用于耐药性乳腺癌预后和治疗的作为新治疗助剂和生物标志物的miRNA的制作方法

用于耐药性乳腺癌预后和治疗的作为新治疗助剂和生物标志物的miRNA的制作方法
【专利说明】用于耐药性乳腺癌预后和治疗的作为新治疗助剂和生物标 志物的miRNA
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2012年11月16日提交的美国临时专利申请No. 61/727,481的优 先权权益，其通过引用以其整体并入本文。
[0003] 说明书 [0004] 发明背景
[0005] A.发明领域
[0006] 本发明涉及微RNA(miRNA)用于治疗癌症的用途，以及这些组合物用于治疗癌症 的用途。
[0007] B.相关领域描述
[0008] 所有乳腺癌中大约15 %至20 %是三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC)。这些癌症通常表现出不同的、侵袭性转移方式。接受TNBC诊断的那些的预 后通常是不良的，并且随之不成比例数目的乳腺癌死亡。虽然在TNBC疾病的早期阶段化学 治疗响应率（response rate)更好，但是超过60%的TNBC患者发生化学抗性，这导致早期 复发和缩短的存活。
[0009] miRNA是小的、非蛋白质编码RNA，其在基因调控中起着广泛作用。超过60%的人 蛋白质编码基因的信使RNA可被miRNA靶向，其在许多人细胞类型中大量存在（Friedman 等，2009)。人类基因组编码超过1000个miRNA(在曼彻斯特大学miRBase中列出了超过 1000 个智人（Homo sapiens)miRNA)〇

【发明内容】

[0010] 在一种情况下，公开了用于减少癌细胞生长的方法，所述方法包括向对象施用有 效量的包含hsa-miR-204或其同源物的组合物，所述对象具有或疑似具有hsa-miR-204或 其同源物表达降低或显著降低的癌细胞。在某些方面中，在所述对象的癌细胞中脑源性神 经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF)或埃兹蛋白是过表达或显著地 过表达的，所述对象具有或疑似具有hsa-miR-204或其同源物表达降低或显著降低的癌细 胞。
[0011] 在一些实施方案中，所述对象是哺乳动物。在某些方面中，所述对象是人。所述对 象可患有癌症，例如乳腺癌、卵巢癌或儿科肾肿瘤。在某些方面中，所述患者的乳腺癌细胞 是三阴性乳腺癌（TNBC)细胞。在某些方面中，癌细胞生长是转移性的。
[0012] 在一些实施方案中，所公开的用于减少癌细胞生长的方法还包括测定对象的细胞 中hsa-miR-204或其同源物的水平。在一些相关的实施方案中，所公开的方法是用于鉴 定可能从用于减少癌细胞生长的治疗受益的患者，所述方法包括测定所述对象的细胞中 hsa-miR-204或其同源物的水平。
[0013] 在某些方面中，通过使用基于定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR)的方法 或基于阵列杂交的方法来测定hsa-miR-204或其同源物的水平。在一些方面中，测定 hsa-miR-204或其同源物的水平是测定从对象获得的血液样品中hsa-miR-204或其同源物 的水平。在一些方面中，测定出从对象获得的血液样品中hsa-miR-204或其同源物的水平 处于降低的水平。
[0014] 在一些实施方案中，包含hsa-miR-204或其同源物的组合物配制成用于全身施 用。在某些方面中，通过静脉内注射来施用该组合物。在某些另外的方面中，所述包含 hsa-miR-204或其同源物的组合物还包含基于脂质的递送载剂（vehicle)或基于纳米颗粒 的递送载剂。
[0015] 在另一些实施方案中，还向对象施用包含第二活性剂的组合物。在另一些方面中， 所述第二活性剂是细胞毒性化学治疗剂、纳米生物缀合物（nanobioconjugate)或者除了 hsa-miR-204或其同源物之外的miRNA。在某些另外的方面中，所述细胞毒性化学治疗剂包 括紫杉烷，并且在某些另外的方面中，所述紫杉烷是紫杉醇（paclitaxel)。
[0016] 在包括施用包含第二活性剂的组合物的一些实施方案中，同时施用包含 hsa-miR-204或其同源物的组合物与包含第二活性剂的组合物。在一些另外的实施方案 中，在施用包含第二活性剂的组合物之前或之后施用包含hsa-miR-204或其同源物的组合 物。在某些方面中，包含hsa-miR-204或其同源物的组合物与包含第二活性剂的组合物之 间的施用时间间隔可以为1天至30天，或者其可以为0. 1、0. 2、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8、 0·9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、 28、29、30或更多小时或天，或者其中可推导出的任意整数。
[0017] 在还包括施用包含第二活性剂的组合物的某些实施方案中，在施用包含 hsa-miR-204或其同源物的组合物之前施用包含第二活性剂的组合物。在某些另外的方面 中，其包括在包含hsa-miR-204或其同源物的组合物之前施用包含第二活性剂的组合物， 癌细胞已经变得对所述第二活性剂有抗性。在某些另外的方面中，在包含hsa-miR-204或 其同源物的组合物之前施用包含第二活性剂的组合物，并且所述第二活性剂是化学治疗药 物。在某些另外的方面中，所述第二活性剂是紫杉酚（taxol)。在某些另外的方面中，所述 第二活性剂是紫杉醇。
[0018] 在上述方法的一些实施方案中，包含hsa-miR-204或其同源物的组合物取自包含 可药用载体的制剂。在一些方面中，所述制剂还满足对于无菌、热原和颗粒物质或其他污染 物的药典要求，或者将其配制成用于全身施用，或者既满足上述药典要求也将其配制成用 于全身施用。
[0019] 还公开了用于筛选潜在致敏物miRNA的方法，当其被抑制时，增加在亚致死浓度 的治疗活性剂中培养的癌细胞系细胞的生存力，所述方法包括：在含有miRNA抑制剂的培 养基中培养癌细胞系细胞一段时间，所述含有miRNA抑制剂的培养基包含亚致死浓度的治 疗活性剂以及候选致敏物miRNA的抑制剂；在缺乏miRNA抑制剂的培养基中培养癌细胞系 细胞相同的一段时间，所述缺乏miRNA抑制剂的培养基包含亚致死浓度的治疗活性剂但是 没有添加所述候选致敏物miRNA的抑制剂；并且在一段时间之后，测定含miRNA抑制剂细 胞群和缺乏miRNA抑制剂细胞群的生存力，其中如果所述含miRNA抑制剂细胞群（用治疗 活性剂和候选致敏物miRNA抑制剂培养）的生存力显著高于所述缺乏miRNA抑制剂细胞群 (用治疗活性剂但是没有添加候选致敏物miRNA抑制剂培养）的生存力，则将所述候选致敏 物miRNA鉴定为潜在致敏物miRNA。
[0020] 在用于筛选的该方法的某些方面中，所述潜在致敏物miRNA是hsa-miR-204、 hsa-miR-185、hsa-miR-211、hsa-miR-367_5p(还称为 hsa-miR-367 * )或 hsa_miR-133A， 或者这些miRNA之任意一种的同源物。在某些方面中，所述治疗活性剂的亚致死浓度是以 其培养72小时之后，80%的所述癌细胞系细胞保持活力的浓度。在某些另外的方面中，所 述治疗活性剂是例如在2nM至SnM亚致死浓度下的紫杉酚和/或其他化学治疗药物。在某 些另外的方面中，所述癌细胞系细胞是TNBC细胞。
[0021] 还公开了用于筛选潜在脱敏物miRNA的方法，当其被抑制时，降低在亚致死浓度 的治疗活性剂中培养的癌细胞系细胞的生存力，所述方法包括：在含有miRNA抑制剂的培 养基中培养癌细胞系细胞一段时间，所述含有miRNA抑制剂的培养基包含亚致死浓度的治 疗活性剂以及候选脱敏物miRNA的抑制剂；在缺乏miRNA抑制剂的培养基中培养癌细胞系 细胞相同的一段时间，所述缺乏miRNA抑制剂的培养基包含亚致死浓度的治疗活性剂但是 没有添加所述候选脱敏物miRNA的抑制剂；并且在一段时间之后，测定含miRNA抑制剂细 胞群和缺乏miRNA抑制剂细胞群的生存力，其中如果所述含miRNA抑制剂细胞群（用治疗 活性剂和候选脱敏物miRNA抑制剂培养）的生存力显著低于所述缺乏miRNA抑制剂细胞群 (用治疗活性剂但是没有添加候选脱敏物miRNA抑制剂培养）的生存力，则将候选脱敏物 miRNA鉴定为潜在脱敏物miRNA。
[0022] 在用于筛选的该方法的某些方面中，所述潜在脱敏物miRNA是hsa-miR-129-3p、 hsa-miR-296-5p、hsa-miR-216a、hsa-miR-1237、hsa-miR-1915 *、hsa_miR-320d，或者这些 miRNA之任意一种的同源物。在某些方面中，所述治疗活性剂的亚致死浓度是以其培养72 小时之后，80%的所述癌细胞系细胞保持活力的浓度。在某些另外的方面中，所述治疗活性 剂是例如在2nM至SnM的亚致死浓度下的紫杉酚和/或其他化学治疗药物。在某些另外的 方面中，所述癌细胞系细胞是TNBC细胞。
[0023] 在一些实施方案中，公开了用于减少癌细胞生长的方法，其包括向对象施用有效 量的包含致敏物miRNA或致敏物miRNA之同源物的组合物，所述对象具有或疑似具有致敏 物miRNA表达降低或显著降低的癌细胞。在一些实施方案中，公开了用于减少癌细胞生长 的方法，所述方法包括向对象施用有效量的包含脱敏物miRNA抑制剂或脱敏物miRNA之同 源物抑制剂的组合物，所述对象具有或疑似具有脱敏物miRNA表达显著增加的癌细胞。
[0024] 在一些实施方案中，公开了用于鉴定可能从用于减少癌细胞生长的治疗受益的对 象的方法，所述方法包括测定所述对象的细胞中致敏物miRNA或致敏物miRNA同源物的水 平。在某些方面中，该方法的致敏物miRNA是hsa-miR-204、hsa-miR-185、hsa-miR-211、 hsa-miR-367_5p (还称为 hsa-miR-367 * )、hsa_miR-133A 或这些致敏物 miRNA 之一的同 源物。
[0025] 在一些实施方案中，公开了用于鉴定可能从用于减少癌细胞生长的治疗受益的 对象的方法，所述方法包括测定所述对象的细胞中脱敏物miRNA或脱敏物RNA同源物 的水平。在某些方面中，该方法的脱敏物miRNA是hsa-miR-129-3p、hsa-miR-296-5p、 hsa_miR-216a、hsa-miR-1237、hsa-miR-1915 *、hsa_miR-320d 或这些脱敏物 miRNA 之一 的同源物。
[0026] 在表 1 中提供了 致敏物 miRNA hsa-miR-204、hsa-miR-185、hsa-miR-211、 hsa-miR-367-5p(还称为 hsa-miR-367 * )和 hsa-miR-133A( SP， hsa-miR-133A-2)， 以及脱敏物 miRNA hsa-miR-129-3p ( SP，hsa-miR-129-l 的-3p 区）、hsa-miR-296-5p、 hsa_miR-216a、hsa-miR-1237、hsa-miR-1915 * 和 has_miR-320d 之莖环序列的序列和 SEQ ID NO。
[0027] 当提及miRNA使用时，术语"同源物"是指像所提及的miRNA那样起作用（例如，像 所提及的miRNA那样能够靶向基因表达）的寡核苷酸。同源物通常具有与所提及的miRNA 在性质（例如，序列和结构）上的相似性水平，根据本公开内容，本领域普通技术人员可将 其鉴定为所提及序列的同源物（例如，使用miRNA同源物鉴定工具，例如，在默认/严格参 数下的 miRNAminer ;参见，例如，可在 groups, csail. mit. edu/pag/mirnaminer/ 上在线获 得的miRNAminer工具；还参见Artzi等，2008) 〇
[0028] 除非另外指明（例如，提及序列同源性或比对），对于化合物，本文表达的百分比 值是按重量计的重量并且与总组合物有关。
[0029] 术语"显著地"（例如，当提及例如"减少"或"增加"；"较低"或"较高"；"抑制" 或"过表达"；"未能超过"或"超过"或者类似类型的限定语而使用时）是指参照或测试样 品中的水平，其至少为大于测定标准误差之幅度的幅度，所述测定用于评估限定语所应用 的特征。在一些情况下，参照或测试样品的统计学显著性可与小于0. 25、0. 15、0. 10、0. 05、 0· 025、0· 01 、0· 005、0· 001、0· 0005 或 0· 0001 的 P 值相关。
[0030] 可药用载体可包括但不限于：病毒、脂质体、纳米颗粒或聚合物及其任意组合。相 关的递送载剂可包括但不限于：脂质体、生物相容性聚合物（包括天然聚合物和合成聚合 物）、脂蛋白、多肽、多糖、脂多糖、人工病毒包膜、无机（包括金属）颗粒、以及细菌或病毒 (例如杆状病毒、腺病毒和逆转录病毒）、菌体、黏粒或质粒载体。
[0031] 术语"约"或"大约"定义为与本领域普通技术人员所理解的接近，并且在一个非 限制性实施方案中，将该术语定义为在10%以内，优选为在5%以内，更优选为在1 %以内， 并且最优选为在0. 5 %以内。
[0032] 术语"抑制"、"减少"、"治疗"或这些术语的任何变体包括任何可测量的降低或完 全抑制以获得期望的结果。类似地，术语"有效"意指足以达到期望的、预期的或想要的结 果。
[0033] 当与术语"包含"一起使用时，词语"一种"或"一个"的使用可意指"一种/个"， 但是也与"一种/个或更多种/个"、"至少一种/个"和"一种/个或多于一种/个"的含 义一致。
[0034] 词语"包含（comprising) "（以及包含的任意形式，例如"包含（comprise) "和"包 含（comprises) "）、"具有（having) "（以及具有的任意形式，例如"具有（have)"和"具有 (has)"）、"包括（including)"（以及包括的任意形式，例如"包括（includes)"和"包括 (include)"）或者"含有（containing)"（以及含有的任意形式，例如"含有（contains)" 和"含有（contain)"）是包括性的或开放式的并且不排除与总组合物有关的另外的、未叙 述的要素或方法步骤。
[0035] 组合物和方法的使用可"包含/包括贯穿本说明书所公开的任何成分或步骤"、"基 本上由贯穿本说明书所公开的任何成分或步骤组成"或者"由贯穿本说明书所公开的任何 成分或步骤组成"。
[0036] 应考虑，在本说明书中讨论的任何实施方案均可相对于本发明的任何方法或组合 物来实施，反之亦然。此外，本发明的组合物可用于实现本发明的方法。
[0037] 从以下详细描述中，本发明的其他目标、特征和优点将变得明显。然而，应理解，仅 通过举例说明的方式给出本发明的详细描述和具体实施例，同时指明一些具体实施方案， 因为从该详细描述中，在本发明的精神和范围内的多种改变和修改对于本领域技术人员来 说是明显的。
【附图说明】
[0038] 图IA至1G.癌症中miR-204的基因组丢失。图1A.在所选择的具有（左边）或 没有（右边）miR-204缺失的儿科肾肿瘤上的高分辨率miRNA-CGH(比较基因组杂交）。由 虚的垂线表示包含miRNA的基因组基因座的缺失。点表示反映拷贝数改变的各探针的位置 和值，在CGH阵列上以一式三份表示。趋势线表示各肿瘤的三个探针的平均值。图1B.从 卵巢癌高分辨率CGH的元分析（η = 354 ;获得自TCGA)获得的图，所述卵巢癌代表具有或 没有缺失的癌症的亚类。由虚的垂线表示包含hsa-miR-204的基因组基因座的缺失。图 1C&1D.在儿科肾肿瘤（C)和卵巢癌（D)中的hsa-miR-204基因组基因座的等位基因 PCR。 y轴表示l〇g2转化的相对定量值。虚线表示拷贝丢失阈值。图IE至1G.当与正常匹配的 对照肾（η = 38)、正常卵巢组织（η = 5)和正常匹配的乳腺组织（η = 10)相比时，示出在 儿科肾肿瘤（η = 38 ;Ε)、晚期卵巢癌（n = 11 ;F)和乳腺癌（n = 10 ;G)中的miR-204水平 之qRT-PCR分析的图示。
[0039] 图2A至2D. hsa-miR-204抑制肿瘤生长和转移。图2A. hsa-miR-204抑制无贴壁 依赖性生长。图描绘了由稳定地过表达乱序（scramble)或miR-204、还用miR-204抑制剂 转染的HEK-293细胞在软琼脂孔中形成的集落数。（* )P < 0. 05 ; ( * * )P < 0. 01。结 果是三次独立实验的平均值。图2B. hsa-miR-204过表达抑制肿瘤生长。HEK-293细胞稳 定地过表达乱序对照或hsa-miR-204。柱状图表示对应hsa-miR-204 (η = 9)和乱序对照 (η = 9)转染子的平均肿瘤体积。（*)Ρ< 0· 001。图2C.来自过表达乱序（对照）或 hsa-miR-204 (miR-204)的肿瘤异体移植物之切片的组织学分析。右边组的图像表示左边组 中所示的方框区域的放大视图。通过肿瘤到肾组织的侵入来反映在对照转染子中的肿瘤侵 入。图2D.用75nM乱序序列（对照）转染或用hsa-miR-204模拟物（miR-204)转染或者 用hsa-miR-204模拟物转染的细胞进一步用hsa-miR-204抑制剂（miR-204+抑制剂）转染 之MDA-MB-231细胞的基膜基质侵入测定。柱状图表示对应在每个滤光器之5个不同场中 用显微镜计数的平均侵入细胞数目。（*** )P< 0.001。
[0040] 图3A至3B. miR-204的全身递送抑制肿瘤转移。图3A.在阴性对照组中具有转移 灶的代表性肺切片。图3B.在hsa-miR-204注射小鼠中没有肝毒性。来自hsa-miR-204注 射小鼠的肝的切片没有示出肝毒性征兆。
[0041] 图4A至4H. hsa-miR-204调控癌症中BDNF的表达。图4A至4C.在多种癌症中， 较高的BDNF表达与较低的hsa-miR-204表达强烈相关。当与正常匹配的对照肾（η = 38)、 正常卵巢组织（η = 5)和正常匹配的乳腺组织（η = 10)相比时，揭示在儿科肾肿瘤（η = 38 ;Α)、晚期卵巢癌（η = 11 ;Β)和乳腺癌（η = 10 ;C)中的hsa-miR-204与BDNF表达负相 关之qRT-PCR分析的图示。图4D. BDNF 3' -UTR中推定的miR-204结合序列的示意图。图 4E. hsa-miR-204过表达细胞和使用BDNF特异性引物用hsa-miR-204抑制子转染的细胞的 qRT-PCR分析。图4F.使用抗BDNF抗体（I : 1000)之用miR-204模拟物转染的HEK-293 细胞的Western印迹分析。将β-肌动蛋白用作上样对照。凝胶照片代表三次独立实验。 图4G.使用Total Labs TL100 ID凝胶分析软件定量的条带强度的图示（η = 3)。将对照 的BDNF蛋白质水平设为100。
[0042] 图5Α至5C. hsa-miR-204通过改变AKT/mTOR/Racl信号传导抑制肿瘤细胞迀移 和侵入。图5A. has-miR-204抑制AKT和mTOR信号传导的激活。用hsa-miR-204转染的 HEK-293细胞在无血清条件下生长并且对其进行使用抗-磷酸化-Ser473-AKTd : 1000)、 抗-总-AKT (1 : 1000)、抗-磷酸化-Ser235/236-S6 (1 : 1000)、抗-总-S6 (1 : 1000)、 抗-磷酸化-Thr37/46-4E-BPl (1 : 1000)和抗-总-4E-BP1 (1 : 1000)的 western 印迹 分析。将β-肌动蛋白（1 : 10, 〇〇〇)用作上样对照。凝胶照片代表三次独立实验。图 5Β. hsa-miR-204增加 ΗΕΚ-293细胞对凋亡的敏感性，如通过使用FITC-膜联蛋白V凋亡 检测试剂盒之膜联蛋白V/PI染色所测定的。示出的百分比细胞群是三次独立实验的平 均土SEM。图5C.使用抗胱天蛋白酶-3(1 : 500)抗体和抗-PARP(1 : 1000)进行的用 hsa-miR-204转染之HEK-293细胞的Western印迹分析揭示胱天蛋白酶-3和PARP之增加 的切割。将β-肌动蛋白（1 : 10, 〇〇〇)用作上样对照。凝胶照片代表三次独立实验。
[0043] 图6.其中成功地测定974种抑制剂的筛选。用紫杉醇（Pac)对MDA-468细胞的 筛选产生了 47种生存力比（v.r.) <0.85的miRNA致敏物。在这些中，10种miRNA显著处 于p < 0. 05的水平。注意筛选的应用标准导致致敏物和脱敏物miRNA的选择。这些miRNA 之一（致敏物hsa-miR-204 (miR-204))，当其过表达时，与对照相比，在紫杉醇的存在下产 生MDA-468细胞生存力的显著降低。
[0044] 图7. hsa-miR-204(miR-2x4)与其靶基因 BDNF和埃兹蛋白之间在表达上的负相 关。
[0045] 图8. BDNF表达和埃兹蛋白表达是hsa-miR-204 (miR-2x4)的真实靶标。
[0046] 图9A至9B.在肿瘤中包含miRNA的染色体区的拷贝数丢失。图9A.多种人miRNA 以及卵巢癌、乳腺癌和儿科肾肿瘤的样品结果。图9B.从乳腺癌高分辨率CGH的元分析获 得的图，所述乳腺癌代表具有或没有缺失的癌症的亚类。由虚垂线表不包含hsa-miR-204 的基因组基因座的缺失。
[0047] 图IOA至10B. hsa-miR-204靶向与肿瘤发生相关的基因。图10A.多于40个包括 BDNF之基因的LogJf数改变。图10B.生物学功能的下调基因。注意，在多种类型的生物 功能的下调基因中，BDNF的普遍存在。
[0048] 图 IlA至 11B. BDNF营救（rescue)hsa-miR-204相关的或诱导的表型。图 11A. BDNF 营救hsa-miR-204诱导的细胞[非]迀移表型。图11B. BDNF营救hsa-miR-204诱导的细 胞[非]侵入表型。
[0049] 图 12. Hsa-miR-204 (miR-204)不影响 TRPM3 水平。
[0050] 图13. miR-296-5p抑制敏化三阴性乳腺癌中的紫杉醇响应。
[0051] 图14. miR-296-5p抑制三阴性乳腺细胞迀移和侵入。
[0052] 图15.为了进一步确定这些miRNA在治疗TNBC中的效力，我们在牙科海绵上培养 肿瘤组织块（1_3)。肿瘤植入物保持如上面两图所示的肿瘤结构。
[0053] 图16.使用脂质体制剂单独添加致敏物miRNA导致肿瘤细胞的杀伤。
【具体实施方式】
[0054] 本发明人已证明，miRNA在介导三阴性乳腺癌（TNBC)细胞中之药物敏感性/抗性 中的关键作用。通过高通量miRNA/miRNA抑制剂文库筛选，本发明人已经鉴定了独特地致 敏针对紫杉醇（通常用作TNBC病症第一线治疗的药物）有药物抗性之TNBC细胞的miRNA。 这些筛选还揭示了，与来自健康同胞的血清相比，致敏针对紫杉醇有抗性之TNBC细胞的 miRNA可以以显著较低的水平存在于复发转移的TNBC患者的血清中。
[0055] 此外，候选致敏物miRNA已经示出具有在多种癌症中的大幅降低的表达并且充当 有效的肿瘤抑制剂。使用基于脂质体的方案，本发明人示出，在临床前小鼠肿瘤模型中，候 选致敏物miRNA的全身递送抑制乳腺癌肺转移而没有肝毒性。
[0056] 本发明人已证明，候选致敏物miRNA通过靶向参与肿瘤发生的基因发挥其功能。 这些包括编码脑源性神经营养因子（BDNF)(已知促进肿瘤发生和侵入的神经营养蛋白家 族成员）的基因。原发性肿瘤的分析揭示了候选致敏物miRNA表达的明显降低伴随着BDNF 或其受体原肌球蛋白相关激酶B(TrkB)表达的增加。这些分析还揭示了候选致敏物miRNA 的丢失不仅导致BDNF过表达，而且导致经过AKT/mTOR信号传导途径的小GTP酶（GTPase) Rac以及肌动蛋白再组织二者的后续激活，这导致癌细胞迀移和侵入。
[0057] 本发明人的一些显著的具体证明如下：通过候选致敏物miRNA之miRNA介导的针 对紫杉醇有药物抗性的癌细胞的致敏；在候选致敏物miRNA全身递送之后，抑制了 TNBC肺 转移；以及候选致敏物miRNA在TNBC患者血清中的较低水平（对于诊断目的潜在地显著）。 赋予药物敏感性的miRNA的鉴定可有助于提供新一代治疗剂，以及提供新的预后工具以通 过分析TNBC细胞的miRNA表达谱来监测针对特定药物的TNBC治疗响应。此外，因为紫杉 醇用于治疗多种类型的癌症，所以本发明具有不仅对于乳腺癌治疗而且对于许多其他类型 癌症治疗的有益启不。
[0058] 本发明人已证明，肿瘤抑制剂 hsa-miRNA-204的基因组丢失通过激活AKT/mTOR/ Racl信号传导和肌动蛋白再组织来促进癌细胞迀移和侵入。
[0059] 包含微RNA的染色体区在癌症中可能是功能上重要的。本发明人已证明，编码 hsa-miR-204的基因组基因座经常在多种癌症（包括卵巢癌、儿科肾肿瘤和乳腺癌）中丢 失。特别地，hsa-miR-204已经示出在多种癌症中具有大幅降低的表达并且其充当有效的 肿瘤抑制剂，当全身递送时，抑制体内肿瘤转移。
[0060] 本发明人已证明，hsa-miR-204通过靶向参与肿瘤发生的基因发挥其功能，包括 脑源性神经营养因子（BDNF)，其为已知促进肿瘤发生和侵入的神经营养蛋白家族成员。 原发性肿瘤的分析还揭示了 BDNF或其受体原肌球蛋白相关激酶B(TrkB)增加的表达与 hsa-miR-204的明显降低的表达相平行。hsa-miR-204的丢失导致BDNF过表达和经过AKT/ mTOR信号传导途径的小GTP酶Rac以及肌动蛋白再组织的后续激活，这导致癌细胞迀移和 侵入。
[0061] 包含hsa-miR-204的基因组基因座的微缺失（microdeletion)与为肿瘤生长 和转移提供重要刺激之关键致癌途径的失调直接相关。因此，本发明人在治疗上操作 hsa-miR-204水平从而抑制肿瘤转移。
[0062] 在表1中提供了本文鉴定的hsa-miR-204和另一些miRNA的序列。
[0063] 表1.选择的miRNA的miRBase登录号、SEQ ID NO和序列：在应用时，各miRNA的 第二行&第四行子序列分别为-5p&-3p子序列。
[0064]
[0065]

[0067] A.微RNA和癌症
[0068] 具有癌基因和肿瘤抑制基因之染色体区的鉴定导致对肿瘤发病机制的更好理解 和更好的治疗结果（Bayani等，2007)。尽管在具有染色体异常的区域中已经鉴定了多个 癌症相关的基因（Albertson等，2003)，但是具有在癌症生长和进展中重要因子之具有随 机或复发性染色体异常的另外区域仍然有待鉴定。目前的研宄表明微RNA(miRNA)是这些 因子组中的一个（Varambally等，2008)。miRNA是通过与靶mRNA的3'非翻译（UTR)区 相结合来调控转录后基因表达的小、内源性、非编码RNA。已知miRNA在包括发育和分化 的多个生物学过程中具有重要功能（Bartel等，2004)。miRNA的失调表达已经涉及包括 癌症的多种人疾病（Bartels等，2009)。有证据表明miRNA可充当癌基因或肿瘤抑制基因 (Esquela-Kerscher 等，2006) 〇
[0069] 已鉴定Hsa-miR-204经常在多种癌症中丢失。本发明人的研宄结果证明 hsa-miR-204通过抑制与肿瘤发生相关的基因（包括脑源性神经营养因子（BDNF))的功 能来充当有效的肿瘤抑制剂。BDNF是生理上重要的神经生长因子，其通过结合以及后续 激活酪氨酸激酶受体，原肌球蛋白相关的激酶B(TrkB)在神经系统发育中起着关键作用 (Lewin，1996 ;Segal等，1996)。此外，据报道，BDNF/TrkB途径在肿瘤发生中具有关键作 用，因为其促进增殖、分化、血管发生和肿瘤侵入（Au等，2009)。BDNF/TrkB的过表达还已 经涉及多种实体瘤（包括神经母细胞瘤、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌和肺癌）的不良预后 (Brodeur，2003 ;Eds jo 等，2003 ;Nakagawara 等，1994)。hsa-miR-204 的丢失导致 BDNF/ TrkB过表达和伴随的AKT/mTOR/Racl信号传导途径的激活，这导致在癌细胞迀移和侵入期 间的肌动蛋白再组织。这些结果强调了包含特定miRNA的染色体区具有在肿瘤发生中特别 的功能重要性。
[0070] B.癌症中 hsa-miR-204 的体细胞丢失（Somatic Loss)
[0071] 为了鉴定与人癌症中畸变染色体区相关的miRNA，将高分辨率定制miRNA比较基 因组杂交（CGH)与高密度CGH公共领域数据集一起用于卵巢癌、乳腺癌和儿科肾肿瘤。该分 析揭示了在这些肿瘤的最小染色体缺失和扩增区域中的多个miRNA。为了开始理解在肿瘤 发生中与miRNA相关的染色体基因座的功能重要性，检查了表现出基因组丢失的miRNA(图 1和例如，图9A)。包含hsa-miR-204的9q21. 12染色体区在44. 63% (158/354)的卵巢癌、 28% (10/35)的乳腺癌和40% (15/38)的儿科肾肿瘤中经常丢失（关于儿科肾肿瘤和卵巢 癌，还可分别参见图IA和IB ;对于乳腺癌，参见图9B)，其进一步通过定量基因组实时PCR 分析所证实（图IC和1D)。此外，在所有三种肿瘤类型中，成熟miR-204水平的降低还与其 基因组DNA含量密切相关（图1E、IF和1G)。
[0072] C.充当有效的肿瘤生长和转移抑制剂的hsa-miR-204
[0073] 在多种癌症组织中的hsa-miR-204的大幅降低表达促进确认（addressing) hsa-miR-204在肿瘤发生中的作用。首先确认了 hsa-miR-204对无贴壁依赖性生长的作 用。据报道，经过52次传代的HEK-293细胞是高度致瘤的（Shen等，2008)，并且过表达 hsa-miR-204的胚胎肾HEK-293细胞表现出降低的集落形成能力。但是，用hsa-miR-204抑 制剂的过表达营救了集落形成能力（图2A)。乳腺癌MDA-MB-231细胞和卵巢癌SKOV3细胞 中的hsa-miR-204过表达也获得了类似结果（数据未示出）。为了进一步证实hsa-miR-204 的潜在肿瘤抑制剂样活性，将稳定地过表达hsa-miR-204或乱序序列的高传代HEK-293细 胞注射入裸鼠的肾被膜中并且在注射后24天评估肿瘤生长和转移。与对照肿瘤形成鲜明 对比，hsa-miR-204过表达肿瘤在尺寸上大幅减小。接着检查了 hsa-miR-204是否还抑制 肿瘤细胞侵入。异种移植物肿瘤切片的组织学分析表明，与对照相比，过表达miR-204的肿 瘤对肾组织的侵入大幅降低或者没有侵入（图2C)。与此一致，hsa-miR-204过表达大幅降 低了乳腺癌（MDA-MB-231)细胞和卵巢癌（SKOV3)细胞体外的迀移和侵入能力（图2D，并且 数据未示出）。
[0074] D. hsa-miR-204 的治疗靶向
[0075] 为了进一步证明hsa-miR-204的转移抑制活性，进行了乳腺癌-肺转移模型中的 治疗实验。首先，通过尾静脉注射表达荧光素酶GFP的MDA-MB-231乳腺癌细胞来建立肺转 移。然后，在30天中，每5天使用基于LANCErII脂质的体内递送载剂将hsa-miR-204或 hsa-miR-204突变体寡核苷酸（阴性对照）注射入这些裸鼠的尾静脉。令人感兴趣的是， hsa-miR-204的全身递送导致肺转移的显著降低或消除，然而，与之相反，hsa-miR-204突 变体寡核苷酸注射的小鼠具有转移，包括严重的肺转移（图3A)。特别地，用hsa-miR-204注 射的小鼠没有表现出明显的副作用，至少如肝毒性的不存在或体重的改变所揭示（图3B， 以及未示出的数据）。这些结果表明hsa-miR-204及其同源物可形成安全和可行的治疗方 案的基础以治疗肿瘤生长和转移。
[0076] 在类似的实验中，用三阴性乳腺癌细胞移植小鼠并且用miR-204寡核苷酸或具有 种子序列突变的寡核苷酸通过尾静脉注射两组小鼠。在30天中，每6天给予尾静脉注射。 令人感兴趣的是，miR-2x4的全身递送导致肺转移的显著降低或消除，而miR-2x4突变体寡 核苷酸注射的小鼠具有严重的肺转移。这些结果表明可在治疗上靶向miR-204以治疗肿瘤 生长和转移。
[0077] E.与肿瘤发生相关的hsa-miR-204靶向基因
[0078] 为了理解支持hsa-miR-204可在肿瘤发生中起作用的机制，鉴定了由miR-204调 控的基因。因为大多数miRNA起着降低靶mRNA水平的作用（Guo等，2010)，所以在过表达 hsa-miR-204的细胞上进行基因表达分析并确定hsa-miR-204的潜在革E标。在hsa-miR-204 过表达细胞中变化的基因之中，下调的基因可能由hsa-miR-204直接靶向。令人感兴趣的 是，多个下调基因与癌症相关的过程有关并且彼此在物理上或功能上相互作用，如通过基 于通路的分析所揭示的（图IOA和10B)。在这些基因中，在一个这样的基因上进行详细分 析：BDNF，其在微阵列分析中示出较高的变化水平并且其特征为在所有预测的生物学通路 中具有最高的功能富集显著性。已知BDNF与其受体TrkB在肿瘤血管发生和转移中起着 关键作用Gidsjo等，2003 ;Nakagawara等，1994)。此外，多种革El标预测算法也预测BDNF被 hsa-miR-204革El向，所述算法包括SvMicrO (Liu等，2010)、贝叶斯决策融合方法（Bayesian decision fusion approach) (Yue 等，2010)和本发明人产生的 miRmate (Du 等，2009)，以及 TargetScan (Lewis 等，2005)和 Pictar (Krek 等，2005)。此外，发现 hsa-miR-204 结合位点 在所有脊椎动物中是进化上保守的，表明其具有跨过多个物种的重要调控功能。重要地，在 多种肿瘤中，hsa-miR-204与BDNF/TrkB的表达示出强烈的负相关（图4A、4B和4C)。
[0079] 为了证实微阵列和靶标预测结果，首先研宄了 hsa-miR-204是否通过与其3， UTR中的预测位点结合来靶向BDNF(图4D)。事实上，当与没有3' -UTR的构建体相比 时，包含BDNF 3' -UTR的pMIR报道基因构建体的荧光素酶活性被显著抑制，其在过表达 hsa-miR-204的细胞中进一步降低。相反，在含BDNF 3' -UTR的构建体中之种子序列的突 变不仅将荧光素酶活性恢复至接近野生型构建体的活性，而且使来自突变体构建体的转录 物对hsa-miR-204过表达不敏感，证实了 hsa-miR-204与BDNF 3' -UTR中预测的结合位点 之间的特异性相互作用。
[0080] 为了进一步证明这些结果，测定在过表达hsa-miR-204细胞中的BDNF的水平。 miR-204过表达导致BDNF在RNA和蛋白质水平两者上的显著降低（图4E、4F和4G)。然后， 检查了 BDNF是否为miR-204功能上重要的靶标。为了确认该结果，进行了营救实验。BDNF 的再引入营救了 hsa-miR-204诱导的表型，包括无贴壁依赖性生长、细胞迀移和侵入（图 11A&1 IB ;以及未示出的数据）。这些结果表明hsa-miR-204介导的BDNF调控是癌细胞生 长、迀移和侵入中的重要事件。
[0081] F. Hsa-miR-204的丢失激活癌细胞中的AKT/mTOR信号传导和Racl易位
[0082] 为了确定通过其hsa-miR-204可表现出其肿瘤生长和转移抑制活性的机制，根据 在之前已经示出激活AKT途径的BDNF(Troca-Martin等，2010)，检查了 hsa-miR-204对 AKT/mTOR信号传导的作用；此外，已经示出通过mTOR对AKT的选择性激活调控癌细胞迀移 和侵入。令人感兴趣的是，hsa-miR-204过表达导致AKT和mTOR下游靶标4E-BP1和S6的 活性降低（图5A)。4E-BP1是在磷酸化之后从eIF4E解离以允许蛋白质翻译的翻译抑制 剂，并且S6是其磷酸化有利于核糖体的组装和后续mRNA翻译的核糖体蛋白质。AKT通过调 控参与肌动蛋白组织、细胞与细胞粘附和细胞运动的多个过程来控制细胞侵入性（Kim等， 2011 ;Grille 等，2003 ;Enomoto 等，2005)。
[0083] 为了检查miR-204是否可在该过程中发挥直接作用，评估了 hsa-miR-204过表达 对小G蛋白Racl的激活的作用。小G蛋白Racl与AKT/mTOR功能上相互作用，并且据报 道，在用BDNF(zadran等，2010)或表皮生长因子（EGF) (Kim等，2011)诱导后，其在细胞迀 移和肌动蛋白再组织中起着重要作用。用BDNF或EGF刺激MDA-MB-231细胞（以及SK0V3 细胞或HEK-293细胞）诱导膜边缘波动（ruffling)，并且该刺激引起Racl易位到边缘波 动 区域（数据未示出）。相反，当用BDNF或EGF诱导时，在过表达hsa-miR-204的细胞中未观 察到膜边缘波动和Racl易位（数据未示出）。凋亡逃避（其对于肿瘤生长和进展是关键的 (Hanahan等，2000))可以是对于表现出hsa-miR-204丢失的癌症中之癌发生的另一种中心 机制。此外，增加的AKT/mTOR活性还与癌症中降低的凋亡有关（Krishnan等，2006)。事实 上，hsa-miR-204过表达导致激活的胱天蛋白酶-3和聚ADP核糖聚合酶（PARP)两者的水 平均显著增加，它们是对细胞和基因组完整性的不可逆性损伤的指示，由此引起凋亡活性 的增加（图5B&5C)。总之，这些发现表明hsa-miR-204的丢失通过激活其靶基因来促进肿 瘤细胞生长、迀移和侵入，所述靶基因是致癌信号级联放大的已知调节子。
[0084] G.高通量功能筛选
[0085] 认为Hsa-miR-204不仅是肿瘤抑制剂，而且是致敏针对化学治疗药物紫杉醇有药 物抗性之乳腺癌的miRNA。
[0086] 为了鉴定可致敏针对紫杉醇有紫杉醇抗性之TNBC细胞的miRNA，采取如下无偏 且全面的方法：将974种化学合成的miRNA抑制剂文库用于高通量筛选平台以鉴定在亚致 死剂量的紫杉醇（2nM至8nM)的存在下降低TNBC细胞生存力的miRNA，并且证实所选择 的候选，所述亚致死剂量是在其下80%的TNBC细胞保持活力的剂量。使用TNBC细胞系 MDA-468。
[0087] 将抑制剂以一种抑制剂一个孔的形式排列在96孔微滴定板上，所述抑制剂的每 一种靶向974种人微RNA中的一种。对于存在（亚致死浓度）药物和没有药物的三次分析， 一式六份地进行紫杉醇抗性MDA-468细胞的转染。使细胞暴露于在IC2tl下或低于IC2tl的药 物72小时，如来源于5天的MTS测定。使用CellTiter-Gl0生存力测定（Promega)来测量 细胞生存力。
[0088] 将每个板上的原始值归一化到内部参照对照样品（阳性对照和阴性对照）以允 许板与板的比较。指定各miRNA抑制剂的生存力比-计算为紫杉醇中的平均生存力除以 没有药物的平均生存力（平均pac/平均载体）。在高通量筛选中，统计学比较的数目显 著地超过生物学重复的数目。对于各miRNA抑制剂，进行两个样品t检验（使用合并方 差）来确定在两个实验条件（存在药物和没有药物）下的平均值之间是否有显著性差异。 基于其在所有P值的分布中的秩来放大所得的原始P值（基于控制错误发现率（FDR)的 Benjamini-Hochberg方法）。已经将该方案成功应用于基于全基因组RNAi的合成致死筛 选研宄，其中在目前筛选中鉴定了 18个命中（hit)的高度可重复列表（图6)。
[0089] 该筛诜导致不同类别miRNA的鉴定：（1)脱敏物：当抑制时,与裁体相比,在紫杉醇 的存在下降低细胞生存力的miRNA (表明当过表达时，这些miRNA将支持细胞生存力）；（2) 致敏物:当抑制时，与载体相比，在絷杉醇的存在下增加细胞生存力的miRNA(表明当过表 达时，这些miRNA将降低细胞生存力）；以及(3)中性药物：当抑制时，当在紫杉醇与裁体之 间比较时，对细胞生存力没有显著影响的miRNA。
[0090] 当与未处理的载体维持的细胞相比时，一种致敏物hsa-miR-204在抑制时示出在 紫杉醇处理的TNBC细胞中细胞生存力的最高幅度增加。如图6中所示，当与未处理的（载 体）对照相比时，致敏物hsa-miR-204的过表达导致在亚致死剂量的紫杉醇的存在下，TNBC 细胞生存力的显著（大于约四倍；P = 〇· 006)降低。
[0091] H.埃兹蛋白
[0092] 本发明人还鉴定了与埃兹蛋白RNA相结合的hsa-miR-204,以及hsa-miR-204种子 区域中的序列3' -UUUCCCUU-5'与埃兹蛋白3' -UTR区中相应的5' -AAAGGGAA-3'序列的特 异性结合。埃兹蛋白是埃兹蛋白/根蛋白膜突蛋白（ERM)家族的成员，并且其通过将细胞 的质膜和肌动蛋白细胞骨架的功能偶联来促进细胞骨架再组织。埃兹蛋白涉及多种成人和 儿科肿瘤的肿瘤生长和转移，并且埃兹蛋白的强多病灶表达与多种肿瘤的不良预后有关。P 糖蛋白与埃兹蛋白在ferm结构域中的149位至242位氨基酸残基处结合并且在人骨肉瘤 的多抗药性中起着关键作用。
[0093] 与在hsa-miR-204与BDNF基因座的表达中之负相关的情况一样（图4A、4B、4C、 4E、4F和4G)，在hsa-miR-204与埃兹蛋白基因座的表达之间也存在负相关（图7)。与BDNF 表达的情况一样，埃兹蛋白表达也是hsa-miR-204的真实革El标（图8)。
[0094] I.另外的考虑
[0095] 已知许多与癌症相关的miRNA位于基因组脆性位点（Calin等，2004)。然而，令人 惊讶地，知道很少关于包含miRNA的具有染色体畸变之区域的功能重要性。可能是最初的 遗传筛选旨在发现染色体异常（通常具有较低的比较基因组杂交分辨率）而忽略了包含 miRNA的基因组区中的改变。因为miRNA影响一个或更多个途径中的多个基因，其调控细胞 生长和凋亡并且当失调时有助于肿瘤形成，所以对编码miRNA之较小基因组区的更进一步 仔细研宄可提供对肿瘤发生机制的重要认识。提出大多数miRNA在癌症中是下调的，并且 包含特定miRNA的遗传区域的微缺失可以是在人癌症的发育和进展中起着重要作用的事 件。
[0096] 本文提供了以下证据：充当有效的肿瘤生长和转移抑制剂的hsa-miR-204在一些 人癌症中是体细胞上丢失的。证明了该hsa-miR-204调控肿瘤中的促血管生成蛋白BDNF 及其受体TrkB的表达和功能，以及hsa-miR-204的丢失通过激活导致Racl易位和肌动蛋 白再组织的AKT/mTOR通路来促进BDNF(或EGF)诱导的癌细胞迀移和侵入。因为AKT与 Racl需要彼此以用于其激活（Kim等，2011 ;Higuchi等，2001)，所以这些发现表明人肿瘤 中hsa-miR-204表达的丢失可在生长因子诱导的癌细胞迀移和侵入期间诱导BDNF/AKT1与 Racl之间的正反馈回路。为了支持这一点，已经示出EGF激活AKT并促进Racl易位到细 胞膜，并且已经示出EGFR与TrkB之间的交叉对话（crosstalk)诱导癌细胞迀移（Qiu等， 2006)。此外，在癌细胞侵入期间对EGF的响应是关键步骤并且其与转移直接相关（WyckofT 等，2004)。除了癌细胞迀移和侵入之外，BDNF/TrkB信号传导的激活也有助于hsa-miR-204 缺失的细胞中的凋亡逃避，因为BDNF/TrkB过表达与AKT的稳定和激活相关，这导致降低 的凋亡（Siu等，2009)。与此一致，这些结果证明hsa-miR-204过表达导致mTOR下游靶标 4E-BP1和S6激酶降低的磷酸化和激活。
[0097] 因为hsa-miR-204位于瞬时受体电位阳离子通道成员3(TRPM3)基因（其是蛋 白质的瞬时受体电位通道家族的成员）内，并且已知这些蛋白质对细胞钙信号传导和体 内稳态是重要的，所以令人感兴趣的推测是，与包含hsa-miR-204之染色体基因座的基 因组丢失相关的表型也可以由宿主基因 TRPM3贡献。但是，本文的结果示出在单独引入 hsa-miR-204之后抑制了肿瘤生长和转移，而在hsa-miR-204模拟物或抑制剂过表达的癌 细胞中TRPM3基因的水平没有改变（图12)。这清楚地表明hsa-miR-204相关的肿瘤抑制 剂表型不是经过TRPM3介导的。然而，不能排除hsa-miR-204及其宿主基因 TRPM3协同作用 以调控肿瘤生长以及肿瘤细胞迀移和侵入的抑制的可能性。由于尚未报道TRPM3在肿瘤发 生中的明确作用，检查TRPM3的潜在肿瘤抑制作用以及其与hsa-miR-204的协同作用（如 果有的话）的详细研宄可能是将来研宄的课题。
[0098] 总之，本文的发现表明，包含特定miRNA的遗传基因座可通过调控关键致癌通路 在癌生长和转移中发挥因果作用。hsa-miR-204靶向BDNF/TrkB的能力表明hsa-miR-204 可控制关键调控机制，并且表明这样的控制的失调可使正常的发育/分化事件倾向于经历 转变，所述BDNF/TrkB在正常细胞过程中具有显著作用并且在侵入性癌症中过表达。因此， 旨在于治疗方案中使用hsa-miR-204的策略具有将在癌细胞中不适当的激活步骤逆转为 更正常状态的优点。本文鉴定的hsa-miR-204为有效的肿瘤抑制剂-连同本文证明的其治 疗潜力和可忽略不计的肝毒性-建立了将hsa-miR-204开发为治疗癌症的可行治疗方案之 关键组分的有力理论。
[0099] 实施例
[0100] 包括了以下实施例以证明本发明的某些非限制性方面。本领域技术人员应理解， 在随后实施例中公开的技术表示由本发明人发现的在本发明的实践中运行良好的技术。然 而，根据本公开内容，本领域技术人员应理解，可在不脱离本发明的精神和范围的情况下， 在所公开的具体实施方案中做出许多改变并且仍然获得同样或类似的结果。
[0101]多个以下实施例提供了示例性材料和方法上的另外细节。
[0102] 实施例1
[0103] (正常和肿瘤组织样品以及细胞系）
[0104] 根据ATCC方案培养用于实验的代表儿科肾肿瘤（HEK-293 ;胚胎肾细胞系）、卵巢 癌（SKOV3)和乳腺癌（MDA-MB-231)的细胞系。从儿童肿瘤协作组（Children's Oncology Group) (Arcadia，CA)获得了 76个儿科肾肿瘤和正常匹配的肾。从UT MD安德森癌症中心 (Houston，TX)获得了 11个晚期卵巢肿瘤和5个正常卵巢组织。从UT健康科学中心（UT Health Science Center) (San Antonio, TX)获得了 15个乳腺癌组织和正常匹配的组织。
[0105] 实施例2
[0106] (RNA和蛋白质分析）
[0107] 从肿瘤和正常组织以及所有细胞系提取了总RNA，并且使其进行qRT-PCR分析，如 之前所述（Imam等，2010)。如之前所述进行Western印迹分析（Imam等，2010)。从Sigma Aldrich购买β-肌动蛋白的抗体（AC-74-A5316)和α-微管蛋白的抗体（T6199)。从 Santa Cruz购买BDNF的抗体。从Cell Signaling购买其他抗体，包括特异于胱天蛋白酶-8 的抗体（IC12-9746)、特异于胱天蛋白酶-3的抗体（8G10-9665)、特异于胱天蛋白酶-9的 抗体（9502)、特异于PARP的抗体（9542S)、特异于AKT的抗体（9272)、特异于磷酸-AKT的 抗体（9271)、特异于S6核糖体蛋白的抗体（2217)以及特异于磷酸-S6核糖体蛋白的抗体 (5G10-2211S)〇
[0108] 实施例3
[0109] (基因组PCR测定）
[0110] 用DNeasy基因组DNA提取试剂盒（Qiagen)从儿科肾肿瘤（η = 38)，和晚期（III 和IV)卵巢癌以及匹配的正常肾（η = 38)和卵巢（η = 4)组织分离基因组DNA。对于 hsa-miR-204的基因组分析，采用使用如所述的基于SYBR Green之定量PCR(qRT-PCR)， 采用2_Λ AGt方法（Varambally等，2008)。简言之，将25ng基因组DNA用作模板以扩 增hsa-miR-204基因座。在每个测定中将代表性对照组织样品用作每个样品与其进行 比较的校准物，以获得相对定量（RQ)值。将来自正常雄性样品（IX)和正常雌性样品 (2 X) (Promega)的基因组DNA用于比较磷酸甘油酸激酶I (PGKl)与5个X染色体特异性 miRNA(hsa_miR-424、hsa-miR-503、hsa-miR-766、hsa-miR-222 和 hsa-miR-221)的水平以 校准多个miRNA基因座中丢失的程度。使用非X染色体TATA结合蛋白质（TBP)基因作为 参照来评估雄性基因组DNA中这些区域的RQ值。基于其分离两个不同数据群的能力，认为 〇. 5及以下的RQ值为至少一个拷贝的基因组基因座丢失。
[0111] 实施例4
[0112] (高分辨率miRNA比较基因组杂交（CGH)测定）
[0113] 根据制造商的方案使用Agilent定制设计微阵列在从儿科肾肿瘤样品分离的 基因组DNA上进行miR NA CGH分析。基于使用Agilent的eArray程序（可在earray. chem. agilent. com/earray上在线获得）以及覆盖所有miRNA区域的另外的探针（在来自 miRBase vl3的各miRNA之前、之中和之后的200bp，用一式三份的探针以增强可靠性）的 Agilent 2X105K人类全基因组基因组微阵列来设计定制阵列。使用用于DNA变化定量的 Nexus Copy Number(BioDiscovery)来进行阵列CGH数据分析。在确定了样品在特定miRNA 位点上具有或没有拷贝数变化后，将所有阵列CGH数据加载到MTLAB中以用于复合图形展 示。示出探针位置和归一化拷贝数的阵列CGH已经提交给GE0/NCBI数据库（GSE28397)。
[0114] 实施例5
[0115] (元分析）
[0116] 在354个卵巢癌（获自癌症基因组图谱（TCGA)项目（The Cancer Genome Atlas Project)，位于〈cancergenome. nih. gov>网上）和35个乳腺癌（GSE15130)上的公共领域 高密度CGH数据集上进行元分析。将所有肿瘤的阵列CGH数据输入Nexus Copy Number。 将拷贝数丢失的阈值设置为l〇g2_0. 5(比默认设置log2-0. 2更严格）。在来自GE0/NCBI 的公共领域基因表达数据集（GSE22820)上进行用于基因表达分析的元分析。通过首先进 行RMA/分位数归一化，然后与相同数据集内的正常相邻组织进行比较来测定乳腺癌样品 中TRPM3 (包含miR-204的基因座）的差别表达。
[0117] 实施例6
[0118](基因表达分析）
[0119] 使用Agilent人类全基因组4X44K阵列（Agilent Technologies)来产生人类基 因表达微阵列数据。根据制造商的方案，使用染料交换复制（dye-swap replicate)将分离 自用miR-204转染之HEK-293细胞的总RNA与来自用乱序寡核苷酸（对照）转染之HEK-293 细胞的RNA进行共杂交。使用Agi lent的Feature Extract ion软件（版本9. 5. 3. 1，Agi lent Technologies)来提取相对基因表达比。用 MATLAB Bioinformatics Toolbox(R2009a， Mathworks)进行分位数归一化。为了测定基因的差别表达，将学生t检验应用于归一化的 表达数据。基于FDR-调整的P < 0. 05 (Benjamini-Hochberg)和倍数改变> 2来选择特 征基因集（Signature gene set)。将差别基因表达数据集保存在GE0/NCBI数据库中（GSE 28400)。
[0120] 实施例7
[0121] (质粒构建）
[0122] 对于pMIR-BDNF 3'UTR构建体而言，将BDNF基因的3' -UTR区段扩增并亚克隆 到pMIR-REPORT载体（Ambion)中的荧光素酶基因下游的HindIII和SpeI位点处。对 于pSilencer-miR-204构建体而言，将约500bp pri-miR-204基因组序列扩增并克隆到 pSiIencer 4. I Puro 载体（Ambion)的 BamHI 和 HindIII 位点中。
[0123] 实施例8
[0124] (细胞生长和软琼脂测定）
[0125] 如之前所述使用pSilencer-miR-204和pSilencers乱序（对照）稳定细胞系进 行细胞生长和软琼脂集落形成测定（Imam等.，2010)。
[0126] 实施例9
[0127] (SCID小鼠中的致瘤性测定）
[0128] 将稳定过表达pSilencer-miR-204或pSilencer-乱序的两百万个HEK-293细胞 注射入9只RAG2+、yc+SCID雄性小鼠（Taconic)和9只对照小鼠的肾被膜中。在移植后 24天使用公式π/6X (LXDXW)来评估肿瘤体积，其中L是肿瘤长度，D是深度并且W是宽 度。将6微米石蜡包埋的肿瘤切片用苏木精和伊红进行染色。涉及动物的所有实验程序均 遵循研宄机构伦理规范进行。
[0129] 实施例10
[0130] (Transwell细胞迀移和基膜基质侵入测定）
[0131] 如之前所述进行Transwell细胞迀移测定（Imam等，2010)。使用用75nM miR-204 模拟物或阴性对照模拟物转染，然后用75nM miR-204-特异性抑制剂或25ng pBluescript KS+对照转染48小时的MDA-MB-231细胞来进行侵入测定，如下所述。转染后48小时，将细 胞接种到预包被有基质胶（lmg/mL) (BD Biosciences)的24孔transwell板的插入物上。 将含血清培养基和纤连蛋白（5 μ g/mL)添加至下室中作为化学引诱物。孵育24小时之后， 洗绦、固定transwell插入物上的细胞，并且用棉拭子轻轻移除未侵入细胞和EC基质。如 所述的，将位于室下面的侵入细胞用结晶紫（〇. 1% )进行染色、空气干燥和照相（Imam等， 2010)〇
[0132] 实施例11
[0133] (治疗实验）
[0134] 将100, 000个MDA-MB-231-GFP-luc细胞注射入尾静脉。从肿瘤细胞注射后第7 天开始，在30天中，每5天以每kg体重Img寡核苷酸的比率注射与RNALancerII体内递送 制剂（Bioo Scientific)复合的 hsa_miR-204(n = 6)或 hsa-miR-204 突变体（η = 6)寡 核苷酸。在第六次注射之后，将所有动物处死。将肺固定并分析转移灶。使用荧光显微镜 捕获肺图像（对于GFP+vIP Iuc ^灶）。收获肝以评估hsa-miR-204注射小鼠中的转移和 肝毒性。
[0135] 实施例12
[0136] (凋亡测定）
[0137] 如之前所述（32)使用FITC膜联蛋白V凋亡检测试剂盒（BD Pharmingen)在一式 三份的孔中（in triplicate wells)进行用75nM hsa-miR-204模拟物或阴性对照模拟物 转染之HE|293或HeLa细胞上的膜联蛋白V/PI染色。
[0138] 实施例13
[0139] (免疫荧光）
[0140] 将细胞用4%的多聚甲醛固定并且在室温（RT)下用(λ 2% Triton X-100渗透15 分钟，然后用磷酸缓冲盐水（PBS)洗涤并在RT下用PBS中的10 %山羊血清封闭45分钟。 在RT下，将细胞用在PBS中稀释的Racl小鼠单克隆抗体（ab33186, Abeam)孵育2小时。 在洗涤三次之后，在RT下，将细胞用1 : 200的Alexa Fluor 647与Alexa Fluor 488鬼 笔环肽缀合的二抗（A12379, Invitrogen，Molecular Probes)孵育1小时。在洗绦三次之 后，在将细胞封在载玻片上之含DAPI的Aqua-Poly/Mount培养基（Polysciences)中。在 Nikon Eclipse TE2000-U显微镜上于200X放大下进行显微照相。
[0141] 实施例14
[0142] (统计分析）
[0143] 在图中的所有值和误差条为平均土SEM ;以图例表示各η值；通过双尾学生t-检 验来确定P值。
[0144] 实施例15
[0145] (miR-296-5p抑制致敏三阴性乳腺癌中的紫杉醇响应）
[0146] 将三阴性乳腺癌细胞用乱序对照或miR-296-5p抑制剂转染3天，然后再用载体 或8nM紫杉醇处理两天。使用CellTiter_Glo(Promega Inc.)来比较载体与药物处理的 miR-296-5p转染的细胞之间的细胞生存力。在紫杉醇存在下，miR-296-5p抑制显著地降低 了细胞生存力。柱状图描绘了对照与用载剂对照（DMSO)或紫杉醇（8nM)处理的miR-296-5p 转染的细胞中之TNBC细胞生存力的百分数。图13。
[0147] 实施例16
[0148] (miR-296-5p抑制三阴性乳腺细胞迀移和侵入）
[0149] 将三阴性乳腺癌细胞用乱序对照或miR-296-5p抑制剂转染48小时。在转染后48 小时，胰蛋白酶消化细胞、使其在无血清培养基中重悬并且加载到3 μπι孔径Transwell室 (Corning，Corning，NY，USA)的顶部。将含血清培养基置于下室作为化学引诱物，将细胞在 37°C下孵育并使其经过趋化室迀移24小时。将在室底部的迀移的细胞用10%福尔马林固 定并用0. 4%结晶紫染色3小时。将实验一式三份地重复并将迀移的细胞用显微镜计数，当 与对照转染的细胞相比时，miR-296-5p抑制剂转染的细胞具有显著较低的迀移能力。代表 图像示出了侵入的细胞。使用Nikon显微镜获取图像。图14。
[0150] 实施例17
[0151] (治疗效力）
[0152] 为了进一步确定这些miRNA在治疗TNBC中的效力，我们使用了离体肿瘤外植体模 型。将新鲜切除的乳腺癌组织切成Imm3试样，在37°C下在CO 2培养箱中，将其置于补充有 氢化可的松和胰岛素的外植体培养基中的含水明胶海绵上。用紫杉醇处理来自TNBC患者 的肿瘤外植体并轻轻移出组织，将其固定在10%中性缓冲福尔马林中并加工成石蜡块。进 行IHC分析以测定Ki67水平。外科试样和外植体的IHC揭示外植体保留了原始外科试样 的组织结构和增殖特性。预期地，外植体的紫杉醇治疗揭示了在非复发TNBC中的Ki67染 色的抑制，而晚期TNBC对紫杉醇没有响应。图15。
[0153] 实施例18
[0154] (脂质体制剂）
[0155] 单独使用致敏物miRNA (75nM)或单独使用紫杉醇（1 μ M)或一起使用miRNA (75nM) 和紫杉醇（1 μ Μ)来处理在明胶海绵上生长的肿瘤外植体。紫杉醇（通过在外植体培养基 中添加）单独处理48小时导致响应于TNBC(早期癌症）Ki67水平（表示肿瘤细胞增殖） 的显著抑制。然而，紫杉醇处理并未导致复发的TNBC外植体中Ki67水平的显著改变，所述 复发的TNBC外植体对紫杉醇没有响应。使用脂质体制剂单独添加致敏物miRNA (75nM) 48 小时导致来自晚期TNBC的肿瘤外植体中Ki67水平（表示肿瘤细胞增殖）的适度抑制。然 而，当致敏物miRNA(75nM)与紫杉醇（IM)组合使用时，所述作用稳健得多。图16。
[0156] 参考文献：
[0157] 以下参考文献通过引用特定地并入本文，在某种程度上，其提供了补充本文所列 那些的示例性过程或其他细节。
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【主权项】
1. 用于减少癌细胞生长的方法，其包括向对象施用有效量的包含hsa-miR-204或其同 源物的组合物，所述对象具有或疑似具有hsa-miR-204或其同源物的表达降低的癌细胞。2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述癌细胞过表达脑源性神经营养因子（BDNF)或 埃兹蛋白。3. 根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述癌细胞是乳腺癌细胞、卵巢癌细 胞或儿科肾肿瘤细胞。4. 根据权利要求3所述的方法，其中所述乳腺癌细胞是三阴性乳腺癌（TNBC)细胞。5. 根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述癌细胞生长是转移性的。6. 根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其还包括测定所述癌细胞中 hsa-miR-204或其同源物的水平。7. 根据权利要求6所述的方法，其中使用定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR)或阵 列杂交来测定hsa-miR-204或其同源物的水平。8. 根据权利要求6或7中任一项所述的方法，其中测定由对象获得的血液样品中 hsa-miR-204或其同源物的水平。9. 根据权利要求8所述的方法，其中与对照相比，所述血液样品中hsa-miR-204或其同 源物的水平降低。10. 根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述包含hsa-miR-204或其同源物 的组合物配制成用于全身施用。11. 根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中通过静脉内注射施用所述包含 hsa-miR-204或其同源物的组合物。12. 根据权利要求11所述的方法，其中所述包含hsa-miR-204或其同源物的组合物还 包含基于脂质的递送载剂或基于纳米颗粒的递送载剂。13. 根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中还向所述对象施用包含第二活性 剂的组合物。14. 根据权利要求13所述的方法，其中所述第二活性剂包括细胞毒性化学治疗剂、纳 米生物缀合物或者除hsa-miR-204或其同源物之外的miRNA。15. 根据权利要求14所述的方法，其中所述细胞毒性化学治疗剂是紫杉烷。16. 根据权利要求15所述的方法，其中所述紫杉烷是紫杉醇。17. 根据权利要求13至16中任一项所述的方法，其中所述包含hsa-miR-204或其同源 物的组合物与所述包含第二活性剂的组合物同时施用。18. 根据权利要求13至16中任一项所述的方法，其中在施用所述包含第二活性剂的组 合物之前或之后施用所述包含hsa-miR-204或其同源物的组合物。19. 根据权利要求18所述的方法，其中施用所述包含hsa-miR-204或其同源物的组合 物与施用所述包含第二活性剂的组合物之间的时间间隔为1天至30天。20. 根据权利要求18或19中任一项所述的方法，其中在所述包含hsa-miR-204或其同 源物的组合物之前施用所述包含第二活性剂的组合物。21. 根据权利要求13至20中任一项所述的方法，其中癌细胞已变得对所述第二活性剂 有抗性。22. 根据权利要求21所述的方法，其中所述第二活性剂是紫杉醇。23. 根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述包含hsa-miR-204或其同源 物的组合物包含可药用载体。24. 根据权利要求23所述的方法，其中制剂满足对于无菌、热原和颗粒物质或其他污 染物的药典要求。25. 根据权利要求23或24中任一项所述的方法，其中所述制剂配制成用于全身施用。26. 根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述对象是哺乳动物。27. 根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述对象是人。28. 用于鉴定可能从用于减少癌细胞生长的治疗受益的对象的方法，所述方法包括测 定所述对象的细胞中hsa-miR-204或其同源物的水平。29. 根据权利要求28所述的方法，其中使用qRT-PCR或阵列杂交来测定所述对象细胞 中的hsa-miR-204或其同源物的水平。30. 根据权利要求29所述的方法，其中测定由所述对象获得的血液样品中 hsa-miR-204或其同源物的水平。31. 根据权利要求30所述的方法，其中与对照相比，所述血液样品中hsa-miR-204或其 同源物的水平降低。32. 用于筛选潜在致敏物miRNA的方法，所述潜在致敏物miRNA在受到抑制时使在亚致 死浓度的治疗活性剂中培养的癌细胞系细胞的生存力增加，所述方法包括： 在含有miRNA抑制剂的培养基中培养癌细胞系细胞，所述含有miRNA抑制剂的培养基 包含亚致死浓度的所述治疗活性剂以及候选致敏物miRNA的抑制剂； 在缺乏miRNA抑制剂的培养基中培养癌细胞系细胞，所述缺乏miRNA抑制剂的培养基 包含亚致死浓度的所述治疗活性剂但是没有添加所述候选致敏物miRNA的抑制剂；以及 在一段时间之后测定含有miRNA抑制剂细胞群和缺乏miRNA抑制剂细胞群的生存力， 其中如果所述含有miRNA抑制剂细胞群的生存力显著高于所述缺乏miRNA抑制剂细胞群的 生存力，则将候选致敏物miRNA鉴定为潜在致敏物miRNA。33. 根据权利要求32所述的方法，其中所述潜在致敏物miRNA是hsa-miR-204、 hsa-miR-185、hsa-miR-211、hsa-miR-367-5p 或 hsa-miR-133A 或者其同源物。34. 根据权利要求33所述的方法，其中所述潜在致敏物mRNA是hsa-miR-204或其同源 物。35. 根据权利要求32至34中任一项所述的方法，其中所述治疗活性剂的亚致死浓度是 以其培养72小时之后80%的所述癌细胞系细胞保持活力的浓度。36. 根据权利要求32至35中任一项所述的方法，其中所述治疗活性剂是紫杉醇。37. 根据权利要求35所述的方法，其中紫杉醇的亚致死浓度是2nM至8nM。38. 根据权利要求32至37中任一项所述的方法，其中癌细胞系细胞是TNBC细胞。39. 用于筛选潜在脱敏物miRNA的方法，所述潜在脱敏物miRNA在被抑制时使在亚致死 浓度的治疗活性剂中培养的癌细胞系细胞的生存力降低，所述方法包括： 在含有miRNA抑制剂的培养基中培养癌细胞系细胞，所述含有miRNA抑制剂的培养基 包含亚致死浓度的所述治疗活性剂以及候选脱敏物miRNA的抑制剂； 在缺乏miRNA抑制剂的培养基中培养癌细胞系细胞，所述缺乏miRNA抑制剂的培养基 包含亚致死浓度的所述治疗活性剂但是没有添加所述候选脱敏物miRNA的抑制剂；以及 在一段时间之后测定含有miRNA抑制剂细胞群和缺乏miRNA抑制剂细胞群的生存力， 其中如果所述含有miRNA抑制剂细胞群的生存力显著低于所述缺乏miRNA抑制剂细胞群的 生存力，则将候选脱敏物miRNA鉴定为潜在脱敏物miRNA。40. 根据权利要求39所述的方法，其中所述潜在脱敏物miRNA是hsa-miR-129-3p、 hsa-miR-296-5p、hsa-miR-216a、hsa-miR-1237、hsa-miR-1915 *、hsa_miR-320d 或其同源 物。41. 根据权利要求39或40中任一项所述的方法，其中所述治疗活性剂的亚致死浓度是 以其培养72小时之后80%的所述癌细胞系细胞保持活力的浓度。42. 根据权利要求39至41中任一项所述的方法，其中所述治疗活性剂是紫杉醇。43. 根据权利要求42所述的方法，其中紫杉醇的亚致死浓度是2nM至8nM。44. 根据权利要求39至43中任一项所述的方法，其中癌细胞系细胞是TNBC细胞。45. 用于减少癌细胞生长的方法，其包括向对象施用有效量的包含致敏物miRNA或其 同源物的组合物，所述对象具有或疑似具有所述致敏物miRNA的表达显著降低的癌细胞。46. 用于减少癌细胞生长的方法，其包括向对象施用有效量的包含脱敏物miRNA或其 同源物之抑制剂的组合物，所述对象具有或疑似具有所述脱敏物miRNA的表达显著增加的 癌细胞。47. 用于鉴定可能从用于减少癌细胞生长的治疗受益的对象的方法，所述方法包括测 定所述对象的细胞中致敏物miRNA或其同源物的水平。48. 根据权利要求47所述的方法，其中所述致敏物miRNA是hsa-miR-204、 hsa-miR-185、hsa-miR-211、hsa-miR-367-5p 或 hsa-miR-133A 或者其同源物。49. 用于鉴定可能从用于减少癌细胞生长的治疗受益的对象的方法，所述方法包括测 定所述对象的细胞中脱敏物miRNA或其同源物的水平。50. 根据权利要求49所述的方法，其中所述潜在脱敏物miRNA是hsa-miR-129-3p、 hsa-miR-296-5p、hsa-miR-216a、hsa-miR-1237、hsa-miR-1915 *、hsa_miR-320d 或其同源 物。
【专利摘要】公开了使用微RNA(miRNA)来治疗癌症的方法和组合物。所述方法和组合物包含hsa-miR-204和hsa-miR-204的同源物。
【IPC分类】C12N15/113, C12Q1/68, A61P35/00, A61K48/00, A61K31/7105
【公开号】CN104884097
【申请号】CN201380065778
【发明人】曼吉特·K·拉奥, 加法尔·S·伊马姆, 别赫亚尔·佐吉, 常耀富, 帕纳多斯·苏巴拉亚卢
【申请人】得克萨斯州大学系统董事会
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2013年11月15日
【公告号】EP2919817A1, US20150306127, WO2014078686A1