一种拉科酰胺类似物的分离方法
一种拉科酰胺类似物的分离方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种拉科酰胺类似物的分离方法。
【背景技术】
[0002]
[0003] 拉科酰胺，一种新型N-甲基-D-天门冬氨酸（NMDA)受体甘氨酸位点拮抗剂，它可 选择性促进钠通道缓慢失活并调节塌陷反应介导蛋白22 (CRMP22)，属于新一类功能性氨基 酸，具有全新双重机制作用的抗癫痫药物。在中国癫痫已经成为神经科仅次于头痛的第二 大常见病，我国对抗癫痫药物有着巨大需求，而拉科酰胺的作用机制不同于已上市的其他 抗癫痫药，对现有药物无法控制症状的患者有较好的疗效，因此拉科酰胺的临床用量需求 较大，市场前景好，其原料药与制剂的开发都具有重要意义。
[0004]
[0005] 目前在文献中报道过的拉科酰胺合成方法多以中间体式III通过脱保护再上乙 酰基得到拉科酰胺，如原研公司的专利CN101928230A、浙江九洲药业股份有限公司的专利 CN102020589A 以及中国专利 CN103319366A。
[0006] 众所周知，为了确保药品安全，须对药物质量进行严格控制，药物含量测定、未知 杂质的结构鉴定和杂质限量是药物质量控制的有效方法，杂质分析是药物质量标准的重要 内容。目前，国内外尚未见拉科酰胺类似物的报道。
[0007] 因此，本领域亟需对拉科酰胺类似物进行分离、鉴定并合成。
【发明内容】
[0008] 本发明所要解决的问题是为了克服现有技术中缺乏拉科酰胺在合成过程中产生 的类似物的分离、鉴定并合成等缺陷，而提供了一种拉科酰胺类似物的分离方法。本发明的 拉科酰胺类似物是对拉科酰胺进行质量控制的必需品；本发明的分离方法可以高效地分离 得到上述的类似物。
[0009] 发明人在研发过程中发现，中间体式III的合成过程中会产生杂质，对终产品拉 科酰胺的质量和收率的影响很大。如果反应条件不当，生成杂质过多，就会在后面步骤中被 衍生化产生更多更复杂的杂质，会严重影响拉科酰胺的药物质量和最终收率，因此，中间体 式III的质量控制至关重要。我方将其分离鉴定，发现其结构如式I所示。
[0010] 本发明提供了一种如式I所示的拉科酰胺类似物的分离方法，其包括下列步骤：
[0011]
[0012] (a)将拉科酰胺类似物的反应母液进行水洗、酸洗再水洗；
[0013] (b)减压浓缩蒸除有机溶剂，得到油状物；
[0014] (C)将所述的油状物进行正相柱层析或高效液相制备色谱，得到式I化合物即可；
[0015] 所述的拉科酰胺类似物的反应母液的制备方法，包括下述步骤：在有机溶剂和水 的两相溶剂中，在碱和相转移催化剂的存在下，将式II化合物与甲基化试剂进行取代反 应，得到即可；
[0016]
[0017] 在所述的分离方法中，所述的酸可为本领域后处理中常规的酸，较佳地为经水稀 释后的酸，更佳地为质量分数为5%的磷酸水溶液。
[0018] 在所述的分离方法中，所述的正相柱层析的条件较佳地为：流动相为正己烷或石 油醚，与乙酸乙酯的混合液，进行洗脱。
[0019] 在所述的分离方法中，所述的正相柱层析的色谱柱的内径较佳地为30_ ;所述的 正相柱层析的色谱柱的长度较佳地为400mm。
[0020] 在所述的分离方法中，所述的正相柱层析的填料较佳地为硅胶；所述的硅胶较佳 地为100目~200目的硅胶。
[0021] 在所述的分离方法中，所述的正相柱层析的流动相中，较佳地，当所述的流动相为 正己烷和乙酸乙酯时，正己烷和乙酸乙酯的体积比为2~5(例如3);当所述的流动相为石 油醚和乙酸乙酯时，石油醚和乙酸乙酯的体积比为2~4(例如2. 5)。
[0022] 在所述的分离方法中，所述的正相柱层析的洗脱体积较佳地为5~10个柱体积， 例如7或8个柱体积。
[0023] 在所述的分离方法中，较佳地，所述的正相柱层析的洗脱液经蒸馏除去溶剂，得到 式I化合物。
[0024] 在所述的分离方法中，所述的高效液相制备色谱的条件较佳地为：流动相A为乙 腈或甲醇，流动相B为水，进行梯度洗脱。
[0025] 在所述的分离方法中，所述的高效液相制备色谱的色谱柱较佳地为Varian L&L4002 ;所述的高效液相制备色谱的色谱柱的内径较佳地为50mm ;所述的高效液相制备 色谱的色谱柱的长度较佳地为200mm。
[0026] 在所述的分离方法中，所述的高效液相制备色谱的填料较佳地为PLRP-S ;所述的 高效液相制备色谱的填料的粒径较佳地为10 μ m，孔径较佳地为10nm。
[0027] 在所述的分离方法中，所述的梯度洗脱较佳地为0 - 15min，A:B = 30:70 ; 15 - 55111丨11，4:8 = 30:70 - 80:20;55 - 65111丨11，4:8 = 90:10，进行线性梯度洗脱。
[0028] 在所述的分离方法中，所述的高效液相制备色谱的流速较佳地为100mL/min。
[0029] 在所述的分离方法中，所述的高效液相制备色谱的检测波长较佳地为210nm。
[0030] 在所述的分离方法中，所述的高效液相制备色谱的温度较佳地为25°C~35°C。
[0031 ] 在所述的分离方法中，所述的高效液相制备色谱的洗脱液较佳地经蒸馏除去溶 剂，得到式I化合物。
[0032] 在所述的拉科酰胺类似物的反应母液的制备方法中，所述的有机溶剂可为本领域 该类反应常规的有机溶剂，较佳地为甲苯或二氯甲烷，更佳地为甲苯。
[0033] 在所述的拉科酰胺类似物的反应母液的制备方法中，所述的有机溶剂与式II化 合物的体积摩尔比可为本领域该类反应常规的体积摩尔比，较佳地为4L/mol~5L/mol，例 如 4. 8L/mol。
[0034] 在所述的拉科酰胺类似物的反应母液的制备方法中，所述的水与式II化合物的 体积摩尔比可为本领域该类反应常规的体积摩尔比，较佳地为〇. lL/mol~0. 5L/mol，更佳 地为 0· 17L/mol ~0· 28L/mol，例如 0· 24L/mol。
[0035] 在所述的拉科酰胺类似物的反应母液的制备方法中，所述的有机溶剂与所述的水 的体积比可为本领域该类反应常规的体积比，较佳地为17~28,例如20。
[0036] 在所述的拉科酰胺类似物的反应母液的制备方法中，所述的碱可为本领域该类反 应常规的碱，较佳地为无机碱，更佳地为氢氧化钠和/或氢氧化钾。
[0037] 在所述的拉科酰胺类似物的反应母液的制备方法中，所述的碱与式II化合物的 摩尔比可为本领域该类反应常规的摩尔比，较佳地为3~5,例如4. 2。
[0038] 在所述的拉科酰胺类似物的反应母液的制备方法中，所述的相转移催化剂可为本 领域该类反应常规的相转移催化剂，较佳地为季铵盐相转移催化剂，更佳地为四丁基溴化 铵。
[0039] 在所述的拉科酰胺类似物的反应母液的制备方法中，所述的相转移催化剂与式II 化合物的摩尔比可为本领域该类反应常规的摩尔比，较佳地为0. 1~0. 15,例如0. 12。
[0040] 在所述的拉科酰胺类似物的反应母液的制备方法中，所述的甲基化试剂可为本领 域该类反应常规的甲基化试剂，较佳地为碘甲烷、硫酸二甲酯和对甲苯磺酸甲酯中的一种 或多种，更佳地为硫酸二甲酯。
[0041] 在所述的拉科酰胺类似物的反应母液的制备方法中，所述的甲基化试剂与式II 化合物的摩尔比可为本领域该类反应常规的摩尔比，较佳地为3~5,例如4。
[0042] 在所述的拉科酰胺类似物的反应母液的制备方法中，所述的取代反应的温度可为 本领域该类反应常规的温度；较佳地为〇°C~50°C，更佳地为25°C~35°C。温度超过45°C 时会导致Boc-保护基的脱除，从而收率下降。
[0043] 在所述的拉科酰胺类似物的反应母液的制备方法中，所述的取代反应的时间较佳 地为3h~100h，例如21h、40h、96h。在3h~IOOh范围内，反应时间越长，收率越高。
[0044] 本发明还提供了上述如式I所示的拉科酰胺类似物作为标准品在下述由式II化 合物制备式ΠΙ化合物的反应中的终点控制的应用，
[0045]
〇
[0046] 本发明中，取代基Boc-为本领域常规所知的叔丁氧羰基。
[0047] 其中，所述的应用较佳地包括下述步骤：将如式I所示的拉科酰胺类似物标准品 溶液和所述反应的反应液分别进行高效液相色谱检测，根据如式I所示的拉科酰胺类似物 标准品色谱图的保留时间确定反应液中相关物质的峰，并根据峰面积计算反应液中式I化 合物的含量，从而最终实现反应终点的控制。
[0048] 其中，所述的高效液相色谱的条件优选如下：流动相A为0. 005~0. 02mol/L磷酸 二氢钾溶液，pH值为2. 8~3. 2,流动相B为乙腈，以流动相A :流动相B按体积比为（55~ 65) : (45~35)进行洗脱，柱温为20~30°C，检测波长为210nm，流速为I. 0~2. OmL/min， 进样量15~25 μ L，如式I所示的拉科酰胺类似物 标准品溶液的浓度为0. 2~0. 4mg/mL。
[0049] 其中，所述的高效液相色谱的条件更优选如下：流动相A为O.Olmol/L磷酸二氢钾 溶液，pH值为3. 0,流动相B为乙腈，以流动相A :流动相B按体积比为60 :40进行洗脱，柱 温为25°C，检测波长为210nm，流速为1.0 mL/min，进样量20 μ L，如式I所示的拉科酰胺类 似物标准品溶液的浓度为〇. 3mg/mL。
[0050] 其中，所述的如式I所示的拉科酰胺类似物标准品溶液较佳地为如式I所示的拉 科酰胺类似物与乙腈混合所形成的溶液。
[0051] 其中，所述的高效液相色谱的色谱柱较佳地为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，其 型号为 Agilent XDB-C18, 250*4. 6mm，5 μ m。
[0052] 其中，在由式II化合物制备式III化合物的反应中，其反应步骤优选如下：在有机 溶剂和水的两相溶剂中，在碱和相转移催化剂的存在下，将式II化合物与甲基化试剂进行 取代反应，即可。
[0053] 所述的甲基化试剂较佳地为对甲苯磺酸甲酯。
[0054] 所述的式II化合物与所述的甲基化试剂的摩尔比较佳地为1 : (3~5)，更佳地为 1:4〇
[0055] 所述的有机溶剂较佳地为甲苯。
[0056] 所述的反应的温度较佳地为10~30°C。
[0057] 所述的相转移催化剂较佳地为四丁基溴化铵。
[0058] 所述的碱较佳地为无机碱，更佳地为氢氧化钠和/或氢氧化钾。
[0059] 在所述的反应中，反应终点的控制优选通过如下方法进行：当检测式I化合物的 含量大于5%时，应立即终止反应，表明反应液中式I化合物的含量较高，反应效果不佳；当 检测式I化合物的含量小于〇. 5%时，不终止反应，否则会导致式III化合物的产率较低，反 应效果不佳；当检测式I化合物的含量大于等于〇. 5%且小于等于5%时，即可终止反应，反 应效果较好；百分比是指质量百分比。
[0060] 本发明还提供了上述如式I所示的拉科酰胺类似物作为标准品在检测拉科酰胺 原料药中式I化合物含量的应用。
[0061] 其中，所述的应用较佳地包括下述步骤：将如式I所示的拉科酰胺类似物标准品 溶液和拉科酰胺原料药溶液分别进行高效液相色谱检测，根据如式I所示的拉科酰胺类似 物标准品色谱图的保留时间确定拉科酰胺原料药溶液中相关物质的峰，并根据峰面积计算 拉科酰胺原料药溶液中式I化合物的含量，从而最终实现拉科酰胺原料药的质量控制。
[0062] 其中，所述的高效液相色谱的条件优选如下：流动相A为乙腈：甲醇：0.01mol/L 磷酸二氢铵按体积比为20:5:75的混合溶液，pH值为7. 0,流动相B为乙腈：甲醇按体积比 为（70~90) : (10~30)的混合溶液，柱温为10~30°C，检测波长为210nm，流速为I. 0~ 2. OmL/min，进样量15~25 μ L，如式I所示的拉科酰胺类似物标准品溶液的浓度为0. 2~ 0. 4mg/mL，拉科酰胺原料药溶液的浓度为0. 2~0. 4mg/mL。
[0063] 其中，所述的高效液相色谱的条件更优选如下：流动相A为乙腈：甲醇：0.0 lmol/L 磷酸二氢铵按体积比为20:5:75的混合溶液，pH值为7. 0,流动相B为乙腈：甲醇按体积比 为80:20的混合溶液，柱温为25°C，检测波长为210nm，流速为1.0 mL/min，进样量20 μ L，如 式I所示的拉科酰胺类似物标准品溶液的浓度为0. 3mg/mL，拉科酰胺原料药溶液的浓度为 0· 3mg/mL〇
[0064] 其中，所述的高效液相色谱的洗脱较佳地按照如下条件进行梯度洗脱，百分比为 体积百分比：
[0065] Omin :100% 流动相 A+0% 流动相 B - 5min :100% 流动相 A+0% 流动相 B - 15min : 75%流动相八+25%流动相13 - 2〇111；[11:75%流动相4+25%流动相13 - 21111；[11:100%流动相 A+0%流动相B - 25min :100%流动相A+0%流动相B。
[0066] 其中，所述的高效液相色谱检测的方法优选如下：记录色谱图至主成分峰保留时 间的3倍；控制拉科酰胺原料药中式I化合物单个最大杂质峰面积不得大于式I化合物 标准品溶液峰面积的〇. 1%，总杂质峰面积之和不得大于式I化合物标准品溶液峰面积的 1. 0%〇
[0067] 其中，所述的如式I所示的拉科酰胺类似物标准品溶液较佳地为如式I所示的拉 科酰胺类似物与流动相B混合所形成的溶液。
[0068] 其中，所述的拉科酰胺原料药溶液较佳地为拉科酰胺原料药与流动相B混合所形 成的溶液。
[0069] 其中，所述的高效液相色谱的色谱柱较佳地为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，其 型号为 Agilent XDB-C18, 250*4. 6mm，5 μ m。
[0070] 在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳 实例。
[0071] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0072] 本发明中所述的室温为25°C~35°C。
[0073] 本发明的积极进步效果在于：本发明的如式I所示的拉科酰胺类似物是对拉科酰 胺进行质量控制的必需品；本发明的分离方法可以高效地分离得到上述的类似物。
【附图说明】
[0074] 图1为拉科酰胺类似物I的MS图；
[0075] 图2为拉科酰胺类似物I的1HNMR图；
[0076] 图3为拉科酰胺类似物I的13CNMR图；
[0077] 图4为拉科酰胺类似物I的HMBC图；
[0078] 图5为拉科酰胺类似物I的HPLC图。
【具体实施方式】
[0079] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商 品说明书选择。
[0080] 需要说明的是，由于HPLC检测时忽略了对甲苯磺酸甲酯、甲苯等原料、溶剂，因 此，实施例中油状物的HPLC检测纯度并非式I化合物在油状物中的含量，而是式I化合物 在忽略了对甲苯磺酸甲酯、甲苯等之后的油状物中的含量。
[0081] 实施例1拉科酰胺类似物式III的合成
[0082] 在IL反应瓶中依次加入甲苯（330mL)、化合物式II (20. 00g，68mmol)，对-甲苯磺 酸甲醋（38. 10g，204mmol)、四丁基溴化按（2. 63g，8. 16mmol)，搅拌均勾，室温下加入氢氧 化钠水溶液（16. OOg氢氧化钠+16mL水），加毕，室温反应3小时。
[0083] 反应毕，加入水（16〇1^)，搅拌511^11，静置分层、分液，有机层依次用5%的磷酸 (80mL)、水（160mLX2)洗涤，有机层55°C减压浓缩，蒸除溶剂后得油状物38. 5g。
[0084] 实施例2拉科酰胺类似物式III的合成
[0085] 在IL反应瓶中依次加入甲苯（330mL)、化合物式II (20g，68mmol)，对-甲苯磺酸 甲醋（50. 67g, 272mmol)、四丁基溴化按（2. 63g，8. 16mmol)，搅拌均勾，室温下加入氢氧化 钾水溶液（16. OOg氢氧化钾+16mL水），加毕，室温反应3小时。
[0086] 反应毕，加入水（160mL)，搅拌5min，静置分层、分液，有机层依次用5%的磷酸 (80mL)、水（160mLX2)洗涤，有机层55°C减压浓缩，蒸除溶剂后得油状物48. 32g。经分离 鉴定、本实施例的产物同实施例1。
[0087] 实施例3拉科酰胺类似物式III的合成
[0088] 在IL反应瓶中依次加入甲苯（330mL)、化合物式II (20. 00g，68mmol)，对-甲苯磺 酸甲醋（63. 50g, 340mmol)、四丁基溴化按（2. 63g，8. 16mmol)，搅拌均勾，室温下加入氢氧 化钾水溶液（16. OOg氢氧化钾+16mL水），加毕，室温反应3小时。
[0089] 反应毕，加入水（16〇1^)，搅拌511^11，静置分层、分液，有机层依次用5%的磷酸 (80mL)、水（160mLX2)洗涤，有机层55°C减压浓缩，蒸除溶剂后得油状物60.97g。经分离 鉴定、本实施例的产物同实施例1。
[0090] 实施例4拉科酰胺类似物式III的合成
[0091] 在IL反应瓶中依次加入甲苯（330mL)、化合物式II (20.00g，68mmol)，对-甲苯磺 酸甲醋（38. 10g，204mmol)、四丁基溴化按（2. 63g，8. 16mmol)，搅拌均勾，室温下加入氢氧 化钾水溶液（11. 5g氢氧化钾+11. 5mL水），加毕，室温反应3小时。
[0092] 反应毕，加入水（16〇1^)，搅拌511^11，静置分层、分液，有机层依次用5%的磷酸 (80mL)、水（160mLX2)洗涤，有机层55°C减压浓缩，蒸除溶剂后得油状物39. 7g。经分离鉴 定、本实施例的产物同实施例1。
[0093] 实 施例5拉科酰胺类似物式I正相柱分离纯化
[0094] 用100g 100-200目硅胶湿法装柱（硅胶柱，30mm*400mm)，取上述实施例1中所得 油状物即式I化合物粗品（4g)湿法上样，用正己烷：乙酸乙酯=3:1 (体积比）的混合液作 为流动相，进行洗脱，用荧光薄层硅胶板检测，洗脱7个柱体积时，荧光薄层硅胶板检测到 目标产品，收集洗脱液，减压浓缩后，得到拉科酰胺类似物式I化合物65mg，HPLC检测纯度 为 99. 7%。
[0095] 实施例6拉科酰胺类似物式I正相柱分离纯化
[0096] 用100g 100-200目硅胶湿法装柱（硅胶柱，30mm*400mm)，取上述实施例1中所得 油状物即式I化合物粗品（4g)湿法上样，用石油醚：乙酸乙酯=2. 5:1 (体积比）的混合液 作为流动相，进行洗脱，用荧光薄层硅胶板检测，洗脱8个柱体积时，荧光薄层硅胶板检测 到目标产品，收集洗脱液，减压浓缩后，得到拉科酰胺类似物式I化合物60mg，HPLC检测纯 度为99. 5%。得化合物经鉴定同实施例5。
[0097] 实施例7拉科酰胺类似物式I正相柱分离纯化
[0098] 用100g 100-200目硅胶湿法装柱（硅胶柱，30mm*400mm)，取上述实施例1中所得 油状物即式I化合物粗品（4g)湿法上样，用正己烷：乙酸乙酯=2:1 (体积比）的混合液作 为流动相，进行洗脱，用荧光薄层硅胶板检测，洗脱5个柱体积时，荧光薄层硅胶板检测到 目标产品，收集洗脱液，减压浓缩后，得到拉科酰胺类似物式I化合物70mg，HPLC检测纯度 为99. 6%。得化合物经鉴定同实施例5。
[0099] 实施例8拉科酰胺类似物式I制备液相分离纯化
[0100] 用Varian SD-I制备液相系统进行纯化，选用色谱柱Varian L&L4002 (内径 50mm*200mm)，自装填料为160.0 g PLRP-S (粒径10 μπι，孔径IOnm)。色谱条件如下：流动 相体系A为水，B为甲醇，流速为100mL/min，检测波长为210nm，柱温为室温，上样上述实施 例1中式I化合物粗品8g，梯度洗脱参数如下：0 - 15min，A:B = 30:70 ;15 - 55min，A:B =30:70 - 80:20;55 - 65111丨11，六:8 = 90:10，根据紫外检测结果，收集25.0111丨11-26.111^11 的洗脱液。将洗脱液减压浓缩，得到拉科酰胺类似物式I化合物125mg，HPLC检测纯度为 99. 5%。得化合物经鉴定同实施例5。
[0101] 实施例9 :拉科酰胺类似物式I制备液相分离纯化
[0102] 用Varian SD-I制备液相系统进行纯化，选用色谱柱Varian L&L4002 (内径 50mm*200mm)，自装填料为160.0 g PLRP-S (粒径10 μπι，孔径IOnm)。色谱条件如下：流动 相体系A为水，B为乙腈，流速为100mL/min，检测波长为210nm，柱温为室温，上样上述实施 例1中式I化合物粗品8g，梯度洗脱参数如下：0 - 15min，A:B = 30:70 ;15 - 55min，A:B =30:70 - 80:20 ;55 - 65min，A:B = 90:10，根据紫外检测结果，收集23.〇111丨11-24.〇11^11 的洗脱液。将洗脱液减压浓缩，得到拉科酰胺类似物式I化合物135mg，HPLC检测纯度为 99. 7%。得化合物经鉴定同实施例5。
[0103] 实施例10式II化合物的合成
[0104] 在IOOL反应釜中将Boc-D-丝氨酸（4. OOKg，19. 5mol)溶于乙酸乙酯（40L)中，加 入氯甲酸异丁酯（2. 67Kg，19. 5mol)，搅拌冷却至-15~-KTC，在此温度下慢慢滴加 N-甲 基吗啡啉（I. 97Kg，19. 5mol)，滴毕反应1小时后，在此温度下滴加苄胺（2. 20Kg，20. 5mol)， 滴毕慢慢升温至30°C，反应3小时。
[0105] 反应毕，加入磷酸/水（1L/9L)搅拌分层，有机层用饱和氯化钠溶液（9L)洗涤，再 用无水硫酸钠（4. OOkg)干燥过夜，过滤，40°C减压浓缩至14. 80kg。
[0106] 结晶：将上述乙酸乙酯浓缩液转移至100L反应釜中，搅拌下缓慢加入正己烷 (40L)，析出固体，继续室温下搅拌3小时，过滤，所得固体减压干燥至恒重，得白色固体式 II 4 23Kg，收率 73. 7 %，HPLC 检测纯度为 98. 7 %。
[0107] 实施例11拉科酰胺类似物式I的合成
[0108] 在IL反应瓶中依次加入甲苯（330mL)、化合物式II(20.00g，68mmol)，对-甲苯磺 酸甲醋（38. 10g，204mmol)、四丁基溴化按（2. 63g，8. 16mmol)，搅拌均勾，室温下加入氢氧 化钾水溶液（16. OOg氢氧化钾+16mL水），加毕，室温反应21小时。
[0109] 反应毕，加入水（160mL)，搅拌5min，静置分层、分液，有机层依次用5%的磷酸 (80mL)、水（160mLX2)洗涤，有机层55°C减压浓缩，蒸除溶剂后得油状物38. 5g，HPLC检测 纯度为58. 5%。
[0110] 实施例12拉科酰胺类似物式I的合成
[0111] 在IL反应瓶中依次加入甲苯（330mL)、化合物式II(20g，68mmol)，对-甲苯磺酸 甲醋（50. 67g, 272mmol)、四丁基溴化按（2. 63g，8. 16mmol)，搅拌均勾，室温下加入氢氧化 钾水溶液（16. OOg氢氧化钾+16mL水），加毕，室温反应21小时。
[0112] 反应毕，加入水（16〇1^)，搅拌511^11，静置分层、分液，有机层依次用5%的磷酸 (80mL)、水（160mLX2)洗涤，有机层55°C减压浓缩，蒸除溶剂后得油状物48. 32g，HPLC检 测纯度为63. 7%。经分离鉴定、本实施例的产物同实施例11。
[0113] 实施例13拉科酰胺类似物式I的合成
[0114] 在IL反应瓶中依次加入甲苯（330mL)、化合物式II(20.00g，68mmol)，对-甲苯磺 酸甲醋（63. 50g, 340mmol)、四丁基溴化按（2. 63g，8. 16mmol)，搅拌均勾，室温下加入氢氧 化钾水溶液（16. OOg氢氧化钾+16mL水），加毕，室温反应21小时。
[0115] 反应毕，加入水（160mL)，搅拌5min，静置分层、分液，有机层依次用5%的磷酸 (80mL)、水（160mLX2)洗涤，有机层55°C减压浓缩，蒸除溶剂后得油状物60.97g，HPLC检 测纯度为68. 7%。经分离鉴定、本实施例的产物同实施例11。
[0116] 实施例14拉科酰胺类似物式I的合成
[0117] 在IL反应瓶中依次加入甲苯（330mL)、化合物式II (20. 00g，68mmol)，对-甲苯磺 酸甲醋（38. 10g，204mmol)、四丁基溴化按（2. 63g，8. 16mmol)，搅拌均勾，室温下加入氢氧 化钾水溶液（11. 5g氢氧化钾+11. 5mL水），加毕，室温反应21小时。
[0118] 反应毕，加入水（16〇1^)，搅拌511^11，静置分层、分液，有机层依次用5%的磷酸 (80mL)、水（160mLX2)洗涤，有机层55°C减压浓缩，蒸除溶剂后得油状物39. 7g，HPLC检测 纯度为59. 7%。经分离鉴定、本实施例的产物同实施例11。
[0119] 实施例15拉科酰胺类似物式I的合成
[0120] 在IL反应瓶中依次加入甲苯（330mL)、化合物式II(20.00g，68mmol)，对-甲苯磺 酸甲醋（38. 10g，204mmol)、四丁基溴化按（2. 63g，8. 16mmol)，搅拌均勾，室温下加入氢氧 化钾水溶液（19. OOg氢氧化钾+19mL水），加毕，室温反应21小时。
[0121] 反应毕，加入水（16〇1^)，搅拌511^11，静置分层、分液，有机层依次用5%的磷酸 (80mL)、水（160mLX2)洗涤，有机层55°C减压浓缩，蒸除溶剂后得油状物36. 3g，HPLC检测 纯度为57. 7%。经分离鉴定、本实施例的产物同实施例11。
[0122] 实施例16拉科酰胺类似物式I的合成
[0123] 在IL反应瓶中依次加入二氯甲烷（330mL)、化合物式II(20g，68mmol)，对-甲苯 磺酸甲醋（38g，204mmol)、四丁基溴化按（2. 63g，8. 16mmol)，搅拌均勾，室温下加入氢氧化 钾水溶液（16g氢氧化钾+16mL水），加毕，室温反应21小时。
[0124] 反应毕，加入水（16〇1^)，搅拌511^11，静置分层、分液，有机层依次用5%的磷酸 (80mL)、水（160mLX2)洗涤，有机层40°C减压浓缩，蒸除溶剂后得油状物37. 2g，HPLC检测 纯度为58. 5%。经分离鉴定、本实施例的产物同实施例11。
[0125] 实施例17拉科酰胺类似物式I的合成
[0126] 在IL反应瓶中依次加入甲苯（330mL)、化合物式II (20g，68mmol)，对-甲苯磺酸 甲醋（50. 67g, 272mmol)、四丁基溴化按（2. 63g，8. 16mmol)，搅拌均勾，降温至0°C，加入氢 氧化钾水溶液（16. OOg氢氧化钾+16mL水），加毕，(TC反应40小时。
[0127] 反应毕，加入水（160mL)，搅拌5min，静置分层、分液，有机层依次用5%的磷酸 (80mL)、水（160mLX2)洗涤，有机层55°C减压浓缩，蒸除溶剂后得油状物45.87g，HPLC检 测纯度为63. 7%。经分离鉴定、本实施例的产物同实施例11。
[0128] 实施例18拉科酰胺类似物式I的合成
[0129] 在IL反应瓶中依次加入甲苯（330mL)、化合物式II(20g，68mmol)，对-甲苯磺酸 甲醋（50. 67g, 272mmol)、四丁基溴化按（2. 63g，8. 16mmol)，搅拌均勾，降温至0°C，加入氢 氧化钾水溶液（16. OOg氢氧化钾+16mL水），加毕，35°C反应20小时。
[0130] 反应毕，加入水（160mL)，搅拌5min，静置分层、分液，有机层依次用5%的磷酸 (80mL)、水（160mLX2)洗涤，有机层55°C减压浓缩，蒸除溶剂后得油状物46. 56g，HPLC检 测纯度为64. 5%。经分离鉴定、本实施例的产物同实施例11。
[0131] 实施例19拉科酰胺类似物式I的合成
[0132] 在IL反应瓶中依次加入甲苯（330mL)、化合物式II(20g，68mmol)，对-甲苯磺酸 甲醋（50. 67g, 272mmol)、四丁基溴化按（2. 63g，8. 16mmol)，搅拌均勾，降温至0°C，加入氢 氧化钾水溶液（16. OOg氢氧化钾+16mL水），加毕，50°C反应20小时。
[0133] 反应毕，加入水（160mL)，搅拌5min，静置分层、分液，有机层依次用5%的磷酸 (80mL)、水（160mLX2)洗涤，有机层55°C减压浓缩，蒸除溶剂后得油状物43.63g，HPLC检 测纯度为60. 7%。经分离鉴定、本实施例的产物同实施例11。
[0134] 实施例20拉科酰胺类似物式I的合成
[0135] 在IL反应瓶中依次加入甲苯（330mL)、化合物式II(20g，68mmol)，对-甲苯磺酸 甲醋（50. 67g, 272mmol)、四丁基溴化按（2. 63g，8. 16mmol)，搅拌均勾，降温至0°C，加入氢 氧化钾水溶液（16. OOg氢氧化钾+16mL水），加毕，50°C反应40小时。
[0136] 反应毕，加入水（160mL)，搅拌5min，静置分层、分液，有机层依次用5%的磷酸 (80mL)、水（160mLX2)洗涤，有机层55°C减压浓缩，蒸除溶剂后得油状物46. 30g，HPLC检 测纯度为63. 6%。经分离鉴定、本实施例的产物同实施例11。
[0137] 实施例21拉科酰胺类似物式I的合成
[0138] 在IL反应瓶中依次加入甲苯（330mL)、化合物式II(20.00g，68mmol)，对-甲苯磺 酸甲醋（38. 10g，204mmol)、四丁基溴化按（2. 63g，8. 16mmol)，搅拌均勾，室温下加入氢氧 化钠水溶液（14. OOg氢氧化钠+16mL水），加毕，室温反应21小时。
[0139] 反应毕，加入水（16〇1^)，搅拌511^11，静置分层、分液，有机层依次用5%的磷酸 (80mL)、水（160mLX2)洗涤，有机层55°C减压浓缩，蒸除溶剂后得油状物36. 5g，HPLC检测 纯度为58. 9%。经分离鉴定、本实施例的产物同实施例11。
[0140] 实施例22拉科酰胺类似物式I的合成
[0141] 在IL反应瓶中依次加入甲苯（330mL)、化合物式II(20.00g，68mmol)，对-甲苯磺 酸甲醋（38. 10g，204mmol)、四丁基溴化按（2. 63g，8. 16mmol)，搅拌均勾，室温下加入氢氧 化钾水溶液（16. OOg氢氧化钾+16mL水），加毕，室温反应96小时。
[0142] 反应毕，加入水（16〇1^)，搅拌511^11，静置分层、分液，有机层依次用5%的磷酸 (80mL)、水（160mLX2)洗涤，有机层55°C减压浓缩，蒸除溶剂后得油状物38. 5g，HPLC检测 纯度为60. 7%。经分离鉴定、本实施例的产物同实施例11。
[0143] 实施例23拉科酰胺类似物式I的合成
[0144] 在IL反应瓶中依次加入甲苯（330mL)、化合物式II(20.00g，68mmol)，碘甲烷 (28. 80g, 204mmol)、四丁基溴化按（2. 63g，8. 16mmol)，搅拌均勾，室温下加入氢氧化钠水溶 液（14. OOg氢氧化钠+16mL水），加毕，室温反应21小时。
[0145] 反应毕，加入水（160mL)，搅拌5min，静置分层、分液，有机层依次用5%的磷酸 (80mL)、水（160mLX2)洗涤，有机层55°C减压浓缩，蒸除溶剂后得油状物41. 5g，HPLC检测 纯度为58. 8%。经分离鉴定、本实施例的产物同实施例11。
[0146] 实施例24拉科酰胺类似物式I的合成
[0147] 在IL反应瓶中依次加入甲苯（330mL)、化合物式II(20.00g，68mmol)，硫酸二甲酯 (25. IOg, 204mmol)、四丁基溴化按（2. 63g，8. 16mmol)，搅拌均勾，室温下加入氢氧化钠水溶 液（14. OOg氢氧化钠+16mL水），加毕，室温反应21小时。
[0148] 反应毕，加入水（16〇1^)，搅拌511^11，静置分层、分液，有机层依次用5%的磷酸 (80mL)、水（160mLX2)洗涤，有机层55°C减压浓缩，蒸除溶剂后得油状物43. 5g，HPLC检测 纯度为57. 6%。经分离鉴定、本实施例的产物同实施例11。
[0149] 实施例25拉科酰胺类似物式I正相柱分离纯化
[0150] 用100g 100-200目硅胶湿法装柱（硅胶柱，30mm*400mm)，取实施例11中所得油 状物即式I化合物粗品（4g)湿法上样，用正己烷：乙酸乙酯=3:1 (体积比）的混合液作为 流动相，进行洗脱，用荧光薄层硅胶板检测，洗脱7个柱体积时，荧光薄层硅胶板检测到目 标产品，收集洗脱液，减压浓缩后，得到拉科酰胺类似物式I化合物0. 401g，HPLC检测纯度 为99. 6%，收率10. 0%，如图5所示。
[0151] 实施例26拉科酰胺类似物式I制备液相分离纯化
[0152] 用Varian SD-I制备液相系统进行纯化，选用色谱柱Varian L&L4002 (内径 50mm*200mm)，自装填料为160.0 g PLRP-S (粒径10 μπι，孔径IOnm)。色谱条件如下：流动相 体系A为水，B为甲醇，流速为100mL/min，检测波长为210nm，柱温为室温，取实施例11中所 得式I化合物粗品IOg上样，梯度洗脱参数如下：〇 - 15min，A:B = 30:70 ;15 - 55min，A:B =30:70 - 80:20;55 - 65111丨11，六:8 = 90:10，根据紫外检测结果，收集25.0111丨11-26.111^11 的洗脱液。将洗脱液减压浓缩，得到拉科酰胺类似物式I化合物I. 21g，HPLC检测纯度为 99. 7%，收率12. 1%。所得化合物经鉴定同实施例25。
[0153] 结构鉴定
[0154] 采用沃特斯公司超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用仪（Q-Tof Premier) 对实施例5或25分离出的产物式I进行分子量测定，如图1所示，式I化合物[M+H]计算 结果为323. 1971，实际检测结果[M+H]为323. 1960,实际检测结果与计算结果一致。
[0155]
[0156] 式 I
[0157] 采用BRUKER核磁共振波谱仪AVANCE III400对实施例5或25分离出的产物 式I进行测定，其氢谱如图2所示，其碳谱如图3所示，其二维谱如图4所示，式I的核磁 鉴定结果氢和碳的核磁信号归属结果见表1，碳编号如式I所示。一、二维核磁数据表明 C-13 (34. 7, 33. 2)所连的 3Η(3· 00, 2. 74)与 C-3 (170. 6, 170.1 )、C-5 (51. 9, 50. 3)有远程相 关，因此推断该化合物结构为式I。
[0158] 表 1
[0159]
[0161] 实施例27 :作为标准品用于甲基化反应步骤的反应终点控制
[0162] 将式I标准品用乙腈溶解，配制成0. 3mg/mL的溶液，并与由化合物II制备化 合物III的甲基化反应3小时后的反应液（在IL反应瓶中依次加入甲苯（330mL)、化合 物式 II (20. 00g，68mmol)，对甲苯磺酸甲醋（38. IOg, 204mmol)、四丁基溴化按（2. 63g， 8. 16mmol)，搅拌均匀，室温下加入氢氧化钾水溶液（11. 5g氢氧化钾+11. 5mL水），加毕，室 温反应3小时）按如下条件分别进行HPLC检测，根据对照品色谱图中式I的保留时间确 定 供试品反应液中该杂质的峰，并按照面积归一法计算式I的含量。
[0163] 其中HPLC参数为：
[0164] 色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（Agilent XDB-C18, 250*4. 6mm，5um)
[0165] 流动相：0· OlM磷酸二氢钾（pH 3· 0)和乙腈
[0166] 柱温：25°C
[0167] 流速：1. OmT ,/mi η
[0168] 运行时间：20min
[0169] 检测波长：2IOnm
[0170]
[0171] 测得式I含量为0.95%，在内控规定限度范围内，终止反应。
[0172] 实施例28 :作为标准品用于甲基化反应产物的质量控制
[0173] 将式I标准品和由化合物II制备化合物III的甲基化反应产物均用乙腈溶解，配 制成浓度为〇. 3mg/mL的溶液，按如下条件分别进行HPLC检测，记录色谱图至主成分峰保留 时间的3倍；控制拉科酰胺原料药中式I化合物单个最大杂质峰面积不得大于式I化合物 标准品溶液峰面积的0. 1%，总杂质峰面积之和不得大于式I化合物标准品溶液峰面积的 1. 0%。根据对照品色谱图中式I的保留时间确定甲基化反应产物中该杂质的峰，并按照面 积归一法计算式I的含量。
[0174] 其中HPLC参数为：
[0175] 色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（Agilent XDB-C18, 250*4. 6mm，5um)
[0176] 流动相：0· OlM磷酸二氢钾（pH 3· 0)和乙腈
[0177] 柱温：25°C
[0178] 流速：1. OmT ,/mi η
[0179] 运行时间：20min
[0180] 检测波长：2IOnm
[0181] 按如下梯度运行：
[0182]
[0183] 测得式I含量为0. 98%，在内控规定限度范围内，可以用于下一步反应。
[0184] 实施例29 :作为标准品用于拉科酰胺的质量控制
[0185] 将式I标准品溶液和拉科酰胺原料药用乙腈：甲醇按体积比为80:20的混合溶液 溶解，配成0. 3mg/mL的溶液。按如下条件分别进行HPLC检测，记录色谱图至主成分峰保留 时间的3倍；控制拉科酰胺原料药中式I化合物单个最大杂质峰面积不得大于式I化合物 标准品溶液峰面积的0. 1%，总杂质峰面积之和不得大于式I化合物标准品溶液峰面积的 1. 0%。根据对照品色谱图中式I的保留时间确定该拉科酰胺原料药的溶液中该杂质的峰， 并按照面积归一法计算式I的含量。
[0186] 其中HPLC参数为：
[0187] 色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（Agilent XDB-C18, 250*4. 6mm，5um)
[0188] 流动相：乙腈/甲醇/0· OlM磷酸氢二铵=20/5/75(体积比），pH为7.0和乙腈/ 甲醇=80/20(体积比）
[0189] 柱温：25°C
[0190] 流速：1. OmT ,/mi η
[0191] 运行时间：20min
[0192] 检测波长：2IOnm
[0193] 按如下梯度运行：
[0194]
[0195] 检测结果如下表所示：
[0196]
[0197] 上述产品的批号为购于上^$第一生彳i药业有k公司生产的拉科酰胺原料药的产 品批号。
【主权项】
1. 一种如式I所示的拉科酰胺类似物的分离方法，其包括下列步骤：(a) 将拉科酰胺类似物的反应母液进行水洗、酸洗再水洗； (b) 减压浓缩蒸除有机溶剂，得到油状物； (c) 将所述的油状物进行正相柱层析或高效液相制备色谱，得到式I化合物即可； 所述的拉科酰胺类似物的反应母液的制备方法，包括下述步骤：在有机溶剂和水的两 相溶剂中，在碱和相转移催化剂的存在下，将式II化合物与甲基化试剂进行取代反应，得 到即可；2. 如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，在所述的分离方法中，所述的酸为经水 稀释后的fe; 和/或，在所述的分离方法中，所述的正相柱层析的条件为：流动相为正己烷或石油 醚，与乙酸乙酯的混合液，进行洗脱； 和/或，在所述的分离方法中，所述的高效液相制备色谱的条件为：流动相A为乙腈或 甲醇，流动相B为水，进行梯度洗脱。3. 如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，在所述的分离方法中，所述的正相柱层 析的色谱柱的内径为30mm ; 和/或，在所述的分离方法中，所述的正相柱层析的色谱柱的长度为400mm ; 和/或，在所述的分离方法中，所述的正相柱层析的填料为硅胶。4. 如权利要求2所述的分离方法，其特征在于，在所述的分离方法中，当所述的流动相 为正己烷和乙酸乙酯时，正己烷和乙酸乙酯的体积比为2~5 ;当所述的流动相为石油醚和 乙酸乙酯时，石油醚和乙酸乙酯的体积比为2~4 ; 和/或，在所述的分离方法中，所述的正相柱层析的洗脱体积为5~10个柱体积。5. 如权利要求2所述的分离方法，其特征在于，在所述的分离方法中，所述的正相柱层 析的洗脱液经蒸馏除去溶剂，得到式I化合物。6. 如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，在所述的分离方法中，所述的高效液相 制备色谱的色谱柱为Varian L&L4002 ; 和/或，在所述的分离方法中，所述的高效液相制备色谱的色谱柱的内径为50_ ; 和/或，在所述的分离方法中，所述的高效液相制备色谱的色谱柱的长度为200_ ; 和/或，在所述的分离方法中，所述的高效液相制备色谱的填料为PLRP-S ;所述的高效 液相制备色谱的填料的粒径为10 μ m，孔径为10nm。7. 如权利要求2所述的分离方法，其特征在于，在所述的分离方法中，所述的梯度洗脱 为 O - 15min，A:B = 30:70 ;15 - 55min，A:B = 30:70 - 80:20 ;55 - 65min，A:B = 90:10， 进行线性梯度洗脱。8. 如权利要求2所述的分离方法，其特征在于，在所述的分离方法中，所述的高效液相 制备色谱的流速为100mL/min ; 和/或，在所述的分离方法中，所述的高效液相制备色谱的检测波长为210nm ; 和/或，在所述的分离方法中，所述的高效液相制备色谱的温度为25°C~35°C。9. 如权利要求2所述的分离方法，其特征在于，在所述的分离方法中，所述的高效液相 制备色谱的洗脱液经蒸馏除去溶剂，得到式I化合物。10. 如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，在所述的拉科酰胺类似物的反应母液 的制备方法中，所述的有机溶剂为甲苯或二氯甲烷； 和/或，在所述的拉科酰胺类似物的反应母液的制备方法中，所述的有机溶剂与式II 化合物的体积摩尔比为4L/mol~5L/mol ; 和/或，在所述的拉科酰胺类似物的反应母液的制备方法中，所述的水与式II化合物 的体积摩尔比为〇. lL/mol~0. 5L/mol ; 和/或，在所述的拉科酰胺类似物的反应母液的制备方法中，所述的有机溶剂与所述 的水的体积比为17~28 ; 和/或，在所述的拉科酰胺类似物的反应母液的制备方法中，所述的碱为无机碱； 和/或，在所述的拉科酰胺类似物的反应母液的制备方法中，所述的碱与式II化合物 的摩尔比为3~5 ; 和/或，在所述的拉科酰胺类似物的反应母液的制备方法中，所述的相转移催化剂为 季铵盐相转移催化剂； 和/或，在所述的拉科酰胺类似物的反应母液的制备方法中，所述的相转移催化剂与 式II化合物的摩尔比为0. 1~0. 15 ; 和/或，在所述的拉科酰胺类似物的反应母液的制备方法中，所述的甲基化试剂为碘 甲烷、硫酸二甲酯和对甲苯磺酸甲酯中的一种或多种； 和/或，在所述的拉科酰胺类似物的反应母液的制备方法中，所述的甲基化试剂与式 Π 化合物的摩尔比为3~5 ; 和/或，在所述的拉科酰胺类似物的反应母液的制备方法中，所述的取代反应的温度 为 0°C~50°C ; 和/或，在所述的拉科酰胺类似物的反应母液的制备方法中，所述的取代反应的时间 为 3h ~100h。
【专利摘要】本发明公开了一种拉科酰胺类似物的分离方法。本发明提供了一种如式I所示的拉科酰胺类似物的分离方法，其包括下列步骤：(a)将拉科酰胺类似物的反应母液进行水洗、酸洗再水洗；(b)减压浓缩蒸除有机溶剂，得到油状物；(c)将所述的油状物进行正相柱层析或高效液相制备色谱，得到式I化合物即可；所述的拉科酰胺类似物的反应母液的制备方法，包括下述步骤：在有机溶剂和水的两相溶剂中，在碱和相转移催化剂的存在下，将式II化合物与甲基化试剂进行取代反应，得到即可。本发明的如式I所示的拉科酰胺类似物是对拉科酰胺进行质量控制的必需品；本发明的分离方法可以高效地分离得到上述的类似物。
【IPC分类】C07C271/22, C07C269/08, C07C269/06
【公开号】CN104892460
【申请号】CN201510355245
【发明人】黄臻辉, 袁永雷, 谢建树, 魏宪民
【申请人】上海上药第一生化药业有限公司, 上海医药集团股份有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月24日
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种拉科酰胺类似物的分离方法。
【背景技术】
[0002]
[0003] 拉科酰胺，一种新型N-甲基-D-天门冬氨酸（NMDA)受体甘氨酸位点拮抗剂，它可 选择性促进钠通道缓慢失活并调节塌陷反应介导蛋白22 (CRMP22)，属于新一类功能性氨基 酸，具有全新双重机制作用的抗癫痫药物。在中国癫痫已经成为神经科仅次于头痛的第二 大常见病，我国对抗癫痫药物有着巨大需求，而拉科酰胺的作用机制不同于已上市的其他 抗癫痫药，对现有药物无法控制症状的患者有较好的疗效，因此拉科酰胺的临床用量需求 较大，市场前景好，其原料药与制剂的开发都具有重要意义。
[0004]
[0005] 目前在文献中报道过的拉科酰胺合成方法多以中间体式III通过脱保护再上乙 酰基得到拉科酰胺，如原研公司的专利CN101928230A、浙江九洲药业股份有限公司的专利 CN102020589A 以及中国专利 CN103319366A。
[0006] 众所周知，为了确保药品安全，须对药物质量进行严格控制，药物含量测定、未知 杂质的结构鉴定和杂质限量是药物质量控制的有效方法，杂质分析是药物质量标准的重要 内容。目前，国内外尚未见拉科酰胺类似物的报道。
[0007] 因此，本领域亟需对拉科酰胺类似物进行分离、鉴定并合成。
【发明内容】
[0008] 本发明所要解决的问题是为了克服现有技术中缺乏拉科酰胺在合成过程中产生 的类似物的分离、鉴定并合成等缺陷，而提供了一种拉科酰胺类似物的分离方法。本发明的 拉科酰胺类似物是对拉科酰胺进行质量控制的必需品；本发明的分离方法可以高效地分离 得到上述的类似物。
[0009] 发明人在研发过程中发现，中间体式III的合成过程中会产生杂质，对终产品拉 科酰胺的质量和收率的影响很大。如果反应条件不当，生成杂质过多，就会在后面步骤中被 衍生化产生更多更复杂的杂质，会严重影响拉科酰胺的药物质量和最终收率，因此，中间体 式III的质量控制至关重要。我方将其分离鉴定，发现其结构如式I所示。
[0010] 本发明提供了一种如式I所示的拉科酰胺类似物的分离方法，其包括下列步骤：
[0011]
[0012] (a)将拉科酰胺类似物的反应母液进行水洗、酸洗再水洗；
[0013] (b)减压浓缩蒸除有机溶剂，得到油状物；
[0014] (C)将所述的油状物进行正相柱层析或高效液相制备色谱，得到式I化合物即可；
[0015] 所述的拉科酰胺类似物的反应母液的制备方法，包括下述步骤：在有机溶剂和水 的两相溶剂中，在碱和相转移催化剂的存在下，将式II化合物与甲基化试剂进行取代反 应，得到即可；
[0016]
[0017] 在所述的分离方法中，所述的酸可为本领域后处理中常规的酸，较佳地为经水稀 释后的酸，更佳地为质量分数为5%的磷酸水溶液。
[0018] 在所述的分离方法中，所述的正相柱层析的条件较佳地为：流动相为正己烷或石 油醚，与乙酸乙酯的混合液，进行洗脱。
[0019] 在所述的分离方法中，所述的正相柱层析的色谱柱的内径较佳地为30_ ;所述的 正相柱层析的色谱柱的长度较佳地为400mm。
[0020] 在所述的分离方法中，所述的正相柱层析的填料较佳地为硅胶；所述的硅胶较佳 地为100目~200目的硅胶。
[0021] 在所述的分离方法中，所述的正相柱层析的流动相中，较佳地，当所述的流动相为 正己烷和乙酸乙酯时，正己烷和乙酸乙酯的体积比为2~5(例如3);当所述的流动相为石 油醚和乙酸乙酯时，石油醚和乙酸乙酯的体积比为2~4(例如2. 5)。
[0022] 在所述的分离方法中，所述的正相柱层析的洗脱体积较佳地为5~10个柱体积， 例如7或8个柱体积。
[0023] 在所述的分离方法中，较佳地，所述的正相柱层析的洗脱液经蒸馏除去溶剂，得到 式I化合物。
[0024] 在所述的分离方法中，所述的高效液相制备色谱的条件较佳地为：流动相A为乙 腈或甲醇，流动相B为水，进行梯度洗脱。
[0025] 在所述的分离方法中，所述的高效液相制备色谱的色谱柱较佳地为Varian L&L4002 ;所述的高效液相制备色谱的色谱柱的内径较佳地为50mm ;所述的高效液相制备 色谱的色谱柱的长度较佳地为200mm。
[0026] 在所述的分离方法中，所述的高效液相制备色谱的填料较佳地为PLRP-S ;所述的 高效液相制备色谱的填料的粒径较佳地为10 μ m，孔径较佳地为10nm。
[0027] 在所述的分离方法中，所述的梯度洗脱较佳地为0 - 15min，A:B = 30:70 ; 15 - 55111丨11，4:8 = 30:70 - 80:20;55 - 65111丨11，4:8 = 90:10，进行线性梯度洗脱。
[0028] 在所述的分离方法中，所述的高效液相制备色谱的流速较佳地为100mL/min。
[0029] 在所述的分离方法中，所述的高效液相制备色谱的检测波长较佳地为210nm。
[0030] 在所述的分离方法中，所述的高效液相制备色谱的温度较佳地为25°C~35°C。
[0031 ] 在所述的分离方法中，所述的高效液相制备色谱的洗脱液较佳地经蒸馏除去溶 剂，得到式I化合物。
[0032] 在所述的拉科酰胺类似物的反应母液的制备方法中，所述的有机溶剂可为本领域 该类反应常规的有机溶剂，较佳地为甲苯或二氯甲烷，更佳地为甲苯。
[0033] 在所述的拉科酰胺类似物的反应母液的制备方法中，所述的有机溶剂与式II化 合物的体积摩尔比可为本领域该类反应常规的体积摩尔比，较佳地为4L/mol~5L/mol，例 如 4. 8L/mol。
[0034] 在所述的拉科酰胺类似物的反应母液的制备方法中，所述的水与式II化合物的 体积摩尔比可为本领域该类反应常规的体积摩尔比，较佳地为〇. lL/mol~0. 5L/mol，更佳 地为 0· 17L/mol ~0· 28L/mol，例如 0· 24L/mol。
[0035] 在所述的拉科酰胺类似物的反应母液的制备方法中，所述的有机溶剂与所述的水 的体积比可为本领域该类反应常规的体积比，较佳地为17~28,例如20。
[0036] 在所述的拉科酰胺类似物的反应母液的制备方法中，所述的碱可为本领域该类反 应常规的碱，较佳地为无机碱，更佳地为氢氧化钠和/或氢氧化钾。
[0037] 在所述的拉科酰胺类似物的反应母液的制备方法中，所述的碱与式II化合物的 摩尔比可为本领域该类反应常规的摩尔比，较佳地为3~5,例如4. 2。
[0038] 在所述的拉科酰胺类似物的反应母液的制备方法中，所述的相转移催化剂可为本 领域该类反应常规的相转移催化剂，较佳地为季铵盐相转移催化剂，更佳地为四丁基溴化 铵。
[0039] 在所述的拉科酰胺类似物的反应母液的制备方法中，所述的相转移催化剂与式II 化合物的摩尔比可为本领域该类反应常规的摩尔比，较佳地为0. 1~0. 15,例如0. 12。
[0040] 在所述的拉科酰胺类似物的反应母液的制备方法中，所述的甲基化试剂可为本领 域该类反应常规的甲基化试剂，较佳地为碘甲烷、硫酸二甲酯和对甲苯磺酸甲酯中的一种 或多种，更佳地为硫酸二甲酯。
[0041] 在所述的拉科酰胺类似物的反应母液的制备方法中，所述的甲基化试剂与式II 化合物的摩尔比可为本领域该类反应常规的摩尔比，较佳地为3~5,例如4。
[0042] 在所述的拉科酰胺类似物的反应母液的制备方法中，所述的取代反应的温度可为 本领域该类反应常规的温度；较佳地为〇°C~50°C，更佳地为25°C~35°C。温度超过45°C 时会导致Boc-保护基的脱除，从而收率下降。
[0043] 在所述的拉科酰胺类似物的反应母液的制备方法中，所述的取代反应的时间较佳 地为3h~100h，例如21h、40h、96h。在3h~IOOh范围内，反应时间越长，收率越高。
[0044] 本发明还提供了上述如式I所示的拉科酰胺类似物作为标准品在下述由式II化 合物制备式ΠΙ化合物的反应中的终点控制的应用，
[0045]
〇
[0046] 本发明中，取代基Boc-为本领域常规所知的叔丁氧羰基。
[0047] 其中，所述的应用较佳地包括下述步骤：将如式I所示的拉科酰胺类似物标准品 溶液和所述反应的反应液分别进行高效液相色谱检测，根据如式I所示的拉科酰胺类似物 标准品色谱图的保留时间确定反应液中相关物质的峰，并根据峰面积计算反应液中式I化 合物的含量，从而最终实现反应终点的控制。
[0048] 其中，所述的高效液相色谱的条件优选如下：流动相A为0. 005~0. 02mol/L磷酸 二氢钾溶液，pH值为2. 8~3. 2,流动相B为乙腈，以流动相A :流动相B按体积比为（55~ 65) : (45~35)进行洗脱，柱温为20~30°C，检测波长为210nm，流速为I. 0~2. OmL/min， 进样量15~25 μ L，如式I所示的拉科酰胺类似物 标准品溶液的浓度为0. 2~0. 4mg/mL。
[0049] 其中，所述的高效液相色谱的条件更优选如下：流动相A为O.Olmol/L磷酸二氢钾 溶液，pH值为3. 0,流动相B为乙腈，以流动相A :流动相B按体积比为60 :40进行洗脱，柱 温为25°C，检测波长为210nm，流速为1.0 mL/min，进样量20 μ L，如式I所示的拉科酰胺类 似物标准品溶液的浓度为〇. 3mg/mL。
[0050] 其中，所述的如式I所示的拉科酰胺类似物标准品溶液较佳地为如式I所示的拉 科酰胺类似物与乙腈混合所形成的溶液。
[0051] 其中，所述的高效液相色谱的色谱柱较佳地为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，其 型号为 Agilent XDB-C18, 250*4. 6mm，5 μ m。
[0052] 其中，在由式II化合物制备式III化合物的反应中，其反应步骤优选如下：在有机 溶剂和水的两相溶剂中，在碱和相转移催化剂的存在下，将式II化合物与甲基化试剂进行 取代反应，即可。
[0053] 所述的甲基化试剂较佳地为对甲苯磺酸甲酯。
[0054] 所述的式II化合物与所述的甲基化试剂的摩尔比较佳地为1 : (3~5)，更佳地为 1:4〇
[0055] 所述的有机溶剂较佳地为甲苯。
[0056] 所述的反应的温度较佳地为10~30°C。
[0057] 所述的相转移催化剂较佳地为四丁基溴化铵。
[0058] 所述的碱较佳地为无机碱，更佳地为氢氧化钠和/或氢氧化钾。
[0059] 在所述的反应中，反应终点的控制优选通过如下方法进行：当检测式I化合物的 含量大于5%时，应立即终止反应，表明反应液中式I化合物的含量较高，反应效果不佳；当 检测式I化合物的含量小于〇. 5%时，不终止反应，否则会导致式III化合物的产率较低，反 应效果不佳；当检测式I化合物的含量大于等于〇. 5%且小于等于5%时，即可终止反应，反 应效果较好；百分比是指质量百分比。
[0060] 本发明还提供了上述如式I所示的拉科酰胺类似物作为标准品在检测拉科酰胺 原料药中式I化合物含量的应用。
[0061] 其中，所述的应用较佳地包括下述步骤：将如式I所示的拉科酰胺类似物标准品 溶液和拉科酰胺原料药溶液分别进行高效液相色谱检测，根据如式I所示的拉科酰胺类似 物标准品色谱图的保留时间确定拉科酰胺原料药溶液中相关物质的峰，并根据峰面积计算 拉科酰胺原料药溶液中式I化合物的含量，从而最终实现拉科酰胺原料药的质量控制。
[0062] 其中，所述的高效液相色谱的条件优选如下：流动相A为乙腈：甲醇：0.01mol/L 磷酸二氢铵按体积比为20:5:75的混合溶液，pH值为7. 0,流动相B为乙腈：甲醇按体积比 为（70~90) : (10~30)的混合溶液，柱温为10~30°C，检测波长为210nm，流速为I. 0~ 2. OmL/min，进样量15~25 μ L，如式I所示的拉科酰胺类似物标准品溶液的浓度为0. 2~ 0. 4mg/mL，拉科酰胺原料药溶液的浓度为0. 2~0. 4mg/mL。
[0063] 其中，所述的高效液相色谱的条件更优选如下：流动相A为乙腈：甲醇：0.0 lmol/L 磷酸二氢铵按体积比为20:5:75的混合溶液，pH值为7. 0,流动相B为乙腈：甲醇按体积比 为80:20的混合溶液，柱温为25°C，检测波长为210nm，流速为1.0 mL/min，进样量20 μ L，如 式I所示的拉科酰胺类似物标准品溶液的浓度为0. 3mg/mL，拉科酰胺原料药溶液的浓度为 0· 3mg/mL〇
[0064] 其中，所述的高效液相色谱的洗脱较佳地按照如下条件进行梯度洗脱，百分比为 体积百分比：
[0065] Omin :100% 流动相 A+0% 流动相 B - 5min :100% 流动相 A+0% 流动相 B - 15min : 75%流动相八+25%流动相13 - 2〇111；[11:75%流动相4+25%流动相13 - 21111；[11:100%流动相 A+0%流动相B - 25min :100%流动相A+0%流动相B。
[0066] 其中，所述的高效液相色谱检测的方法优选如下：记录色谱图至主成分峰保留时 间的3倍；控制拉科酰胺原料药中式I化合物单个最大杂质峰面积不得大于式I化合物 标准品溶液峰面积的〇. 1%，总杂质峰面积之和不得大于式I化合物标准品溶液峰面积的 1. 0%〇
[0067] 其中，所述的如式I所示的拉科酰胺类似物标准品溶液较佳地为如式I所示的拉 科酰胺类似物与流动相B混合所形成的溶液。
[0068] 其中，所述的拉科酰胺原料药溶液较佳地为拉科酰胺原料药与流动相B混合所形 成的溶液。
[0069] 其中，所述的高效液相色谱的色谱柱较佳地为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，其 型号为 Agilent XDB-C18, 250*4. 6mm，5 μ m。
[0070] 在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳 实例。
[0071] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0072] 本发明中所述的室温为25°C~35°C。
[0073] 本发明的积极进步效果在于：本发明的如式I所示的拉科酰胺类似物是对拉科酰 胺进行质量控制的必需品；本发明的分离方法可以高效地分离得到上述的类似物。
【附图说明】
[0074] 图1为拉科酰胺类似物I的MS图；
[0075] 图2为拉科酰胺类似物I的1HNMR图；
[0076] 图3为拉科酰胺类似物I的13CNMR图；
[0077] 图4为拉科酰胺类似物I的HMBC图；
[0078] 图5为拉科酰胺类似物I的HPLC图。
【具体实施方式】
[0079] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商 品说明书选择。
[0080] 需要说明的是，由于HPLC检测时忽略了对甲苯磺酸甲酯、甲苯等原料、溶剂，因 此，实施例中油状物的HPLC检测纯度并非式I化合物在油状物中的含量，而是式I化合物 在忽略了对甲苯磺酸甲酯、甲苯等之后的油状物中的含量。
[0081] 实施例1拉科酰胺类似物式III的合成
[0082] 在IL反应瓶中依次加入甲苯（330mL)、化合物式II (20. 00g，68mmol)，对-甲苯磺 酸甲醋（38. 10g，204mmol)、四丁基溴化按（2. 63g，8. 16mmol)，搅拌均勾，室温下加入氢氧 化钠水溶液（16. OOg氢氧化钠+16mL水），加毕，室温反应3小时。
[0083] 反应毕，加入水（16〇1^)，搅拌511^11，静置分层、分液，有机层依次用5%的磷酸 (80mL)、水（160mLX2)洗涤，有机层55°C减压浓缩，蒸除溶剂后得油状物38. 5g。
[0084] 实施例2拉科酰胺类似物式III的合成
[0085] 在IL反应瓶中依次加入甲苯（330mL)、化合物式II (20g，68mmol)，对-甲苯磺酸 甲醋（50. 67g, 272mmol)、四丁基溴化按（2. 63g，8. 16mmol)，搅拌均勾，室温下加入氢氧化 钾水溶液（16. OOg氢氧化钾+16mL水），加毕，室温反应3小时。
[0086] 反应毕，加入水（160mL)，搅拌5min，静置分层、分液，有机层依次用5%的磷酸 (80mL)、水（160mLX2)洗涤，有机层55°C减压浓缩，蒸除溶剂后得油状物48. 32g。经分离 鉴定、本实施例的产物同实施例1。
[0087] 实施例3拉科酰胺类似物式III的合成
[0088] 在IL反应瓶中依次加入甲苯（330mL)、化合物式II (20. 00g，68mmol)，对-甲苯磺 酸甲醋（63. 50g, 340mmol)、四丁基溴化按（2. 63g，8. 16mmol)，搅拌均勾，室温下加入氢氧 化钾水溶液（16. OOg氢氧化钾+16mL水），加毕，室温反应3小时。
[0089] 反应毕，加入水（16〇1^)，搅拌511^11，静置分层、分液，有机层依次用5%的磷酸 (80mL)、水（160mLX2)洗涤，有机层55°C减压浓缩，蒸除溶剂后得油状物60.97g。经分离 鉴定、本实施例的产物同实施例1。
[0090] 实施例4拉科酰胺类似物式III的合成
[0091] 在IL反应瓶中依次加入甲苯（330mL)、化合物式II (20.00g，68mmol)，对-甲苯磺 酸甲醋（38. 10g，204mmol)、四丁基溴化按（2. 63g，8. 16mmol)，搅拌均勾，室温下加入氢氧 化钾水溶液（11. 5g氢氧化钾+11. 5mL水），加毕，室温反应3小时。
[0092] 反应毕，加入水（16〇1^)，搅拌511^11，静置分层、分液，有机层依次用5%的磷酸 (80mL)、水（160mLX2)洗涤，有机层55°C减压浓缩，蒸除溶剂后得油状物39. 7g。经分离鉴 定、本实施例的产物同实施例1。
[0093] 实 施例5拉科酰胺类似物式I正相柱分离纯化
[0094] 用100g 100-200目硅胶湿法装柱（硅胶柱，30mm*400mm)，取上述实施例1中所得 油状物即式I化合物粗品（4g)湿法上样，用正己烷：乙酸乙酯=3:1 (体积比）的混合液作 为流动相，进行洗脱，用荧光薄层硅胶板检测，洗脱7个柱体积时，荧光薄层硅胶板检测到 目标产品，收集洗脱液，减压浓缩后，得到拉科酰胺类似物式I化合物65mg，HPLC检测纯度 为 99. 7%。
[0095] 实施例6拉科酰胺类似物式I正相柱分离纯化
[0096] 用100g 100-200目硅胶湿法装柱（硅胶柱，30mm*400mm)，取上述实施例1中所得 油状物即式I化合物粗品（4g)湿法上样，用石油醚：乙酸乙酯=2. 5:1 (体积比）的混合液 作为流动相，进行洗脱，用荧光薄层硅胶板检测，洗脱8个柱体积时，荧光薄层硅胶板检测 到目标产品，收集洗脱液，减压浓缩后，得到拉科酰胺类似物式I化合物60mg，HPLC检测纯 度为99. 5%。得化合物经鉴定同实施例5。
[0097] 实施例7拉科酰胺类似物式I正相柱分离纯化
[0098] 用100g 100-200目硅胶湿法装柱（硅胶柱，30mm*400mm)，取上述实施例1中所得 油状物即式I化合物粗品（4g)湿法上样，用正己烷：乙酸乙酯=2:1 (体积比）的混合液作 为流动相，进行洗脱，用荧光薄层硅胶板检测，洗脱5个柱体积时，荧光薄层硅胶板检测到 目标产品，收集洗脱液，减压浓缩后，得到拉科酰胺类似物式I化合物70mg，HPLC检测纯度 为99. 6%。得化合物经鉴定同实施例5。
[0099] 实施例8拉科酰胺类似物式I制备液相分离纯化
[0100] 用Varian SD-I制备液相系统进行纯化，选用色谱柱Varian L&L4002 (内径 50mm*200mm)，自装填料为160.0 g PLRP-S (粒径10 μπι，孔径IOnm)。色谱条件如下：流动 相体系A为水，B为甲醇，流速为100mL/min，检测波长为210nm，柱温为室温，上样上述实施 例1中式I化合物粗品8g，梯度洗脱参数如下：0 - 15min，A:B = 30:70 ;15 - 55min，A:B =30:70 - 80:20;55 - 65111丨11，六:8 = 90:10，根据紫外检测结果，收集25.0111丨11-26.111^11 的洗脱液。将洗脱液减压浓缩，得到拉科酰胺类似物式I化合物125mg，HPLC检测纯度为 99. 5%。得化合物经鉴定同实施例5。
[0101] 实施例9 :拉科酰胺类似物式I制备液相分离纯化
[0102] 用Varian SD-I制备液相系统进行纯化，选用色谱柱Varian L&L4002 (内径 50mm*200mm)，自装填料为160.0 g PLRP-S (粒径10 μπι，孔径IOnm)。色谱条件如下：流动 相体系A为水，B为乙腈，流速为100mL/min，检测波长为210nm，柱温为室温，上样上述实施 例1中式I化合物粗品8g，梯度洗脱参数如下：0 - 15min，A:B = 30:70 ;15 - 55min，A:B =30:70 - 80:20 ;55 - 65min，A:B = 90:10，根据紫外检测结果，收集23.〇111丨11-24.〇11^11 的洗脱液。将洗脱液减压浓缩，得到拉科酰胺类似物式I化合物135mg，HPLC检测纯度为 99. 7%。得化合物经鉴定同实施例5。
[0103] 实施例10式II化合物的合成
[0104] 在IOOL反应釜中将Boc-D-丝氨酸（4. OOKg，19. 5mol)溶于乙酸乙酯（40L)中，加 入氯甲酸异丁酯（2. 67Kg，19. 5mol)，搅拌冷却至-15~-KTC，在此温度下慢慢滴加 N-甲 基吗啡啉（I. 97Kg，19. 5mol)，滴毕反应1小时后，在此温度下滴加苄胺（2. 20Kg，20. 5mol)， 滴毕慢慢升温至30°C，反应3小时。
[0105] 反应毕，加入磷酸/水（1L/9L)搅拌分层，有机层用饱和氯化钠溶液（9L)洗涤，再 用无水硫酸钠（4. OOkg)干燥过夜，过滤，40°C减压浓缩至14. 80kg。
[0106] 结晶：将上述乙酸乙酯浓缩液转移至100L反应釜中，搅拌下缓慢加入正己烷 (40L)，析出固体，继续室温下搅拌3小时，过滤，所得固体减压干燥至恒重，得白色固体式 II 4 23Kg，收率 73. 7 %，HPLC 检测纯度为 98. 7 %。
[0107] 实施例11拉科酰胺类似物式I的合成
[0108] 在IL反应瓶中依次加入甲苯（330mL)、化合物式II(20.00g，68mmol)，对-甲苯磺 酸甲醋（38. 10g，204mmol)、四丁基溴化按（2. 63g，8. 16mmol)，搅拌均勾，室温下加入氢氧 化钾水溶液（16. OOg氢氧化钾+16mL水），加毕，室温反应21小时。
[0109] 反应毕，加入水（160mL)，搅拌5min，静置分层、分液，有机层依次用5%的磷酸 (80mL)、水（160mLX2)洗涤，有机层55°C减压浓缩，蒸除溶剂后得油状物38. 5g，HPLC检测 纯度为58. 5%。
[0110] 实施例12拉科酰胺类似物式I的合成
[0111] 在IL反应瓶中依次加入甲苯（330mL)、化合物式II(20g，68mmol)，对-甲苯磺酸 甲醋（50. 67g, 272mmol)、四丁基溴化按（2. 63g，8. 16mmol)，搅拌均勾，室温下加入氢氧化 钾水溶液（16. OOg氢氧化钾+16mL水），加毕，室温反应21小时。
[0112] 反应毕，加入水（16〇1^)，搅拌511^11，静置分层、分液，有机层依次用5%的磷酸 (80mL)、水（160mLX2)洗涤，有机层55°C减压浓缩，蒸除溶剂后得油状物48. 32g，HPLC检 测纯度为63. 7%。经分离鉴定、本实施例的产物同实施例11。
[0113] 实施例13拉科酰胺类似物式I的合成
[0114] 在IL反应瓶中依次加入甲苯（330mL)、化合物式II(20.00g，68mmol)，对-甲苯磺 酸甲醋（63. 50g, 340mmol)、四丁基溴化按（2. 63g，8. 16mmol)，搅拌均勾，室温下加入氢氧 化钾水溶液（16. OOg氢氧化钾+16mL水），加毕，室温反应21小时。
[0115] 反应毕，加入水（160mL)，搅拌5min，静置分层、分液，有机层依次用5%的磷酸 (80mL)、水（160mLX2)洗涤，有机层55°C减压浓缩，蒸除溶剂后得油状物60.97g，HPLC检 测纯度为68. 7%。经分离鉴定、本实施例的产物同实施例11。
[0116] 实施例14拉科酰胺类似物式I的合成
[0117] 在IL反应瓶中依次加入甲苯（330mL)、化合物式II (20. 00g，68mmol)，对-甲苯磺 酸甲醋（38. 10g，204mmol)、四丁基溴化按（2. 63g，8. 16mmol)，搅拌均勾，室温下加入氢氧 化钾水溶液（11. 5g氢氧化钾+11. 5mL水），加毕，室温反应21小时。
[0118] 反应毕，加入水（16〇1^)，搅拌511^11，静置分层、分液，有机层依次用5%的磷酸 (80mL)、水（160mLX2)洗涤，有机层55°C减压浓缩，蒸除溶剂后得油状物39. 7g，HPLC检测 纯度为59. 7%。经分离鉴定、本实施例的产物同实施例11。
[0119] 实施例15拉科酰胺类似物式I的合成
[0120] 在IL反应瓶中依次加入甲苯（330mL)、化合物式II(20.00g，68mmol)，对-甲苯磺 酸甲醋（38. 10g，204mmol)、四丁基溴化按（2. 63g，8. 16mmol)，搅拌均勾，室温下加入氢氧 化钾水溶液（19. OOg氢氧化钾+19mL水），加毕，室温反应21小时。
[0121] 反应毕，加入水（16〇1^)，搅拌511^11，静置分层、分液，有机层依次用5%的磷酸 (80mL)、水（160mLX2)洗涤，有机层55°C减压浓缩，蒸除溶剂后得油状物36. 3g，HPLC检测 纯度为57. 7%。经分离鉴定、本实施例的产物同实施例11。
[0122] 实施例16拉科酰胺类似物式I的合成
[0123] 在IL反应瓶中依次加入二氯甲烷（330mL)、化合物式II(20g，68mmol)，对-甲苯 磺酸甲醋（38g，204mmol)、四丁基溴化按（2. 63g，8. 16mmol)，搅拌均勾，室温下加入氢氧化 钾水溶液（16g氢氧化钾+16mL水），加毕，室温反应21小时。
[0124] 反应毕，加入水（16〇1^)，搅拌511^11，静置分层、分液，有机层依次用5%的磷酸 (80mL)、水（160mLX2)洗涤，有机层40°C减压浓缩，蒸除溶剂后得油状物37. 2g，HPLC检测 纯度为58. 5%。经分离鉴定、本实施例的产物同实施例11。
[0125] 实施例17拉科酰胺类似物式I的合成
[0126] 在IL反应瓶中依次加入甲苯（330mL)、化合物式II (20g，68mmol)，对-甲苯磺酸 甲醋（50. 67g, 272mmol)、四丁基溴化按（2. 63g，8. 16mmol)，搅拌均勾，降温至0°C，加入氢 氧化钾水溶液（16. OOg氢氧化钾+16mL水），加毕，(TC反应40小时。
[0127] 反应毕，加入水（160mL)，搅拌5min，静置分层、分液，有机层依次用5%的磷酸 (80mL)、水（160mLX2)洗涤，有机层55°C减压浓缩，蒸除溶剂后得油状物45.87g，HPLC检 测纯度为63. 7%。经分离鉴定、本实施例的产物同实施例11。
[0128] 实施例18拉科酰胺类似物式I的合成
[0129] 在IL反应瓶中依次加入甲苯（330mL)、化合物式II(20g，68mmol)，对-甲苯磺酸 甲醋（50. 67g, 272mmol)、四丁基溴化按（2. 63g，8. 16mmol)，搅拌均勾，降温至0°C，加入氢 氧化钾水溶液（16. OOg氢氧化钾+16mL水），加毕，35°C反应20小时。
[0130] 反应毕，加入水（160mL)，搅拌5min，静置分层、分液，有机层依次用5%的磷酸 (80mL)、水（160mLX2)洗涤，有机层55°C减压浓缩，蒸除溶剂后得油状物46. 56g，HPLC检 测纯度为64. 5%。经分离鉴定、本实施例的产物同实施例11。
[0131] 实施例19拉科酰胺类似物式I的合成
[0132] 在IL反应瓶中依次加入甲苯（330mL)、化合物式II(20g，68mmol)，对-甲苯磺酸 甲醋（50. 67g, 272mmol)、四丁基溴化按（2. 63g，8. 16mmol)，搅拌均勾，降温至0°C，加入氢 氧化钾水溶液（16. OOg氢氧化钾+16mL水），加毕，50°C反应20小时。
[0133] 反应毕，加入水（160mL)，搅拌5min，静置分层、分液，有机层依次用5%的磷酸 (80mL)、水（160mLX2)洗涤，有机层55°C减压浓缩，蒸除溶剂后得油状物43.63g，HPLC检 测纯度为60. 7%。经分离鉴定、本实施例的产物同实施例11。
[0134] 实施例20拉科酰胺类似物式I的合成
[0135] 在IL反应瓶中依次加入甲苯（330mL)、化合物式II(20g，68mmol)，对-甲苯磺酸 甲醋（50. 67g, 272mmol)、四丁基溴化按（2. 63g，8. 16mmol)，搅拌均勾，降温至0°C，加入氢 氧化钾水溶液（16. OOg氢氧化钾+16mL水），加毕，50°C反应40小时。
[0136] 反应毕，加入水（160mL)，搅拌5min，静置分层、分液，有机层依次用5%的磷酸 (80mL)、水（160mLX2)洗涤，有机层55°C减压浓缩，蒸除溶剂后得油状物46. 30g，HPLC检 测纯度为63. 6%。经分离鉴定、本实施例的产物同实施例11。
[0137] 实施例21拉科酰胺类似物式I的合成
[0138] 在IL反应瓶中依次加入甲苯（330mL)、化合物式II(20.00g，68mmol)，对-甲苯磺 酸甲醋（38. 10g，204mmol)、四丁基溴化按（2. 63g，8. 16mmol)，搅拌均勾，室温下加入氢氧 化钠水溶液（14. OOg氢氧化钠+16mL水），加毕，室温反应21小时。
[0139] 反应毕，加入水（16〇1^)，搅拌511^11，静置分层、分液，有机层依次用5%的磷酸 (80mL)、水（160mLX2)洗涤，有机层55°C减压浓缩，蒸除溶剂后得油状物36. 5g，HPLC检测 纯度为58. 9%。经分离鉴定、本实施例的产物同实施例11。
[0140] 实施例22拉科酰胺类似物式I的合成
[0141] 在IL反应瓶中依次加入甲苯（330mL)、化合物式II(20.00g，68mmol)，对-甲苯磺 酸甲醋（38. 10g，204mmol)、四丁基溴化按（2. 63g，8. 16mmol)，搅拌均勾，室温下加入氢氧 化钾水溶液（16. OOg氢氧化钾+16mL水），加毕，室温反应96小时。
[0142] 反应毕，加入水（16〇1^)，搅拌511^11，静置分层、分液，有机层依次用5%的磷酸 (80mL)、水（160mLX2)洗涤，有机层55°C减压浓缩，蒸除溶剂后得油状物38. 5g，HPLC检测 纯度为60. 7%。经分离鉴定、本实施例的产物同实施例11。
[0143] 实施例23拉科酰胺类似物式I的合成
[0144] 在IL反应瓶中依次加入甲苯（330mL)、化合物式II(20.00g，68mmol)，碘甲烷 (28. 80g, 204mmol)、四丁基溴化按（2. 63g，8. 16mmol)，搅拌均勾，室温下加入氢氧化钠水溶 液（14. OOg氢氧化钠+16mL水），加毕，室温反应21小时。
[0145] 反应毕，加入水（160mL)，搅拌5min，静置分层、分液，有机层依次用5%的磷酸 (80mL)、水（160mLX2)洗涤，有机层55°C减压浓缩，蒸除溶剂后得油状物41. 5g，HPLC检测 纯度为58. 8%。经分离鉴定、本实施例的产物同实施例11。
[0146] 实施例24拉科酰胺类似物式I的合成
[0147] 在IL反应瓶中依次加入甲苯（330mL)、化合物式II(20.00g，68mmol)，硫酸二甲酯 (25. IOg, 204mmol)、四丁基溴化按（2. 63g，8. 16mmol)，搅拌均勾，室温下加入氢氧化钠水溶 液（14. OOg氢氧化钠+16mL水），加毕，室温反应21小时。
[0148] 反应毕，加入水（16〇1^)，搅拌511^11，静置分层、分液，有机层依次用5%的磷酸 (80mL)、水（160mLX2)洗涤，有机层55°C减压浓缩，蒸除溶剂后得油状物43. 5g，HPLC检测 纯度为57. 6%。经分离鉴定、本实施例的产物同实施例11。
[0149] 实施例25拉科酰胺类似物式I正相柱分离纯化
[0150] 用100g 100-200目硅胶湿法装柱（硅胶柱，30mm*400mm)，取实施例11中所得油 状物即式I化合物粗品（4g)湿法上样，用正己烷：乙酸乙酯=3:1 (体积比）的混合液作为 流动相，进行洗脱，用荧光薄层硅胶板检测，洗脱7个柱体积时，荧光薄层硅胶板检测到目 标产品，收集洗脱液，减压浓缩后，得到拉科酰胺类似物式I化合物0. 401g，HPLC检测纯度 为99. 6%，收率10. 0%，如图5所示。
[0151] 实施例26拉科酰胺类似物式I制备液相分离纯化
[0152] 用Varian SD-I制备液相系统进行纯化，选用色谱柱Varian L&L4002 (内径 50mm*200mm)，自装填料为160.0 g PLRP-S (粒径10 μπι，孔径IOnm)。色谱条件如下：流动相 体系A为水，B为甲醇，流速为100mL/min，检测波长为210nm，柱温为室温，取实施例11中所 得式I化合物粗品IOg上样，梯度洗脱参数如下：〇 - 15min，A:B = 30:70 ;15 - 55min，A:B =30:70 - 80:20;55 - 65111丨11，六:8 = 90:10，根据紫外检测结果，收集25.0111丨11-26.111^11 的洗脱液。将洗脱液减压浓缩，得到拉科酰胺类似物式I化合物I. 21g，HPLC检测纯度为 99. 7%，收率12. 1%。所得化合物经鉴定同实施例25。
[0153] 结构鉴定
[0154] 采用沃特斯公司超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用仪（Q-Tof Premier) 对实施例5或25分离出的产物式I进行分子量测定，如图1所示，式I化合物[M+H]计算 结果为323. 1971，实际检测结果[M+H]为323. 1960,实际检测结果与计算结果一致。
[0155]
[0156] 式 I
[0157] 采用BRUKER核磁共振波谱仪AVANCE III400对实施例5或25分离出的产物 式I进行测定，其氢谱如图2所示，其碳谱如图3所示，其二维谱如图4所示，式I的核磁 鉴定结果氢和碳的核磁信号归属结果见表1，碳编号如式I所示。一、二维核磁数据表明 C-13 (34. 7, 33. 2)所连的 3Η(3· 00, 2. 74)与 C-3 (170. 6, 170.1 )、C-5 (51. 9, 50. 3)有远程相 关，因此推断该化合物结构为式I。
[0158] 表 1
[0159]
[0161] 实施例27 :作为标准品用于甲基化反应步骤的反应终点控制
[0162] 将式I标准品用乙腈溶解，配制成0. 3mg/mL的溶液，并与由化合物II制备化 合物III的甲基化反应3小时后的反应液（在IL反应瓶中依次加入甲苯（330mL)、化合 物式 II (20. 00g，68mmol)，对甲苯磺酸甲醋（38. IOg, 204mmol)、四丁基溴化按（2. 63g， 8. 16mmol)，搅拌均匀，室温下加入氢氧化钾水溶液（11. 5g氢氧化钾+11. 5mL水），加毕，室 温反应3小时）按如下条件分别进行HPLC检测，根据对照品色谱图中式I的保留时间确 定 供试品反应液中该杂质的峰，并按照面积归一法计算式I的含量。
[0163] 其中HPLC参数为：
[0164] 色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（Agilent XDB-C18, 250*4. 6mm，5um)
[0165] 流动相：0· OlM磷酸二氢钾（pH 3· 0)和乙腈
[0166] 柱温：25°C
[0167] 流速：1. OmT ,/mi η
[0168] 运行时间：20min
[0169] 检测波长：2IOnm
[0170]
[0171] 测得式I含量为0.95%，在内控规定限度范围内，终止反应。
[0172] 实施例28 :作为标准品用于甲基化反应产物的质量控制
[0173] 将式I标准品和由化合物II制备化合物III的甲基化反应产物均用乙腈溶解，配 制成浓度为〇. 3mg/mL的溶液，按如下条件分别进行HPLC检测，记录色谱图至主成分峰保留 时间的3倍；控制拉科酰胺原料药中式I化合物单个最大杂质峰面积不得大于式I化合物 标准品溶液峰面积的0. 1%，总杂质峰面积之和不得大于式I化合物标准品溶液峰面积的 1. 0%。根据对照品色谱图中式I的保留时间确定甲基化反应产物中该杂质的峰，并按照面 积归一法计算式I的含量。
[0174] 其中HPLC参数为：
[0175] 色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（Agilent XDB-C18, 250*4. 6mm，5um)
[0176] 流动相：0· OlM磷酸二氢钾（pH 3· 0)和乙腈
[0177] 柱温：25°C
[0178] 流速：1. OmT ,/mi η
[0179] 运行时间：20min
[0180] 检测波长：2IOnm
[0181] 按如下梯度运行：
[0182]
[0183] 测得式I含量为0. 98%，在内控规定限度范围内，可以用于下一步反应。
[0184] 实施例29 :作为标准品用于拉科酰胺的质量控制
[0185] 将式I标准品溶液和拉科酰胺原料药用乙腈：甲醇按体积比为80:20的混合溶液 溶解，配成0. 3mg/mL的溶液。按如下条件分别进行HPLC检测，记录色谱图至主成分峰保留 时间的3倍；控制拉科酰胺原料药中式I化合物单个最大杂质峰面积不得大于式I化合物 标准品溶液峰面积的0. 1%，总杂质峰面积之和不得大于式I化合物标准品溶液峰面积的 1. 0%。根据对照品色谱图中式I的保留时间确定该拉科酰胺原料药的溶液中该杂质的峰， 并按照面积归一法计算式I的含量。
[0186] 其中HPLC参数为：
[0187] 色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（Agilent XDB-C18, 250*4. 6mm，5um)
[0188] 流动相：乙腈/甲醇/0· OlM磷酸氢二铵=20/5/75(体积比），pH为7.0和乙腈/ 甲醇=80/20(体积比）
[0189] 柱温：25°C
[0190] 流速：1. OmT ,/mi η
[0191] 运行时间：20min
[0192] 检测波长：2IOnm
[0193] 按如下梯度运行：
[0194]
[0195] 检测结果如下表所示：
[0196]
[0197] 上述产品的批号为购于上^$第一生彳i药业有k公司生产的拉科酰胺原料药的产 品批号。
【主权项】
1. 一种如式I所示的拉科酰胺类似物的分离方法，其包括下列步骤：(a) 将拉科酰胺类似物的反应母液进行水洗、酸洗再水洗； (b) 减压浓缩蒸除有机溶剂，得到油状物； (c) 将所述的油状物进行正相柱层析或高效液相制备色谱，得到式I化合物即可； 所述的拉科酰胺类似物的反应母液的制备方法，包括下述步骤：在有机溶剂和水的两 相溶剂中，在碱和相转移催化剂的存在下，将式II化合物与甲基化试剂进行取代反应，得 到即可；2. 如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，在所述的分离方法中，所述的酸为经水 稀释后的fe; 和/或，在所述的分离方法中，所述的正相柱层析的条件为：流动相为正己烷或石油 醚，与乙酸乙酯的混合液，进行洗脱； 和/或，在所述的分离方法中，所述的高效液相制备色谱的条件为：流动相A为乙腈或 甲醇，流动相B为水，进行梯度洗脱。3. 如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，在所述的分离方法中，所述的正相柱层 析的色谱柱的内径为30mm ; 和/或，在所述的分离方法中，所述的正相柱层析的色谱柱的长度为400mm ; 和/或，在所述的分离方法中，所述的正相柱层析的填料为硅胶。4. 如权利要求2所述的分离方法，其特征在于，在所述的分离方法中，当所述的流动相 为正己烷和乙酸乙酯时，正己烷和乙酸乙酯的体积比为2~5 ;当所述的流动相为石油醚和 乙酸乙酯时，石油醚和乙酸乙酯的体积比为2~4 ; 和/或，在所述的分离方法中，所述的正相柱层析的洗脱体积为5~10个柱体积。5. 如权利要求2所述的分离方法，其特征在于，在所述的分离方法中，所述的正相柱层 析的洗脱液经蒸馏除去溶剂，得到式I化合物。6. 如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，在所述的分离方法中，所述的高效液相 制备色谱的色谱柱为Varian L&L4002 ; 和/或，在所述的分离方法中，所述的高效液相制备色谱的色谱柱的内径为50_ ; 和/或，在所述的分离方法中，所述的高效液相制备色谱的色谱柱的长度为200_ ; 和/或，在所述的分离方法中，所述的高效液相制备色谱的填料为PLRP-S ;所述的高效 液相制备色谱的填料的粒径为10 μ m，孔径为10nm。7. 如权利要求2所述的分离方法，其特征在于，在所述的分离方法中，所述的梯度洗脱 为 O - 15min，A:B = 30:70 ;15 - 55min，A:B = 30:70 - 80:20 ;55 - 65min，A:B = 90:10， 进行线性梯度洗脱。8. 如权利要求2所述的分离方法，其特征在于，在所述的分离方法中，所述的高效液相 制备色谱的流速为100mL/min ; 和/或，在所述的分离方法中，所述的高效液相制备色谱的检测波长为210nm ; 和/或，在所述的分离方法中，所述的高效液相制备色谱的温度为25°C~35°C。9. 如权利要求2所述的分离方法，其特征在于，在所述的分离方法中，所述的高效液相 制备色谱的洗脱液经蒸馏除去溶剂，得到式I化合物。10. 如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，在所述的拉科酰胺类似物的反应母液 的制备方法中，所述的有机溶剂为甲苯或二氯甲烷； 和/或，在所述的拉科酰胺类似物的反应母液的制备方法中，所述的有机溶剂与式II 化合物的体积摩尔比为4L/mol~5L/mol ; 和/或，在所述的拉科酰胺类似物的反应母液的制备方法中，所述的水与式II化合物 的体积摩尔比为〇. lL/mol~0. 5L/mol ; 和/或，在所述的拉科酰胺类似物的反应母液的制备方法中，所述的有机溶剂与所述 的水的体积比为17~28 ; 和/或，在所述的拉科酰胺类似物的反应母液的制备方法中，所述的碱为无机碱； 和/或，在所述的拉科酰胺类似物的反应母液的制备方法中，所述的碱与式II化合物 的摩尔比为3~5 ; 和/或，在所述的拉科酰胺类似物的反应母液的制备方法中，所述的相转移催化剂为 季铵盐相转移催化剂； 和/或，在所述的拉科酰胺类似物的反应母液的制备方法中，所述的相转移催化剂与 式II化合物的摩尔比为0. 1~0. 15 ; 和/或，在所述的拉科酰胺类似物的反应母液的制备方法中，所述的甲基化试剂为碘 甲烷、硫酸二甲酯和对甲苯磺酸甲酯中的一种或多种； 和/或，在所述的拉科酰胺类似物的反应母液的制备方法中，所述的甲基化试剂与式 Π 化合物的摩尔比为3~5 ; 和/或，在所述的拉科酰胺类似物的反应母液的制备方法中，所述的取代反应的温度 为 0°C~50°C ; 和/或，在所述的拉科酰胺类似物的反应母液的制备方法中，所述的取代反应的时间 为 3h ~100h。
【专利摘要】本发明公开了一种拉科酰胺类似物的分离方法。本发明提供了一种如式I所示的拉科酰胺类似物的分离方法，其包括下列步骤：(a)将拉科酰胺类似物的反应母液进行水洗、酸洗再水洗；(b)减压浓缩蒸除有机溶剂，得到油状物；(c)将所述的油状物进行正相柱层析或高效液相制备色谱，得到式I化合物即可；所述的拉科酰胺类似物的反应母液的制备方法，包括下述步骤：在有机溶剂和水的两相溶剂中，在碱和相转移催化剂的存在下，将式II化合物与甲基化试剂进行取代反应，得到即可。本发明的如式I所示的拉科酰胺类似物是对拉科酰胺进行质量控制的必需品；本发明的分离方法可以高效地分离得到上述的类似物。
【IPC分类】C07C271/22, C07C269/08, C07C269/06
【公开号】CN104892460
【申请号】CN201510355245
【发明人】黄臻辉, 袁永雷, 谢建树, 魏宪民
【申请人】上海上药第一生化药业有限公司, 上海医药集团股份有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月24日
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