一种新型细胞色素cyp3a4酶特异性探针反应及其应用
一种新型细胞色素cyp3a4酶特异性探针反应及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属医药技术领域，具体涉及一种木脂素类化合物戈米辛A，其可作为细胞色 素CYP3A4酶的特异性探针底物，用于定量检测不同来源生物样本及体内细胞色素CYP3A4 酶活性。
【背景技术】
[0002] 细胞色素P450酶（CytochromeP450,CYP)为一类亚铁血红素一硫醇盐蛋白的超 家族，是人体内最重要的I相药物代谢酶，催化多种内源和外源物质的代谢。该超家族包 含多个亚家族，如CYP1A2,CYP2D6,CYP2C8,CYP2C9,CYP2C19,CYP2E1,CYP3A4 和CYP3A5 等， 参与约80%以上的上市药物的代谢转化，其中经CYP3A亚家族代谢的药物约占50%(Nat RevDrugDiscov. 2005, 4 (10) : 825-833)。人体中主要表达四种CYP3A亚型，分别为CYP3A4、 CYP3A5、CYP3A7及CYP3A43。其中CYP3A4在成人体内总细胞色素CYP酶中含量最高，在体 内各组织器官广泛的分布，相比于人群中表达量低、表达频率低的CYP3A5, 一直被认为是成 年个体的最主要的CYP单酶。由于CYP3A5亚家族与CYP3A4具有83%的高度同源性[Curr DrugMetab. 2008,9:20 - 33]，CYP3A4和CYP3A5两个亚家族通常具有相似的底物识别性， 即某一底物若被CYP3A4催化代谢，也极可能同时被CYP3A5亚型酶代谢。但已有研究发现 CYP3A代谢的底物在这两种单酶的催化性质不尽相同。在人类肝脏中，CYP3A被认为是最 主要的CYP3亚型，且在女性中有更高的表达量。CYP3A5存在基因多态性，其在肝脏中表达 量的个体差异可从〇%到50% ;CYP3A5的表达还存在种族差异，仅三分之一的高加索人（白种 人）和一半以上的非洲裔美国人表达CYP3A5。由此可见，由于遗传因素和非遗传因素的影 响，CYP3A4和CYP3A5亚型酶，无论是其表达量、催化功能，还是代谢贡献率都会存在很大的 个体差异性，这对于CYP3A介导代谢的药物在体内的暴露水平会产生不可忽视的影响。
[0003] 目前，已经发现的或已在体外、体内研究中广泛应用的CYP3A亚家族探针底物，如 咪达唑仑（midazolam)、硝苯地平（nifedipine)、睾酮（testosterone)等，都同时是CYP3A4 和CYP3A5的特异性底物，利用这些探针底物对细胞色素CYP酶进行的评估结果反映的就是 细胞色素CYP3A亚家族各单酶的催化能力的总和。然而，近期研究发现，细胞色素CYP3A5 在某些个体中显现的催化能力甚至与细胞色素CYP3A4的催化能力相当（DrugMetab Dispos. 2002, 30:883-891)，此时利用目前已有的探针底物则会混淆细胞色素CYP3A4和 3A5的催化能力，从而无法清晰地分析细胞色素CYP3A4对特定药物的代谢清除贡献率。
[0004] 此外，在大鼠（细胞色素CYP3A1、细胞色素CYP3A2)、狗(细胞色素CYP3A12、细胞 色素CYP3A26)，兔（细胞色素CYP3A6)，猪（细胞色素CYP3A29)，猴（细胞色素CYP3A64)等 哺乳动物体内，也高表达细胞色素CYP3A4的同功酶，这些酶之间的底物有非常广泛的重叠 性。利用细胞色素CYP3A4的高选择性探针底物也可在体外活性测定方面实现对不同种属 中细胞色素CYP3A4的同功酶的评价与考察。
[0005] 目前，CYP3A4酶活性的体外评价体系主要包括重组单酶、哺乳动物的亚细胞组分 、新鲜分离的肝细胞、肝切片、肝灌流等（ToxicologyinVitro2006, 135-153)，其中已经 商品化的重组细胞色素CYP3A4单酶主要来自于细菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞以及酵母菌 建立的克隆表达体系，而亚细胞组分主要包括微粒体、细胞浆及S9成分。采用这些标准化 的评价体系，结合相应的辅因子(如：NADPH等）和孵育条件，可通过检测探针底物的代谢清 除或产物生成速率，对上述各种体系中表达的CYP3A4酶活性进行表征。
[0006] 此外，采用静脉注射或口服的方式，使待测人或动物服用一定剂量的探针底物，在 一定时间内，搜集血浆和尿液样本，测定其中原型化合物或其代谢产物的含量，以此来作为 整体水平细胞色素CYP3A活性的评价指标。Lin(Pharmacogenetics2001, 11 (9) :781-791) 等人使用咪达唑仑作为体内探针，给健康成年人静脉注射或口服一定剂量之后，发现服药4 小时后的血浆中咪达唑仑浓度与血药浓度曲线下面积（AUC)存在较好的相关性，可以用来 对机体对细胞色素CYP3A介导药物代谢的清除能力进行判断。Furuta(US6905839B2)等人 采用内源性皮质醇作为细胞色素CYP3A的内源性体内探针，通过测定志愿者血浆样品中皮 质醇的浓度和尿液样品中代谢产物6P-羟基皮质醇的浓度，采用尿中6P-羟基皮质醇的 累积量与血浆皮质醇AUC的比值反映体内CYP3A活性大小，发现该指标可以很好的表征体 内细胞色素CYP3A的活性，进而用于不同人体的CYP3A活性标定，对于作为CYP3A底物的已 上市药物，可作为指导该类药物的个体给药剂量调整的重要依据。
[0007] 综上所述，特异性地评估体内外细胞色素CYP3A4代谢酶活性及CYP3A4对特定药 物代谢清除的贡献率的关键在于选择高特异性的探针药物。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一类木脂素类化合物以及其在检测CYP3A4酶活性中的用 途及其检测方法，具体为戈米辛A可作为CYP3A4酶的高特异性探针底物，用于定量测定不 同来源生物样本及体内CYP3A4的酶活。与目前已报道的CYP3A探针/标准底物不同，戈米 辛A具有高特异性表征CYP3A4酶活性的能力，CYP3A5催化活性极微弱可忽略不计。因此 能够高特异性的评价机体或组织中CYP3A4酶对药物的代谢处置能力，对体内外药物代谢 研究具有重要意义。
[0009] 本发明具体提供了一种新型细胞色素CYP3A4酶特异性探针底物，其特征在于：该 探针底物为戈米辛A(GomisinA)，是一种天然木脂素类成分，该化合物的结构如图1所示。
[0010] 本发明还提供了所述新型细胞色素CYP3A4酶特异性探针底物的应用，其特征在 于：采用所述新型细胞色素CYP3A4酶特异性探针底物检测CYPP3A4酶活性：通过定量定时 测定相应代谢产物的生成速率或底物的减少速率实现CYP3A4酶活性的检测。
[0011] 戈米辛A仅能被CYP3A4选择性代谢并生成一个主要代谢产物8-羟基戈米辛A，其 余代谢酶包括CYP3A5均难以催化其代谢，8-羟基化反应符合米氏动力学，其单位时间内的 转化速率可用于定量测定不同生物体系(包括重组单酶体系、人及动物细胞/组织制备液 等）中细胞色素CYP3A4酶的活性。
[0012] 采用重组细胞色素CYP单酶，肝微粒体孵育体系进行考察，通过相关性分析，特异 性抑制实验，重组单酶代谢反应，以及酶反应动力学几方面的证据，证明戈米辛A可特异性 的经CYP3A4酶代谢(如图2所示)，生成8-羟基戈米辛A，高效液相图谱见图3,原形及代谢 产物的质谱图见图4,代谢通路与代谢产物结构见图5。进一步采用各种哺乳动物的新鲜提 取的肝微粒体、原代培养肝细胞、肝切片、肝灌流等代谢评价体系进行考察，发现该代谢 反应具有非常良好的特异性。
[0013] 作为高特异性的细胞色素CYP3A4的探针底物，戈米辛A可以用来检测细胞色素 CYP3A4酶活性，尤其适合用于对细菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞以及酵母菌克隆表达体系生 产的CYP3A4重组酶、多种哺乳动物组织器官来源的微粒体、S-9等制备物中CYP3A4的活性 标定，以及体内CYP3A4活性的标定。
[0014] 本发明还提供了戈米辛A与已有CYP3A4探针底物睾酮、硝苯地平、咪达唑仑在代 谢酶选择性上的优势比较：戈米辛A作为特异性探针底物，在CYP3A4和CYP3A5两种重组 单酶孵育体系中，通过相应代谢产物的酶反应动力学分析(如图6所示)，证明戈米辛A在 CYP3A4与CYP3A5中的最大反应速度（Vm)之比显著高于睾酮、硝苯地平和咪达唑仑(如图7 所示)，表明CYP3A4对戈米辛A的催化效能远远高于CYP3A5的催化效能，即高选择性的被 CYP3A4代谢，而CYP3A5的催化贡献极微弱可忽略不计。
[0015] 本发明所述新型细胞色素CYP3A4酶特异性探针底物的应用，其特征在于，采用所 述新型细胞色素CYP3A4酶特异性探针底物在体外检测生物样本中细胞色素CYP3A4酶活 性，其优选的测定方法及条件为：
[0016] --体系中以戈米辛A中作为探针底物；底物浓度范围为1-500iiM;
[0017] -在pH7. 4且具有辅因子NADPH或其生成体系的孵育体系中，反应温度为 10-60°C之间，优选37°C为最优反应时间；
[0018]--反应时间为5-60min;确保获得相应羟化代谢产物达到定量限且底物转化率 低于20%时终止反应；
[0019] -通过检测单位时间内底物减少量或产物生成量，即底物减少速率或产物生成 速率，作为CYP3A4酶活性的评价指标，实现细胞色素CYP3A4酶活性的检测。
[0020] 其中检测底物减少量或其对应羟化产物生成量的定量检测方法为紫外吸收光谱、 质谱、放射性同位素示踪技术、荧光激发光谱、蒸发光散射或电化学光谱检测。所有检测器 包括紫外吸收光谱检测器、质谱、放射性同位素示踪技术、蒸发光散射或电化学光谱检测器 中的一种或多种串联。
[0021] 本发明所述新型细胞色素CYP3A4酶特异性探针底物还可以检测体内细胞色素 CYP3A4酶活性，其优选的测定方法及条件为：
[0022] --通过静脉注射或口服的方式，使得待测的哺乳动物服用0. 1至500mg/kg体重 的戈米辛A或其药物制剂；
[0023]--在〇至24小时内选取时间点，收集待测动物的血浆样本；
[0024] -测定底物减少速率或产物生成速率，作为细胞色素CYP3A4酶活的评价指标。
[0025] 本发明还提供了含有所述新型细胞色素CYP3A4酶特异性探针底物的药物制剂， 其特征在于：所述药物制剂含有戈米辛A。
[0026] 本发明还提供了含有所述新型细胞色素CYP3A4酶特异性探针底物的药物组合 物，其特征在于：所述药物组合物由戈米辛A与任何可药用载体/成分所组成。
[0027] 选用本发明所述CYP3A4酶的特异性探针底物检测CYP3A4酶活性具有以下突出优 势：
[0028] (1)高特异性：戈米辛A可被目标CYP3A4高特异性地代谢成为相应的羟化产物。
[0029] (2)高安全性：戈米辛A的毒性极低，大鼠口服半数致死量（LD5tl)为980mg/kg，在 使用剂量下底物及其代谢产物均安全无毒，适合开发成为体内探针药物。
[0030] (3)易于制备：底物戈米辛A是五味子科植物茎叶及果实中富含的一种天然化学 成分，来源简单且易于分离纯化。
[0031] (4)检测灵敏：该化合物为具有联苯环辛烯母核结构的化合物，有良好的紫外吸 收特性（230~280nm)及质谱离子化效果，可通过常规分析手段（如LC-UV、LC-ESI-MS等） 对其定量分析。 在临床应用中，无需另行购买昂贵的检测设备。
【附图说明】
[0032] 图1?戈米辛A的化学结构式；
[0033] 图2.戈米辛A的人重组单酶筛选实验结果；
[0034] 图3.戈米辛A及其羟化代谢产物在人重组单酶CYP3A4和CYP3A5中的色谱图；
[0035] 图4.戈米辛A及其羟化代谢产物在人重组单酶CYP3A4中的质谱图；
[0036] 图5.戈米辛A经CYP3A4介导的羟化代谢通路；
[0037] 图6.戈米辛A在CYP3A4及CYP3A5单酶体系中的动力学；
[0038] 图7.戈米辛A、睾酮、硝苯地平及咪达唑仑在CYP3A4及CYP3A5单酶体系中的最大 反应速度比之的比较；
[0039]图8.戈米辛A及其代谢产物在大鼠灌流液中的药时曲线。
【具体实施方式】
[0040] 下列实施例是为了进一步说明本发明，而不是要限制其范围。
[0041] 实施例1
[0042] 戈米辛A用于检测人重组CYP3A4及CYP3A4+细胞色素b5体系的酶活
[0043] 利用戈米辛A检测两种人重组单酶(重组表达体系中含有细胞色素b5和不含细胞 色素b5两种）在催化活性上的差异，具体步骤如下：
[0044] (1) 200微升体外代谢反应体系中，IOmM葡萄糖-6-磷酸，1单位的葡萄糖-6-磷 酸脱氢酶，以及4mMMgCl2，含有细胞色素b5的重组CYP3A4浓度为0. 05mg/ml，戈米辛A终 浓度为50iiM，于37°C条件下预孵5分钟；
[0045](2)于反应体系中加入20illNADP+(终浓度ImM)起始反应；
[0046] (3)反应10分钟后，加入200ill甲醇，剧烈震荡后，终止反应；
[0047] (4)采用高速冷冻离心机，在20,OOOXg的条件下，高速离心上述体系15分钟后， 取上清，进行UFLC-UV检测分析；
[0048] (5)以同样操作进行不含有细胞色素b5的重组CYP3A4的活性测定。
[0049] 通过紫外吸收光谱在250nm下对戈米辛A的8-羟化产物生成量进行定量检测，利 用戈米辛A作为探针底物测得的含有细胞色素b5的重组CYP3A4的酶活性相比之于不含细 胞色素b5的重组CYP3A4的酶活性提高了 30. 7%。
[0050] 实施例2
[0051] 戈米辛A用于12例个体人肝微粒体中CYP3A4酶活的测定
[0052] 购买商业化的十二例来自不同个体的人肝微粒体样本，利用戈米辛A测定人肝样 品中CYP3A4的酶活，具体操作流程如下：
[0053] (I) 200微升体外代谢反应体系中，IOmM葡萄糖-6-磷酸，1单位的葡萄糖-6-磷 酸脱氢酶，以及4mMMgCl2，人肝微粒体浓度为0. 2mg/ml，戈米辛A终浓度为50iiM，于37°C 条件下预孵3分钟；
[0054] (2)于反应体系中加入20illNADP+ (终浓度ImM)起始反应；
[0055] (3) 10分钟后，加入200ill甲醇，剧烈震荡后，终止反应；
[0056] (4)采用高速冷冻离心机，在20,OOOXg的条件下，高速离心上述体系10分钟后， 取上清，进行UFLC-UV检测分析；
[0057] 通过紫外吸收光谱在250nm下对戈米辛A的8-羟化产物的生成量进行定量检测。 测定结果表明，根据戈米辛A代谢产物的生成速度在不同来源的人肝微粒体中具有较大差 另Ij，最高活性与最低活性差距达7. 8倍。
[0058] 实施例3
[0059] 通过离体大鼠肝灌流实验，验证戈米辛A作为体内P4503A探针底物的特异性：
[0060] (1)选择体重在180~220g的雄性Wistar大鼠10只，建立大鼠肝脏循环灌流 模式，采用灌流缓冲液，以lOml/min的灌流速度，将肝脏中的血液冲掉并平衡肝脏约10分 钟；
[0061] (2)然后换至总体积为200毫升的灌流液，按5mg/kg的剂量在灌流液中一次性加 入戈米辛A;
[0062] (3)分别于 0, 5, 15, 25, 35, 50, 75, 100, 150, 210, 300 分钟，收集灌流液样品约 200 微升，置入离心管，四摄氏度保存；
[0063] (4)将得到的灌流液样品取出100微升，加入等体积的甲醇，充分混匀后采用高速 冷冻离心机，在12000g条件下离心20分钟后，取上清准备上样分析；
[0064] (5)采用岛津液质联用系统LC-MS2010EV，检测戈米辛A在[M+K]+m/z455. 1及8-羟 基戈米辛A在[M+K]+m/z471. 1下的相对丰度，根据在相同体系下做的标准曲线对血样中的 戈米辛A和8-羟基戈米辛A含量进行测定；
[0065] (6)根据测得戈米辛A的在灌流液药物浓度，得到药物浓度-时间曲线（如图8 所示)，分别获得各只大鼠的药时曲线下面积（AUC，85~137yg?h/ml)，药物消除半衰期 (1. 6~3. 5小时)等参数及各时间点灌流液中代谢产物8-羟基戈米辛A的浓度，以此作为 大鼠细胞色素CYP3A酶活性的评价指标。之后，使用同批大鼠制备获得的肝微粒体，采用奎 宁作为体外探针测定其细胞色素CYP3A4酶活性，发现与上述生物样品中酶活指标具有很 好的相关性。
[0066] 实施例4
[0067] 戈米辛A作为体内探针检测体内P4503A酶活用于给药剂量的调整
[0068] 采用180~220g的雄性Wistar大鼠3只，采用0. 5ml/kg的剂量腹腔注射四氯化 碳制造肝损伤模型，在给予四氯化碳24小时后，按10mg/kg的剂量分别给予每只大鼠口服 给予戈米辛A，并于用药后15分钟时采集血样，获得血浆中的8-羟基戈米辛A浓度反映大 鼠体内P4503A的实际酶活。根据戈米辛A和咪达唑仑在体外大鼠肝微粒孵育体系中的最 大产物生成速度之比（156pmol/min/mg&97pmol/min/mg)L6,结合戈米辛A在肝损伤大鼠 体内和正常大鼠体内的线性反应速度（2nM/min和6nM/min)，得到咪达唑仑在肝损伤大鼠 体内和正常大鼠体内的线性反应速度分别为I. 25nM/min和3. 75nM/min，已知咪达唑仑在 正常大鼠的常规静脉注射剂量为0.lmg/kg，推算对于四氯化碳肝损伤大鼠，咪达唑仑的给 予剂量为〇. 〇〇3mg/kg。之后在同一批肝损伤大鼠中按照0. 003mg/kg的剂量尾静脉注射咪 达唑仑，而正常大鼠按照0.lmg/kg剂量尾静脉注射咪达唑仑，发现两组血浆药时曲线十分 接近（AUC，542±24iig.VmlMUC, 523±36iig.Vml),证明戈米辛A可准确标定大鼠体内 P4503A酶活从而对咪达唑仑进行有效剂量调整的可靠性。
[0069] 实施例5
[0070] 采用戈米辛A作为体内探针考察健康成年人体中P4503A4酶活差异
[0071] 通过健康成年人（6人，3男，3女，年龄25~35岁）口服5mg的戈米辛A，在随后的 72小时内，搜集人体血浆及尿液样品，测定其中戈米辛A和8-羟基戈米辛A的含量。两周 后，采用同一组受试人员在空腹状态下于7:00am之前排空晨尿，一小时之后即8:00am自行 排尿并收集尿液样本，以一小时内尿液中的6P-羟化皮质醇的累积排泄量作为该人员体 内细胞色素CYP3A4活性的评价指标。将两组数据结果对比后表明，服用戈米辛A之后，血 浆样品中戈米辛A的曲线下面积、0. 5小时血浆中8-羟基戈米辛A的浓度与该受试人员细 胞色素CYP3A4酶活性显著相关（r=7. 920)。说明该化合物可以作为人体细胞色素CYP3A4 酶活性表征的探针来使用。
[0072] 上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人 士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明 精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种新型细胞色素 CYP3A4酶特异性探针底物，其特征在于：该探针底物为戈米辛A， 结构式如式（1)所示。2. -种权利要求1所述新型细胞色素 CYP3A4酶特异性探针底物的应用，其特征在于：采用所述新型细胞色素 CYP3A4酶特异性探针底物检测CYPP3A4酶活性。3. 按照权利要求2所述新型细胞色素 CYP3A4酶特异性探针底物的应用，其特征在于：采用所述新型细胞色素 CYP3A4酶特异性探针底物在体外检测生物样本中细胞色素 CYP3A4 酶活性。4. 按照权利要求3所述新型细胞色素 CYP3A4酶特异性探针底物的应用，其特征在于， 测定方法及条件为： --体系中以戈米辛A中作为探针底物；底物浓度范围为1-500 μ M ; --在ρΗ7. 4且具有辅因子NADPH或其生成体系的孵育体系中，反应温度为10-60°C之 间； --反应时间为5-60min ;确保获得相应羟化代谢产物达到定量限且底物转化率低于 20%时终止反应； --通过检测单位时间内底物减少量或产物生成量，即底物减少速率或产物生成速 率，实现细胞色素 CYP3A4酶活性的检测。5. 按照权利要求2所述新型细胞色素 CYP3A4酶特异性探针底物的应用，其特征在于：采用所述新型细胞色素 CYP3A4酶特异性探针底物检测体内细胞色素 CYP3A4酶活性。6. 按照权利要求5所述新型细胞色素 CYP3A4酶特异性探针底物的应用，其特征在于， 测定方法及条件为： --通过静脉注射或口服的方式，使得待测的哺乳动物服用〇. 1至500mg/kg体重的戈 米辛A或其药物制剂； --在0至24小时内选取时间点，收集待测动物的血浆样本； --测定底物减少速率或产物生成速率，作为细胞色素 CYP3A4酶活的评价指标。7. -种含有权利要求1所述新型细胞色素 CYP3A4酶特异性探针底物的药物制剂，其特 征在于：所述药物制剂含有戈米辛A。8. -种含有权利要求1所述新型细胞色素 CYP3A4酶特异性探针底物的药物组合物，其 特征在于：所述药物组合物由戈米辛A与任何可药用载体/成分所组成。
【专利摘要】本发明提供了一种新型细胞色素CYP3A4酶的特异性探针反应及其应用：戈米辛A可作为CYP3A4酶的探针底物来检测该酶的活性，以戈米辛A或其药物制剂作为特异性的探针底物，通过在单位时间内定量测定底物戈米辛A的减少速率或产物8-羟基戈米辛A的生成速率作为细胞色素CYP3A4酶活的评价指标。该探针底物还具有高安全性，可作为整体探针使用，通过静脉注射使待测哺乳动物服用0.1至500mg/kg体重的戈米辛A或其药物制剂；在0至24小时内选取时间点，收集待测动物的血浆样本；测定底物戈米辛A的减少速率或产物8-羟基戈米辛A的生成速率，作为整体细胞色素CYP3A4酶活性的评价指标。本发明可实现不同来源的生物样本及体内CYP3A4酶活的定量评估。
【IPC分类】A61K31/36, C07D317/70, C12Q1/26
【公开号】CN104892563
【申请号】CN201410081691
【发明人】杨凌, 吴敬敬, 葛广波, 宁静, 杜逊甫
【申请人】中国科学院大连化学物理研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年3月6日
【技术领域】
[0001] 本发明属医药技术领域，具体涉及一种木脂素类化合物戈米辛A，其可作为细胞色 素CYP3A4酶的特异性探针底物，用于定量检测不同来源生物样本及体内细胞色素CYP3A4 酶活性。
【背景技术】
[0002] 细胞色素P450酶（CytochromeP450,CYP)为一类亚铁血红素一硫醇盐蛋白的超 家族，是人体内最重要的I相药物代谢酶，催化多种内源和外源物质的代谢。该超家族包 含多个亚家族，如CYP1A2,CYP2D6,CYP2C8,CYP2C9,CYP2C19,CYP2E1,CYP3A4 和CYP3A5 等， 参与约80%以上的上市药物的代谢转化，其中经CYP3A亚家族代谢的药物约占50%(Nat RevDrugDiscov. 2005, 4 (10) : 825-833)。人体中主要表达四种CYP3A亚型，分别为CYP3A4、 CYP3A5、CYP3A7及CYP3A43。其中CYP3A4在成人体内总细胞色素CYP酶中含量最高，在体 内各组织器官广泛的分布，相比于人群中表达量低、表达频率低的CYP3A5, 一直被认为是成 年个体的最主要的CYP单酶。由于CYP3A5亚家族与CYP3A4具有83%的高度同源性[Curr DrugMetab. 2008,9:20 - 33]，CYP3A4和CYP3A5两个亚家族通常具有相似的底物识别性， 即某一底物若被CYP3A4催化代谢，也极可能同时被CYP3A5亚型酶代谢。但已有研究发现 CYP3A代谢的底物在这两种单酶的催化性质不尽相同。在人类肝脏中，CYP3A被认为是最 主要的CYP3亚型，且在女性中有更高的表达量。CYP3A5存在基因多态性，其在肝脏中表达 量的个体差异可从〇%到50% ;CYP3A5的表达还存在种族差异，仅三分之一的高加索人（白种 人）和一半以上的非洲裔美国人表达CYP3A5。由此可见，由于遗传因素和非遗传因素的影 响，CYP3A4和CYP3A5亚型酶，无论是其表达量、催化功能，还是代谢贡献率都会存在很大的 个体差异性，这对于CYP3A介导代谢的药物在体内的暴露水平会产生不可忽视的影响。
[0003] 目前，已经发现的或已在体外、体内研究中广泛应用的CYP3A亚家族探针底物，如 咪达唑仑（midazolam)、硝苯地平（nifedipine)、睾酮（testosterone)等，都同时是CYP3A4 和CYP3A5的特异性底物，利用这些探针底物对细胞色素CYP酶进行的评估结果反映的就是 细胞色素CYP3A亚家族各单酶的催化能力的总和。然而，近期研究发现，细胞色素CYP3A5 在某些个体中显现的催化能力甚至与细胞色素CYP3A4的催化能力相当（DrugMetab Dispos. 2002, 30:883-891)，此时利用目前已有的探针底物则会混淆细胞色素CYP3A4和 3A5的催化能力，从而无法清晰地分析细胞色素CYP3A4对特定药物的代谢清除贡献率。
[0004] 此外，在大鼠（细胞色素CYP3A1、细胞色素CYP3A2)、狗(细胞色素CYP3A12、细胞 色素CYP3A26)，兔（细胞色素CYP3A6)，猪（细胞色素CYP3A29)，猴（细胞色素CYP3A64)等 哺乳动物体内，也高表达细胞色素CYP3A4的同功酶，这些酶之间的底物有非常广泛的重叠 性。利用细胞色素CYP3A4的高选择性探针底物也可在体外活性测定方面实现对不同种属 中细胞色素CYP3A4的同功酶的评价与考察。
[0005] 目前，CYP3A4酶活性的体外评价体系主要包括重组单酶、哺乳动物的亚细胞组分 、新鲜分离的肝细胞、肝切片、肝灌流等（ToxicologyinVitro2006, 135-153)，其中已经 商品化的重组细胞色素CYP3A4单酶主要来自于细菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞以及酵母菌 建立的克隆表达体系，而亚细胞组分主要包括微粒体、细胞浆及S9成分。采用这些标准化 的评价体系，结合相应的辅因子(如：NADPH等）和孵育条件，可通过检测探针底物的代谢清 除或产物生成速率，对上述各种体系中表达的CYP3A4酶活性进行表征。
[0006] 此外，采用静脉注射或口服的方式，使待测人或动物服用一定剂量的探针底物，在 一定时间内，搜集血浆和尿液样本，测定其中原型化合物或其代谢产物的含量，以此来作为 整体水平细胞色素CYP3A活性的评价指标。Lin(Pharmacogenetics2001, 11 (9) :781-791) 等人使用咪达唑仑作为体内探针，给健康成年人静脉注射或口服一定剂量之后，发现服药4 小时后的血浆中咪达唑仑浓度与血药浓度曲线下面积（AUC)存在较好的相关性，可以用来 对机体对细胞色素CYP3A介导药物代谢的清除能力进行判断。Furuta(US6905839B2)等人 采用内源性皮质醇作为细胞色素CYP3A的内源性体内探针，通过测定志愿者血浆样品中皮 质醇的浓度和尿液样品中代谢产物6P-羟基皮质醇的浓度，采用尿中6P-羟基皮质醇的 累积量与血浆皮质醇AUC的比值反映体内CYP3A活性大小，发现该指标可以很好的表征体 内细胞色素CYP3A的活性，进而用于不同人体的CYP3A活性标定，对于作为CYP3A底物的已 上市药物，可作为指导该类药物的个体给药剂量调整的重要依据。
[0007] 综上所述，特异性地评估体内外细胞色素CYP3A4代谢酶活性及CYP3A4对特定药 物代谢清除的贡献率的关键在于选择高特异性的探针药物。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一类木脂素类化合物以及其在检测CYP3A4酶活性中的用 途及其检测方法，具体为戈米辛A可作为CYP3A4酶的高特异性探针底物，用于定量测定不 同来源生物样本及体内CYP3A4的酶活。与目前已报道的CYP3A探针/标准底物不同，戈米 辛A具有高特异性表征CYP3A4酶活性的能力，CYP3A5催化活性极微弱可忽略不计。因此 能够高特异性的评价机体或组织中CYP3A4酶对药物的代谢处置能力，对体内外药物代谢 研究具有重要意义。
[0009] 本发明具体提供了一种新型细胞色素CYP3A4酶特异性探针底物，其特征在于：该 探针底物为戈米辛A(GomisinA)，是一种天然木脂素类成分，该化合物的结构如图1所示。
[0010] 本发明还提供了所述新型细胞色素CYP3A4酶特异性探针底物的应用，其特征在 于：采用所述新型细胞色素CYP3A4酶特异性探针底物检测CYPP3A4酶活性：通过定量定时 测定相应代谢产物的生成速率或底物的减少速率实现CYP3A4酶活性的检测。
[0011] 戈米辛A仅能被CYP3A4选择性代谢并生成一个主要代谢产物8-羟基戈米辛A，其 余代谢酶包括CYP3A5均难以催化其代谢，8-羟基化反应符合米氏动力学，其单位时间内的 转化速率可用于定量测定不同生物体系(包括重组单酶体系、人及动物细胞/组织制备液 等）中细胞色素CYP3A4酶的活性。
[0012] 采用重组细胞色素CYP单酶，肝微粒体孵育体系进行考察，通过相关性分析，特异 性抑制实验，重组单酶代谢反应，以及酶反应动力学几方面的证据，证明戈米辛A可特异性 的经CYP3A4酶代谢(如图2所示)，生成8-羟基戈米辛A，高效液相图谱见图3,原形及代谢 产物的质谱图见图4,代谢通路与代谢产物结构见图5。进一步采用各种哺乳动物的新鲜提 取的肝微粒体、原代培养肝细胞、肝切片、肝灌流等代谢评价体系进行考察，发现该代谢 反应具有非常良好的特异性。
[0013] 作为高特异性的细胞色素CYP3A4的探针底物，戈米辛A可以用来检测细胞色素 CYP3A4酶活性，尤其适合用于对细菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞以及酵母菌克隆表达体系生 产的CYP3A4重组酶、多种哺乳动物组织器官来源的微粒体、S-9等制备物中CYP3A4的活性 标定，以及体内CYP3A4活性的标定。
[0014] 本发明还提供了戈米辛A与已有CYP3A4探针底物睾酮、硝苯地平、咪达唑仑在代 谢酶选择性上的优势比较：戈米辛A作为特异性探针底物，在CYP3A4和CYP3A5两种重组 单酶孵育体系中，通过相应代谢产物的酶反应动力学分析(如图6所示)，证明戈米辛A在 CYP3A4与CYP3A5中的最大反应速度（Vm)之比显著高于睾酮、硝苯地平和咪达唑仑(如图7 所示)，表明CYP3A4对戈米辛A的催化效能远远高于CYP3A5的催化效能，即高选择性的被 CYP3A4代谢，而CYP3A5的催化贡献极微弱可忽略不计。
[0015] 本发明所述新型细胞色素CYP3A4酶特异性探针底物的应用，其特征在于，采用所 述新型细胞色素CYP3A4酶特异性探针底物在体外检测生物样本中细胞色素CYP3A4酶活 性，其优选的测定方法及条件为：
[0016] --体系中以戈米辛A中作为探针底物；底物浓度范围为1-500iiM;
[0017] -在pH7. 4且具有辅因子NADPH或其生成体系的孵育体系中，反应温度为 10-60°C之间，优选37°C为最优反应时间；
[0018]--反应时间为5-60min;确保获得相应羟化代谢产物达到定量限且底物转化率 低于20%时终止反应；
[0019] -通过检测单位时间内底物减少量或产物生成量，即底物减少速率或产物生成 速率，作为CYP3A4酶活性的评价指标，实现细胞色素CYP3A4酶活性的检测。
[0020] 其中检测底物减少量或其对应羟化产物生成量的定量检测方法为紫外吸收光谱、 质谱、放射性同位素示踪技术、荧光激发光谱、蒸发光散射或电化学光谱检测。所有检测器 包括紫外吸收光谱检测器、质谱、放射性同位素示踪技术、蒸发光散射或电化学光谱检测器 中的一种或多种串联。
[0021] 本发明所述新型细胞色素CYP3A4酶特异性探针底物还可以检测体内细胞色素 CYP3A4酶活性，其优选的测定方法及条件为：
[0022] --通过静脉注射或口服的方式，使得待测的哺乳动物服用0. 1至500mg/kg体重 的戈米辛A或其药物制剂；
[0023]--在〇至24小时内选取时间点，收集待测动物的血浆样本；
[0024] -测定底物减少速率或产物生成速率，作为细胞色素CYP3A4酶活的评价指标。
[0025] 本发明还提供了含有所述新型细胞色素CYP3A4酶特异性探针底物的药物制剂， 其特征在于：所述药物制剂含有戈米辛A。
[0026] 本发明还提供了含有所述新型细胞色素CYP3A4酶特异性探针底物的药物组合 物，其特征在于：所述药物组合物由戈米辛A与任何可药用载体/成分所组成。
[0027] 选用本发明所述CYP3A4酶的特异性探针底物检测CYP3A4酶活性具有以下突出优 势：
[0028] (1)高特异性：戈米辛A可被目标CYP3A4高特异性地代谢成为相应的羟化产物。
[0029] (2)高安全性：戈米辛A的毒性极低，大鼠口服半数致死量（LD5tl)为980mg/kg，在 使用剂量下底物及其代谢产物均安全无毒，适合开发成为体内探针药物。
[0030] (3)易于制备：底物戈米辛A是五味子科植物茎叶及果实中富含的一种天然化学 成分，来源简单且易于分离纯化。
[0031] (4)检测灵敏：该化合物为具有联苯环辛烯母核结构的化合物，有良好的紫外吸 收特性（230~280nm)及质谱离子化效果，可通过常规分析手段（如LC-UV、LC-ESI-MS等） 对其定量分析。 在临床应用中，无需另行购买昂贵的检测设备。
【附图说明】
[0032] 图1?戈米辛A的化学结构式；
[0033] 图2.戈米辛A的人重组单酶筛选实验结果；
[0034] 图3.戈米辛A及其羟化代谢产物在人重组单酶CYP3A4和CYP3A5中的色谱图；
[0035] 图4.戈米辛A及其羟化代谢产物在人重组单酶CYP3A4中的质谱图；
[0036] 图5.戈米辛A经CYP3A4介导的羟化代谢通路；
[0037] 图6.戈米辛A在CYP3A4及CYP3A5单酶体系中的动力学；
[0038] 图7.戈米辛A、睾酮、硝苯地平及咪达唑仑在CYP3A4及CYP3A5单酶体系中的最大 反应速度比之的比较；
[0039]图8.戈米辛A及其代谢产物在大鼠灌流液中的药时曲线。
【具体实施方式】
[0040] 下列实施例是为了进一步说明本发明，而不是要限制其范围。
[0041] 实施例1
[0042] 戈米辛A用于检测人重组CYP3A4及CYP3A4+细胞色素b5体系的酶活
[0043] 利用戈米辛A检测两种人重组单酶(重组表达体系中含有细胞色素b5和不含细胞 色素b5两种）在催化活性上的差异，具体步骤如下：
[0044] (1) 200微升体外代谢反应体系中，IOmM葡萄糖-6-磷酸，1单位的葡萄糖-6-磷 酸脱氢酶，以及4mMMgCl2，含有细胞色素b5的重组CYP3A4浓度为0. 05mg/ml，戈米辛A终 浓度为50iiM，于37°C条件下预孵5分钟；
[0045](2)于反应体系中加入20illNADP+(终浓度ImM)起始反应；
[0046] (3)反应10分钟后，加入200ill甲醇，剧烈震荡后，终止反应；
[0047] (4)采用高速冷冻离心机，在20,OOOXg的条件下，高速离心上述体系15分钟后， 取上清，进行UFLC-UV检测分析；
[0048] (5)以同样操作进行不含有细胞色素b5的重组CYP3A4的活性测定。
[0049] 通过紫外吸收光谱在250nm下对戈米辛A的8-羟化产物生成量进行定量检测，利 用戈米辛A作为探针底物测得的含有细胞色素b5的重组CYP3A4的酶活性相比之于不含细 胞色素b5的重组CYP3A4的酶活性提高了 30. 7%。
[0050] 实施例2
[0051] 戈米辛A用于12例个体人肝微粒体中CYP3A4酶活的测定
[0052] 购买商业化的十二例来自不同个体的人肝微粒体样本，利用戈米辛A测定人肝样 品中CYP3A4的酶活，具体操作流程如下：
[0053] (I) 200微升体外代谢反应体系中，IOmM葡萄糖-6-磷酸，1单位的葡萄糖-6-磷 酸脱氢酶，以及4mMMgCl2，人肝微粒体浓度为0. 2mg/ml，戈米辛A终浓度为50iiM，于37°C 条件下预孵3分钟；
[0054] (2)于反应体系中加入20illNADP+ (终浓度ImM)起始反应；
[0055] (3) 10分钟后，加入200ill甲醇，剧烈震荡后，终止反应；
[0056] (4)采用高速冷冻离心机，在20,OOOXg的条件下，高速离心上述体系10分钟后， 取上清，进行UFLC-UV检测分析；
[0057] 通过紫外吸收光谱在250nm下对戈米辛A的8-羟化产物的生成量进行定量检测。 测定结果表明，根据戈米辛A代谢产物的生成速度在不同来源的人肝微粒体中具有较大差 另Ij，最高活性与最低活性差距达7. 8倍。
[0058] 实施例3
[0059] 通过离体大鼠肝灌流实验，验证戈米辛A作为体内P4503A探针底物的特异性：
[0060] (1)选择体重在180~220g的雄性Wistar大鼠10只，建立大鼠肝脏循环灌流 模式，采用灌流缓冲液，以lOml/min的灌流速度，将肝脏中的血液冲掉并平衡肝脏约10分 钟；
[0061] (2)然后换至总体积为200毫升的灌流液，按5mg/kg的剂量在灌流液中一次性加 入戈米辛A;
[0062] (3)分别于 0, 5, 15, 25, 35, 50, 75, 100, 150, 210, 300 分钟，收集灌流液样品约 200 微升，置入离心管，四摄氏度保存；
[0063] (4)将得到的灌流液样品取出100微升，加入等体积的甲醇，充分混匀后采用高速 冷冻离心机，在12000g条件下离心20分钟后，取上清准备上样分析；
[0064] (5)采用岛津液质联用系统LC-MS2010EV，检测戈米辛A在[M+K]+m/z455. 1及8-羟 基戈米辛A在[M+K]+m/z471. 1下的相对丰度，根据在相同体系下做的标准曲线对血样中的 戈米辛A和8-羟基戈米辛A含量进行测定；
[0065] (6)根据测得戈米辛A的在灌流液药物浓度，得到药物浓度-时间曲线（如图8 所示)，分别获得各只大鼠的药时曲线下面积（AUC，85~137yg?h/ml)，药物消除半衰期 (1. 6~3. 5小时)等参数及各时间点灌流液中代谢产物8-羟基戈米辛A的浓度，以此作为 大鼠细胞色素CYP3A酶活性的评价指标。之后，使用同批大鼠制备获得的肝微粒体，采用奎 宁作为体外探针测定其细胞色素CYP3A4酶活性，发现与上述生物样品中酶活指标具有很 好的相关性。
[0066] 实施例4
[0067] 戈米辛A作为体内探针检测体内P4503A酶活用于给药剂量的调整
[0068] 采用180~220g的雄性Wistar大鼠3只，采用0. 5ml/kg的剂量腹腔注射四氯化 碳制造肝损伤模型，在给予四氯化碳24小时后，按10mg/kg的剂量分别给予每只大鼠口服 给予戈米辛A，并于用药后15分钟时采集血样，获得血浆中的8-羟基戈米辛A浓度反映大 鼠体内P4503A的实际酶活。根据戈米辛A和咪达唑仑在体外大鼠肝微粒孵育体系中的最 大产物生成速度之比（156pmol/min/mg&97pmol/min/mg)L6,结合戈米辛A在肝损伤大鼠 体内和正常大鼠体内的线性反应速度（2nM/min和6nM/min)，得到咪达唑仑在肝损伤大鼠 体内和正常大鼠体内的线性反应速度分别为I. 25nM/min和3. 75nM/min，已知咪达唑仑在 正常大鼠的常规静脉注射剂量为0.lmg/kg，推算对于四氯化碳肝损伤大鼠，咪达唑仑的给 予剂量为〇. 〇〇3mg/kg。之后在同一批肝损伤大鼠中按照0. 003mg/kg的剂量尾静脉注射咪 达唑仑，而正常大鼠按照0.lmg/kg剂量尾静脉注射咪达唑仑，发现两组血浆药时曲线十分 接近（AUC，542±24iig.VmlMUC, 523±36iig.Vml),证明戈米辛A可准确标定大鼠体内 P4503A酶活从而对咪达唑仑进行有效剂量调整的可靠性。
[0069] 实施例5
[0070] 采用戈米辛A作为体内探针考察健康成年人体中P4503A4酶活差异
[0071] 通过健康成年人（6人，3男，3女，年龄25~35岁）口服5mg的戈米辛A，在随后的 72小时内，搜集人体血浆及尿液样品，测定其中戈米辛A和8-羟基戈米辛A的含量。两周 后，采用同一组受试人员在空腹状态下于7:00am之前排空晨尿，一小时之后即8:00am自行 排尿并收集尿液样本，以一小时内尿液中的6P-羟化皮质醇的累积排泄量作为该人员体 内细胞色素CYP3A4活性的评价指标。将两组数据结果对比后表明，服用戈米辛A之后，血 浆样品中戈米辛A的曲线下面积、0. 5小时血浆中8-羟基戈米辛A的浓度与该受试人员细 胞色素CYP3A4酶活性显著相关（r=7. 920)。说明该化合物可以作为人体细胞色素CYP3A4 酶活性表征的探针来使用。
[0072] 上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人 士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明 精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种新型细胞色素 CYP3A4酶特异性探针底物，其特征在于：该探针底物为戈米辛A， 结构式如式（1)所示。2. -种权利要求1所述新型细胞色素 CYP3A4酶特异性探针底物的应用，其特征在于：采用所述新型细胞色素 CYP3A4酶特异性探针底物检测CYPP3A4酶活性。3. 按照权利要求2所述新型细胞色素 CYP3A4酶特异性探针底物的应用，其特征在于：采用所述新型细胞色素 CYP3A4酶特异性探针底物在体外检测生物样本中细胞色素 CYP3A4 酶活性。4. 按照权利要求3所述新型细胞色素 CYP3A4酶特异性探针底物的应用，其特征在于， 测定方法及条件为： --体系中以戈米辛A中作为探针底物；底物浓度范围为1-500 μ M ; --在ρΗ7. 4且具有辅因子NADPH或其生成体系的孵育体系中，反应温度为10-60°C之 间； --反应时间为5-60min ;确保获得相应羟化代谢产物达到定量限且底物转化率低于 20%时终止反应； --通过检测单位时间内底物减少量或产物生成量，即底物减少速率或产物生成速 率，实现细胞色素 CYP3A4酶活性的检测。5. 按照权利要求2所述新型细胞色素 CYP3A4酶特异性探针底物的应用，其特征在于：采用所述新型细胞色素 CYP3A4酶特异性探针底物检测体内细胞色素 CYP3A4酶活性。6. 按照权利要求5所述新型细胞色素 CYP3A4酶特异性探针底物的应用，其特征在于， 测定方法及条件为： --通过静脉注射或口服的方式，使得待测的哺乳动物服用〇. 1至500mg/kg体重的戈 米辛A或其药物制剂； --在0至24小时内选取时间点，收集待测动物的血浆样本； --测定底物减少速率或产物生成速率，作为细胞色素 CYP3A4酶活的评价指标。7. -种含有权利要求1所述新型细胞色素 CYP3A4酶特异性探针底物的药物制剂，其特 征在于：所述药物制剂含有戈米辛A。8. -种含有权利要求1所述新型细胞色素 CYP3A4酶特异性探针底物的药物组合物，其 特征在于：所述药物组合物由戈米辛A与任何可药用载体/成分所组成。
【专利摘要】本发明提供了一种新型细胞色素CYP3A4酶的特异性探针反应及其应用：戈米辛A可作为CYP3A4酶的探针底物来检测该酶的活性，以戈米辛A或其药物制剂作为特异性的探针底物，通过在单位时间内定量测定底物戈米辛A的减少速率或产物8-羟基戈米辛A的生成速率作为细胞色素CYP3A4酶活的评价指标。该探针底物还具有高安全性，可作为整体探针使用，通过静脉注射使待测哺乳动物服用0.1至500mg/kg体重的戈米辛A或其药物制剂；在0至24小时内选取时间点，收集待测动物的血浆样本；测定底物戈米辛A的减少速率或产物8-羟基戈米辛A的生成速率，作为整体细胞色素CYP3A4酶活性的评价指标。本发明可实现不同来源的生物样本及体内CYP3A4酶活的定量评估。
【IPC分类】A61K31/36, C07D317/70, C12Q1/26
【公开号】CN104892563
【申请号】CN201410081691
【发明人】杨凌, 吴敬敬, 葛广波, 宁静, 杜逊甫
【申请人】中国科学院大连化学物理研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年3月6日
最新回复(0)