从阱提取受抑制液体的制作方法

从阱提取受抑制液体的制作方法
【专利说明】从阱提取受抑制液体
[0001] 本申请要求2012年11月8日提交的美国临时申请61/724, 118和2013年3月12 日提交的美国临时申请61/777, 459的优先权，所述两个申请均以引用方式并入本文。 发明领域
[0002] 本发明提供用于从芯片中的开放式阱提取受抑制液体（例如，受表面张力抑制的 液体）的方法、系统、组件和制品。例如，本发明提供可附接至芯片和/或与芯片相邻的提 取固定装置，以使得被迫离开所述开放式阱的任何受抑制液体由所述提取固定装置收集或 流过所述提取固定装置。
[0003] 背景
[0004] 典型的纳米阱芯片是由芯片衬底中的72 X 72阵列（5184)的阱或腔组成。在这 种典型的芯片中，每个阱的直径为450 μπι，且深度为940 μπι，并且填充有几纳升体积的液 体反应物。小尺寸防止反应材料被移液管移除，例如，如同常规96或384阱板那样。在给 定小尺寸的阱的情况下，阱内流体的表面张力成为将液体从阱移除所必须克服的力的更大 分量，因此使得移除过程复杂化。
[0005] 发明概述
[0006] 本发明提供用于从芯片中的开放式阱（例如，纳米阱）提取受抑制液体（例如，受 表面张力抑制的液体）的方法、系统、组件和制品，其中当阱保持倒置时受表面张力抑制的 液体不会由于重力而从阱中流出。例如，本发明提供可附接至芯片和/或与芯片相邻的提 取固定装置，以使得被迫离开开放式阱的任何受抑制液体（例如，受表面张力抑制的液体） 由所述提取固定装置收集和/或流过所述提取固定装置。另外，例如，本发明提供由附接至 芯片和/或与芯片相邻的提取固定装置组成的组件、以及使此类组件经受力以使得开放式 阱中的受抑制液体的至少一部分被迫离开并且由所述提取固定装置收集和/或流过所述 提取固定装置的方法。在液体流过提取固定装置的某些实施方案中，液体被收集在收集管 中。
[0007] 在一些实施方案中，本发明提供从芯片中的至少一个开放式阱移除受抑制液体 (例如，受表面张力抑制的液体）的方法，所述方法包括：a)提供包括与芯片相邻和/或附 接至芯片的至少一个提取固定装置的组件，i)其中所述芯片包括衬底和形成于所述衬底 中的多个开放式阱（或至少一个开放式阱），其中所述多个开放式阱含有受抑制液体，并且 ii)其中所述至少一个提取固定装置与所述芯片相邻和/或附接至所述芯片，以使得被迫 离开所述多个开放式阱的任何受抑制液体由所述至少一个提取固定装置收集；以及b)使 所述组件经受力以使得所述受抑制液体的至少一部分成为释放液体，所述释放液体从所述 多个开放式阱中的至少一个流出并且由所述至少一个提取固定装置保持或流过所述至少 一个提取固定装置（例如，流到收集管中）。在某些实施方案中，所述提取固定装置是由封 闭芯片的多个部件组成。
[0008] 在某些实施方案中，本发明提供从芯片中的至少一个开放式阱移除受抑制液体 (例如，受表面张力抑制的液体）的方法，所述方法包括：使组件经受力，其中所述组件包括 与芯片相邻和/或附接至芯片的至少一个提取固定装置，其中所述芯片包括衬底和形成于 所述衬底中的多个开放式阱（或至少一个开放式阱），其中所述多个开放式阱含有受抑制 液体，并且其中所述使所述组件经受力使得所述受抑制液体的至少一部分成为从所述多个 开放式阱中的至少一个流出的释放液体，其中所述释放液体由所述至少一个提取固定装置 保持或流过所述至少一个提取固定装置。
[0009] 在特定实施方案中，所述力选自由以下组成的组：向心力、离心力、真空力和突然 减速（例如，运动停止）或任何其它移动的力。在其它实施方案中，所述力是由离心机或类 似装置生成。
[0010] 在另外的实施方案中，本发明提供包括以下的组件：与芯片相邻和/或附接至芯 片的至少一个提取固定装置，其中所述芯片包括衬底和形成于所述衬底中的多个开放式阱 (或至少一个开放式阱），其中所述多个开放式阱含有液体并且被设定尺寸以使得不管所 述芯片如何取向表面张力或其它抑制力均阻止所述液体从所述开放式阱流出，并且其中所 述至少一个提取固定装置附接至所述芯片和/或与所述芯片相邻以使得被迫离开所述多 个开放式阱的任何液体由所述至少一个提取固定装置收集或流过所述至少一个提取固定 装置（例如，流到收集管中）。
[0011] 在一些实施方案中，本发明提供包括以下的系统：a)芯片，其中所述芯片包括衬 底和形成于所述衬底中的多个开放式阱（或至少一个开放式阱），其中所述多个开放式阱 含有受抑制液体，和b)至少一个提取固定装置，所述至少一个提取固定装置被设定尺寸以 附接至所述芯片和/或保持与所述芯片相邻以便形成组件，并且其中所述至少一个提取固 定装置进一步被设定尺寸以使得当受抑制液体存在于所述多个开放式阱中并且被迫离开 所述多个开放式阱以形成释放液体时，所述释放液体由所述至少一个提取固定装置收集或 流过所述至少一个提取固定装置（例如，流到收集管中）。在另外的实施方案中，所述系统 还包括c)被配置成向所述组件施加力的装置。在特定实施方案中，所述装置包括离心机。
[0012] 在某些实施方案中，本发明提供包括以下的制造制品：提取固定装置，所述提取固 定装置被设定尺寸以附接至芯片以便形成组件（和/或被设定尺寸以保持与芯片相邻），其 中所述芯片包括衬底和形成于所述衬底中的多个开放式阱（或至少一个开放式阱），其中 所述多个开放式阱含有受抑制液体，并且其中所述提取固定装置进一步被设定尺寸以使得 当受抑制液体存在于所述多个开放式阱中并且被迫离开所述多个开放式阱以形成释放液 体时，所述释放液体的至少一部分由所述提取固定装置收集或流过所述提取固定装置。
[0013] 在一些实施方案中，本发明提供制作组件的方法，所述方法包括：a)将至少一个 提取固定装置附接至芯片（或保持提取固定装置与芯片相邻）以形成组件，其中所述芯片 包括衬底和形成于所述衬底中的多个开放式阱（或至少一个开放式阱），其中所述多个开 放式阱含有受抑制液体，其中所述至少一个提取固定装置附接至所述芯片（和/或与所述 芯片相邻），以使得被迫离开所述多个开放式阱以成为释放液体的任何受抑制液体由所述 至少一个提取固定装置收集或流过所述至少一个提取固定装置；以及b)利用密封部件将 所述至少一个提取固定装置密封至所述芯片，以便在所述芯片的至少一部分与所述至少一 个提取固定装置之间形成水密密封。在某些实施方案中，所述密封部件包括〇形环或其它 垫圈。在其它实施方案中，所述密封部件选自由以下组成的组：螺丝、粘合剂、至少一个夹具 和螺栓。
[0014] 在特定实施方案中，本发明提供包括以下的方法：a)提供芯片，其中所述芯片包 括衬底和形成于所述衬底中的多个开放式阱（或至少一个开放式阱），其中所述多个开放 式阱含有受抑制液体，并且其中所述芯片至少部分地由覆盖所述多个开放式阱的密封膜覆 盖；b)将所述密封膜的至少一部分从所述芯片移除以形成开放区域；c)将提取固定装置 附接至所述芯片（或保持所述提取固定装置与所述芯片相邻），以使得所述开放区域由所 述提取固定装置覆盖以形成组件，其中所述提取固定装置附接至所述芯片和/或与所述芯 片相邻，以使得被迫离开所述多个开放式阱以成为释放液体的任何受抑制液体由所述提取 固定装置保持或流过所述提取固定装置；以及d)利用密封部件将所述至少一个提取固定 装置密封至所述芯片，以便在所述芯片的至少一部分与所述提取固定装置之间形成水密密 封。在某些实施方案中，所述方法还包括步骤e):使所述组件经受力以使得所述受表面张 力抑制的液体的至少一部分从所述多个开放式阱中的至少一个流出以成为释放液体，所述 释放液体由所述提取固定装置收集或流过所述提取固定装置。
[0015] 在特定实施方案中，所述至少一个提取固定装置包括提取固定装置基部，其中所 述提取固定装置基部包括被设定尺寸以收集流体的锥形区段。在其它实施方案中，所述至 少一个提取固定装置包括提取固定装置基部，其中所述提取固定装置基部包括以下中的至 少一个：i)被设定尺寸以保持所述芯片的口袋部件；ii)被设定尺寸以收集流体的锥形区 段；以及iii)被设定尺寸以保持垫圈的垫圈轨道。在另外的实施方案中，所述至少一个提 取固定装置还包括被设定尺寸以附接至所述提取固定装置基部（例如，以使得所述芯片被 封闭在其中）的提取固定装置顶板。在某些实施方案中，所述至少一个提取固定装置还包 括：i)被设定尺寸以附接至所述提取固定装置基部的提取固定装置顶板；ii)被配置成配 合在所述芯片与所述提取固定装置顶板之间的纸垫圈；和/或iii)被配置成允许通过所述 固定装置顶板分配样品的样品杯。在另外的实施方案中，所述锥形区段包括被设定尺寸以 允许移液管移除位于其中的任何释放液体的流体保持部件。在一些实施方案中，从所述多 个开放式阱中的至少一个流出的液体由所述至少一个提取固定装置保持。
[0016] 在特定实施方案中，所述组件、系统和方法还具有基部保持部件，其中所述基部保 持部件被设定尺寸以保持与芯片相邻的至少一个提取固定装置。在一些实施方案中，所述 组件、系统和方法还包括安装在所述基部保持部件中的至少一个收集管，其中从所述多个 开放式阱中的至少一个流出的液体流过所述至少一个提取固定装置进入所述至少一个收 集管中。在其它实施方案中，所述基部保持部件被设定尺寸以保持与所述芯片相邻的提取 固定装置中的至少两个（例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个提取固定装置）。在 另外的实施方案中，所述至少一个提取固定装置附接至所述芯片。在特定实施方案中，所述 基部保持部件被设定尺寸以保持与芯片相邻（例如，在一端上）并且与收集管相邻（例如， 在另一端上）的至少一个提取固定装置。在某些实施方案中，所述收集管包括聚合酶链反 应管、EPPEND0RF或相似类型的管。
[0017] 在其它实施方案中，所述至少一个提取固定装置包括：i)覆盖部件，和ii)流体保 持部件；其中所述覆盖部件被设定尺寸以覆盖所述芯片的至少一部分，并且包括可拆卸地 附接至所述流体保持部件的端口。在特定实施方案中，所述流体保持部件包括测试管。在 一些实施方案中，所述覆盖部件在围绕所述端口的区域中具有大致平面的形状。
[0018] 在某些实施方案中，至少25% (例如，25%…35%…50%…60%…75%…85%… 95%…98%…99. 5%…99. 9%…100% )的受抑制液体（例如，受表面张力抑制的液体） 成为释放液体并且从所述多个开放式阱流出，并且由所述提取固定装置保持或流过所述提 取固定装置。在一些实施方案中，所述至少一个提取固定装置包括至少两个提取固定装置 (例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15~25个或更多个）。在特定实施方案中，所 述多个开放式阱中的至少一些具有在〇. 1纳升与500纳升之间（例如，约0. 1η1···0. 9nl… I. 5nl··· 5. Onl…IOnl…20nl…35nl…50nl…75nl…100nl··· 150nl…300nl··· 450nl … 500nl)的容积。在特定实施方案中，所述多个开放式阱中的至少一些具有在I. 0纳升与250 纳升之间（例如，l-250nl、10-200nl、25-150nl、40-100nl 或 50-100nl)的容积。
[0019] 在一些实施方案中，所述多个开放式阱包括至少3个开放式阱（例如，3…l(l··· 100…350··· 500··· 750··· 1000…1500…3000…5000…7500…10, 000…15, 000…20, 000… 30, 000…45, 000个或更多个开放式阱）。在其它实施 方案中，所述受抑制液体包含PCR试 剂（例如，引物、聚合酶、水、缓冲液、模板核酸序列、逆转录酶等）。在其它实施方案中，所述 受抑制液体包含扩增的核酸。在另外的实施方案中，所述方法还包括使由所述至少一个提 取固定装置保持或流过所述至少一个提取固定装置的释放液体经受核酸检测分析的步骤。
[0020] 在另外的实施方案中，所述芯片具有IOmm至200mm(例如，lOmnr·· 50mnr·· lOOmnr·· 150mm…或 200mm)的长度、IOmm 至 200mm(例如，10mm··· 50mm…100mm…150mm…或 200mm) 的宽度和〇. Imm至10厘米（例如，〇. Imm…I. 0mm…10mm…10cm)的厚度。在其它实施方案 中，所述衬底包括选自由以下组成的组的材料：玻璃、陶瓷、类金属、硅、硅酸盐、氮化硅、二 氧化硅、石英、砷化镓、塑料和有机聚合物材料。在另外的实施方案中，所述芯片还包括单独 控制的加热元件，每个所述加热元件可操作地连接至开放式讲。在一些实施方案中，所述至 少一个提取固定装置由附接部件附接至所述芯片，所述附接部件选自由以下组成的组：螺 丝、粘合剂、至少一个夹具和螺栓。
[0021] 在一些实施方案中，本发明提供用于减少纳米阱芯片上的扩增子产量的动态范围 的方法，所述方法包括：i)识别初始纳米阱芯片中的至少一个阱，所述至少一个阱在扩增 期间从特定靶标产生相对于所述纳米阱芯片中的所有阱扩增期间的平均扩增子产量增加 或减少的扩增子产量；以及ii)除了至少以下各项之外使用与所述初始纳米阱芯片相同设 置的测试纳米阱芯片来执行扩增：A)所述测试纳米阱芯片上的另外的阱被用于识别为具 有减少的扩增子产量的靶标；B)发现具有增加的表达的靶标与其它靶标结合以使得在单 个阱中发生多重扩增；C)增大发现具有低扩增子产量的阱中的引物浓度；D)减小发现具有 高扩增子产量的阱中的引物浓度；E)使抑制剂包含在发现具有高扩增子产量的阱中；F)切 换到发现具有高扩增子产量的阱中的效率较低的引物；G)如果扩增子产量减少则更改阱 中的热循环温度和/或时间以增加扩增子产量，或如果扩增子产量增加则更改阱中的热循 环温度和/或时间以减少扩增子产量；以及H)如果扩增子产量减少则更改阱的深度、宽度 和/或容积以增加扩增子产量，或如果扩增子产量增加则更改阱的深度、宽度和/或容积以 减少扩增子产量。
[0022] 定义
[0023] 如此处所使用，当芯片保持倒置以使得开放式阱的开口面向地面时液体不会由于 重力而从所述阱中流出的情况下，所述液体被"抑制"在芯片的所述阱中。在某些实施方案 中，液体由于表面张力而被抑制在阱中（即，所述液体是受表面张力抑制的液体）。
【附图说明】
[0024] 图1示出可定位在提取固定装置内的纳米阱芯片（10)，所述提取固定装置是由 通过四个拇指螺丝（40)彼此附接的提取固定装置基部（20)和提取固定装置顶板（30)组 成。这个示例性实施方案中所示的提取固定装置基部（20)具有：用于保持芯片的口袋部件 (25) ;用于收集流体并且包括流体保持部件（26)的锥形区段（27);以及用于保持垫圈（例 如，0形环）的垫圈轨道（28)，所述垫圈有助于在提取固定装置顶板（30)与提取固定装置 基部（20)之间形成液密密封。
[0025] 图2A示出具有纳米阱芯片（10)位于其上的基部保持部件（50)的自上而下视图。 图2B示出基部保持部件（50)的侧面透视图，其中四个提取固定装置（35)被保持低于基部 保持部件（50)并且与纳米阱芯片（10)相邻。图2C示出基部保持部件（50)穿过图2A的 截面B-B的横截面。图2C中的横截面示出保持在基部保持部件（50)内、收集管(60)上方 的四个提取固定装置（35)中的两个。
[0026] 图3示出包含纸垫圈（70)的提取固定装置的示例性实施方案。图3示出介于纳 米阱芯片（10)与固定装置顶板（30)之间的纸垫圈（70)。图3中还示出的是固定装置顶板 (30)中的样品杯（90)，样品可引入所述样品杯（90)中。示出可覆盖样品杯（90)的保护性 标签（45)。示出在固定装置顶板（30)中用于将所有部件附接在一起（例如，用于锚定在 提取固定装置基部（20)中的所示的孔中）的四个螺丝（40)。还示出在提取固定装置基部 (20)中的是垫圈轨道（28)，其中示出橡胶垫圈处于适当位置。
[0027] 图4示出固定装置顶板中的体填充（bulk fill)固定装置的各种示例性实施方 案。图A-I示出固定装置顶板（30)的顶视图，其中样品杯（90)形成于所述固定装置顶板 (30)的中心，所述样品杯（90)具有形成于所述样品杯（90)中心的隔膜（80)以允许将样 品针状喷射到样品杯中（例如，当提取固定装置在真空填充站顶部上时靶标样品的针状喷 射，所述真空填充站将样品向下吸取到下方的纳米阱芯片中）。图A-2示出样品杯（90)穿 过图A-I的截面A-A的侧视图。图B-I示出固定装置顶板（30)的顶视图，其中样品杯（90) 形成于所述固定装置顶板（30)的中心，而图B-2示出图B-I穿过截面B-B的侧视图。图 B-3示出图B-2中的体填充固定装置的放大图，其示出套管（110)和在所述套管顶部上的鸭 嘴阀（101)，当施加（或释放）真空以将样品向下吸取（部分120示出在释放或施加真空时 示例性液体前部以及液体是如何能够流到芯片上的）到纳米阱芯片（10)中时所述鸭嘴阀 (101)允许空气排出，从而防止样品杯中的液体起泡。图C-I示出固定装置顶板（30)的顶 视图，其中样品杯（90)形成于所述固定装置顶板（30)的中心，而图C-2示出图C-I穿过截 面C-C的侧视图。图C-3示出图C-2中的体填充固定装置的放大图，其示出套管（110)和 组合阀（102)，所述组合阀（102)通过鸭嘴阀通气同时允许液体流过伞形部分。
[0028] 详述
[0029] 本发明提供用于从芯片中的开放式阱提取受抑制液体的方法、系统、组件和制品， 其中当所述阱保持倒置时所述液体不会由于重力而从所述阱中流出。例如，本发明提供可 附接至芯片和/或与芯片相邻的提取固定装置，以使得被迫离开开放式阱的任何受抑制液 体由所述提取固定装置收集或流过所述提取固定装置。另外，例如，本发明提供由附接至芯 片的提取固定装置组成的组件、以及使此类组件经受力以使得开放式阱中的受抑制液体的 至少一部分被迫离开所述提取固定装置并且由所述提取固定装置保持或流过所述提取固 定装置的方法。
[0030] 在某些实施方案中，本发明允许将芯片中的阱（例如，纳米阱）中的受抑制液体释 放并且汇合到单个池中（例如，来自特定芯片的所有液体都汇合到单个液体样品中）。在一 些实施方案中，本发明采用离心机或类似装置来提供将受抑制反应物液体从纳米阱芯片提 取出来所必需的力。
[0031] 在本发明的实施方案的研发期间所进行工作中，使用以胶带粘接到SMARTCHIP纳 米阱芯片（来自加利福尼亚州弗里蒙特市的Wafergen公司）的简单提取固定装置来测试 这种纳米阱提取概念的可行性。通过称取纳米阱芯片在填充之前和之后的重量以确定所述 阱中反应物的准确量来测试所述概念。将提取固定装置以胶带粘接到芯片上并且整体放置 到离心机的臂中，以使得向心力将作用来将流体从阱中推出。使用两个组件通过将它们装 载在相对侧上来保持离心机平衡。另外，在使芯片/固定装置组合旋转之前称取提取固定 装置的重量。在离心机中进行测试，所述离心机以2000rpm持续运行15分钟。移除提取固 定装置并称取其重量。最初在芯片中的约15%的流体被捕获在提取固定装置中。
[0032] 在本发明的研发期间进行其它工作中，使用图1中的部件，将待提取的芯片 (SMARTCHIP)侧面朝下放置好，以使得其面向提取固定装置的锥形区段。芯片静置在锥形区 段上方的口袋中，并且当利用四个拇指螺丝将芯片向下紧固时，提取固定装置的顶部区段 随后将芯片锁定到适当位置中。整个提取固定装置由0形环密封，从而保持包含的所提取 流体，直到移除所述流体以供进一步分析。应注意，锥形区段被分成两部分，即在离心分离 期间捕获流体的大锥形和将所捕获流体集中到较小区域中的较小区段。这允许移液管将所 提取流体移除，以便转移到另一个容器中。随后，将提取固定装置放置到常见的实验室离心 机中并且旋转。测试已证明离心机的速度对于回收较大百分比的液体是重要的。如果转动 低于一定速度（例如，根据芯片中的纳米阱的尺寸），则极少乃至没有流体从纳米阱芯片移 除。这是因为由离心机产生的力不足以克服保持阱中流体的表面张力。高于特定速度（例 如，针对纳米阱的特定尺寸），提取可为有效的，从而捕获最初在纳米阱芯片中的超过75% 的流体。在某些实施方案中，所述组件应旋转超过2000rpm以实现75 %提取率。
[0033] 在某些实施方案中，使用提取固定装置来从单个芯片收集多个样品（例如，汇集 的样品）（例如，多个提取固定装置用在单个芯片上）。此类实施方案的实例如下。在这种 实施方案中，芯片在地理学上被分成离散的区段，诸如4或9个区段。通过由约4mm宽的研 磨表面形成的密封"街道"将每个区段与相邻区段分开。芯片可通过多重采样纳米分配器 而装载有试剂（例如，PCR反应物）并且进行处理以达到反应条件（例如，用于PCR反应的 加热和冷却循环）。在热循环之后，通过使剃刀刀片或其它切割部件在切割路线上运行来将 密封膜一次切除一个区段，所述切割路线存在于每个密封"街道"的中心处。在特定实施方 案中，在任何时间都仅切除一个区段，并且将单独的提取固定装置放置在所述区段上并且 由其底部边缘上的PSA(压力敏感粘合剂）密封。在此类实施方案中，可采用图2中所描述 的布置。单独的提取固定装置中的每一个可具有将接受（例如）200ul收集管的端口。可 将后续区段去膜并且以相同的方式覆盖。在某些实施方案中，一旦所有单独的提取固定装 置均在适当位置，就附接夹具，所述夹具同时将单独的提取固定装置向下夹紧。在其它实施 方案中，不采用夹具。随后，将整个组件放置在离心机中并且如以上单个样品实施方案中所 述的那样进行处理。一旦完成离心机步骤，就移除芯片组件并且将其定位在固定装置上，同 时芯片的侧面朝上。在这种取向下，纳米阱中的内容汇集在收集管的底部。可移除单独的 收集管并将其加盖，然后在移除下一个管之前在所述收集管的位置中安装空管以防止任何 污染物（例如，液体中的扩增子）。一旦使用者已利用空收集管移除芯片组件并将其加盖， 就可丢弃整个组件。此类实施例允许对单独样品进行扩增或其它操作，而没有来自不同区 段的扩增子的交叉污染的风险。另一种样品提取方法是通过使用基部保持部件一侧上的隔 膜密封并且随后使用皮下注射器来提取离心内容。
[0034] 在某些实施方案中，提取固定装置被配置成将来自纳米阱芯片的所有液体都收集 到单个池中。图1中示出示例性实施方案，其中提取固定装置是由匹配并且包围芯片的提 取固定装置基部（20)和提取固定装置顶板（30)组成。提取固定装置顶板（30)和提取固 定装置基部（20)可利用任何类型的部件（例如，螺丝、粘合剂、VELCRO等）彼此附接。在图 1中，附接部件是四个拇指螺丝（40)。如图1所示，提取固定装置基部（20)可具有：用于保 持芯片的口袋部件（25)、用于收集流体的锥形区段（27)(其可包括流体保持部件（26))和 用于保持垫圈（例如，0形环）的垫圈轨道（28)，所述垫圈有助于在提取固定装置顶板（30) 与提取固定装置基部（20)之间形成液密密封。
[0035] 在一些实施方案中，多个提取固定装置一起使用，以使得每个提取固定装置收集 芯片的阱中的液体的一部分。图2中示出示例性实施方案，其中使用保持在基部保持部件 内的四 个提取固定装置。在图2A中，基部保持部件（50)被示出具有位于其顶部上的倒置纳 米阱芯片（10)。图2B示出基部保持部件（50)的侧面透视图，其中四个提取固定装置（35) 被保持低于基部保持部件（50)并且与纳米阱芯片（10)相邻。其它数量的提取固定装置也 可用于基部保持部件中，诸如1、2、3、5、6、7、8、9个或更多个。图2C示出基部保持部件（50) 穿过图2A的截面B-B的横截面。图2C中横截面示出保持在基部保持部件（50)内、收集管 (60)上方的四个提取固定装置（35)中的两个。收集管可为PCR管（例如200 μ 1)或任何 其它类型的合适管或收集容器。
[0036] 在某些实施方案中，本发明的提取固定装置采用纸垫圈（例如在纳米阱芯片与固 定装置顶板之间）。图3中示出提取固定装置的示例性实施方案。图3示出介于纳米阱芯 片（10)与固定装置顶板（30)之间的纸垫圈（70)。图3中还示出的是固定装置顶板（30) 中的样品杯（90)，样品可引入所述样品杯（90)中。示出可覆盖样品杯（90)的保护性标签 (45)。示出在固定装置顶板（30)中用于将所有部件附接在一起（例如，用于锚定在提取固 定装置基部（20)中的所示的孔中）的四个螺丝（40)(其可为任何类型的附接部件）。还示 出在提取固定装置基部（20)中的是垫圈轨道（28)，其中示出橡胶垫圈处于适当位置。 [0037] 在某些实施方案中，使用纸垫圈来防止或减缓添加至本发明的提取固定装置中的 纳米阱的样品材料的泄漏（例如，当液体样品通过样品杯喷射到提取固定装置中时）。任何 类型的合适纸张均可用于纸垫圈。优选地，纸垫圈是由以下类型的纸张组成：这种纸张可用 于围住液体流前部并且吸附过量液体，但不是特别迅速（例如，太迅速地吸附液体样品的 纸张并不是优选的，因为这可能导致低的填充重量进入纳米阱芯片）。在某些实施方案中， 所采用的纸张类型是喷墨用纸，诸如KODAK喷墨用纸（例如，30-70镑喷墨用纸、或约44镑 喷墨用纸、或80镑喷墨用纸）。在某些实施方案中，所采用的纸张是滤纸、吸墨纸、垫片纸或 层析纸。在某些实施方案中，所采用的纸张是44镑消光喷墨用纸（例如来自KODAK公司）。 在某些实施方案中，纸垫圈的厚度是在0. 005英寸与0. 009英寸之间。在一些实施方案中， 所采用的纸张是未涂覆的商品级纸张、未涂覆的表面处理纸张或涂覆纸（例如，像各种类 型的喷墨用纸）。在特定实施方案中，所述纸张是无酸美术纸（例如，约60…70…80镑无 酸美术纸）。
[0038] 在某些实施方案中，用于纸垫圈的纸张是吸墨型纸张、垫片型纸张或层析型纸张。 此类纸张的实例包括垫片纸/吸墨纸、标准级、湿法增强、硬化低灰分级和硬化无灰级，其 可在下表1-5中找到：
[0039] 表 1
[0043] 表 3
[0044]
[0049] 在某些实施方案中，当纳米阱芯片已存在于提取固定装置内时所述纳米阱芯片装 载有样品。这种装载可例如通过形成固定装置顶板的一部分的体填充固定装置（例如，并 且其允许液体传输穿过固定装置顶板）来完成。图3和图4示出体填充固定装置的被称为 样品杯（90)的部分，所述样品杯（90)延伸穿过固定装置顶板（30)以使得当纳米阱芯片已 在提取固定装置内时能够将样品引入到纳米阱芯片中。
[0050] 图4示出固定装置顶板中的体填充固定装置的各种示例性实施方案。图4A-1示出 固定装置顶板（30)的顶视图，其中样品杯（90)形成于所述固定装置顶板（30)的中心，所 述样品杯（90)具有在样品杯中心的隔膜（80)以允许将样品针状喷射到样品杯中（例如， 当提取固定装置在真空填充站顶部上时样品的针状喷射，所述真空填充站将样品向下吸取 到下方的纳米阱芯片中）。图4A-2示出样品杯（90)穿过图4A-1的截面A-A的侧视图。图 4B-1示出固定装置顶板（30)的顶视图，其中样品杯（90)形成于所述固定装置顶板（30)的 中心，而图4B-2示出图4B-1穿过截面B-B的侧视图。在此类实施方案中，可在将提取固定 装置放置在填充站（例如，其可施加真空）中之前将样品预装载到体填充固定装置中。图 4B-3示出图4B-2中的体填充固定装置的放大图，其示出套管（110)和在所述套管顶部上的 鸭嘴阀（101)，当施加（或释放）真空以将样品向下吸取（部分120示出在释放或施加真空 时示例性液体前部以及液体是如何能够流到芯片上的）到纳米阱芯片（10)中时所述鸭嘴 阀（101)允许空气排出，从而防止样品杯中的液体起泡。图4C-1示出固定装置顶板（30) 的顶视图，其中样品杯（90)形成于所述固定装置顶板（30)的中心，而图4C-2示出图4C-1 穿过截面C-C的侧视图。在此类实施方案中，可在将提取固定装置放置在填充站（例如，其 可施加或释放真空）中之前将样品预装载到体填充固定装置中。图4C-3示出图4C-2中的 体填充固定装置的放大图，其示出套管（110)和组合阀（102)，所述组合阀（102)通过鸭嘴 阀通气同时允许液体流过伞形部分。
[0051] 本发明并不受所采用的微型阀的类型限制。示例性微型阀（例如，来自 MINI-VALVE公司）包括但不限于：鸭嘴阀、伞形阀、蝶形阀、鸭嘴-伞形组合阀、x-fragm阀、 微型阀球（minivalveball)、交叉狭口阀和圆顶阀。
[0052] 本发明并不受提取固定装置的形状、尺寸或组成限制。能够收集（并且保持或传 输到另一个部件）被迫离开纳米阱（从整个芯片或其选定部分）的液体的任何提取固定装 置均可用于本发明。在某些实施方案中，提取固定装置具有配合在纳米阱芯片的至少一部 分上的大体锥形形状（例如，如图1所示）。在其它实施方案中，提取物固定装置是平坦的 或部分平坦的，但具有收集被迫离开纳米阱的液体的能力。在某些实施方案中，提取固定装 置具有允许附接或匹配到纳米阱芯片的附接部件。在特定实施方案中，提取固定装置具有 使流体集中到较小区域中以便可容易地将其移除（例如通过移液管）的部分。在一些实施 方案中，收集固定装置包含选自玻璃、硅、金属或其它合适材料的材料。在另外的实施方案 中，提取固定装置的尺寸是由其所附接的纳米芯片的尺寸和/或芯片-提取固定装置组件 插入的装置的尺寸决定（例如，提取固定装置的尺寸是这样的，以使得所形成的组件可配 合到离心机的臂上）。
[0053] 本发明并不受所采用的芯片的类型限制。一般来说，此类芯片具有多个阱，所述阱 包含或被设定尺寸以包含俘获在这些阱中的液体以使得重力独自不能够使液体从这些阱 中流出（例如，受表面张力抑制的液体处于这些阱中）。美国专利8, 252, 581、7, 833, 709和 7, 547, 556中提供示例性芯片，所有这些专利均通过引用方式以其全部内容（包括例如，其 中所使用的芯片、阱、热循环条件以及相关试剂的教义）并入本文。其它示例性芯片包括在 QUANTSTUDI0 实时 PCR 系统（Applied Biosystems 公司）中所使用的 0PENARRAY 板。
[0054] 本发明的芯片的总尺寸可变化并且其范围可以是例如几微米到几厘米的厚度、以 及几毫米到50厘米的宽度或长度。通常，整个芯片的尺寸范围为约IOmm到约200mm的宽 度和/或长度、以及约Imm到约IOmm的厚度。在一些实施方案中，芯片为约40mm(宽度）x 40mm (长度）X 3mm (厚度）。
[0055] 芯片还可以是例如一组较小芯片。例如，芯片可包括两个到九个较小芯片（例如， 二…六…或九个可寻址单元阵列），其中每个较小芯片之间具有热缓冲器。作为一组较小芯 片的芯片在本文中还被称为板。在这个实例的实施方案中，每个较小芯片对应于整个芯片 中的单元阵列寻址到的不同预先确定温度。
[0056] 芯片上的阱（例如，纳米阱）的总数量可根据将采用本发明的芯片的具体应用而 变化。芯片表面上的阱的密度可根据具体应用而变化。阱的密度以及阱的尺寸和容积可根 据所期望的应用以及诸如将采用本发明的方法的生物体的种类等因素而变化。
[0057] 本发明并不受纳米芯片中的阱的数量限制。大量的阱可结合到芯片中。在各种实 施方案中，芯片上的阱的总数量为约100到约200, 000个、或约5000到约10, 000个。在其 它实施方案中，芯片包括较小芯片，每个较小芯片包括约5, 000到约20, 000个阱。例如，方 形芯片可包括125 X 125个纳米阱，其直径为0.1mm。
[0058] 芯片中的阱（例如，纳米阱）可被制作成任何常规尺寸、形状或容积。所述阱的长 度可为约100 μ m至约1mm，宽度可为约100 μ m至约1mm，并且深度可为约100 μ m至约1mm。 在各种实施方案中，每个纳米阱具有为约1到约4的纵横比（深度与宽度之比）。在一个实 施方案中，每个纳米阱具有为约2的纵横比。横截面面积可为圆形、椭圆形、卵形、锥形、矩 形、三角形、多边形的或任何其它形状。在阱的任何给定深度处的横截面面积也可在尺寸和 形状上发生变化。
[0059] 在某些实施方案中，这些阱具有约0.1 nl到约Iul的容积。纳米阱通常具有小于 lul、优选小于500nl的容积。所述容积可小于200nl或小于100nl。在实施方案中，纳米阱 的容积为约l〇〇nl。当需要时，可将纳米阱制作成增加表面积与容积的比率，从而促进穿过 单元的热传递，这可减少热循环的升温时间。每个阱（例如，纳米阱）的空腔可采取多种配 置。例如，阱内空腔可由线性或弯曲的壁分开以形成单独但相邻的隔室，或由圆形壁分开以 形成内环形和外环形隔室。
[0060] 如果需要，具有高的内表面与容积比率的阱可涂覆有材料以减小其中所包含的反 应物可能与所述阱的内表面相互作用的可能性。如果试剂易于不合期望地与内表面相互作 用或粘附到所述内表面，则涂层是特别有用的。可根据反应物的性质来选择疏水性或亲水 性涂层。多种合适的涂层材料在本领域中是可用的。一些材料可共价地粘附到表面，其它 材料可通过非共价相互作用附接至表面。涂层材料的非限制性实例包括硅烷化试剂，诸如 二甲基氯硅烷、二甲基二氯硅烷、六甲基二硅氮烷或三甲基氯硅烷、聚马来酰亚胺，以及硅 化试剂（诸如氧化硅、AQUASIL和SURFASIL)。另外的合适涂层材料是阻断剂，诸如氨基酸 或聚合物，所述聚合物包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮、聚腺苷酸和聚马来酰亚胺。某些涂层 材料可通过加热、辐射以及通过化学反应交联至表面。本领域的技术人员应当知道用于涂 覆芯片的纳米阱的其它合适装置，或能够探知此类装置，而不需要进行过多的试验。
[0061] 在一些实施方案中，芯片的单独单元包括用于接收并且限制样品的纳米阱，所述 阱在装满样品时被密封。所述阵列中的单独阱可由阻止液体经过的物理屏障彼此分开。阱 顶部可为开放的，但通常与其它阱物理地隔离以限制液体经过。因此，阱具有适于接收并且 限制反应样品的至少一个空腔。为了将一个阱与环境隔离以限制液体经过，可将所述阱密 封。在某些实施方案中，密封纳米阱的方法是将矿物油沉积在所述阱内样品的顶部上以限 制所述样品。所述矿物油可为纳米分配的。可通过任何合适的方法密封阱。
[0062] 在许多应用中，密封阱是合乎期望的，以防止液体蒸发并且因此在整个热循环期 间维持优选的反应浓度。因此，可采用用于密封纳米阱阵列的技术。此类密封可为永久性 的或可移除的。可用的密封技术需考虑若干因素。第一，所述方法通常应能够对大量的阱 进行高生产量处理。第二，所述方法通常应允许对单独的纳米阱进行选择性密封。这样，所 述方法可产生包括以任何所期望图案或格式散布在密封纳米阱之间的开放式阱的芯片。开 放式和/或未填充的阱不仅可允许被动散热，而且还可减少相邻纳米阱之间的热传递。替 代的密 封方法导致阱阵列包含至少一个开放式阱。所述方法可包括以下步骤：(a)沿限定 至少一个开放式阱的开放表面的外围尺寸施加可辐射固化的粘合剂；(b)放置封盖以包围 限定待密封的至少一个开放式阱的开放表面的外围尺寸；以及（c)将所述阵列暴露于辐射 光束以实现密封。
[0063] 示例性芯片可具有约0. 625mm的厚度，其中阱具有约0. 25mm(250um)的长度和宽 度的尺寸。纳米讲深度可为约0. 525mm(525um)，在给定讲下方余下约0.1 mm的芯片。纳米 阱开口可包括任何形状，诸如圆形、方形、矩形或任何其它期望的几何形状。举例来说，纳米 讲可包括在约IOOum与约Imm之间的直径或宽度、在约150um与约Imm之间的间距或长度 以及在约IOum至约Imm之间的深度。每个阱的空腔可采取多种配置。例如，纳米阱内的空 腔可由线性或弯曲的壁分开以形成单独但相邻的隔室。
[0064] 可使用例如通常已知的光刻技术形成芯片的阱（例如，纳米阱）。可使用湿法KOH 蚀刻技术或各向异性干法蚀刻技术形成纳米阱。
[0065] 具有高的内表面与容积比率的阱可涂覆有材料以减小其中所包含的反应物可能 与纳米阱的内表面相互作用的可能性。芯片还可以由电阻加热材料制成。材料的非限制 性实例包括金属板，诸如铝和不锈钢衬底（诸如SS-316)。在所使用的衬底是金属的情况 下，通常优选使表面涂覆有绝缘层以防止衬底在利用流体样品的操作期间发生腐蚀和/或 电解。在非金属加热材料的情况下通常不需要涂层。可使用多种保护性涂层，包括例如由 Si02、Si3N4和Teflon制成的这些涂层。
[0066] 可进一步更改芯片的阱（例如，纳米阱）的表面以形成用于反应试剂的吸附位 点。这些位点可包括用于附接生物或化学化合物的接头部分，所述化合物诸如简单或复杂 的有机或无机分子、肽、蛋白质（例如抗体）或多核苷酸。本领域的技术人员应当理解，存 在形成吸附位点以固定化学反应物或生物反应物的许多方法。例如，大量的技术可用于通 过共价或非共价键将核酸和氨基酸直接固定在芯片上、将它们锚固至接头部分或将它们栓 连至固定部分（参见例如，Methods Mol. Biol.卷 20 (1993)，Beier 等人；Nucleic Acids Res. 27:1970-1-977 (1999)，Joos 等人；Anal. Chem. 247:96-101 (1997)，Guschin 等人； Anal. Biochem. 250:203-211 (1997)，所有文献均以引用方式并入本文）。纳米阱的表面可被 等离子蚀刻以允许探针或引物的固定化。
[0067] 如本文所使用，术语"化学反应"是指涉及物质的化学性质改变的任何过程。这种 过程包括涉及生物分子（诸如蛋白质、糖蛋白、核酸、脂类和无机化学制品，或其组合）的数 目众多的反应。芯片在化学和生物应用中具有广泛多种用途。化学反应可涉及核酸分子之 间、蛋白质之间、核酸与蛋白质之间、蛋白质与小分子之间的相互作用。在所述过程通过酶 催化的情况下，其还被称为"酶促反应"。
[0068] 芯片通常可用于进行酶促反应。可在芯片的阱中完成的典型酶促反应包括但不限 于核酸扩增，诸如定量聚合酶链反应（qPCR)、核酸测序、逆转录和核酸连接反应。在实施方 案中，在芯片上进行的核酸扩增反应是实时聚合酶链反应。在另一个实施方案中，核酸扩增 反应是逆转录偶联聚合酶链反应。
[0069] 如本文所使用，"核酸扩增"是指靶核酸以拷贝数量增加的酶促反应。这种增加可 以线性方式或以指数方式发生。扩增可由自然或重组DNA聚合酶来执行，所述聚合酶例如 像Taq聚合酶、Pfu聚合酶、T7DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段和/或RNA 聚合酶（诸如逆转录酶）。
[0070] -般来说，聚合酶链反应（PCR)的目的在于制造与最初供应的小体积靶DNA或种 子DNA完全相同的大体积DNA。所述反应涉及复制DNA链以及随后在后续循环中使用复制 品生成其它复制品。每个循环将使存在的DNA量近似加倍，从而导致存在于反应混合物中 的靶DNA链复制品的体积成几何级数。美国专利第4, 683, 195号（Mullis)和美国专利第 4, 683, 202号（Mullis等人）中教导PCR的一般进程。简单地说，核酸通过PCR实现的扩 增涉及使DNA热变性、使两个引物退火到在将要扩增的靶核酸片段两侧的序列以及利用聚 合酶使退火的引物延伸的重复循环。引物杂交到相对的靶核酸链上，并且被定向以使得由 聚合酶实现的合成在引物之间的片段上进行，从而有效地使靶片段的量加倍。此外，因为延 伸产物还与引物互补并且能够结合引物，所以每个连续的循环基本上使先前循环中合成的 靶核酸的量加倍。这导致特定靶核酸的指数累积。典型的常规PCR热循环方案包括（a)在 90摄氏度到95摄氏度范围内变性、（b)在50摄氏度到68摄氏度的温度范围内退火和（c) 在68摄氏度到75摄氏度下延伸的30个循环。
[0071] 芯片可用于逆转录PCR反应（RT-PCR)中。RT-PCR是常规PCR的另一种变型，其中 逆转录酶首先将RNA分子转化为双链cDNA分子，所述双链cDNA分子随后被用作聚合酶链 反应中的后续扩增的模板。在执行RT-PCR时，通常在靶核酸热变性之后将逆转录酶添加至 反应样品。随后，在合适的温度（例如，30-45摄氏度）下维持反应持续足够量的时间（例 如，5-60分钟），以便在预定的扩增循环发生之前生成cDNA模板。这种反应对于检测遗传信 息存储在RNA分子中的生物实体特别有用。这类生物实体的非限制性实例包括RNA病毒， 诸如HIV和肝炎引起的病毒。由本发明体现的RT-PCR的另一种重要的应用是基于在测试 样品中检测到的mRNA水平对生物实体的同时定量。
[0072] 核酸"定量"扩增的方法对于本领域的技术人员来说是众所周知的。例如，定量 PCR(qPCR)可涉及使用相同的引物来同时共扩增已知数量的控制序列。这提供可用于校正 PCR反应的内部标准。执行qPCR的其它方式在本领域中是可用的。核酸扩增通常是借助于 扩增试剂来执行。扩增试剂通常包括酶类、水缓冲液、盐类、引物、靶核酸和核苷三磷酸。根 据上下文，扩增试剂可为完全或不完全的扩增反应混合物。
[0073] 芯片的纳米阱中的液体内所包含的试剂取决于将要进行的反应。在实施方案中， 可寻址单元阵列的阱中的至少一个包含用于进行核酸扩增反应的试剂。试剂可为用于免疫 分析、核酸检测分析包括但不限于核酸扩增的试剂。试剂可在芯片的单元中呈干燥状态或 液体状态。在实施方案中，芯片中能够执行核酸扩增反应的阱中的至少一个包含以下中的 至少一个：探针、聚合酶和dNTP。在另一个实施方案中，芯片的纳米阱包含具有探针、引物 和聚合酶的溶液。在各种实施方案中，每个腔室包括（1)用于所述标准基因组内的多核苷 酸靶标的引物，和（2)与所述引物相关联的探针，如果所述引物与所述靶标结合则所述探 针发出浓度相关的信号。在各种实施方案中，每个阱包括用于基因组内的多核苷酸靶标的 引物和与所述引物相关联的探针，如果所述引物与所述靶标结合则所述探针发出浓度相关 的信号。在另一个实施方案中，芯片的至少一个阱包含具有正向PCR引物、逆向PCR引物和 至少一个FAM标记的MGB淬火PCR探针的溶液。在实施方案中，将引物对分配到阱中并且 随后诸如通过冻结使其干燥。使用者随后可选择性地分配（诸如纳米分配）样品、探针和 /或聚合酶。
[0074] 在本发明的其它实施方案中，阱可包含呈干燥形式的上述溶液中的任一种。在这 个实施方案中，可将这种干燥形式涂覆到阱或导向到阱的底部。使用者可在进行分析之前 将水和样品的混合物添加至每个阱。在这个实施方案中，可利用内衬将包含干燥后的反应 混合物的芯片密封、将其存储或运送到另一个位置（例如与本文所述的提取固定装置结 合）。内衬可一体剥离而不会损坏粘合剂的均匀性。内衬明显不同于封盖，以便有助于识别 并且便于操作。选择内衬的材料以使在从粘合剂剥离时的静电生成最小化。当使用者准备 使用芯片时，打破密封并且移除内衬，并且将样品添加至芯片的单元。在许多应用中，密封 纳米阱是合乎期望的，以防止液体蒸发并且因此在整个热循环期间维持优选的反应浓度。
[0075] 芯片可用于基因分型、基因表达或由PCR执行的其它DNA分析。在板中执行的分 析并不限于DNA分析，诸如TAQMAN、TAQMAN GolcUSYBR gold和SYBR green，并且还包括其 它分析，诸如受体结合、酶和其它高通量筛选分析。在一些实施方案中，ROX标记的探针被 用作内部标准。
[0076] 本发明还提供用于使用包含多个预装载的纳米阱的芯片来执行PCR分析的方法， 所述方法包括：将样品放置到纳米阱中以形成反应混合物；利用矿物油或另一种密封机制 来密封芯片的纳米阱；将芯片放置到热循环系统中；使所述系统循环；分析结果；并且将试 剂从纳米阱提取到捕获固定装置中。
[0077] 芯片可由任何合适的衬底组成。衬底常常是良好的热导体。良好的热导体通常具 有高于IWAT 1K'优选高于IOOWAr1K'更优选高于HOWAr1Ir1的热导率值。然而，材料的 热导率可为2501/1^ 1!^或更高，其通常不超过SOOWAr1K'在某些实施方案中，衬底是相 对惰性的和化学上稳定的。此类衬底通常对与预期应用中所采用的反应样品反应表现出低 水平的倾向。在一些实施方案中，所述材料是基于将热控制元件整合到衬底上或与其相邻 的能力或可行性来选择的。示例性材料包括但不限于类金属或半导体，诸如硅、硅酸盐、氮 化硅、二氧化硅、磷化镓、砷化镓或其任何组合。其它材料包括玻璃、陶瓷（包括晶体和非晶 体硅酸盐、以及非硅酸盐基陶瓷）、金属或合金、包含掺杂剂（例如，用于增加热导率的氧化 铝）的复合聚合物、或本领域中可用的塑料和有机聚合物材料范围中的任一种。在一个实 施方案中，在此类衬底（包括Al或SS-316以及类似的其它衬底）中制作纳米阱。
[0078] 在某些实施方案中，使用导热性聚合物来制作芯片。例如，可使用聚碳酸酯、聚丙 烯或本领域的技术人员已知的任何其它传导性聚合物来制作芯片。可通过任何合适的方法 制作芯片。制作芯片的方法的实例包括但不限于微钻、放电方法、热压，并且热压是利用使 用水作为光导而制成的工具完成的。或者，可使用集成电路（IC)和微机电系统（MEMS)产 业中所确立的技术来制作芯片。制作过程通常进行为：选择芯片衬底，然后使用适当的IC 处理方法和/或MEMS微加工技术来构造并整合各种部件。可根据IC处理和/或MEMS微 加工的标准技术来执行芯片制作。芯片可被制作为多层结构。所述过程通常进行来构造底 层。然后，采用包括但不限于光刻、化学气相沉积或物理气相沉积、干法或湿法蚀刻的技术 组合来建立位于其上或嵌入其中的结构。气相沉积例如能够将极薄且均匀的涂层制作到其 它材料上，而蚀刻允许大规模生产较大的芯片结构。其它有用的技术诸如离子注入、等离子 灰化、粘结和电镀也可用于改进芯片的表面性质或整合芯片的各种部件。
[0079] 在某些实施方案中，装置、制品和组件是系统诸如自动化样品处理系统（例如，其 具有中心计算机控制）的一部分。在特定实施方案中，系统提供至少部分的自动化，包括样 品制备、芯片中的反应（例如芯片的纳米阱中的PCR反应）、对反应（例如光学实时扩增子 积聚）的分析、数据分析/存储/显示以及从芯片的纳米阱收集受抑制液体（例如使用本 文所述的提取固定装置）。在特定实施方案中，系统还包括对从纳米阱所收集液体的另外的 操作。
[0080] 本发明还提供减小纳米阱芯片（例如，以阱中预装载有引物对出现的芯片）（诸如 Wafergen公司的 SMARTCHIP)上产生的扩增子的动态范围的方法。某些阱中产生的扩增子 数量与其它阱中产生的扩增子数量的大差异可能形成大的动态范围（某些阱中产生的扩 增子的量对比其它阱中产生的扩增子的量的大差异）。在对扩增子进行测序时，此类大差异 可能形成覆盖深度方面的大误差。阱之间的扩增子产量可能存在差异一个原因涉及PCR反 应中的引物设计和后续效率。对于纳米阱芯片（例如，具有预装载有PCR引物的阱），在受 关注的扩增子内，常常存在在对扩增子进行测序时可导致大范围的测序覆盖的扩增子扩增 范围。这种覆盖上的差异可例如高达50倍或更多。例如，在1000个测序扩增子的情况下， 具有30X至1500X或50倍扩展的测序覆盖范围将不是非典型的。
[0081] 用于减小纳米阱芯片中的覆盖的动态范围以使得针对芯片上给定靶标所产生的 扩增子至少部分地归一化的示例性方法如下。此类方法可单独使用或以任一和所有组合的 方式组合：
[0082] i)在特定实施方案中，如果发现某些阱为特定芯片上的低表达者，那么可将芯片 配置修改成使用更多对于低表达扩增子可用的阱以便相对于其它阱提高总量。例如，如果 覆盖的跨度为30X至1500X，并且30X阱随后一式三份运行，则预期的覆盖范围将为90X至 1500X、或仅17X跨度。
[0083] ii)在另一个实施方案中，高表达的扩增子可多路复用以降低其产量。例如，对于 小数量扩增子（例如两组到四组）的多路复用，与单个管分析相比，引物设计制作的更简单 (其中结合有数以百计的引物），并且有害相互作用的机会更大。
[0084] iii)在一些实施方案中，一种方法是基于针对高扩增子反应的引物滴定和引物稀 释和/或相反地针对低扩增子反应增加引物浓度。
[0085] iv)用于减小扩增子扩增的动态范围的另一种方法涉及使用设计用于富含GC的 靶标的主混合物。某些靶标的一个问题是富含GC的区域通常产生少量的扩增子。例如，主 混合物可包括甜菜碱或允许增加富含GC区域的PCR扩增的其它试剂。
[0086] V)在某些实施方案中，可将以标准引物生成高扩增子水平的靶标切换成对于所述 靶标效率较低的引物，以便减小在PCR期间产生的扩增子水平。
[0087] vi)在特定实施方案中，可更改特定讲的热循环温度以便在给定讲中产生更少量 (或更大量）的扩增子。
[0088] vii)在一些实施方案中，调整阱的深度、宽度和/或整体容积以补偿高或低的扩 增子产量。例如，较深的阱可用于低表达的扩增子，而较浅的阱可用于高表达的扩增子。 [0089] 在某些实施方案中，如以上所提及，采用多路复用来减小高表达的扩增子的浓度。 以下简化实例可用于确定在一组特定引物的情况下这种多路复用是否有用。选择四个引 物，具有对人类基因组DNA大致相当的CT (例如来自BCH的四个引物，"A"、"B"、"C"、"D"）。 这些引物以如下七种配置分配在384阱板或纳米阱芯片的阱中：A、B、C、D、A+B、A+B+C、和 A+B+C+D。所有引物均以标称浓度分配并且进行热循环（例如在LC480上）。随后测量每 个阱中的扩增子的DNA浓度（例如，使用分光光度计）。如果所有阱均具有大致相同的DNA 浓度，则用于减弱高表达分析的多路复用应为有用的。如果根据阱中引物的数量来称取DNA 浓度，则多路复用可能将不会有用。
[0090] 本申请中提及的所有出版物和专利均以引入方式并入本文。在不脱离本发明的范 围和精神的情况下，对本发明的所述方法和组合物的各种修改和变化对于本领域的技术人 员来说将是明显的。虽然已结合特定的优选实施方案描述了本发明，但应当理解，本发明如 所要求保护的那样不应过度地受限于此类具体实施方案。实际上，对用于执行本发明的所 述模式的各种修改（这些修改对于相关领域的技术人员来说是明显的）旨在以下权利要求 书的范围内。
【主权项】
I. 一种从芯片中的至少一个开放式阱移除受抑制液体的方法，所述方法包括： a) 提供包括与芯片相邻的至少一个提取固定装置的组件， i) 其中所述芯片包括衬底和形成于所述衬底中的多个开放式阱，其中所述多个开放式 阱包含受抑制液体，并且 ii) 其中所述至少一个提取固定装置与所述芯片相邻，以使得被迫离开所述多个开放 式阱的任何所述受抑制液体由所述至少一个提取固定装置收集；以及 b) 使所述组件经受力以使得所述受抑制液体的至少一部分成为释放液体，所述释放液 体从所述多个开放式阱中的至少一个流出并且由所述至少一个提取固定装置保持或流过 所述至少一个提取固定装置。 2?如权利要求1所述的方法，其中所述力选自由以下组成的组：向心力、离心力、真空 力和运动突然停止。
3. 如权利要求1所述的方法，其中所述力是由离心机生成。
4. 如权利要求1所述的方法，其中所述至少一个提取固定装置包括提取固定装置基 部，其中所述提取固定装置基部包括被设定尺寸以收集流体的锥形区段。
5. 如权利要求1所述的方法，其中所述至少一个提取固定装置包括提取固定装置基 部，其中所述提取固定装置基部包括：i)被设定尺寸以保持所述芯片的口袋部件；ii)被设 定尺寸以收集流体的锥形区段；以及iii)被设定尺寸以保持垫圈的垫圈轨道。
6. 如权利要求5所述的方法，其中所述至少一个提取固定装置还包括：i)被设定尺寸 以附接至所述提取固定装置基部以便封闭所述芯片的提取固定装置顶板；ii)被配置成配 合在所述芯片与所述提取固定装置顶板之间的纸垫圈；以及iii)被配置成允许通过所述 固定装置顶板分配样品的样品杯。
7. 如权利要求1所述的方法，其中从所述多个开放式阱中的至少一个流出的所述液体 由所述至少一个提取固定装置保持。
8. 如权利要求1所述的方法，其还提供基部保持部件，其中所述基部保持部件被设定 尺寸以保持与所述芯片相邻的所述至少一个提取固定装置。
9. 如权利要求8所述的方法，其还包括安装在所述基部保持部件中的至少一个收集 管，其中从所述多个开放式阱中的至少一个流出的所述液体流过所述至少一个提取固定装 置进入所述至少一个收集管中。
10. 如权利要求1所述的方法，其中所述至少一个提取固定装置附接至所述芯片。 II. 如权利要求1所述的方法，其中所述受抑制液体的至少35%成为所述释放液体并 且从所述多个开放式阱流出并且由所述提取固定装置收集。
12. 如权利要求1所述的方法，其中所述受抑制液体是受表面张力抑制的液体。
13. 如权利要求1所述的方法，其中所述至少一个提取固定装置包括至少两个提取固 定装置。
14. 如权利要求1所述的方法，其中所述至少一个提取固定装置包括至少九个提取固 定装置。
15. 如权利要求1所述的方法，其中所述多个开放式阱中的每一个具有在0. 1纳升与 500纳升之间的容积。
16. 如权利要求1所述的方法，其中所述多个开放式阱中的每一个具有在I. 0纳升与 250纳升之间的容积。
17. 如权利要求1所述的方法，其中所述多个开放式阱包括至少3个开放式阱。
18. 如权利要求1所述的方法，其中所述多个开放式阱包括至少1000个开放式阱。
19. 如权利要求1所述的方法，其中所述受抑制液体包含PCR试剂。
20. 如权利要求1所述的方法，其中所述受抑制液体包含扩增的核酸。
21. 如权利要求1所述的方法，其还包括使所述释放液体经受核酸检测分析的步骤。 22?如权利要求1所述的方法，其中所述芯片具有IOmm至200mm的长度、IOmm至200mm 的宽度和〇? Imm至10厘米的厚度。
23. 如权利要求1所述的方法，其中所述衬底包括选自由以下组成的组的材料：玻璃、 陶瓷、类金属、硅、硅酸盐、氮化硅、二氧化硅、石英、砷化镓、塑料和有机聚合物材料。
24. 如权利要求1所述的方法，其中所述芯片还包括单独控制的加热元件，每个所述加 热元件可操作地连接至开放式阱。
25. 如权利要求1所述的方法，其中所述至少一个提取固定装置通过附接部件附接至 所述芯片或保持与所述芯片相邻，所述附接部件选自由以下组成的组：螺丝、粘合剂、至少 一个夹具和螺栓。
26. -种从芯片中的至少一个开放式阱移除受抑制液体的方法，所述方法包括： 使组件经受力，其中所述组件包括与芯片相邻和/或附接至所述芯片的至少一个提取 固定装置， 其中所述芯片包括衬底和形成于所述衬底中的多个开放式阱， 其中所述多个开放式阱包含受抑制液体，并且 其中所述使所述组件经受力使得所述受抑制液体的至少一部分成为释放液体，所述释 放液体从所述多个开放式阱中的至少一个流出并且由所述至少一个提取固定装置保持或 流过所述至少一个提取固定装置。
27. -种组件，其包括：与芯片相邻和/或附接至所述芯片的至少一个提取固定装置， 其中所述芯片包括衬底和形成于所述衬底中的多个开放式阱，其中所述多个开放式阱 含有液体并且被设定尺寸，以使得不管所述芯片如何取向所述液体的性质均阻止其从所述 开放式阱流出，并且 其中所述至少一个提取固定装置与所述芯片相邻和/或附接至所述芯片，以使得被迫 离开所述多个开放式阱的任何所述液体流过所述至少一个提取固定装置或由所述至少一 个提取固定装置保持。
28. 如权利要求27所述的组件，其中所述至少一个提取固定装置包括提取固定装置基 部，其中所述提取固定装置基部包括被设定尺寸以收集流体的锥形区段。
29. 如权利要求27所述的组件，其中所述至少一个提取固定装置包括提取固定装置基 部，其中所述提取固定装置基部包括：i)被设定尺寸以保持所述芯片的口袋部件；ii)被设 定尺寸以收集流体的锥形区段；以及iii)被设定尺寸以保持垫圈的垫圈轨道。
30. 如权利要求29所述的组件，其中所述至少一个提取固定装置还包括提取固定装置 顶板，所述提取固定装置顶板被设定尺寸以附接至所述提取固定装置基部以便封闭所述芯 片。
31. 如权利要求27所述的组件，其中从所述多个开放式阱中的至少一个流出的所述液 体由所述至少一个提取固定装置保持。
32. 如权利要求27所述的组件，其还提供基部保持部件，其中所述基部保持部件被设 定尺寸以保持与所述芯片相邻的所述至少一个提取固定装置。
33. 如权利要求32所述的组件，其还包括安装在所述基部保持部件中的至少一个收集 管，其中从所述多个开放式阱中的至少一个流出的所述液体流过所述至少一个提取固定装 置进入所述至少一个收集管中。
34. 如权利要求27所述的组件，其中所述至少一个提取固定装置附接至所述芯片。
35. 如权利要求27所述的组件，其中所述至少一个提取固定装置包括至少两个提取固 定装置。
36. 如权利要求27所述的组件，其中所述至少一个提取固定装置包括至少九个提取固 定装置。
37. 如权利要求27所述的组件，其中所述多个开放式阱中的每一个具有在0. 1纳升与 500纳升之间的容积。
38. 如权利要求27所述的组件，其中所述多个开放式阱中的每一个具有在I. 0纳升与 250纳升之间的容积。
39. 如权利要求27所述的组件，其中所述液体的所述性质是表面张力。
40. 如权利要求27所述的组件，其中所述 多个开放式阱包括至少100个开放式阱。
41. 如权利要求27所述的组件，其中所述多个开放式阱包括至少1000个开放式阱。
42. 如权利要求27所述的组件，其中所述受抑制液体包含PCR试剂。
43. 如权利要求27所述的组件，其中所述受抑制液体包含扩增的核酸。 44?如权利要求27所述的组件，其中所述芯片具有IOmm至200mm的长度、IOmm至200mm 的宽度以及〇? Imm至10厘米的厚度。
45. 如权利要求27所述的组件，其中所述衬底包括选自由以下组成的组的材料：玻璃、 陶瓷、类金属、硅、硅酸盐、氮化硅、二氧化硅、石英、砷化镓、塑料和有机聚合物材料。
46. 如权利要求27所述的组件，其中所述芯片还包括单独控制的加热元件，每个所述 加热元件可操作地连接至开放式阱。
47. 如权利要求27所述的组件，其中所述至少一个提取固定装置通过附接部件附接至 所述芯片或保持与所述芯片相邻，所述附接部件选自由以下组成的组：螺丝、粘合剂、至少 一个夹具和螺栓。
48. -种系统，其包括： a) 芯片，其中所述芯片包括衬底和形成于所述衬底中的多个开放式阱，其中所述多个 开放式阱含有受抑制液体，以及 b) 至少一个提取固定装置，所述至少一个提取固定装置被设定尺寸以与所述芯片相邻 和/或附接至所述芯片以便形成组件，并且其中所述至少一个提取固定装置进一步被设定 尺寸，以使得当所述受抑制液体存在于所述多个开放式阱中并且被迫离开所述多个开放式 阱以形成释放液体时，所述释放液体由所述至少一个提取固定装置保持或流过所述至少一 个提取固定装置。
49. 如权利要求48所述的系统，其还包括c)被配置成向所述组件施加力的装置。
50. 如权利要求49所述的系统，其中所述装置包括离心机。
51. 如权利要求48所述的系统，其中所述至少一个提取固定装置包括提取固定装置基 部，其中所述提取固定装置基部包括被设定尺寸以收集流体的锥形区段。
52. 如权利要求48所述的系统，其中所述至少一个提取固定装置包括提取固定装置基 部，其中所述提取固定装置基部包括：i)被设定尺寸以保持所述芯片的口袋部件；ii)被设 定尺寸以收集流体的锥形区段；以及iii)被设定尺寸以保持垫圈的垫圈轨道。
53. 如权利要求52所述的系统，其中所述至少一个提取固定装置还包括：i)被设定尺 寸以附接至所述提取固定装置基部以便封闭所述芯片的提取固定装置顶板；ii)被配置成 配合在所述芯片与所述提取固定装置顶板之间的纸垫圈；以及iii)被配置成允许通过所 述固定装置顶板分配样品的样品杯。
54. 如权利要求52所述的系统，其中从所述多个开放式阱中的至少一个流出的所述液 体由所述至少一个提取固定装置保持。
55. 如权利要求48所述的系统，其还提供基部保持部件，其中所述基部保持部件被设 定尺寸以保持与所述芯片相邻的所述至少一个提取固定装置。
56. 如权利要求55所述的系统，其还包括安装在所述基部保持部件中的至少一个收集 管，其中从所述多个开放式阱中的至少一个流出的所述液体流过所述至少一个提取固定装 置进入所述至少一个收集管中。
57. 如权利要求48所述的系统，其中所述至少一个提取固定装置附接至所述芯片。
58. 如权利要求48所述的系统，其中所述至少一个提取固定装置包括至少两个提取固 定装置。
59. 如权利要求48所述的系统，其中所述至少一个提取固定装置包括至少九个提取固 定装置。
60. 如权利要求48所述的系统，其中所述多个开放式阱中的每一个具有在0. 1纳升与 500纳升之间的容积。
61. 如权利要求48所述的系统，其中所述多个开放式阱中的每一个具有在I. 0纳升与 250纳升之间的容积。
62. 如权利要求48所述的系统，其中所述多个开放式阱包括至少2个开放式阱。
63. 如权利要求48所述的系统，其中所述多个开放式阱包括至少1000个开放式阱。
64. 如权利要求48所述的系统，其中所述受抑制液体是受表面张力抑制的液体。
65. 如权利要求48所述的系统，其中所述芯片具有IOmm至200mm的长度、IOmm至200mm 的宽度以及〇? Imm至10厘米的厚度。
66. 如权利要求48所述的系统，其中所述衬底包括选自由以下组成的组的材料：玻璃、 陶瓷、类金属、硅、硅酸盐、氮化硅、二氧化硅、石英、砷化镓、塑料和有机聚合物材料。
67. 如权利要求48所述的系统，其中所述芯片还包括单独控制的加热元件，每个所述 加热元件可操作地连接至开放式阱。
68. 如权利要求48所述的系统，其中所述至少一个提取固定装置通过附接部件附接至 所述芯片或保持与所述芯片相邻，所述附接部件选自由以下组成的组：螺丝、粘合剂、至少 一个夹具和螺栓。
69. -种制造制品，其包括：提取固定装置，所述提取固定装置被设定尺寸以附接至芯 片和/或保持与所述芯片相邻以便形成组件， 其中所述芯片包括衬底和形成于所述衬底中的多个开放式阱，其中所述多个开放式阱 含有受抑制液体，并且 其中所述提取固定装置进一步被设定尺寸以使得当所述受抑制液体存在于所述多个 开放式阱中并且被迫离开所述多个开放式阱以成为释放液体时，所述释放液体的至少一部 分由所述提取固定装置保持或流过所述提取固定装置。
70. 如权利要求69所述的制品，其中所述至少一个提取固定装置包括提取固定装置基 部，其中所述提取固定装置基部包括被设定尺寸以收集流体的锥形区段。
71. 如权利要求69所述的制品，其中所述至少一个提取固定装置包括提取固定装置基 部，其中所述提取固定装置基部包括：i)被设定尺寸以保持所述芯片的口袋部件；ii)被设 定尺寸以收集流体的锥形区段；iii)被设定尺寸以保持垫圈的垫圈轨道。
72. 如权利要求71所述的制品，其中所述至少一个提取固定装置还包括提取固定装置 顶板，所述提取固定装置顶板被设定尺寸以附接至所述提取固定装置基部以便封闭所述芯 片。
73. 如权利要求71所述的制品，其中从所述多个开放式阱中的至少一个流出的所述液 体由所述至少一个提取固定装置保持。
74. 如权利要求69所述的制品，其还提供基部保持部件，其中所述基部保持部件被设 定尺寸以保持与所述芯片相邻的所述至少一个提取固定装置。
75. 如权利要求74所述的制品，其还包括安装在所述基部保持部件中的至少一个收集 管，其中从所述多个开放式阱中的至少一个流出的所述液体流过所述至少一个提取固定装 置进入所述至少一个收集管中。
76. 如权利要求69所述的制品，其中所述至少一个提取固定装置附接至所述芯片。
77. -种制作组件的方法，其包括： a) 将至少一个提取固定装置附接至芯片和/或使至少一个提取固定装置和芯片接触， 以形成组件， 其中所述芯片包括衬底和形成于所述衬底中的多个开放式阱，其中所述多个开放式阱 含有受抑制液体， 其中所述至少一个提取固定装置附接至所述芯片和/或与所述芯片相邻，以使得被迫 离开所述多个开放式阱以成为释放液体的任何所述受抑制液体由所述至少一个提取固定 装置保持或流过所述至少一个提取固定装置，以及 b) 利用密封部件将所述至少一个提取固定装置密封至所述芯片，以便在所述芯片的至 少一部分与所述至少一个提取固定装置之间形成水密密封。
78. 如权利要求77所述的方法，其中所述密封部件包括O形环。
79. 如权利要求77所述的方法，其中所述密封部件选自由以下组成的组：螺丝、粘合 剂、至少一个夹具和螺栓。
80. -种方法，其包括： a) 提供芯片，其中所述芯片包括衬底和形成于所述衬底中的多个开放式阱，其中所述 多个开放式阱含有受抑制液体，并且其中所述芯片至少部分地由覆盖所述多个开放式阱的 密封膜覆盖； b) 将所述密封膜的至少一部分从所述芯片移除以形成开放区域； C)将提取固定装置附接至所述芯片和/或使得所述提取固定装置与所述芯片相邻，以 使得所述开放区域由所述提取固定装置覆盖以形成组件，其中所述提取固定装置附接至所 述芯片和/或与所述芯片相邻，以使得被迫离开所述多个开放式阱以成为释放液体的任何 所述受抑制液体由所述提取固定装置保持或流过所述提取固定装置；以及 d)利用密封部件将所述至少一个提取固定装置密封至所述芯片，以便在所述芯片的至 少一部分与所述提取固定装置之间形成水密密封。
81. 如权利要求80所述的方法，其还包括步骤e):使所述组件经受力以使得所述受抑 制液体的至少一部分从所述多个开放式阱中的至少一个流出以成为释放液体，所述释放液 体由所述提取固定装置保持。
82. -种用于减小纳米阱芯片上的扩增子产量的动态范围的方法，其包括： i) 识别初始纳米阱芯片中的至少一个阱，所述至少一个阱在扩增期间从特定靶标产生 相对于所述纳米阱芯片中的所有所述阱扩增期间的平均扩增子产量增加或减少的扩增子 产量；以及 ii) 除了至少以下各项之外使用与所述初始纳米阱芯片相同设置的测试纳米阱芯片来 执行扩增： A) 所述测试纳米阱芯片上的另外的阱被用于识别为具有减少的扩增子产量的靶标； B) 发现具有增加的表达的靶标与其它靶标结合以使得在单个阱中发生多重扩增； C) 增大发现具有低扩增子产量的阱中的引物浓度； D) 减小发现具有高扩增子产量的阱中的引物浓度； E) 使抑制剂包含在发现具有高扩增子产量的阱中； F) 切换到发现具有高扩增子产量的阱中的效率较低的引物； G) 如果扩增子产量减少则更改阱中的热循环温度和/或时间以增加扩增子产量，或如 果扩增子产量增加则更改阱中的热循环温度和/或时间以减少扩增子产量；以及 H) 如果扩增子产量减少则更改阱的深度、宽度和/或容积以增加扩增子产量，或如果 扩增子产量增加则更改阱的深度、宽度和/或容积以减少扩增子产量。
【专利摘要】本发明提供用于从芯片中的开放式阱提取受抑制液体(例如，受表面张力抑制的液体)的方法、系统、组件和制品，其中当所述阱保持倒置时所述受抑制液体不会由于重力而从所述阱中流出。例如，本发明提供可附接至芯片和/或保持与所述芯片相邻的提取固定装置，以使得被迫离开所述开放式阱的任何受抑制液体由所述提取固定装置收集或流过所述提取固定装置。另外，例如，本发明提供由附接至芯片和/或保持与所述芯片相邻的提取固定装置组成的组件、以及使此类组件经受力以使得所述开放式阱中的所述受抑制液体的至少一部分被迫离开并且由所述提取固定装置收集或流过所述提取固定装置的方法。
【IPC分类】C12M1/00, B01L3/00
【公开号】CN104884168
【申请号】CN201380058480
【发明人】B·L·格里斯沃尔德, S·A·胡塞恩, R·莫蒂, W·B·唐格, G·康特里, J·邓恩, P·林
【申请人】瓦弗根公司
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2013年11月8日
【公告号】CA2891088A1, EP2916953A2, US20140130885, WO2014074863A2, WO2014074863A3