一种高纯度水黄皮素的制备方法
一种高纯度水黄皮素的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及化合物制备领域，具体涉及一种高纯度水黄皮素的制备方法。
【背景技术】
[0002] 化学对照品又称标准品，是中药质量标准研宄、质量检测和质量控制的实物对照， 中药化学对照品的研宄，是中药标准化研宄的一个非常重要的部分，对产品的质量评价，特 别是在药品生产的质量控制中，中药化学对照品起着极其重大的作用，是中药质量控制的 基础与核心。
[0003] 水黄皮素是一种呋喃黄酮类化学成分，是植物活性成分之一，也是许多植物和药 品标准质量控制的指标性成分。目前尚未相应的国家药品标准物质，国内外对水黄皮素中 药化学对照品的系统研宄未见报道，参照中药化学对照品（供含量测定用）的技术要求，对 水黄皮素化学对照品进行研宄，建立水黄皮素化学对照品的批量提取工艺、纯度与含量以 及杂质检查的分析测定方法，从而建立水黄皮素化学对照品的技术标准，为其作为中药化 学对照品以及药材和制剂的质量标准研宄提供科学基础和保证。
[0004] 水黄皮素是从豆科植物干花豆/7OrtZia 干豆花叶植物分离得 到的活性物质，从公开文献所知，文献报道水黄皮素的提取分离过程和含量测定方法，如： 1.【题名】水黄皮化学成分的研宄：干燥的水黄皮叶粗粉8 kg，用10倍量的75乙醇提取3 次，提取液浓缩后得总浸膏2.1 kg。将浸膏混悬于水中，用石油醚萃取至萃取液基本无色， 合并及浓缩萃取液，得石油醚部分（124 g)。将石油醚萃取物75 g经反复硅胶柱色谱分离， 用石油醚、石油醚一醋酸乙酯梯度洗脱，得水黄皮素单体。2.【题名】玉郎伞的化学成分分 析：取玉郎伞粗粉，用95%乙醇（相当药材10倍量）渗漉，收集渗漉液浓缩得黄色沉淀物 (收率0.27%)，经氯仿回流得氯仿溶出物（收率0.16%)。取上述氯仿溶出物，用100~ 200目硅胶拌和均匀后低温干燥，研细后上硅胶柱（湿法装柱），用氯仿、氯仿一甲醇梯度洗 脱，收集到73个组分，TLC检识，合并斑点相同组分，经反复柱层析和薄层分离制备，用丙酮 多次重结晶纯化，分离得到水黄皮素单体。3.【题名】壮药干花豆枝叶化学成分研宄：干花 豆枝叶15Kg，阴干，粉碎，用95%乙醇冷浸提取3次，合并提取液减压浓缩，得乙醇浸膏约 500 g。所得浸膏加水混悬后依次用石油醚2 L萃取后处理得石油醚浸膏30 g，醋酸乙酯2 L萃取后处理得醋酸乙酯浸膏50 g，正丁醇2 L萃取后处理得正丁醇浸膏45 g，萃取后水 溶液浓缩得水部分200g。取醋酸乙酯浸膏45 g经硅胶柱色谱，以氯仿一甲醇（100:0 - 0: 100)梯度洗脱，每份200 mL，经TLC薄层检测合并成分相近部位，Fr. III经硅胶柱色谱，石 油醚一醋酸乙酯（20 :1)洗脱，收集流分，通过C18、S印hadexLH-20等反复柱色谱分离得到 水黄皮素单体。4.【题名】水黄皮化学成分及抗氧化活性研宄：对水黄皮叶粗粉采用75%乙 醇提取，再经过石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇等不同极性溶剂萃取，共分成四个不同极 性部位。然后用硅胶柱层析、聚酰胺柱层析、大孔吸附树脂和葡聚糖凝胶（Sephadex LH-20) 等多种层析分离手段得到水黄皮素。5.【题名】RP-HPLC法测定水黄皮药材中水黄皮素的 含量：建立RP-HPLC测定水黄皮药材中水黄皮素含量的方法。6.【题名】HPLC法测定玉郎 伞中水黄皮素的含量：建立高效液相色谱法测定玉郎伞中水黄皮素含量的方法。7.【题名】 HPLC法测定肿痛宁酊中水黄皮素的含量：建立HPLC法测定肿痛宁酊中水黄皮素的含量。 8.【题名】薄层色谱一荧光分析法测定水罗伞药材中水黄皮素含量的研宄：建立薄层色谱一 荧光分光光度法测定水罗伞中水黄皮素含量的方法。9.【题名】水罗伞药材的鉴别及水黄 皮素的含量测定：采用性状、显微、TLC等法鉴别水罗伞药材真伪；采用HPLC法测定水罗伞 药材中水黄皮素的含量，药材检查等项参照中国药典方法测定，制订壮药材水罗伞的质量 标准。10.【名称】一种高含量水黄皮素的提纯方法，申请号201010263044. 5的发明专利申 请公开了一种高含量水黄皮素的提纯方法，具体方法包括：将干花豆茎枝粉碎，用一定浓 度乙醇提取、浓缩，石油醚萃取两次，萃余液上大孔树脂，洗脱液浓缩再上聚酰胺柱分离 纯化，95%乙醇重结晶即得。
[0005] 上述方法从不同角度论述了水黄皮素的提取分离，分离纯度较高，但纯度大多数 未达到中药化学对照品的要求，即纯度大于98%，无法满足高纯度水黄皮素化学对照品的需 要。
[0006] 通过对水黄皮素化学对照品进行研宄，建立水黄皮素化学对照品的批量提取工 艺、纯度与含量以及杂质检查的分析测定方法，从而建立水黄皮素化学对照品的技术标准， 为其作为中药化学对照品以及药材和制剂的质量标准研宄提供科学基础和保证。研宄结果 可为水黄皮素化学对照品提供更完整的基础化学依据，掌握其化学信息和分析测试技术， 有利于相关产品的进一步开发利用，而且对于开发我国特有产物，开发具有高技术、高附加 值的产品，提高市场竞争能力，将会产生潜在而不可估量的社会效益与经济效益。今后生产 的各种产品，无论是在国内或是进入国际市场，都需要靠高水平的质量标准和高水平的分 析测试技术来获得发展和提高，否则将失去市场，产品的质量标准和检测方法变得愈来愈 重要，"安全、有效和质量可控"的用药标准已成为国际共识，药品生产应围绕着这一中心展 开，其核心为质量标准控制水平，而化学对照品则起关键的作用。但目前大部分中药药材及 其制剂，因化学成分不明或无化学对照品，无法阐明其作用的化学物质基础，也无法进行质 量控制，而不能被现代文明社会所接受，也成为中草药和天然药物难以进入国际药品市场 的制约关键，技术壁皇给发展中药产业带来了困难，因此，进行中草药化学成分的研宄及质 量标准规范化研宄是中药现代化发展的必经之路，对阐明中草药作用的物质基础以及中草 药制剂的生产加工工艺的制定、伪劣产品的鉴别等等具有重要的意义。毫无疑问，对水黄皮 素进行质量标准研宄，建立规范化的分析测试方法，制定高技术水平的控制水黄皮素质量 的检测指标和分析方法，使之科学化、规范化，增强国际竞争力，为中药进入国际市场创造 条件，具有重大的实际意义和学术价值。
[0007] 水黄皮素作为植物、药材及其产品的化学对照品，是质量控制的技术关键，众多企 业、科研和检验部门都需要高纯度的水黄皮素对照品，其市场需求很大，由于水黄皮素在药 材中的含量低，提取分离技术要求很高、难度很大。本发明进行水黄皮素中药化学标准品制 备及其质量控制技术研宄，解决高纯度水黄皮素化学对照品的问题，对中药现代化的作用 是显而易见的，具有重大的实际意义和学术价值。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种高纯度水黄皮素的制备方法。
[0009] 本发明是从豆科植物干豆花/7OrtZia 的根中经提取、分离、精 制、纯化而制得的水黄皮素，其化学名、分子式、结构式如下： 中文名：水黄皮素 化学名：3-甲氧基-2-苯基-4H-呋喃[2, 3-Η]-1-苯并呋喃-4-酮（3-methoxy-2-phe nyl_4H-furo[2, 3-H]-1-benzopyran-4-one) 英文名：Karanjin 分子式：C18 H12 O4 结构式如下：
本发明的目的是通过下列的技术方案实现的： 本发明所述的高纯度水黄皮素的制备方法，具体包括如下步骤： 1) 干豆花的干燥根用乙醇回流提取，提取液滤过，合并滤液，回收乙醇，得浸膏； 2) 浸膏再经石油醚萃取，静置，合并石油醚层，浓缩得石油醚萃取物； 3) 石油醚萃取物经硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯-丙酮系统梯度洗脱，收集含水黄 皮素的流分，所述的石油醚-乙酸乙酯-丙酮系统梯度洗脱条件为：〇~A分钟，洗脱系统 为石油醚；B~C分钟，洗脱系统为石油醚-乙酸乙酯-丙酮，比例为10:1:2~6:4:1 ;所述 A为10~25,所述B为11~26,所述C为50~70 ; 4) 流分用TLC检测合并，浓缩，重结晶，即得纯度为重量含量80~90 %的水黄皮素粗 结晶； 5) 将水黄皮素粗结晶用制备高效液相色谱法分离纯化，收集水黄皮素组分； 6) 对所收集的每一份洗脱液利用HPLC检测，合并保留时间相同而且纯度在90%-98%之 间和纯度大于98%以上的水黄皮素，减压浓缩，得到纯度90%-98%之间以及大于98%以上的 水黄皮素。
[0010] 所述步骤1)中乙醇的加入量为药材重量的5-10倍，乙醇浓度为50-90%，回流提取 次数为2-8次。
[0011] 所述步骤5)制备高效液相色谱的色谱柱为C-18柱，甲醇-水为流动相洗脱，流速 为5~10 mL/min，检测波长为304nm，柱温为25-35°C。
[0012] 所述步骤4) TLC检测方法为：薄层板：硅胶G ;3种展开剂系统：系统（1)石油 酿-丙酮重量比例7:3,系统（2)二氯甲烧-丙酮重量比例9. 8:0. 2,系统（3)石油酿-乙 酸乙醋-丙酮重量比例8:1:1 ;点样：用甲醇制lmg/mL的溶液，在同一硅胶G板上，按不同 的点样量梯度点样，点样量分别为20 ug、40 ug、60 ug、 80 ug、100 ug;置展开缸分别展开， 展距：15cm ;定位：喷以5%硫酸乙醇溶液，晾干，在105°C加热至斑点显色清晰，置紫外灯 (365nm)下检视；结果在薄层色谱中，可见黄绿色的单一的荧光斑点，3种展开剂系统，5个 不同浓度的梯度点样，均为单一斑点，未见杂质斑点。
[0013] 所述步骤6)的HPLC检测方法为：色谱条件：色谱柱C-18,4. 6X250mm，IOum ;流 速：0. 6-1. 5ml/min ;进样量：10~20ul ;面积归一化法定量；系统条件为以下三个条件的 其中之一： 条件（1)流动相：甲醇-0. 2%磷酸溶液重量比例30:70-90:10,检测波长：260nm ; 条件（2)流动相：乙腈-0. 2%磷酸溶液重量比例30:70-80:20,检测波长：260nm ; 条件（3)流动相：乙腈-0. 2%磷酸溶液重量比例20:80-80:20,检测波长：304nm。
[0014] 优选的，所述步骤6)的系统条件（3)流动相：乙腈-0.2%磷酸溶液重量比例 30:70-80:20 ;检测波长：304nm。
[0015] 含量与纯度测定：精密称取于105°C干燥至恒重的对照品适量，加流动相溶液制 成每1ml含Img的溶液，在测定条件下，进样20ul (约相当于20ug)，注入液相色谱仪，用3 个流动相溶剂系统分别记录色谱图至主成分的出峰保留时间的2. 5倍以上，用面积归一化 法计算含量，结果系统测定对照品含量在均98%以上。杂质检查，分别在不同系统记录的色 谱图中，除溶剂峰外，杂质峰面积总和结果均小于2. 0%。
[0016] 峰纯度检测：取对照品适量，按流动相系统，在高效液相色谱仪上，用二极管阵列 DAD检测器进行峰纯度检查，水黄皮素的HPLC色谱峰>98%，其色谱峰紫外吸收光谱图，三维 图谱以及5点光谱图完全重合，表明为单一纯物质峰。
[0017] 结果：本发明分离、纯化的水黄皮素化学对照品，经红外光谱、紫外光谱、核磁共 振、质谱以及理化检测确认化学结构。经3个展开系统5个不同浓度的TLC检测，2个流动 相系统和2个不同波长的HPLC检测，同时对色谱峰用DAD做纯度检查，表明符合中药含量 测定用化学对照品的要求，含量大于98%。
[0018] -种高纯度水黄皮素，上述的制备方法制备而成，其纯度大于98%。
[0019] 本发明提供的一种高纯度水黄皮素的制备方法具有以下优点： 1、本发明设计合理，工艺简单，利用醇水溶剂提取，经过一次硅胶柱层析后重结晶即可 得到纯度较高的水黄皮素，最后经制备高效液相色谱法制备出纯度达到98%以上的水黄皮 素化学对照品，方法简便易行。
[0020] 2、本发明分离速度快，生产周期短，适合工业化生产，有很好的应用前景。
[0021] 3、本发明采用薄层色谱和高效液相色谱进行纯度检查、含量测定及质量控制，确 保产品的质量。
[0022] 4、本发明从干豆花中制备出纯度符合化学对照品要求，含量在98%以上的水黄皮 素，解决了水黄皮素化学对照品的供应问题，为干豆花药材的质量控制提供了提供科学基 础和保证。
【附图说明】
[0023] 图1是高纯度水黄皮素的制备工艺流程图； 图2是水黄皮素色谱峰紫外吸收光谱图； 图3是水黄皮素 DAD峰纯度检查HPLC色谱图； 图4是水黄皮素质量控制的HPLC检测色谱图。
【具体实施方式】
[0024] 下面通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明 本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明 要求保护的范围。除非另有说明，本发明中的乙醇量的百分数是体积百分数，v/v表示溶液 的体积比。
[0025] 对比例 干豆花的干燥根5kg，粉碎后加入6倍85%乙醇加热回流提取4次，每次2小时，合并 提取液；将提取液浓缩至原体积的1/4,用等体积量的石油醚超声萃取2次，弃去萃取液， 将萃余液上AB-8大孔吸附树脂柱，先用水洗脱至无色，然后用6倍柱体积80%甲醇洗脱， 收集，减压回收试剂，浓缩，所得浸膏通过聚酰胺柱层析，依次用乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲醇 (9 : 1)、乙酸乙酯-甲醇（9 : 4)梯度洗脱，收集洗脱液，回收试剂，浓缩至干得粗晶，用 95%乙醇反复重结晶5次，得纯度98. 8%水黄皮素产品。
[0026] 实施例1 : 一种高纯度水黄皮素的制备方法，具体步骤为： 1) 干豆花的干燥根5kg粉碎后用8倍重量的90%的乙醇回流提取3次，提取液滤过，合 并滤液，回收乙醇，得浸膏； 2) 浸膏再经石油醚萃取，静置，合并石油醚层，浓缩得石油醚萃取物； 3) 石油醚萃取物经硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯-丙酮系统梯度洗脱，收集含水黄 皮素的流分，所述的石油醚-乙酸乙酯-丙酮系统梯度洗脱条件为：0-20min，洗脱系统为石 油醚；21-50min，洗脱系统为石油醚-乙酸乙酯-丙酮，比例为8 :2 :1 ; 4) 流分用TLC检测合并，浓缩，重结晶，即得纯度为重量含量80~90%的水黄皮素粗 结晶； 5) 将水黄皮素粗结晶用制备高效液相色谱法分离纯化，收集水黄皮素组分； 6) 对所收集的每一份洗脱液利用HPLC检测，合并保留时间相同而且纯度在90%-98%之 间和纯度大于98%以上的水黄皮素，减压浓缩，得到纯度为92%以及98. 6%的水黄皮素。
[0027] 所述步骤5)制备高效液相色谱的色谱柱为C-18柱，甲醇-水：65:35为流动相洗 脱，流速为5mL/min，检测波长为304nm，柱温为25°C。
[0028] 所述步骤4) TLC检测方法为：取水黄皮素粗品加甲醇制成每1ml含Img的溶液， 在同一硅胶G薄层板上，分别按20 ug、40 ug、60 ug、80 ug、100 ug不同的浓度梯度点样， 以石油醚-丙酮（7 :3)、二氯甲烷-丙酮（9. 8:0. 2)、石油醚-乙酸乙酯-丙酮（8:1:1)三种 系统为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%硫酸乙醇溶液，在105°C加热至斑点显色清晰，置 紫外光（365nm)下检视。在薄层色谱中，三种展开剂系统，五个不同浓度的梯度点样，均为 单一斑点，未见杂质斑点。
[0029] 所述步骤6)的HPLC检测方法为：色谱条件：色谱柱C-18,4. 6X250mm，IOum ;流 速：0. 6ml/min ;进样量：10ul ;系统条件：流动相乙腈-0. 2%磷酸68 :32,检测波长304nm ; 面积归一化法计算含量，主成分(水黄皮素 C18 H12 O4)峰不得少于98.0%，如有杂质峰，除溶 剂峰外，各杂质峰面积总和不得超过2. 0%。
[0030] 实施例2 : 一种高纯度水黄皮素的制备方法，具体步骤为： 1) 干豆花的干燥根5kg粉碎后用9倍重量的80%的乙醇回流提取4次，提取液滤过，合 并滤液，回收乙醇，得浸膏； 2) 浸膏再经石油醚萃取，静置，合并石油醚层，浓缩得石油醚萃取物； 3) 石油醚萃取物经硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯-丙酮系统梯度洗脱，收集含水黄 皮素的流分，所述的石油醚-乙酸乙酯-丙酮系统梯度洗脱条件为：〇-25min，洗脱系统为石 油醚；26-50min，洗脱系统为石油醚-乙酸乙酯-丙酮，比例为7 :3 :1 ; 4) 流分用TLC检测合并，浓缩，重结晶，即得纯度为重量含量80~90 %的水黄皮素粗 结晶； 5) 将水黄皮素粗结晶用制备高效液相色谱法分离纯化，收集水黄皮素组分； 6) 对所收集的每一份洗脱液利用HPLC检测，合并保留时间相同而且纯度在90%-98%之 间和纯度大于98%以上的水黄皮素，减压浓缩，得到纯度为95%以及98. 8%的水黄皮素。
[0031] 所述步骤5)制备高效液相色谱的色谱柱为C-18柱，甲醇-水：70:30为流动相洗 脱，流速为6mL/min，检测波长为304nm，柱温为30°C。
[0032] 所述步骤4) TLC检测方法为：取水黄皮素粗品加甲醇制成每1ml含Img的溶液， 在同一硅胶G薄层板上，分别按20 ug、40 ug、60 ug、80 ug、100 ug不同的浓度梯度点样， 以石油醚-丙酮（7 :3)、二氯甲烷-丙酮（9. 8:0. 2)、石油醚-乙酸乙酯-丙酮（8:1:1)三种 系统为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%硫酸乙醇溶液，在105°C加热至斑点显色清晰，置 紫外光（365nm)下检视。在薄层色谱中，三种展开剂系统，五个不同浓度的梯度点样，均为 单一斑点，未见杂质斑点。
[0033] 所述步骤6)的HPLC检测方法为：色谱条件：色谱柱C-18,4. 6X250mm，IOum ;流 速：1. 2ml/min ;进样量：10ul ;系统条件：流动相乙腈-0. 2%磷酸72 :28,检测波长304nm ; 面积归一化法计算含量，主成分(水黄皮素 C18 H12 O4)峰不得少于98.0%，如有杂质峰，除溶 剂峰外，各杂质峰面积总和不得超过2. 0%。
[0034] 实施例3 : 一种高纯度水黄皮素的制备方法，具体步骤为： 1) 干豆花的干燥根6kg粉碎后用10倍重量的70%的乙醇回流提取5 次，提取液滤过， 合并滤液，回收乙醇，得浸膏； 2) 浸膏再经石油醚萃取，静置，合并石油醚层，浓缩得石油醚萃取物； 3) 石油醚萃取物经硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯-丙酮系统梯度洗脱，收集含水黄 皮素的流分，所述的石油醚-乙酸乙酯-丙酮系统梯度洗脱条件为：〇-15min，洗脱系统为石 油醚；16-60min，洗脱系统为石油醚-乙酸乙酯-丙酮，比例为9 :1 :1 ; 4) 流分用TLC检测合并，浓缩，重结晶，即得纯度为重量含量80~90%的水黄皮素粗 结晶； 5) 将水黄皮素粗结晶用制备高效液相色谱法分离纯化，收集水黄皮素组分； 6) 对所收集的每一份洗脱液利用HPLC检测，合并保留时间相同而且纯度在90%-98%之 间和纯度大于98%以上的水黄皮素，减压浓缩，得到纯度为96. 6%以及99. 3%的水黄皮素。
[0035] 所述步骤5)制备高效液相色谱的色谱柱为C-18柱，甲醇-水：75:25为流动相洗 脱，流速为5mL/min，检测波长为304nm，柱温为35°C。
[0036] 所述步骤4) TLC检测方法为：取水黄皮素粗品加甲醇制成每1ml含Img的溶液， 在同一硅胶G薄层板上，分别按20 ug、40 ug、60 ug、80 ug、100 ug不同的浓度梯度点样， 以石油醚-丙酮（7 :3)、二氯甲烷-丙酮（9. 8:0. 2)、石油醚-乙酸乙酯-丙酮（8:1:1)三种 系统为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%硫酸乙醇溶液，在105°C加热至斑点显色清晰，置 紫外光（365nm)下检视。在薄层色谱中，三种展开剂系统，五个不同浓度的梯度点样，均为 单一斑点，未见杂质斑点。
[0037] 所述步骤6)的HPLC检测方法为：色谱条件：色谱柱C-18,4. 6X250mm，IOum ;流 速;进样量：10ul ;系统条件：流动相乙腈-0. 2%磷酸80 :20,检测波长304nm ;面 积归一化法计算含量，主成分(水黄皮素 C18 H12 O4)峰不得少于98.0%，如有杂质峰，除溶剂 峰外，各杂质峰面积总和不得超过2. 0%。
[0038] 实施例4 一种高纯度水黄皮素的制备方法，具体步骤为： 1) 干豆花的干燥根5kg粉碎后用7倍重量的60%的乙醇回流提取2次，提取液滤过，合 并滤液，回收乙醇，得浸膏； 2) 浸膏再经石油醚萃取，静置，合并石油醚层，浓缩得石油醚萃取物； 3) 石油醚萃取物经硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯-丙酮系统梯度洗脱，收集含水黄 皮素的流分，所述的石油醚-乙酸乙酯-丙酮系统梯度洗脱条件为：〇-l〇min，洗脱系统为石 油醚；ll-50min，洗脱系统为石油醚-乙酸乙酯-丙酮，比例为6 :4 :1 ; 4) 流分用TLC检测合并，浓缩，重结晶，即得纯度为重量含量80~90%的水黄皮素粗 结晶； 5) 将水黄皮素粗结晶用制备高效液相色谱法分离纯化，收集水黄皮素组分； 6) 对所收集的每一份洗脱液利用HPLC检测，合并保留时间相同而且纯度在90%-98%之 间和纯度大于98%以上的水黄皮素，减压浓缩，得到纯度为96. 5%以及99. 2%的水黄皮素。
[0039] 所述步骤5)制备高效液相色谱的色谱柱为C-18柱，甲醇-水：15:85为流动相洗 脱，流速为10mL/min，检测波长为304nm，柱温为35°C。
[0040] 所述步骤4) TLC检测方法为：取水黄皮素粗品加甲醇制成每1ml含Img的溶液， 在同一硅胶G薄层板上，分别按20 ug、40 ug、60 ug、80 ug、100 ug不同的浓度梯度点样， 以石油醚-丙酮（7 :3)、二氯甲烷-丙酮（9. 8:0. 2)、石油醚-乙酸乙酯-丙酮（8:1:1)三种 系统为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%硫酸乙醇溶液，在105°C加热至斑点显色清晰，置 紫外光（365nm)下检视。在薄层色谱中，三种展开剂系统，五个不同浓度的梯度点样，均为 单一斑点，未见杂质斑点。
[0041] 所述步骤6)的HPLC检测方法为：色谱条件：色谱柱C-18,4. 6X250mm，IOum ;流 速：0. 8ml/min ;进样量：10ul ;系统条件：甲醇-0. 2%磷酸溶液30:70,检测波长260nm ;面 积归一化法计算含量，主成分(水黄皮素 C18 H12 O4)峰不得少于98.0%，如有杂质峰，除溶剂 峰外，各杂质峰面积总和不得超过2. 0%。
[0042] 实施例5 一种高纯度水黄皮素的制备方法，具体步骤为： 1)干豆花的干燥根5kg粉碎后用6倍重量的50%的乙醇回流提取8次，提取液滤过，合 并滤液，回收乙醇，得浸膏； 2) 浸膏再经石油醚萃取，静置，合并石油醚层，浓缩得石油醚萃取物； 3) 石油醚萃取物经硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯-丙酮系统梯度洗脱，收集含水黄 皮素的流分，所述的石油醚-乙酸乙酯-丙酮系统梯度洗脱条件为：0-20min，洗脱系统为石 油醚；21-50min，洗脱系统为石油醚-乙酸乙酯-丙酮，比例为8 :1 :2 ; 4) 流分用TLC检测合并，浓缩，重结晶，即得纯度为重量含量80~90 %的水黄皮素粗 结晶； 5) 将水黄皮素粗结晶用制备高效液相色谱法分离纯化，收集水黄皮素组分； 6) 对所收集的每一份洗脱液利用HPLC检测，合并保留时间相同而且纯度在90%-98%之 间和纯度大于98%以上的水黄皮素，减压浓缩，得到纯度为95. 2%以及99. 0%的水黄皮素。
[0043] 所述步骤5)制备高效液相色谱的色谱柱为C-18柱，甲醇-水：30:70为流动相洗 脱，流速为8mL/min，检测波长为304nm，柱温为30°C。
[0044] 所述步骤4) TLC检测方法为：取水黄皮素粗品加甲醇制成每1ml含Img的溶液， 在同一硅胶G薄层板上，分别按20 ug、40 ug、60 ug、80 ug、100 ug不同的浓度梯度点样， 以石油醚-丙酮（7 :3)、二氯甲烷-丙酮（9. 8:0. 2)、石油醚-乙酸乙酯-丙酮（8:1:1)三种 系统为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%硫酸乙醇溶液，在105°C加热至斑点显色清晰，置 紫外光（365nm)下检视。在薄层色谱中，三种展开剂系统，五个不同浓度的梯度点样，均为 单一斑点，未见杂质斑点。
[0045] 所述步骤6)的HPLC检测方法为：色谱条件：色谱柱C-18,4. 6X250mm，IOum ;流 速：lml/min ;进样量：20ul ;系统条件：甲醇-0. 2%磷酸溶液90:10,检测波长260nm ;面积 归一化法计算含量，主成分(水黄皮素 C18 H12 O4)峰不得少于98. 0%，如有杂质峰，除溶剂峰 外，各杂质峰面积总和不得超过2. 0%。
[0046] 实施例6 一种高纯度水黄皮素的制备方法，具体步骤为： 1) 干豆花的干燥根5kg粉碎后用5倍重量的60%的乙醇回流提取7次，提取液滤过，合 并滤液，回收乙醇，得浸膏； 2) 浸膏再经石油醚萃取，静置，合并石油醚层，浓缩得石油醚萃取物； 3) 石油醚萃取物经硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯-丙酮系统梯度洗脱，收集含水 黄皮素的流分，所述的石油醚-乙酸乙酯-丙酮系统梯度洗脱条件为：梯度洗脱条件为： 0-15min，洗脱系统为石油醚；16-50min，洗脱系统为石油醚-乙酸乙酯-丙酮，比例为9 :3 : 1 ; 4) 流分用TLC检测合并，浓缩，重结晶，即得纯度为重量含量80~90%的水黄皮素粗 结晶； 5) 将水黄皮素粗结晶用制备高效液相色谱法分离纯化，收集水黄皮素组分； 6) 对所收集的每一份洗脱液利用HPLC检测，合并保留时间相同而且纯度在90%-98%之 间和纯度大于98%以上的水黄皮素，减压浓缩，得到纯度为94. 3%以及99. 1%的水黄皮素。
[0047] 所述步骤5)制备高效液相色谱的色谱柱为C-18柱，甲醇-水：40:60为流动相洗 脱，流速为6mL/min，检测波长为304nm，柱温为30°C。
[0048] 所述步骤4) TLC检测方法为：取水黄皮素粗品加甲醇制成每1ml含Img的溶液， 在同一硅胶G薄层板上，分别按20 ug、40 ug、60 ug、80 ug、100 ug不同的浓度梯度点样， 以石油醚-丙酮（7 :3)、二氯甲烷-丙酮（9. 8:0. 2)、石油醚-乙酸乙酯-丙酮（8:1:1)三种 系统为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%硫酸乙醇溶液，在105°C加热至斑点显色清晰，置 紫外光（365nm)下检视。在薄层色谱中，三种展开剂系统，五个不同浓度的梯度点样，均为 单一斑点，未见杂质斑点。
[0049] 所述步骤6)的HPLC检测方法为：色谱条件：色谱柱C-18,4. 6X250mm，IOum ;流 速：lml/min ;进样量：20ul ;系统条件：乙腈-0. 2%磷酸溶液30:70,检测波长260nm ;面积 归一化法计算含量，主成分(水黄皮素 C18 H12 O4)峰不得少于98. 0%，如有杂质峰，除溶剂峰 外，各杂质峰面积总和不得超过2. 0%。
[0050] 实施例7 一种高纯度水黄皮素的制备方法，具体步骤为： 1) 干豆花的干燥根5kg粉碎后用8倍重量的75%的乙醇回流提取4次，提取 液滤过，合 并滤液，回收乙醇，得浸膏； 2) 浸膏再经石油醚萃取，静置，合并石油醚层，浓缩得石油醚萃取物； 3) 石油醚萃取物经硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯-丙酮系统梯度洗脱，收集含水黄 皮素的流分，所述的石油醚-乙酸乙酯-丙酮系统梯度洗脱条件为：0-20min，洗脱系统为石 油醚；21-60min，洗脱系统为石油醚-乙酸乙酯-丙酮，比例为10 :1 :2 ; 4) 流分用TLC检测合并，浓缩，重结晶，即得纯度为重量含量80~90%的水黄皮素粗 结晶； 5) 将水黄皮素粗结晶用制备高效液相色谱法分离纯化，收集水黄皮素组分； 6) 对所收集的每一份洗脱液利用HPLC检测，合并保留时间相同而且纯度在90%-98%之 间和纯度大于98%以上的水黄皮素，减压浓缩，得到纯度93. 8%以及98. 5%的水黄皮素。
[0051] 所述步骤5)制备高效液相色谱的色谱柱为C-18柱，甲醇-水：60:40为流动相洗 脱，流速为7mL/min，检测波长为304nm，柱温为30°C。
[0052] 所述步骤4) TLC检测方法为：取水黄皮素粗品加甲醇制成每1ml含Img的溶液， 在同一硅胶G薄层板上，分别按20 ug、40 ug、60 ug、80 ug、100 ug不同的浓度梯度点样， 以石油醚-丙酮（7 :3)、二氯甲烷-丙酮（9. 8:0. 2)、石油醚-乙酸乙酯-丙酮（8:1:1)三种 系统为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%硫酸乙醇溶液，在105°C加热至斑点显色清晰，置 紫外光（365nm)下检视。在薄层色谱中，三种展开剂系统，五个不同浓度的梯度点样，均为 单一斑点，未见杂质斑点。
[0053] 所述步骤6)的HPLC检测方法为：色谱条件：色谱柱C-18,4. 6X250mm，IOum ;流 速;进样量：10ul ;系统条件：乙腈-0. 2%磷酸溶液80:20,检测波长260nm ;面积 归一化法计算含量，主成分(水黄皮素 C18 H12 O4)峰不得少于98. 0%，如有杂质峰，除溶剂峰 外，各杂质峰面积总和不得超过2. 0%。
[0054] 实施例8 一种高纯度水黄皮素的制备方法，具体步骤为： 1) 干豆花的干燥根5kg粉碎后用10倍重量的65%的乙醇回流提取3次，提取液滤过， 合并滤液，回收乙醇，得浸膏； 2) 浸膏再经石油醚萃取，静置，合并石油醚层，浓缩得石油醚萃取物； 3) 石油醚萃取物经硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯-丙酮系统梯度洗脱，收集含水黄 皮素的流分，所述的石油醚-乙酸乙酯-丙酮系统梯度洗脱条件为：〇-25min，洗脱系统为石 油醚；26-70min，洗脱系统为石油醚-乙酸乙酯-丙酮，比例为7 :2 :1 ; 4) 流分用TLC检测合并，浓缩，重结晶，即得纯度为重量含量80~90%的水黄皮素粗 结晶； 5) 将水黄皮素粗结晶用制备高效液相色谱法分离纯化，收集水黄皮素组分； 6) 对所收集的每一份洗脱液利用HPLC检测，合并保留时间相同而且纯度在90%-98%之 间和纯度大于98%以上的水黄皮素，减压浓缩，得到纯度92. 3%以及99. 7%的水黄皮素。
[0055] 所述步骤5)制备高效液相色谱的色谱柱为C-18柱，甲醇-水：75:25为流动相洗 脱，流速为7mL/min，检测波长为304nm，柱温为30°C。
[0056] 所述步骤4) TLC检测方法为：取水黄皮素粗品加甲醇制成每1ml含Img的溶液， 在同一硅胶G薄层板上，分别按20 ug、40 ug、60 ug、80 ug、100 ug不同的浓度梯度点样， 以石油醚-丙酮（7 :3)、二氯甲烷-丙酮（9. 8:0. 2)、石油醚-乙酸乙酯-丙酮（8:1:1)三种 系统为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%硫酸乙醇溶液，在105°C加热至斑点显色清晰，置 紫外光（365nm)下检视。在薄层色谱中，三种展开剂系统，五个不同浓度的梯度点样，均为 单一斑点，未见杂质斑点。
[0057] 所述步骤6)的HPLC检测方法为：色谱条件：色谱柱C-18,4. 6X250mm，IOum ;流 速;进样量：10ul ;系统条件：乙腈-0. 2%磷酸溶液30:70,检测波长304nm ;面积 归一化法计算含量，主成分(水黄皮素 C18 H12 O4)峰不得少于98. 0%，如有杂质峰，除溶剂峰 外，各杂质峰面积总和不得超过2. 0%。
[0058] 虽然，上文中已经用一般性说明、【具体实施方式】及试验，对本发明作了详尽的描 述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见 的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的 范围。
【主权项】
1. 一种高纯度水黄皮素的制备方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤： 1) 干豆花的干燥根用乙醇回流提取，提取液滤过，合并滤液，回收乙醇，得浸膏； 2) 浸膏再经石油醚萃取，静置，合并石油醚层，浓缩得石油醚萃取物； 3) 石油醚萃取物经硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯-丙酮系统梯度洗脱，收集含水黄 皮素的流分，所述的石油醚-乙酸乙酯-丙酮系统梯度洗脱条件为：〇~A分钟，洗脱系统 为石油醚；B~C分钟，洗脱系统为石油醚-乙酸乙酯-丙酮，比例为10:1:2~6:4:1 ;所述 A为10~25,所述B为11~26,所述C为50~70 ; 4) 流分用TLC检测合并，浓缩，重结晶，即得纯度为重量含量80~90 %的水黄皮素粗 结晶； 5) 将水黄皮素粗结晶用制备高效液相色谱法分离纯化，收集水黄皮素组分； 6) 对所收集的每一份洗脱液利用HPLC检测，合并保留时间相同而且纯度在90%-98%之 间和纯度大于98%以上的水黄皮素，减压浓缩，得到纯度90%-98%之间以及大于98%以上的 水黄皮素。2. 如权利要求1所述的高纯度水黄皮素的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中乙醇 的加入量为药材重量的5-10倍，乙醇浓度为50-90%，回流提取次数为2-8次。3. 如权利要求1所述的高纯度水黄皮素的制备方法，其特征在于，所述步骤5)制备高 效液相色谱的色谱柱为C-18柱，甲醇-水为流动相洗脱，流速为5~10mL/min，检测波长 为 304nm，柱温为 25-35°C。4. 如权利要求3所述的高纯度水黄皮素的制备方法，其特征在于，所述甲醇-水流动相 甲醇-水配比为：15:85~80:20。5. 如权利要求1所述的高纯度水黄皮素的制备方法，其特征在于，所述步骤4)TLC检测 方法为：薄层板：硅胶G;3种展开剂系统：系统（1)石油醚-丙酮重量比例7:3,系统（2)二 氯甲烷-丙酮重量比例9. 8:0. 2,系统（3)石油醚-乙酸乙酯-丙酮重量比例8:1:1 ;点样： 用甲醇制lmg/mL的溶液，在同一硅胶G板上，按不同的点样量梯度点样，点样量分别为20 ug、40ug、60ug、80ug、100ug;置展开缸分别展开，展距：15cm;定位：喷以5%硫酸乙醇溶 液，晾干，在l〇5°C加热至斑点显色清晰，置紫外灯（365nm)下检视；结果在薄层色谱中，可 见黄绿色的单一的荧光斑点，3种展开剂系统，5个不同浓度的梯度点样，均为单一斑点，未 见杂质斑点。6. 如权利要求1所述的高纯度水黄皮素的制备方法，其特征在于，所述步骤6)的HPLC 检测方法为：色谱条件：色谱柱C-18,4.6X250mm，IOum;流速：0.6-1. 5ml/min;进样量： 10~20ul;面积归一化法定量；系统条件为以下三个条件的其中之一： 条件（1)流动相：甲醇-0. 2%磷酸溶液重量比例30:70-90:10,检测波长：260nm; 条件（2)流动相：乙腈-0. 2%磷酸溶液重量比例30:70-80:20,检测波长：260nm; 条件（3)流动相：乙腈-0. 2%磷酸溶液重量比例20:80-80:20,检测波长：304nm。7. 如权利要求6所述的高纯度水黄皮素的制备方法，其特征在于，所述的系统条件（3) 流动相：乙腈-0. 2%磷酸溶液重量比例30:70-80:20 ;检测波长：304nm。8. -种高纯度水黄皮素，用权利要求1所述的制备方法制备而成，其纯度大于98%。
【专利摘要】本发明涉及一种高纯度水黄皮素的制备方法，其方法是：将干花豆的干燥根粉碎，用乙醇加热回流提取，合并提取液，浓缩，混悬液用石油醚萃取，静置，合并石油醚层，浓缩得石油醚萃取物。石油醚萃取物经硅胶柱层析，用石油醚：乙酸乙酯：丙酮系统梯度洗脱，用薄层色谱检测，收集含有水黄皮素的洗脱液，合并，减压浓缩，重结晶，得到水黄皮素粗结晶。再用制备高效液相法分离纯化，对所收集的每一份洗脱液利用分析型高效液相色谱检测，分别得到纯度在90%～98%之间的水黄皮素和纯度大于98%的水黄皮素组分。该设计合理，工艺简单分离速度快，生产周期短，适合工业化生产。
【IPC分类】C07D493/04
【公开号】CN104892620
【申请号】CN201510247241
【发明人】刘布鸣, 黄瑞松, 黄艳, 冯军, 邱宏聪
【申请人】广西壮族自治区中医药研究院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月15日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及化合物制备领域，具体涉及一种高纯度水黄皮素的制备方法。
【背景技术】
[0002] 化学对照品又称标准品，是中药质量标准研宄、质量检测和质量控制的实物对照， 中药化学对照品的研宄，是中药标准化研宄的一个非常重要的部分，对产品的质量评价，特 别是在药品生产的质量控制中，中药化学对照品起着极其重大的作用，是中药质量控制的 基础与核心。
[0003] 水黄皮素是一种呋喃黄酮类化学成分，是植物活性成分之一，也是许多植物和药 品标准质量控制的指标性成分。目前尚未相应的国家药品标准物质，国内外对水黄皮素中 药化学对照品的系统研宄未见报道，参照中药化学对照品（供含量测定用）的技术要求，对 水黄皮素化学对照品进行研宄，建立水黄皮素化学对照品的批量提取工艺、纯度与含量以 及杂质检查的分析测定方法，从而建立水黄皮素化学对照品的技术标准，为其作为中药化 学对照品以及药材和制剂的质量标准研宄提供科学基础和保证。
[0004] 水黄皮素是从豆科植物干花豆/7OrtZia 干豆花叶植物分离得 到的活性物质，从公开文献所知，文献报道水黄皮素的提取分离过程和含量测定方法，如： 1.【题名】水黄皮化学成分的研宄：干燥的水黄皮叶粗粉8 kg，用10倍量的75乙醇提取3 次，提取液浓缩后得总浸膏2.1 kg。将浸膏混悬于水中，用石油醚萃取至萃取液基本无色， 合并及浓缩萃取液，得石油醚部分（124 g)。将石油醚萃取物75 g经反复硅胶柱色谱分离， 用石油醚、石油醚一醋酸乙酯梯度洗脱，得水黄皮素单体。2.【题名】玉郎伞的化学成分分 析：取玉郎伞粗粉，用95%乙醇（相当药材10倍量）渗漉，收集渗漉液浓缩得黄色沉淀物 (收率0.27%)，经氯仿回流得氯仿溶出物（收率0.16%)。取上述氯仿溶出物，用100~ 200目硅胶拌和均匀后低温干燥，研细后上硅胶柱（湿法装柱），用氯仿、氯仿一甲醇梯度洗 脱，收集到73个组分，TLC检识，合并斑点相同组分，经反复柱层析和薄层分离制备，用丙酮 多次重结晶纯化，分离得到水黄皮素单体。3.【题名】壮药干花豆枝叶化学成分研宄：干花 豆枝叶15Kg，阴干，粉碎，用95%乙醇冷浸提取3次，合并提取液减压浓缩，得乙醇浸膏约 500 g。所得浸膏加水混悬后依次用石油醚2 L萃取后处理得石油醚浸膏30 g，醋酸乙酯2 L萃取后处理得醋酸乙酯浸膏50 g，正丁醇2 L萃取后处理得正丁醇浸膏45 g，萃取后水 溶液浓缩得水部分200g。取醋酸乙酯浸膏45 g经硅胶柱色谱，以氯仿一甲醇（100:0 - 0: 100)梯度洗脱，每份200 mL，经TLC薄层检测合并成分相近部位，Fr. III经硅胶柱色谱，石 油醚一醋酸乙酯（20 :1)洗脱，收集流分，通过C18、S印hadexLH-20等反复柱色谱分离得到 水黄皮素单体。4.【题名】水黄皮化学成分及抗氧化活性研宄：对水黄皮叶粗粉采用75%乙 醇提取，再经过石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇等不同极性溶剂萃取，共分成四个不同极 性部位。然后用硅胶柱层析、聚酰胺柱层析、大孔吸附树脂和葡聚糖凝胶（Sephadex LH-20) 等多种层析分离手段得到水黄皮素。5.【题名】RP-HPLC法测定水黄皮药材中水黄皮素的 含量：建立RP-HPLC测定水黄皮药材中水黄皮素含量的方法。6.【题名】HPLC法测定玉郎 伞中水黄皮素的含量：建立高效液相色谱法测定玉郎伞中水黄皮素含量的方法。7.【题名】 HPLC法测定肿痛宁酊中水黄皮素的含量：建立HPLC法测定肿痛宁酊中水黄皮素的含量。 8.【题名】薄层色谱一荧光分析法测定水罗伞药材中水黄皮素含量的研宄：建立薄层色谱一 荧光分光光度法测定水罗伞中水黄皮素含量的方法。9.【题名】水罗伞药材的鉴别及水黄 皮素的含量测定：采用性状、显微、TLC等法鉴别水罗伞药材真伪；采用HPLC法测定水罗伞 药材中水黄皮素的含量，药材检查等项参照中国药典方法测定，制订壮药材水罗伞的质量 标准。10.【名称】一种高含量水黄皮素的提纯方法，申请号201010263044. 5的发明专利申 请公开了一种高含量水黄皮素的提纯方法，具体方法包括：将干花豆茎枝粉碎，用一定浓 度乙醇提取、浓缩，石油醚萃取两次，萃余液上大孔树脂，洗脱液浓缩再上聚酰胺柱分离 纯化，95%乙醇重结晶即得。
[0005] 上述方法从不同角度论述了水黄皮素的提取分离，分离纯度较高，但纯度大多数 未达到中药化学对照品的要求，即纯度大于98%，无法满足高纯度水黄皮素化学对照品的需 要。
[0006] 通过对水黄皮素化学对照品进行研宄，建立水黄皮素化学对照品的批量提取工 艺、纯度与含量以及杂质检查的分析测定方法，从而建立水黄皮素化学对照品的技术标准， 为其作为中药化学对照品以及药材和制剂的质量标准研宄提供科学基础和保证。研宄结果 可为水黄皮素化学对照品提供更完整的基础化学依据，掌握其化学信息和分析测试技术， 有利于相关产品的进一步开发利用，而且对于开发我国特有产物，开发具有高技术、高附加 值的产品，提高市场竞争能力，将会产生潜在而不可估量的社会效益与经济效益。今后生产 的各种产品，无论是在国内或是进入国际市场，都需要靠高水平的质量标准和高水平的分 析测试技术来获得发展和提高，否则将失去市场，产品的质量标准和检测方法变得愈来愈 重要，"安全、有效和质量可控"的用药标准已成为国际共识，药品生产应围绕着这一中心展 开，其核心为质量标准控制水平，而化学对照品则起关键的作用。但目前大部分中药药材及 其制剂，因化学成分不明或无化学对照品，无法阐明其作用的化学物质基础，也无法进行质 量控制，而不能被现代文明社会所接受，也成为中草药和天然药物难以进入国际药品市场 的制约关键，技术壁皇给发展中药产业带来了困难，因此，进行中草药化学成分的研宄及质 量标准规范化研宄是中药现代化发展的必经之路，对阐明中草药作用的物质基础以及中草 药制剂的生产加工工艺的制定、伪劣产品的鉴别等等具有重要的意义。毫无疑问，对水黄皮 素进行质量标准研宄，建立规范化的分析测试方法，制定高技术水平的控制水黄皮素质量 的检测指标和分析方法，使之科学化、规范化，增强国际竞争力，为中药进入国际市场创造 条件，具有重大的实际意义和学术价值。
[0007] 水黄皮素作为植物、药材及其产品的化学对照品，是质量控制的技术关键，众多企 业、科研和检验部门都需要高纯度的水黄皮素对照品，其市场需求很大，由于水黄皮素在药 材中的含量低，提取分离技术要求很高、难度很大。本发明进行水黄皮素中药化学标准品制 备及其质量控制技术研宄，解决高纯度水黄皮素化学对照品的问题，对中药现代化的作用 是显而易见的，具有重大的实际意义和学术价值。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种高纯度水黄皮素的制备方法。
[0009] 本发明是从豆科植物干豆花/7OrtZia 的根中经提取、分离、精 制、纯化而制得的水黄皮素，其化学名、分子式、结构式如下： 中文名：水黄皮素 化学名：3-甲氧基-2-苯基-4H-呋喃[2, 3-Η]-1-苯并呋喃-4-酮（3-methoxy-2-phe nyl_4H-furo[2, 3-H]-1-benzopyran-4-one) 英文名：Karanjin 分子式：C18 H12 O4 结构式如下：
本发明的目的是通过下列的技术方案实现的： 本发明所述的高纯度水黄皮素的制备方法，具体包括如下步骤： 1) 干豆花的干燥根用乙醇回流提取，提取液滤过，合并滤液，回收乙醇，得浸膏； 2) 浸膏再经石油醚萃取，静置，合并石油醚层，浓缩得石油醚萃取物； 3) 石油醚萃取物经硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯-丙酮系统梯度洗脱，收集含水黄 皮素的流分，所述的石油醚-乙酸乙酯-丙酮系统梯度洗脱条件为：〇~A分钟，洗脱系统 为石油醚；B~C分钟，洗脱系统为石油醚-乙酸乙酯-丙酮，比例为10:1:2~6:4:1 ;所述 A为10~25,所述B为11~26,所述C为50~70 ; 4) 流分用TLC检测合并，浓缩，重结晶，即得纯度为重量含量80~90 %的水黄皮素粗 结晶； 5) 将水黄皮素粗结晶用制备高效液相色谱法分离纯化，收集水黄皮素组分； 6) 对所收集的每一份洗脱液利用HPLC检测，合并保留时间相同而且纯度在90%-98%之 间和纯度大于98%以上的水黄皮素，减压浓缩，得到纯度90%-98%之间以及大于98%以上的 水黄皮素。
[0010] 所述步骤1)中乙醇的加入量为药材重量的5-10倍，乙醇浓度为50-90%，回流提取 次数为2-8次。
[0011] 所述步骤5)制备高效液相色谱的色谱柱为C-18柱，甲醇-水为流动相洗脱，流速 为5~10 mL/min，检测波长为304nm，柱温为25-35°C。
[0012] 所述步骤4) TLC检测方法为：薄层板：硅胶G ;3种展开剂系统：系统（1)石油 酿-丙酮重量比例7:3,系统（2)二氯甲烧-丙酮重量比例9. 8:0. 2,系统（3)石油酿-乙 酸乙醋-丙酮重量比例8:1:1 ;点样：用甲醇制lmg/mL的溶液，在同一硅胶G板上，按不同 的点样量梯度点样，点样量分别为20 ug、40 ug、60 ug、 80 ug、100 ug;置展开缸分别展开， 展距：15cm ;定位：喷以5%硫酸乙醇溶液，晾干，在105°C加热至斑点显色清晰，置紫外灯 (365nm)下检视；结果在薄层色谱中，可见黄绿色的单一的荧光斑点，3种展开剂系统，5个 不同浓度的梯度点样，均为单一斑点，未见杂质斑点。
[0013] 所述步骤6)的HPLC检测方法为：色谱条件：色谱柱C-18,4. 6X250mm，IOum ;流 速：0. 6-1. 5ml/min ;进样量：10~20ul ;面积归一化法定量；系统条件为以下三个条件的 其中之一： 条件（1)流动相：甲醇-0. 2%磷酸溶液重量比例30:70-90:10,检测波长：260nm ; 条件（2)流动相：乙腈-0. 2%磷酸溶液重量比例30:70-80:20,检测波长：260nm ; 条件（3)流动相：乙腈-0. 2%磷酸溶液重量比例20:80-80:20,检测波长：304nm。
[0014] 优选的，所述步骤6)的系统条件（3)流动相：乙腈-0.2%磷酸溶液重量比例 30:70-80:20 ;检测波长：304nm。
[0015] 含量与纯度测定：精密称取于105°C干燥至恒重的对照品适量，加流动相溶液制 成每1ml含Img的溶液，在测定条件下，进样20ul (约相当于20ug)，注入液相色谱仪，用3 个流动相溶剂系统分别记录色谱图至主成分的出峰保留时间的2. 5倍以上，用面积归一化 法计算含量，结果系统测定对照品含量在均98%以上。杂质检查，分别在不同系统记录的色 谱图中，除溶剂峰外，杂质峰面积总和结果均小于2. 0%。
[0016] 峰纯度检测：取对照品适量，按流动相系统，在高效液相色谱仪上，用二极管阵列 DAD检测器进行峰纯度检查，水黄皮素的HPLC色谱峰>98%，其色谱峰紫外吸收光谱图，三维 图谱以及5点光谱图完全重合，表明为单一纯物质峰。
[0017] 结果：本发明分离、纯化的水黄皮素化学对照品，经红外光谱、紫外光谱、核磁共 振、质谱以及理化检测确认化学结构。经3个展开系统5个不同浓度的TLC检测，2个流动 相系统和2个不同波长的HPLC检测，同时对色谱峰用DAD做纯度检查，表明符合中药含量 测定用化学对照品的要求，含量大于98%。
[0018] -种高纯度水黄皮素，上述的制备方法制备而成，其纯度大于98%。
[0019] 本发明提供的一种高纯度水黄皮素的制备方法具有以下优点： 1、本发明设计合理，工艺简单，利用醇水溶剂提取，经过一次硅胶柱层析后重结晶即可 得到纯度较高的水黄皮素，最后经制备高效液相色谱法制备出纯度达到98%以上的水黄皮 素化学对照品，方法简便易行。
[0020] 2、本发明分离速度快，生产周期短，适合工业化生产，有很好的应用前景。
[0021] 3、本发明采用薄层色谱和高效液相色谱进行纯度检查、含量测定及质量控制，确 保产品的质量。
[0022] 4、本发明从干豆花中制备出纯度符合化学对照品要求，含量在98%以上的水黄皮 素，解决了水黄皮素化学对照品的供应问题，为干豆花药材的质量控制提供了提供科学基 础和保证。
【附图说明】
[0023] 图1是高纯度水黄皮素的制备工艺流程图； 图2是水黄皮素色谱峰紫外吸收光谱图； 图3是水黄皮素 DAD峰纯度检查HPLC色谱图； 图4是水黄皮素质量控制的HPLC检测色谱图。
【具体实施方式】
[0024] 下面通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明 本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明 要求保护的范围。除非另有说明，本发明中的乙醇量的百分数是体积百分数，v/v表示溶液 的体积比。
[0025] 对比例 干豆花的干燥根5kg，粉碎后加入6倍85%乙醇加热回流提取4次，每次2小时，合并 提取液；将提取液浓缩至原体积的1/4,用等体积量的石油醚超声萃取2次，弃去萃取液， 将萃余液上AB-8大孔吸附树脂柱，先用水洗脱至无色，然后用6倍柱体积80%甲醇洗脱， 收集，减压回收试剂，浓缩，所得浸膏通过聚酰胺柱层析，依次用乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲醇 (9 : 1)、乙酸乙酯-甲醇（9 : 4)梯度洗脱，收集洗脱液，回收试剂，浓缩至干得粗晶，用 95%乙醇反复重结晶5次，得纯度98. 8%水黄皮素产品。
[0026] 实施例1 : 一种高纯度水黄皮素的制备方法，具体步骤为： 1) 干豆花的干燥根5kg粉碎后用8倍重量的90%的乙醇回流提取3次，提取液滤过，合 并滤液，回收乙醇，得浸膏； 2) 浸膏再经石油醚萃取，静置，合并石油醚层，浓缩得石油醚萃取物； 3) 石油醚萃取物经硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯-丙酮系统梯度洗脱，收集含水黄 皮素的流分，所述的石油醚-乙酸乙酯-丙酮系统梯度洗脱条件为：0-20min，洗脱系统为石 油醚；21-50min，洗脱系统为石油醚-乙酸乙酯-丙酮，比例为8 :2 :1 ; 4) 流分用TLC检测合并，浓缩，重结晶，即得纯度为重量含量80~90%的水黄皮素粗 结晶； 5) 将水黄皮素粗结晶用制备高效液相色谱法分离纯化，收集水黄皮素组分； 6) 对所收集的每一份洗脱液利用HPLC检测，合并保留时间相同而且纯度在90%-98%之 间和纯度大于98%以上的水黄皮素，减压浓缩，得到纯度为92%以及98. 6%的水黄皮素。
[0027] 所述步骤5)制备高效液相色谱的色谱柱为C-18柱，甲醇-水：65:35为流动相洗 脱，流速为5mL/min，检测波长为304nm，柱温为25°C。
[0028] 所述步骤4) TLC检测方法为：取水黄皮素粗品加甲醇制成每1ml含Img的溶液， 在同一硅胶G薄层板上，分别按20 ug、40 ug、60 ug、80 ug、100 ug不同的浓度梯度点样， 以石油醚-丙酮（7 :3)、二氯甲烷-丙酮（9. 8:0. 2)、石油醚-乙酸乙酯-丙酮（8:1:1)三种 系统为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%硫酸乙醇溶液，在105°C加热至斑点显色清晰，置 紫外光（365nm)下检视。在薄层色谱中，三种展开剂系统，五个不同浓度的梯度点样，均为 单一斑点，未见杂质斑点。
[0029] 所述步骤6)的HPLC检测方法为：色谱条件：色谱柱C-18,4. 6X250mm，IOum ;流 速：0. 6ml/min ;进样量：10ul ;系统条件：流动相乙腈-0. 2%磷酸68 :32,检测波长304nm ; 面积归一化法计算含量，主成分(水黄皮素 C18 H12 O4)峰不得少于98.0%，如有杂质峰，除溶 剂峰外，各杂质峰面积总和不得超过2. 0%。
[0030] 实施例2 : 一种高纯度水黄皮素的制备方法，具体步骤为： 1) 干豆花的干燥根5kg粉碎后用9倍重量的80%的乙醇回流提取4次，提取液滤过，合 并滤液，回收乙醇，得浸膏； 2) 浸膏再经石油醚萃取，静置，合并石油醚层，浓缩得石油醚萃取物； 3) 石油醚萃取物经硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯-丙酮系统梯度洗脱，收集含水黄 皮素的流分，所述的石油醚-乙酸乙酯-丙酮系统梯度洗脱条件为：〇-25min，洗脱系统为石 油醚；26-50min，洗脱系统为石油醚-乙酸乙酯-丙酮，比例为7 :3 :1 ; 4) 流分用TLC检测合并，浓缩，重结晶，即得纯度为重量含量80~90 %的水黄皮素粗 结晶； 5) 将水黄皮素粗结晶用制备高效液相色谱法分离纯化，收集水黄皮素组分； 6) 对所收集的每一份洗脱液利用HPLC检测，合并保留时间相同而且纯度在90%-98%之 间和纯度大于98%以上的水黄皮素，减压浓缩，得到纯度为95%以及98. 8%的水黄皮素。
[0031] 所述步骤5)制备高效液相色谱的色谱柱为C-18柱，甲醇-水：70:30为流动相洗 脱，流速为6mL/min，检测波长为304nm，柱温为30°C。
[0032] 所述步骤4) TLC检测方法为：取水黄皮素粗品加甲醇制成每1ml含Img的溶液， 在同一硅胶G薄层板上，分别按20 ug、40 ug、60 ug、80 ug、100 ug不同的浓度梯度点样， 以石油醚-丙酮（7 :3)、二氯甲烷-丙酮（9. 8:0. 2)、石油醚-乙酸乙酯-丙酮（8:1:1)三种 系统为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%硫酸乙醇溶液，在105°C加热至斑点显色清晰，置 紫外光（365nm)下检视。在薄层色谱中，三种展开剂系统，五个不同浓度的梯度点样，均为 单一斑点，未见杂质斑点。
[0033] 所述步骤6)的HPLC检测方法为：色谱条件：色谱柱C-18,4. 6X250mm，IOum ;流 速：1. 2ml/min ;进样量：10ul ;系统条件：流动相乙腈-0. 2%磷酸72 :28,检测波长304nm ; 面积归一化法计算含量，主成分(水黄皮素 C18 H12 O4)峰不得少于98.0%，如有杂质峰，除溶 剂峰外，各杂质峰面积总和不得超过2. 0%。
[0034] 实施例3 : 一种高纯度水黄皮素的制备方法，具体步骤为： 1) 干豆花的干燥根6kg粉碎后用10倍重量的70%的乙醇回流提取5 次，提取液滤过， 合并滤液，回收乙醇，得浸膏； 2) 浸膏再经石油醚萃取，静置，合并石油醚层，浓缩得石油醚萃取物； 3) 石油醚萃取物经硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯-丙酮系统梯度洗脱，收集含水黄 皮素的流分，所述的石油醚-乙酸乙酯-丙酮系统梯度洗脱条件为：〇-15min，洗脱系统为石 油醚；16-60min，洗脱系统为石油醚-乙酸乙酯-丙酮，比例为9 :1 :1 ; 4) 流分用TLC检测合并，浓缩，重结晶，即得纯度为重量含量80~90%的水黄皮素粗 结晶； 5) 将水黄皮素粗结晶用制备高效液相色谱法分离纯化，收集水黄皮素组分； 6) 对所收集的每一份洗脱液利用HPLC检测，合并保留时间相同而且纯度在90%-98%之 间和纯度大于98%以上的水黄皮素，减压浓缩，得到纯度为96. 6%以及99. 3%的水黄皮素。
[0035] 所述步骤5)制备高效液相色谱的色谱柱为C-18柱，甲醇-水：75:25为流动相洗 脱，流速为5mL/min，检测波长为304nm，柱温为35°C。
[0036] 所述步骤4) TLC检测方法为：取水黄皮素粗品加甲醇制成每1ml含Img的溶液， 在同一硅胶G薄层板上，分别按20 ug、40 ug、60 ug、80 ug、100 ug不同的浓度梯度点样， 以石油醚-丙酮（7 :3)、二氯甲烷-丙酮（9. 8:0. 2)、石油醚-乙酸乙酯-丙酮（8:1:1)三种 系统为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%硫酸乙醇溶液，在105°C加热至斑点显色清晰，置 紫外光（365nm)下检视。在薄层色谱中，三种展开剂系统，五个不同浓度的梯度点样，均为 单一斑点，未见杂质斑点。
[0037] 所述步骤6)的HPLC检测方法为：色谱条件：色谱柱C-18,4. 6X250mm，IOum ;流 速;进样量：10ul ;系统条件：流动相乙腈-0. 2%磷酸80 :20,检测波长304nm ;面 积归一化法计算含量，主成分(水黄皮素 C18 H12 O4)峰不得少于98.0%，如有杂质峰，除溶剂 峰外，各杂质峰面积总和不得超过2. 0%。
[0038] 实施例4 一种高纯度水黄皮素的制备方法，具体步骤为： 1) 干豆花的干燥根5kg粉碎后用7倍重量的60%的乙醇回流提取2次，提取液滤过，合 并滤液，回收乙醇，得浸膏； 2) 浸膏再经石油醚萃取，静置，合并石油醚层，浓缩得石油醚萃取物； 3) 石油醚萃取物经硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯-丙酮系统梯度洗脱，收集含水黄 皮素的流分，所述的石油醚-乙酸乙酯-丙酮系统梯度洗脱条件为：〇-l〇min，洗脱系统为石 油醚；ll-50min，洗脱系统为石油醚-乙酸乙酯-丙酮，比例为6 :4 :1 ; 4) 流分用TLC检测合并，浓缩，重结晶，即得纯度为重量含量80~90%的水黄皮素粗 结晶； 5) 将水黄皮素粗结晶用制备高效液相色谱法分离纯化，收集水黄皮素组分； 6) 对所收集的每一份洗脱液利用HPLC检测，合并保留时间相同而且纯度在90%-98%之 间和纯度大于98%以上的水黄皮素，减压浓缩，得到纯度为96. 5%以及99. 2%的水黄皮素。
[0039] 所述步骤5)制备高效液相色谱的色谱柱为C-18柱，甲醇-水：15:85为流动相洗 脱，流速为10mL/min，检测波长为304nm，柱温为35°C。
[0040] 所述步骤4) TLC检测方法为：取水黄皮素粗品加甲醇制成每1ml含Img的溶液， 在同一硅胶G薄层板上，分别按20 ug、40 ug、60 ug、80 ug、100 ug不同的浓度梯度点样， 以石油醚-丙酮（7 :3)、二氯甲烷-丙酮（9. 8:0. 2)、石油醚-乙酸乙酯-丙酮（8:1:1)三种 系统为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%硫酸乙醇溶液，在105°C加热至斑点显色清晰，置 紫外光（365nm)下检视。在薄层色谱中，三种展开剂系统，五个不同浓度的梯度点样，均为 单一斑点，未见杂质斑点。
[0041] 所述步骤6)的HPLC检测方法为：色谱条件：色谱柱C-18,4. 6X250mm，IOum ;流 速：0. 8ml/min ;进样量：10ul ;系统条件：甲醇-0. 2%磷酸溶液30:70,检测波长260nm ;面 积归一化法计算含量，主成分(水黄皮素 C18 H12 O4)峰不得少于98.0%，如有杂质峰，除溶剂 峰外，各杂质峰面积总和不得超过2. 0%。
[0042] 实施例5 一种高纯度水黄皮素的制备方法，具体步骤为： 1)干豆花的干燥根5kg粉碎后用6倍重量的50%的乙醇回流提取8次，提取液滤过，合 并滤液，回收乙醇，得浸膏； 2) 浸膏再经石油醚萃取，静置，合并石油醚层，浓缩得石油醚萃取物； 3) 石油醚萃取物经硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯-丙酮系统梯度洗脱，收集含水黄 皮素的流分，所述的石油醚-乙酸乙酯-丙酮系统梯度洗脱条件为：0-20min，洗脱系统为石 油醚；21-50min，洗脱系统为石油醚-乙酸乙酯-丙酮，比例为8 :1 :2 ; 4) 流分用TLC检测合并，浓缩，重结晶，即得纯度为重量含量80~90 %的水黄皮素粗 结晶； 5) 将水黄皮素粗结晶用制备高效液相色谱法分离纯化，收集水黄皮素组分； 6) 对所收集的每一份洗脱液利用HPLC检测，合并保留时间相同而且纯度在90%-98%之 间和纯度大于98%以上的水黄皮素，减压浓缩，得到纯度为95. 2%以及99. 0%的水黄皮素。
[0043] 所述步骤5)制备高效液相色谱的色谱柱为C-18柱，甲醇-水：30:70为流动相洗 脱，流速为8mL/min，检测波长为304nm，柱温为30°C。
[0044] 所述步骤4) TLC检测方法为：取水黄皮素粗品加甲醇制成每1ml含Img的溶液， 在同一硅胶G薄层板上，分别按20 ug、40 ug、60 ug、80 ug、100 ug不同的浓度梯度点样， 以石油醚-丙酮（7 :3)、二氯甲烷-丙酮（9. 8:0. 2)、石油醚-乙酸乙酯-丙酮（8:1:1)三种 系统为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%硫酸乙醇溶液，在105°C加热至斑点显色清晰，置 紫外光（365nm)下检视。在薄层色谱中，三种展开剂系统，五个不同浓度的梯度点样，均为 单一斑点，未见杂质斑点。
[0045] 所述步骤6)的HPLC检测方法为：色谱条件：色谱柱C-18,4. 6X250mm，IOum ;流 速：lml/min ;进样量：20ul ;系统条件：甲醇-0. 2%磷酸溶液90:10,检测波长260nm ;面积 归一化法计算含量，主成分(水黄皮素 C18 H12 O4)峰不得少于98. 0%，如有杂质峰，除溶剂峰 外，各杂质峰面积总和不得超过2. 0%。
[0046] 实施例6 一种高纯度水黄皮素的制备方法，具体步骤为： 1) 干豆花的干燥根5kg粉碎后用5倍重量的60%的乙醇回流提取7次，提取液滤过，合 并滤液，回收乙醇，得浸膏； 2) 浸膏再经石油醚萃取，静置，合并石油醚层，浓缩得石油醚萃取物； 3) 石油醚萃取物经硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯-丙酮系统梯度洗脱，收集含水 黄皮素的流分，所述的石油醚-乙酸乙酯-丙酮系统梯度洗脱条件为：梯度洗脱条件为： 0-15min，洗脱系统为石油醚；16-50min，洗脱系统为石油醚-乙酸乙酯-丙酮，比例为9 :3 : 1 ; 4) 流分用TLC检测合并，浓缩，重结晶，即得纯度为重量含量80~90%的水黄皮素粗 结晶； 5) 将水黄皮素粗结晶用制备高效液相色谱法分离纯化，收集水黄皮素组分； 6) 对所收集的每一份洗脱液利用HPLC检测，合并保留时间相同而且纯度在90%-98%之 间和纯度大于98%以上的水黄皮素，减压浓缩，得到纯度为94. 3%以及99. 1%的水黄皮素。
[0047] 所述步骤5)制备高效液相色谱的色谱柱为C-18柱，甲醇-水：40:60为流动相洗 脱，流速为6mL/min，检测波长为304nm，柱温为30°C。
[0048] 所述步骤4) TLC检测方法为：取水黄皮素粗品加甲醇制成每1ml含Img的溶液， 在同一硅胶G薄层板上，分别按20 ug、40 ug、60 ug、80 ug、100 ug不同的浓度梯度点样， 以石油醚-丙酮（7 :3)、二氯甲烷-丙酮（9. 8:0. 2)、石油醚-乙酸乙酯-丙酮（8:1:1)三种 系统为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%硫酸乙醇溶液，在105°C加热至斑点显色清晰，置 紫外光（365nm)下检视。在薄层色谱中，三种展开剂系统，五个不同浓度的梯度点样，均为 单一斑点，未见杂质斑点。
[0049] 所述步骤6)的HPLC检测方法为：色谱条件：色谱柱C-18,4. 6X250mm，IOum ;流 速：lml/min ;进样量：20ul ;系统条件：乙腈-0. 2%磷酸溶液30:70,检测波长260nm ;面积 归一化法计算含量，主成分(水黄皮素 C18 H12 O4)峰不得少于98. 0%，如有杂质峰，除溶剂峰 外，各杂质峰面积总和不得超过2. 0%。
[0050] 实施例7 一种高纯度水黄皮素的制备方法，具体步骤为： 1) 干豆花的干燥根5kg粉碎后用8倍重量的75%的乙醇回流提取4次，提取 液滤过，合 并滤液，回收乙醇，得浸膏； 2) 浸膏再经石油醚萃取，静置，合并石油醚层，浓缩得石油醚萃取物； 3) 石油醚萃取物经硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯-丙酮系统梯度洗脱，收集含水黄 皮素的流分，所述的石油醚-乙酸乙酯-丙酮系统梯度洗脱条件为：0-20min，洗脱系统为石 油醚；21-60min，洗脱系统为石油醚-乙酸乙酯-丙酮，比例为10 :1 :2 ; 4) 流分用TLC检测合并，浓缩，重结晶，即得纯度为重量含量80~90%的水黄皮素粗 结晶； 5) 将水黄皮素粗结晶用制备高效液相色谱法分离纯化，收集水黄皮素组分； 6) 对所收集的每一份洗脱液利用HPLC检测，合并保留时间相同而且纯度在90%-98%之 间和纯度大于98%以上的水黄皮素，减压浓缩，得到纯度93. 8%以及98. 5%的水黄皮素。
[0051] 所述步骤5)制备高效液相色谱的色谱柱为C-18柱，甲醇-水：60:40为流动相洗 脱，流速为7mL/min，检测波长为304nm，柱温为30°C。
[0052] 所述步骤4) TLC检测方法为：取水黄皮素粗品加甲醇制成每1ml含Img的溶液， 在同一硅胶G薄层板上，分别按20 ug、40 ug、60 ug、80 ug、100 ug不同的浓度梯度点样， 以石油醚-丙酮（7 :3)、二氯甲烷-丙酮（9. 8:0. 2)、石油醚-乙酸乙酯-丙酮（8:1:1)三种 系统为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%硫酸乙醇溶液，在105°C加热至斑点显色清晰，置 紫外光（365nm)下检视。在薄层色谱中，三种展开剂系统，五个不同浓度的梯度点样，均为 单一斑点，未见杂质斑点。
[0053] 所述步骤6)的HPLC检测方法为：色谱条件：色谱柱C-18,4. 6X250mm，IOum ;流 速;进样量：10ul ;系统条件：乙腈-0. 2%磷酸溶液80:20,检测波长260nm ;面积 归一化法计算含量，主成分(水黄皮素 C18 H12 O4)峰不得少于98. 0%，如有杂质峰，除溶剂峰 外，各杂质峰面积总和不得超过2. 0%。
[0054] 实施例8 一种高纯度水黄皮素的制备方法，具体步骤为： 1) 干豆花的干燥根5kg粉碎后用10倍重量的65%的乙醇回流提取3次，提取液滤过， 合并滤液，回收乙醇，得浸膏； 2) 浸膏再经石油醚萃取，静置，合并石油醚层，浓缩得石油醚萃取物； 3) 石油醚萃取物经硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯-丙酮系统梯度洗脱，收集含水黄 皮素的流分，所述的石油醚-乙酸乙酯-丙酮系统梯度洗脱条件为：〇-25min，洗脱系统为石 油醚；26-70min，洗脱系统为石油醚-乙酸乙酯-丙酮，比例为7 :2 :1 ; 4) 流分用TLC检测合并，浓缩，重结晶，即得纯度为重量含量80~90%的水黄皮素粗 结晶； 5) 将水黄皮素粗结晶用制备高效液相色谱法分离纯化，收集水黄皮素组分； 6) 对所收集的每一份洗脱液利用HPLC检测，合并保留时间相同而且纯度在90%-98%之 间和纯度大于98%以上的水黄皮素，减压浓缩，得到纯度92. 3%以及99. 7%的水黄皮素。
[0055] 所述步骤5)制备高效液相色谱的色谱柱为C-18柱，甲醇-水：75:25为流动相洗 脱，流速为7mL/min，检测波长为304nm，柱温为30°C。
[0056] 所述步骤4) TLC检测方法为：取水黄皮素粗品加甲醇制成每1ml含Img的溶液， 在同一硅胶G薄层板上，分别按20 ug、40 ug、60 ug、80 ug、100 ug不同的浓度梯度点样， 以石油醚-丙酮（7 :3)、二氯甲烷-丙酮（9. 8:0. 2)、石油醚-乙酸乙酯-丙酮（8:1:1)三种 系统为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%硫酸乙醇溶液，在105°C加热至斑点显色清晰，置 紫外光（365nm)下检视。在薄层色谱中，三种展开剂系统，五个不同浓度的梯度点样，均为 单一斑点，未见杂质斑点。
[0057] 所述步骤6)的HPLC检测方法为：色谱条件：色谱柱C-18,4. 6X250mm，IOum ;流 速;进样量：10ul ;系统条件：乙腈-0. 2%磷酸溶液30:70,检测波长304nm ;面积 归一化法计算含量，主成分(水黄皮素 C18 H12 O4)峰不得少于98. 0%，如有杂质峰，除溶剂峰 外，各杂质峰面积总和不得超过2. 0%。
[0058] 虽然，上文中已经用一般性说明、【具体实施方式】及试验，对本发明作了详尽的描 述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见 的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的 范围。
【主权项】
1. 一种高纯度水黄皮素的制备方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤： 1) 干豆花的干燥根用乙醇回流提取，提取液滤过，合并滤液，回收乙醇，得浸膏； 2) 浸膏再经石油醚萃取，静置，合并石油醚层，浓缩得石油醚萃取物； 3) 石油醚萃取物经硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯-丙酮系统梯度洗脱，收集含水黄 皮素的流分，所述的石油醚-乙酸乙酯-丙酮系统梯度洗脱条件为：〇~A分钟，洗脱系统 为石油醚；B~C分钟，洗脱系统为石油醚-乙酸乙酯-丙酮，比例为10:1:2~6:4:1 ;所述 A为10~25,所述B为11~26,所述C为50~70 ; 4) 流分用TLC检测合并，浓缩，重结晶，即得纯度为重量含量80~90 %的水黄皮素粗 结晶； 5) 将水黄皮素粗结晶用制备高效液相色谱法分离纯化，收集水黄皮素组分； 6) 对所收集的每一份洗脱液利用HPLC检测，合并保留时间相同而且纯度在90%-98%之 间和纯度大于98%以上的水黄皮素，减压浓缩，得到纯度90%-98%之间以及大于98%以上的 水黄皮素。2. 如权利要求1所述的高纯度水黄皮素的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中乙醇 的加入量为药材重量的5-10倍，乙醇浓度为50-90%，回流提取次数为2-8次。3. 如权利要求1所述的高纯度水黄皮素的制备方法，其特征在于，所述步骤5)制备高 效液相色谱的色谱柱为C-18柱，甲醇-水为流动相洗脱，流速为5~10mL/min，检测波长 为 304nm，柱温为 25-35°C。4. 如权利要求3所述的高纯度水黄皮素的制备方法，其特征在于，所述甲醇-水流动相 甲醇-水配比为：15:85~80:20。5. 如权利要求1所述的高纯度水黄皮素的制备方法，其特征在于，所述步骤4)TLC检测 方法为：薄层板：硅胶G;3种展开剂系统：系统（1)石油醚-丙酮重量比例7:3,系统（2)二 氯甲烷-丙酮重量比例9. 8:0. 2,系统（3)石油醚-乙酸乙酯-丙酮重量比例8:1:1 ;点样： 用甲醇制lmg/mL的溶液，在同一硅胶G板上，按不同的点样量梯度点样，点样量分别为20 ug、40ug、60ug、80ug、100ug;置展开缸分别展开，展距：15cm;定位：喷以5%硫酸乙醇溶 液，晾干，在l〇5°C加热至斑点显色清晰，置紫外灯（365nm)下检视；结果在薄层色谱中，可 见黄绿色的单一的荧光斑点，3种展开剂系统，5个不同浓度的梯度点样，均为单一斑点，未 见杂质斑点。6. 如权利要求1所述的高纯度水黄皮素的制备方法，其特征在于，所述步骤6)的HPLC 检测方法为：色谱条件：色谱柱C-18,4.6X250mm，IOum;流速：0.6-1. 5ml/min;进样量： 10~20ul;面积归一化法定量；系统条件为以下三个条件的其中之一： 条件（1)流动相：甲醇-0. 2%磷酸溶液重量比例30:70-90:10,检测波长：260nm; 条件（2)流动相：乙腈-0. 2%磷酸溶液重量比例30:70-80:20,检测波长：260nm; 条件（3)流动相：乙腈-0. 2%磷酸溶液重量比例20:80-80:20,检测波长：304nm。7. 如权利要求6所述的高纯度水黄皮素的制备方法，其特征在于，所述的系统条件（3) 流动相：乙腈-0. 2%磷酸溶液重量比例30:70-80:20 ;检测波长：304nm。8. -种高纯度水黄皮素，用权利要求1所述的制备方法制备而成，其纯度大于98%。
【专利摘要】本发明涉及一种高纯度水黄皮素的制备方法，其方法是：将干花豆的干燥根粉碎，用乙醇加热回流提取，合并提取液，浓缩，混悬液用石油醚萃取，静置，合并石油醚层，浓缩得石油醚萃取物。石油醚萃取物经硅胶柱层析，用石油醚：乙酸乙酯：丙酮系统梯度洗脱，用薄层色谱检测，收集含有水黄皮素的洗脱液，合并，减压浓缩，重结晶，得到水黄皮素粗结晶。再用制备高效液相法分离纯化，对所收集的每一份洗脱液利用分析型高效液相色谱检测，分别得到纯度在90%～98%之间的水黄皮素和纯度大于98%的水黄皮素组分。该设计合理，工艺简单分离速度快，生产周期短，适合工业化生产。
【IPC分类】C07D493/04
【公开号】CN104892620
【申请号】CN201510247241
【发明人】刘布鸣, 黄瑞松, 黄艳, 冯军, 邱宏聪
【申请人】广西壮族自治区中医药研究院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月15日
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