一种从盐渍萝卜中制备对羟基苯甲醛的方法
一种从盐渍萝卜中制备对羟基苯甲醛的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及活性药物的技术领域，尤其涉及一种从盐渍萝卜中制备对羟基苯甲醛 的方法。
【背景技术】
[0002] 对羟基苯甲醛（4-羟基苯甲醛）广泛分布于自然界中，植物、海洋生物中都存在对 羟基苯甲醛。它们或作为某些植物或食品中的挥发性成分，或是某些海洋生物的代谢物产 物，对一些人体致病菌如金黄色葡萄球菌、白色念珠菌以及其他海洋细菌等都具有很好的 抑菌效果。在现有技术中，在萝卜中还鲜有报道对羟基苯甲醛的存在。
[0003] 有鉴于此，本发明人研宄和设计了一种从盐渍萝卜中制备对羟基苯甲醛的方法， 本案由此产生。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种从盐渍萝卜中制备对羟基苯甲醛的方法，通过在盐渍 萝卜中加入抽提液逐步抽提后，并通过反相硅胶柱及正相硅胶柱的色谱分离，最终制得对 羟基苯甲醛，本发明首次从盐渍萝卜中分离到了对羟基苯甲醛，该成分是盐渍萝卜中抑制 真菌的活性物质。
[0005] 为实现上述目的，本发明解决其技术问题的技术方案是：
[0006] 一种从盐渍萝卜中制备对羟基苯甲醛的方法，包括以下步骤：
[0007] 步骤一、盐渍萝卜干粉的制备：将盐渍萝卜切成薄片，于50°C下烘干，粉碎，过20 目筛，得盐渍萝卜干粉，装于密封袋中，干燥器中保存备用；
[0008] 步骤二、盐渍萝卜粗提物的制备：称取已烘干粉碎的5年盐渍萝卜粉2份，每份 20g，分别置于2个500mL三角瓶中，按料液比1:15分别加入乙酸乙酯和丙酮，封口后置于 摇床中，40°C，150rpm下提取6h，抽滤，收集滤液；再向残渣中加入相应溶剂进行第二次提 取，在同样的条件下提取3h，抽滤，收集滤液，待残渣中溶剂挥干后，再交换溶剂提取1次， 提取条件同第二次提取，合并滤液，40°C减压浓缩至圆底烧瓶中，回收溶剂，分别得乙酸乙 酯和丙酮提取物浸膏，合并乙酸乙酯和丙酮提取物浸膏，得到盐渍萝卜粗提物，4°C贮存备 用；
[0009] 步骤三、盐渍萝卜粗提物的初步分离：将盐渍萝卜粗提物用甲醇溶解后过滤，40°C 减压浓缩后上含170g填料的S印hadex LH-20凝胶柱，用甲醇作为洗脱剂进行洗脱，控制流 速为5~9s/drop，使用自动收集器收集各流份，每60min收集1管，共收集得到128管流 份；合并第48至第63管的流份，再进行减压浓缩，得到组分Yl ;
[0010] 步骤四、组分Yl的分离纯化：组分Yl用适量甲醇溶解后，直接上含170g填料的 Sephadex LH-20凝胶柱，用甲醇作为洗脱剂进行洗脱，经若干次凝胶柱分离，最终收集得到 31管流份，合并第11至第15管流份得310mg样品，将该部分标记为组分1-2 ;
[0011] 步骤五、组分1-2的分离纯化：组分1-2加适量甲醇溶解后，过反相硅胶柱进行分 离，以50% CH3OH进行洗脱，洗脱体积为1L，每200mL收集1个流份，共收集得到5个流份， 45°C减压浓缩除去溶剂后，选择第1个流份用正相硅胶进行分离；将正相硅胶分离后的2mg 样品用IOmg硅胶粉拌样，0. 08g硅胶用石油醚饱和后装柱，样品上柱后，用石油醚进行洗 脱，收集第20至第32管的流份，合并流份后浓缩，蒸干溶剂后，制得对羟基苯甲醛。
[0012] 作为实施例的优选方式，所述步骤五中采用的正相硅胶柱进行分离的步骤为：
[0013] (1)硅胶粉活化
[0014] 取200~300目硅胶粉于试剂瓶中，用扎孔的锡箔纸包好瓶口，置于IKTC烘箱中 活化2~3h，冷却后封好瓶口置于干燥器中，备用；
[0015] ⑵拌样
[0016] 根据样品的量4mg，向干净的圆底烧瓶中硅胶粉20mg，用胶头滴管吸取样品液滴 至圆底烧瓶中的硅胶粉上，迅速搅拌均匀并间歇用电吹风给圆底烧瓶加热以使溶剂快速挥 干，使样品呈均匀粉末状，如此重复，直至样品全部吸附于硅胶粉上，继续加热，使样品中的 溶剂完全挥发，用滤纸封口后置于干燥器中备用；
[0017] ⑶装柱
[0018] 采用湿法装柱，称取0. 2g硅胶用石油醚饱和后装柱；
[0019] ⑷上样
[0020] 采用干法上样，将吸附有样品的硅胶粉装至层析柱中，使其均匀沉降于硅胶层表 面，待样品沉降完全，打开阀门，收集洗脱液；
[0021] (5)样品洗脱
[0022] 梯度洗脱：先用初始洗脱剂对样品进行洗脱，然后逐渐增加洗脱剂的极性，洗脱过 程中用泵加压并用薄层层析TLC追踪，直至目标点被洗脱；
[0023] (6)样品的收集与合并
[0024] 用小试管分部收集样品，将含有目标点的样品管按照出柱顺序合并为几个部分， 减压浓缩后，继续进行薄层层析，根据样品的具体情况继续进行分离或者合并浓缩后4°C贮 减备用。
[0025] 作为实施例的优选方式，所述薄层层析TLC追踪为：将GF254硅胶板于IKTC烘 箱中活化2~3h，待其自然冷却至室温后取出，置于干燥器中备用，用玻璃毛细管吸取适 量样品，点于硅胶板基线上，并在样点下端用铅笔做好标记，硅胶板上基线距板底端距离为 0· 8~lcm，两样点之间的距离不小于0· 8cm，用吹风机吹干溶剂后，置于装有饱和层析液的 层析缸中展开，待溶剂前沿展至距薄层板顶端约Icm时，用镊子取出，吹干溶剂，用紫外分 析仪和其它显色剂进行显色。
[0026] 作为实施例的优选方式，还包括对羟基苯甲醛的结构鉴定：将过正相硅胶柱后制 得的对羟基苯甲醛装入核磁管中，蒸干溶剂，加入氘代试剂，以TMS作为内标，使用400MHz 核磁共振仪测定化合物的核磁谱，测定项目包括1H-NMR、13C-NMR、DEPT 90、DEPT 135^H-1H COSY、HSQC、HMBC ;将样品用含5%甲酸的甲醇溶液溶解后测定质谱，质谱条件：电离源： 电喷雾电离源；干燥气温度：200°C ;干燥气压力：20psi ;雾化气压力：50psi ;雾化室温度 50°C ;针孔电压：5000V ;屏蔽电压：600V ;毛细管电压：80V。
[0027] 本发明采用上述技术方案后，通过在盐渍萝卜中加入抽提液逐步抽提，并通过反 相硅胶柱及正相硅胶柱的色谱分离，最终制得对羟基苯甲醛，本发明从盐渍萝卜中首次分 离到了对羟基苯甲醛，该成分是盐渍萝卜中抑制真菌的活性物质。
【附图说明】
[0028] 图1是本发明Y3的薄层层析结果；其中，展开剂石油醚：乙酸乙酯=5:1，碘显示；
[0029] 图2是本发明Y3的结构图。
【具体实施方式】
[0030] 本发明揭示了一种从盐渍萝卜中制备对羟基苯甲醛的方法，包括以下步骤：
[0031] 步骤一、盐渍萝卜干粉的制备：将盐渍萝卜切成薄片，于50°C下烘干，粉碎，过20 目筛，得盐渍萝卜干粉，装于密封袋中，干燥器中保存备用；
[0032] 步骤二、盐渍萝卜粗提物的制备：称取已烘干粉碎的5年盐渍萝卜粉2份，每份 20g，分别置于2个500mL三角瓶中，按料液比1:15分别加入乙酸乙酯和丙酮，封口后置于 摇床中，40°C，150rpm下提取6h，抽滤，收集滤液；再向残渣中加入相应溶剂进行第二次提 取，在同样的条件下提取3h，抽滤，收集滤液，待残渣中溶剂挥干后，再交换溶剂提取1次， 提取条件同第二次提取，合并滤液，40°C减压浓缩至圆底烧瓶中，回收溶剂，分别得乙酸乙 酯和丙酮提取物浸膏，合并乙酸乙酯和丙酮提取物浸膏，得到盐渍萝卜粗提物，4°C贮存备 用；
[0033] 步骤三、盐渍萝卜粗提物的初步分离：将盐渍萝卜粗提物用甲醇溶解后过滤，40°C 减压浓缩后上含170g填料的S印hadex LH-20凝胶柱，用甲醇作为洗脱剂进行洗脱，控制流 速为5~9s/drop，使用自动收集器收集各流份，每60min收集1管，共收集得到128管流 份；合并第48至第63管的流份，再进行减压浓缩，得到组分Yl ;
[0034] 步骤四、组分Yl的分离纯化：组分Yl用适量甲醇溶解后，直接上含170g填料的 Sephadex LH-20凝胶柱，用甲醇作为洗脱剂进行洗脱，经若干次凝胶柱分离，最终收集得到 31管流份，合并第11至第15管流份得310mg样品，将该部分标记为组分1-2 ;
[0035] 步骤五、组分1-2的分离纯化：组分1-2加适量甲醇溶解后，过反相硅胶柱进行分 离，以50% CH3OH进行洗脱，洗脱体积为1L，每200mL收集1个流份，共收集得到5个流份， 45°C减压浓缩除去溶剂后，选择第1个流份用正相硅胶进行分离；将正相硅胶分离后的2mg 样品用IOmg硅胶粉拌样，0. 08g硅胶用石油醚饱和后装柱，样品上柱后，用石油醚进行洗 脱，收集第20至第32管的流份，合并流份后浓缩，蒸干溶剂后，制得对羟基苯甲醛。
[0036] 作为实施例的优选方式，所述步骤五中采用的正相硅胶柱进行分离的步骤为：
[0037] (1)硅胶粉活化
[0038] 取200~300目硅胶粉于试剂瓶中，用扎孔的锡箔纸包好瓶口，置于IKTC烘箱中 活化2~3h，冷却后封好瓶口置于干燥器中，备用；
[0039] (2)拌样
[0040] 根据样品的量4mg，向干净的圆底烧瓶中硅胶粉2 0mg，用胶头滴管吸取样品液滴 至圆底烧瓶中的硅胶粉上，迅速搅拌均匀并间歇用电吹风给圆底烧瓶加热以使溶剂快速挥 干，使样品呈均匀粉末状，如此重复，直至样品全部吸附于硅胶粉上，继续加热，使样品中的 溶剂完全挥发，用滤纸封口后置于干燥器中备用；
[0041] ⑶装柱
[0042] 采用湿法装柱，称取0. 2g硅胶用石油醚饱和后装柱；
[0043] ⑷上样
[0044] 采用干法上样，将吸附有样品的硅胶粉装至层析柱中，使其均匀沉降于硅胶层表 面，待样品沉降完全，打开阀门，收集洗脱液；
[0045] (5)样品洗脱
[0046] 梯度洗脱：先用初始洗脱剂对样品进行洗脱，然后逐渐增加洗脱剂的极性，洗脱过 程中用泵加压并用薄层层析TLC追踪，结果如图1所示，直至目标点被洗脱；
[0047] (6)样品的收集与合并
[0048] 用小试管分部收集样品，将含有目标点的样品管按照出柱顺序合并为几个部分， 减压浓缩后，继续进行薄层层析，根据样品的具体情况继续进行分离或者合并浓缩后4°C贮 减备用。
[0049] 作为实施例的优选方式，所述薄层层析TLC追踪为：将GF254硅胶板于IKTC烘 箱中活化2~3h，待其自然冷却至室温后取出，置于干燥器中备用，用玻璃毛细管吸取适 量样品，点于硅胶板基线上，并在样点下端用铅笔做好标记，硅胶板上基线距板底端距离为 0· 8~lcm，两样点之间的距离不小于0· 8cm，用吹风机吹干溶剂后，置于装有饱和层析液的 层析缸中展开，待溶剂前沿展至距薄层板顶端约Icm时，用镊子取出，吹干溶剂，用紫外分 析仪和其它显色剂进行显色。
[0050] 作为实施例的优选方式，还包括对羟基苯甲醛的结构鉴定：将过正相硅胶柱后制 得的对羟基苯甲醛装入核磁管中，蒸干溶剂，加入氘代试剂，以TMS作为内标，使用400MHz 核磁共振仪测定化合物的核磁谱，测定项目包括1H-NMR、13C-NMR、DEPT 90、DEPT 135^H-1H COSY、HSQC、HMBC ;将样品用含5%甲酸的甲醇溶液溶解后测定质谱，质谱条件：电离源： 电喷雾电离源；干燥气温度：200°C ;干燥气压力：20psi ;雾化气压力：50psi ;雾化室温度 50°C ;针孔电压：5000V ;屏蔽电压：600V ;毛细管电压：80V。对羟基苯甲醛的核磁谱数据如 表1所示。
[0051] 进行质谱测定后可知化合物Y3的ESI-MS :m/z = 121 [M-1]+，综合Y3的核磁谱数 据以及质谱数据并与文献进行比对，推测化合物为对羟基苯甲醛（分子式为C7H 6O2，分子量 为122. 1)，其结构如图2所示。
[0052] 表1化合物Y3的核磁谱数据
[0053]
[0054] 盐渍萝卜作为闽南地区的一种传统腌制食品，在当地人的日常生活中占据着非常 重要的地位，是闽南人智慧的结晶，是中华民族传统食品文化的传承。目前，盐渍萝卜的食 用价值正在被越来越多的人认可，因此，对盐渍萝卜进行各方面的研宄具有重要的意义和 应用价值。本研宄中主要通过结合凝胶柱层析和硅胶柱层析对盐渍萝卜中的抗菌活性成分 进行了分离，并首次分离出了对羟基苯甲醛，对羟基苯甲醛作为盐渍萝卜的抗真菌成分，对 于盐渍萝卜的二次开发意义重大。
[0055] 本领域的普通技术人员能从本发明公开内容直接导出或联想到的所有变形，均应 认为是本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种从盐渍萝卜中制备对羟基苯甲醛的方法，其特征在于：包括以下步骤： 步骤一、盐渍萝卜干粉的制备：将盐渍萝卜切成薄片，于50°C下烘干，粉碎，过20目筛， 得盐渍萝卜干粉，装于密封袋中，干燥器中保存备用； 步骤二、盐渍萝卜粗提物的制备：称取已烘干粉碎的5年盐渍萝卜粉2份，每份20g，分 别置于2个500mL三角瓶中，按料液比1:15分别加入乙酸乙酯和丙酮，封口后置于摇床中， 40°C，150rpm下提取6h，抽滤，收集滤液；再向残澄中加入相应溶剂进行第二次提取，在同 样的条件下提取3h，抽滤，收集滤液，待残渣中溶剂挥干后，再交换溶剂提取1次，提取条件 同第二次提取，合并滤液，40°C减压浓缩至圆底烧瓶中，回收溶剂，分别得乙酸乙酯和丙酮 提取物浸膏，合并乙酸乙酯和丙酮提取物浸膏，得到盐渍萝卜粗提物，4°C贮存备用； 步骤三、盐渍萝卜粗提物的初步分离：将盐渍萝卜粗提物用甲醇溶解后过滤，40°C减压 浓缩后上含17〇g填料的SephadexLH-20凝胶柱，用甲醇作为洗脱剂进行洗脱，控制流速为 5~9s/drop，使用自动收集器收集各流份，每60min收集1管，共收集得到128管流份；合 并第48至第63管的流份，再进行减压浓缩，得到组分Yl; 步骤四、组分Yl的分离纯化：组分Yl用适量甲醇溶解后，直接上含170g填料的SephadexLH-20凝胶柱，用甲醇作为洗脱剂进行洗脱，经若干次凝胶柱分离，最终收集得到 31管流份，合并第11至第15管流份得310mg样品，将该部分标记为组分1-2 ; 步骤五、组分1-2的分离纯化：组分1-2加适量甲醇溶解后，过反相硅胶柱进行分离，以 50%CH3OH进行洗脱，洗脱体积为1L，每200mL收集1个流份，共收集得到5个流份，45°C减 压浓缩除去溶剂后，选择第1个流份用正相硅胶进行分离；将正相硅胶分离后的2mg样品 用IOmg硅胶粉拌样，0. 08g硅胶用石油醚饱和后装柱，样品上柱后，用石油醚进行洗脱，收 集第20至第32管的流份，合并流份后浓缩，蒸干溶剂后，制得对羟基苯甲醛。2. 如权利要求1所述的一种从盐渍萝卜中制备对羟基苯甲醛的方法，其特征在于：所 述步骤五中采用的正相硅胶柱进行分离的步骤为： (1) 硅胶粉活化 取200~300目硅胶粉于试剂瓶中，用扎孔的锡箔纸包好瓶口，置于IKTC烘箱中活化 2~3h，冷却后封好瓶口置于干燥器中，备用； (2) 拌样 根据样品的量2mg，向干净的圆底烧瓶中硅胶粉10mg，用胶头滴管吸取样品液滴至圆 底烧瓶中的硅胶粉上，迅速搅拌均匀并间歇用电吹风给圆底烧瓶加热以使溶剂快速挥干， 使样品呈均匀粉末状，如此重复，直至样品全部吸附于硅胶粉上，继续加热，使样品中的溶 剂完全挥发，用滤纸封口后置于干燥器中备用； (3) 装柱 采用湿法装柱，称取0. 08g硅胶用石油醚饱和后装柱； (4) 上样 采用干法上样，将吸附有样品的硅胶粉装至层析柱中，使其均匀沉降于硅胶层表面，待 样品沉降完全，打开阀门，收集洗脱液； (5) 样品洗脱 梯度洗脱：先用初始洗脱剂对样品进行洗脱，然后逐渐增加洗脱剂的极性，洗脱过程中 用泵加压并用薄层层析TLC追踪，直至目标点被洗脱； (6)样品的收集与合并 用小试管分部收集样品，将含有目标点的样品管按照出柱顺序合并为几个部分，减压 浓缩后，继续进行薄层层析，根据样品的具体情况继续进行分离或者合并浓缩后4°C贮藏备 用。3. 如权利要求2所述的一种从盐渍萝卜中制备对羟基苯甲醛的方法，其特征在于：所 述薄层层析TLC追踪为：将GF254硅胶板于110°C烘箱中活化2~3h，待其自然冷却至室 温后取出，置于干燥器中备用，用玻璃毛细管吸取适量样品，点于硅胶板基线上，并在样点 下端用铅笔做好标记，硅胶板上基线距板底端距离为〇. 8~lcm，两样点之间的距离不小于 0. 8cm，用吹风机吹干溶剂后，置于装有饱和层析液的层析缸中展开，待溶剂前沿展至距薄 层板顶端约Icm时，用镊子取出，吹干溶剂，用紫外分析仪和其它显色剂进行显色。4. 如权利要求1所述的一种从盐渍萝卜中制备对羟基苯甲醛的方法，其特征在于：还 包括对羟基苯甲醛的结构鉴定：将过正相硅胶柱后制得的对羟基苯甲醛装入核磁管中，蒸 干溶剂，加入氘代试剂，以TMS作为内标，使用400MHz核磁共振仪测定化合物的核磁谱，测 定项目包括1H-NMR、13C-NMR、DEPT90、DEPT1355?-?COSY、HSQC、HMBC;将样品用含 5% 甲酸的甲醇溶液溶解后测定质谱，质谱条件：电离源：电喷雾电离源；干燥气温度：200°C; 干燥气压力：20psi;雾化气压力：50psi;雾化室温度50°C;针孔电压：5000V;屏蔽电压： 600V;毛细管电压：80V。
【专利摘要】本发明公开了一种从盐渍萝卜中制备对羟基苯甲醛的方法，包括以下步骤：步骤一、盐渍萝卜干粉的制备：将盐渍萝卜切成薄片，于50℃下烘干，粉碎，过20目筛，得盐渍萝卜干粉，装于密封袋中，干燥器中保存备用；步骤二、盐渍萝卜粗提物的制备，步骤三、盐渍萝卜粗提物的初步分离；步骤四、组分Y1的分离纯化；步骤五、组分1-2的分离纯化：组分1-2加甲醇溶解后，过反相硅胶柱分离，以50％CH3OH进行洗脱，选择第1个流份用正相硅胶分离；用石油醚进行洗脱，收集第20至第32管的流份，合并流份后浓缩，蒸干溶剂后，制得对羟基苯甲醛。本发明首次从盐渍萝卜分离出了对羟基苯甲醛，对羟基苯甲醛作为盐渍萝卜的抗真菌有效成分，对于盐渍萝卜的二次开发意义重大。
【IPC分类】C07C47/565, C07C45/79, C07C45/78
【公开号】CN104892383
【申请号】CN201510257677
【发明人】李健, 苏文金, 苏国成, 刘静雯, 何明明
【申请人】集美大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月20日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及活性药物的技术领域，尤其涉及一种从盐渍萝卜中制备对羟基苯甲醛 的方法。
【背景技术】
[0002] 对羟基苯甲醛（4-羟基苯甲醛）广泛分布于自然界中，植物、海洋生物中都存在对 羟基苯甲醛。它们或作为某些植物或食品中的挥发性成分，或是某些海洋生物的代谢物产 物，对一些人体致病菌如金黄色葡萄球菌、白色念珠菌以及其他海洋细菌等都具有很好的 抑菌效果。在现有技术中，在萝卜中还鲜有报道对羟基苯甲醛的存在。
[0003] 有鉴于此，本发明人研宄和设计了一种从盐渍萝卜中制备对羟基苯甲醛的方法， 本案由此产生。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种从盐渍萝卜中制备对羟基苯甲醛的方法，通过在盐渍 萝卜中加入抽提液逐步抽提后，并通过反相硅胶柱及正相硅胶柱的色谱分离，最终制得对 羟基苯甲醛，本发明首次从盐渍萝卜中分离到了对羟基苯甲醛，该成分是盐渍萝卜中抑制 真菌的活性物质。
[0005] 为实现上述目的，本发明解决其技术问题的技术方案是：
[0006] 一种从盐渍萝卜中制备对羟基苯甲醛的方法，包括以下步骤：
[0007] 步骤一、盐渍萝卜干粉的制备：将盐渍萝卜切成薄片，于50°C下烘干，粉碎，过20 目筛，得盐渍萝卜干粉，装于密封袋中，干燥器中保存备用；
[0008] 步骤二、盐渍萝卜粗提物的制备：称取已烘干粉碎的5年盐渍萝卜粉2份，每份 20g，分别置于2个500mL三角瓶中，按料液比1:15分别加入乙酸乙酯和丙酮，封口后置于 摇床中，40°C，150rpm下提取6h，抽滤，收集滤液；再向残渣中加入相应溶剂进行第二次提 取，在同样的条件下提取3h，抽滤，收集滤液，待残渣中溶剂挥干后，再交换溶剂提取1次， 提取条件同第二次提取，合并滤液，40°C减压浓缩至圆底烧瓶中，回收溶剂，分别得乙酸乙 酯和丙酮提取物浸膏，合并乙酸乙酯和丙酮提取物浸膏，得到盐渍萝卜粗提物，4°C贮存备 用；
[0009] 步骤三、盐渍萝卜粗提物的初步分离：将盐渍萝卜粗提物用甲醇溶解后过滤，40°C 减压浓缩后上含170g填料的S印hadex LH-20凝胶柱，用甲醇作为洗脱剂进行洗脱，控制流 速为5~9s/drop，使用自动收集器收集各流份，每60min收集1管，共收集得到128管流 份；合并第48至第63管的流份，再进行减压浓缩，得到组分Yl ;
[0010] 步骤四、组分Yl的分离纯化：组分Yl用适量甲醇溶解后，直接上含170g填料的 Sephadex LH-20凝胶柱，用甲醇作为洗脱剂进行洗脱，经若干次凝胶柱分离，最终收集得到 31管流份，合并第11至第15管流份得310mg样品，将该部分标记为组分1-2 ;
[0011] 步骤五、组分1-2的分离纯化：组分1-2加适量甲醇溶解后，过反相硅胶柱进行分 离，以50% CH3OH进行洗脱，洗脱体积为1L，每200mL收集1个流份，共收集得到5个流份， 45°C减压浓缩除去溶剂后，选择第1个流份用正相硅胶进行分离；将正相硅胶分离后的2mg 样品用IOmg硅胶粉拌样，0. 08g硅胶用石油醚饱和后装柱，样品上柱后，用石油醚进行洗 脱，收集第20至第32管的流份，合并流份后浓缩，蒸干溶剂后，制得对羟基苯甲醛。
[0012] 作为实施例的优选方式，所述步骤五中采用的正相硅胶柱进行分离的步骤为：
[0013] (1)硅胶粉活化
[0014] 取200~300目硅胶粉于试剂瓶中，用扎孔的锡箔纸包好瓶口，置于IKTC烘箱中 活化2~3h，冷却后封好瓶口置于干燥器中，备用；
[0015] ⑵拌样
[0016] 根据样品的量4mg，向干净的圆底烧瓶中硅胶粉20mg，用胶头滴管吸取样品液滴 至圆底烧瓶中的硅胶粉上，迅速搅拌均匀并间歇用电吹风给圆底烧瓶加热以使溶剂快速挥 干，使样品呈均匀粉末状，如此重复，直至样品全部吸附于硅胶粉上，继续加热，使样品中的 溶剂完全挥发，用滤纸封口后置于干燥器中备用；
[0017] ⑶装柱
[0018] 采用湿法装柱，称取0. 2g硅胶用石油醚饱和后装柱；
[0019] ⑷上样
[0020] 采用干法上样，将吸附有样品的硅胶粉装至层析柱中，使其均匀沉降于硅胶层表 面，待样品沉降完全，打开阀门，收集洗脱液；
[0021] (5)样品洗脱
[0022] 梯度洗脱：先用初始洗脱剂对样品进行洗脱，然后逐渐增加洗脱剂的极性，洗脱过 程中用泵加压并用薄层层析TLC追踪，直至目标点被洗脱；
[0023] (6)样品的收集与合并
[0024] 用小试管分部收集样品，将含有目标点的样品管按照出柱顺序合并为几个部分， 减压浓缩后，继续进行薄层层析，根据样品的具体情况继续进行分离或者合并浓缩后4°C贮 减备用。
[0025] 作为实施例的优选方式，所述薄层层析TLC追踪为：将GF254硅胶板于IKTC烘 箱中活化2~3h，待其自然冷却至室温后取出，置于干燥器中备用，用玻璃毛细管吸取适 量样品，点于硅胶板基线上，并在样点下端用铅笔做好标记，硅胶板上基线距板底端距离为 0· 8~lcm，两样点之间的距离不小于0· 8cm，用吹风机吹干溶剂后，置于装有饱和层析液的 层析缸中展开，待溶剂前沿展至距薄层板顶端约Icm时，用镊子取出，吹干溶剂，用紫外分 析仪和其它显色剂进行显色。
[0026] 作为实施例的优选方式，还包括对羟基苯甲醛的结构鉴定：将过正相硅胶柱后制 得的对羟基苯甲醛装入核磁管中，蒸干溶剂，加入氘代试剂，以TMS作为内标，使用400MHz 核磁共振仪测定化合物的核磁谱，测定项目包括1H-NMR、13C-NMR、DEPT 90、DEPT 135^H-1H COSY、HSQC、HMBC ;将样品用含5%甲酸的甲醇溶液溶解后测定质谱，质谱条件：电离源： 电喷雾电离源；干燥气温度：200°C ;干燥气压力：20psi ;雾化气压力：50psi ;雾化室温度 50°C ;针孔电压：5000V ;屏蔽电压：600V ;毛细管电压：80V。
[0027] 本发明采用上述技术方案后，通过在盐渍萝卜中加入抽提液逐步抽提，并通过反 相硅胶柱及正相硅胶柱的色谱分离，最终制得对羟基苯甲醛，本发明从盐渍萝卜中首次分 离到了对羟基苯甲醛，该成分是盐渍萝卜中抑制真菌的活性物质。
【附图说明】
[0028] 图1是本发明Y3的薄层层析结果；其中，展开剂石油醚：乙酸乙酯=5:1，碘显示；
[0029] 图2是本发明Y3的结构图。
【具体实施方式】
[0030] 本发明揭示了一种从盐渍萝卜中制备对羟基苯甲醛的方法，包括以下步骤：
[0031] 步骤一、盐渍萝卜干粉的制备：将盐渍萝卜切成薄片，于50°C下烘干，粉碎，过20 目筛，得盐渍萝卜干粉，装于密封袋中，干燥器中保存备用；
[0032] 步骤二、盐渍萝卜粗提物的制备：称取已烘干粉碎的5年盐渍萝卜粉2份，每份 20g，分别置于2个500mL三角瓶中，按料液比1:15分别加入乙酸乙酯和丙酮，封口后置于 摇床中，40°C，150rpm下提取6h，抽滤，收集滤液；再向残渣中加入相应溶剂进行第二次提 取，在同样的条件下提取3h，抽滤，收集滤液，待残渣中溶剂挥干后，再交换溶剂提取1次， 提取条件同第二次提取，合并滤液，40°C减压浓缩至圆底烧瓶中，回收溶剂，分别得乙酸乙 酯和丙酮提取物浸膏，合并乙酸乙酯和丙酮提取物浸膏，得到盐渍萝卜粗提物，4°C贮存备 用；
[0033] 步骤三、盐渍萝卜粗提物的初步分离：将盐渍萝卜粗提物用甲醇溶解后过滤，40°C 减压浓缩后上含170g填料的S印hadex LH-20凝胶柱，用甲醇作为洗脱剂进行洗脱，控制流 速为5~9s/drop，使用自动收集器收集各流份，每60min收集1管，共收集得到128管流 份；合并第48至第63管的流份，再进行减压浓缩，得到组分Yl ;
[0034] 步骤四、组分Yl的分离纯化：组分Yl用适量甲醇溶解后，直接上含170g填料的 Sephadex LH-20凝胶柱，用甲醇作为洗脱剂进行洗脱，经若干次凝胶柱分离，最终收集得到 31管流份，合并第11至第15管流份得310mg样品，将该部分标记为组分1-2 ;
[0035] 步骤五、组分1-2的分离纯化：组分1-2加适量甲醇溶解后，过反相硅胶柱进行分 离，以50% CH3OH进行洗脱，洗脱体积为1L，每200mL收集1个流份，共收集得到5个流份， 45°C减压浓缩除去溶剂后，选择第1个流份用正相硅胶进行分离；将正相硅胶分离后的2mg 样品用IOmg硅胶粉拌样，0. 08g硅胶用石油醚饱和后装柱，样品上柱后，用石油醚进行洗 脱，收集第20至第32管的流份，合并流份后浓缩，蒸干溶剂后，制得对羟基苯甲醛。
[0036] 作为实施例的优选方式，所述步骤五中采用的正相硅胶柱进行分离的步骤为：
[0037] (1)硅胶粉活化
[0038] 取200~300目硅胶粉于试剂瓶中，用扎孔的锡箔纸包好瓶口，置于IKTC烘箱中 活化2~3h，冷却后封好瓶口置于干燥器中，备用；
[0039] (2)拌样
[0040] 根据样品的量4mg，向干净的圆底烧瓶中硅胶粉2 0mg，用胶头滴管吸取样品液滴 至圆底烧瓶中的硅胶粉上，迅速搅拌均匀并间歇用电吹风给圆底烧瓶加热以使溶剂快速挥 干，使样品呈均匀粉末状，如此重复，直至样品全部吸附于硅胶粉上，继续加热，使样品中的 溶剂完全挥发，用滤纸封口后置于干燥器中备用；
[0041] ⑶装柱
[0042] 采用湿法装柱，称取0. 2g硅胶用石油醚饱和后装柱；
[0043] ⑷上样
[0044] 采用干法上样，将吸附有样品的硅胶粉装至层析柱中，使其均匀沉降于硅胶层表 面，待样品沉降完全，打开阀门，收集洗脱液；
[0045] (5)样品洗脱
[0046] 梯度洗脱：先用初始洗脱剂对样品进行洗脱，然后逐渐增加洗脱剂的极性，洗脱过 程中用泵加压并用薄层层析TLC追踪，结果如图1所示，直至目标点被洗脱；
[0047] (6)样品的收集与合并
[0048] 用小试管分部收集样品，将含有目标点的样品管按照出柱顺序合并为几个部分， 减压浓缩后，继续进行薄层层析，根据样品的具体情况继续进行分离或者合并浓缩后4°C贮 减备用。
[0049] 作为实施例的优选方式，所述薄层层析TLC追踪为：将GF254硅胶板于IKTC烘 箱中活化2~3h，待其自然冷却至室温后取出，置于干燥器中备用，用玻璃毛细管吸取适 量样品，点于硅胶板基线上，并在样点下端用铅笔做好标记，硅胶板上基线距板底端距离为 0· 8~lcm，两样点之间的距离不小于0· 8cm，用吹风机吹干溶剂后，置于装有饱和层析液的 层析缸中展开，待溶剂前沿展至距薄层板顶端约Icm时，用镊子取出，吹干溶剂，用紫外分 析仪和其它显色剂进行显色。
[0050] 作为实施例的优选方式，还包括对羟基苯甲醛的结构鉴定：将过正相硅胶柱后制 得的对羟基苯甲醛装入核磁管中，蒸干溶剂，加入氘代试剂，以TMS作为内标，使用400MHz 核磁共振仪测定化合物的核磁谱，测定项目包括1H-NMR、13C-NMR、DEPT 90、DEPT 135^H-1H COSY、HSQC、HMBC ;将样品用含5%甲酸的甲醇溶液溶解后测定质谱，质谱条件：电离源： 电喷雾电离源；干燥气温度：200°C ;干燥气压力：20psi ;雾化气压力：50psi ;雾化室温度 50°C ;针孔电压：5000V ;屏蔽电压：600V ;毛细管电压：80V。对羟基苯甲醛的核磁谱数据如 表1所示。
[0051] 进行质谱测定后可知化合物Y3的ESI-MS :m/z = 121 [M-1]+，综合Y3的核磁谱数 据以及质谱数据并与文献进行比对，推测化合物为对羟基苯甲醛（分子式为C7H 6O2，分子量 为122. 1)，其结构如图2所示。
[0052] 表1化合物Y3的核磁谱数据
[0053]
[0054] 盐渍萝卜作为闽南地区的一种传统腌制食品，在当地人的日常生活中占据着非常 重要的地位，是闽南人智慧的结晶，是中华民族传统食品文化的传承。目前，盐渍萝卜的食 用价值正在被越来越多的人认可，因此，对盐渍萝卜进行各方面的研宄具有重要的意义和 应用价值。本研宄中主要通过结合凝胶柱层析和硅胶柱层析对盐渍萝卜中的抗菌活性成分 进行了分离，并首次分离出了对羟基苯甲醛，对羟基苯甲醛作为盐渍萝卜的抗真菌成分，对 于盐渍萝卜的二次开发意义重大。
[0055] 本领域的普通技术人员能从本发明公开内容直接导出或联想到的所有变形，均应 认为是本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种从盐渍萝卜中制备对羟基苯甲醛的方法，其特征在于：包括以下步骤： 步骤一、盐渍萝卜干粉的制备：将盐渍萝卜切成薄片，于50°C下烘干，粉碎，过20目筛， 得盐渍萝卜干粉，装于密封袋中，干燥器中保存备用； 步骤二、盐渍萝卜粗提物的制备：称取已烘干粉碎的5年盐渍萝卜粉2份，每份20g，分 别置于2个500mL三角瓶中，按料液比1:15分别加入乙酸乙酯和丙酮，封口后置于摇床中， 40°C，150rpm下提取6h，抽滤，收集滤液；再向残澄中加入相应溶剂进行第二次提取，在同 样的条件下提取3h，抽滤，收集滤液，待残渣中溶剂挥干后，再交换溶剂提取1次，提取条件 同第二次提取，合并滤液，40°C减压浓缩至圆底烧瓶中，回收溶剂，分别得乙酸乙酯和丙酮 提取物浸膏，合并乙酸乙酯和丙酮提取物浸膏，得到盐渍萝卜粗提物，4°C贮存备用； 步骤三、盐渍萝卜粗提物的初步分离：将盐渍萝卜粗提物用甲醇溶解后过滤，40°C减压 浓缩后上含17〇g填料的SephadexLH-20凝胶柱，用甲醇作为洗脱剂进行洗脱，控制流速为 5~9s/drop，使用自动收集器收集各流份，每60min收集1管，共收集得到128管流份；合 并第48至第63管的流份，再进行减压浓缩，得到组分Yl; 步骤四、组分Yl的分离纯化：组分Yl用适量甲醇溶解后，直接上含170g填料的SephadexLH-20凝胶柱，用甲醇作为洗脱剂进行洗脱，经若干次凝胶柱分离，最终收集得到 31管流份，合并第11至第15管流份得310mg样品，将该部分标记为组分1-2 ; 步骤五、组分1-2的分离纯化：组分1-2加适量甲醇溶解后，过反相硅胶柱进行分离，以 50%CH3OH进行洗脱，洗脱体积为1L，每200mL收集1个流份，共收集得到5个流份，45°C减 压浓缩除去溶剂后，选择第1个流份用正相硅胶进行分离；将正相硅胶分离后的2mg样品 用IOmg硅胶粉拌样，0. 08g硅胶用石油醚饱和后装柱，样品上柱后，用石油醚进行洗脱，收 集第20至第32管的流份，合并流份后浓缩，蒸干溶剂后，制得对羟基苯甲醛。2. 如权利要求1所述的一种从盐渍萝卜中制备对羟基苯甲醛的方法，其特征在于：所 述步骤五中采用的正相硅胶柱进行分离的步骤为： (1) 硅胶粉活化 取200~300目硅胶粉于试剂瓶中，用扎孔的锡箔纸包好瓶口，置于IKTC烘箱中活化 2~3h，冷却后封好瓶口置于干燥器中，备用； (2) 拌样 根据样品的量2mg，向干净的圆底烧瓶中硅胶粉10mg，用胶头滴管吸取样品液滴至圆 底烧瓶中的硅胶粉上，迅速搅拌均匀并间歇用电吹风给圆底烧瓶加热以使溶剂快速挥干， 使样品呈均匀粉末状，如此重复，直至样品全部吸附于硅胶粉上，继续加热，使样品中的溶 剂完全挥发，用滤纸封口后置于干燥器中备用； (3) 装柱 采用湿法装柱，称取0. 08g硅胶用石油醚饱和后装柱； (4) 上样 采用干法上样，将吸附有样品的硅胶粉装至层析柱中，使其均匀沉降于硅胶层表面，待 样品沉降完全，打开阀门，收集洗脱液； (5) 样品洗脱 梯度洗脱：先用初始洗脱剂对样品进行洗脱，然后逐渐增加洗脱剂的极性，洗脱过程中 用泵加压并用薄层层析TLC追踪，直至目标点被洗脱； (6)样品的收集与合并 用小试管分部收集样品，将含有目标点的样品管按照出柱顺序合并为几个部分，减压 浓缩后，继续进行薄层层析，根据样品的具体情况继续进行分离或者合并浓缩后4°C贮藏备 用。3. 如权利要求2所述的一种从盐渍萝卜中制备对羟基苯甲醛的方法，其特征在于：所 述薄层层析TLC追踪为：将GF254硅胶板于110°C烘箱中活化2~3h，待其自然冷却至室 温后取出，置于干燥器中备用，用玻璃毛细管吸取适量样品，点于硅胶板基线上，并在样点 下端用铅笔做好标记，硅胶板上基线距板底端距离为〇. 8~lcm，两样点之间的距离不小于 0. 8cm，用吹风机吹干溶剂后，置于装有饱和层析液的层析缸中展开，待溶剂前沿展至距薄 层板顶端约Icm时，用镊子取出，吹干溶剂，用紫外分析仪和其它显色剂进行显色。4. 如权利要求1所述的一种从盐渍萝卜中制备对羟基苯甲醛的方法，其特征在于：还 包括对羟基苯甲醛的结构鉴定：将过正相硅胶柱后制得的对羟基苯甲醛装入核磁管中，蒸 干溶剂，加入氘代试剂，以TMS作为内标，使用400MHz核磁共振仪测定化合物的核磁谱，测 定项目包括1H-NMR、13C-NMR、DEPT90、DEPT1355?-?COSY、HSQC、HMBC;将样品用含 5% 甲酸的甲醇溶液溶解后测定质谱，质谱条件：电离源：电喷雾电离源；干燥气温度：200°C; 干燥气压力：20psi;雾化气压力：50psi;雾化室温度50°C;针孔电压：5000V;屏蔽电压： 600V;毛细管电压：80V。
【专利摘要】本发明公开了一种从盐渍萝卜中制备对羟基苯甲醛的方法，包括以下步骤：步骤一、盐渍萝卜干粉的制备：将盐渍萝卜切成薄片，于50℃下烘干，粉碎，过20目筛，得盐渍萝卜干粉，装于密封袋中，干燥器中保存备用；步骤二、盐渍萝卜粗提物的制备，步骤三、盐渍萝卜粗提物的初步分离；步骤四、组分Y1的分离纯化；步骤五、组分1-2的分离纯化：组分1-2加甲醇溶解后，过反相硅胶柱分离，以50％CH3OH进行洗脱，选择第1个流份用正相硅胶分离；用石油醚进行洗脱，收集第20至第32管的流份，合并流份后浓缩，蒸干溶剂后，制得对羟基苯甲醛。本发明首次从盐渍萝卜分离出了对羟基苯甲醛，对羟基苯甲醛作为盐渍萝卜的抗真菌有效成分，对于盐渍萝卜的二次开发意义重大。
【IPC分类】C07C47/565, C07C45/79, C07C45/78
【公开号】CN104892383
【申请号】CN201510257677
【发明人】李健, 苏文金, 苏国成, 刘静雯, 何明明
【申请人】集美大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月20日
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