理论，在将移植物移植到受体之前用CAR T细胞处理该移植物起到降低、抑制或消除活化的T和/或B细胞的活性，从而防止再次激活，或诱导该T和/或细胞对随后的来自受体的组织和/或细胞的抗原性激活的应答不足的作用。根据本披露，本领域技术人员将理解，在移植前预调整或预处理移植物可降低或消除移植物抗宿主应答。
[0112]治疗应用
[0113]在一个实施方式中，本发明包含一种细胞治疗，其中T细胞被遗传改造以表达CAR，并且该CAR T细胞被注射到需要的受体中。该注射的细胞能够杀死靶向的细胞。在一个实施方式中，该靶向的细胞是B细胞。与抗体治疗不同，CAR T细胞能够在体内复制，造成能导致持续的B细胞耗减和耐受的长期留存。
[0114]在一个实施方式中，本发明的CAR T细胞可经历强大的体内T细胞扩增并可留存增加的时间量。在另一个实施方式中，本发明的CAR T细胞进化为可被重新活化以抑制B细胞增殖的特异性记忆T细胞。例如，CART19细胞引起特异性针对表达CD19的细胞的免疫应答。
[0115]本发明的CAR改造的T细胞也可起到一类用于在哺乳动物中离体免疫和/或体内治疗的疫苗的作用。优选地，该哺乳动物是人类。
[0116]关于离体免疫，在将该细胞给予到哺乳动物之前以下至少发生一件:i)扩增该细胞，?)向该细胞引入编码CAR的核酸，和/或iii)细胞的冻存。
[0117]本领域熟知离体程序，并且在下文更完整地讨论。简言之，从哺乳动物(优选人类)分离细胞并用表达本文披露的CAR的载体遗传改造(例如在体外转导或转染)。该CAR-改造的细胞可给予到哺乳动物受体以提供治疗益处。该哺乳动物受体可以是人类，并且该CAR-改造的细胞对该受体可以是自体的。可选地，该细胞对该受体可以是同种异体的、同种的或异种的。
[0118]除了以离体免疫的方式使用基于细胞的疫苗，本发明也提供用于在患者体内免疫以引起针对B细胞抗原的免疫应答的多种组合物和方法。
[0119]通常，如本文所述的活化和扩增的细胞可用于耗减B细胞并诱导耐受。具体地，本发明的CAR改造的T细胞用于治疗与器官或组织移植物相关的一种或多种疾病、病症、综合征或症状(例如GVHD和/或与其相关的症状)。因此，本发明提供用于治疗或预防器官排斥和GVHD的方法，包括向需要的对象给予有效治疗量的本发明的CAR改造的T细胞。
[0120]在一个实施方式中，本发明的CAR T细胞与免疫抑制剂联合给予。可使用本领域知悉的任何免疫抑制剂。例如，该免疫抑制剂可以是环孢毒素(Cyclosporine)、硫唑嘌呤(Azath1prine)、雷帕霉素(Rapamycin)、麦考酸酸莫醋(Mycophenolate mofetil)、麦考酸酸(Mycophenolic acid)、强的松(Prednisone)、西罗莫司(Sirolimus)、巴利昔单抗(Basiliximab)或达珠单抗(Daclizumab)或其任何组合。可使用额外的特异性免疫抑制剂，包括但不限于 ORTHOCLONE 0KT?3 (鼠单抗-CD3)、SANDIMMUNE?, NEORAL?、SANGDYA?(环孢毒素)、PR0GRAF?(FK506,他克莫司(tacrolimus))、CELLCEPT?(麦考酚酸莫酯，其活性代谢物是麦考酚酸)、MURAN?(硫唑嘌呤)、糖皮质类固醇、肾上腺皮质固醇例如 DELTASONE?(强的松)和 HYDELTRASOL? (强的松龙)、FOLEXb^P MEXATE ?(甲氨蝶呤(methotrxate))、OXSORALEN-ULTRA?(甲氧沙林(methoxsalen))、RITUXAN?(利安昔单抗(rituximab))和 RAPAMUNE?(西罗莫司)。
[0121]本发明的CAR T细胞可在免疫抑制剂之前、之后或同时向患者给予。例如，可在向患者给予免疫抑制剂之后给予本发明的CAR T细胞，或者在向患者给予免疫抑制剂之前给予本发明的CAR T细胞。可选地或额外地，本发明的CAR T细胞可与向患者给予免疫抑制剂同时给予。
[0122]本发明的CAR T细胞和/或免疫抑制剂可在移植后向患者给予。可选地或额外地，本发明的CAR T细胞和/或免疫抑制剂可在移植前向患者给予。本发明的CAR T细胞和/或免疫抑制剂也可在移植手术期间向患者给予。
[0123]在一些实施方式中，本发明的向患者给予CAR T细胞的方法在免疫抑制治疗开始后进行一次。在一些实施方式中，该方法进行多于一次，例如以监测移植受体一段时间，以及(如果适用)在不同免疫抑制治疗方法中。在一些实施方式中，如果预测移植受体耐受移植物，免疫抑制治疗减少。在一些实施方式中，如果预测移植受体耐受移植物，不开处方进行免疫抑制治疗，例如停止免疫抑制治疗。如果移植受体表现出非耐受生物标志物特征，可重新开始或在标准水平继续免疫抑制治疗。
[0124]器官或组织移植物可以是心脏、心瓣膜、肺、肾、肝、胰腺、肠、皮肤、血管、骨髓、干细胞、骨或胰岛细胞。
[0125]本发明的CAR T细胞可在诊断移植器官或组织排斥后给予，然后同时给予本发明的CAR T细胞和免疫抑制剂直至器官或组织排斥的症状消退。
[0126]在一些实施方式中，本发明的CAR T细胞在诊断增加的抗体滴度后给予，然后同时给予本发明的CAR T细胞和免疫抑制剂直至抗体滴度降低。
[0127]优选地，用本发明的CAR T细胞治疗是通过向患者给予有效量的本发明的CAR T细胞实现的。
[0128]本发明的CAR T细胞可单独给予，或作为与稀释剂和/或其他组分例如IL-2或其他细胞因子或细胞群组合的药物制剂给予。简而言之，本发明的药物组合物可包含与一个或多个药学或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合的如本文所描述的靶向细胞群。此类组合物可包含缓冲剂例如中性缓冲的盐水、磷酸缓冲的盐水等；碳水化合物例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂例如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选地按配方制造用于静脉内给予。
[0129]本发明的药物组合物可用适于待治疗(或待预防)的疾病的方式给予。给予的量和频率由诸如患者症状以及患者疾病的类型和严重程度等因素确定，尽管适当的剂量可由临床试验确定。
[0130]当指示“有效量”时，待给予的本发明的组合物的精确量可由医生考虑患者(受试者)的年龄、体重、抗体滴度和症状的个体差异确定。通常而言，包含本文描述的T细胞的药物组合物可以14至10 9细胞/kg体重，优选地10 5至10 6细胞/kg体重，包括在该范围内的全部整数值的剂量给予。T细胞组合物也可以以上述剂量多次给予。细胞可用免疫治疗中众所周知的注射技术给予(参加例如罗森伯格(Rosenberg)等人，《新英格兰医学杂志》(New Eng.J.0f Med.) 319:1676，1988)。对于具体患者的最优剂量和治疗方案可由医学领域技术人员通过监测患者的疾病征兆并相应调整治疗方便地确定。
[0131]在一些实施方式中，可能想要向受试者给予活化的T细胞并且然后随后重新抽取血液(或进行分离采血)，根据本发明活化获得的T细胞，并且用这些活化并扩增的T细胞重新注射该患者。此过程可每隔数周进行多次。在一些实施方式中，T细胞可以从1cc至400cc的血液抽取物活化。在一些实施方式中，T细胞从20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或10cc血液抽取物活化。不限于理论，使用此多次抽血/多次重新注射的方案可起到选出某些T细胞群的作用。
[0132]受试者组合物的给予可用任何方便的方式，包括气溶胶吸入、注射、摄取、输液、植入或移植进行。本文说明的组合物可以皮下、皮内、瘤内、节内、髓内、肌肉内、静脉内(1.V.)注射或腹膜内向患者给予。在一个实施方式中，本发明的T细胞组 合物用皮内或皮下注射给予。在另一个实施方式中，本发明的T细胞组合物优选地用1.v.注射给予。T细胞的组合物可直接注射到肿瘤、淋巴结或感染位点。
[0133]在本发明的一些实施方式中，用本文描述的方法或本领域知悉的T细胞扩增至治疗水平的其他方法活化和扩增的细胞与任何数量的相关治疗物质联合(例如之前、同时或之后)给予至患者，包括但不限于用药剂治疗例如抗病毒治疗、用于MS患者的西多福韦(cidofovir)和白介素_2、阿糖胞苷(Cytarabine)(也称为ARA-C)或那他珠单抗(natalizumab)治疗或用于银肩病患者的依法利珠单抗(efalizumab)治疗或者用于PML患者的其他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的T细胞可与化疗、放射、免疫抑制剂组合使用，例如环孢毒素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、麦考酚酸以及FK506、抗体或其他免疫清除剂例如CAM PATH、抗-⑶3抗体或其他抗体治疗、细胞毒素、氟达拉滨(fludaribine)、环孢毒素、FK506、雷帕霉素、麦考酚酸、固醇类、FR901228、细胞因子和放射。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶(环孢毒素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号转导重要的P70S6激酶(雷帕霉素)(刘(Liu)等人，《细胞》(Cell)66:807-815,1991 ;亨德森(Henderson)等人，《免疫学》(Immun.)73:316-321，1991 ;比勒(Bierer)等人，《免疫学新见》(Curr.0pin.1mmun.) 5:763-773，1993)。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物联合(例如之前，同时或者之后)骨髓移植、使用化疗剂例氟达拉滨、外部光束辐射治疗(XRT)、环磷酰胺或抗体例如0KT3或CAMPATH的T细胞清除治疗向患者给予。在另一个实施方式中，本发明的细胞组合物在B细胞清除治疗例如与CD20反应的药剂例如利妥昔单抗之后给予。例如，在一个实施方式中，受试者可能经历标准的高剂量化疗治疗，然后进行外周血干细胞移植。在一些实施方式中，在移植后，受试者接受本发明的扩增的免疫细胞的注射。在另一个实施方式中，扩增的细胞在手术之前或之后给予。
[0134]向患者待给予的上述治疗的剂量将随正在治疗的症状的精确性质以及治疗受体而变化。可根据本领域接受的习惯进行人类给予剂量的范围确定。例如，对于成年患者CAMPATH的剂量通常将在I至约10mg的范围内，通常以I至30天之间的周期每天给予。优选的剂量是I至1mg每天，尽管在一些情况下可使用高达40mg每天的较大剂量(在美国专利号6，120，766中描述)。
[0135]实验实施例
[0136]本发明参考以下实验实施例进一步详细描述。以下实施例仅为说明目的提供，并且除非另有具体说明，不意欲作为限制。因此，本发明不应被解释为受限于以下实施例，相反，应被解释为包含显然是本文提供的教导的结果的任何以及全部变体。
[0137]没有进一步说明，相信本领域的普通技术人员能使用上文的说明和以下的说明性实施例制备并且利用本发明的组合物并实施所要求权利的方法。因此，以下工作实施例具体地指出了本发明的优选实施方式，并且不应被解释为以任何方式限制本披露的其余部分。
[0138]实施例1:表达嵌合受体的T细胞耗减B细胞并诱导耐受
[0139]本文说明的结果证明CART 19细胞在患者中留存并提供治疗益处至少18个月。该经改造的T细胞在体内扩增超过1000倍，迀移到骨髓并以高水平持续表达功能性CAR至少6个月。平均每个注射的CAR+T细胞消除至少1000个CLL细胞。在三位患者中的两位中，在血液和骨髓中证明了 CD19特异性免疫应答，伴随完全消退。部分细胞作为记忆CAR+T细胞留存，提示了这种非MHC限制的方法有效治疗B细胞恶性肿瘤的潜力。
[0140]用于这些实验的材料和方法说明如下。
[0141]材料和方法
[0142]实验方案设计
[0143]临床试验(NCT01029366)如PCT/US 11/64191中所描述的进行，其以引用方式整体并入于此。
[0144]裁体产牛
[0145]CD19-BB-Z转基因(GeMCRIS 0607-793)按说明设计并构建(米洛内(Milone)等人，2009，《分子治疗》(Mol Ther.) 17:1453-1464)。慢病毒载体根据现行药品生产质量管理规范，使用一种三载体生产方法在Lentigen公司按说明生产(Zufferey等人，1997，《自然生物技术》(Nature b1technol) 15:871-875)。
[0146]制各CART19细朐产品
[0147]使用用抗-⑶3和抗-⑶28单克隆抗体包被的顺磁性聚苯乙烯微珠制备T细胞的多种方法已被报道(拉波特(Laport)等人，2003，《血液》(Blood) 102:2004-2013)。慢病毒转导如描述进行(莱文(Levine)等人，2006，《美国科学院院报》(Proc Natl Acad Sci U SA)103:17372-17377)。
[0148]现在说明实验结果。
[0149]CART19的体内扩增和留存以及向骨髓迁移
[0150]使用⑶3/⑶28微珠扩增并表达4-1BB信号传导域的CAR+T细胞被认为是缺少4-1BB的CAR的改进。开发了 Q-PCR测定以允许定量跟踪血液和骨髓中的CART19。如图1A和IC所示，所有患者在血液中有至少6个月的CART19-细胞扩增和留存。值得注意的是，在注射后第一个月期间，患者UPN 01和UPN 03在血液中有1，000至10，000倍的CAR+T细胞扩增。峰值扩增水平与患者UPN 01 (第15天)和患者UPN 03 (第23天)的注射后临床综合征的发生一致。此外，在可用一级动力学建模的初始降解后，CART19 T细胞水平在全部三位患者中从注射后第90天至第180天稳定。值得注意的是，如图1D至IF所示，在全部患者中，CART19 T细胞也迀移到了骨髓，虽然比在血液中观察到的水平低5至10倍。患者UPN 01和UPN 03在骨髓中具有对数线性降解，消失T1/2为约35天。
[0151]延长的表汰和血液中记忆CART19细朐群的律立
[0152]CAR-介导的癌症免疫治疗的中心问题是优化的细胞制备和共刺激域是否增强遗传改造的T细胞在患者中的留存并允许在患者中建立CAR+记忆T细胞。先前的研宄未证明注射后强大的扩增、延长的留存和/或T细胞上CAR的表达(克肖(Kershaw)等人，2006,《临床癌症研宄》(Clin Cancer Res) 12:6106-6115 ;拉莫斯(Lamers)等人，2006，《临床肿瘤学杂志》(J Clin Oncol) 24:e20-e22 ;蒂尔(Till)等人，2008，《血液》(Blood)，112，2261-2271 ;萨沃尔托(Savoldo)等人，2011，《临床研宄杂志》(J Clin Invest)do1:10.1172/JCI46110)。在注射后169天来自血液和骨髓的样品的流式细胞分析显示在UPN 03中存在CAR19表达细胞(图2A和2B)，以及如图2A中所示的B细胞的消失。值得注意的是，如图1和图4所示，根据Q-PCR测定，全部三位患者在4个月及之后有留存的CAR+细胞。流式细胞术得到的CAR+细胞的体内频率与对CART19转基因进行的PCR测定获得的值紧密吻合。重要的是，在患者UPN 03中，只有⑶3+细胞表达CAR19，因为如图2A所示，CAR19+细胞不能在⑶16-或⑶14-阳性亚群中被检测到。如图5所示，注射后第71天，在患者UPN 01的血液中4.2%的T细胞表面也检测到了 CAR表达。
[0153]接着，使用多色流式细胞术，利用抗-CAR特异基因型抗体(MDA-67)和图6中所示的分门策略进行详细研宄以进一步特征化UPN 03中CART19细胞的表达、表型和功能。在⑶8+和⑶4+细胞中都观察到了基于CAR19表达的记忆和活化标志物表达中的显著差异。在第56天，CART19CD8+细胞主要显示效应子记忆表型(CCR7-CD27-CD28-)与如图2C所示的延长的和强大的暴露于抗原一致。相反，CAR-阴性CD8+细胞由效应子和中心记忆细胞的混合物组成，随着子细胞集中表达CCR7，并且在⑶27+/⑶28-以及⑶27+/⑶28+部分有大量细胞。尽管CART19和CAR-阴性细胞群实质上表达⑶57，这个分子均匀地与CART19细胞中的F1D-1共表达，可能反映了这些细胞大量增殖的历史。与CAR-阴性细胞群相反，全部CART19⑶8+细胞群缺少⑶25和⑶127的表达。到第169天，CAR-阴性细胞群的表型与第56天的样品保持相似，CART19细胞群进化为含有少量具有中心记忆细胞特征，显著表达CCR7、较高水平的⑶27和⑶28的细胞群以及I3D-1阴性，⑶57阴性以及⑶127-阳性的CAR+细胞。
[0154]在⑶4+部分，在第56天，CART19细胞的特征为一致缺乏CCR7，并且分布在⑶57+和-部分的⑶27+/⑶28+/TO-1+细胞占统治地位，并且实质上缺乏⑶25和⑶127表达，如图2B所示。相反，CAR-阴性细胞在此时间点为CCR7、⑶27和TO-1表达异质，表达⑶127，并且也含有大量⑶25+/⑶127-(潜在调控T细胞)群。到第169天，⑶28表达在全部CAR+⑶4+细胞中保持均匀的阳性，部分CART19⑶4+细胞向中心记忆表型进化，具有CCR7表达，较高百分比的⑶27-细胞，存在I3D-1阴性亚群，以及获得⑶127表达。除了⑶27表达降低，⑶25+/⑶127-细胞的百分比降低，CAR阴性细胞维持了与其第56天的对应物合理的一致。
[0155]CART19细胞6个月后在血液中保持效应子功能
[0156]除了短留存和不重复的体内增殖，先前的CAR+T细胞的试验的限制是注射的T细胞在体内快速丧失功能活性。患者UPN 01和03中高水平的CART19细胞留存和CAR19分子的表面表达提供了直接测试从冻存外周血样品中恢复的细胞中抗-CD19-特异性效应子功能的机会。来自患者UPN 03的PBMC用⑶19表达阳性或阴性的靶向细胞培养(图2D)。对⑶19-阳性，而非⑶19-阴性靶细胞特异性的脱粒证明了 CART19 T细胞的强大的⑶19-特异性效应子功能，如用表面CD107a表达评估。值得注意的是，将CART19细胞群暴露于CD 19-阳性靶标诱导了表面CAR-19的快速内部化，如图6中同一效应子细胞在标准流式细胞染色中CAR19表面表达所示。促进CART19细胞脱粒不需要靶标细胞上共刺激分子的存在，因为NAML-6细胞系不表达CD80或CD86 (Brentjens等人，2007，《临床癌症研宄》(ClinCancer Res) 13:5426-5435)。效应子功能在注射后第56天明显，并且在第169天的时间点保持。CAR+和CAR-T细胞强大的效应子功能也可用药物学刺激证明。
[0157]CART 19细朐的临床活件
[0158]除了短暂的发热反应，在任何患者注射后的4天内都没有任何观察到的显著毒性。然而，所有患者随后都在第一次注射后第7天与第21天之间发生了显著的临床和实验室毒性。这些毒性是短期并且可逆的。在到目前为止治疗的三位患者中，根据标准评价标准，在CART19注射后>6个月时有2个CR和I个PR(哈雷克(Hallek)等人，2008，《血液》(Blood) 111:5446)。每个患者的过往病史和对治疗响应的细节在图7中描述。
[0159]简而言之，患者UPN 01在注射后10天开始发生了发热综合征，伴有寒战和暂时性的低血压。发热持续了约2周并消退；患者没有其他全身症状。如图3所示，患者实现了快速和完全的响应。在注射后I与6个月之间，用流式细胞术在血液中未检测到循环的CLL细胞。通过形态和如图3B所示的流式细胞分析，在CART19细胞注射后第1、3和6个月的骨髓显示持续没有淋巴细胞渗透。如图3C所示，在注射后I和3个月的CT扫描显示了淋巴节肿大的消退。到本报告撰写之日，完全消退持续了超过10个月。
[0160]患者UPN 02用两轮苯达旲司汀和利安昔单抗治疗，导致了如图3A所不的稳定疾病。患者在注射CART19 T细胞前接受了第三剂量的苯达莫司汀作为淋巴细胞耗减化疗。患者在第一次注射后第11天以及第二次CART19细胞激发当天发生了 40°C的发热、寒战以及呼吸困难，需要24小时住院。发热和全身症状持续，并且在第15天患者发生了暂时性的心功能障碍；在第18天开始皮质类固醇治疗后所有症状消退。在CART19注射后，并且与高烧一致，患者发生了 P53缺陷型CLL细胞从外周血快速清除，如图3A所示，并且淋巴节肿大部分消减，在治疗I个月后，骨髓显示了持续的大量CL L渗透，尽管外周血大量细胞减少。患者维持无症状。
[0161]患者UPN 03在CART19细胞注射前接受了喷司他丁和环磷酰胺作为淋巴细胞耗减化疗。在化疗3天后，但先于细胞注射，骨髓细胞过多(60%)，其中约50%与CLL有关。患者接受了低剂量的CART19细胞(1.5x105CAR+T细胞/kg分3天给予)。再次，没有急性注射毒性。然而，在第一次注射后14天，患者开始寒战、发热、恶心以及腹泻。到注射后第22天，诊断了肿瘤溶解综合征，需要住院。患者全身性症状消退，并且在CART19注射I个月内，通过形态学、流式细胞术、细胞遗传学和FISH分析，患者的循环CLL从血液和骨髓中清除。CT扫描显示异常淋巴节肿大消退，如图3B和3C所示。完全消退从第一次CART19细胞注射后持续了超过8个月。
[0162]体内CART19效应子与CLL靶细朐比例的考虎
[0163]临床前研宄显示大型肿瘤科被溶化，并且注射2.2x107CAR能根除由IxlO9个细胞组成的肿瘤，例如在人源化小鼠中体内E:T比例为1:42(卡本尼托(Carpenito)等人，2009，《美国科学院院报》(Proc Natl Acad Sci U S A) 106:3360-3365)，尽管这些计算未考虑注射后T细胞的扩增。CLL肿瘤负荷随时间的估计允许计算肿瘤减小，并且基于注射的CAR+T细胞的数量计算三名受试者体内估计的CART19E:T比例。肿瘤负荷是通过测量骨髓、血液以及次级淋巴组织中CLL负荷计算的。如图7所示的基线肿瘤负荷说明每个患者在CART19注射前有大约112个CLL细胞(即I千克肿瘤负荷)。患者UPN 03在第-1天(即剂化疗后并且CART19注射前)在骨髓中具有8.8χ10η个CLL细胞的估计基线肿瘤负荷，根据体积CT扫描分析的方法，在次级淋巴组织中测量的肿瘤量为3.3-5.5χ10η个CLL细胞。已知UPN 03只注射了 1.4xl07个CART19细胞，使用初始总肿瘤负荷的估计(1.3x10 12个CLL细胞)，并且在治疗后未检测到CLL细胞，达到了惊人的1:93,000的E:T比例。相似的计算得出，UPN 01和UPN 02的体内有效的E:T比例为1:2200和1:1000。最后，CART19 T细胞的连续杀伤的贡献，与>1，000倍的体内CART19扩增结合，可能贡献了 CART19细胞介导的强大的抗白血病效果。
[0164]表达嵌合受体的T细胞在晚期白血■病患者中建己忆和有效的抗肿瘤作用
[0165]CAR有限的体内表达和效应子功能是测试第一代CAR的试验中的中心限制(克肖(Kershaw)等人，2006，《临床癌症研宄》(Clin Cancer Res) 12:6106-6115 ;拉默斯(Lamers)等人，2006，《临床肿瘤学杂志》(J Clin 0ncol)24:e20-e22 ;蒂尔(Till)等人，2008，《血液》(Blood)，112，2261-2271 ;帕克(Park)等人，2007，《分子治疗》(Mol Ther) 15:825833 ；普莱(Pule)等人，2008，《自然医学》(Nat Med) 14:1264-1270)。根据证明含4-1BB信号组件的CAR的增强的留存的临床前建模(Milone等人，2009，《分子治疗》(Mol Ther.) 17:1453-1464 ;卡本尼托(Carpenito)等人，2009，《美国科学院院报》(Proc Natl Acad SciU S A) 106:3360-3365)，设计了实验以开发用慢病毒载体技术改造的第二代CAR。第二代CAR被证明在慢性HIV感染的背景下是安全的(莱文(Levine)等人，2006，《美国科学院院报》(Proc Natl Acad Sci U S A) 103:17372-17377)。本结果说明当此第二代 CAR 在 T细胞中表达并在设计以促进中心记忆T细胞植入的条件下培养((拉波波特)Rapoport等人，2005，《自然医学》(Nat Med) 11:1230-1237 ;Bondanza 等人，2006，《血液》(Blood) 107:1828-1836)时，与先前的报道相比，观察到注射后改善的CAR T细胞扩增。CART19细胞建立了⑶19-特异性细胞记忆，并且以先前在体内未达到的E:T比例杀死肿瘤细胞。
[0166]CART19是第一个整合4-1BB信号传导域的CAR试验，并且是第一个使用慢病毒载体技术。本结果证明CAR有效地迀移到肿瘤位点，事实上建立了显示CD19特异性的“肿瘤渗透淋巴细胞”。显著的体内扩增允许第一次证明从患者直接回收的CAR可保持体内效应子功能数月。先前的研宄提示，将第一代CAR引入病毒特异性T细胞优选地是初级T细胞((Pule)等人，2008，《自然医学》(Nat Med) 14:1264-1270)，然而引入最优地共刺激的初级T细胞的第二代CAR的结果对此观念提出了疑问。不意欲受限于任何具体理论，提出了警告性注解，临床效果是深远和空前的，随着全部三位患者中千克尺寸的肿瘤负荷溶解，其中两位患者伴有延迟的可能危险地高水平的细胞因子释放。没有观察到经典的细胞因子爆发效果。然而，本研宄被设计为通过有意在3天的时间段内注射CART19以减轻此可能性。
[0167]发现非常低剂量的CAR能引起有效的临床响应。这是证明CART19载体设计的安全性的试验性研宄。比先前的试验低若干个数量级的CART19细胞的剂量可具有临床益处的观察可能对将来在更宽的范围实施CAR治疗，并且设计测试针对不同于CD19的靶标的CAR的试验具有重要意义。
[0168]本研宄还提示，CART19在中心记忆和效应子T细胞中都表达，并且这可能导致其与先前报道相比的长期存活。不意欲受限于任何具体理论，CART细胞可能在遇到并随后清除表达代替抗原的靶标细胞(例如CLL肿瘤细胞或正常B细胞)时在体内分化为类中心记忆状态。实际上4-1BB的信号转导被报道在TCR信号转导背景下促进记忆的发育(萨巴格(Sabbagh)等人，2007，《免疫学动态》(Trends Immunol) 28:333-339)。
[0169]CART19扩展的增殖和存活显示了先前未被报道的CAR T细胞的药物动力学方面。观察到血清和骨髓中细胞因子的释放的动力学与峰值CART19水平相关，因此可能当表达CD19的细胞靶点变得有限时衰退开始。CART19扩展的存活的机制可能与4-1BB域上述的整合或通过天然TCR和/或CAR信号转导有关。有趣的可能性是扩展的存活与骨髓细胞中识别的CART19群相关，引出了 CD19CAR可通过与B细胞前体细胞在骨髓中相遇而维持的假说。与此问题相关的是什么驱动CART19细胞的最初体内扩增？除了极少数例外(萨尔瓦托(Savoldo)等人，2011，《临床研宄杂志》(J Clin Invest) do1: 10.1172/JCI46110 ;普莱(Pule)等人，2008，《自然医学》(Nat Med) 14:1264-1270)，本研宄是唯一的省略IL-2注射的试验，因此CART19细胞可能响应内稳态细胞因子，或者更可能地，响应在白血病靶标和/或正常B细胞上表达的⑶19而扩增。在后一种情况下，这可能是针对正常APC上的靶标例如⑶19和⑶20的CAR的有吸引力的性质，因为CART19的自身更新可能发生在正常细胞上，通过“自身疫苗/激发”的方法提供CAR记忆的机制，并且因而提供长期肿瘤免疫监控。CART19内稳态的机制可能需要进一步研宄，以明确细胞固有和外在的留存机制。在这些结果之前，大部分研宄人员将CAR治疗视作暂时形式的免疫治疗，然而具有优化的信号传导域的CAR可能参与减缓诱导和巩固，以及长期免疫监控。
[0170]在全部三位患者，包括两位罹患p53缺陷性白血病的患者中观察到了有效的抗白血病效果。先前的对CAR的研宄难以区分抗肿瘤效果和淋巴耗减性化疗。然而，延迟的细胞因子释放结合同时发生的氟达拉滨耐受性患者中肿瘤溶解的动力学，并且可能依靠本研宄中的体内CAR扩增，说明CART19介导有效的抗肿瘤效果。本结果不排除化疗在增强CAR效能中的功能。
[0171]可能需要与其他中心正在进行的研宄的结果进行载体、转基因和细胞生产过程的深入比较以得到对获得持续的CAR T细胞体内功能所需的关键性质的完整理解。与抗体治疗不同，CAR-改造的T细胞具有在体内复制的潜能，并且长期留存可导致持续的肿瘤控制。由非交叉抗性杀伤T细胞组成的现成治疗的的可用性具有改善罹患B细胞恶性肿瘤的患者的结果的潜力。抗体治疗，例如用剂诸如利妥昔单抗和贝伐株单抗的限制是该治疗需要反复注射抗体，这既不方便又昂贵。在单次注射CART19细胞后用在T细胞上表达的抗CD19scFv进行延长的抗体治疗(在本病例中在至今治疗的三名患者中至少6个月)具有多种实践优势，包括方便和节约成本。
[0172]在注射18个月后持续监测CART19
[0173]本文展示的结果显示全部三位患者中CART19的长期表达以及深度B细胞发育不良(图8和图9)，以及血浆细胞的减少(图10)。该CART19试验的主要意外之处是具有鼠scFv,显示高度免疫原性表型的CART19细胞实际上未被宿主患者的免疫系统排斥。这说明CART19细胞耗减了宿主患者中的正常B细胞，并且因此诱导了耐受。
[0174]不意欲受限于任何具体理论，CART19细胞可用于以下应用:1) “交叉配对”阳性的实体器官移植患者；消除已有的记忆B细胞可能允许目前在免疫的患者中不可能的器官移植；2)诱导对患者(例如血友病)给予的免疫原性蛋白的耐受；3)利妥昔单抗在关节炎和其他自体免疫病症中具有治疗效力；CART19可能同样起作用或更好。
[0175]在一些情况下，CART19细胞可用于消除全部B细胞亚类(例如原初B细胞、记忆B细胞、血浆细胞前体和“抑制性B调节细胞”)。B调节细胞可能参与一些癌症的免疫抑制，并且因此CART19可通过移除B调节细胞改善免疫应答。
[0176]本文引用的每个专利、专利申请和出版物的公开内容在此以引用方式整体并入于此。尽管本发明参考【具体实施方式】被披露，显然本领域其他技术人员可在不背离本发明的实际精神和范围的情况下设计其他实施方式或本发明的变形。所附的权利要求书意欲被解释为包含所有此类实施方式和等同的变形。
【主权项】
1.一种耗减受试者中B细胞的方法，所述方法包括向受试者给予有效量的经遗传改造以表达CAR的细胞，其中所述CAR包含抗原结合域、共刺激信号传导区和CD3 ζ信号传导域，其中所述抗原结合域靶向B细胞表面标志物，从而耗减所述受试者中的B细胞。2.一种促进受试者中耐受的方法，所述方法包括向受试者给予有效量的经遗传改造以表达CAR的细胞，其中所述CAR包含抗原结合域、共刺激信号传导区和CD3 ζ信号传导域，其中所述抗原结合域靶向B细胞表面标志物，从而促进所述受试者中的耐受。3.如权利要求2所述的方法，其中所述耐受是对移植的组织的移植耐受。4.如权利要求2所述的方法，其中所述经遗传改造的细胞耗减B细胞。5.如权利要求2所述的方法，其中所述经遗传改造的细胞与所述移植的组织同时给予。6.如权利要求2所述的方法，其中所述经遗传改造的细胞在所述移植的组织给予之前给予。7.如权利要求2所述的方法，其中所述经遗传改造的细胞在所述移植的组织给予之后给予。8.—种治疗移植物抗宿主病(GVHD)的方法，所述方法包括向需要的受试者给予经遗传改造以表达CAR的细胞，其中所述CAR包含抗原结合域、共刺激信号传导区和CD3 ζ信号传导域，其中所述抗原结合域靶向B细胞表面标志物，从而治疗所述受试者中的GVHD。9.如权利要求8所述的方法，其中所述经遗传改造的细胞耗减B细胞。10.如权利要求8所述的方法，其中所述经遗传改造的细胞与移植的组织同时给予。11.如权利要求8所述的方法，其中所述经遗传改造的细胞在所述移植的组织给予之前给予。12.如权利要求8所述的方法，其中所述经遗传改造的细胞在所述移植的组织给予之后给予。
【专利摘要】本发明提供多种用于诱导人类中耐受的组合物和方法。本发明包括给予经遗传改造的表达CAR的T细胞，其中该CAR包含抗原结合域、跨膜域、共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导域。
【IPC分类】A61K48/00
【公开号】CN104884095
【申请号】CN201380037500
【发明人】B·L·莱文, M·D·卡罗斯, C·H·琼
【申请人】宾夕法尼亚大学董事会
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2013年7月12日
【公告号】CA2876734A1, EP2872184A2, US20150290244, WO2014012001A2, WO2014012001A3