一种治疗癌症的硒化白藜芦醇制剂的制作方法
一种治疗癌症的硒化白藜芦醇制剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种治疗癌症的药物，尤其是一种治疗癌症的以碱金属离子硒配合物 为功能团的硒化白藜芦醇制剂。
【背景技术】
[0002] 癌症是严重威胁着人类的健康和生命。据世界卫生组织统计，全世界每年死于癌 症的患者约500万，药物治疗是治疗癌症的有效疗法之一。目前已研究出对癌症有积极效 果的多种药物，但是其治疗效果并不尽如人意，且目前对多种癌症具有普遍治疗效果的药 物还很少。研发出对癌症，尤其是多种癌症，有良好效果的药物成为研究的热点和难点。
[0003] 反式白藜芦醇（活性高于顺式白藜芦醇）系亨有盛誉的功能性多酚类化合物（主 要来源于葡萄（红葡萄酒）、虎杖、花生、桑椹等植物）。反式白藜芦醇是一种生物性很强的 天然多酚类物质，又称为芪三酚。经硒强化的硒化白藜芦醇制剂更兼有硒化合物的诸多生 物功能，且超大剂量服用无毒副作用，是不可多得的有机硒化合物。白藜芦醇原本在国际上 作为肿瘤的化学预防剂使用，也是对降低血小板聚集，预防和治疗动脉粥样硬化、心脑血管 疾病的化学预防剂。美国农业部的研究结果表明，花生红衣与仁中也含有相当多的白藜芦 醇。白藜芦醇的实验研究已经证实具有对心血管疾病和癌症的有益作用。白藜芦醇对激素 依赖性肿瘤有明显的预防作用。还可对骨质疏松、痤疮及老年痴呆症有预防作用，具有抗病 毒及免疫调节作用。对人体内部一种单体抗衰老酶起作用，进而发挥预防各种年龄相关疾 病、延长预期寿命的潜在作用。
[0004] 但是，据报道，传统的白藜芦醇对癌症的治疗具有选择性且效果有限。[参见： Cancer-specific Therapeutic Potential of Resveratrol !Metabolic Approach against Hallmarks of Cancerhttp ：//functionalfoodscenter. net/files/73514409.pdf.此 外，另一些研究表明尽管白藜芦醇在体外培养的细胞中具有抗肿瘤作用，在某些动物模 型中对肿瘤的抑制作用可能是无效的。（参见：Cancerprevention andtreatment with resveratrol ：from rodent studies to clinicaltrials，Cancer Prev Res May 20092 ； 409).
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种能够有效作用于癌细胞的以碱金属离子硒配合物为 功能团的硒化白藜芦醇制剂。
[0006] -种治疗癌症的硒化白藜芦醇，具有如下结构：
[0007]
[0008] 其中位置3,4, 5上的羟基可以被取代，3,4, 5至少有一个位置被R取代，
[0009] 其中，R为碱金属离子硒配合物
[0010] 一种所述的治疗癌症的硒化白藜芦醇的制备方法，包括如下步骤：
[0011] A.将所述反式白藜芦醇至少与一种金属无机碱反应，获得芪三酚羟酸基盐：.
[0012] B.将获得之芪三酚羟酸基盐与SeO2反应，获得所述的以碱金属离子硒配合物为功 能团的反式硒化白藜芦醇制剂。
[0013] 优选地，所述步骤A的金属无机碱为氢氧化钠，氢氧化钾或氢氧化镁。
[0014] 优选地，所述步骤A的反应温度为80°C~150°C，所述步骤B的反应温度为 120。。~360。。。
[0015] 优选地，所述步骤A中的反式白藜芦醇纯度彡99%。
[0016] 优选地，所述步骤B中所得的所述以碱金属离子硒配合物为功能团的反式硒化 白藜芦醇制剂包括> 80% (质量分数）硒化反式白藜芦醇，< 8 %硒化顺式白藜芦醇，及 彡10%的高纯白藜芦醇（纯度彡99% )。
[0017] 所述的硒化白藜芦醇在治疗癌症中的应用。
[0018] 本发明的有益效果：本发明的硒化白藜芦醇制剂在杀灭癌细胞以及提高人体免 疫力方面具有突破性的功效，对于多种癌症如：肺癌、淋巴癌、胃癌、肝癌、小肠癌、大肠癌及 妇科癌症等具有普遍的治疗作用，取得了良好的治疗效果。
[0019] 本发明的这些目的，特点，和优点将会在下面的【具体实施方式】，附图，和权利要求 中详细的揭露。
【附图说明】
[0020] 图1为根据本发明实施例获得的以碱金属离子硒配合物为功能团的硒化白藜芦 醇制剂的高效液相色谱图。
【具体实施方式】
[0021] 根据本发明的一个较佳实施例，一种治疗癌症的反式硒化白藜芦醇制剂，包括芪 三酚羟酸基及以碱金属离子硒配合物为功能团。
[0022] 根据本发明的又一较佳实施例，所述以碱金属离子硒配合物为功能团的反式硒化 白藜芦醇制剂，其制备方法包括如下步骤：
[0023] A.将高纯度（彡99% )反式白藜芦醇至少与一种金属无机碱反应，获得芪三酚羟 酸基盐；
[0024] B.将获得之芪三酚羟酸基盐与SeO2反应，获得所述的以碱金属离子硒配合物为功 能团的硒化反式白藜芦醇和硒化顺式白藜芦醇，即为所述以碱金属离子硒配合物为功能团 的高硒含量硒化反式白藜芦醇复合制剂。
[0025] 优选地，所述硒化白藜芦醇复合制剂商品中：硒化反式白藜芦醇> 80% (质量分 数），硒化式白藜芦醇<8%，另有彡10%的高纯白藜芦醇（彡99%)。
[0026] 其中，
[0027] 所述顺式白藜芦醇
[0028] 所述硒化顺式白藜芦醇
[0029] 所述碱金属离子硒配合物功能匡
[0030] 根据本发明的又一较佳实施例，所述反应底物反式白藜芦醇（比顺式白藜芦醇活 性高）、反式硒化白藜芦醇制剂及碱金属离子硒配合物为功能团的结构分别为：
[0031]
[0032] 反式白藜芦醇Resveratrol C14H1203228. 25硒化后：反式硒化白藜芦醇制剂：
[0033]
[0034] 所述碱金属离子硒配合物功能团
[0035] 说明：R的位置可以分别位于3、4、5位置，在反式硒化白藜芦醇合成中，随着硒含 量的增加，合成反应趋于激烈，反应活性增高，3、4、5位置均可同时接上两个R，或3、4、或4、 5、或3、5 (视Ph值之控制），此时反式硒化白藜芦醇的硒含量可达36. 6%。
[0036] 所述碱金属离子硒配合物为功能团
[0037] 实施例1
[0038] A.将高纯度99% )反式白藜芦醇至少与氢氧化钠反应，获得芪三酚羟酸基 钠，其中，反式白藜芦醇：氢氧化钠=1 : 0.25(质量比），反应温度控制在120°C，时间 180s，获得芪三酚羟酸基钠盐；
[0039] B.将获得之芪三酚羟酸基钠与SeO2反应，获得所述的以碱金属离子硒配合物为功 能团的反式硒化白藜芦醇制剂（质量分数> 80% )，和硒化顺式白藜芦醇制剂8% )， 其中，芪三酚羟酸基钠盐：SeO2=I : 0.35,反应温度控制在280°C，时间250s，冷却后，获得 所述的以碱金属离子硒配合物为功能团的高硒含量硒化反式白藜芦醇复合制剂。
[0040] 其中，在出厂硒化白藜芦醇复合制剂商品中：硒化反式白藜芦醇的质量分数 彡80%，硒化顺式白藜芦醇的质量分数< 8%，另有彡1. 0%的高纯白藜芦醇（彡99% )。
[0041] 实施例2
[0042] A.将高纯度99% )反式白藜芦醇至少与氢氧化钾反应，获得芪三酚羟酸基 钾，其中，反式白藜芦醇：氢氧化钾=1 : 0.25(质量比），反应温度控制在120°C，时间 180s，获得芪三酚羟酸基钾盐；
[0043] B.将获得之芪三酚羟酸基钾与SeO2反应，获得所述的以碱金属离子硒配合物为功 能团的反式硒化白藜芦醇制剂（质量分数> 80% )，和硒化顺式白藜芦醇制剂8% )，其 中，芪三酚羟酸基钾盐：SeO2=I : 0.35(质量比），反应温度控制在280°C，时间250s，冷却 后，获得所述的以碱金属离子硒配合物为功能团的高硒含量硒化反式白藜芦醇复合制剂。
[0044] 其中，在出厂硒化白藜芦醇复合制剂商品中：硒化反式白藜芦醇的质量分数 彡80%，硒化顺式白藜芦醇的质量分数< 8%，另有彡10%的高纯白藜芦醇（彡99% )。
[0045] 实施例3
[0046] A.将高纯度99% )反式白藜芦醇至少与氢氧化镁反应，获得芪三酚羟酸基 镁，其中，反式白藜芦醇：氢 氧化镁=1 : 0.25(质量比），反应温度控制在120°C，时间 180s，获得芪三酚羟酸基镁盐；
[0047] B.将获得之芪三酚羟酸基镁与SeO2反应，获得所述的以碱金属离子硒配合物为功 能团的反式硒化白藜芦醇制剂（质量分数> 80% )，和硒化顺式白藜芦醇制剂8% )，其 中，芪三酚羟酸基镁盐：SeO2=I : 0.35(质量比），反应温度控制在280°C，时间250s，冷却 后，获得所述的以碱金属离子硒配合物为功能团的高硒含量硒化反式白藜芦醇复合制剂。
[0048] 其中，在出厂硒化白藜芦醇复合制剂商品中：硒化反式白藜芦醇的质量分数 彡80%，硒化顺式白藜芦醇的质量分数< 8%，另有彡10%的高纯白藜芦醇（彡99% )。 [0049] 药物对不同志愿者的治疗效果
[0050] 例 1 :
[0051] 志愿者1性别：女 年龄：58岁
[0052] 每天早晚两次口服所述硒化白藜芦醇制剂，每次0. 4g，其中，所述硒化白藜芦醇根 据本发明的实施例1制得。
[0053] CT 胸部增强报告（服药前）
[0054] 报告日期：2012-08-31
[0055] 临床信息："左肺腺癌伴鳞样分化"
[0056] 检查方法及部位
[0057] 影像学表现
[0058] 1.左肺门肿块与肺不张分界不清，肺门向外隆突肿块约32X19mmaM27)。
[0059] 2.纵隔5组淋巴结肿大为23 X 14mm (頂15)。
[0060] 3.扫及肝内多发低密度灶，有囊肿。
[0061] 超声检查报告单（服药后）
[0062] 报告日期：2012-11-12
[0063] 影像学表现（与2〇12年8月3I日对比）：
[0064] 1.左肺门肿块与肺不张分界清晰，肺门向外隆突肿块减小为llX6mmaM27)。
[0065] 2.纵隔5组淋巴结肿大为23 X 14mm (頂15)。
[0066] 3.肝内无多发低密度灶，囊肿消失。
[0067] 例 2 :
[0068] 志愿者2性别：男年龄：51
[0069] 每天早晚两次口服所述硒化白藜芦醇制剂，每次0. 4g，其中，所述硒化白藜芦醇根 据本发明的实施例2制得。
[0070] 检查日期：2012-08-21 (服药前）
[0071] 放射学表现：
[0072] 小肠腺癌术后改变，左下腹吻合口处FDG浓聚影，复发；
[0073] 腹盆腔多个代谢增高的淋巴结，考虑转移，考虑肿瘤进展。
[0074] 脾脏肿大；
[0075] 两肺陈旧灶。
[0076] 诊断：小肠腺癌术后复发，肿瘤转移。
[0077] 放射科影像检查报告单（服药后）
[0078] 报告时间：2012-12-13
[0079] 临床诊断：小肠腺癌切除术后腹腔多发
[0080] 放射学表现：（与2012年8月21日检查结果对比）
[0081] 术区见高密度缝合线影；吻合口未见明显增厚，未见异常强化；
[0082] 腹盆腔未见肿大淋巴结；
[0083] 肝左叶未见囊肿；
[0084] 脾脏肿大体积减小、密度正常；
[0085] 肺部无陈旧灶。
[0086] 放射学诊断：小肠术后改变，未见明显复发或转移
[0087] 例 3 :
[0088] 志愿者3 :淋巴癌患者 性别：男 年龄：63岁
[0089] 每天早晚两次口服所述硒化白藜芦醇制剂，每次0. 4g，其中，所述硒化白藜芦醇根 据本发明的实施例3制得。
[0090] 报告日期：2013-02-25 (服药前）
[0091] 临床诊断：颅内多发占位
[0092] 检测项目：CT
[0093] 检查结果：
[0094] 1.左侧甲状腺高代谢结节，为原发恶性肿瘤；脑内多发占位并代谢增高，符合恶 性肿瘤影像学表现；
[0095] 2.双侧颌下，咽旁间隙，颈静脉间隙、颈根部淋巴结肿大及并部分代谢增高，多考 虑转移；
[0096] 3.右肺上叶、下叶小结节。
[0097] 报告日期：2013-05-15 (服药后）
[0098] 检查结果：
[0099] 1.头颅形态大小正常，与前片（2013-02-28检查结果）相比，病灶缩小，余脑实质 未见明显异常强化影；
[0100] 2.双侧颌下，咽旁间隙，颈静脉间隙、颈根部淋巴结体积减小；
[0101] 3.右肺上叶、下叶未见结节。
[0102] 诊断：脑内多发占位性病变治疗后改变
[0103] 报告日期：2013-05-23 (服药后）
[0104] 1.病灶缩小，余脑实质未见异常强化影；
[0105] 2.双侧颌下，咽旁间隙，颈静脉间隙、颈根部淋巴结体积正常；
[0106] 3.右肺上叶、下叶未见结节。
[0107] 诊断：比服药前有明显好转。
[0108] 例4:
[0109] 每天早晚两次口服所述硒化白藜芦醇制剂，每次〇. 4g，其中，所述硒化白藜芦醇根 据本发明的实施例1制得。
[0110] 志愿者4: 性别：女 年龄：57
[0111] 临床诊断：肿瘤 检查部位和名称：上腹部CT，CT重建
[0112] 报告日期：2013-11-13 (服药前）
[0113] 放射学表现：肝内见多发大小不一略低密度灶，最大截面积约97*61_，造影后呈 不均匀强化。
[0114] 放射学诊断：1.肝内转移瘤。
[0115] 报告日期：2013-12-16 (服药后）
[0116] 放射学表现：肝内略低密度灶大部分已消失，最大截面积为51*34mm。
[0117] 放射学诊断：1.肝脏内大部分肿瘤消失，且肿瘤体积较服药前减小。
[0118] 值得提出的是，据统计，将本发明的治疗癌症的硒化白藜芦醇制剂按照一定剂量 给100个志愿者（患有包括肺癌、淋巴癌、胃癌、肝癌、小肠癌、大肠癌及妇科癌症等）服用， 癌症症状减轻者达84%，其中治愈者达62%，未见明显副作用。
[0119] 通过上述实施例，本发明的目的已经被完全有效的达到了。熟悉该项技艺的人士 应该明白本发明包括但不限于附图和上面【具体实施方式】中描述的内容。任何不偏离本发明 的功能和结构原理的修改都将包括在权利要求书的范围中。
[0120] 目的：观察大鼠灌胃受试物P13后的中毒反应及死亡情况，用于初步评价受试物 P13安全性。
[0121] 方法：挑选健康的50只SD大鼠为试验动物，雌雄各半，随机分为5组，分别为剂量 组 I (194mg/kg)、剂量组 2 (324mg / kg)、剂量组 3 (540mg/kg)、剂量组 4 (900mg/kg)、剂量组 5(1500mg / kg)。每组各5只动物，雌雄各半。禁食不禁水过夜后，大鼠均按lml/lOOgbw 灌胃给药一次。给药后4h内严密观察动物出现的反应及死亡情况。然后每天上、下午各一 次对动物进行死亡和濒死情况观察，连续观察14天。动物死亡及时剖检，其他动物在观察 期结束后进行大体解剖，记录每只动物的大体病理改变。
[0122] 结果：（1)大鼠灌服P13后，观察期剂量组5中雌雄大鼠全部死亡，剂量组4中雄 性大鼠死亡4只，雌性大鼠全部死亡，剂量组3中雄性大鼠无死亡，雌性大鼠有4只动物死 亡，剂量组2中雄性大鼠有1只动物死亡，雌性大鼠有2只动物死亡，剂量组1中雌雄大鼠都 无死亡，其余动物全部存活。（2) 14天观察期结束后进行剖检，其中2200、2202、2203、2302、 1301、1302肝表面粗糙，其余脏器无明显症状。
[0123] 结论：按照国家食品药品监督管理局《【H】GPT1_1化学药物急性毒性试验技术指 导原则》及预实验结果设计剂量进行试验，根据试验结果求得P13对雌雄大鼠急性经口半数 致死剂量（LD 5tl)为：
[0124] 雄性大鼠：677. 58mg/kg，可信限：449. 99_1047mg/kg
[0125] 雌性大鼠：379. 96mg/kg，可信限：252. 94 ~564. 88mg/kg
[0126] 1.试验题目
[0127] P13大鼠急性经口毒性试验。 [0128] 2.试验目的
[0129] 研究P13对大鼠的急性经口半数致死剂量（LD5tl)。同时为亚慢性和慢性毒理学研 究中剂量设计提供依据。
[0130] 3.准则和参考文献
[0131] 本试验参照国家食品药品监督管理局《【H】 GPTl-I化学药物急性毒性试验技术指 导原则》为准则。
[0132] 4.试验机构
[0133] 试验机构：上海西普尔-必凯实验动物有限公司
[0134] 地址：上海市浦东新区金科路3577号
[0135] 邮编：201203
[0136] 电话：021-50793648
[0137] 传真：（021)50793645
[0138] 5.委托单位及联系人
[0139] 委托单位：上海爱启医药技术有限公司
[0140] 地址：上海市张江高科技园区蔡伦路781号1110室
[0141] 联系人：宋获玮
[0142] 联系方式：13386238676
[0143] 6.机构负责人、项目负责人及试验相关人员
[0144] 机构负责人：陈国强
[0145] 地址：金科路3577号邮编：201203
[0146] 电话：50793648 Email ：chenguoqiangislarc. org. cn
[0147] 项目负责人：赵丽亚
[0148] 地址：金科路3577号·邮编：201203
[0149] 电话：50793648Email :[email protected]· org. cn
[0150] 饲育管理负责人：金益
[0151] 地址：金科路3577号邮编：201203
[0152] 电话：50793648Email : jinyiOslarc. org. cn
[0153] 供试品管理负责人：朱晓君
[0154] 电话：50793648Email :[email protected]· org. cn
[0155] 档案管理负责人：南震宇
[0156] 电话：50793648 Email ：nanzhenyuislarc. org. cn
[0157] 给药人员：刘嘉
[0158] 症状观察人员：李伟、刘磊、施祎锴等
[0159] 7.质量保证
[0160] QAU负责人：赵莹
[0161] 地址：金科路3577号 邮编：201203
[0162] 电话：50793648 Email ：zhaoyingislarc. org. cn
[0163] 8.供试品和溶媒
[0164] 8.1供试品
[0165] 中文名：P13
[0166] 英文名：P13
[0167] 批号：20130903
[0168] CAS号：委托方未提供
[0169] 物理性状：固体粉末
[0170] 纯度：委托方未提供
[0171] 提供单位：上海爱启医药技术有限公司
[0172] 提供日期：20130903
[0173] 失效期：20150903
[0174] 接收总量：（包括容器重）55. 497g
[0175] 防护措施：接触供试品的人员应采取适当的防护措施，包括口罩、帽子、手套、工作 服等。
[0176] 贮存条件：室温保存。
[0177] 贮存地点：本机构供试品室。
[0178] 稳定性：委托方确认供试品在存储温度下稳定。
[0179] 剩余供试品处理：试验结束后，剩余供试品返还供试品室按SOP处理。8. 2溶媒
[0180] 名称：超纯水
[0181] 9.试验日程
[0182] 试验启动：2013年09月11日
[0183] 引鼠日期：2013年09月13日
[0184] 试验开始：2013年09月23日
[0185] 试验结束：2013年10月07日
[0186] 报告草稿：2013年11月01日
[0187] 最终报告：2013年11月07日
[0188] 10.材料与方法
[0189] 10. 1试验体系
[0190] 种类：大鼠
[0191] 品系：SD (Sprague Dawley)
[0192] 等级：SPF级，参照中华人民共和国国家标准《GB14922. 2-2011实验动物微生物学 等级监测》。
[0193] 提供单位：上海西普尔-必凯实验动物有限公司
[0194] 实验动物生产许可证号：SCXK (沪）2008-0016
[0195] 实验动物质量合格证号：2008001634592
[0196] 选择理由：大鼠为此类急性毒性试验的公认首选动物，其遗传性状稳定，背景数据 清晰。
[0197] 动物要求：未曾交配，动物健康，符合实验动物质量要求。
[0198] 动物数：引入动物数54只，雌雄各半：使用动物数50只，雌雄各半。
[0199] 体重：引入时雄性动物体重范围100_130g，雌性动物体重范围120_140g。
[0200] 健康检查与适应：动物引入后24小时内进行健康检查，有异常表现的动物立即淘 汰。适应期每笼5只动物，适应时间至少5天。
[0201] 适应期结束后选出50只大鼠作为大鼠急性经口毒性试验的实验动物，开始给药， 其时动物体重为150_180g。
[0202] KX 2试验条件
[0203] 饲育条件：试验场所在本单位三号楼屏障系统3139室2008043-ZYZX饲育架的层 二、层三、层四，实验动物使用许可证号：SYXK(沪）2008-0058。受试动物饲养于塑料笼具 内，适应期动物饲养于规格为L38. 00cmXW32. 5cmxH17. 5cm的笼具内，笼具放置于饲育架 上，饲育架分7层，每层5个笼具，饲育架规格为L167. 0cmXW70.0 cm :XH171. 0cm。给药后 5只1笼饲育。
[0204] 动物房每日使用消毒液擦拭房间地面（消毒液每周更换）。笼具每周更换一次。 用塑料水瓶给水，自由饮水和采食。
[0205] 环境条件：动物室（L6. 2mXW5. 8mXH2. 7m)通过空调机组吸入新鲜空气和 大气排风维持正压；温度为20-26°C，相对湿度为40-70% (房间清洁期除外）：照明： 彡200Lux(明暗各12小时），噪音在60dB以下；换气次数：彡15次/小时；落下菌数在3 个以下（无动物时，直径9cm平皿暴露30分钟）。
[0206] 摄食及饮水：动物饲料为全价营养固体料，由上海西普尔-必凯实验动物有限公 司提供，经高压蒸汽灭菌后给实验动物食用。提供饲料质量检测报告，饲料营养成分和污染 物含量符合国标《GB14924. 3-2010实验动物配合饲利营养成分》和《GB14924. 2-2001实验 动物配合饲料卫生标准》。
[0207] 饮水为本单位净水系统制备的过滤水。水质委托专业机构检测，检测指标符合 《GB5749-2006生活饮用水卫生标准》。
[0208] 动物福利：分组后剩余动物用于其它试验或处以安乐死，试验中濒死动物和试验 结束时存活动物处以安乐死，安乐死均采用二氧化碳窒息方法，尸体委托上海市动物无害 化处理中心处理。
[0209] 10. 3试验方法
[0210] 10. 3.1剂量设计
[0211] 设计5个剂量组，分别为剂量组I (194mg / kg)、剂量组2(324mg/kg)、剂量组 3 (540mg/kg)、剂量组4 (900mg/kg)、剂量组5 (1500mg/kg)。剂量组1、剂量组2、剂量组3、 剂量组 4、剂量 5 动物分别灌胃给予 19. 4ng/mL、32. 4mg/mL、54mg/mL、90mg/mL、150mg / mL 的供试品混悬液，灌胃容积为lml/100g bw,染毒1次。
[0212] 剂量设计依据：按照国家食品药品监督管理局《【H】GPT1_1化学药物急性毒性试 验技术指导原则》及预实验结果设计剂量。预实验中每个剂量经口染毒雌雄各2只动物，结 果显示1500mg/kg中4只动物全部死亡，400mg/kg中有一只动物死亡，200mg/kg无动物死 亡，因此正式试验在200mg/kg与1500mg/kg之间设 计5个剂量。
[0213] 10. 3. 2动物分组
[0214] 适应期结束后对动物分组。
[0215] 分组方法：适应期结束后对所有动物进行称重并计算平均体重。选取一般状态良 好，各剂量组内同性别动物体重差异应小于平均体重的10%，组间同性别动物体重均值差 异应小于5%，标识动物作为原始编码，按照体重从大到小排列，每5只动物分为1个小组， 随机从已划分的"5段"中，每段选取1只动物，组成某个剂量组，记录下选定后的动物新编 码（新编码随机编写，不以体重升序或降序排列）。按原始编码抓取动物，在分组表中找到 相应的组别及新编码，依次放到对应的组内。
[0216] 动物标识：身份识别采用笼卡、苦味酸被毛染色和耳号标记识别。笼卡标识显示动 物编号和剂量组，被毛标识显示组内动物编号的个位0-9,耳号标记显示组内动物编号的个 位0-9和识别组别。剂量设计与动物分组见表1。
[0217] 表1.剂量设计与动物分组表
[0218]
[0219] 10. 3. 3供试品配制
[0220] 使用纯水在蓝盖瓶上标定40mL刻度,备用。
[0221] 染毒当天配制供试品。按照剂量设计计算理论称样量；分别称取供试品置于标定 过的蓝盖瓶中。加少量超纯水搅拌均匀后定容到标定的刻度线。配制结束后，在蓝盖瓶瓶 身贴好标签备用。计算公式：供试品浓度（mg / mL) =剂量（mg / kg) /灌胃容积（mL / kg),理论称样量（mg)=配制体积（mL) X供试品浓度（mg / mL)。
[0222] 表2.所需供试品浓度 [02231
[0224] 10. 3. 4染毒途径、染毒周期及观察期
[0225] 根据人类对供试品的可能接触途径，采用灌胃方式经口染毒，配制的供试品使用 磁力搅拌器搅拌5min后开始给药，给药过程中需持续搅拌。给药容积为10mL/kg体重。 给药前对动物进行称重，计算给药体积。使用量程为5mL、最小刻度为0. 2mL的一次性无菌 注射器进行灌胃，灌胃针头16G。给予含有相应浓度的供试品混悬液。动物分组当日给药， 给药前动物隔夜禁食，不禁水，灌胃后2h恢复进食。染毒一次,观察期为14天,症状均已恢 复，可结束试验。必要时可延长观察期至21天或28天。试验结束时，剂量组1、剂量组2、 剂量组3、剂量组4、剂量组5按染毒末计划解剖动物号（见表3)进行大体解剖。
[0226] 表3.计划解剖动物编号
[0227]
[0228] 10. 3. 5临床观察和检查
[0229] 1)症状观察
[0230] 给药后4h内严密观察，给药后第1天至第14天每天症状观察1次（染毒当日为 〇天）。观察和记录动物皮毛变化、眼和黏膜、呼吸系统、循环系统、神经系统变化，特别是肢 体活动和行为的改变。记录各动物的中毒症状及其发生和缓解、消失时间。发现动物死亡 后，记录死亡时间。
[0231] 每天上、下午各一次对动物进行两次死亡和濒死情况观察。
[0232] 2)体重称量
[0233] 给药当天、观察期间每3天称量一次。
[0234] 3)大体解剖
[0235] 所有的试验动物应进行大体解剖，试验过程中因濒死而处死的动物、死亡动物应 及时进行大体解剖，其他动物在观察期结束后处死并进行大体解剖。记录每只动物的大体 病理改变。
[0236] 10. 4数据处理
[0237] 10. 41用bliss软件统计计算LD5tl值和可信限。
[0238] 11.结果与结论
[0239] 11. 1 结果
[0240] 11. 1. 1临床观察结果
[0241] 5个剂量组的临床症状见附表1。
[0242] 11. 1. 2动物死亡结果统计
[0243] 观察期剂量组5雌雄全部死亡、剂量组4雌性死亡5只，雄性死亡4只，剂量组3雌 性死亡4只，雄性无死亡，剂量组2雌性死亡2只，雄性死亡1只，剂量组1雌雄都无死亡， 其余动物全部存活。见附表2。
[0244] 11. 1.3动物体重
[0245] 给药当天、观察期间每3天称量一次动物体重，见附表3-4。
[0246] 11. 1.5大体解剖结果
[0247] 试验动物进行大体解剖时，6只动物的肝脏出现表面粗糙。见附表5。
[0248] 11. 2 结论
[0249] 11. 2. 1供试品的LD5tl值和可信限
[0250] 按照国家食品药品监督管理局《【H】GPT1_1化学药物急性毒性试验技术指导原则》 及预实验结果设计剂量进行试验，根据试验结果求得P13对雌雄大鼠急性经口半数致死剂 量（LD 5tl)为：
[0251] 雄性大鼠：677. 58mg/kg，可信限：449. 99 ~1047mg / kg
[0252] 雌性大鼠：379. 96mg / kg，可信限：252. 94 ~564. 88mg / kg
[0253] 12.资料存档
[0254] 档案管理负责人：南震宇 电话：50793648
[0255] 归档后，下列资料将在本机构档案室归档后保存10年：
[0256] ?试验计划书及其所有修改页；
[0257] ?原始记录；
[0258] ?最终报告等。
[0259] 此外，供试品留样归档后保存5年，或保存到供试品失效后。
[0260] 如需延长保存时间，由委托方和本机构协商决定具体事宜。
[0261] 13.试验偏离
[0262] 本试验按照计划书SP13001和相关SOP进行，试验中未出现偏离。
[0263] 14.附表
[0264] 附表1.临床症状结果表
[0265]
[0266] 附表3.雄性动物分组时体重对照表
[0267]
[0268] 续附表3.雌性动物分组时体重对照表
[0269]
[0270] 附表4.雄性动物体重变化表 单位：g
[0271]
[0272] 续附表4.雌性动物体重变化表 单位：g
[0273]
[0274] 附表5.雄性动物大体解剖结果表
[0275]
[0276] 续附表5.雌性动物大体解剖结果表
[0277]
【主权项】
1. 一种治疗癌症的硒化白藜芦醇，具有如下结构：其中位置3,4, 5上的羟基可以被取代，3,4, 5至少有一个位置被R取代， 其中，R为碱金属离子硒配合物，2. -种制备如权利要求1所述的硒化白藜芦醇的制备方法，包括如下步骤： A. 将所述反式白藜芦醇至少与一种金属无机碱反应，获得芪三酚羟酸基盐； B. 将获得之芪三酚羟酸基盐与SeO2反应，获得所述的以碱金属离子硒配合物为功能团 的反式硒化白藜芦醇制剂。3. 根据权利要求2所述的制备方法，其中所述步骤A的金属无机碱为氢氧化钠，氢氧化 钾或氢氧化镁。4. 根据权利要求2所述的治疗癌症的硒化白藜芦醇，其中所述步骤A的反应温度为 80°C~150°C，所述步骤B的反应温度为120°C~360°C。5. 根据权利要求2所述的治疗癌症的硒化白藜芦醇，其中，所述步骤A中的反式白藜芦 醇纯度> 99%。6. 根据权利要求2所述的治疗癌症的硒化白藜芦醇，其中所述步骤B中所得的所述以 碱金属离子硒配合物为功能团的反式硒化白藜芦醇制剂包括>80% (质量分数）硒化反式 白藜芦醇，<8%硒化顺式白藜芦醇，及彡10%的高纯白藜芦醇（纯度彡99%)。7. 根据权利要求1所述的硒化白藜芦醇在治疗癌症中的应用。
【专利摘要】一种治疗癌症的反式硒化白藜芦醇具有如下结构：其中位置3，4，5上的羟基可以被取代，3，4，5至少有一个位置被R取代，其中，R为碱金属离子硒配合物，本发明的反式硒化白藜芦醇制剂对多种癌症如肺癌、淋巴癌、胃癌、肝癌、小肠癌、大肠癌及妇科癌症等具有普遍的治疗作用，取得了良好的治疗效果。
【IPC分类】A61P35/00, C07C391/02, A61K31/095
【公开号】CN104892478
【申请号】CN201410080996
【发明人】陈躬, 宋昆元
【申请人】上海爱启生态科技有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年3月6日
【公告号】WO2015131423A1
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种治疗癌症的药物，尤其是一种治疗癌症的以碱金属离子硒配合物 为功能团的硒化白藜芦醇制剂。
【背景技术】
[0002] 癌症是严重威胁着人类的健康和生命。据世界卫生组织统计，全世界每年死于癌 症的患者约500万，药物治疗是治疗癌症的有效疗法之一。目前已研究出对癌症有积极效 果的多种药物，但是其治疗效果并不尽如人意，且目前对多种癌症具有普遍治疗效果的药 物还很少。研发出对癌症，尤其是多种癌症，有良好效果的药物成为研究的热点和难点。
[0003] 反式白藜芦醇（活性高于顺式白藜芦醇）系亨有盛誉的功能性多酚类化合物（主 要来源于葡萄（红葡萄酒）、虎杖、花生、桑椹等植物）。反式白藜芦醇是一种生物性很强的 天然多酚类物质，又称为芪三酚。经硒强化的硒化白藜芦醇制剂更兼有硒化合物的诸多生 物功能，且超大剂量服用无毒副作用，是不可多得的有机硒化合物。白藜芦醇原本在国际上 作为肿瘤的化学预防剂使用，也是对降低血小板聚集，预防和治疗动脉粥样硬化、心脑血管 疾病的化学预防剂。美国农业部的研究结果表明，花生红衣与仁中也含有相当多的白藜芦 醇。白藜芦醇的实验研究已经证实具有对心血管疾病和癌症的有益作用。白藜芦醇对激素 依赖性肿瘤有明显的预防作用。还可对骨质疏松、痤疮及老年痴呆症有预防作用，具有抗病 毒及免疫调节作用。对人体内部一种单体抗衰老酶起作用，进而发挥预防各种年龄相关疾 病、延长预期寿命的潜在作用。
[0004] 但是，据报道，传统的白藜芦醇对癌症的治疗具有选择性且效果有限。[参见： Cancer-specific Therapeutic Potential of Resveratrol !Metabolic Approach against Hallmarks of Cancerhttp ：//functionalfoodscenter. net/files/73514409.pdf.此 外，另一些研究表明尽管白藜芦醇在体外培养的细胞中具有抗肿瘤作用，在某些动物模 型中对肿瘤的抑制作用可能是无效的。（参见：Cancerprevention andtreatment with resveratrol ：from rodent studies to clinicaltrials，Cancer Prev Res May 20092 ； 409).
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种能够有效作用于癌细胞的以碱金属离子硒配合物为 功能团的硒化白藜芦醇制剂。
[0006] -种治疗癌症的硒化白藜芦醇，具有如下结构：
[0007]
[0008] 其中位置3,4, 5上的羟基可以被取代，3,4, 5至少有一个位置被R取代，
[0009] 其中，R为碱金属离子硒配合物
[0010] 一种所述的治疗癌症的硒化白藜芦醇的制备方法，包括如下步骤：
[0011] A.将所述反式白藜芦醇至少与一种金属无机碱反应，获得芪三酚羟酸基盐：.
[0012] B.将获得之芪三酚羟酸基盐与SeO2反应，获得所述的以碱金属离子硒配合物为功 能团的反式硒化白藜芦醇制剂。
[0013] 优选地，所述步骤A的金属无机碱为氢氧化钠，氢氧化钾或氢氧化镁。
[0014] 优选地，所述步骤A的反应温度为80°C~150°C，所述步骤B的反应温度为 120。。~360。。。
[0015] 优选地，所述步骤A中的反式白藜芦醇纯度彡99%。
[0016] 优选地，所述步骤B中所得的所述以碱金属离子硒配合物为功能团的反式硒化 白藜芦醇制剂包括> 80% (质量分数）硒化反式白藜芦醇，< 8 %硒化顺式白藜芦醇，及 彡10%的高纯白藜芦醇（纯度彡99% )。
[0017] 所述的硒化白藜芦醇在治疗癌症中的应用。
[0018] 本发明的有益效果：本发明的硒化白藜芦醇制剂在杀灭癌细胞以及提高人体免 疫力方面具有突破性的功效，对于多种癌症如：肺癌、淋巴癌、胃癌、肝癌、小肠癌、大肠癌及 妇科癌症等具有普遍的治疗作用，取得了良好的治疗效果。
[0019] 本发明的这些目的，特点，和优点将会在下面的【具体实施方式】，附图，和权利要求 中详细的揭露。
【附图说明】
[0020] 图1为根据本发明实施例获得的以碱金属离子硒配合物为功能团的硒化白藜芦 醇制剂的高效液相色谱图。
【具体实施方式】
[0021] 根据本发明的一个较佳实施例，一种治疗癌症的反式硒化白藜芦醇制剂，包括芪 三酚羟酸基及以碱金属离子硒配合物为功能团。
[0022] 根据本发明的又一较佳实施例，所述以碱金属离子硒配合物为功能团的反式硒化 白藜芦醇制剂，其制备方法包括如下步骤：
[0023] A.将高纯度（彡99% )反式白藜芦醇至少与一种金属无机碱反应，获得芪三酚羟 酸基盐；
[0024] B.将获得之芪三酚羟酸基盐与SeO2反应，获得所述的以碱金属离子硒配合物为功 能团的硒化反式白藜芦醇和硒化顺式白藜芦醇，即为所述以碱金属离子硒配合物为功能团 的高硒含量硒化反式白藜芦醇复合制剂。
[0025] 优选地，所述硒化白藜芦醇复合制剂商品中：硒化反式白藜芦醇> 80% (质量分 数），硒化式白藜芦醇<8%，另有彡10%的高纯白藜芦醇（彡99%)。
[0026] 其中，
[0027] 所述顺式白藜芦醇
[0028] 所述硒化顺式白藜芦醇
[0029] 所述碱金属离子硒配合物功能匡
[0030] 根据本发明的又一较佳实施例，所述反应底物反式白藜芦醇（比顺式白藜芦醇活 性高）、反式硒化白藜芦醇制剂及碱金属离子硒配合物为功能团的结构分别为：
[0031]
[0032] 反式白藜芦醇Resveratrol C14H1203228. 25硒化后：反式硒化白藜芦醇制剂：
[0033]
[0034] 所述碱金属离子硒配合物功能团
[0035] 说明：R的位置可以分别位于3、4、5位置，在反式硒化白藜芦醇合成中，随着硒含 量的增加，合成反应趋于激烈，反应活性增高，3、4、5位置均可同时接上两个R，或3、4、或4、 5、或3、5 (视Ph值之控制），此时反式硒化白藜芦醇的硒含量可达36. 6%。
[0036] 所述碱金属离子硒配合物为功能团
[0037] 实施例1
[0038] A.将高纯度99% )反式白藜芦醇至少与氢氧化钠反应，获得芪三酚羟酸基 钠，其中，反式白藜芦醇：氢氧化钠=1 : 0.25(质量比），反应温度控制在120°C，时间 180s，获得芪三酚羟酸基钠盐；
[0039] B.将获得之芪三酚羟酸基钠与SeO2反应，获得所述的以碱金属离子硒配合物为功 能团的反式硒化白藜芦醇制剂（质量分数> 80% )，和硒化顺式白藜芦醇制剂8% )， 其中，芪三酚羟酸基钠盐：SeO2=I : 0.35,反应温度控制在280°C，时间250s，冷却后，获得 所述的以碱金属离子硒配合物为功能团的高硒含量硒化反式白藜芦醇复合制剂。
[0040] 其中，在出厂硒化白藜芦醇复合制剂商品中：硒化反式白藜芦醇的质量分数 彡80%，硒化顺式白藜芦醇的质量分数< 8%，另有彡1. 0%的高纯白藜芦醇（彡99% )。
[0041] 实施例2
[0042] A.将高纯度99% )反式白藜芦醇至少与氢氧化钾反应，获得芪三酚羟酸基 钾，其中，反式白藜芦醇：氢氧化钾=1 : 0.25(质量比），反应温度控制在120°C，时间 180s，获得芪三酚羟酸基钾盐；
[0043] B.将获得之芪三酚羟酸基钾与SeO2反应，获得所述的以碱金属离子硒配合物为功 能团的反式硒化白藜芦醇制剂（质量分数> 80% )，和硒化顺式白藜芦醇制剂8% )，其 中，芪三酚羟酸基钾盐：SeO2=I : 0.35(质量比），反应温度控制在280°C，时间250s，冷却 后，获得所述的以碱金属离子硒配合物为功能团的高硒含量硒化反式白藜芦醇复合制剂。
[0044] 其中，在出厂硒化白藜芦醇复合制剂商品中：硒化反式白藜芦醇的质量分数 彡80%，硒化顺式白藜芦醇的质量分数< 8%，另有彡10%的高纯白藜芦醇（彡99% )。
[0045] 实施例3
[0046] A.将高纯度99% )反式白藜芦醇至少与氢氧化镁反应，获得芪三酚羟酸基 镁，其中，反式白藜芦醇：氢 氧化镁=1 : 0.25(质量比），反应温度控制在120°C，时间 180s，获得芪三酚羟酸基镁盐；
[0047] B.将获得之芪三酚羟酸基镁与SeO2反应，获得所述的以碱金属离子硒配合物为功 能团的反式硒化白藜芦醇制剂（质量分数> 80% )，和硒化顺式白藜芦醇制剂8% )，其 中，芪三酚羟酸基镁盐：SeO2=I : 0.35(质量比），反应温度控制在280°C，时间250s，冷却 后，获得所述的以碱金属离子硒配合物为功能团的高硒含量硒化反式白藜芦醇复合制剂。
[0048] 其中，在出厂硒化白藜芦醇复合制剂商品中：硒化反式白藜芦醇的质量分数 彡80%，硒化顺式白藜芦醇的质量分数< 8%，另有彡10%的高纯白藜芦醇（彡99% )。 [0049] 药物对不同志愿者的治疗效果
[0050] 例 1 :
[0051] 志愿者1性别：女 年龄：58岁
[0052] 每天早晚两次口服所述硒化白藜芦醇制剂，每次0. 4g，其中，所述硒化白藜芦醇根 据本发明的实施例1制得。
[0053] CT 胸部增强报告（服药前）
[0054] 报告日期：2012-08-31
[0055] 临床信息："左肺腺癌伴鳞样分化"
[0056] 检查方法及部位
[0057] 影像学表现
[0058] 1.左肺门肿块与肺不张分界不清，肺门向外隆突肿块约32X19mmaM27)。
[0059] 2.纵隔5组淋巴结肿大为23 X 14mm (頂15)。
[0060] 3.扫及肝内多发低密度灶，有囊肿。
[0061] 超声检查报告单（服药后）
[0062] 报告日期：2012-11-12
[0063] 影像学表现（与2〇12年8月3I日对比）：
[0064] 1.左肺门肿块与肺不张分界清晰，肺门向外隆突肿块减小为llX6mmaM27)。
[0065] 2.纵隔5组淋巴结肿大为23 X 14mm (頂15)。
[0066] 3.肝内无多发低密度灶，囊肿消失。
[0067] 例 2 :
[0068] 志愿者2性别：男年龄：51
[0069] 每天早晚两次口服所述硒化白藜芦醇制剂，每次0. 4g，其中，所述硒化白藜芦醇根 据本发明的实施例2制得。
[0070] 检查日期：2012-08-21 (服药前）
[0071] 放射学表现：
[0072] 小肠腺癌术后改变，左下腹吻合口处FDG浓聚影，复发；
[0073] 腹盆腔多个代谢增高的淋巴结，考虑转移，考虑肿瘤进展。
[0074] 脾脏肿大；
[0075] 两肺陈旧灶。
[0076] 诊断：小肠腺癌术后复发，肿瘤转移。
[0077] 放射科影像检查报告单（服药后）
[0078] 报告时间：2012-12-13
[0079] 临床诊断：小肠腺癌切除术后腹腔多发
[0080] 放射学表现：（与2012年8月21日检查结果对比）
[0081] 术区见高密度缝合线影；吻合口未见明显增厚，未见异常强化；
[0082] 腹盆腔未见肿大淋巴结；
[0083] 肝左叶未见囊肿；
[0084] 脾脏肿大体积减小、密度正常；
[0085] 肺部无陈旧灶。
[0086] 放射学诊断：小肠术后改变，未见明显复发或转移
[0087] 例 3 :
[0088] 志愿者3 :淋巴癌患者 性别：男 年龄：63岁
[0089] 每天早晚两次口服所述硒化白藜芦醇制剂，每次0. 4g，其中，所述硒化白藜芦醇根 据本发明的实施例3制得。
[0090] 报告日期：2013-02-25 (服药前）
[0091] 临床诊断：颅内多发占位
[0092] 检测项目：CT
[0093] 检查结果：
[0094] 1.左侧甲状腺高代谢结节，为原发恶性肿瘤；脑内多发占位并代谢增高，符合恶 性肿瘤影像学表现；
[0095] 2.双侧颌下，咽旁间隙，颈静脉间隙、颈根部淋巴结肿大及并部分代谢增高，多考 虑转移；
[0096] 3.右肺上叶、下叶小结节。
[0097] 报告日期：2013-05-15 (服药后）
[0098] 检查结果：
[0099] 1.头颅形态大小正常，与前片（2013-02-28检查结果）相比，病灶缩小，余脑实质 未见明显异常强化影；
[0100] 2.双侧颌下，咽旁间隙，颈静脉间隙、颈根部淋巴结体积减小；
[0101] 3.右肺上叶、下叶未见结节。
[0102] 诊断：脑内多发占位性病变治疗后改变
[0103] 报告日期：2013-05-23 (服药后）
[0104] 1.病灶缩小，余脑实质未见异常强化影；
[0105] 2.双侧颌下，咽旁间隙，颈静脉间隙、颈根部淋巴结体积正常；
[0106] 3.右肺上叶、下叶未见结节。
[0107] 诊断：比服药前有明显好转。
[0108] 例4:
[0109] 每天早晚两次口服所述硒化白藜芦醇制剂，每次〇. 4g，其中，所述硒化白藜芦醇根 据本发明的实施例1制得。
[0110] 志愿者4: 性别：女 年龄：57
[0111] 临床诊断：肿瘤 检查部位和名称：上腹部CT，CT重建
[0112] 报告日期：2013-11-13 (服药前）
[0113] 放射学表现：肝内见多发大小不一略低密度灶，最大截面积约97*61_，造影后呈 不均匀强化。
[0114] 放射学诊断：1.肝内转移瘤。
[0115] 报告日期：2013-12-16 (服药后）
[0116] 放射学表现：肝内略低密度灶大部分已消失，最大截面积为51*34mm。
[0117] 放射学诊断：1.肝脏内大部分肿瘤消失，且肿瘤体积较服药前减小。
[0118] 值得提出的是，据统计，将本发明的治疗癌症的硒化白藜芦醇制剂按照一定剂量 给100个志愿者（患有包括肺癌、淋巴癌、胃癌、肝癌、小肠癌、大肠癌及妇科癌症等）服用， 癌症症状减轻者达84%，其中治愈者达62%，未见明显副作用。
[0119] 通过上述实施例，本发明的目的已经被完全有效的达到了。熟悉该项技艺的人士 应该明白本发明包括但不限于附图和上面【具体实施方式】中描述的内容。任何不偏离本发明 的功能和结构原理的修改都将包括在权利要求书的范围中。
[0120] 目的：观察大鼠灌胃受试物P13后的中毒反应及死亡情况，用于初步评价受试物 P13安全性。
[0121] 方法：挑选健康的50只SD大鼠为试验动物，雌雄各半，随机分为5组，分别为剂量 组 I (194mg/kg)、剂量组 2 (324mg / kg)、剂量组 3 (540mg/kg)、剂量组 4 (900mg/kg)、剂量组 5(1500mg / kg)。每组各5只动物，雌雄各半。禁食不禁水过夜后，大鼠均按lml/lOOgbw 灌胃给药一次。给药后4h内严密观察动物出现的反应及死亡情况。然后每天上、下午各一 次对动物进行死亡和濒死情况观察，连续观察14天。动物死亡及时剖检，其他动物在观察 期结束后进行大体解剖，记录每只动物的大体病理改变。
[0122] 结果：（1)大鼠灌服P13后，观察期剂量组5中雌雄大鼠全部死亡，剂量组4中雄 性大鼠死亡4只，雌性大鼠全部死亡，剂量组3中雄性大鼠无死亡，雌性大鼠有4只动物死 亡，剂量组2中雄性大鼠有1只动物死亡，雌性大鼠有2只动物死亡，剂量组1中雌雄大鼠都 无死亡，其余动物全部存活。（2) 14天观察期结束后进行剖检，其中2200、2202、2203、2302、 1301、1302肝表面粗糙，其余脏器无明显症状。
[0123] 结论：按照国家食品药品监督管理局《【H】GPT1_1化学药物急性毒性试验技术指 导原则》及预实验结果设计剂量进行试验，根据试验结果求得P13对雌雄大鼠急性经口半数 致死剂量（LD 5tl)为：
[0124] 雄性大鼠：677. 58mg/kg，可信限：449. 99_1047mg/kg
[0125] 雌性大鼠：379. 96mg/kg，可信限：252. 94 ~564. 88mg/kg
[0126] 1.试验题目
[0127] P13大鼠急性经口毒性试验。 [0128] 2.试验目的
[0129] 研究P13对大鼠的急性经口半数致死剂量（LD5tl)。同时为亚慢性和慢性毒理学研 究中剂量设计提供依据。
[0130] 3.准则和参考文献
[0131] 本试验参照国家食品药品监督管理局《【H】 GPTl-I化学药物急性毒性试验技术指 导原则》为准则。
[0132] 4.试验机构
[0133] 试验机构：上海西普尔-必凯实验动物有限公司
[0134] 地址：上海市浦东新区金科路3577号
[0135] 邮编：201203
[0136] 电话：021-50793648
[0137] 传真：（021)50793645
[0138] 5.委托单位及联系人
[0139] 委托单位：上海爱启医药技术有限公司
[0140] 地址：上海市张江高科技园区蔡伦路781号1110室
[0141] 联系人：宋获玮
[0142] 联系方式：13386238676
[0143] 6.机构负责人、项目负责人及试验相关人员
[0144] 机构负责人：陈国强
[0145] 地址：金科路3577号邮编：201203
[0146] 电话：50793648 Email ：chenguoqiangislarc. org. cn
[0147] 项目负责人：赵丽亚
[0148] 地址：金科路3577号·邮编：201203
[0149] 电话：50793648Email :[email protected]· org. cn
[0150] 饲育管理负责人：金益
[0151] 地址：金科路3577号邮编：201203
[0152] 电话：50793648Email : jinyiOslarc. org. cn
[0153] 供试品管理负责人：朱晓君
[0154] 电话：50793648Email :[email protected]· org. cn
[0155] 档案管理负责人：南震宇
[0156] 电话：50793648 Email ：nanzhenyuislarc. org. cn
[0157] 给药人员：刘嘉
[0158] 症状观察人员：李伟、刘磊、施祎锴等
[0159] 7.质量保证
[0160] QAU负责人：赵莹
[0161] 地址：金科路3577号 邮编：201203
[0162] 电话：50793648 Email ：zhaoyingislarc. org. cn
[0163] 8.供试品和溶媒
[0164] 8.1供试品
[0165] 中文名：P13
[0166] 英文名：P13
[0167] 批号：20130903
[0168] CAS号：委托方未提供
[0169] 物理性状：固体粉末
[0170] 纯度：委托方未提供
[0171] 提供单位：上海爱启医药技术有限公司
[0172] 提供日期：20130903
[0173] 失效期：20150903
[0174] 接收总量：（包括容器重）55. 497g
[0175] 防护措施：接触供试品的人员应采取适当的防护措施，包括口罩、帽子、手套、工作 服等。
[0176] 贮存条件：室温保存。
[0177] 贮存地点：本机构供试品室。
[0178] 稳定性：委托方确认供试品在存储温度下稳定。
[0179] 剩余供试品处理：试验结束后，剩余供试品返还供试品室按SOP处理。8. 2溶媒
[0180] 名称：超纯水
[0181] 9.试验日程
[0182] 试验启动：2013年09月11日
[0183] 引鼠日期：2013年09月13日
[0184] 试验开始：2013年09月23日
[0185] 试验结束：2013年10月07日
[0186] 报告草稿：2013年11月01日
[0187] 最终报告：2013年11月07日
[0188] 10.材料与方法
[0189] 10. 1试验体系
[0190] 种类：大鼠
[0191] 品系：SD (Sprague Dawley)
[0192] 等级：SPF级，参照中华人民共和国国家标准《GB14922. 2-2011实验动物微生物学 等级监测》。
[0193] 提供单位：上海西普尔-必凯实验动物有限公司
[0194] 实验动物生产许可证号：SCXK (沪）2008-0016
[0195] 实验动物质量合格证号：2008001634592
[0196] 选择理由：大鼠为此类急性毒性试验的公认首选动物，其遗传性状稳定，背景数据 清晰。
[0197] 动物要求：未曾交配，动物健康，符合实验动物质量要求。
[0198] 动物数：引入动物数54只，雌雄各半：使用动物数50只，雌雄各半。
[0199] 体重：引入时雄性动物体重范围100_130g，雌性动物体重范围120_140g。
[0200] 健康检查与适应：动物引入后24小时内进行健康检查，有异常表现的动物立即淘 汰。适应期每笼5只动物，适应时间至少5天。
[0201] 适应期结束后选出50只大鼠作为大鼠急性经口毒性试验的实验动物，开始给药， 其时动物体重为150_180g。
[0202] KX 2试验条件
[0203] 饲育条件：试验场所在本单位三号楼屏障系统3139室2008043-ZYZX饲育架的层 二、层三、层四，实验动物使用许可证号：SYXK(沪）2008-0058。受试动物饲养于塑料笼具 内，适应期动物饲养于规格为L38. 00cmXW32. 5cmxH17. 5cm的笼具内，笼具放置于饲育架 上，饲育架分7层，每层5个笼具，饲育架规格为L167. 0cmXW70.0 cm :XH171. 0cm。给药后 5只1笼饲育。
[0204] 动物房每日使用消毒液擦拭房间地面（消毒液每周更换）。笼具每周更换一次。 用塑料水瓶给水，自由饮水和采食。
[0205] 环境条件：动物室（L6. 2mXW5. 8mXH2. 7m)通过空调机组吸入新鲜空气和 大气排风维持正压；温度为20-26°C，相对湿度为40-70% (房间清洁期除外）：照明： 彡200Lux(明暗各12小时），噪音在60dB以下；换气次数：彡15次/小时；落下菌数在3 个以下（无动物时，直径9cm平皿暴露30分钟）。
[0206] 摄食及饮水：动物饲料为全价营养固体料，由上海西普尔-必凯实验动物有限公 司提供，经高压蒸汽灭菌后给实验动物食用。提供饲料质量检测报告，饲料营养成分和污染 物含量符合国标《GB14924. 3-2010实验动物配合饲利营养成分》和《GB14924. 2-2001实验 动物配合饲料卫生标准》。
[0207] 饮水为本单位净水系统制备的过滤水。水质委托专业机构检测，检测指标符合 《GB5749-2006生活饮用水卫生标准》。
[0208] 动物福利：分组后剩余动物用于其它试验或处以安乐死，试验中濒死动物和试验 结束时存活动物处以安乐死，安乐死均采用二氧化碳窒息方法，尸体委托上海市动物无害 化处理中心处理。
[0209] 10. 3试验方法
[0210] 10. 3.1剂量设计
[0211] 设计5个剂量组，分别为剂量组I (194mg / kg)、剂量组2(324mg/kg)、剂量组 3 (540mg/kg)、剂量组4 (900mg/kg)、剂量组5 (1500mg/kg)。剂量组1、剂量组2、剂量组3、 剂量组 4、剂量 5 动物分别灌胃给予 19. 4ng/mL、32. 4mg/mL、54mg/mL、90mg/mL、150mg / mL 的供试品混悬液，灌胃容积为lml/100g bw,染毒1次。
[0212] 剂量设计依据：按照国家食品药品监督管理局《【H】GPT1_1化学药物急性毒性试 验技术指导原则》及预实验结果设计剂量。预实验中每个剂量经口染毒雌雄各2只动物，结 果显示1500mg/kg中4只动物全部死亡，400mg/kg中有一只动物死亡，200mg/kg无动物死 亡，因此正式试验在200mg/kg与1500mg/kg之间设 计5个剂量。
[0213] 10. 3. 2动物分组
[0214] 适应期结束后对动物分组。
[0215] 分组方法：适应期结束后对所有动物进行称重并计算平均体重。选取一般状态良 好，各剂量组内同性别动物体重差异应小于平均体重的10%，组间同性别动物体重均值差 异应小于5%，标识动物作为原始编码，按照体重从大到小排列，每5只动物分为1个小组， 随机从已划分的"5段"中，每段选取1只动物，组成某个剂量组，记录下选定后的动物新编 码（新编码随机编写，不以体重升序或降序排列）。按原始编码抓取动物，在分组表中找到 相应的组别及新编码，依次放到对应的组内。
[0216] 动物标识：身份识别采用笼卡、苦味酸被毛染色和耳号标记识别。笼卡标识显示动 物编号和剂量组，被毛标识显示组内动物编号的个位0-9,耳号标记显示组内动物编号的个 位0-9和识别组别。剂量设计与动物分组见表1。
[0217] 表1.剂量设计与动物分组表
[0218]
[0219] 10. 3. 3供试品配制
[0220] 使用纯水在蓝盖瓶上标定40mL刻度,备用。
[0221] 染毒当天配制供试品。按照剂量设计计算理论称样量；分别称取供试品置于标定 过的蓝盖瓶中。加少量超纯水搅拌均匀后定容到标定的刻度线。配制结束后，在蓝盖瓶瓶 身贴好标签备用。计算公式：供试品浓度（mg / mL) =剂量（mg / kg) /灌胃容积（mL / kg),理论称样量（mg)=配制体积（mL) X供试品浓度（mg / mL)。
[0222] 表2.所需供试品浓度 [02231
[0224] 10. 3. 4染毒途径、染毒周期及观察期
[0225] 根据人类对供试品的可能接触途径，采用灌胃方式经口染毒，配制的供试品使用 磁力搅拌器搅拌5min后开始给药，给药过程中需持续搅拌。给药容积为10mL/kg体重。 给药前对动物进行称重，计算给药体积。使用量程为5mL、最小刻度为0. 2mL的一次性无菌 注射器进行灌胃，灌胃针头16G。给予含有相应浓度的供试品混悬液。动物分组当日给药， 给药前动物隔夜禁食，不禁水，灌胃后2h恢复进食。染毒一次,观察期为14天,症状均已恢 复，可结束试验。必要时可延长观察期至21天或28天。试验结束时，剂量组1、剂量组2、 剂量组3、剂量组4、剂量组5按染毒末计划解剖动物号（见表3)进行大体解剖。
[0226] 表3.计划解剖动物编号
[0227]
[0228] 10. 3. 5临床观察和检查
[0229] 1)症状观察
[0230] 给药后4h内严密观察，给药后第1天至第14天每天症状观察1次（染毒当日为 〇天）。观察和记录动物皮毛变化、眼和黏膜、呼吸系统、循环系统、神经系统变化，特别是肢 体活动和行为的改变。记录各动物的中毒症状及其发生和缓解、消失时间。发现动物死亡 后，记录死亡时间。
[0231] 每天上、下午各一次对动物进行两次死亡和濒死情况观察。
[0232] 2)体重称量
[0233] 给药当天、观察期间每3天称量一次。
[0234] 3)大体解剖
[0235] 所有的试验动物应进行大体解剖，试验过程中因濒死而处死的动物、死亡动物应 及时进行大体解剖，其他动物在观察期结束后处死并进行大体解剖。记录每只动物的大体 病理改变。
[0236] 10. 4数据处理
[0237] 10. 41用bliss软件统计计算LD5tl值和可信限。
[0238] 11.结果与结论
[0239] 11. 1 结果
[0240] 11. 1. 1临床观察结果
[0241] 5个剂量组的临床症状见附表1。
[0242] 11. 1. 2动物死亡结果统计
[0243] 观察期剂量组5雌雄全部死亡、剂量组4雌性死亡5只，雄性死亡4只，剂量组3雌 性死亡4只，雄性无死亡，剂量组2雌性死亡2只，雄性死亡1只，剂量组1雌雄都无死亡， 其余动物全部存活。见附表2。
[0244] 11. 1.3动物体重
[0245] 给药当天、观察期间每3天称量一次动物体重，见附表3-4。
[0246] 11. 1.5大体解剖结果
[0247] 试验动物进行大体解剖时，6只动物的肝脏出现表面粗糙。见附表5。
[0248] 11. 2 结论
[0249] 11. 2. 1供试品的LD5tl值和可信限
[0250] 按照国家食品药品监督管理局《【H】GPT1_1化学药物急性毒性试验技术指导原则》 及预实验结果设计剂量进行试验，根据试验结果求得P13对雌雄大鼠急性经口半数致死剂 量（LD 5tl)为：
[0251] 雄性大鼠：677. 58mg/kg，可信限：449. 99 ~1047mg / kg
[0252] 雌性大鼠：379. 96mg / kg，可信限：252. 94 ~564. 88mg / kg
[0253] 12.资料存档
[0254] 档案管理负责人：南震宇 电话：50793648
[0255] 归档后，下列资料将在本机构档案室归档后保存10年：
[0256] ?试验计划书及其所有修改页；
[0257] ?原始记录；
[0258] ?最终报告等。
[0259] 此外，供试品留样归档后保存5年，或保存到供试品失效后。
[0260] 如需延长保存时间，由委托方和本机构协商决定具体事宜。
[0261] 13.试验偏离
[0262] 本试验按照计划书SP13001和相关SOP进行，试验中未出现偏离。
[0263] 14.附表
[0264] 附表1.临床症状结果表
[0265]
[0266] 附表3.雄性动物分组时体重对照表
[0267]
[0268] 续附表3.雌性动物分组时体重对照表
[0269]
[0270] 附表4.雄性动物体重变化表 单位：g
[0271]
[0272] 续附表4.雌性动物体重变化表 单位：g
[0273]
[0274] 附表5.雄性动物大体解剖结果表
[0275]
[0276] 续附表5.雌性动物大体解剖结果表
[0277]
【主权项】
1. 一种治疗癌症的硒化白藜芦醇，具有如下结构：其中位置3,4, 5上的羟基可以被取代，3,4, 5至少有一个位置被R取代， 其中，R为碱金属离子硒配合物，2. -种制备如权利要求1所述的硒化白藜芦醇的制备方法，包括如下步骤： A. 将所述反式白藜芦醇至少与一种金属无机碱反应，获得芪三酚羟酸基盐； B. 将获得之芪三酚羟酸基盐与SeO2反应，获得所述的以碱金属离子硒配合物为功能团 的反式硒化白藜芦醇制剂。3. 根据权利要求2所述的制备方法，其中所述步骤A的金属无机碱为氢氧化钠，氢氧化 钾或氢氧化镁。4. 根据权利要求2所述的治疗癌症的硒化白藜芦醇，其中所述步骤A的反应温度为 80°C~150°C，所述步骤B的反应温度为120°C~360°C。5. 根据权利要求2所述的治疗癌症的硒化白藜芦醇，其中，所述步骤A中的反式白藜芦 醇纯度> 99%。6. 根据权利要求2所述的治疗癌症的硒化白藜芦醇，其中所述步骤B中所得的所述以 碱金属离子硒配合物为功能团的反式硒化白藜芦醇制剂包括>80% (质量分数）硒化反式 白藜芦醇，<8%硒化顺式白藜芦醇，及彡10%的高纯白藜芦醇（纯度彡99%)。7. 根据权利要求1所述的硒化白藜芦醇在治疗癌症中的应用。
【专利摘要】一种治疗癌症的反式硒化白藜芦醇具有如下结构：其中位置3，4，5上的羟基可以被取代，3，4，5至少有一个位置被R取代，其中，R为碱金属离子硒配合物，本发明的反式硒化白藜芦醇制剂对多种癌症如肺癌、淋巴癌、胃癌、肝癌、小肠癌、大肠癌及妇科癌症等具有普遍的治疗作用，取得了良好的治疗效果。
【IPC分类】A61P35/00, C07C391/02, A61K31/095
【公开号】CN104892478
【申请号】CN201410080996
【发明人】陈躬, 宋昆元
【申请人】上海爱启生态科技有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年3月6日
【公告号】WO2015131423A1
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