人乳头瘤病毒感染相关癌症的治疗用组合物的制作方法

人乳头瘤病毒感染相关癌症的治疗用组合物的制作方法
【专利说明】人乳头瘤病毒感染相关癌症的治疗用组合物 【技术领域】
[0001] 本申请基于申请号为KR10-2012-0084820、申请日为2012/08/02的韩国专利申请 来要求优先权，其全部内容在此引入本申请作为参考。
[0002] 本发明涉及包括宫颈癌在内的人乳头瘤病毒感染相关疾病的基因治疗用组合物。 【【背景技术】】
[0003] 高危型（High-risk)人乳头瘤病毒（Human Papilloma Virus :以下称为 HPV) I6型、人乳头瘤病毒18型是引起宫颈癌及宫颈非典型增生的主要因素，也是引起生殖器癌和 头颈部鳞状细胞癌的原因。宫颈癌是女性恶性肿瘤中最为普通的类型之一。虽然浸润性宫 颈癌的发病率正在逐渐减少，但作为在发展中国家的所有女性人群中最频繁发病的癌症， 占女性癌症的25%。人乳头瘤病毒为具有约8000个碱基序列的引起良性、恶性肿瘤的小的 脱氧核糖核酸（DNA)病毒。目前为止，根据基因组的差异，确认了 100多个以上的人乳头瘤 病毒亚型，并完全分析了约90个左右的人乳头瘤病毒的基因型。在这种类型中，几乎90% 的宫颈癌与高危型人乳头瘤病毒（例如，人乳头瘤病毒16型、人乳头瘤病毒18型、人乳头 瘤病毒31型、人乳头瘤病毒33型、人乳头瘤病毒35型、人乳头瘤病毒45型、人乳头瘤病毒 51型、人乳头瘤病毒52型、人乳头瘤病毒56型）有关。50%以上的感染了人乳头瘤病毒 的宫颈癌与人乳头瘤病毒16型有关，之后与人乳头瘤病毒18型（12% )、人乳头瘤病毒45 型（8% )、人乳头瘤病毒31型（5% )有关。这种人乳头瘤病毒将2个致癌（oncogenic) 蛋白E6和E7编码化。这些蛋白质均与由人乳头瘤病毒介导的细胞无限增殖化及细胞转化 有关。致癌性E6蛋白与野生型的p53肿瘤抑制蛋白相结合来通过泛素途径分解p53。另 一方面，E7蛋白直接与Rb相结合来进行过度磷酸化。首先，E6与作为E3泛素蛋白连接酶 (ubi quit in-protein ligase)的 E6 相关蛋白（E6-AP，E6_associated protein)形成复合 体。之后，E6/E6-AP复合体与野生型的p53相结合来进行泛素化，从而妨碍由对DNA损伤 的P53介导的细胞的反应。虽然主要借助由Mdm2介导的泛素化来调节p53肿瘤抑制蛋白， 但在感染人乳头瘤病毒的宫颈癌细胞中，p53的分解在Mdm2中完全被由E6介导的泛素化 所代替。因此，与其他很多癌症不同，感染人乳头瘤病毒的宫颈癌几乎具有野生型的P53基 因。但是，一贯被E6蛋白分解，因而p53蛋白的表达水平非常低。尤其，人乳头瘤病毒E6 蛋白为只能够杀死宫颈癌细胞的特定靶，因而相当受瞩目。将E6或E6/E6-AP复合体作为 靶的这种战略包括多种治疗方法。
[0004] 有细胞毒素药物的使用、放出病毒的E6致癌蛋白的锌的抑制剂、模拟E6-AP的模 拟表位（mimotope)、抗E6核酶、将病毒的E6致癌蛋白作为靶的肽适体、将病毒的E6致癌基 因作为靶的小干扰核糖核酸（RNA)以及它们的并用处理等。最近，证明了小干扰核糖核酸 不仅可在动物细胞中选择性地使内部基因沉默，还可在由病毒引起的疾病中选择性地使病 毒的基因沉默。由小干扰核糖核酸的转染引起的核糖核酸干扰（RNAi)成为了用于治疗人 类的病毒感染的新的治疗方法。在感染人乳头瘤病毒的宫颈癌细胞中，将E6和E7的基因 作为祀的小干扰核糖核酸引起p53和pRb的积累，导致细胞凋亡（apoptosis)或细胞衰老。 证实了在感染人乳头瘤病毒16型的宫颈癌细胞株和感染人乳头瘤病毒18型的宫颈癌细胞 株的情况下，将病毒的E6及E7癌基因作为靶的核糖核酸干扰选择性地使这些蛋白的表达 沉默。
[0005] 另一方面，具有对多种核酸的变形（例如，碱基、糖和/或磷酸盐）的核酸的、 基于血清核糖核酸酶的分解被抑制，因而可增加功效。在本领域中，众所周知的有记 述可作为核酸导入的糖、碱基及磷酸盐变形的几种例。例如，使寡核苷酸以借助基于 核酸酶耐药组的变形，如2' -氨基、2' -C-烯丙基、2' -氟基、2' -0-甲基、2' -H核苷 酸碱基变形来增大稳定性和/或生物学活性的方式变形（参照Eckstein et al.，PCT 公开公报 WO 92/07065 ;文献[Perrault et al. ,Nature 344:565-568, 1990];文献 [Pieken et al. , Science 253:314-317,1991];文献[Usman and Cedergren, Trends in Biochem.Sci. 17:334-339, 1992] ;Usman et al. PCT 公开公报 TO 93/15187 ;Sproat, 美国专利第 5334711 号及文献[Beigelman et al. , J. Biol. Chem. , 270:25702, 1995]; Beigelman et al·, PCT 公开公报WO 97/26270 ;Beigelman et al·,美国专利第 5716824 号；Usman et al.,美国专利第 5627053 号；Woolf et al. ,PCT 公开公报 WO 98/13526 Jhompson et al.,美国专利申请第 60/082404 号（1998 年 4 月 20 日申 请）；文献[Karpeisky et al·, Tetrahedron Lett·,39: ΙΟΙ, I"8];文献[Earnshaw and Gait, Biopolymers(Nucleic acid Sciences)48:39-55, 1998];文献[Verma and Eckstein, Annu. Rev. Biochem. 67:99-134, 1998];以及文献[Burlina et al.,Bioorg. Med. Chem. 5:1999-2010, 1997])。可将类似的变形用于使本发明的核酸变形。
[0006] 1999年，并用处理了基于顺铂（Cisplatin)的化疗和放射治疗，其结果，明显改善 了局部患有重度宫颈癌的女性的生存率。当前，顺铂为广泛用于治疗包括卵巢癌、子宫颈 癌、头颈癌、非小细胞肺癌等的癌症的DNA损伤药物。最近，调查出基于钼（Platinum)的药 剂的作用机制。但是，尚未完全理解包括在细胞上基于顺铂治疗的药物的吸收及排出的调 节、DNA损伤的信号化、细胞周期的追踪、DNA修复及细胞死亡的过程。在人乳头瘤病毒18 型海拉（HeLa)细胞中，在顺铂治疗后，p53蛋白从由E6介导的分解中脱离，并优先积累于核 仁。并且，在人乳头瘤病毒16型SiHa细胞中，借助同时放射疗法和顺铂治疗来恢复了 p53 功能，从而增加了放射线感受性。
[0007] 因此，本发明人努力探索能够使对E6/E7特异性的小干扰核糖核酸发生化学变形 来表现单独或复合组合的抗癌效果，或者当与现有的化学疗法或放射疗法并用执行时，能 够表现协同效应的有效的新序列的小干扰核糖核酸，其结果，确认了在以下实施例及发明 要求保护范围中所罗列的核苷酸及它们的特定组合减少作为相关蛋白的TP53及E7的表达 和人乳头瘤病毒E6信使核糖核酸（mRNA)，并诱导细胞的死亡，通过实验证明了在单独或与 抗癌剂并用给药方面，功效更优于碱基序列残基无变形的核糖核酸。
[0008] 本说明书全文中，参照了多篇论文及专利文献，并表示了其引用。所引用的论文及 专利文献的公开内容全部插入于本说明书作为参照，从而更加明确说明本发明所属的技术 领域的水平及本发明的内容。 【
【发明内容】
】
[0009] 【发明要解决的技术课题】
[0010] 本发明人为了开发对由人乳头瘤病毒感染引起的多种疾病的有效的基因治疗剂 而锐意研宄努力。其结果发现了在利用将人乳头瘤病毒16型或人乳头瘤病毒18型病毒的 E6/E7基因作为靶的表达抑制用特定核糖核酸或它们的碱基变形的核糖核酸序列的情况 下，可有效抑制人乳头瘤病毒的基因表达，对包括宫颈癌在内的人乳头瘤病毒感染相关疾 病表现出优秀的治疗活性，从而完成了本发明。
[0011] 因此，本发明的目的在于，提供人乳头瘤病毒（HPV，human papilloma virus)感染 相关疾病，具体地人乳头瘤病毒感染相关癌症，更具体地宫颈癌（cervical cancer)的预防 或治疗用组合物。
[0012] 本发明的另一目的在于，提供人乳头瘤病毒（HPV，human papilloma virus)感染 相关疾病，具体地人乳头瘤病毒感染相关癌症，更具体地宫颈癌（cervical cancer)的预防 或治疗方法。
[0013] 以下发明的详细说明、发明要求保护范围及附图，将更加明确本发明的其他目的 及优点。
[0014] 【解决课题的技术方案】
[0015] 根据本发明的一实施方式，本发明提供人乳头瘤病毒（HPV，human papilloma virus)感染相关疾病的预防或治疗用组合物，上述人乳头瘤病毒感染相关疾病的预防或治 疗用组合物包含选自由序列表中序列16、序列22、序列28、序列34、序列40、序列66、序列 72、序列84、序列90、序列108及它们的反义核苷酸序列组成的组中的一种以上的核苷酸序 列作为有效成分。
[0016] 本发明人为了开发对由人乳头瘤病毒感染引起的多种疾病的有效的基因治疗剂 而锐意研宄努力。其结果发现了在利用将人乳头瘤病毒16型或人乳头瘤病毒18型病毒的 E6/E7基因作为靶的表达抑制用特定核糖核酸或它们的碱基变形的核糖核酸序列的情况 下，可有效抑制人乳头瘤病毒的基因表达，对包括宫颈癌在内的人乳头瘤病毒感染相关疾 病表现出优秀的治疗活性。
[0017] 根据本发明，序列表中序列16、序列22、序列28、序列34及序列40将人乳头瘤病 毒16型病毒作为靶，序列表中序列72、序列84、序列90及序列108为将人乳头瘤病毒16 型病毒作为靶的表达抑制用核糖核酸序列。
[0018] 在本说明书中，术语"核苷酸"意味着以单链或双链形态存在的核 糖核苷酸，只要不以其他特殊的方式提及，那么就包含天然核苷酸的类似物 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980) ;Uhlman 及 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990))〇
[0019] 在本说明书中，术语"表达抑制"意味着引起靶基因的功能下降，优选地，意味着由 此靶基因的表达无法被检测到或以无意义的水平存在。
[0020] 根据本发明的优选实例，本发明的核苷酸序列为具有对人乳头瘤病毒18型病毒 或人乳头瘤病毒16型病毒的E6/E7基因的基因沉默（silencing)能力的核糖核酸序列，更 优选为小干扰核糖核酸、短发夹核糖核酸、微小核糖核酸（miRNA)或反义寡核苷酸。
[0021] 在本说明书中，术语"小干扰核糖核酸"意味着可通过特定信使核糖核酸的裂解 (cleavage)诱导核糖核酸干扰（RNAi，RNA interference)现象的短的双链核糖核酸。小 干扰核糖核酸由具有与靶基因的信使核糖核酸同源的序列的正义核糖核酸和具有与其互 补的序列的反义核糖核酸链构成。小干扰核糖核酸可抑制靶基因的表达，因而提供为有效 的基因敲减方法或基因治疗（gene therapy)方法。
[0022] 小干扰核糖核酸并不局限于核糖核酸之间成对的双链核糖核酸部分完全成对，而 是可包括借助错配（对应的碱基不互补）、凸起（没有与一侧链相对应的碱基）等不成对的 部分。总长为10至100个碱基，优选为15至80个碱基，最优选为17至23个碱基。只要 可借助核糖核酸干扰效果来抑制革G基因的表达，钝性（blunt)末端或粘性（cohesive)末端 均可成为小干扰核糖核酸末端结构。粘性末端结构均可为3末端突出的结构和5末端侧突 出的结构。突出的碱基数并不受限制。例如，碱基数可以为1至8个碱基，优选为2至6个 碱基。并且，小干扰核糖核酸在可维持靶基因的表达抑制效果的范围内，例如可在一侧末端 的突出部分包含低分子核糖核酸（例如，转运核糖核酸（tRNA)、核糖体核糖核酸（rRNA)、病 毒核糖核酸等的天然核糖核酸分子或人工核糖核酸分子）。小干扰核糖核酸末端结构无需 两侧均具有裂解结构，也可以为双链核糖核酸的一侧的末端部位借助连接核糖核酸相连接 的茎环型结构。作为连接核糖核酸的长度，只要不妨碍茎部分成对，就不受特殊限制。
[0023] 在本说明书中，术语" 短发夹核糖核酸（shRNA，small hairpin RNA) "意味着以单 链的方式由50~70个组成的核苷酸，在体内（in vivo)形成莖环（stem-loop)结构。艮口， 短发夹核糖核酸为形成用于通过核糖核酸干扰抑制基因表达的紧密的发夹结构的核糖核 酸序列。在5~10个核苷酸的环部位的两侧，以互补的方式由15~30个核苷酸的长核糖 核酸形成碱基对，并形成双链茎。短发夹核糖核酸通过包含U6启动子的载体向细胞内转 导，并大致转移至子细胞，从而遗传基因表达抑制，以始终进行表达。短发夹核糖核酸的发 夹结构借助细胞内机制被裂解，从而成为小干扰核糖核酸之后，与核糖核酸诱导沉默复合 体（RISC，RNA-induced silencing complex)相结合。这些RISC与信使核糖核酸相结合来 裂解信使核糖核酸。短发夹核糖核酸被核糖核酸聚合酶III转录。根据本发明，本发明的 核苷酸序列可构成形成在环部位两侧存在的双链茎序列的短发夹核糖核酸结构。
[0024] 在本说明书中，术语"微小核糖核酸（miRNA，microRNA) "意味着用于调苄基因表 达，且全长由10~50个核苷酸，优选为15~40个核苷酸，更优选为17~25个核苷酸构 成的单链核糖核酸分子。微小核糖核酸为在细胞内不被表达的寡核苷酸，具有短茎-环结 构。微小核糖核酸与1或2以上的信使核糖核酸（messenger RNA)的全部或部分具有同源 性，并通过与上述信使核糖核酸的互补性的结合，抑制靶基因表达。
[0025] 在本说明书中，术语"反义寡核苷酸"意味着包含对特定信使核糖核酸的序列互补 的核苷酸序列的核糖核酸或它们的衍生物，与信使核糖核酸内的互补性的序列相结合，来 抑制信使核糖核酸翻译成蛋白质。本发明的反义核苷酸序列意味着对靶基因的信使核糖核 酸互补，且可与靶基因的信使核糖核酸相结合的核糖核酸序列，可抑制靶基因的信使核糖 核酸的翻译、向细胞质内的转运（translocation)、成熟（maturation)或其他所有生物学 功能所需的必要活性。
[0026] 上述反义寡核苷酸可在一种以上的碱基、糖或骨架（backbone)的位置变形，以增 进功效（De Mesmaeker et al·，Curr Opin Struct Biol. ,5(3) :343-55, 1995)。寡核苷 酸骨架可变形为硫代磷酸醋（phosphorothioate)、磷酸三醋（phosphotriester)、甲基磷 酸醋（methyl phosphonate)、单链烷基、环烷基、单链杂原子、杂环糖磺酸盐等。并且，反义 核酸可包含一种以上的被取代的糖部分（sugar moiety)。反义寡核苷酸可包含变形的碱 基。上述变形的碱基有次黄嗓呤（hypoxanthine)、6-甲基腺嗓呤（6-methyl adenine)、 5-甲基喃啶（5-methyl pyrimidine)(尤其，5-甲基胞喃啶（5-methyl cytosine))、5_ 轻 甲基胞喃啶（HMC，5-hydroxymethyl cytosine)、糖基轻甲基胞喃啶（glycosyl HMC)、龙胆 二糖基轻甲基胞喃啶（gentiobiosyl HMC)、2_氨基腺嗓呤（2-aminoadenine)、2_硫脲喃 啶（2_thiouracil)、2-硫代胸腺喃啶（2_thiothymine)、5-溴尿喃啶（5-bromouracil)、 5_ 轻甲基尿喃啶（5-hydroxymethyl uracil)、8_ 氮鸟嗓呤（8-azaguanine)、7_ 脱氮鸟嗓 吟（7_(163238皿11；[116)、呢（6-氛基己基）腺嗓吟（呢（6-3111；[110]16171)3(1611；[116)、2,6-二氛 基嗓呤（2,6-diaminopurine)、2-0-甲基尿喃啶（2-0-methyl uracil)、2_0_ 甲基鸟嗓呤 (2-0_methylguanine)及 2-氟胞喃啶（2-fluorocytosine)等。
[0027] 根据本发明的更优选的实例，本发明的核苷酸序列为小干扰核糖核酸序列。
[0028] 根据本发明的再一实施方式，本发明提供人乳头瘤病毒（HPV，human papilloma virus)感染相关疾病的预防或治疗用组合物，上述人乳头瘤病毒感染相关疾病的预防或治 疗用组合物包含含有变形的骨架（backbone)或一种以上的变形的碱基的选自由序列表中 序列1、序列7、序列12、序列16、序列22、序列28、序列34、序列40、序列46、序列51、序列 56、序列62、序列66、序列72、序列78、序列84、序列90、序列96、序列102、序列108及它们 的反义核苷酸序列组成的组中的一种以上的核苷酸序列作为有效成分。即，在所罗列的上 述核苷酸序列中，骨架变形的核苷酸或碱基变形的核苷酸可成为本发明的人乳头瘤病毒感 染相关疾病的预防或治疗用组合物。
[0029] 适用于本发明的核苷酸的骨架或碱基的变形可包括为了提高稳定性或所需的活 性而在本领域中通常所施加的任何变形。
[0030] 优选地，本发明的变形的骨架包括选自由烷基膦酸醋（alkylphosphonate)、 硫代磷酸醋、二硫代磷酸醋（phosphorodithioate)、烷基硫代膦酸醋 (alkylphosphonothioate)、氨基磷酸醋（phosphoamidate)、磷酸盐醋（phosphate ester)、 氨基甲酸醋（carbamate)、乙酰亚胺醋（acetamidate)、羧甲基醋（carboxymethyl ester)、 碳酸醋（carbonate)及磷酸三醋（phosphate triester)组成的组中的一种以上的变形。 [0031 ] 优选地，本发明的变形的碱基包括选自由甲基化（methylation)、糖基化 (glycosylation)及卤化（halogenation)组成的组中的一种以上的变形。更优选地，本发 明的变形的碱基为被2' -0甲基化（methylation)的碱基或被2' -氟化（fIuorination) 的喊基。
[0032] 根据本发明，本发明人确认如下：在对将人乳头瘤病毒16型或人乳头瘤病毒18型 病毒的E6/E7基因作为靶的表达抑制用核糖核酸的特定位置施加2' -0甲基化或2' -氟化 的变形的情况下，与变形前的核酸分子相比，大大提高了对靶基因的表达的抑制效率，在人 的血浆等中，增加了稳定性，在动物的药物动态学实验中，半衰期也显著增加了两倍以上。
[0033] 2'-0甲基化意味着与核糖核酸分子的核糖（ribose)的2号碳相结合的羟基被甲 基化来变形为2' -甲氧基，2' -氟化意味着与核糖核酸分子的核糖的2号碳相结合的羟基 被氟基取代来变形为2' -氟基。
[0034] 根据本发明的优选实例，在本发明的核苷酸中，被2' -0甲基化（methylation)的 碱基为U或G。
[0035] 根据本发明的优选实例，在本发明的核苷酸中，被2' -氟化（fluorination)的碱 基为c。
[0036] 根据本发明的优选实例，在本发明中，一种以上的碱基被2' -0甲基化 (methylation)或被2' -氟化（fluorination)的核苷酸序列选自由序列表中序列2、序列 3、序列5、序列6、序列8、序列10、序列11、序列13、序列15、序列17、序列18、序列20、序列 21、序列23、序列24、序列26、序列27、序列29、序列30、序列32、序列33、序列35、序列36、 序列38、序列39、序列41、序列42、序列44、序列45、序列47、序列49、序列50、序列52、序 列54、序列55、序列57、序列58、序列60、序列61、序列63、序列65、序列67、序列68、序列 70、序列71、序列73、序列74、序列76、序列77、序列79、序列80、序列82、序列83、序列85、 序列86、序列88、序列89、序列91、序列92、序列94、序列95、序列97、序列98、序列100、序 列101、序列103、序列104、序列106、序列107、序列109、序列110、序列112及序列113的 核苷酸序列组成的组中。
[0037] 根据本发明的另一实施方式，本发明提供人乳头瘤病毒（HPV，human papilloma virus)感染相关疾病的预防或治疗用组合物，上述人乳头瘤病毒感染相关疾病的预防或治 疗用组合物包含选自由以下混合组组成的组中的核苷酸混合组作为有效成分，上述混合组 分别为由序列表中序列2、序列4、序列8、序列9、序列12及序列15的核苷酸序列组成的混 合组、由序列表中序列18、序列21、序列29及序列32的核苷酸序列组成的混合组、由序列 表中序列42、序列45、序列52及序列55的核苷酸序列组成的混合组、由序列表中序列58、 序列59、序列63及序列65的核苷酸序列组成的混合组、由序列表中序列68、序列71、序列 91及序列94的核苷酸序列组成的混合组以及由序列表中序列98、序列100、序列109及序 列112的核苷酸序列组成的混合组。
[0038] 根据本发明，本发明人发现了在本发明的核苷酸序列使用为形成特定组合的混合 组的情况下，与使用单一序列的核糖核酸的情况相比，大大提高了靶基因的抑制效率，从而 对人乳头瘤病毒感染相关疾病具有更优秀的治疗活性。
[0039] 根据本发明的优选实例，使用本发明的组合物来进行治疗的人乳头瘤病毒感染相 关疾病选自由尖锐湿琉（genital warts)、阴道炎（vagina inflammation)、盆腔炎（pelvic inf la_ation)及癌症组成的组中，更优选地，使用本发明的组合物来进行治疗的癌症选 自由宫颈癌（cervical cancer)、阴道癌（vagina cancer)、外阴癌（vulva cancer)、肛门 癌（anal cancer)、阴莖癌（penis cancer)、扁桃体癌（tonsil cancer)、咽癌（pharynx cancer)、喉癌（larynx cancer)、头颈癌（head&neck)及肺腺癌（lung adenocarcinoma)组 成的组中。最优选地，使用本发明的组合物来进行治疗的癌症为宫颈癌。
[0040] 本发明的组合物可制备为包含本发明的核酸分子的药剂学有效量的药剂学组合 物。
[0041] 在本说明书中，术语"药剂学有效量"意味着实现上述的本发明的关节炎预防、减 轻或治疗功效或活性所需的充分的量。
[0042] 包含于本发明的药剂学组合物的药剂学上接受的载体通常用于制剂，包含乳 糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微 晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯（methyl hydroxybenzoate)、羟基苯甲酸丙醋（propyl hydroxybenzoate)、滑石、硬脂酸镁、环糊精 及其共聚物以及矿物油等，但并不限定于此。本发明的药剂学组合物除了上述成分之外，还 可包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。适当的药剂学上接受的 载体及制剂详细记载于 Remington' s Pharmaceutical Sciences (19th ed·，1995)中。
[0043] 本发明的药剂学组合物能够以口服或非口服方式进行给药，优选地，以非口服方 式进行给药，若以非口服方式进行给药，则能够以静脉内注射、皮下注射、肌肉注射、腹腔注 射、局部给药、经皮给药、关节腔给药等方式进行给药。
[0044] 本发明的药剂学组合物的适当的给药量可根据制剂化方法、给药方式、患者的年 龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性等因素来多样地开 处方。另一方面，本发明的药剂学组合物的给药量优选为每日0.0001~l〇〇mg/kg。
[0045] 在本发明的药剂学组合物使用为抗癌剂的情况下，可与本领域中通常所使用的抗 癌组合物并用，更具体地，可与顺铂或紫杉醇等的抗癌剂并用来进行给药。
[0046] 本发明的药剂学组合物可根据本发明所属技术领域的普通技术人员能够容易实 施的方法，利用药剂学上接受的载体和/或赋形剂来制剂化，从而可制备成单位容量形态 或以放入大容量容器内的方式制备。此时，剂型可以为油或水性介质中的溶液、悬浮液或 乳化液形态，或者也可以为浸膏剂、粉剂、颗粒剂、片剂或胶囊形态，还可包含分散剂或稳定 剂。
[0047] 根据本发明更优选的实例，本发明的核酸分子包含于基因传递系统（gene delive ry system)〇
[0048] 在本说明书中，术语"基因传递系统"意味着将所需的靶基因导入于对象细胞来进 行表达的介质。理想的基因传递系统应对人体无害，容易大量生产，并能有效传递基因。 [0049] 在本说明书中，术语"基因传递"意味着向细胞内传递基因，具有与基因的细胞内 转导（transduction)相同的意义。在组织水平上，上述术语"基因传递"具有与基因的传 播（spread)相同的意义。因此，本发明的基因传递系统可记载为基因转导系统和基因传播 系统。
[0050] 为了制备本发明的基因传递系统，优选地，本发明的核苷酸序列存在于适当的表 达构建体（expression construct)内。优选地，在上述表达构建体中，本发明的核苷酸序 列操作性地与启动子相连接。在本说明书中，术语"操作性地相连接"意味着核酸表达调节 序列（例：启动子、信号序列或转录调节因子结合位置的阵列）和其他核酸序列之间的功 能性结合，由此上述调节序列调节上述其他核酸序列的转录和/或翻译。在本发明中，与本 发明的核苷酸序列相结合的启动子可优选在动物细胞中，更优选在哺乳动物细胞中启动， 来调节松弛素基因的转录，包含来源于哺乳动物病毒的启动子及来源于哺乳动物细胞的基 因组的启动子，并包含如哺乳动物巨细胞病毒（CMV)启动子、腺病毒晚期启动子、痘苗病毒 7. 5K启动子、SV40启动子、HSV的tk启动子、RSV启动子、EFl α启动子、金属硫蛋白启动 子、β-肌动蛋白启动子、人类IL-2基因的启动子、人类IFN基因的启动子、人类IL-4基因 的启动子、人类淋巴毒素基因的启动子、人类GM-CSF基因的启动子及U6启动子，但并不限 定于此。
[0051] 本发明的基因传递系统能够以多种形态制备，能够以（i)裸（naked)重组DNA分 子、（ii)质粒、（iii)病毒载体及（iv)包含上述裸重组DNA分子或质粒的脂质体或类脂质 体的形态制备。
[0052] 本发明的核苷酸序列可适用于通常用于基因治疗的所有基因传递系统，优选地， 可适用于质粒、腺病毒（Lockett LJ，et al. ,Clin. Cancer Res.3:2075-2080(1997))、 腺相关病毒（Adeno-associated viruses:AAV, Lashford LS. , et al. , Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999)、逆车专录病毒 (Gunzburg WH, et al. , Retroviral vectors. Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999)、慢病毒（￥&叫6.6七&1.，]\(]1;[11· Invest. 104(11) :R55_62(1999))、单纯痕疼病毒（Chamber R.，et al.，Proc. Natl. Act. Sci USA 92:1411-1415(1995))、痕苗病毒（Puhlmann M.et al·，Human Gene Therapy 10:649-657 (1999))、脂质体（Metho s in Molecular Biology, Vol 199, S.C. Basu and M. Basu (Eds.) ,Human Press 2002)或类脂质体。
[0053] 最优选地，本发明的核苷酸序列利用阳离子脂质体（cationic liposome)来传递。
[0054] 根据本发明的还一实施方式，本发明提供人乳头瘤病毒（HPV，human papilloma virus)感染相关疾病的预防或治疗方法，上述人乳头瘤病毒感染相关疾病的预防或治疗方 法包括将药剂学组合物给药到对象（subject)的步骤，上述药剂学组合物包含：(a)，选自 由序列表中序列16、序列22、序列28、序列34、序列40、序列66、序列72、序列84、序列90、 序列108及它们的反义核苷酸序列组成的组中的一种以上的核苷酸序列的药剂学有效量， 以及（b)，药剂学上接受的载体。
[0055] 根据本发明的又一实施方式，本发明提供人乳头瘤病毒（HPV，human papilloma virus)感染相关疾病的预防或治疗方法，上述人乳头瘤病毒感染相关疾病的预防或治疗方 法包括将药剂学组合物给药到对象（subject)的步骤，上述药剂学组合物包含：(a)，包含 变形的骨架（backbone)或一种以上的变形的碱基的选自由序列表中序列1、序列7、序列 12、序列16、序列22、序列28、序列34、序列40、序列46、序列51、序列56、序列62、序列66、 序列72、序列78、序列84、序列90、序列96、序列102、序列108及它们的反义核苷酸序列组 成的组中的一种以上的核苷酸序列的药剂学有效量，以及（b)，药剂学上接受的载体。
[0056] 根据本发明的又一实施方式，本发明提供人乳头瘤病毒（HPV，human papilloma virus)感染相关疾病的预防或治疗方法，上述人乳头瘤病毒感染相关疾病的预防或治疗方 法包括将药剂学组合物给药到对象（subject)的步骤，上述药剂学组合物包含：(a)，选自 由以下混合组组成的组中的核苷酸混合组的药剂学有效量，上述混合组分别为由序列表中 序列2、序列4、序列8、序列9、序列12及序列15的核苷酸序列组成的混合组、由序列表中 序列18、序列21、序列29及序列32的核苷酸序列组成的混合组、由序列表中序列42、序列 45、序列52及序列55的核苷酸序列组成的混合组、由序列表中序列58、序列59、序列63及 序列65的核苷酸序列组成的混合组、由序列表中序列68、序列71、序列91及序列94的核 苷酸序列组成的混合组以及由序列表中序列98、序列100、序列109及序列112的核苷酸序 列组成的混合组，以及（b)，药剂学上接受的载体。
[0057] 本发明的方法利用上述的本发明组合物，因而为了避免本说明书过于复杂，省略 两者之间的共同的内容的记载。
[0058] 【发明效果】
[0059] 归纳本发明的特征及优点如下：
[0060] (a)本发明提供人乳头瘤病毒（HPV，human papilloma virus)感染相关疾病，具 体地人乳头瘤病毒感染相关癌症，更具体地宫颈癌（cervical cancer)的预防或治疗用组 合物或治疗方法。
[0061] (b)在使用本发明的核苷酸序列、它们的碱基变形的序列及它们的特定组合的情 况下，大大抑制人乳头瘤病毒16型或人乳头瘤病毒18型的E6/E7基因的表达，从而能够有 用地利用为有效的人乳头瘤病毒感染相关疾病的治疗用组合物或治疗方法。 【【附图说明】】
[0062] 图1为表示在人乳头瘤病毒16型、人乳头瘤病毒18型的小干扰核糖核酸中，基于 碱基序列的残基取代变化，确认稳定性的提高（图la)、蛋白质分子水平上的效果上升（图 Ib)及信使核糖核酸分子水平上的效果上升（图Ic)的结果的图。
[0063] 图2为表示在人乳头瘤病毒18型的小干扰核糖核酸中，确认碱基序列的残基取代 对优秀细胞的衰老诱导效果（图2a)及细胞死亡效果（图2b)的结果的图。
[0064] 图3为表示在感染人乳头瘤病毒18型的海拉宫颈癌细胞株中，基于碱基序列被取 代的426小干扰核糖核酸和抗癌剂顺铂的并用治疗的细胞衰老诱导效果（图3a)及借助显 微镜观察这一效果的结果（图3b)的图。
[0065] 图4为表示人乳头瘤病毒16型、人乳头瘤病毒18型的基于碱基序列被取代的优 秀的小干扰核糖核酸的混合治疗效果及与顺铂的并用治疗效果的协同效应的确认结果的 图。图4a、图4b及图4c分别表示细胞增殖抑制效果、细胞死亡效果及蛋白质分子水平上的 效果。
[0066] 图5为表示人乳头瘤病毒18型的小干扰核糖核酸细胞和动物中的脱靶 (off-target)效果的确认结果的图。图5a及图5b分别表示细胞上的白介素-6(IL-6)减 少效果及动物中的胞内细胞因子（INF-ga_a)减少效果。
[0067] 图6为表示通过莖环实时聚合酶链反应（Stem-loop Real-Time PCR)将人乳头瘤 病毒18型的426小干扰核糖核酸量化的结果的图。
[0068] 图7为表示确认在多种形态的脂质体中小干扰核糖核酸也表现出与在细胞中相 同的细胞死亡效果的结果的图。
[0069] 图8为表示确认基于在动物实验中表现出优秀的效果的碱基序列被取代的小干 扰核糖核酸的混合组和抗癌剂并用治疗的协同效应的图。图8a、图8b及图8c分别表示各 小鼠的肿瘤大小变化、小鼠肿瘤照片及小鼠体重的变化数值。
[0070] 【实施方式】
[0071] 以下，通过实施例对本发明进行更加详细的说明。这些实施例仅用于更加具体地 说明本发明，根据本发的要旨，本发明的范围并不受这些实施例的限制，这对于本发明所属
技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。 【实施例】
[0072]【实验方法】
[0073] 【人乳头瘤病毒16型、人乳头瘤病毒18型的小干扰核糖核酸的制备】
[0074] 下列表1、表2中的小干扰核糖核酸从韩国柏业（Bioneer)公司订货并制备而成。 在下列表中，由下划线表示的小干扰核糖核酸序列为被碱基残基与甲基相结合的2' -O-Me 变形核苷酸取代的碱基，由粗斜体表示的序列为被由氟基取代碱基残基的羟基的2' -F变 形核苷酸取代的碱基。
[0075]【表1】
[0076] 【人乳头瘤病毒16型的小干扰核糖核酸（HPV 16型siRNA)】
[0077]
[0078]
[0079]【表2】
[0080] 【人乳头瘤病毒18型的小干扰核糖核酸（HPV 18型siRNA)】
[0081]
[0082]
[0083]
[0084] 【小干扰核糖核酸的稳定性的确认】
[0085] 将小干扰核糖核酸混入10%牛血清或10%人血清之后，置于37°C的温度条件，并 按不同时间取样品后，进行急冷，并保管于_70°C的温度条件下。以50V在12%的聚丙烯酰 胺（polyacrylamide)凝胶对被收集的样品进行1个半小时的电泳，并在以Et-Br染色后， 利用紫外线（UV)来进行了测定。
[0086] 【细胞培养及小干扰核糖核酸的转导】
[0087] 按2X IO5或L 5X 10 5的细胞数，将宫颈癌细胞和感染人乳头瘤病毒18型的海拉 宫颈癌细胞株（HeLa ;ATCC CCL-2)或感染人乳头瘤病毒16型的SiHa (SiHa ;ATCC HTB-35) 或CaSki (CaSki，ATCC CRL-1550)宫颈癌细胞株接种于6-孔板之后，在37°C的温度及5% 的二氧化碳的条件下，在含有10%的牛血清的RPMI1640或DMEM培养基中分别培养了 24小 时。若在培养基中培养24小时，使得细胞吸附于培养容器表面，则使用DharmaFECT 1转染 试剂（美国Dharmacon公司）来分别转导20nM的作为对照组的非变形小干扰核糖核酸和 作为实验组的以上述方法变形的小干扰核糖核酸寡核苷酸，之后培养了 24小时。
[0088] 【抗癌剂的处理】
[0089] 向通过上述方法按2 X IO5或I. 5 X 10 5的细胞数接种于6-孔板并培养1天的海拉 或Caski细胞株转导小干扰核糖核酸之后，利用顺铂（CDDP)来进行处理，并培养成最终浓 度分别为2. 5uM。
[0090]【细胞衰老相关β半乳糖苷酶（SA-β-gal)活性的测定】
[0091] 以上述方法向海拉或Caski细胞株单独转导小干扰核糖核酸，或者与抗癌剂并用 给药后，培养了一天。利用细胞衰老测定试剂盒（美国BioVision公司），并用磷酸缓冲盐 溶液（PBS)来进行清洗，之后在37°C的温度下，在SA-β -gal染色溶液中处理了 12小时。 利用普通光学显微镜，以100~200倍的倍率观察了染色成蓝色的细胞。
[0092]【利用流式细胞仪的细胞死亡的测定】
[0093] 以上述方法向海拉或Caski细胞株单独转导小干扰核糖核酸，或者与抗癌剂并用 给药后，培养了一天。利用细胞死亡测定试剂盒（美国BD公司），并用膜联蛋白（Annexin V)和碘化丙啶（PI，propidium iodi de)试剂来进行染色，从而在常温条件下反应30分钟 后，利用流式细胞仪来确认了细胞的死亡。
[0094] 【小干扰核糖核酸的治疗影响的调查】
[0095] 以上述方法向海拉或Caski细胞株单独转导小干扰核糖核酸，或者与抗癌剂并用 给药后，培养了一天。为了观察蛋白质的变化，向细胞添加 RIPA细胞裂解液（RIPA lysis buffer) (150mM 的 NaCl、10mM 的三羟甲基氨基甲烷（Tris-HCl (pH7. 4))、5mM 的乙二胺 四乙酸（EDTA，ethylene diamine tetraacetic acid)、0.1 % 的十二烷基硫酸钠（SDS， 8〇(1；[11111(10(16071811]^3七6)、0.5%的脱氧胆酸盐（(16(?5^11〇13七6)及1%的乙基苯基聚乙二 醇（NP-40, octylphenoxypolyethoxyethanol))来进行破碎，并借助普通的免疫印迹法来 观察了蛋白质变化量。从美国圣克鲁斯（Santa Cruz)公司购买了抗TP53、抗E7、抗-肌 动蛋白（Actin)小鼠抗体，并以1:1000的比例进行稀释来使用。从美国杰克逊实验室购 买了山羊-抗-小鼠免疫球蛋白G辣根过氧化物酶结合抗体（Goat-anti-mouse IgG HRP conjugate antibody)，并以1:3000的比例进行稀释来使用。
[0096] 并且，为了观察信使核糖核酸的变化量，利用Trizol溶液（Trizol solution，美 国英杰（Invitrogen)公司）来破碎了细胞，并通过乙醇纯化检测RNA，从而借助普通的实时 聚合酶链反应（Real-time PCR)方法来观察了信使核糖核酸的变化量。
[0097] 【小干扰核糖核酸的脱靶效果的影响的调查】
[0098] 将海拉或Caski细胞株接种于6-孔板之后，在37°C的温度及5%的二氧化碳的条 件下，在含有10%的牛血清的RPMI1640或DMEM培养基中分别培养了 24小时。转导作为阳 性对照组的β半乳糖苷酶小干扰核糖核酸和小干扰核糖核酸来培养后，取下培养基，并执 行了普通的白介素-6 (IL-6)(美国BD公司）酶联免疫吸附测定（ELISA)方法。
[0099] 对6周龄的小鼠静脉注射作为阳性对照组的β半乳糖苷酶小干扰核糖核酸和作 为阴性对照组的小干扰核糖核酸来反应6小时之后，提取小鼠的血液，在分离血清后，执行 了胞内细胞因子（INF-gamma)(美国BD公司）酶联免疫吸附测定（ELISA)。
[0100]【用于小干扰核糖核酸量化的茎-环（Stem-loop)实时聚合酶链反应】
[0101] 对260~300g的4周龄的大鼠以静脉内注射的方式将小干扰核糖核酸给药后，按 不同时间提取大鼠血液，并分离了血浆。将分离的血浆稀释于〇. 25%的聚乙二醇辛基苯基 酿（triton X-100)缓冲液，并用 Taqman微小RNA反转录试剂盒（Taqman microRNA Reverse Transcription kit)(美国应用生物系统（Applied Biosystem)公司）来合成互补脱氧核 糖核酸（cDNA)后，以实时聚合酶链反应方法来进行量化，从而检测了小干扰核糖核酸。
[0102] 【小干扰核糖核酸的动物实验】
[0103] 将5X IO6的人乳头瘤病毒18型的海拉细胞株异种移植于雌性裸鼠，并在10天之 后确认生成了癌细胞之后，以2~3天的间隔对尾部静脉注射了 3mg/kg的小干扰核糖核 酸，以3~4天的间隔腹腔注射了顺铂（2mg/kg)和紫杉醇（4mg/kg)，反复注射9次，并以 2~3天的间隔测定了肿瘤的大小。
[0104] 【实验结果】
[0105] 【小干扰核糖核酸处理浓度及治疗次数的变化】
[0106] 当向感染人乳头瘤病毒16型、人乳头瘤病毒18型的Caski或海拉细胞株转导 小干扰核糖核酸，且单独或与抗癌剂并用治疗时，在以往的技术中，只能在长期以高浓度 (IOOnM)进行连续处理的情况下，才能够确认小干扰核糖核酸的功效，但在利用本发明的变 形小干扰核糖核酸的情况下，即使在短期以低浓度（20nM以下）处理一次，也发挥了优秀的 功效。
[0107] 【残基被取代的小干扰核糖核酸的稳定性的评价】
[0108] 在将以上述方法取得的组合51至组合54的小干扰核糖核酸与10%的人血清混合 后，在37°C的温度下，按不同时间取各个小干扰核糖核酸，并保管于_70°C的温度条件下， 之后电泳于12%的聚丙烯酰胺凝胶并以Et-Br染色后，利用紫外线来进行了测定。其结果， 如图Ia所示，在碱基序列的残基未被取代的组合51中，小干扰核糖核酸在2小时以内消 失，但在碱基序列的残基被取代的组合52至组合54中，小干扰核糖核酸残存4小时以上， 从而确认了稳定性大大提高。尤其，组合54中呈现出即使经过24小时，小干扰核糖核酸仍 残存的最优秀的稳定性。
[0109] 【残基被取代的小干扰核糖核酸的分子水平上的效果】
[0110] 以上述方法向海拉细胞株转导人乳头瘤病毒18型的小干扰核糖核酸组合44至 组合50的小干扰核糖核酸和对照组模拟、绿色荧光蛋白（GFP)小干扰核糖核酸，来确认了 TP53、E7蛋白的变化量，并将肌动蛋白用作了持家基因。如图Ib所示，对未取代碱基序列 的残基的组合44和取代碱基序列的残基的组合45至组合50的TP53和E7蛋白的变化量 进行了比较。此时，确认了与其他序列相比，在组合48中，TP53蛋白表达的增加和E7蛋白 表达的减少具有更优秀的功效。
[0111] 并且，在人乳头瘤病毒16型的小干扰核糖核酸497的情况下，在以上述方法将组 合12至组合15转导于Caski细胞株后，提取信使核糖核酸，来确认了 E6信使核糖核酸和 P21信使核糖核酸表达量。其结果，如图Ic所示，与对照组相比，取代碱基序列的残基的组 合13的E6信使核糖核酸减少了 60%以上，p21信使核糖核酸增加了 1100%以上。当与未 取代碱基序列的残基的组合12比较时，也确认了组合13比其他序列更优秀。
[0112] 【取代残基的小干扰核糖核酸的细胞衰老诱导效果】
[0113] 测定了以上述方法处理的海拉或Caski细胞株的SA-β -gal的活性。其结果，如 图2a所示，在转导用于现有发明的人乳头瘤病毒18型的E6/E7的小干扰核糖核酸组和450 小干扰核糖核酸的碱基序列的残基未被取代的组合51的情况下，与对照组小干扰核糖核 酸相比，SA-β-gal的活性提高了 10~20倍左右，另一方面，在小干扰核糖核酸的碱基序 列的残基被取代的组合54中，呈现出高50倍以上的SA-β -gal的活性。这证明与碱基序 列未被取代的组合51相比，碱基序列被取代的组合54的细胞衰老效果更优秀。
[0114] 【残基被取代的小干扰核糖核酸的细胞死亡效果】
[0115] 使用流式细胞仪，以上述方法测定了细胞死亡效果。与对照组比较，来确认了人乳 头瘤病毒18型的E6/E7、人乳头瘤病毒18型的E6小干扰核糖核酸组、碱基序列的残基被取 代的组合48、组合54组的细胞死亡效果，其结果，与对照组相比，人乳头瘤病毒18型的E6/ E7、人乳头瘤病毒18型的E6小干扰核糖核酸组仅仅表现出15~20%的细胞死亡效果，与 其相比，残基被取代的小干扰核糖核酸组中则表现出约60%以上的细胞死亡效果（图2b)。 这证明与现有的小干扰核糖核酸相比，碱基序列被取代的小干扰核糖核酸的癌细胞死亡效 果更明显增大。
[0116] 【残基被取代的小干扰核糖核酸和顺铂的并用治疗效果】
[0117] 以上述方法对海拉细胞株处理顺铂和碱基序列的残基被取代的组合48,并测定了 SA-β -gal活性，其结果，如图3a及图3b所示，在分别单独处理顺铂和组合48的细胞株中， 细胞也被染成蓝色，从而表现出SA- β -gal的活性，但在组合48和顺铂的并用治疗组中，几 乎所有细胞被染成深蓝色，从而表现出强的SA-β-gal的活性。这种结果证明与小干扰核 糖核酸和顺铂的单独治疗组相比，并用治疗组的细胞衰老效果明显优秀。
[0118] 【基于小干扰核糖核酸混合物的单独治疗及并用治疗的细胞增殖抑制效果】
[0119] 以上述方法对人乳头瘤病毒16型的Caski细胞株分别处理20nM的作为单独组的 人乳头瘤病毒16型的碱基序列被取代的小干扰核糖核酸组合2、组合9及组合13,转导分 别处理IOnM的组合2和组合9的混合组、分别处理IOnM的组合2和组合13的混合组、分 别处理IOnM的组合9和组合13的混合组、分别处理IOnM的组合9和组合13的混合组以 及分别处理7nM的组合2、组合9及组合13的混合组，并在24小时后测定了细胞数。其结 果，如图4a所示，在碱基序列被取代的各小干扰核糖核酸的单独处理组和小干扰核糖核酸 混合物处理组中，细胞增殖以类似的形态减少。尤其，在小干扰核糖核酸的3种混合物处理 组中，虽然分别仅处理了 7nM的小干扰核糖核酸，但效果与单独处理20nM的小干扰核糖核 酸时相同。
[0120] 在下列表3中示出了本发明中所使用的小干扰核糖核酸混合组的组合，在这些组 合中，将混合两个以上的具有尤其高的细胞增殖抑制效果的组合的小干扰核糖核酸混合组 (siRNA Pool)示于下列表4中。
[0121] 【表3】
[0122] 【小干扰核糖核酸的组合】
[0123]
[0124]
[0125]

[0127] 【表4】
[0128] 【小干扰核糖核酸混合组（siRNA Pool)】
[0129]
[0130] 【基于小干扰核糖核酸混合物的单独治疗及并用治疗的细胞死亡效果】
[0131] 以上述方法向人乳头瘤病毒18型的海拉细胞株转导处理20nM的人乳头瘤病毒18 型的碱基序列被取代的小干扰核糖核酸组合48和组合54、处理IOnM的作为小干扰核糖核 酸组合的混合组的SP4(组合48 (5nM)和组合54 (5nM))的混合组，在24小时后用膜联蛋白 (Annexin V)和碘化丙啶来进行染色，之后使用流式细胞仪来确认了细胞的死亡效果。其结 果，如图4b所示，碱基序列被取代的小干扰核糖核酸单独处理组和小干扰核糖核酸混合组 (SP4)均表现出80%以上的细胞死亡效果。根据结果，可知处理20nM的小干扰核糖核酸单 独组时与处理IOnM的小干扰核糖核酸混合组时的细胞死亡效果类似，从而可以确认小干 扰核糖核酸混合组的优秀性。
[0132] 【基于小干扰核糖核酸混合物的单独治疗及并用治疗的分子水平上的效果】
[0133] 为了以上述方法在取代碱基序列的组合2、组合9、组合13和顺铂的并用治疗组、 顺铂单独治疗组、组合2和组合9的混合组和顺铂的并用治疗组、组合2和组合13的混合 组和顺铂的并用治疗组、组合9和组合13的混合组和顺铂的并用治疗组、混合组SPl (组合 2、组合9及组合13的混合组）和顺铂的并用治疗组中比较TP53蛋白的表达量，对人乳头 瘤病毒16型的Caski细胞株使用了免疫印迹法。其结果，如图4c所示，在小干扰核糖核酸 混合组和顺铂的并用治疗组中，在以7nM的低浓度处理的混合组SPl中，TP53蛋白的表达 量增加最多。
[0134] 这是由于仅将模仿自然当中存在的小干扰核糖核酸混合组的特征，且有能力并有 效的小干扰核糖核酸选择性地由混合物构成，因而能够以低于现有的处理浓度的浓度进行 混合来使用，并且还可减少脱靶效果。
[0135] 【小干扰核糖核酸的脱靶效果】
[0136] 以上述方法向人乳头瘤病毒18型的海拉细胞株转导作为阳性对照组的β半乳糖 苷酶小干扰核糖核酸、未取代残基的组合44及碱基序列残基被取代的组合48,从而执行了 白介素-6的免疫反应实验。其结果，如图5a所示，在阳性对照组和组合44中，白介素-6 的免疫反应增加，但在碱基序列的残基被取代的组合48中，白介素-6的免疫反应减少为阳 性对照组的1/2的水平。
[0137] 并且，对6周龄的小鼠静脉注射引起免疫反应的β半乳糖苷酶小干扰核糖核酸、 人乳头瘤病毒18型的小干扰核糖核酸组合44和组合48来反应6小时之后，执行了胞内细 胞因子的免疫反应实验（图5b)。在作为阳性对照组的β半乳糖苷酶小干扰核糖核酸和组 合44中，胞内细胞因子的水平增加，从而观察到了免疫反应，但在组合48中，胞内细胞因子 成为阴性对照组水平，胞内细胞因子并未增加，从而未观察到免疫反应。
[0138] 由此可知，与残基 未被取代的小干扰核糖核酸相比，在残基被取代的小干扰核糖 核酸的处理组中，减少了免疫反应。
[0139] 【残基被取代的小干扰核糖核酸的药物动态学实验】
[0140] 以上述方法对大鼠以静脉内注射的方式将人乳头瘤病毒18型的小干扰核糖核酸 组合44和组合48进行给药，并按不同时间提取血液，分离血浆，通过茎-环实时聚合酶链 反应方法来将小干扰核糖核酸量化。其结果，如图6a所示，组合48比组合44,半衰期长两 倍以上，由此可知，碱基序列的残基被取代的组合48在体内更加稳定。
[0141] 【多种形态的脂质体（Liposome)中的小干扰核糖核酸的效果】
[0142] 以上述方法使用市场上销售的Dharmacon公司的Dharmafect转染试剂、 Invitrgen公司的阳离子脂质体（Oligofectamine)、Lipofectamine2000药物传递系统及 本发明人制备的阳离子脂质体，来向人乳头瘤病毒18型的海拉细胞株转导小干扰核糖核 酸，并在24小时后测定细胞数，从而确认了增殖抑制效果。其结果，如图7a所示，确认了在 多种药物传递系统中，可有效地向感染人乳头瘤病毒的细胞株传递小干扰核糖核酸。
[0143] 【小干扰核糖核酸混合组和抗癌剂的并用治疗效果】
[0144] 以上述方法将癌细胞异种移植于小鼠，并在10天之后确认生成了癌细胞后，反复 注射9次小干扰核糖核酸和抗癌剂，并以2~3天的间隔测定了肿瘤的大小。其结果，如 图8a所示，SP4 (组合48和组合54的混合组）和抗癌剂的并用治疗组表现出比组合44和 组合51的混合组和抗癌剂的并用治疗组更加显著的治疗效果。由此可知，与碱基序列的残 基未被取代的小干扰核糖核酸组合44和组合51的混合组相比，碱基序列的残基被取代的 SP4的功效、效果更加优秀。并且，如图8b所示，在第17天，对顺铂和紫杉醇的抗癌给药组 以及抗癌剂和SP4混合并用给药组的小鼠肿瘤进行比较，可以确认大小和状态有非常大的 差异。并且，如图8c所示，在给药后，观察第9天和第28天的小鼠体重变化量，其结果，体 重未表现出基于毒性的减少。由此可以确认不存在基于小干扰核糖核酸的毒性的副作用。
[0145] 以上，对本发明的特定部分进行了详细记述，对于本发明所属技术领域的普通技 术人员来说，这种具体记述仅仅是优选的实例，很显然，本发明的范围并不限定于此。因此， 本发明的实质性的范围应根据所附的发明要求保护范围和其等同技术方案来定义。
【主权项】
1. 一种人乳头瘤病毒感染相关疾病的预防或治疗用组合物，其特征在于，包含选自由 序列表中序列16、序列22、序列28、序列34、序列40、序列66、序列72、序列84、序列90、序 列108及它们的反义核苷酸序列组成的组中的一种以上的核苷酸序列作为有效成分。2. -种人乳头瘤病毒感染相关疾病的预防或治疗用组合物，其特征在于，包含含有变 形的骨架或一种以上的变形的碱基的选自由序列表中序列1、序列7、序列12、序列16、序列 22、序列28、序列34、序列40、序列46、序列51、序列56、序列62、序列66、序列72、序列78、 序列84、序列90、序列96、序列102、序列108及它们的反义核苷酸序列组成的组中的一种 以上的核苷酸序列作为有效成分。3. 根据权利要求2所述的人乳头瘤病毒感染相关疾病的预防或治疗用组合物，其特征 在于，上述变形的骨架包括选自由烷基膦酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸 酯、氨基磷酸酯、磷酸盐酯、氨基甲酸酯、乙酰亚胺酯、羧甲基酯、碳酸酯及磷酸三酯组成的 组中的一种以上的变形。4. 根据权利要求2所述的人乳头瘤病毒感染相关疾病的预防或治疗用组合物，其特征 在于，上述变形的碱基包括选自由甲基化、糖基化及卤化组成的组中的一种以上的变形。5. 根据权利要求4所述的人乳头瘤病毒感染相关疾病的预防或治疗用组合物，其特征 在于，上述变形的碱基为被2' -O甲基化的碱基或被2' -氟化的碱基。6. 根据权利要求5所述的人乳头瘤病毒感染相关疾病的预防或治疗用组合物，其特征 在于，上述被2' -0甲基化的碱基为U或G。7. 根据权利要求5所述的人乳头瘤病毒感染相关疾病的预防或治疗用组合物，其特征 在于，上述被2' -氟化的碱基为C。8. 根据权利要求5所述的人乳头瘤病毒感染相关疾病的预防或治疗用组合物，其特征 在于，包含上述被2' -0甲基化的碱基或被2' -氟化的碱基的核苷酸序列选自由序列表中 序列2、序列3、序列5、序列6、序列8、序列10、序列11、序列13、序列15、序列17、序列18、 序列20、序列21、序列23、序列24、序列26、序列27、序列29、序列30、序列32、序列33、序 列35、序列36、序列38、序列39、序列41、序列42、序列44、序列45、序列47、序列49、序列 50、序列52、序列54、序列55、序列57、序列58、序列60、序列61、序列63、序列65、序列67、 序列68、序列70、序列71、序列73、序列74、序列76、序列77、序列79、序列80、序列82、序 列83、序列85、序列86、序列88、序列89、序列91、序列92、序列94、序列95、序列97、序列 98、序列100、序列101、序列103、序列104、序列106、序列107、序列109、序列110、序列112 及序列113的核苷酸序列组成的组中。9. 根据权利要求1至8中任一项所述的人乳头瘤病毒感染相关疾病的预防或治疗用组 合物，其特征在于，上述核苷酸为小干扰核糖核酸、短发夹核糖核酸或反义寡核苷酸。10. 根据权利要求9所述的人乳头瘤病毒感染相关疾病的预防或治疗用组合物，其特 征在于，上述核苷酸为小干扰核糖核酸。11. 一种人乳头瘤病毒感染相关疾病的预防或治疗用组合物，其特征在于，包含选自由 以下混合组组成的组中的核苷酸混合组作为有效成分，上述混合组分别为由序列表中序列 2、序列4、序列8、序列9、序列12及序列15的核苷酸序列组成的混合组、由序列表中序列 18、序列21、序列29及序列32的核苷酸序列组成的混合组、由序列表中序列42、序列45、 序列52及序列55的核苷酸序列组成的混合组、由序列表中序列58、序列59、序列63及序 列65的核苷酸序列组成的混合组、由序列表中序列68、序列71、序列91及序列94的核苷 酸序列组成的混合组以及由序列表中序列98、序列100、序列109及序列112的核苷酸序列 组成的混合组。12. 根据权利要求1、2及11中任一项所述的人乳头瘤病毒感染相关疾病的预防或治疗 用组合物，其特征在于，上述人乳头瘤病毒感染相关疾病选自由尖锐湿疣、阴道炎、盆腔炎 及癌症组成的组中。13. 根据权利要求12所述的人乳头瘤病毒感染相关疾病的预防或治疗用组合物，其特 征在于，上述癌症选自由宫颈癌、阴道癌、外阴癌、肛门癌、阴莖癌、扁桃体癌、咽癌、喉癌、头 颈癌及肺腺癌组成的组中。14. 一种人乳头瘤病毒感染相关疾病的预防或治疗方法，其特征在于，包括将药剂学组 合物给药到对象的步骤，上述药剂学组合物包含： (a) ，选自由序列表中序列16、序列22、序列28、序列34、序列40、序列66、序列72、序 列84、序列90、序列108及它们的反义核苷酸序列组成的组中的一种以上的核苷酸序列的 药剂学有效量，以及 (b) ，药剂学上接受的载体。15. -种人乳头瘤病毒感染相关疾病的预防或治疗方法，其特征在于，包括将药剂学组 合物给药到对象的步骤，上述药剂学组合物包含： (a) ，包含变形的骨架或一种以上的变形的碱基的选自由序列表中序列1、序列7、序列 12、序列16、序列22、序列28、序列34、序列40、序列46、序列51、序列56、序列62、序列66、 序列72、序列78、序列84、序列90、序列96、序列102、序列108及它们的反义核苷酸序列组 成的组中的一种以上的核苷酸序列的药剂学有效量，以及 (b) ，药剂学上接受的载体。16. 根据权利要求15所述的人乳头瘤病毒感染相关疾病的预防或治疗方法，其特征在 于，上述变形的骨架包括选自由烷基膦酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、 氨基磷酸酯、磷酸盐酯、氨基甲酸酯、乙酰亚胺酯、羧甲基酯、碳酸酯及磷酸三酯组成的组中 的一种以上的变形。17. 根据权利要求15所述的人乳头瘤病毒感染相关疾病的预防或治疗方法，其特征在 于，上述变形的碱基包括选自由甲基化、糖基化及卤化组成的组中的一种以上的变形。18. 根据权利要求17所述的人乳头瘤病毒感染相关疾病的预防或治疗方法，其特征在 于，上述变形的碱基为被2' -O甲基化的碱基或被2' -氟化的碱基。19. 根据权利要求18所述的人乳头瘤病毒感染相关疾病的预防或治疗方法，其特征在 于，上述被2' -0甲基化的碱基为U或G。20. 根据权利要求18所述的人乳头瘤病毒感染相关疾病的预防或治疗方法，其特征在 于，上述被2' -氟化的碱基为C。21. 根据权利要求18所述的人乳头瘤病毒感染相关疾病的预防或治疗方法，其特征在 于，包含上述被2' -0甲基化的碱基或被2' -氟化的碱基的核苷酸序列选自由序列表中序 列2、序列3、序列5、序列6、序列8、序列10、序列11、序列13、序列15、序列17、序列18、序 列20、序列21、序列23、序列24、序列26、序列27、序列29、序列30、序列32、序列33、序列 35、序列36、序列38、序列39、序列41、序列42、序列44、序列45、序列47、序列49、序列50、 序列52、序列54、序列55、序列57、序列58、序列60、序列61、序列63、序列65、序列67、序 列68、序列70、序列71、序列73、序列74、序列76、序列77、序列79、序列80、序列82、序列 83、序列85、序列86、序列88、序列89、序列91、序列92、序列94、序列95、序列97、序列98、 序列100、序列101、序列103、序列104、序列106、序列107、序列109、序列110、序列112及 序列113的核苷酸序列组成的组中。22. 根据权利要求14至21中任一项所述的人乳头瘤病毒感染相关疾病的预防或治疗 方法，其特征在于，上述核苷酸为小干扰核糖核酸、短发夹核糖核酸或反义寡核苷酸。23. 根据权利要求22所述的人乳头瘤病毒感染相关疾病的预防或治疗方法，其特征在 于，上述核苷酸为小干扰核糖核酸。24. -种人乳头瘤病毒感染相关疾病的预防或治疗方法，其特征在于，包括将药剂学组 合物给药到对象的步骤，上述药剂学组合物包含： (a) ，选自由以下混合组组成的组中的核苷酸混合组的药剂学有效量，上述混合组分别 为由序列表中序列2、序列4、序列8、序列9、序列12及序列15的核苷酸序列组成的混合 组、由序列表中序列18、序列21、序列29及序列32的核苷酸序列组成的混合组、由序列表 中序列42、序列45、序列52及序列55的核苷酸序列组成的混合组、由序列表中序列58、序 列59、序列63及序列65的核苷酸序列组成的混合组、由序列表中序列68、序列71、序列91 及序列94的核苷酸序列组成的混合组以及由序列表中序列98、序列100、序列109及序列 112的核苷酸序列组成的混合组，以及 (b) ，药剂学上接受的载体。25. 根据权利要求14、15及24中任一项所述的人乳头瘤病毒感染相关疾病的预防或治 疗方法，其特征在于，上述人乳头瘤病毒感染相关疾病选自由尖锐湿疣、阴道炎、盆腔炎及 癌症组成的组中。26. 根据权利要求25所述的人乳头瘤病毒感染相关疾病的预防或治疗方法，其特征在 于，上述癌症选自由宫颈癌、阴道癌、外阴癌、肛门癌、阴莖癌、扁桃体癌、咽癌、喉癌、头颈癌 及肺腺癌组成的组中。
【专利摘要】本发明涉及人乳头瘤病毒(HPV，human papillomavirus)感染相关疾病，具体地人乳头瘤病毒感染相关癌症，更具体地宫颈癌(cervica1 cancer)的预防或治疗用组合物。在使用本发明中公开的核苷酸序列、它们的碱基变形的序列及它们的特定组合的情况下，大大抑制人乳头瘤病毒16型或人乳头瘤病毒18型的E6/E7基因的表达，从而能够有用地利用为有效的人乳头瘤病毒感染相关疾病的治疗用组合物。
【IPC分类】A61P35/00, A61K31/7105, A61K31/7088, A61K48/00
【公开号】CN104884096
【申请号】CN201380051662
【发明人】慎英基, 金永德, 郑宪淳, 金得爱
【申请人】Abion株式会社
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2013年8月1日
【公告号】CA2880777A1, EP2881123A1, US20150299711, WO2014021667A1