具有抗人肝癌HepG2细胞活性的TB类衍生物合成方法
具有抗人肝癌HepG2细胞活性的TB类衍生物合成方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种TB类衍生物合成方法，特别是一种具有抗人肝癌H印G2细胞活性 的TB类衍生物合成方法。
【背景技术】
[0002] 由于环境污染及不良的生活习惯影响，恶性肿瘤已成为人类健康的头号杀手，其 中，肝癌是最常见的恶性肿瘤之一。目前，癌症的治疗方法有手术治疗、放射治疗及药物治 疗等。早期肝癌进行根治的有效方法是手术疗法，但由于肝癌早期症状不明显，大部分患者 就诊时已经是晚期，尽管勉强进行手术切除，但因临床易转移和复发，总体效果较差。近年 来，人们一直在不断的研制新药来对抗这种疾病，药物作为治疗肝癌的重要手段，一方面可 以减少患者的病痛、延长生存时间，另一方面，对于将来攻克彻底治疗这一难题具有实际的 意义。
[0003] 黄酮类化合物主要骨架由两个苯环（A和B)和三个碳相互连接而成（图1)，根据 C3的氧化程度、B环连接位置以及三碳链是否成环等特点，可将其分为10种不同的类型，而 每一种类型都有一定的药理活性，因此在实际当中被广泛应用于医药、食品及化妆品等行 业。
[0004] 苯并咪唑类化合物是一类重要的含氮杂环化合物，存在于多种药物中。该类化合 物主要依靠杂环上的Ν、Η、0活性部分与细菌体内蛋白质中DNA形成氢键，并破坏DNA结构， 对多种生物体内的酶和受体都具有抑制作用。由于苯并咪唑类化合物及其配合物所具有的 良好药理和生物活性，如抗溃疡、抗高血压、抗真菌、抗癌、杀虫、除草等药用价值，已广泛应 用于医药和农药行业，并显示出良好的药效。
[0005] TB及其衍生物所具有的特殊V型腔状结构和多个氢键结合位点，可以与DNA相互 作用，因此本发明将TB、黄酮以及苯并咪唑类化合物进行强强联合，首次设计合成了 TB-查 尔酮类化合物、TB-黄酮类化合物和TB-苯并咪唑类化合物，希望通过二者的强强联合筛选 到具有抗肝癌活性的化合物，为将其开发为抗肝癌新药打下基础。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是要提供一种具有抗人肝癌H印G2细胞活性的TB类衍生物合成方 法，解决的问题。
[0007] 本发明的目的是这样实现的：该TB类衍生物合成方法包括：TB-查尔酮类化合物、 TB-黄酮类化合物和TB-苯并咪唑类化合物，并通过MTT法测定所述的TB衍生物的抗人肝 癌HepG2细胞活性。
[0008] 1、TB-查尔酮类化合物的合成方法：
[0009]
[0010] 1)化合物4的合成：
[0011] 圆底烧瓶中加入0.5111111〇1化合物1即2,8-二甲酰基了8,0.75111111〇1取代-2-羟 基苯乙酮，所述的取代-2-羟基苯乙酮为4-0CH 3-2-羟基苯乙酮；5-CH3_2-羟基苯乙酮或 5-0CH3-2-羟基苯乙酮，I. 8mmol NaOH和5mL无水乙醇，60°C反应，薄层层析跟踪，溶液变为 橙色；反应完毕后，冷却至室温，加入冰水，用IM HCl调pH至3-4 ;抽滤，水洗，滤饼用柱层 析提纯，石油醚：乙酸乙醋=2:1，得橙色粉末化合物4,所述的化合物4为4a:R = 4-0CH3; 4b: R = 5-〇13或 4c :R = 5-0CH 3;
[0012] 2)化合物5的合成：
[0013] 圆底烧瓶中加入0. 5mmol化合物2即2-溴-8-甲酰基TB，0. 75mmol取代-2-羟 基苯乙酮，所述的取代-2-羟基苯乙酮为4-0CH3-2-羟基苯乙酮；5-CH 3_2-羟基苯乙酮或 5-0CH3-2-羟基苯乙酮，I. 8mmol NaOH和5mL无水乙醇，60°C反应，薄层层析跟踪，溶液变为 橙色；反应完毕后，冷却至室温，加入冰水，用IM HCl调pH至3-4。抽滤，水洗，滤饼用柱层 析提纯，石油醚：乙酸乙醋=2:1，得橙色粉末化合物5,所述的化合物5为5a:R = 4-0CH3; 5b:R = 5-〇13或 5c :R = 5-0CH3;
[0014] 3)化合物6的合成：
[0015] 圆底烧瓶中加入0.5111111〇1化合物3即2,8-二-4'-甲酰基苯基了8,0.75111111〇1取 代-2-羟基苯乙酮，所述的取代-2-羟基苯乙酮为6al: R = 5-CH3;6al :R = 5-0CH 3或6b : R1= 5-0CH 3, R2= H，I. 8mmol NaOH和5mL无水乙醇，60°C反应，薄层层析跟踪，溶液变为橙 色；反应完毕后，冷却至室温，加入冰水，用IM HCl调pH至3-4。抽滤，水洗，滤饼用柱层析 提纯，石油醚：乙酸乙酯=2:1，得橙色粉末化合物6，所述的化合物6为TB-黄酮类化合物。
[0016] 2、TB-黄酮类化合物的合成方法：
[0017]
[0018] I) TB-二氢黄酮化合物7的合成
[0019] 将0. 5mmol化合物5溶于15mL乙醇中，加入醋酸钠0. 5mmol，回流搅拌反应24h， TLC跟踪至反应完全，冷却至室温，加入水10mL，抽滤，滤饼柱层析分离（石油醚：乙酸乙酯 =4:1)，得浅黄色固体7即TB二氢黄酮化合物。
[0020] 2) TB黄酮化合物8的合成
[0021] 圆底烧瓶中加入0. 5mmol化合物5和3mL DMSO, 130°C反应2d，TLC跟踪至反应完 全，冷却至室温，加入水10mL，抽滤，滤饼柱层析分离，石油醚：乙酸乙酯=2:1，得浅黄色固 体化合物8即TB黄酮化合物。
[0022] 3、TB-苯并咪唑类化合物的合成方法：
[0023]
[0024] TB苯并咪唑类化合物9的合成：
[0025] 圆底烧瓶中加入0. 25mmol化合物3,0. 75mmol苯二胺和0. 03g SSA，并加入5mL CH2Cl2，室温下搅拌至反应完全，柱层析，石油醚：乙酸乙酯=1:1，得黄色固体化合物9即 TB苯并咪唑类化合物。
[0026] 本发明的优点和效果在于：本发明将查尔酮、苯并咪唑等具有生理活性的片断引 入TB骨架，首次设计合成了含有苯并咪唑、查尔酮等取代基的新型朝格尔碱衍生物，希望 通过二者的强强联合筛选到具有抗肝癌活性的化合物，解决了目前康肝癌药物严重缺乏的 问题。
[0027] 1、可简便快速得到含有苯并咪唑、查尔酮等取代基的新型朝格尔碱衍生物。
[0028] 2、反应的产率普遍较高，显示出底物的普适性。
[0029] 3、反应条件温和，操作简单，反应时间特别短，产率高，后处理简便。
[0030] 4、反应绿色环保，经济高效，具有极高的实际应用价值。
[0031] 5、6个产物具有优良的抗人肝癌HepG2细胞活性，具有开发为抗肝癌新药的潜力。
【附图说明】：
[0032] 图1是现有技术的黄酮类化合物的基本骨架图。
[0033] 图2是本发明的TB-查尔酮类化合物结构图。
[0034] 图3是本发明的TB-黄酮类化合物结构图。
[0035] 图4是本发明的TB-苯并咪唑类化合物结构图。
【具体实施方式】
[0036] 该TB类衍生物合成方法包括：TB-查尔酮类化合物、TB-黄酮类化合物和TB-苯并 咪唑类化合物，并通过MTT法测定所述的TB衍生物的抗人肝癌H印G2细胞活性；
[0037] 1、TB-查尔酮类化合物的合成方法：
[0038]
[0039] 1)化合物4的合成：
[0040] 圆底烧瓶中加入0.5臟〇1化合物1即2,8-二甲酰基了8,0.75臟〇1取代-2-羟 基苯乙酮，所述的取代-2-羟基苯乙酮为4-0CH 3-2-羟基苯乙酮；5-CH3_2-羟基苯乙酮或 5-0CH3-2-羟基苯乙酮，I. 8mmol NaOH和5mL无水乙醇，60°C反应，薄层层析跟踪，溶液变为 橙色；反应完毕后，冷却至室温，加入冰水，用IM HCl调pH至3-4 ;抽滤，水洗，滤饼用柱层 析提纯，石油醚：乙酸乙醋=2:1，得橙色粉末化合物4,所述的化合物4为4a:R = 4-0CH3; 4b: R = 5-〇13或 4c :R = 5-OCH 3。
[0041] 2)化合物5的合成：
[0042] 圆底烧瓶中加入0. 5mmol化合物2即2-溴-8-甲酰基TB，0. 75mmol取代-2-羟 基苯乙酮，所述的取代-2-羟基苯乙酮为4-0CH3-2-羟基苯乙酮；5-CH 3_2-羟基苯乙酮或 5-0CH3-2-羟基苯乙酮，I. 8mmol NaOH和5mL无水乙醇，60°C反应，薄层层析跟踪，溶液变为 橙色；反应完毕后，冷却至室温，加入冰水，用IM HCl调pH至3-4。抽滤，水洗，滤饼用柱层 析提纯，石油醚：乙酸乙醋=2:1，得橙色粉末化合物5,所述的化合物为5a:R = 4-0CH3; 5b:R = 5-〇13或 5c :R = 5-0CH3。
[0043] 3)化合物6的合成：
[0044] 圆底烧瓶中加入0· 5mmol化合物3即2, 8-二-4' -甲酰基苯基ΤΒ，0· 75mmol取 代-2-羟基苯乙酮，所述的取代-2-羟基苯乙酮为6al: R = 5-CH3;6al :R = 5-OCH 3或6b : R1= 5-0CH 3, R2= H，I. 8mmol NaOH和5mL无水乙醇，60°C反应，薄层层析跟踪，溶液变为橙 色；反应完毕后，冷却至室温，加入冰水，用IM HCl调pH至3-4。抽滤，水洗，滤饼用柱层析 提纯，石油醚：乙酸乙酯=2:1，得橙色粉末化合物6，所述的化合物6为TB-黄酮类化合物。 [0045] 2、TB-黄酮类化合物的合成方法：
[0046]
[0047] I) TB-二a頁0同化甘物丫的甘成
[0048] 将0. 5mmol化合物5溶于15mL乙醇中，加入0. 5mmol醋酸钠，回流搅拌反应24h， TLC跟踪至反应完全，冷却至室温，加入水10mL，抽滤，滤饼柱层析分离（石油醚：乙酸乙酯 =4:1)，得浅黄色固体7即TB二氢黄酮化合物。
[0049] 2) TB-黄酮化合物8的合成
[0050] 圆底烧瓶中加入0. 5mmol化合物5和3mL DMSO, 130°C反应2d，TLC跟踪至反应完 全，冷却至室温，加入水10mL，抽滤，滤饼柱层析分离，石油醚：乙酸乙酯=2:1，得浅黄色固 体化合物8即TB黄酮化合物。
[0051] 3、TB-苯并咪唑类化合物的合成方法：
[0052]
[0053] TB-苯并咪唑类化合物9的合成[0054] 圆底烧瓶中加入0. 25mmol化合物3,0. 75mmol苯二胺和0. 03g SSA，并加入5mL CH2Cl2，室温下搅拌至反应完全，柱层析，石油醚：乙酸乙酯=1:1，得黄色固体化合物9即 TB苯并咪唑类化合物。
[0055] 4、产物的抗人肝癌H印G2细胞活性：
[0056] 细胞的培养
[0057] 将解冻复苏的!fepG2细胞株接种于含10 %新生牛血清的DMEM培养基中，置于 37 °C、5 %的CO2饱和湿度培养箱中传代培养，取对数生长期细胞用于实验。
[0058] MTT法检测TB及其衍生物作用!fepG2细胞后的细胞抑制率
[0059] 1)取对数生长期HepG2细胞制成I X IOVmL单细胞悬液，接种于96孔板中，每孔 100uL，置37°C、5% CO2条件下培养24h，待细胞贴壁。
[0060] 2)移去原培养液，加入5ug/mL浓度的TB及其衍生物的培养基处理细胞，另设空白 对照组。将培养板置37°C，5% CO2细胞培养箱常规培养24h。
[0061] 3)实验终止4h以前，每孔加入5mg/mL的MTT溶液20uL (用PBS配制，pH = 7. 4， 0. 22um滤膜过滤除菌），终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加 DCM IOOuL/孔，室温 下振荡l〇min。
[0062] 4)在酶联免疫监测仪上测定各孔吸光度值（选择波长490nm)，重复3次。
[0063] 5)计算TB衍生物对!fepG2细胞的抑制率：
[0064] 抑制率％ = [1-(加药细胞OD-空白组0D)八对照细胞00-空白组00)]父100%。
[0065] 表1 5ug/mL产物对人肝癌!fepG2细胞的抑制率（％ )
[0066]
[0067] MTT测定结果表明，当浓度仅为5ug/mL时，化合物4a、5a、5b、7a、8b和9a对H印G2 细胞的增殖即具有明显的抑制作用，其抑制率超过10% (表1)。
[0068] 为进一步研宄浓度对细胞凋亡的影响，分别配制该10个化合物的25ug/mL和 50ug/mL两种浓度溶液并测试其对H印G2细胞的增殖抑制作用（表2)。
[0069] 表2不同浓度TB衍生物对人肝癌H印G2细胞的抑制率（％ )
[0070]
[0071] 结果显示，随着浓度的增加，这些化合物对H印G2细胞增殖的抑制率明显上升。令 人兴奋的是，25ug/mL的5a和5b对H印G2细胞增殖的抑制率超过了 80%，50ug/mL的5a和 7a对H印G2细胞增殖的抑制率超过了 90% (表2)，具有极高的深度研宄价值。
[0072] 实施例1 :以目标产物4a的合成为例。
[0073] 其合成步骤包括：1)以4-溴苯胺为起始原料与多聚甲醛在低温相下发生反应得 到化合物2, 8-二溴-TB ;2)以2, 8-二溴-TB为原料经甲酰化及Suzuki C-C偶联得到化合 物1 ;3)将化合物1与2-羟基-5-甲基苯酮进行羟醛缩合反应，得到目标化合物4a，共三 个步骤。1)4-溴苯胺与多聚甲醛在-15°C反应生成化合物2, 8-二溴-TB，其反应式如下：
[0074]
[0075] _15°C下，在250mL干燥的三口圆底烧瓶中加入60mmol对溴苯胺和120mmol多聚 甲醛，搅拌，用恒压漏斗缓慢滴入120mL三氟乙酸，变成枣红色溶液，滴加完毕后，(TC下继 续搅拌6天。反应完毕后，减压蒸掉TFA，将残液转至装有冰块的烧杯中，缓慢加入氨水中 和、CH 2Cl2萃取、水洗、无水Na2SO4干燥，柱层析分离产物（石油醚：乙酸乙酯=6:1)，得浅 黄色固体化合物2, 8-二溴-TB。
[0076] 2)化合物2, 8-二溴-TB经甲酰化及Suzuki C-C偶联得到化合物1其反应式如 下：
[0077]
[0078] IOOmL二颈瓶中加入5mmol化合物2, 8-二溴-TB，20mL无水三氟乙酸（THF)，氩气 保护下冷却至_78°C，缓慢滴加4. 8mL 2. 5M(12mmol)n-BuLi的正己烷溶液，控制时间I. 5h， 滴完后继续反应0. 5h，再注入I. 2mL无水N，N-二甲基甲酰胺（DMF)，2min滴完，缓慢恢复至 室温，反应12h，加20mL水淬灭反应，CH2Cl 2 (3 X 20mL)萃取，无水Na2SO4干燥有机相，柱层 析（石油醚：乙酸乙酯=1:1)得浅黄色固体化合物1。
[0079] 3)化合物1与2-羟基-5甲基苯乙酮发生羟醛缩合反应的目标产物4a，其反应式 如下：
[0080]
[0081] 圆底烧瓶中加入0. 5mmol化合物1、I. 25mmol 2-羟基-5-甲基苯乙酮和I. 8mmol NaOH，和5mL无水乙醇，60°C反应至溶液变为橙色（TLC跟踪）。反应完毕后，冷却至室 温，加入冰水，用IM HCl调pH至3-4。抽滤，水洗，滤饼用柱层析提纯（石油醚：乙酸乙 酯=2:1)，得橙色目标产物 4a 粉末。Μ·ρ·202· 1-203.0°C NMR(400MHz，Acetone) δ 1 2. 77 (s, 2H), 8. 04 (s, 2H), 7. 96 (s, 1H), 7. 92 (s, 1H), 7. 83 (s, 1H), 7. 79 (s, 1H), 7. 71 (d, J =8. 6Hz, 2H), 7. 50 (s, 2H), 7. 38 (d, J = 8. 5Hz, 2H), 7. 27 (d, J = 8. 4Hz, 2H), 6. 87 (d, J = 8. 4Hz, 2H), 4. 82 (s, 1H), 4. 77 (s, 1H), 4. 38 (s, 3H), 4. 33 (s, 1H), 2. 31 (s, 6H) ；HRMS (APCI) m/ z:calcd for C35H30N2O4 (M-H) ? 541. 2127 ；Found, 541. 2182.
【主权项】
1. 一种具有抗人肝癌H印G2细胞活性的TB类衍生物合成方法，其特征是：该TB类衍 生物合成方法包括：TB-查尔酮类化合物、TB-黄酮类化合物和TB-苯并咪唑类化合物，并通 过MTT法测定所述的TB衍生物的抗人肝癌H印G2细胞活性； 所述的TB-查尔酮类化合物的合成方法：1) 化合物4的合成： 圆底烧瓶中加入〇. 5mmol化合物1即2,8_二甲酰基TB，0. 75mmol取代-2-羟基 苯乙酮，所述的取代-2-羟基苯乙酮为4-0CH3-2-羟基苯乙酮；5-CH3_2-羟基苯乙酮或 5-0CH3-2-羟基苯乙酮，I. 8mmol NaOH和5mL无水乙醇，60°C反应，薄层层析跟踪，溶液变为 橙色；反应完毕后，冷却至室温，加入冰水，用IM HCl调pH至3-4 ;抽滤，水洗，滤饼用柱层 析提纯，石油醚：乙酸乙醋=2:1，得橙色粉末化合物4,所述的化合物4为4a:R = 4-0CH3;4b: R = 5-〇13或 4c :R = 5-0CH 3; 2) 化合物5的合成： 圆底烧瓶中加入〇. 5mmol化合物2即2-溴-8-甲酰基TB，0. 75mmol取代-2-羟基 苯乙酮，所述的取代-2-羟基苯乙酮为4-0CH3-2-羟基苯乙酮；5-CH3_2-羟基苯乙酮或 5-0CH3-2-羟基苯乙酮，I. 8mmol NaOH和5mL无水乙醇，60°C反应，薄层层析跟踪，溶液变为 橙色；反应完毕后，冷却至室温，加入冰水，用IM HCl调pH至3-4。抽滤，水洗，滤饼用柱层 析提纯，石油醚：乙酸乙醋=2:1，得橙色粉末化合物5,所述的化合物5为5a:R = 4-0CH3;5b:R = 5-〇13或 5c :R = 5-0CH3; 3) 化合物6的合成： 圆底烧瓶中加入0.5111111〇1化合物3即2,8-二-4'-甲酰基苯基18,0.75111111〇1取代-2-羟 基苯乙酮，所述的取代-2-羟基苯乙酮为6al:R = 5-CH3;6al:R = 5-0〇13或613 !R1 = 5-0CH3, R2= H，I. 8mmol NaOH和5mL无水乙醇，60°C反应，薄层层析跟踪，溶液变为橙色；反 应完毕后，冷却至室温，加入冰水，用IM HCl调pH至3-4 ;抽滤，水洗，滤饼用柱层析提纯， 石油醚：乙酸乙酯=2:1，得橙色粉末化合物6,所述的化合物6为TB-黄酮类化合物。 所述的TB-黄酮类化合物的合成方法：1. TB-二氢黄酮化合物7的合成 将0. 5mmol化合物5溶于15mL乙醇中，加入醋酸钠0. 5mmol，回流搅拌反应24h，TLC 跟踪至反应完全，冷却至室温，加入水10mL，抽滤，滤饼柱层析分离（石油醚：乙酸乙酯= 4:1)，得浅黄色固体7即TB二氢黄酮化合物； 2. TB-黄酮化合物8的合成 圆底烧瓶中加入〇. 5mmol化合物5和3mL DMSO, 130°C反应2d，TLC跟踪至反应完全， 冷却至室温，加入水10mL，抽滤，滤饼柱层析分离，石油醚：乙酸乙酯=2:1，得浅黄色固体 化合物8即TB黄酮化合物； 所述的TB-苯并咪唑类化合物的合成方法：3. TB-苯并咪唑类化合物9的合成 圆底烧瓶中加入〇. 25mmol化合物3,0. 75mmol苯二胺和0. 03g SSA，并加入5mL CH2Cl2, 室温下搅拌至反应完全，柱层析，石油醚：乙酸乙酯=1:1，得黄色固体化合物9即TB苯并 咪唑类化合物。
【专利摘要】一种具有抗人肝癌HepG2细胞活性的TB类衍生物合成方法，属于TB类衍生物合成方法。本发明采用不同的醛基取代-TB衍生物与邻羟基苯乙酮类化合物发生羟醛缩合反应，得到TB-查尔酮类化合物；不同的醛基取代的TB衍生物与苯二胺在硅磺酸(SSA)的催化下经缩合反应得到TB-苯并咪唑类化合物，再以TB-查尔酮类化合物为原料控制不同的反应条件，得到一系列TB-黄酮类化合物。初步研究了这两种不同类型的TB类衍生物对抗人肝癌HepG2细胞的活性，从中筛选得到了6个抗人肝癌HepG2细胞活性优良的产物，为将其开发为抗肝癌新药打下了基础。优点：反应产率较高。反应条件温和，操作简单，反应时间特别短，产率高，后处理简便。反应绿色环保，经济高效，具有极高的实际应用价值。
【IPC分类】C07D487/08, A61P35/00
【公开号】CN104892616
【申请号】CN201510272697
【发明人】王园江, 宛瑜, 黄树颖, 吴翚
【申请人】江苏师范大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月25日
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种TB类衍生物合成方法，特别是一种具有抗人肝癌H印G2细胞活性 的TB类衍生物合成方法。
【背景技术】
[0002] 由于环境污染及不良的生活习惯影响，恶性肿瘤已成为人类健康的头号杀手，其 中，肝癌是最常见的恶性肿瘤之一。目前，癌症的治疗方法有手术治疗、放射治疗及药物治 疗等。早期肝癌进行根治的有效方法是手术疗法，但由于肝癌早期症状不明显，大部分患者 就诊时已经是晚期，尽管勉强进行手术切除，但因临床易转移和复发，总体效果较差。近年 来，人们一直在不断的研制新药来对抗这种疾病，药物作为治疗肝癌的重要手段，一方面可 以减少患者的病痛、延长生存时间，另一方面，对于将来攻克彻底治疗这一难题具有实际的 意义。
[0003] 黄酮类化合物主要骨架由两个苯环（A和B)和三个碳相互连接而成（图1)，根据 C3的氧化程度、B环连接位置以及三碳链是否成环等特点，可将其分为10种不同的类型，而 每一种类型都有一定的药理活性，因此在实际当中被广泛应用于医药、食品及化妆品等行 业。
[0004] 苯并咪唑类化合物是一类重要的含氮杂环化合物，存在于多种药物中。该类化合 物主要依靠杂环上的Ν、Η、0活性部分与细菌体内蛋白质中DNA形成氢键，并破坏DNA结构， 对多种生物体内的酶和受体都具有抑制作用。由于苯并咪唑类化合物及其配合物所具有的 良好药理和生物活性，如抗溃疡、抗高血压、抗真菌、抗癌、杀虫、除草等药用价值，已广泛应 用于医药和农药行业，并显示出良好的药效。
[0005] TB及其衍生物所具有的特殊V型腔状结构和多个氢键结合位点，可以与DNA相互 作用，因此本发明将TB、黄酮以及苯并咪唑类化合物进行强强联合，首次设计合成了 TB-查 尔酮类化合物、TB-黄酮类化合物和TB-苯并咪唑类化合物，希望通过二者的强强联合筛选 到具有抗肝癌活性的化合物，为将其开发为抗肝癌新药打下基础。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是要提供一种具有抗人肝癌H印G2细胞活性的TB类衍生物合成方 法，解决的问题。
[0007] 本发明的目的是这样实现的：该TB类衍生物合成方法包括：TB-查尔酮类化合物、 TB-黄酮类化合物和TB-苯并咪唑类化合物，并通过MTT法测定所述的TB衍生物的抗人肝 癌HepG2细胞活性。
[0008] 1、TB-查尔酮类化合物的合成方法：
[0009]
[0010] 1)化合物4的合成：
[0011] 圆底烧瓶中加入0.5111111〇1化合物1即2,8-二甲酰基了8,0.75111111〇1取代-2-羟 基苯乙酮，所述的取代-2-羟基苯乙酮为4-0CH 3-2-羟基苯乙酮；5-CH3_2-羟基苯乙酮或 5-0CH3-2-羟基苯乙酮，I. 8mmol NaOH和5mL无水乙醇，60°C反应，薄层层析跟踪，溶液变为 橙色；反应完毕后，冷却至室温，加入冰水，用IM HCl调pH至3-4 ;抽滤，水洗，滤饼用柱层 析提纯，石油醚：乙酸乙醋=2:1，得橙色粉末化合物4,所述的化合物4为4a:R = 4-0CH3; 4b: R = 5-〇13或 4c :R = 5-0CH 3;
[0012] 2)化合物5的合成：
[0013] 圆底烧瓶中加入0. 5mmol化合物2即2-溴-8-甲酰基TB，0. 75mmol取代-2-羟 基苯乙酮，所述的取代-2-羟基苯乙酮为4-0CH3-2-羟基苯乙酮；5-CH 3_2-羟基苯乙酮或 5-0CH3-2-羟基苯乙酮，I. 8mmol NaOH和5mL无水乙醇，60°C反应，薄层层析跟踪，溶液变为 橙色；反应完毕后，冷却至室温，加入冰水，用IM HCl调pH至3-4。抽滤，水洗，滤饼用柱层 析提纯，石油醚：乙酸乙醋=2:1，得橙色粉末化合物5,所述的化合物5为5a:R = 4-0CH3; 5b:R = 5-〇13或 5c :R = 5-0CH3;
[0014] 3)化合物6的合成：
[0015] 圆底烧瓶中加入0.5111111〇1化合物3即2,8-二-4'-甲酰基苯基了8,0.75111111〇1取 代-2-羟基苯乙酮，所述的取代-2-羟基苯乙酮为6al: R = 5-CH3;6al :R = 5-0CH 3或6b : R1= 5-0CH 3, R2= H，I. 8mmol NaOH和5mL无水乙醇，60°C反应，薄层层析跟踪，溶液变为橙 色；反应完毕后，冷却至室温，加入冰水，用IM HCl调pH至3-4。抽滤，水洗，滤饼用柱层析 提纯，石油醚：乙酸乙酯=2:1，得橙色粉末化合物6，所述的化合物6为TB-黄酮类化合物。
[0016] 2、TB-黄酮类化合物的合成方法：
[0017]
[0018] I) TB-二氢黄酮化合物7的合成
[0019] 将0. 5mmol化合物5溶于15mL乙醇中，加入醋酸钠0. 5mmol，回流搅拌反应24h， TLC跟踪至反应完全，冷却至室温，加入水10mL，抽滤，滤饼柱层析分离（石油醚：乙酸乙酯 =4:1)，得浅黄色固体7即TB二氢黄酮化合物。
[0020] 2) TB黄酮化合物8的合成
[0021] 圆底烧瓶中加入0. 5mmol化合物5和3mL DMSO, 130°C反应2d，TLC跟踪至反应完 全，冷却至室温，加入水10mL，抽滤，滤饼柱层析分离，石油醚：乙酸乙酯=2:1，得浅黄色固 体化合物8即TB黄酮化合物。
[0022] 3、TB-苯并咪唑类化合物的合成方法：
[0023]
[0024] TB苯并咪唑类化合物9的合成：
[0025] 圆底烧瓶中加入0. 25mmol化合物3,0. 75mmol苯二胺和0. 03g SSA，并加入5mL CH2Cl2，室温下搅拌至反应完全，柱层析，石油醚：乙酸乙酯=1:1，得黄色固体化合物9即 TB苯并咪唑类化合物。
[0026] 本发明的优点和效果在于：本发明将查尔酮、苯并咪唑等具有生理活性的片断引 入TB骨架，首次设计合成了含有苯并咪唑、查尔酮等取代基的新型朝格尔碱衍生物，希望 通过二者的强强联合筛选到具有抗肝癌活性的化合物，解决了目前康肝癌药物严重缺乏的 问题。
[0027] 1、可简便快速得到含有苯并咪唑、查尔酮等取代基的新型朝格尔碱衍生物。
[0028] 2、反应的产率普遍较高，显示出底物的普适性。
[0029] 3、反应条件温和，操作简单，反应时间特别短，产率高，后处理简便。
[0030] 4、反应绿色环保，经济高效，具有极高的实际应用价值。
[0031] 5、6个产物具有优良的抗人肝癌HepG2细胞活性，具有开发为抗肝癌新药的潜力。
【附图说明】：
[0032] 图1是现有技术的黄酮类化合物的基本骨架图。
[0033] 图2是本发明的TB-查尔酮类化合物结构图。
[0034] 图3是本发明的TB-黄酮类化合物结构图。
[0035] 图4是本发明的TB-苯并咪唑类化合物结构图。
【具体实施方式】
[0036] 该TB类衍生物合成方法包括：TB-查尔酮类化合物、TB-黄酮类化合物和TB-苯并 咪唑类化合物，并通过MTT法测定所述的TB衍生物的抗人肝癌H印G2细胞活性；
[0037] 1、TB-查尔酮类化合物的合成方法：
[0038]
[0039] 1)化合物4的合成：
[0040] 圆底烧瓶中加入0.5臟〇1化合物1即2,8-二甲酰基了8,0.75臟〇1取代-2-羟 基苯乙酮，所述的取代-2-羟基苯乙酮为4-0CH 3-2-羟基苯乙酮；5-CH3_2-羟基苯乙酮或 5-0CH3-2-羟基苯乙酮，I. 8mmol NaOH和5mL无水乙醇，60°C反应，薄层层析跟踪，溶液变为 橙色；反应完毕后，冷却至室温，加入冰水，用IM HCl调pH至3-4 ;抽滤，水洗，滤饼用柱层 析提纯，石油醚：乙酸乙醋=2:1，得橙色粉末化合物4,所述的化合物4为4a:R = 4-0CH3; 4b: R = 5-〇13或 4c :R = 5-OCH 3。
[0041] 2)化合物5的合成：
[0042] 圆底烧瓶中加入0. 5mmol化合物2即2-溴-8-甲酰基TB，0. 75mmol取代-2-羟 基苯乙酮，所述的取代-2-羟基苯乙酮为4-0CH3-2-羟基苯乙酮；5-CH 3_2-羟基苯乙酮或 5-0CH3-2-羟基苯乙酮，I. 8mmol NaOH和5mL无水乙醇，60°C反应，薄层层析跟踪，溶液变为 橙色；反应完毕后，冷却至室温，加入冰水，用IM HCl调pH至3-4。抽滤，水洗，滤饼用柱层 析提纯，石油醚：乙酸乙醋=2:1，得橙色粉末化合物5,所述的化合物为5a:R = 4-0CH3; 5b:R = 5-〇13或 5c :R = 5-0CH3。
[0043] 3)化合物6的合成：
[0044] 圆底烧瓶中加入0· 5mmol化合物3即2, 8-二-4' -甲酰基苯基ΤΒ，0· 75mmol取 代-2-羟基苯乙酮，所述的取代-2-羟基苯乙酮为6al: R = 5-CH3;6al :R = 5-OCH 3或6b : R1= 5-0CH 3, R2= H，I. 8mmol NaOH和5mL无水乙醇，60°C反应，薄层层析跟踪，溶液变为橙 色；反应完毕后，冷却至室温，加入冰水，用IM HCl调pH至3-4。抽滤，水洗，滤饼用柱层析 提纯，石油醚：乙酸乙酯=2:1，得橙色粉末化合物6，所述的化合物6为TB-黄酮类化合物。 [0045] 2、TB-黄酮类化合物的合成方法：
[0046]
[0047] I) TB-二a頁0同化甘物丫的甘成
[0048] 将0. 5mmol化合物5溶于15mL乙醇中，加入0. 5mmol醋酸钠，回流搅拌反应24h， TLC跟踪至反应完全，冷却至室温，加入水10mL，抽滤，滤饼柱层析分离（石油醚：乙酸乙酯 =4:1)，得浅黄色固体7即TB二氢黄酮化合物。
[0049] 2) TB-黄酮化合物8的合成
[0050] 圆底烧瓶中加入0. 5mmol化合物5和3mL DMSO, 130°C反应2d，TLC跟踪至反应完 全，冷却至室温，加入水10mL，抽滤，滤饼柱层析分离，石油醚：乙酸乙酯=2:1，得浅黄色固 体化合物8即TB黄酮化合物。
[0051] 3、TB-苯并咪唑类化合物的合成方法：
[0052]
[0053] TB-苯并咪唑类化合物9的合成[0054] 圆底烧瓶中加入0. 25mmol化合物3,0. 75mmol苯二胺和0. 03g SSA，并加入5mL CH2Cl2，室温下搅拌至反应完全，柱层析，石油醚：乙酸乙酯=1:1，得黄色固体化合物9即 TB苯并咪唑类化合物。
[0055] 4、产物的抗人肝癌H印G2细胞活性：
[0056] 细胞的培养
[0057] 将解冻复苏的!fepG2细胞株接种于含10 %新生牛血清的DMEM培养基中，置于 37 °C、5 %的CO2饱和湿度培养箱中传代培养，取对数生长期细胞用于实验。
[0058] MTT法检测TB及其衍生物作用!fepG2细胞后的细胞抑制率
[0059] 1)取对数生长期HepG2细胞制成I X IOVmL单细胞悬液，接种于96孔板中，每孔 100uL，置37°C、5% CO2条件下培养24h，待细胞贴壁。
[0060] 2)移去原培养液，加入5ug/mL浓度的TB及其衍生物的培养基处理细胞，另设空白 对照组。将培养板置37°C，5% CO2细胞培养箱常规培养24h。
[0061] 3)实验终止4h以前，每孔加入5mg/mL的MTT溶液20uL (用PBS配制，pH = 7. 4， 0. 22um滤膜过滤除菌），终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加 DCM IOOuL/孔，室温 下振荡l〇min。
[0062] 4)在酶联免疫监测仪上测定各孔吸光度值（选择波长490nm)，重复3次。
[0063] 5)计算TB衍生物对!fepG2细胞的抑制率：
[0064] 抑制率％ = [1-(加药细胞OD-空白组0D)八对照细胞00-空白组00)]父100%。
[0065] 表1 5ug/mL产物对人肝癌!fepG2细胞的抑制率（％ )
[0066]
[0067] MTT测定结果表明，当浓度仅为5ug/mL时，化合物4a、5a、5b、7a、8b和9a对H印G2 细胞的增殖即具有明显的抑制作用，其抑制率超过10% (表1)。
[0068] 为进一步研宄浓度对细胞凋亡的影响，分别配制该10个化合物的25ug/mL和 50ug/mL两种浓度溶液并测试其对H印G2细胞的增殖抑制作用（表2)。
[0069] 表2不同浓度TB衍生物对人肝癌H印G2细胞的抑制率（％ )
[0070]
[0071] 结果显示，随着浓度的增加，这些化合物对H印G2细胞增殖的抑制率明显上升。令 人兴奋的是，25ug/mL的5a和5b对H印G2细胞增殖的抑制率超过了 80%，50ug/mL的5a和 7a对H印G2细胞增殖的抑制率超过了 90% (表2)，具有极高的深度研宄价值。
[0072] 实施例1 :以目标产物4a的合成为例。
[0073] 其合成步骤包括：1)以4-溴苯胺为起始原料与多聚甲醛在低温相下发生反应得 到化合物2, 8-二溴-TB ;2)以2, 8-二溴-TB为原料经甲酰化及Suzuki C-C偶联得到化合 物1 ;3)将化合物1与2-羟基-5-甲基苯酮进行羟醛缩合反应，得到目标化合物4a，共三 个步骤。1)4-溴苯胺与多聚甲醛在-15°C反应生成化合物2, 8-二溴-TB，其反应式如下：
[0074]
[0075] _15°C下，在250mL干燥的三口圆底烧瓶中加入60mmol对溴苯胺和120mmol多聚 甲醛，搅拌，用恒压漏斗缓慢滴入120mL三氟乙酸，变成枣红色溶液，滴加完毕后，(TC下继 续搅拌6天。反应完毕后，减压蒸掉TFA，将残液转至装有冰块的烧杯中，缓慢加入氨水中 和、CH 2Cl2萃取、水洗、无水Na2SO4干燥，柱层析分离产物（石油醚：乙酸乙酯=6:1)，得浅 黄色固体化合物2, 8-二溴-TB。
[0076] 2)化合物2, 8-二溴-TB经甲酰化及Suzuki C-C偶联得到化合物1其反应式如 下：
[0077]
[0078] IOOmL二颈瓶中加入5mmol化合物2, 8-二溴-TB，20mL无水三氟乙酸（THF)，氩气 保护下冷却至_78°C，缓慢滴加4. 8mL 2. 5M(12mmol)n-BuLi的正己烷溶液，控制时间I. 5h， 滴完后继续反应0. 5h，再注入I. 2mL无水N，N-二甲基甲酰胺（DMF)，2min滴完，缓慢恢复至 室温，反应12h，加20mL水淬灭反应，CH2Cl 2 (3 X 20mL)萃取，无水Na2SO4干燥有机相，柱层 析（石油醚：乙酸乙酯=1:1)得浅黄色固体化合物1。
[0079] 3)化合物1与2-羟基-5甲基苯乙酮发生羟醛缩合反应的目标产物4a，其反应式 如下：
[0080]
[0081] 圆底烧瓶中加入0. 5mmol化合物1、I. 25mmol 2-羟基-5-甲基苯乙酮和I. 8mmol NaOH，和5mL无水乙醇，60°C反应至溶液变为橙色（TLC跟踪）。反应完毕后，冷却至室 温，加入冰水，用IM HCl调pH至3-4。抽滤，水洗，滤饼用柱层析提纯（石油醚：乙酸乙 酯=2:1)，得橙色目标产物 4a 粉末。Μ·ρ·202· 1-203.0°C NMR(400MHz，Acetone) δ 1 2. 77 (s, 2H), 8. 04 (s, 2H), 7. 96 (s, 1H), 7. 92 (s, 1H), 7. 83 (s, 1H), 7. 79 (s, 1H), 7. 71 (d, J =8. 6Hz, 2H), 7. 50 (s, 2H), 7. 38 (d, J = 8. 5Hz, 2H), 7. 27 (d, J = 8. 4Hz, 2H), 6. 87 (d, J = 8. 4Hz, 2H), 4. 82 (s, 1H), 4. 77 (s, 1H), 4. 38 (s, 3H), 4. 33 (s, 1H), 2. 31 (s, 6H) ；HRMS (APCI) m/ z:calcd for C35H30N2O4 (M-H) ? 541. 2127 ；Found, 541. 2182.
【主权项】
1. 一种具有抗人肝癌H印G2细胞活性的TB类衍生物合成方法，其特征是：该TB类衍 生物合成方法包括：TB-查尔酮类化合物、TB-黄酮类化合物和TB-苯并咪唑类化合物，并通 过MTT法测定所述的TB衍生物的抗人肝癌H印G2细胞活性； 所述的TB-查尔酮类化合物的合成方法：1) 化合物4的合成： 圆底烧瓶中加入〇. 5mmol化合物1即2,8_二甲酰基TB，0. 75mmol取代-2-羟基 苯乙酮，所述的取代-2-羟基苯乙酮为4-0CH3-2-羟基苯乙酮；5-CH3_2-羟基苯乙酮或 5-0CH3-2-羟基苯乙酮，I. 8mmol NaOH和5mL无水乙醇，60°C反应，薄层层析跟踪，溶液变为 橙色；反应完毕后，冷却至室温，加入冰水，用IM HCl调pH至3-4 ;抽滤，水洗，滤饼用柱层 析提纯，石油醚：乙酸乙醋=2:1，得橙色粉末化合物4,所述的化合物4为4a:R = 4-0CH3;4b: R = 5-〇13或 4c :R = 5-0CH 3; 2) 化合物5的合成： 圆底烧瓶中加入〇. 5mmol化合物2即2-溴-8-甲酰基TB，0. 75mmol取代-2-羟基 苯乙酮，所述的取代-2-羟基苯乙酮为4-0CH3-2-羟基苯乙酮；5-CH3_2-羟基苯乙酮或 5-0CH3-2-羟基苯乙酮，I. 8mmol NaOH和5mL无水乙醇，60°C反应，薄层层析跟踪，溶液变为 橙色；反应完毕后，冷却至室温，加入冰水，用IM HCl调pH至3-4。抽滤，水洗，滤饼用柱层 析提纯，石油醚：乙酸乙醋=2:1，得橙色粉末化合物5,所述的化合物5为5a:R = 4-0CH3;5b:R = 5-〇13或 5c :R = 5-0CH3; 3) 化合物6的合成： 圆底烧瓶中加入0.5111111〇1化合物3即2,8-二-4'-甲酰基苯基18,0.75111111〇1取代-2-羟 基苯乙酮，所述的取代-2-羟基苯乙酮为6al:R = 5-CH3;6al:R = 5-0〇13或613 !R1 = 5-0CH3, R2= H，I. 8mmol NaOH和5mL无水乙醇，60°C反应，薄层层析跟踪，溶液变为橙色；反 应完毕后，冷却至室温，加入冰水，用IM HCl调pH至3-4 ;抽滤，水洗，滤饼用柱层析提纯， 石油醚：乙酸乙酯=2:1，得橙色粉末化合物6,所述的化合物6为TB-黄酮类化合物。 所述的TB-黄酮类化合物的合成方法：1. TB-二氢黄酮化合物7的合成 将0. 5mmol化合物5溶于15mL乙醇中，加入醋酸钠0. 5mmol，回流搅拌反应24h，TLC 跟踪至反应完全，冷却至室温，加入水10mL，抽滤，滤饼柱层析分离（石油醚：乙酸乙酯= 4:1)，得浅黄色固体7即TB二氢黄酮化合物； 2. TB-黄酮化合物8的合成 圆底烧瓶中加入〇. 5mmol化合物5和3mL DMSO, 130°C反应2d，TLC跟踪至反应完全， 冷却至室温，加入水10mL，抽滤，滤饼柱层析分离，石油醚：乙酸乙酯=2:1，得浅黄色固体 化合物8即TB黄酮化合物； 所述的TB-苯并咪唑类化合物的合成方法：3. TB-苯并咪唑类化合物9的合成 圆底烧瓶中加入〇. 25mmol化合物3,0. 75mmol苯二胺和0. 03g SSA，并加入5mL CH2Cl2, 室温下搅拌至反应完全，柱层析，石油醚：乙酸乙酯=1:1，得黄色固体化合物9即TB苯并 咪唑类化合物。
【专利摘要】一种具有抗人肝癌HepG2细胞活性的TB类衍生物合成方法，属于TB类衍生物合成方法。本发明采用不同的醛基取代-TB衍生物与邻羟基苯乙酮类化合物发生羟醛缩合反应，得到TB-查尔酮类化合物；不同的醛基取代的TB衍生物与苯二胺在硅磺酸(SSA)的催化下经缩合反应得到TB-苯并咪唑类化合物，再以TB-查尔酮类化合物为原料控制不同的反应条件，得到一系列TB-黄酮类化合物。初步研究了这两种不同类型的TB类衍生物对抗人肝癌HepG2细胞的活性，从中筛选得到了6个抗人肝癌HepG2细胞活性优良的产物，为将其开发为抗肝癌新药打下了基础。优点：反应产率较高。反应条件温和，操作简单，反应时间特别短，产率高，后处理简便。反应绿色环保，经济高效，具有极高的实际应用价值。
【IPC分类】C07D487/08, A61P35/00
【公开号】CN104892616
【申请号】CN201510272697
【发明人】王园江, 宛瑜, 黄树颖, 吴翚
【申请人】江苏师范大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月25日
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