使用mes和mops作为流动相改性剂从多峰树脂洗脱生物分子的制作方法

使用mes和mops作为流动相改性剂从多峰树脂洗脱生物分子的制作方法
【专利说明】使用MES和MOPS作为流动相改性剂从多峰树脂洗脱生物分 子
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年10月24日提交的美国申请序列号61/717, 880的优先权，其 通过提述以其整体并入本文。 发明领域
[0003] 本发明涉及使用多峰（multimodal)树脂和包含Good' S缓冲液的洗脱缓冲液来纯 化或富集生物分子的方法。
[0004] 发明背景
[0005] 多峰树脂（也称混合模式树脂）是包含至少两种不同的基团的层析介质，其中所 述基团与靶分子通过至少两种不同的机制相互作用。例如，多峰离子交换剂携带带电基 团（例如，带正电的氨基基团、带正电的季铵基基团、带负电的羧酸基团、带负电的磺酸基 团），所述带电基团可通过电荷-电荷相互作用与靶分子相互作用。这些多峰离子交换剂额 外携带其他可与靶分子通过不同作用模式（如疏水相互作用、范德华相互作用、偶极相互 作用、阳离子-π相互作用或氢键）进行相互作用的基团。
[0006] EP 2 167 526 Bl描述使用包含含有疏水部分和带负电部分的配体的多峰树脂纯 化凝血因子VIII。洗脱用包含高浓度的盐（>1.5Μ)、至少40% (w/v)的乙二醇、丙二醇或其 组合和钙离子的洗脱缓冲液实施。
[0007] US 2011/0160435 Al描述另一使用多峰树脂纯化凝血因子VIII的工艺。洗脱缓 冲液包含至少一种在PH6至8带正电的氨基酸。优选地，所述氨基酸选自下组：赖氨酸、精 氨酸和组氨酸，且所述氨基酸以高于0. 4M，特别是高于0. 5M的浓度使用。
[0008] US 2011/0166332 Al描述用于从液体蛋白制备物通过将所述制备物与多峰阴离 子交换剂接触来分离至少一种非聚集蛋白的方法。实验部分描述使用在20mM Tris、20mM H印es、20mM MES、50mM NaCl中包含IM甘氨酸的洗脱缓冲液及pH9. 0至pH4. 5的线性梯度 分离非聚集IgG。
[0009] 发明概述
[0010] 在第一方面，本发明涉及用于纯化或富集生物分子的方法，所述方法包括如下步 骤：
[0011] (a)提供包含所述生物分子的水溶液；
[0012] (b)将所述水溶液与多峰树脂接触；
[0013] (C)任选地用水性洗涤缓冲液洗涤所述多峰树脂；
[0014] (d)用水性缓冲溶液从所述多峰树脂洗脱所述生物分子，其中所述水性缓冲溶 液包含如下、基本上由如下组成或者由如下组成：至少15mM的Good's缓冲液；总浓度为 0-400mM的丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组 氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪 氨酸或缬氨酸中的一种或多种；总浓度为0_400mM的尿素、盐酸胍、硫氰酸胍、氯化铵、硫酸 铵、磷酸铵、乙酸铵、氯化钠、柠檬酸钠、辛酸钠、磷酸钠、碘化钠、氯化钾、柠檬酸钾、硫酸钾、 磷酸钾、碘化钾、氯化镁、硫酸镁、磷酸镁、氯化钙、硫酸钙、磷酸钙和牛磺酸中的一种或多 种；和O% -60% (v/v)的乙二醇或丙二醇或乙二醇和丙二醇的混合物；并
[0015] (e)收集包含生物分子的级分，由此获得纯化或富集形式的生物分子。
[0016] 在一个实施方案中，所述水性缓冲溶液包含15mM至2. 5mM的Good's缓冲液，如至 少20mM、50mM、100mM、150mM、200mM或更多的Good's缓冲液。在另一实施方案中，所述水性 缓冲溶液包含10mM-400mM的丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组 氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪 氨酸和缬氨酸中的一种或多种；10mM-400mM的硫氰酸胍、氯化铵、硫酸铵、磷酸铵、乙酸铵、 氯化钠、柠檬酸钠、磷酸钠、碘化钠、氯化钾、柠檬酸钾、硫酸钾、磷酸钾、碘化钾、氯化镁、硫 酸镁、磷酸镁、氯化钙、硫酸钙、磷酸钙和牛磺酸中的一种或多种；和1%-60% (v/v)的乙二 醇或丙二醇或乙二醇和丙二醇的混合物。
[0017] 在一个实施方案中，在水性缓冲液中的所述Good' s缓冲液是MES、M0PS或Tris。
[0018] 第二方面，本发明涉及通过根据所述第一方面的方法可获得的纯化的生物分子， 如蛋白。
[0019] 第三方面本发明涉及制备物，其包含：
[0020] (a)生物分子，和
[0021] (b)水性缓冲溶液，所述水性缓冲溶液包含如下、基本上由如下组成或者由如下组 成：至少15mM的至少一种Good's缓冲液；总浓度为0-400mM的丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、 天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨 酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸中的一种或多种；总浓度为 0-400mM的尿素、盐酸胍、硫氰酸胍、氯化铵、硫酸铵、磷酸铵、乙酸铵、氯化钠、柠檬酸钠、辛 酸钠、磷酸钠、碘化钠、氯化钾、柠檬酸钾、硫酸钾、磷酸钾、碘化钾、氯化镁、硫酸镁、磷酸镁、 氯化钙、硫酸钙、磷酸钙和牛磺酸中的一种或多种；和0%-60% (v/v)的乙二醇或丙二醇或 乙二醇和丙二醇的混合物。
[0022] 在一个实施方案中，所述水性缓冲溶液包含15mM至2. 5mM的Good's缓冲液，如至 少20mM、50mM、100mM、150mM、200mM或更多的Good's缓冲液。在另一实施方案中，所述水性 缓冲液包含10mM-400mM的丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨 酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨 酸和缬氨酸中的一种或多种；10mM-400mM的硫氰酸胍、氯化铵、硫酸铵、磷酸铵、乙酸铵、氯 化钠、柠檬酸钠、磷酸钠、碘化钠、氯化钾、柠檬酸钾、硫酸钾、磷酸钾、碘化钾、氯化镁、硫酸 镁、磷酸镁、氯化钙、硫酸钙、磷酸钙和牛磺酸中的一种或多种；和1%-60% (v/v)的乙二醇 或丙二醇或乙二醇和丙二醇的混合物。
[0023] 在一个实施方案中，在所述水性缓冲液中的所述Good' s缓冲液是MES、MOPS或 Tris0
[0024] 第四方面，本发明涉及水性缓冲溶液用于从多峰树脂解吸生物分子的用途，其中 所述水性缓冲溶液包含如下、基本上由如下组成或者由如下组成：至少15mM的至少一种 Good' s缓冲液；总浓度为0-400mM的丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨 酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝 氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸中的一种或多种；总浓度为0_400mM的尿素、盐酸 胍、硫氰酸胍、氯化铵、硫酸铵、磷酸铵、乙酸铵、氯化钠、柠檬酸钠、辛酸钠、磷酸钠、碘化钠、 氯化钾、柠檬酸钾、硫酸钾、磷酸钾、碘化钾、氯化镁、硫酸镁、磷酸镁、氯化钙、硫酸钙、磷酸 钙和牛磺酸中的一种或多种；和0%-60% (v/v)的乙二醇或丙二醇或乙二醇和丙二醇的混 合物。
[0025] 例如，在一些实施方案中，所述水性缓冲溶液包含15mM至2. 5mM的Good' s缓冲 液，如至少20mM、50mM、100mM、150mM、200mM或更多的Good' s缓冲液。在另一实施方案中， 所述水性缓冲液包含10mM-400mM的丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘 氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色 氨酸、酪氨酸和缬氨酸中的一种或多种；10mM-400mM的硫氰酸胍、氯化铵、硫酸铵、磷酸铵、 乙酸铵、氯化钠、柠檬酸钠、磷酸钠、碘化钠、氯化钾、柠檬酸钾、硫酸钾、磷酸钾、碘化钾、氯 化镁、硫酸镁、磷酸镁、氯化钙、硫酸钙、磷酸钙和牛磺酸中的一种或多种；和1% -60% (v/ V)的乙二醇或丙二醇或乙二醇和丙二醇的混合物。
[0026] 在一个实施方案中，在所述水性缓冲液中的所述Good' s缓冲液是MES、MOPS或 Tris0
[0027] 第五方面，本发明涉及水性缓冲溶液用于增加吸附在多峰树脂上的生物分子回收 率的用途，其通过将（a)其上已吸附所述生物分子的多峰树脂与（b)水性缓冲溶液接触， 其中所述水性缓冲溶液包含如下、基本上由如下组成或者由如下组成：至少15mM的至少一 种Good's缓冲液；总浓度为0-400mM的丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷 氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、 丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸中的一种或多种；总浓度为0_400mM的尿素、盐酸 胍、硫氰酸胍、氯化铵、硫酸铵、磷酸铵、乙酸铵、氯化钠、柠檬酸钠、辛酸钠、磷酸钠、碘化钠、 氯化钾、柠檬酸钾、硫酸钾、磷酸钾、碘化钾、氯化镁、硫酸镁、磷酸镁、氯化钙、硫酸钙、磷酸 钙和牛磺酸中的一种或多种；和0% -60% (v/v)的乙二醇或丙二醇或乙二醇和丙二醇的 混合物。例如，所述用于增加吸附在多峰树脂上的生物分子的回收率的水性缓冲溶液可包 括至少15mM、至少IOOmM或至少200mM的Good' s缓冲液；10mM-400mM的丙氨酸、天冬酰 胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、 苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸中的一种或多种；一种或多种 10mM-400mM的硫氰酸胍、氯化铵、硫酸铵、磷酸铵、乙酸铵、氯化钠、柠檬酸钠、磷酸钠、碘化 钠、氯化钾、柠檬酸钾、硫酸钾、磷酸钾、碘化钾、氯化镁、硫酸镁、磷酸镁、氯化钙、硫酸钙、磷 酸钙和牛磺酸；和1% -60% (v/v)的乙二醇或丙二醇或乙二醇和丙二醇的混合物。
[0028] 在一个实施方案中，将包含从所述多峰树脂回收的生物分子的溶液应用于超滤/ 渗滤（UF/DF)、切向流过滤（TFF)、微滤（MF)和疏水相互作用层析（HIC)。在一个实施方案 中，将包含从多峰树脂回收的生物分子的溶液应用于HIC。
[0029] 第六方面，本发明涉及制品，其包含：
[0030] (a)包装材料或容器；
[0031] (b)水性缓冲溶液，所述水性缓冲溶液包含如下、基本上由如下组成或者由如下组 成：
[0032] -至少15mM的至少一种Good' s缓冲液；
[0033] -总浓度为0_400mM的丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷 氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、 苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸；
[0034] -总浓度为0_400mM的尿素、盐酸胍、硫氰酸胍、氯化铵、硫酸铵、磷酸铵、乙酸铵、 氯化钠、柠檬酸钠、辛酸钠、磷酸钠、碘化钠、氯化钾、柠檬酸钾、硫酸钾、磷酸钾、碘化钾、氯 化镁、硫酸镁、磷酸镁、氯化钙、硫酸钙、磷酸钙和牛磺酸；和
[0035] _0%-60% (v/v)的乙二醇或丙二醇或乙二醇和丙二醇的混合物；和
[0036] (C)包含用于实施根据第一方面的方法的说明的数据载体。
[0037] 在一个实施方案中，在所述制品中的水性缓冲溶液包括至少15mM、至少IOOmM或 至少200mM的Good' s缓冲液；10mM-400mM的丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷 氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、 苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸中的一种或多种；10mM-400mM的硫氰酸胍、氯化铵、硫酸 铵、磷酸铵、乙酸铵、氯化钠、柠檬酸钠、磷酸钠、碘化钠、氯化钾、柠檬酸钾、硫酸钾、磷酸 钾、碘化钾、氯化镁、硫酸镁、磷酸镁、氯化钙、硫酸钙、磷酸钙和牛磺酸中的一种或多种；和 1%-60% (v/v)的乙二醇或丙二醇或乙二醇和丙二醇的混合物。
[0038] 其他特征和优势将从附图和说明书以及从权利要求显而易见。
[0039] 图简述
[0040] 图1是由包含MES和精氨酸的洗脱缓冲液从多峰层析树脂Capto? Adhere (GE Healthcare)解吸阿加糖酶β的实验的产率的等高线图。等高线图是对于6. 25的pH值计 算。
[0041] 图2是由包含MOPS和精氨酸的洗脱缓冲液从多峰层析树脂Capto? A dhere (GE Healthcare)解吸阿加糖酶β的实验的产率的等高线图。等高线图是对于7.0的pH值计 算。
[0042] 图3是由包含MES和二醇的洗脱缓冲液从多峰层析树脂Capto? Adhere (GE Healthcare)解吸阿加糖酶β的实验的产率的等高线图。
[0043] 图4是Capto? Adhere的多峰配体。该分子最左边部分形成与支持介质的连接。
[0044] 图5是Capto? MMC的多峰配体。
[0045] 图 6 是 Pall PPA HyperCel?、Pall HEA HyperCel?和 Pall MEP HyperCel ?的多 峰配体。图6A给出与胺基（未显示）结合的Pall PPA HyperCel?的苯丙基取代物。图 6B给出与胺基（未显示）结合的HEA HyperCel?的正己基取代物。图6C展示Pall MEP HyperCel?的4-疏乙基-吡啶配体。
[0046] 图7是从Merck Millipore, Germany可获得的Eshimmo? HCX树脂的多峰配体。 [0047] 发明详述
[0048] 本发明基于如下发现，即通常用作缓冲剂的MES和MOP两者在破坏多峰相互作用 中出人意料地有效。因此，当从多峰层析树脂解吸生物分子时，通过使用MES、MOPS或其他 Good's缓冲液有可能降低精氨酸或具有高导电性的相关流动相改性剂的浓度，或有可能使 用没有或基本上没有精氨酸和相关流动相改性剂的洗脱缓冲液。此外，通过使用依照本发 明的增加浓度的MES、M0PS或其他Good' s缓冲液，有可能显著降低或甚至完全避免洗脱缓 冲液中离液剂（chaotropic agent)的存在。
[0049] 与多峰层析树脂结合的生物分子的解吸可由于组合了离子、氢键和疏水相互作用 的相互作用的复杂特性而具有挑战性。传统的流动相添加剂，如简单的盐（例如，NaCl) 和有机溶剂，由于其对单个模式的相互作用具有相反作用，因此对于生物分子的解吸可能 效果不佳。例如，NaCl的添加减弱离子相互作用但增强疏水相互作用，而对于有机溶剂 则相反。因此，需要特别的流动相改性剂以共同地破坏多峰相互作用。在文献中已报道 可使用精氨酸、狐、尿素和辛酸钠 （Arakawa 等，Protein Expression and Purification 63 2009 ρρ· 158-163,Kaleas 等，J.Chromatogr. A, 1217,2010 ρρ· 235-242 和 Holstein 等，Biotechnol.Bioeng·，109 Jan 2012)。
[0050] 上述流动相改性剂（例如，精氨酸或其他氨基酸）的溶液通常呈现高导电性，其 对于在多峰树脂层析后实施的随后的纯化步骤（例如，离子交换步骤）是不利的。更具体 地，高导电性可能需要大量稀释或延长的透析次数。此外，数种经常使用的流动相改性剂， 如果这些流动相的改性剂以高浓度存在，可使生物分子（例如，蛋白）的四级结构甚至三级 结构变性。如果流动相改性剂是离液剂如尿素或胍盐，则变性的风险很高。
[0051] 因此，理想的是减少精氨酸或其他具有高导电性的添加剂并鉴定呈现低导电性的 流动相改性剂。更理想的是在洗脱缓冲液中降低离液剂（如尿素、盐酸胍、硫氰酸胍）的浓 度并鉴定对生物分子发挥较弱作用或不具有变性作用的流动相改性剂。
[0052] 定义由于本文描述的特定的方法学、流程和试剂可发生变化，因此本发明不限于 这些本文描述的特定的方法学、流程和试剂。此外，本文所用术语仅为达到描述特定实施方 案的目的，并非意在限制本发明的保护范围，其仅通过附加的权利要求进行限定。除非另作 限定，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解相同的 含义。
[0053] 本文所用术语如描述于 "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations) "，Leuenberger, H. G. W, Nagel, B.和 Kdlbl，H.编 (1995) ,Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland 所定义。
[0054] 贯穿本说明书和随后的权利要求，除非上下文另有需要，词语"包含"及变化如"包 含了 "和"含有"应理解为暗示包括陈述的整数或步骤或整数或步骤的组，而不排除任何其 他整数或步骤或整数或步骤的组。
[0055] 贯穿本说明书的文本引用了多个文件（举例来说：专利、专利申请、科学出版物、 制造者规格、说明书、GenBank登录号序列访问编号等）。本文的内容不能理解为对凭借发 明在先本发明没有资格早于所述公开内容的承认。本文引用的一些文件表征为"通过提述 并入"。在这些并入的参考文献的定义或教导和本说明书引用的定义或教导发生冲突的情 况下，采取本说明书的文本作为优先。
[0056] 术语"Good's缓冲液"最初指由Norman Good及其合作者在1966年选取和描述的 作为特别适用于生物研宄的十二种缓冲剂中的一种。在本说明书的上下文中，"Good' s缓 冲液"不仅涵盖最初描述的十二种缓冲剂还进一步涵盖结构上相关的缓冲剂。因此，如本文 所用的术语"Good' s缓冲液"包含下列化学化合物：ADA、ACES、BES、Bicine、CAPS、CAPS0、 CHES、HEPES、MES、MOPS、PIPES、TAPS、TES 和 Tris。
[0057] ADA是N-(2-乙酰胺基）亚氨基二乙酸的缩写。
[0058] ACES是N-(2-乙酰胺基）_2_氨基乙横酸的缩写。
[0059] BES是N，N-双（2-羟乙基）-2-氨基乙磺酸的缩写
[0060] Bicine是N，N-双（2-羟乙基）甘氨酸的缩写。
[0061] CAPS是3-(环己基氨基）-1_丙磺酸的缩写。
[0062] CAPSO是3-(环己基氨基）-2_羟基-1-丙磺酸的缩写。
[0063] CHES是2_(环己基氨基）乙磺酸的缩写。
[0064] HEPES是4-(2-羟乙基）哌嗪-1-乙磺酸的缩写。
[0065] MES是2-(N-吗啉代）乙磺酸的缩写。
[0066] MOPS是3- (N-吗啉代）丙磺酸的缩写。
[0067] PIPES是1，4-哌嗪二乙磺酸的缩写。
[0068] TAPS是N-[三（羟甲基）甲基]-3-氨基丙磺酸的缩写。
[0069] TES是2_[ (2-羟基-1，1-二（羟甲基）乙基）氨基]乙磺酸的缩写。
[0070] Tris是三（羟甲基）氨基甲烷的缩写。
[0071] Pall MEP HyperCel?是由与4-巯基乙基吡啶（4-MEP)连接的刚性纤维素基质 组成的层析吸附剂（参见图6C)。纤维素珠赋予高的多孔性、化学稳定性和低的非特异相 互作用。珠的平均直径为80 μ m至100 μ m。由混合模式或多模式的机制操作的Pall MEP HyperCel?也描述为疏水电荷诱导层析（HCIC)。HCIC基于电离的双模式配体的pH依赖性 行为。
[0072] Pall PPA HyperCel?是层析混合模式吸附剂。吸附剂的材料基于高多孔性交联 纤维素并包含苯丙胺基团作为配体（参见图6A)。
[0073] Pall HEA HyperCel?是层析混合模式吸附剂。吸附剂材料基于高多孔性交联纤 维素并包含己胺基团作为配体（参见图6B)。
[0074] Capto? Adhere是采用固定于多孔琼脂糖粒子上的配体N-苄基-N-甲基乙醇胺 的层析吸附剂。其可从GE Healthcare Life Sciences获得。该配体的详细化学结构示于 图4。
[0075] Capto? MMC是采用固定于多孔琼脂糖粒子上的衍生自N-苯甲酰基甲硫氨酸的配 体的层析吸附剂。其可从GE Healthcare Life Sciences获得。该配体详细的化学结构示 于图5。
[0076] Cshmunoat HCX介质是将（配体的）触须结构与基于亲水性聚乙烯醚的基质偶 联的混合模式树脂。更具体地，所述基础基质是移植有刚性聚乙烯醚亲水性聚合物的表面。 平均粒度（d5(l)是75 μ m至95 μ m。Eshmuno? HCX介质中采用的配体的详细化学结构示 于图 7。Eshnilin〇'、!i HCX 介质可从 Merck Millipore, Germany 或 EMD Millipore, USA 获 得。
[0077] α -半乳糖苷酶
[0078] α -半乳糖苷酶是从糖脂和糖蛋白水解末端α -半乳糖基部分的糖苷水解酶。其 由GLA基因编码。该酶是从糖脂和糖蛋白水解末端α-半乳糖基部分的同源二聚糖蛋白。 其主要水解神经酰胺三己糖苷，并且它可催化蜜二糖水解成为半乳糖和葡萄糖。
[0079] 此基因中的多个突变影响该酶的合成、加工和稳定性，这导致Fabry's病，一种由 分解代谢a -D-半乳糖基糖脂部分失败而导致的罕见的溶酶体贮积症和神经鞘脂贮积症。 两种酶的替代疗法可用于对α-半乳糖苷酶缺陷进行功能性补偿。阿加糖酶α和β都是 重组形式的人α-半乳糖苷酶A且都具有与天然酶相同的氨基酸序列。阿加糖酶α和β 在其寡糖侧链的结构上有所不同。制药公司Shire以商标名Replagal?制造阿加糖酶α 作为对于Fabry's病的治疗。制药公司Genzyme以商标名Fabrazyme?"+:产合成的阿加糖 酶β用于Fabry's病的治疗。
[0080] 除非清楚地相反指示，下列的每一个方面可与任何其他一个或多个方面结合。具 体地，除非清楚地相反指示，任何指示作为优选的或具有优势的特征可与任何其他一个或 多个指示作为优选的或具有优势的特征组合。本发明特别针对一些实施方案，在这些实施 方案中对特别优选的特征与一个或多个其他特别优选的特征进行了组合。
[0081] 在第一方面中，本发明涉及用于纯化或富集生物分子的方法，所述方法包括步 骤：
[0082] (a)提供包含所述生物分子的水溶液；
[0083] (b)将所述水溶液与多峰树脂接触；
[0084] (C)任选地用水性洗涤缓冲液洗涤所述多峰树脂；
[0085] (d)通过水性缓冲溶液从所述多峰树脂洗脱所述生物分子，其中所述水性缓冲溶 液包含如下、基本上由如下组成或者由如下组成：
[0086] -至少15mM的至少一种Good's缓冲液，如15mM_2. 5M的至少一种Good's缓冲液， 50mM-2. 0M、75mM-l. 5M、IOOmM-L 25M、200mM-l. 0M、300mM-900mM、400mM-750mM 的至少一种 Good's缓冲液；
[0087] -总浓度为 0-400mM (如 0mM、10mM-350mM、25mM-300mM、50mM-250mM、100mM-200mM 或125mM-150mM)的丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘 氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色 氨酸、酪氨酸和缬氨酸；
[0088] -总浓度为 0-400mM (如 0mM、10mM-350mM、25mM-300mM、50mM-250mM、100mM-200mM 或125mM-150mM)的尿素、盐酸胍、硫氰酸胍、氯化铵、硫酸铵、磷酸铵、乙酸铵、氯化钠、柠檬 酸钠、辛酸钠、磷酸钠、碘化钠、氯化钾、柠檬酸钾、硫酸钾、磷酸钾、碘化钾、氯化镁、硫酸镁、 磷酸镁、氯化钙、硫酸钙、磷酸钙和牛磺酸；和
[0089] -〇 % -60 % (v/v)(如 1 % -50 % (v/v)、5 % -40 % (v/v)、8 % -30 % (v/v)、 10% -25% (v/v)或15% -20% (v/v))的乙二醇或丙二醇或乙二醇和丙二醇的混合物；并
[0090] (e)收集包含生物分子的级分，由此获得纯化或富集形式的生物分子。
[0091] 根据第一方面的方法与用于纯化或富集生物分子的之前的方法相比提供数个优 势。之前使用多峰层析的纯化或富集生物分子的方法通常采用包含高浓度精氨酸、甘氨酸 或其他氨基酸（例如，IM甘氨酸，比照US 2011/0166332 Al实施例1;或0.8mol/kg L-精氨 酸，比照US 2011/0160435 Al实施例10)或高浓度盐（例如，最多2. 5M的NH4Cl或NaCl，比 照EP 2 167 526 Bl实施例6)的洗脱缓冲液。然而，精氨酸和其他添加剂呈现高导电性，其 对随后通常在多峰树脂层析后实施的纯化步骤（例如，离子交换步骤）不利。具体地，高导 电性可能需要大量稀释或延长的透析次数。此外，高浓度的盐可使生物分子（例如，蛋白） 的四级结构或甚至三级结构变性。如果盐是离液剂（例如，胍盐或高氯酸锂），则变性的风 险特别尚。
[0092] 根据第一方面的方法提供解吸生物分子受到仅包含低浓度的氨基酸（如 0-400mM，如10mM-300mM)和仅包含低浓度的盐或离液剂（如0-400mM，如10-300mM)的洗 脱缓冲液的影响的优势，由此降低生物分子变性的风险并促进随后的纯化步骤。该优势由 在洗脱缓冲液中增加 Good's缓冲液浓度至至少15mM、至少50mM、至少IOOmM或至少200mM 的值实现。Good' s缓冲液由于其在生物研宄中的用途和通常对生物分子具有温和至无影 响而众所周知。因此，本发明的纯化或富集方法相比传统应用的方法更加温和。
[0093] 综上所述，依据本发明生物分子（如蛋白，如酶）的解吸受15mM或更高浓度的 Good' s缓冲液（如50mM、100mM或200mM或更高）与400mM以下浓度的氨基酸的组合或 由15mM或更高浓度的Good' s缓冲液（如50mM、100mM或200mM或更高）与总浓度不超过 60% (v/v)的乙二醇和/或丙二醇的组合影响。当然，所述氨基酸和乙二醇可同时存在。
[0094] 在一些实施方案中，水性缓冲溶液包含至少一种氨基酸（例如，丙氨酸、精氨酸、 天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨 酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸）或乙二醇或丙 二醇或乙二醇和丙二醇的混合物。换而言之，这些实施方案中，如果所述水性缓冲溶液包含 一种或多种氨基酸，则乙二醇和丙二醇的浓度各为〇%。相反地，在这些实施方案中，如果所 述水性缓冲溶液包含乙二醇或丙二醇或两者，则所述一种或多种氨基酸的总浓度为〇mM。
[0095] 在一些实施方案中，所述水性缓冲溶液包含0 % -60 % (v/v)(如1 % -50 % (v/v)、 5%-40% (v/v)、8%-30% (v/v)、10%-25% (v/v)、15%-20% (v/v))的乙二醇。
[0096] 在这些实施方案中，其中所述水性缓冲溶液包含至少一种氨基酸，所述至少一种 氨基酸通常选自下组：丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、 亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸。换而言之，在这些 实施方案中不存在天冬氨酸、谷氨酸、色氨酸和酪氨酸。在第一方面的那些实施方案中，其 中所述水性缓冲溶液包含至少一种氨基酸，所述至少一种氨基酸选自下组：丙氨酸、半胱氨 酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸。换而言之，在这些实施方案 中，通常不存在天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙 氨酸、色氨酸和酪氨酸。在第一方面的那些实施方案中，其中所述水性缓冲溶液包含至少一 种氨基酸，所述至少一种氨基酸通常选自下组：丙氨酸、甘氨酸、组氨酸和赖氨酸。换而言 之，在这些实施方案中，通常不存在天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、异亮 氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
[0097] 在一个实施方案中，所述至少一种Good's缓冲液选自下组：MES、M0PS、Tris、ADA、 ACES、BES、Bicine、CAPS、CAPS0、CHES、HEPES、PIPES、TAPS 和 TES。在一个实施方案中，所 述至少一种Good' s缓冲液是MES，而在另一实施方案中，所述至少一种Good' s缓冲液是 MOPS0
[0098] 在一个实施方案中，所述生物分子是蛋白（如酶、结构蛋白、转运蛋白、信号蛋白、 跨膜蛋白、肽激素或抗体）或其片段，或核酸（例如，单链寡核苷酸、双链寡核苷酸、单链 多核苷酸或双链多核苷酸）。核酸可为，例如，DNA、RNA或由DNA和RNA形成的杂交双链。 在一个实施方案中，所述生物分子是酶（例如，氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构 酶或连接酶）。例如，在一个实施方案中，所述酶是水解酶，如糖苷酶（经常称为糖苷水解 酶）。在一个实施方案中，所述糖苷酶是α-半乳糖苷酶，如选自下组的α-半乳糖苷酶： 阿加糖酶α (例如，Shire, United Kingdom制造的Replagal1?)和阿加糖酶β (例如，由 Genzyme, Cambridge, MA制造的Fabmzyme⑧）。在一个实施方案中，所述α -半乳糖苷酶 是阿加糖酶β。在另一实施方案中，所述生物分子是肽激素，如促甲状腺激素（也称为TSH 或促甲状腺素）。TSH是由两个亚基组成的糖蛋白，所述两个亚基为：α亚基和β亚基。重 组形式的人TSH-α可从Genzyme Corp.以商标名"Thyrogen"获得。在另一实施方案中， 所述生物分子是抗体，如单克隆抗体。在一些实施方案中，所述生物分子是糖基化的蛋白。
[0099] 在第一方面的一个实施方案中，所述多峰树脂选自下组：Capto? Adhere、Capto? MMC、Pall PPA HyperCel?、Pall HEA HyperCel?、Pall MEP HyperCel?和 Eshmuno? HCX 介质。在本申请提交日于这些多峰树脂中使用的配体示于图4、5、6八、68、6(：和7。在一个实 施方案中，所述多峰树脂是Capto? Adhere。
[0100] 在第二方面中，本发明涉及通过根据第一方面的方法可获得或已获得的纯化的生 物分子。生物分子可由比本领通常已知的纯化或富集方法更温和的方法进行纯化或富集。 因此，预期纯化的生物分子相比通过现有技术的方法获得的纯化的生物分子处于更加天然 的状态。
[0101] 在一些实施方案中，所述水性缓冲溶液包含至少一种氨基酸（例如，丙氨酸、精氨 酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、 赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸）或乙二醇 或丙二醇或乙二醇和丙二醇的组合物。换而言之，在这些实施方案中，如果所述水性缓冲溶 液包含一种或多种氨基酸，则乙二醇和丙二醇的浓度各为0 %。相反地，在这些实施方案中， 如果所述水性缓冲溶液包含乙二醇或丙二醇或两者，则所述一种或多种氨基酸的总浓度为 OmM0
[0102] 在一些实施方案中，所述水性缓冲溶液包含0 % -60 % (v/v)(如1 % -50 % (v/v)、 5%-40% (v/v)、8%-30% (v/v)、10%-25% (v/v)、15%-20% (v/v))的乙二醇。
[0103] 在那些实施方案中，其中所述水性缓冲溶液包含至少一种氨基酸，所述至少一种 氨基酸通常选自下组：丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、 亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸。换而言之，在这些 实施方案中，通常不存在天冬氨酸、谷氨酸、色氨酸和酪氨酸。在那些实施方案中，其中所 述水性缓冲溶液包含至少一种氨基酸，所述至少一种氨基酸通常选自下组：丙氨酸、半胱氨 酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸。换而言之，在这些实施方案 中，通常不存在天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙 氨酸、色氨酸和酪氨酸。在那些实施方案中，其中所述水性缓冲溶液包含至少一种氨基酸， 所述至少一种氨基酸通常选自下组：丙氨酸、甘氨酸、组氨酸和赖氨酸。换而言之，在这些 实施方案中，通常不存在天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、亮氨 酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
[0104] 在一个实施方案中，所述至少一种Good's缓冲液选自下组：MES、M0PS、Tris、ADA、 ACES、BES、Bicine、CAPS、CAPS0、CHES、HEPES、PIPES、TAPS 和 TES。在一个实施方案中，所 述至少一种Good' s缓冲液是MES，而在另一实施方案中，所述至少一种Good' s缓冲液是 MOPSo
[0105] 在一个实施方案中，所述生物分子是蛋白（例如，酶、结构蛋白、转运蛋白、信号 蛋白、跨膜蛋白、肽激素或抗体）或其片段，或核酸（例如，单链寡核苷酸、双链寡核苷酸、 单链多核苷酸或双链多核苷酸）。核酸可为，例如，DNA、RNA或由DNA和RNA形成的杂交 双链。在一个实施方案中，所述生物分子是酶（例如，氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合 酶、异构酶或连接酶）。例如，所述酶是水解酶，如糖苷酶（经常称为糖苷水解酶）。在 一个实施方案中，所述糖苷酶是α-半乳糖苷酶，如选自下组的α-半乳糖苷酶：阿加 糖酶α (例如，Shire, United Kingdom制造的Replagal? )和阿加糖酶β (例如，由 Genzyme, Cambridge, MA制造的Fabrazyme? )。在一个实施方案中，所述α -半乳糖苷酶 是阿加糖酶β。在另一实施方案中，所述生物分子是肽激素，如促甲状腺激素（也称为TSH 或促甲状腺素）。TSH是由两个亚基组成的糖蛋白，所述两个亚基为：α亚基和β亚基。重 组形式的人TSH-α可从Genzyme Corp.以商标名"Thyrogen"获得。在另一实施方案中， 所述生物分子是抗体，如单克隆抗体。在一些实施方案中，所述生物分子是糖基化的蛋白。
[0106] 在一个实施方案中，所述多峰树脂选自下组：Capto? Adhere、Capto? MMC、Pall PPA HyperCel?、Pall HEA HyperCel?、Pall MEP HyperCel?和 Eshmuno? HCX 介质。在 本申请提交日于这些多峰树脂中使用的配体示于图4、5、6A、6B、6C和7。在一个实施方案 中，所述多峰树脂是Capto? Adhere。
[0107] 第三方面，本发明涉及制备物，其包含：
[0108] (a)生物分子；和
[0109] (b)水性缓冲溶液，所述水性缓冲溶液包含如下、基本上由如下组成或者由如下组 成：
[0110] -至少15mM的至少一种Good's缓冲液，如15mM_2. 5M的至少一种Good's缓冲液， 如 50mM-2. 0M、75mM-l. 5M、100mM-l. 25M、200mM-l. 0M、300mM-900mM、400mM-750mM 的至少一 种Good's缓冲液；
[0111] -总浓度为 0-400mM (如 0mM、10mM-350mM、25mM-300mM、50mM-250mM、100mM-200mM 或125mM-150mM)的丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘 氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色 氨酸、酪氨酸和缬氨酸；
[0112] -总浓度为 0-400mM (如 0mM、10mM-350mM、25mM-300mM、50mM-250mM、100mM-200mM 或125mM-150mM)的尿素、盐酸胍、硫氰酸胍、氯化铵、硫酸铵、磷酸铵、乙酸铵、氯化钠、柠檬 酸钠、辛酸钠、磷酸钠、碘化钠、氯化钾、柠檬酸钾、硫酸钾、磷酸钾、碘化钾、氯化镁、硫酸镁、 磷酸镁、氯化钙、硫酸钙、磷酸钙和牛磺酸；和
[0113] -〇 % -60 % (v/v)(如 1 % -50 % (v/v)、5 % -40 % (v/v)、8 % -30 % (v/v)、 10%-25% (v/v)或15%-20% (v/v))的乙二醇或丙二醇或乙二醇和丙二醇的混合物。
[0114] 如上文第一方面的讨论部分所释，本文描述的水性缓冲溶液与本领域描述的洗脱 缓冲液相比涉及降低的生物分子变性风险。因此，预期根据第三方面的制备物包含相比本 领域描述的制备物中的生物分子处于更加天然状态的生物分子。
[0115] 在一些实施方案中，所述水缓冲该溶液包含至少一种氨基酸（例如，丙氨酸、精氨 酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、 赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙 氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸）或乙二醇 或丙二醇或乙二醇和丙二醇的组合物。换而言之，在这些实施方案中，如果所述水性缓冲溶 液包含一种或多种氨基酸，则乙二醇和丙二醇的浓度各为O %。相反地，在这些实施方案中， 如果所述水性缓冲溶液包含乙二醇或丙二醇或两者，则所述一种或多种氨基酸的总浓度为 OmM0
[0116] 在一些实施方案中，所述水性缓冲溶液包含0% -60% (v/v)(如1% -50% (v/v)、 5%-40% (v/v)、8%-30% (v/v)、10%-25% (v/v)、15%-20% (v/v))的乙二醇。
[0117] 在那些实施方案中，其中所述水性缓冲溶液包含至少一种氨基酸，所述至少一种 氨基酸通常选自下组：丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、 亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸。换而言之，在这些 实施方案中，通常不存在天冬氨酸、谷氨酸、色氨酸和酪氨酸。在那些实施方案中，其中所 述水性缓冲溶液包含至少一种氨基酸，所述至少一种氨基酸通常选自下组：丙氨酸、半胱氨 酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸。换而言之，在这些实施方案 中，通常不存在天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙 氨酸、色氨酸和酪氨酸。在那些实施方案中，其中所述水性缓冲溶液包含至少一种氨基酸， 所述至少一种氨基酸通常选自下组：丙氨酸、甘氨酸、组氨酸和赖氨酸。换而言之，在这些 实施方案中，通常不存在天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、亮氨 酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
[0118] 在一个实施方案中，所述至少一种Good's缓冲液选自下组：MES、MOPS、Tris、ADA、 ACES、BES、Bicine、CAPS、CAPSO、CHES、HEPES、PIPES、TAPS 和 TES。在一个实施方案中，所 述至少一种Good' s缓冲液是MES，而在另一实施方案中，所述至少一种Good' s缓冲液是 MOPS0
[0119] 在一个实施方案中，所述生物分子是蛋白（例如，酶、结构蛋白、转运蛋白、信号蛋 白、跨膜蛋白、肽激素或抗体）或其片段，或核酸（例如，单链寡核苷酸、双链寡核苷酸、单 链多核苷酸或双链多核苷酸）。核酸可为，例如，DNA、RNA或由DNA和RNA形成的杂交双 链。在一个实施方案中，所述生物分子是酶（例如，氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、 异构酶或连接酶）。在一个实施方案中，所述酶是水解酶，如糖苷酶（经常称为糖苷水解 酶）。在一个实施方案中，所述糖苷酶是α-半乳糖苷酶，如选自下组的α-半乳糖苷酶： 阿加糖酶α (例如，Shire, United Kingdom制造的Replagal? )和阿加糖酶β (例如，由 Genzyme, Cambridge, MA制造的Fabrazyme? )。在一个实施方案中，所述α -半乳糖苷 酶是阿加糖酶β，而在另一实施方案中，所述生物分子是肽激素，如促甲状腺激素（也称为 TSH或促甲状腺素）。TSH是由两个亚基组成的糖蛋白，所述两个亚基为：α亚基和β亚 基。重组形式的人TSH-α可从Genzyme Corp.以商标名"Thyrogen"获得。在另一实施方 案中，所述生物分子是抗体，如单克隆抗体。在一些实施方案中，所述生物分子是糖基化的 蛋白。
[0120] 第四方面，本发明涉及水性缓冲溶液用于从多峰树脂解吸生物分子的用途，其中 所述水缓冲该溶液包含如下、基本上由如下组成或者由如下组成：
[0121] -至少15mM的至少一种Good's缓冲液，如15mM-2. 5M的至少一种Good's缓冲液， 50mM-2. 0M、75mM-l. 5M、IOOmM-L 25M、200mM-l. 0M、300mM-900mM、400mM-750mM 的至少一种 Good's缓冲液；
[0122] -总浓度为 0-400mM (如 0mM、10mM-350mM、25mM-300mM、50mM-250mM、100mM-200mM 或125mM-150mM)的丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘 氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色 氨酸、酪氨酸和缬氨酸；
[0123] -总浓度为 0-400mM (如 0mM、10mM-350mM、25mM-300mM、50mM-250mM、100mM-200mM 或125mM-150mM)的尿素、盐酸胍、硫氰酸胍、氯化铵、硫酸铵、磷酸铵、乙酸铵、氯化钠、柠檬 酸钠、辛酸钠、磷酸钠、碘化钠、氯化钾、柠檬酸钾、硫酸钾、磷酸钾、碘化钾、氯化镁、硫酸镁、 磷酸镁、氯化钙、硫酸钙、磷酸钙和牛磺酸；和
[0124] -〇 % -60 % (v/v)(如 1 % -50 % (v/v)、5 % -40 % (v/v)、8 % -30 % (v/v)、 10%-25% (v/v)或15%-20% (v/v))的乙二醇或丙二醇或乙二醇和丙二醇的混合物。
[0125] 如将在下文的实验部分阐述，本文描述的水性缓冲溶液特别适用于从多峰树脂解 吸生物分子。特别意外的是Good' s缓冲液在从多峰树脂解吸生物分子中有效至与精氨酸 具有可比性的程度。
[0126] 在一些实施方案中，所述水性缓冲溶液包含至少一种氨基酸（例如，丙氨酸、精氨 酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、 赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸）或乙二醇 或丙二醇或乙二醇和丙二醇的组合物。换而言之，在这些实施方案中，如果所述水性缓冲溶 液包含一种或多种氨基酸，则乙二醇和丙二醇的浓度各为0 %。相反地，在这些实施方案中， 如果所述水性缓冲溶液包含乙二醇或丙二醇或两者，则所述一种或多种氨基酸的总浓度为 OmM0
[0127] 在一些实施方案中，所述水性缓冲溶液包含0% -60% (v/v)(如1% -50% (v/v)、 5%-40% (v/v)、8%-30% (v/v)、10%-25% (v/v)、15%-20% (v/v))的乙二醇。
[0128] 在那些实施方案中，其中所述水性缓冲溶液包含至少一种氨基酸，所述至少一种 氨基酸通常选自下组：丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、 亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸。换而言之，在这些 实施方案中，通常不存在天冬氨酸、谷氨酸、色氨酸和酪氨酸。在那些实施方案中，其中所 述水性缓冲溶液包含至少一种氨基酸，所述至少一种氨基酸通常选自下组：丙氨酸、半胱氨 酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸。换而言之，在这些实施方案 中，通常不存在天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙 氨酸、色氨酸和酪氨酸。在那些实施方案中，其中所述水性缓冲溶液包含至少一种氨基酸， 所述至少一种氨基酸通常选自下组：丙氨酸、甘氨酸、组氨酸和赖氨酸。换而言之，在这些 实施方案中，通常不存在天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、亮氨 酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
[0129] 在一个实施方案中，所述至少一种Good's缓冲液选自下组：MES、M0PS、Tris、ADA、 ACES、BES、Bicine、CAPS、CAPS0、CHES、HEPES、PIPES、TAPS 和 TES。在一个实施方案中，所 述至少一种Good' s缓冲液是MES，而在另一实施方案中，所述至少一种Good' s缓冲液是 MOPSo
[0130] 在一个实施方案中，所述生物分子是蛋白（例如，酶、结构蛋白、转运蛋白、信号蛋 白、跨膜蛋白、肽激素或抗体）或其片段，或核酸（例如，单链寡核苷酸、双链寡核苷酸、单链 多核苷酸或双链多核苷酸）。核酸可为，例如，DNA、RNA或由DNA和RNA形成的杂交双链。 在一个实施方案中，所述生物分子是酶（例如，氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构 酶或连接酶）。在一个实施方案中，所述酶是水解酶，如糖苷酶（经常称为糖苷水解酶）。 在另一实施方案中，所述糖苷酶是 α-半乳糖苷酶，如阿加糖酶α (例如，Shire, United Kingdom制造的Replagal? )或阿加糖酶β (例如，由Genzyme, Cambridge, MA制造的 Fabrazyme? )。在一个实施方案中，所述α-半乳糖苷酶是阿加糖酶β。在另一实施 方案中，所述生物分子是肽激素，如促甲状腺激素（也称为TSH或促甲状腺素）。TSH是由 两个亚基组成的糖蛋白，所述两个亚基为：α亚基和β亚基。重组形式的人TSH-α可从 Genzyme Corp.以商标名"Thyrogen"获得。在另一实施方案中，所述生物分子是抗体，如单 克隆抗体。在一些实施方案中，所述生物分子是糖基化的蛋白。
[0131] 在一个实施方案中，所述多峰树脂选自下组：Capto? Adhere、Capto? MMC、Pall PPA HyperCel?、Pall HEA HyperCel?、Pall MEP HyperCel?和 Eshmuno? HCX 介质。在 本申请提交日于这些多峰树脂中使用的配体示于图4、5、6A、6B、6C和7。在一个实施方案 中，所述多峰树脂是Capto? Adhere。
[0132] 第五方面，本发明涉及水性缓冲溶液用于增加吸附在多峰树脂上的生物分子的回 收率的用途，其中通过将（a)其上已吸附所述生物分子的多峰树脂与（b)水性缓冲溶液接 触，其中所述水性缓冲溶液包含如下、基本上由如下组成或者由如下组成：
[0133] -至少15mM的至少一种Good's缓冲液，如15mM_2. 5M的至少一种Good's缓冲液， 50mM-2. 0M、75mM-l. 5M、IOOmM-L 25M、200mM-l. 0M、300mM-900mM、400mM-750mM 的至少一种 Good's缓冲液；
[0134] -总浓度为 0-400mM (如 0mM、10mM-350mM、25mM-300mM、50mM-250mM、100mM-200mM 或125mM-150mM)的丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘 氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色 氨酸、酪氨酸和缬氨酸；
[0135] -总浓度为 0-400mM (如 0mM、10mM-350mM、25mM-300mM、50mM-250mM、100mM-200mM 或125mM-150mM)的尿素、盐酸胍、硫氰酸胍、氯化铵、硫酸铵、磷酸铵、乙酸铵、氯化钠、柠檬 酸钠、辛酸钠、磷酸钠、碘化钠、氯化钾、柠檬酸钾、硫酸钾、磷酸钾、碘化钾、氯化镁、硫酸镁、 磷酸镁、氯化钙、硫酸钙、磷酸钙和牛磺酸；和
[0136] -〇 % -60 % (v/v)(如 1 % -50 % (v/v)、5 % -40 % (v/v)、8 % -30 % (v/v)、 10%-25% (v/v)或15%-20% (v/v))的乙二醇或丙二醇或乙二醇和丙二醇的混合物。
[0137] 如将在下文的实验部分阐述，本文描述的水性缓冲溶液特别适用于以很高的回收 率从多峰树脂解吸生物分子。发明人使用本发明所述的水性缓冲溶液实现了多至99%的回 收率（参见表1)。
[0138] 在一些实施方案中，所述水性缓冲溶液包含至少一种氨基酸（例如，丙氨酸、精氨 酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、 赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸）或乙二醇 或丙二醇或乙二醇和丙二醇的组合物。换而言之，在这些实施方案中，如果所述水性缓冲溶 液包含一种或多种氨基酸，则乙二醇和丙二醇的浓度各为O %。相反地，在这些实施方案中， 如果所述水性缓冲溶液包含乙二醇或丙二醇或两者，则所述一种或多种氨基酸的总浓度为 OmM0
[0139] 在第五方面的一些实施方案中，所述水性缓冲溶液包含0% -60% (v/v)(如 1%_50% (v/v)、5%_40% (v/v)、8%_30% (v/v)、10%_25% (v/v)、15%_20% (v/v)) 的乙二醇。
[0140] 在那些实施方案中，其中所述水性缓冲溶液包含至少一种氨基酸，所述至少一种 氨基酸通常选自下组：丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、 亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸。换而言之，在这些 实施方案中，通常不存在天冬氨酸、谷氨酸、色氨酸和酪氨酸。在那些实施方案中，其中所 述水性缓冲溶液包含至少一种氨基酸，所述至少一种氨基酸通常选自下组：丙氨酸、半胱氨 酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸。换而言之，在这些实施方案 中，通常不存在天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙 氨酸、色氨酸和酪氨酸。在那些实施方案中，其中所述水性缓冲溶液包含至少一种氨基酸， 所述至少一种氨基酸通常选自下组：丙氨酸、甘氨酸、组氨酸和赖氨酸。换而言之，在这些 实施方案中，通常不存在天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、亮氨 酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
[0141] 在一个实施方案中，所述至少一种Good's缓冲液选自下组：MES、MOPS、Tris、ADA、 ACES、BES、Bicine、CAPS、CAPSO、CHES、HEPES、PIPES、TAPS 和 TES。在一个实施方案中，所 述至少一种Good' s缓冲液是MES，而在另一实施方案中，所述至少一种Good' s缓冲液是 MOPS0
[0142] 在一个实施方案中，所述生物分子是蛋白（例如，酶、结构蛋白、转运蛋白、信号蛋 白、跨膜蛋白、肽激素或抗体）或其片段，或核酸（例如，单链寡核苷酸、双链寡核苷酸、单 链多核苷酸或双链多核苷酸）。核酸可为，例如，DNA、RNA或由DNA和RNA形成的杂交双 链。在一个实施方案中，所述生物分子是酶（例如，氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、 异构酶或连接酶）。在一个实施方案中，所述酶是水解酶，如糖苷酶（经常称为糖苷水解 酶）。在一个实施方案中，所述糖苷酶是α-半乳糖苷酶，如选自下组的α-半乳糖苷酶： 阿加糖酶α (例如，Shire, United Kingdom制造的R.eplaga_)和阿加糖酶β (例如，由 Genzyme, Cambridge, MA制造的Fabrazyme? )。在一个实施方案中，所述α -半乳糖苷酶 是阿加糖酶β。在另一实施方案中，所述生物分子是肽激素，如促甲状腺激素（也称为TSH 或促甲状腺素）。TSH是由两个亚基组成的糖蛋白，所述两个亚基为：α亚基和β亚基。重 组形式的人TSH-α可从Genzyme Corp.以商标名"Thyrogen"获得。在另一实施方案中， 所述生物分子是抗体，如单克隆抗体。在一些实施方案中，所述生物分子是糖基化的蛋白。
[0143] 在一个实施方案中，所述多峰树脂选自下组：Capto? Adhere、Capto? MMC、Pall PPA HyperCel?、Pall HEA HyperCel?、Pall MEP HyperCel?和：Eshmuno? HCX 介质。在 本申请提交日于这些多峰树脂中使用的配体示于图4、5、6A、6B、6C和7。在一个实施方案 中，所述多峰树脂是Capto? Adhere。
[0144] 第六方面，本发明针对一种制品，其包含：
[0145] (a)包装材料或容器；
[0146] (b)水性缓冲溶液，所述水性缓冲溶液包含如下、基本上由如下组成或者由如下组 成：
[0147] -至少15mM的至少一种Good's缓冲液，如15mM_2. 5M的至少一种Good's缓冲液， 50mM-2. 0M、75mM-l. 5M、IOOmM-L 25M、200mM-l. 0M、300mM-900mM、400mM-750mM 的至少一种 Good's缓冲液；
[0148] -总浓度为 0-400mM (如 0mM、10mM-350mM、25mM-300mM、50mM-250mM、100mM-200mM 或125mM-150mM)的丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘 氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色 氨酸、酪氨酸和缬氨酸；
[0149] -总浓度为 0-400mM (如 0mM、10mM-350mM、25mM-300mM、50mM-250mM、100mM-200mM 或125mM-150mM)的尿素、盐酸胍、硫氰酸胍、氯化铵、硫酸铵、磷酸铵、乙酸铵、氯化钠、柠檬 酸钠、辛酸钠、磷酸钠、碘化钠、氯化钾、柠檬酸钾、硫酸钾、磷酸钾、碘化钾、氯化镁、硫酸镁、 磷酸镁、氯化钙、硫酸钙、磷酸钙和牛磺酸；和
[0150] -〇 % -60 % (v/v)(如 1 % -50 % (v/v)、5 % -40 % (v/v)、8 % -30 % (v/v)、 10% -25% (v/v)或15% -20% (v/v))的乙二醇或丙二醇或乙二醇和丙二醇的混合物；和
[0151] (C)包含用于实施本文描述的方法的说明的数据载体。
[0152] 本发明中作为特征的水性缓冲溶液与现有技术中描述的洗脱缓冲液相比涉及降 低的生物分子变性风险。根据第六方面的制品提供该具有优势的水性缓冲溶液与容器或包 装材料及包含用于实施利用该具有优势的水性缓冲溶液的方法的说明的数据载体的组合。
[0153] 因此，预期根据本方面的制备物包含与现有技术描述的制备物中的生物分子相比 处于更加天然状态的生物分子。
[0154] 在一个实施方案中，所述数据载体选自下组：在所述包装材料或容器上存在的 标签（例如，粘贴标签、标志（tag)、芯片或RFID标志的形式）和包装说明书（packaging insert)(例如，单张；小册子；芯片；或计算机可读存储介质，如软盘、⑶-ROM、⑶-R、DVD或 蓝光光盘）。在一些实施方案中，所述数据载体包含书面信息、视觉信息（例如，图片）或计 算机可读信息（例如程序或条形码）。
[0155] 在一个实施方案中，所述数据载体进一步包含一种或多种下列信息：
[0156] (i)使用水性缓冲溶液的说明；
[0157] (ii)质量信息如关于所述水性缓冲溶液的批次/批号、制造或组装地点或过期或 销售日期的信息，或关于制品正确的储存或处理的信息；
[0158] (iii)关于所述水性缓冲溶液的组成的信息；
[0159] (iv)关于实施根据第一方面的方法时获得的信息解读的信息；
[0160] (V)关于采用不适合的方法时可能的误解或错误结果的警告；和
[0161] (Vi)关于使用不合适的试剂和/或缓冲液时可能的误解或错误结果的警告。
[0162] 在第六方面的一个实施方案中，所述制品进一步包含一种或多种下列组分：
[0163] (d)层析介质；
[0164] (e)层析柱；
[0165] (f)用于校准用于纯化或富集生物分子的方法的参照生物分子，如用于校准根据 第一方面的方法的参照生物分子。
[0166] 在一些实施方案中，所述层析柱预装有层析介质。
[0167] 在一个实施方案中，所述层析介质是多峰层析树脂。在一个实施方案中，所述多峰 树脂选自下组：Capto? Adhere、Capto? MMC、Pall PPA HyperCel?、Pall HEA HyperCel?、 Pall MEP HyperCel?和Eshniuno? HCX介质。在这些多峰树脂中使用的配体示于图4、5、 6A、6B、6C和7。在一个实施方案中，所述多峰树脂是Capto? Adhere。
[0168] 在一个实施方案中，所述参照生物分子选自由蛋白组成的组（例如，酶、结构蛋 白、转运蛋白、信号蛋白、跨膜蛋白、肽激素或抗体）和核酸（例如，单链寡核苷酸、双链 寡核苷酸、单链多核苷酸或双链多核苷酸）。核酸可为，例如，DNA、RNA或由DNA和RNA 形成的杂交双链。在一个实施方案中，所述参照生物分子是酶（例如，氧化还原酶、转移 酶、水解酶、裂合酶、异构酶或连接酶）。例如，所述参照酶可以是水解酶，如糖苷酶（经 常称为糖苷水解酶）。在一个实施方案中，所述参照糖苷酶是α-半乳糖苷酶，如阿加 糖酶α (例如，Shire, United Kingdom制造的Replagal? )或阿加糖酶β (例如，由 Genzyme, Cambridge, MA制造的Fabl'azyme? )。在一个实施方案中，所述参照α -半乳糖 苷酶是阿加糖酶β。在另一实施方案中，所述参照生物分子是肽激素，如促甲状腺激素（也 称为TSH或促甲状腺素）。TSH是由两个亚基组成的糖蛋白，所述两个亚基为：α亚基和β 亚基。重组形式的人TSH-α可从Genzyme Corp.以商标名"Thyrogen"获得。在另一实施 方案中，所述参照生物分子是抗体，如单克隆抗体。在一些实施方案中，所述参照生物分子 是糖基化的蛋白。
[0169] 在一些实施方案中，所述水性缓冲溶液包含至少一种氨基酸（例如，丙氨酸、精氨 酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、 赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸）或乙二醇 或丙二醇或乙二醇和丙二醇的组合物。换而言之，在这些实施方案中，如果所述水性缓冲溶 液包含一种或多种氨基酸，则乙二醇和丙二醇的浓度各为0 %。相反地，在这些实施方案中， 如果所述水性缓冲溶液包含乙二醇或丙二醇或两者，则所述一种或多种氨基酸的总浓度为 OmM0
[0170] 在第六方面的一些实施方案中，所述水性缓冲溶液包含0 % -60% (v/v)(如 1%_50% (v/v)、5%_40% (v/v)、8%_30% (v/v)、10%_25% (v/v)、15%_20% (v/v)) 的乙二醇。
[0171] 在那些实施方案中，其中所述水性缓冲溶液包含至少一种氨基酸，所述至少一种 氨基酸通常选自下组：丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、 亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸。换而言之，在这些 实施方案中，通常不存在天冬氨酸、谷氨酸、色氨酸和酪氨酸。在那些实施方案中，其中所 述水性缓冲溶液包含至少一种氨基酸，所述至少一种氨基酸通常选自下组：丙氨酸、半胱氨 酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸。换而言之，在这些实施方案 中，通常不存在天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙 氨酸、色氨酸和酪氨酸。在那些实施方案中，其中所述水性缓冲溶液包含至少一种氨基酸， 所述至少一种氨基酸通常选自下组：丙氨酸、甘氨酸、组氨酸和赖氨酸。换而言之，在这些 实施方案中，通常不存在天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、亮氨 酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
[0172] 在第六方面的一个实施方案中，所述至少一种Good' s缓冲液选自下组:MES、 MOPS、Tris、ADA、ACES、BES、Bi cine、CAPS、CAPSO、CHES、HEPES、PIPES、TAPS 和 TES。在一个 实施方案中，所述至少一种Good's缓冲液是MES。在另一实施方案中，所述至少一种Good's 缓冲液是MOPS。 实施例
[0173] 提出下列实施例以向本领域的技术人员提供如何制备和使用本发明中作为特征 的方法和组合物的完整公开和描述，而非意欲限制发明人看作其发明保护的范围。已作出 努力以确保关于使用的数字的精确性但应说明一些试验误差和偏差。
[0174] 实施例1 :伸用Good's缓冲液和氨基酸的组合解吸牛物分子
[0175] 在该实验中，生物分子阿加糖酶β (由Genzyme, Cambridge, MA制造的 Fabrazyme?)结合于多峰层析树脂 Capto? Adhere (GE Healthcare)并使用 MES 和 MOPS 解吸（参见表1和图1和2)。该表显示了详细的实验设计，其中在150mM至400mM的精氨 酸存在下，在5. 5至7. 5的pH范围内，测试了浓度为50mM至200mM的MES和浓度为20mM 至200mM的MOPS。在这些实验中对收率进行监测作为从层析树脂解吸的指示物。在给定的 缓冲条件下，〇%收率意指无解吸而100%意指生物分子的完全解吸。实验设计和分析使用 Design-Expert? 完成。
[0176] 表1:用MES和MOPS洗脱的实验设计和结果
[0177]< br>[0178] 图1和图2显示分别于pH 6. 25使用MES和于pH 7. 0使用MOPS的收率的等高线 图。如文献预期的，对于给定的pH和MES浓度，收率随精氨酸浓度增加单调增加。令人惊 讶的是，对于给定的pH和精氨酸浓度，收率也随MES和MOPS的浓度单调增加。定量上，发 现MES在解吸中至少与精氨酸同样有效，而MOPS的有效性相比精氨酸略低。综上所述，MES 和MOPS在从多峰树脂解吸生物分子中都与添加剂如精氨酸发挥相似的作用。
[0179] 认为MES和MOPS是对于在下游加工中生物分子的洗脱特别适合的添加剂。这是 由于（i)MES和MOPS溶液比精氨酸和胍具有较低导电性，使得后续的离子交换步骤更易进 行，和（ii)由于MES和MOPS的生物分子溶液通常作为Good's缓冲系统的一部分用于生物 化学，因此认为包含MES和MOPS的溶液比其他添加剂更少破坏生物分子。
[0180] 正如其他添加剂（如NaCl、尿素、胍盐等）可应用于许多不同多峰层析树脂， MES和MOPS可用于从其他可用的多峰层析树脂（如Pal I PPA HyperCe 1?、Pal I HEA HyperCel?、Pall MEP HyperCelTM、Capto? MMC和潜在的多种其他组合疏水、离子和/或氢 键相互作用的多峰树脂）解吸生物分子。
[0181] 此外，预期其他 Good's 缓冲液（例如，ADA、ACES、BES、Bicine、CAPS、CAPSO、CHES、 HEPES、MES、MOPS、PIPES、TAPS、TES和Tris)在从多峰层析树脂解吸生物分子中呈现与MES 和MOPS相似的具有优势的特性。
[0182] 卖施例2:伸用Good's缓冲液和二醇的组合解吸牛物分子
[0183] 对来自实施例1的实验进行了修饰，其中用乙二醇取代精氨酸。该实验的等高线 图示于图3。
[0184] 表2:用MES和二醇洗脱的实验设计和结果
[0185]
[0186] *大于100%的收率是不可能的且仅为测量误差的结果。然而，认为其接近100%。
[0187] 其他实施方案在权利要求中。
【主权项】
1. 一种用于纯化和富集生物分子的方法，所述方法包括如下步骤： (a) 提供包含所述生物分子的水溶液； (b) 将所述水溶液与多峰（multimodal)树脂接触； (c) 任选地用水性洗涤缓冲液洗涤所述多峰树脂； (d) 通过水性缓冲溶液从所述多峰树脂洗脱所述生物分子， 其中所述水性缓冲溶液包含如下的一种或多种： (i) 至少15mM的Good's缓冲液； (ii) 0-400mM的丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘 氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色 氨酸、酪氨酸或缬氨酸； (iii) 0-400mM的盐酸胍、硫氰酸胍、氯化铵、硫酸铵、磷酸铵、乙酸铵、氯化钠、柠檬酸 钠、辛酸钠、磷酸钠、碘化钠、氯化钾、柠檬酸钾、硫酸钾、磷酸钾、碘化钾、氯化镁、硫酸镁、磷 酸镁、氯化钙、硫酸钙、磷酸钙或牛磺酸；和 (iv) l%-60% (v/v)的乙二醇或丙二醇或乙二醇和丙二醇的混合物； 和 (e) 收集包含生物分子的级分，由此获得纯化或富集形式的生物分子。2. 根据权利要求1的方法，其中所述水性缓冲溶液包含15mM至2. 5M的Good' s缓冲 液。3. 根据权利要求1或权利要求2的方法，其中所述Good's缓冲液是MES、M0PS或Tris。4. 根据权利要求1或权利要求2的方法，其中所述Good' s缓冲液是MES。5. 根据权利要求1或权利要求2的方法，其中所述Good' s缓冲液是MOPS。6. 根据权利要求1至5任一项的方法，其中所述生物分子是蛋白。7. 根据权利要求6的方法，其中所述蛋白是酶。8. 根据权利要求7的方法，其中所述酶是糖苷酶。9. 根据权利要求8的方法，其中所述糖苷酶是α -半乳糖苷酶。10. 根据权利要求9的方法，其中所述α -半乳糖苷酶选自下组：阿加糖酶 (agalsidase) α和阿加糖酶β。11. 根据权利要求1至10任一项的方法，其中所述多峰树脂选自下组：CaptO ? Adhere、Capto? MMC、Pall PPA HyperCel?、Pall HEA HyperCel?、Pall MEP HyperCel?和 Eshmuno? HCX。12. -种通过根据权利要求1至11任一项的方法获得的纯化的生物分子。13. -种制备物，其包含： (a) 生物分子；和 (b) 水性缓冲溶液，其包含如下的一种或多种： (i) 至少15mM的Good's缓冲液； (ii) 0-400mM的丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘 氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色 氨酸、酪氨酸或缬氨酸； (iii) 0-400mM的盐酸胍、硫氰酸胍、氯化铵、硫酸铵、磷酸铵、乙酸铵、氯化钠、柠檬酸 钠、辛酸钠、磷酸钠、碘化钠、氯化钾、柠檬酸钾、硫酸钾、磷酸钾、碘化钾、氯化镁、硫酸镁、磷 酸镁、氯化钙、硫酸钙、磷酸钙或牛磺酸；和 (iv) l%-60% (v/v)的乙二醇或丙二醇或乙二醇和丙二醇的混合物。14. 根据权利要求13的制备物，其中所述水性缓冲溶液包含15mM和2. 5M的Good' s 缓冲液。15. 根据权利要求13或14的制备物，其中所述至少一种Good's缓冲液选自下组:MES、 MOPS 或 Tris。16. 根据权利要求13或14的制备物，其中所述Good' s缓冲液是MES。17. 根据权利要求13或14的制备物，其中所述Good' s缓冲液是MOPS。18. 根据权利要求13至17任一项的制备物，其中所述生物分子是蛋白。19. 根据权利要求18的制备物，其中所述蛋白是酶。20. 根据权利要求19的制备物，其中所述酶是糖苷酶。21. 根据权利要求20的制备物，其中所述糖苷酶是α -半乳糖苷酶。22. 根据权利要求21的制备物，其中所述α-半乳糖苷酶选自下组：阿加糖酶α和阿 加糖酶β。23. -种用于从多峰树脂解吸生物分子的方法，包括将结合于多峰树脂的生物分子与 水性缓冲液接触，其中所述水性缓冲液包含如下的一种或多种： (i) 至少15mM的Good's缓冲液； (ii) 0-400mM的丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘 氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色 氨酸、酪氨酸或缬氨酸； (iii) 0-400mM的盐酸胍、硫氰酸胍、氯化铵、硫酸铵、磷酸铵、乙酸铵、氯化钠、柠檬酸 钠、辛酸钠、磷酸钠、碘化钠、氯化钾、柠檬酸钾、硫酸钾、磷酸钾、碘化钾、氯化镁、硫酸镁、磷 酸镁、氯化钙、硫酸钙、磷酸钙或牛磺酸；和 (iv) l%-60% (v/v)的乙二醇或丙二醇或乙二醇和丙二醇的混合物。24. -种通过将其上已吸附所述生物分子的多峰树脂与水性缓冲溶液接触来增加吸附 在多峰树脂上的生物分子回收率的方法，其中所述水性缓冲溶液包含如下的一种或多种： (i) 至少15mM的Good's缓冲液； (ii) 0-400mM的丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘 氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色 氨酸、酪氨酸或缬氨酸； (iii) 0-400mM的盐酸胍、硫氰酸胍、氯化铵、硫酸铵、磷酸铵、乙酸铵、氯化钠、柠檬酸 钠、辛酸钠、磷酸钠、碘化钠、氯化钾、柠檬酸钾、硫酸钾、磷酸钾、碘化钾、氯化镁、硫酸镁、磷 酸镁、氯化钙、硫酸钙、磷酸钙或牛磺酸；和 (iv) l%-60% (v/v)的乙二醇或丙二醇或乙二醇和丙二醇的混合物。25. 权利要求23或权利要求24的方法，其中所述水性缓冲溶液包含15mM-2. 5M的 Good's缓冲液。26. 权利要求23至25任一项的方法，其中所述Good's缓冲液选自下组：MES、MOPS或 Tris027. 权利要求23至25任一项的方法，其中所述Good's缓冲液是MES。28. 权利要求23至25任一项的方法，其中所述Good's缓冲液是MOPS。29. 权利要求23至28任一项的方法，其中所述生物分子是蛋白。30. 权利要求29的方法，其中所述蛋白是酶。31. 权利要求30的方法，其中所述酶是糖苷酶。32. 权利要求31的方法，其中所述糖苷酶是α -半乳糖苷酶。33. 权利要求32的方法，其中所述α-半乳糖苷酶选自下组：阿加糖酶α和阿加糖酶 β O34. 权利要求23至33任一项的方法，其中所述多峰树脂选自下组：Capto ? Adhere、 Capto? MMC、Pall PPA HyperCel?、Pall HEA HyperCel?、Pall MEP HyperCeln^ Eshmuno? HCX035. -种制品，其包含： (a) 包装材料或容器； (b) 水性缓冲溶液，所述水性缓冲溶液包含如下的一种或多种： (i) 至少15mM的Good's缓冲液； (ii) 0-400mM的丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘 氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色 氨酸、酪氨酸或缬氨酸； (iii) 0-400mM的尿素、盐酸胍、硫氰酸胍、氯化铵、硫酸铵、磷酸铵、乙酸铵、氯化钠、柠 檬酸钠、辛酸钠、磷酸钠、碘化钠、氯化钾、柠檬酸钾、硫酸钾、磷酸钾、碘化钾、氯化镁、硫酸 镁、磷酸镁、氯化钙、硫酸钙、磷酸钙或牛磺酸；和 (iv) l%-60% (v/v)的乙二醇或丙二醇或乙二醇和丙二醇的混合物，和 (c) 包含用于实施根据权利要求1至11任一项的方法的说明的数据载体。36. 根据权利要求35的制品，其中所述数据载体是在所述包装材料或容器或包装说明 书上存在的标签。37. 根据权利要求35或权利要求36的制品，其中所述数据载体包括书面信息、视觉信 息或计算机可读信息。38. 根据权利要求35至37任一项的制品，其中所述数据载体进一步包括一种或多种下 列信息： (i) 使用水性缓冲溶液的说明； (ii) 质量信息如关于所述水性缓冲溶液的批次/批号、制造或组装地点或过期或销售 日期的信息，或关于制品正确的储存或处理的信息； (iii) 关于所述水性缓冲溶液的组成的信息； (iv) 关于实施根据权利要求1至11任一项的方法时获得的信息解读的信息； (V)关于采用不适合的方法时可能的误解或错误结果的警告；和 (vi)关于使用不合适的试剂和/或缓冲液时可能的误解或错误结果的警告。39. 根据权利要求35至38任一项的制品，其进一步包含一种或多种如下组分： (d) 层析介质； (e) 层析柱；和 (f) 可用于校准纯化或富集生物分子的方法的参照生物分子。40. 根据权利要求39的制品，其中所述层析柱预装有所述层析介质。41. 根据权利要求39至40任一项的制品，其中所述层析介质是多峰层析树脂。42. 根据权利要求41的制品，其中所述多峰层析树脂选自下组：Capto ? Adhere、 Capto? MMC、Pall PPA HyperCel?、Pall HEA HyperCel?、Pall MEP HyperCeln^ Eshmuno? HCX043. 根据权利要求39至42任一项的制品，其中所述参照生物分子是蛋白或核酸。44. 根据权利要求35至43任一项的制品，其中所述水性缓冲溶液包含15mM-2. 5M的 Good's缓冲液。45. 根据权利要求35至44任一项的制品，其中所述至少一种Good's缓冲液选自下组： MES、MOPS 和 Tris。46. 根据权利要求35至45任一项的制品，其中所述Good's缓冲液是MES。47. 根据权利要求35至45任一项的制品，其中所述Good's缓冲液是MOPS。
【专利摘要】本发明涉及使用多峰树脂和包含Good's缓冲液的洗脱缓冲液用于纯化或富集生物分子的方法。
【IPC分类】B01D15/38, C07K1/16
【公开号】CN104884147
【申请号】CN201380067814
【发明人】R·戈达瓦特, D·卡明斯, V·瓦里库
【申请人】建新公司
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2013年10月23日
【公告号】CA2888824A1, EP2911759A1, US20150275195, WO2014066471A1