嗜氮酮类化合物及其制备方法和用图
嗜氮酮类化合物及其制备方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物化学领域，具体地说涉及一类新嗜氮酮类化合物及其制备方法和 用途，以及该类化合物的产生菌。
【背景技术】
[0002] 蛋白质酪氨酸磷酸酶（Protein-tyrosine phosphatase，PTP)在细胞信号传导中 具有重要的作用，它们通过调节细胞内蛋白酪氨酸的磷酸化水平来控制细胞的生长、分化、 代谢；细胞迀移、基因转录、离子通道开闭、免疫反应、细胞凋亡以及成骨发育也受到调控。 蛋白质酪氨酸磷酸酶的紊乱可导致多种疾病，如糖尿病、肥胖症和骨质疏松症（Desai，et al., 1996, Cell, 84: 599-609; Kishiharaetal., 1993, Cell, 74:143-156; Hardy S, et al. , Anticaner Agents Med Chem 2011, Jun 27. )〇
[0003] 蛋白质酪氨酸磷酸酶是一个大家族，按其在细胞内所处的位置可分为跨膜受体型 和胞内非受体型。目前的研宄结果证明其中PTP1B、SHP2与胰岛素信号通路关系最为密切。 蛋白酪氨酸磷酸酶一 IB(Protein tyrosine Phosphatase 1B，PTP1B)是在体内广泛表达的 胞内蛋白质酪氨酸磷酸酶，由PTPNl基因编码（Brown-Shimer S·，et al. ,Proc Nat Acad Sci, 1990，87: 5148-5152)。蛋白酪氨酸磷酸酶 SHP2[Src homology 2 (SH2) domain containing phosphotyrosine- phosphatase 2，SHP2]是一种由 PTPNll 基因编码，细胞 质内广泛表达的非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶。SHP2分子结构包括N端两个Src同源区、中部 一个酪氨酸磷酸（酯）酶活性区域、C端一个包含多个酪氨酸磷酸化位点及一个富含脯氨酸 Motif 尾巴的区域[Neel B.G·，etal·，Trends Biochem Sci, 2003，28(6): 284-293]。
[0004] 胰岛素（Insulin)通过与胰岛素受体（Insulin receptor，IR)的α亚基结合，激 活受体胞内β亚基内在的酪氨酸激酶活性，从而导致酪氨酸参加自身的磷酸化。而被激活 的胰岛素受体酪氨酸激酶再通过磷酸化胰岛素受体底物（Insulin receptor substrate， IRS)，从而将胰岛素信号传递下去。胰岛素抵抗的主要原因是胰岛素信号通路的阻断或减 弱。研宄发现PTPlB通过对胰岛素受体激酶（insulin receptor kinase，IRK)或IRK活性 片段的磷酸化酪氨酸残基去磷酸化作用，对胰岛素信号传导进行负调节。PTPlB通过无催化 活性的C-末端结构域与内质网相连，与其他PTPase相比，有更高的去IR0和IRS磷酸化 活性，从而抑制IRS和PI3K的P85亚基复合物的形成以及Akt、MAPK的磷酸化水平，而且胰 岛素诱导的糖原合成被抑制，因此，PTPlB可在胰岛素信号级联中的多个位点发挥负调控作 用。过度表达PTPlB能增加胰岛素受体脱磷酸化、下调受体后信号；相反，抑制受体一 PTPlB 结合、PTPlB的定点突变以及给与抑制性抗体的实验方法均可增强胰岛素信号。[Elchebly M.,et al. , Science 1999, 283: 1544-1548. ]〇
[0005] 更重要的研宄证明，PTPlB基因敲除小鼠的基础代谢水平和总体能量消耗升高， 体重减轻，膜岛素敏感性增强[Klaman L.D·，et al. Molecular and Cellular Biology, 20 (15) ,5479-5489]。Tonks 等[Tonks N.K·，et al·，Mol Cell Biol, 1990, 10:458-463] 的实验表明，给爪蟾卵显微注射PTPlB阻断了胰岛素的作用。最近的基因敲除小鼠模型的 研宄已充分证明了 PTPlB是胰岛素作用的特异性调控子，PTPlB可影响体重和能量消耗的 调节。Elchebly等报道，PTPlB基因敲除鼠在表型上是健康的，同时有较低的空腹血胰岛 素和血糖水平、在胰岛素耐量实验中血糖明显下降等胰岛素敏感性增加的表现，且这种增 敏效应具有组织特异性，它可增加骨骼肌对葡萄糖的摄取，但对脂肪组织无明显影响。更 加令人振奋的是，敲除鼠在高脂饮食喂养时不会出现肥胖或体重增加，也不发生IR的加重 [Elchebly M.，et al.，Science 1999，283: 1544-1548]。这一研宄结果提出了一个可 能性：抑制PTPlB能有效的解决代谢综合征的两个主要问题，糖耐量减低和肥胖，PTPlB是 研宄开发抗糖尿病药物的一个重要的新靶点。
[0006] 蛋白质酪氨酸磷酸酶 SHP-l(SH2_containing tyrosine phosphatase 1，SHP-1)， 是含有SH2结构域的胞内非受体型酪氨酸磷酸酶。SHP-I在一些造血细胞中表达量较高， 并在造血细胞信号传导过程中起负调节作用，如JAK-STATs通路[Yajun Han，et al.， Blood, 2006 Vol. 108，2796-2803];近些年来，有研宄发现SHP-I在控制血糖方面也有 作用[Dubois MJ, etal·，NatMed, 2006，Vol. 12，549-556]，它可以通过调节肝脏和 肌肉中的胰岛素信号通路，以及肝脏的胰岛素清除率，维持血糖浓度的稳定。有研宄表明， 先天功能性缺失SHP-I的小鼠，与野生型小鼠相比，其肝脏和肌肉中的胰岛素信号通路得 到了加强，并且具有明显的葡萄糖耐受以及胰岛素敏感性[Witkiewicz A, et al.，Hum Pathol，2007，38(3): 462-7])。因此，SHP-I活性的增强是引起2型糖尿病的重要原因 之一，将SHP-I作为治疗2型糖尿病及胰岛素抵抗的药物靶标蛋白具有广阔的应用前景。
[0007] 巨噬细胞蛋白酪氨酸磷酸酶2 (MEG2)，最初是从人的巨噬细胞MEG-01和脐 静脉内皮细胞的cDNA文库中克隆，并因此而得名。MEG2表达于多种细胞，在人脑、胰 脏、白细胞、巨·细胞等中表达量较高[Kruger JM, et al·，J Biol Chem. 2002 Jan 25;277 (4):2620-8; Wang X，et al·，J Immunol, 2002，168(9): 4612-9]。Cho CY 等 发现MEG2是胰岛素依赖性的F0X01亚细胞定位的调控因子，该基因在细胞中的异常表达可 抑制胰岛素诱导的胰岛素受体磷酸化，从而抑制胰岛素的信号通路。利用RNAi技术使MEG2 表达降低，可明显增加胰岛素的作用，从而使糖尿病小鼠对糖尿病的耐受性得到改善[Cho CY，Cell Metab，2006，3(5): 367-78] "MEG2的抑制剂被证明具有潜在的抗II型糖尿病 的作用[Zhang S，et al·，J Am Chem Soc, 2012，134(43): 18116-24]。
[0008] 糖尿病（diabetes mellitus)是一种由遗传和环境相互作用而引起的、以高血糖、 胰岛素抵抗为特征的临床综合征。糖尿病是因胰岛素分泌绝对或相当不足以及靶组织细胞 对胰岛素灵敏性降低，引起糖、蛋白、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱的疾病。高血糖是 糖尿病的临床主要标志，但久病可引起多个系统的损害。由于糖尿病人群中高发冠心病、 缺铁性或出血性血管病、失明、肢端环疽等严重的并发症，所以糖尿病具有很高的致死率和 致残率。据国际糖尿病联盟2012年发布的《糖尿病地图》估计，2012年糖尿病患病人数为 3. 71亿，其中死亡人数为480万。最新数据显示，糖尿病上升趋势仍在持续。截止到2013 年年末，共计510万人死于糖尿病并发症。并居当今世界死亡原因的第4位，已严重危害了 人类的健康。中国糖尿病人数超过1亿，并随着生活方式改变和老龄化的问题并呈快速的 上升趋势。另外，据2012年世界卫生组织数据，全球肥胖人数超5亿，肥胖以及肥胖带来的 相关疾病也早已成为全球面临的重大卫生健康难题。
[0009] 目前一般讲糖尿病分为两类，I型糖尿病(胰岛素依赖糖尿病，IDDM)与II型糖尿 病(非胰岛素依赖型糖尿病，NIDDM)。I型糖尿病的病因是胰岛细胞被破坏，从而引起胰岛 素的绝对不足，患者必须依赖胰岛素维持生命；而II型糖尿病原因复杂，是由于胰岛素的 相对不足或胰岛素抵抗引起的。糖尿病中90%以上是II型。所以II型糖尿病药物的治疗 策略是增加胰岛素分泌以及胰岛素增敏。
[0010] 总之，大量的研宄结果已经证明蛋白酪氨酸磷酸酶介导多种疾病的发生和发展， 蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂具有预防和治疗肥胖、糖尿病以及相关并发症的药物作用。蛋白 酪氨酸磷酸酶已经作为新的抗糖尿病、肥胖等药物研宄的祀点[Darry A.J., Future Med Chem, 2010，2(10): 1563-1576]。
[0011] 嗜氮酮类化合物（azaphi Iones )是一类结构新颖的真菌来源的聚酮类次级代谢产 物，含有插烯γ-吡啶酮骨架(见式1)，具有多种生物活性。截止到2012年，共发现该类化 合物近400个，根据不同位置取代基团的差异分为18小类（Gao JM，Chemical Review， 2013，113: 4755-4811)。本发明化合物属于8位连接脂肪酮取代的角型γ-内酯结构类。 文献报道的该类化合物有12个，包括从helotialean子囊菌中分离的helotialins A-C、 来源于红树林内生真菌鲜红青霉ZH4-E2)的Chermesinones A-C、盘单毛抱属真菌COffi jDia PRL 1754)的 monochaetin 和分离自弯头 曲霉i/e/yeciiASy* 的弯头霉素 la, lb, lc, 2a, 2b。Anke H 等报道弯头霉 素 la, lb，lc，2a，2b具有抗细菌、抗真菌和小鼠腹水瘤抑制作用[Anke H，et al. J Antibiot, 1981，34(8): 923-928] ;Musso L 等报道，弯头霉素 la, lb, 2a, 2b 对热激蛋 白90 (HSP90)具有很弱的抑制活性(对Hsp90-ATPase抑制活性IC5tl大于5〇μΜ，对Hsp90 结合IC 5tl大于100μΜ )，弯头霉素 Ib对人卵巢癌细胞株IGR0V-1、人黑色素瘤细胞株JR8、人 上皮癌细胞株Α431具有一定的抑制活性，IC5tl约为26μΜ (Musso L, et al. Bioorg Med Chem, 2010，18: 6031-6043)。本发明涉及的化合物、制备方法及活性未见报道。
[0012] a i啃mm失1七甘籾官栄。
【发明内容】
[0013] 本发明的目的是提供一种具有PTP抑制作用的嗜氮酮类化合物，以及该类化合物 的制备方法和医药用途，并提供了产生此类化合物的菌株。
[0014] 为实现本发明目的，本发明提供了一种嗜氮酮类化合物，其结构如下式：
其中，R为7~12个碳的直链或支链烷基、烯基。
[0015] 优选 R 为：n-C7H15、C (CH3) =CH (C7H15)、n-C9H19、CH (CH3) (C8H17)、Ii-C1 而3或 CH (CH 3) (CltlH21)中的任意一种。
[0016] 本发明所提供的嗜氮酮类化合物产生菌株为弯头曲霉，其保藏名称为弯头曲霉 (NCC0415,保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心，保藏日期2014年4月30日，保藏编号为CGMCC No. 9095,保藏地址为：北京市朝 阳区北辰西路1号院3号中国科院微生物研宄所。
[0017] 本发明所提供的真菌菌株NCC0415,经宏观及显微形态观察将其鉴定为弯头曲霉 QAspergillus defIectus)。
[0018] 本发明所述的鉴定方法为将菌株NCC0415的孢子液涂布于载玻片上，于400倍显 微镜下进行显微形态观察。将菌株NCC0415的孢子液点种于3种曲霉鉴定培养基：CYA (查 氏酵母粉琼脂)、MEA (麦芽粉琼脂)、CY20S (20%蔗糖查氏酵母粉琼脂)25°C下培养7~14天， 进行宏观形态观察。经过宏观及显微形态观察，将NCC0415鉴定为弯头曲霉价7ΛΛ5 deflectus )〇
[0019] 本发明所使用的弯头曲霉真菌菌株NCC0415是从四川 古澜黄荆老林土壤中分离得到的一株野生菌株。
[0020] 本发明所述的土壤样品采集方法为用无菌铲铲去靠近植物根部土壤的表层的腐 殖土，然后取距离地表深度为5-lOcm的土样约30克置于已灭菌的纸袋中保存。
[0021] 本发明所述的土壤样品的分离方法为取1克该样品加入到IOmL无菌水中充分振 荡，随后取ImL混悬液加入到另一支装有9mL无菌水的试管中充分振荡，依此类推进行梯度 稀释值至KT ltl浓度。每个浓度取0. 2mL涂布PDA双碟，随后在26°C下进行静置培养，双碟 培养周期为3~10天，在此期间从双碟中挑取形态不同的菌落于TOA (北京双旋）斜面中进 行培养，斜面培养时间为14天。通过上述方法获得了一株真菌，将其命名为NCC0415。
[0022] 本发明提供了上述嗜氮酮类化合物的制备方法，该方法是采用上述弯头曲霉 (As/76?r^77A/5· 发酵制备所述嗜氮酮类化合物。具体地说，包括以下步骤： a、制备弯头曲霉的种子液： 将菌株NCC0415的斜面培养物或孢子液接种于种子培养基，培养温度为22~30 °C、转 速为100~220 rpm，培养时间为48~72 h获得种子液； 其中所述的种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉10. 〇~40.0 克、葡萄糖10. 0~40.0 克、热榨黄豆饼粉4. 0~20. 0克、麦芽粉I. 0~6. 0克、酵母粉I. 0~3. 0克、氯化钠0. 5~2. 0克、 七水硫酸镁〇· 5~2. 0克，加自来水定容至lOOOmL，ρΗ6· 5~7· 0, 121°C灭菌30min。
[0023] b、制备弯头曲霉i/e/yeciiAs) NCC0415 的发酵产物： 将上述种子液以体积百分比3~10 %的接种量接种于固体发酵培养基，发酵温度22 °C ~37 °C、发酵时间10~20天，得到发酵液。
[0024] 其中所说的固体发酵培养基包括固体颗粒状基质、粉状基质、无机盐，所述粉状基 质或无机盐任选添加或不添加。
[0025] c、向上述发酵液中加入有机溶剂浸泡，过滤，滤液浓缩得到粗浸膏，所述有机溶剂 为甲醇、乙醇、丙酮或乙酸乙酯。
[0026] d、上述粗浸膏中加入非极性有机溶剂，搅拌，静置，固液分离得到下层固体相为干 浸膏A。
[0027] e、将干浸膏A过硅胶柱层析，石油醚：氯仿：甲醇梯度洗脱，收集洗脱液，HPLC检 测，分组合并，将具有245, 350nm特征吸收峰的部分合并，减压蒸干得黄褐色粉末。
[0028] 将上述得到的黄褐色粉末溶解，通过HPLC制备色谱柱制备，乙腈-水梯度洗脱，UV 检测器检测，依次收集洗脱之色谱峰，相同部分合并，分别浓缩至干得到如权利要求1或2 所述化合物。
[0029] 其中步骤b中固体发酵培养基所包括的固体颗粒状基质为大米、小米、小麦、麸 皮、玉米渣，所包括的粉状基质为热轧黄豆饼粉、棉籽粉、玉米蛋白粉，所包括的无机盐成份 为磷酸盐、硫酸镁、氯化钠；121°C灭菌30min。
[0030] 其中步骤C中有机溶剂加入量优选用发酵液2倍以上体积，浸泡2~4小时。
[0031] 其中步骤d中粗浸膏中加入4~6倍体积的石油醚或正己烧，搅拌均勾，-4°C静置 2~4小时分相。
[0032] 其中步骤f干浸膏A过硅胶300~400目硅胶柱，干法上样。石油醚：氯仿：甲醇 (7:3:0~0:10:0~0:7:3 )梯度洗脱，收集洗脱液。
[0033] 其中步骤f中得到的黄褐色粉末以DMSO溶解，0. 45um滤膜过滤后进行HPLC制 备，乙腈-水梯度洗脱，UV检测器检测波长设为254nm。依次收集洗脱之色谱峰，相同部分 合并分别减压蒸干得 NCC0415-81、NCC0415-82、NCC0415-83、NCC0415-84、NCC0415-85 和 NCC0415-87。
[0034] 除上述制备方法外，本发明所述新嗜氮酮类化合物还可以按照常规方法，通过合 成、半合成或生物转化的方式获得。
[0035] 本发明还提供了上述新嗜氮酮类化合物的一种医药用途：将该化合物用于制备预 防或治疗PTP所介导疾病的药物。
[0036] 本发明所述PTP所介导疾病，具体地说是指糖尿病或肥胖症。
[0037] 涉及上述医药用途时，根据本领域技术人员的公知常识，不仅是本发明所述新嗜 氮酮类化合物本身，其药学上可接受的盐、异构体、酯或前体药物都可以具有与其相同或相 近的医药用途。上述药学上可接受的盐包括钠、钾、钙盐，以及胺盐；所述胺包括氨、烷基胺、 苯胺和氨基酸；所述氨基酸包括精氨酸、赖氨酸。上述药学上可接受的盐还可以形成溶剂化 物，并具有与之相同或相近的医药用途；所述溶剂化物包括水合物、醇合物。上述前药在体 内代谢变化后能够释放出本发明所述嗜氮酮类化合物。
[0038] 本发明所述嗜氮酮类化合物的医药用途，具体来说是通过以下方法实现的： 按照常规方法制备药物组合物，其包含上述嗜氮酮类化合物和可药用载体。其中，所 述嗜氮酮类化合物的质量百分含量为〇. 1-99%，优选5-75%。该药物组合物按照给药途径不 同，可分为口服制剂、舌下或颊给药制剂、吸入制剂、注射剂、直肠给药制剂、经皮给药制剂 等。其中，优选口服制剂。
[0039] 当制备口服制剂时，单位剂型中所述嗜氮酮类化合物的含量为l_500mg，优选 l-250mg。可选择的剂型包括片剂、丸剂、锭剂、胶囊剂、液体、凝胶、糖浆剂、浆液、悬液等。其 中，优选片剂、胶囊剂。可药用载体包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇、淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维 素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯啦咯烷酮、琼脂、藻酸、藻酸钠、滑石粉、硬 脂酸镁、微粉硅胶、脂肪油、液体石蜡、液体聚乙二醇等。
[0040] 当制备舌下或颊给药制剂时，可以采取片剂或糖锭剂的形式，按照常规方法配制。
[0041] 当制备吸入制剂时，可以采取加压气雾剂的形式。适合的推进剂包括二氯二氟甲 烷、三氯氟代甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳。可药用载体包括乳糖、淀粉。
[0042] 当制备注射剂时，单位剂型中所述嗜氮酮类化合物的含量为0. l-100mg，优选 0. l-25mg。可选择的剂型包括油性注射液、水性注射液或冻干粉针剂。可药用载体包括脂 肪油、油酸乙酯、甘油三酯、脂质体、羧甲基纤维素钠、葡聚糖、交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、 藻酸、藻酸钠。
[0043] 当制备直肠给药制剂时，可以采取栓剂或灌肠剂的形式。可药用载体包括可可脂、 甘油酯。
[0044] 当制备经皮给药制剂时，可以采取贴剂的形式。可药用载体包括聚丙烯酸钠、聚丙 烯酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇。
[0045] 上述药物组合物在应用时，应达到有效治疗剂量，并根据疾病的性质、患者的年 龄、体重进行合理调整。通常，所述嗜氮酮类化合物的给药剂量为0. 01-100mg/kg体重，优 选为0. l-10mg/kg体重，更优选的是l-5mg/kg体重。给药剂量和频率最终应由医生决定。
【附图说明】
[0046] 图1为菌株的分生孢子梗及分生孢子结构。
[0047] 图2为菌株在CYA上25°C培养7天的菌落形态。
[0048] 图3为菌株在MEA上25°C培养7天的菌落形态。
[0049] 图4为菌株在CY20S上25°C培养7天的菌落形态。
[0050] 图5为菌株在CYA上37°C培养7天的菌落形态。
【具体实施方式】
[0051] 下面用具体实施例来进一步说明本发明的内容，但并不以任何方式意味着对本发 明进行限制。下列实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
[0052] 下列实施例所涉及的部分原材料的规格型号如下： 核磁共振仪：Bruker Avance III 500, TMS为内标 高分辨质谱：LTQ Orbitrap Discovery (Thermo Scientific, Germany) 中压层析系统：Buchi公司 高压液相系统(分析）：Waters公司，2个515型泵，996检测器 高压液相系统(制备）：Waters公司，600型泵，2487检测器 酶标仪：Perkin Elmer 公司 Victor2 1420 Multilabel Counter 分析型色谱柱：Chromasil ODS column (4· 6 X 250 mm, 10 mm) 制备色谱柱：Phenomenex ODS column (21. 2 X 250 mm, 10 mm) 层析硅胶：300~400目，青岛海洋化工厂 色谱级甲醇和乙腈购自德国Merck公司，其他试剂均为分析纯，购自北京化学试剂厂。
[0053] 实施 例 1、弯头曲霉ofefYecNCC0415的分离 真菌菌株NCC0415的分离用培养基为PDA (北京双旋）； 取1克土壤样品(采自四川古澜黄荆老林土壤)，放入装有9mL无菌水的50mL离心管中， 充分振荡。取ImL悬浊液放入装有9mL无菌水的试管中，混匀。依次进行系列梯度稀释直 到KT'每个梯度下取0.2mL涂板。所涂平板置于25°C下进行培养，从中获得了一株真菌， 将其命名为NCC0415。
[0054] 实施例2、菌株NCC0415的鉴定 将菌株NCC0415的孢子液涂布于载玻片上，于400倍显微镜下进行显微形态观察。将 菌株NCC0415的孢子液点种于曲霉鉴定培养基上：CYA (查氏酵母粉琼脂)、MEA (麦芽粉琼 脂)、CY20S (20%蔗糖查氏酵母粉琼脂)中，25°C下培养7天，进行宏观形态观察，同时做CYA 上37 °C培养。
[0055] 菌株NCC0415的分生孢子梗及分生孢子结构（如图1所示）；该菌株产生的分生孢 梗子较短，壁光滑。分生孢子梗顶端弯曲，呈烟斗状。顶囊呈球形，1/3表面可育，产孢结构 双层，分生孢子呈球形，壁光滑。
[0056] 菌株NCC0415在培养基中的形态特征如下： NCC0415在CYA (查氏酵母粉琼脂）上25°C培养7天的菌落形态（如图2所示)，菌落 生长局限，菌落直径达到15-20mm ;质地丝绒状，质地紧密，菌丝体呈橙黄色；菌落边缘不整 齐；菌落反面呈橙红色。
[0057] NCC0415在MEA (麦芽粉琼脂）上25°C培养7天的菌落形态(如图3所示)，菌落生 长局限，直径达到15-20mm，菌落隆起，质地絮状，菌落颜色近于奶油浅黄色；菌落反面呈褐 色。
[0058] NCC0415在CY20S (20%蔗糖查氏酵母粉琼脂）上25°C培养7天的菌落形态(如图 4所示)，菌落直径达到28-32mm，菌落平坦，中央部位稍隆起，菌株质地呈奶油状，质地软，中 央部位呈淡橘红色，其余呈奶油白，有少量菌丝存在。
[0059] NCC0415在CYA (查氏酵母粉琼脂）上37°C培养7天的菌落形态(如图5所示)，生 长良好，7天菌落直径达到23-26mm。菌落平坦或中央隆起，质地致密，呈白色或灰褐色。
[0060] 实施例3嗜氮酮类化合物的制备 按照以下步骤制备嗜氮酮类化合物： (a)制备弯头曲霉i/e/yeciiAs) NCC0415 的种子液 将弯头曲霉（￡/e/7eciw5·)真菌NCC0415接种于种子培养基，25 °C、转速 200 rpm培养72 h获得种子液。种子培养基的制备方法为：玉米淀粉30.0 克、葡萄糖10.0 克，热榨黄豆饼粉4.0克、麦芽粉5.0克、酵母粉3.0克，氯化钠2.0克，七水硫酸镁1.0克， 加自来水溶解定容至1000 ml，pH值6. 5,121 °C灭菌30 min。
[0061] (b)制备弯头曲霉NCC0415 的固体发酵产物 将种子液以5%的接种量接种于装有100克固体大米发酵培养基的750mL三角瓶中， 22°C、静置培养20天。发酵培养基的制备方法为：大米与水按4:1比例混合均匀，浸泡时 间3-10小时。然后按总重的2. 5%加入热榨黄豆饼粉，混合均匀后分装于750mL三角瓶中， 每瓶装量100克，胶塞，121°C下灭菌30min ; (c)嗜氮酮类化合物的制备 真菌NCC0415大米发酵产物4kg，加入乙酸乙酯8L，搅拌均匀，浸泡2小时，过滤。重复 一次。合并两次滤液，加无水硫酸钠干燥。过滤，滤液减压蒸干得到粗浸膏125g。
[0062] (d)NCC0415提取浸膏125g加入625ml石油醚，搅拌均匀，-4°C静置2小时，分相。 下层固体相32g为干浸膏A ; (e)干浸膏A过硅胶柱层析粗分。硅胶300~400目装柱49x310mm，干法上样。梯度洗 脱，流速80ml/min，梯度设置:_
以50ml/份收集洗脱液。HPLC检测，分组合并。在石油醚-氯仿洗脱部分将有245， 350nm特征吸收峰的部分合并，减压蒸干得3. 2g黄褐色粉末。
[0063] 将上述得到的粉末以DMSO溶解，0. 45um滤膜过滤后进行HPLC制备。乙腈-水梯 度洗脱，流速18ml/min，梯度设置：
UV检测器检测波长设为254nm。依次收集色谱峰，分别减压蒸干得NCC0415-81(21mg， RT :20. lmin)、NCC0415-82 (20mg，RT :21.8min)、NCC0415-83 (74mg，RT :22.4min)、 NCC0415-84 (90mg，RT :23. 2min)、NCC0415-85 (12mg，RT :24.4min)、NCC0415-87 (88mg， RT :25. Omin)。
[0064] 所得上述各化合物的化学结构、理化性质和核磁数据如下： (I)NCOMl5-8U 弯头曲菌素 Kl): 淡黄色结晶性粉末，HRMS给出m/z:
359. 1853,分子式：021112605,? NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.36 (s, 1H), 6.01 (s, 1H), 5.35 (s, 1H), 3.85 (d, 1H), 3.74 (d， 1H), 3. 10(ddd, 1H), 2.49 (ddd, 1H), 2. 15(s, 3H), 1.60(m, 2H),1.57(s, 3H), I. 18~1. 32(m, 8H), 0· 87(t, 3H) ;13C 匪R (126 MHz, CDCl3) 5 202.45, 191.60, 168.74, 159.53, 147.64, 144.79, 114.61, 107.46, 105.60, 82.97, 56.62, 43.06, 42.89, 31.76，29.15, 29.01，23.32, 23.21, 22.70, 19.58，14.19。
[0065] (2)NCC0415_82 (弯头曲菌素 K2):
淡黄?结瞄?王物、木，甘卞 A :<-Z4hl；jUUb，'hl NMK〈bUU MHz, UUUJV 0 V. 2? (,s, 1H), 6. 65 (t, 1H), 6. 01(s, 1H), 5. 38 (s, 1H), 4. 33 (d, 1H), 4. 03 (d, 1H), 2. 30(m, H), 2. 14(s, 3H), 1.83(s, 3H), 1.59(s, 3H), 1.47(m, 2H), 1.20-1. 37 (m, 10H), 0.88(t, 3H) ；13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 192.19, 192.13, 168.77, 159.43, 150.03, 147.25, 144.73, 136.49, 114.72, 107.44, 105.73, 83.01, 51.67, 44.06, 31.84, 29.86, 29.54, 29.19, 28.48, 23.29, 22.76, 19.61, 14.22, 11. 74〇
[0066] (3)NCC0415_83 (弯头曲菌素 K3):
淡黄色结晶性粉末，HRMS给出m/z: 387. 2166,分子式：C23H3005,1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.36 (s, 1H), 6.03 (s，1H), 5.35 (s, 1H), 3.85 (d, 1H), 3.76 (d， 1H), 3.10 (ddd, 1H), 2.49 (ddd, 1H), 2.16 (s, 3H), 1.60 (m, Η), 1.57 (s, 3H)， I. 18~1· 32(m，12H)，0· 87(t, 3H) ;13C 匪R (126 MHz, CDCl3) δ 202.40, 191.49, 168.77, 159.48, 147.57, 144.75, 114.53, 107.41, 105.51, 82.92, 56.57, 43.01, 42.85, 31.91, 29.46, 29.44, 29.29, 29.00,23.26,23.14,22.71, 19.51, 14. 17〇
[0067] (4)NCC0415_84 (弯头曲菌素 K4):
淡黄色结晶性粉末，HRMS 给出 m/z: 401. 2325[M+1]+，分子式：024113205,? NMR (500 MHz, CDCl3) δ7. 29(s, 1H), 6. 04(s, 1H), 5. 36 (s, 1H), 3. 95 (d, 1H), 3. 87(d, 1H), 3. 08(m, 1H), 2. 16(s, 3H), 1.72(m, 1H), 1.58(s, 3H), I. 15~1. 37 (m, 13H), 1.04(d, 3H), 0.87 (t, 3H);13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 206.19，191.57，168.63，159.52， 147.20, 144.63, 114.53, 107.40, 105.57, 82.87, 54.80, 45.78, 43.12, 31.91, 31.55, 29.80, 29.46, 29.32, 27.11, 23.30, 22.70, 19.53, 16.70, 14. 17〇
[0068] (5)NCC0415-85 (弯头曲菌素 K5):
淡黄色结晶性粉末，分子式：C25H3405/HNMR (500 MHz, CDCl3) δ7. 35(s, 1H)， 6. 00(s, 1H), 5. 35(s, 1H), 3. 85 (d, 1H), 3. 72 (d, 1H), 3. 10(ddd, 1H), 2. 48 (ddd, 1H), 2. 15(s, 3H), 1.60(m, 2H), 1.57(s, 3H), I. 18-1.32 (m, 16H), 0.88 (t, 3H)； 13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 202.45, 191. 54, 168. 74, 159.44, 147. 59, 144.66, 114.59, 107.43, 105.65, 82.98, 56.63, 43.09, 42.90, 32.04, 29.74, 29.72, 29.58, 29.52, 29.46, 29.08, 23.33, 23.22, 22.82, 19.59, 14. 26〇
[0069] (6)NCC0415_87 (弯头曲菌素 K6):
淡黄色结晶性粉末，HRMS 给出 m/z: 429. 2644[M+1]+，分子式：0261 13605,? NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.30 (s, 1H), 6.04 (s, 1H), 5.37 (s, 1H), 3.94 (d, 1H), 3.87 (d， 1H), 3.08(m, 1H), 2. 16(s, 3H), 1.71(m, 1H), I. 16-1.40 (m, 17H), 1.04(d, 3H), 0.88(t, 3H) ；13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 206.24, 191.67, 168.63, 159.58, 147.27, 144.74, 114.55, 107.44, 105.55, 82.87, 54.79, 45.77, 43.08, 31.97, 31.57, 29.82, 29.68, 29.67, 29.53, 29.40, 27.13, 23.32, 22.75, 19.56, 16.73, 14. 20〇
[0070] 实施例4 NCC0415的发酵和含嗜氮酮类化合物粗提取物的制备 (a)制备弯头曲霉i/e/yeciiAs) NCC0415 的种子液 将弯头曲霉（真菌NCC0415接种于种子培养基，22 °C、转速 100 rpm培养72 h获得种子液。种子培养基的制备方法为：玉米淀粉10.0克、葡萄糖40.0 克，热榨黄豆饼粉14.0克、麦芽粉6.0克、酵母粉1.0克，氯化钠1.0克，七水硫酸镁0.5 克，加自来水溶解定容至1000 ml，pH值7.0,121 °C灭菌30 min。
[0071] (b)制备弯头曲霉NCC0415 的固体发酵产物 将种子液以7%的接种量接种于装有100克固体玉米渣发酵培养基的750mL三角瓶中， 30°C、静置培养14天。发酵培养基的制备方法为：玉米渣与水按3:1比例混合均匀，加入 少许氯化钠（1克)，浸泡时间3-10小时。然后分装于750mL三角瓶中，每瓶装量100克，胶 塞，121°C下灭菌30min ; (c)含嗜氮酮类化合物粗提取物的制备 真菌NCC0415大米发酵产物4kg，加入工业丙酮4L提取，搅拌均匀，浸泡2小时，分相。 重复一次。合并两次上清液，加无水硫酸钠干燥。过滤，滤液减压蒸干得到粗浸膏ll〇g。
[0072] 实施例5 NCC0415的发酵和含嗜氮酮类化合物粗提取物的制备 (a)制备弯头曲霉i/e/yeciiAs) NCC0415 的种子液 将弯头曲霉（真菌NCC0415接种于种子培养基，30 °C、转速 220 rpm培养48 h获得种子液。种子培养基的制备方法为：玉米淀粉40.0克、葡萄糖30.0 克，热榨黄豆饼粉20. 0克、麦芽粉1.0克、酵母粉2.0克，氯化钠0.5克，七水硫酸镁2.0 克，加自来水溶解定容至1000 ml，pH值6. 7,121 °C灭菌30 min。
[0073] (b)制备弯头曲霉NCC0415 的固体发酵产物 将种子液以3%的接种量接种于装有100克固体小米发酵培养基的750mL三角瓶中， 37°C、静置培养10天。发酵培养基的制备方法为：小米与水按8:3比例混合均匀，浸泡时间 3-10小时。然后按总重的2. 5%加入玉米蛋白粉，加入少许无水硫酸镁（0. 5克)，混合均匀 后分装于750mL三角瓶中，每瓶装量100克，胶塞，121°C下灭菌30min ; (c)含嗜氮酮类化合物粗提取物的制备 真菌NCC0415大米发酵产物4kg，加入甲醇12L，搅拌均匀，浸泡3小时，过滤。重复一 次。合并两次滤液，加无水硫酸钠干燥。过滤，滤液减压蒸干得到粗浸膏96g。
[0074] 实施例6 NCC0415的发酵和含嗜氮酮类化合物粗提取物的制备 按照以下步骤制备嗜氮酮类化合物： (a)制备弯头曲霉i/e/yeciiAs) NCC0415 的种子液 将弯头曲霉（真菌NCC0415接种于种子培养基，26 °C、转速 200 rpm培养72 h获得种子液。种子培养基的制备方法为：玉米淀粉20.0克、葡萄糖20.0 克，热榨黄豆饼粉8. 0克、麦芽粉3. 0克、酵母粉2. 5克，氯化钠1. 5克，七水硫酸镁1. 5克， 加自来水溶解定容至1000 ml，pH值6. 8,121 °C灭菌30 min。
[0075] (b)制备弯头曲霉NCC0415 的固体发酵产物 将种子液以10%的接种量接种于装有100克麸皮与棉籽粉混合发酵培养基的750mL三 角瓶中，26°C、静置培养20天。发酵培养基的制备方法为：麸皮：棉籽粉：水按1:1:2比例 混合均匀，加入少许磷酸钠（1. 5克)，然后分装于750mL三角瓶中，每瓶装量100克，胶塞， 121°C 下灭菌 30min ; (c)含嗜氮酮类化合物粗提取物的制备 真菌NCC0415大米发酵产物4kg，加入工业乙醇8L浸提，搅拌均匀，浸泡2小时，分相。 重复一次。合并两次液体，加无水硫酸钠干燥。过滤，滤液减压蒸干得到粗浸膏l〇〇g。
[0076] 实施例7 ]\^62、5即1、5即2和？了？18的抑制活性测定 MEG2、SHP1、SHP2和PTPlB均为利用基因工程方法在大肠杆菌中表达后，经亲和层析纯 化获得的活性人重组蛋白质酪氨酸磷酸酶。
[0077] 抑制活性的测定方法如下：将实施例3制备的嗜氮酮类化合物稀释后加入到96孔 板中，并分别加入每孔100 μ 1含MEG2、SHPl、SHP2或PTPlB任一酶蛋白的反应缓冲液，室温 下孵育15分钟后，加入100mL含5 mM对硝基苯磷酸二钠（pNPP)反应底物的缓冲液。37°C 反应保温30 min，加0. 2 M NaOH终止反应，用酶标仪测定405nm下的光吸收变化。
[0078] 按以下公式计算抑制率： 抑制率=(1-实验组吸光度平均值/空白对照组吸光度平均值）X 100%。
[0079] 抑制活性的评价标准： IC5tl值为抑制率为50%时的嗜氮酮类化合物浓度（mg/ml) 所述嗜氮酮类化合物的抑制活性如表1所示。
[0080] 表 1
上述结果表明，本发明制备的嗜氮酮类化合物具有显著的PTP抑制活性，可用于制备 预防或治疗PTP所介导疾病的药物。
[0081] 实施例8具有PTP抑制作用的药物组合物的制备 称取IOg实施例1制备的嗜氮酮类化合物，加入蔗糖50g、糊精100g，混匀后加乙醇制 成湿颗粒，干燥，加入微粉硅胶2g，再次混匀，装入胶囊壳，制成具有PTP抑制作用的药物 500 粒。
[0082] 以本发明所述化合物为活性成分，按照本领域已知的方法制备，均可以制备成各 种临床所需制剂，在此不再一一赘述。
【主权项】
1. 结构如下式所示的嗜氮酮类化合物：其中R为7~12个碳的直链或支链烷基、烯基。2. 根据权利要求1所述化合物，其中所述R为：n-C 7H15、C(CH3)=CH(C7H15)、n-C 9H19、 CH(CH3) (C8H17)、Ii-C11H2^ CH (CH3) (CltlH21)中的任意一种。3. 权利要求1或2所述嗜氮酮类化合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤： a、 制备弯头曲霉的种子液： 将弯头曲霉ofe/VeciiAs)的斜面培养物或孢子液接种于种子培养基，培 养温度为22~30°C、转速为100~220rpm，培养时间为48~72 h获得种子液； 所述弯头曲霉为菌株 NCC0415,保藏号 CGMCC No. 9095; 所述种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉10. 〇~40. 0克、葡萄糖10. 0~40. 0克、热 榨黄豆饼粉4. 0~20. 0克、麦芽粉I. 0~6. 0克、酵母粉I. 0~3. 0克、氯化钠0. 5~2. 0 克、七水硫酸镁〇· 5~2. 0克，加自来水定容至lOOOmL，ρΗ6· 5~7. 0，121°C灭菌30min ; b、 制备弯头曲霉（ofefYecNCC0415的发酵产物： 将上述种子液以体积百分比3-10%的接种量接种于固体发酵培养基，发酵温度 22°C -37°C、发酵时间10~20天，得到发酵液； 其中所说的固体发酵培养基包括固体颗粒状基质、粉状基质、无机盐，所述粉状基质或 无机盐任选添加或不添加； c、 向上述发酵液中加入有机溶剂浸泡，过滤，滤液浓缩得到粗浸膏，所述有机溶剂为甲 醇、乙醇、丙酮或乙酸乙酯； d、 上述粗浸膏中加入非极性有机溶剂，搅拌，静置，固液分离得到下层固体相为干浸膏 A； e、 将干浸膏A过硅胶柱层析，石油醚：氯仿：甲醇梯度洗脱，收集洗脱液，HPLC检测，分 组合并，将具有245, 350nm特征吸收峰的部分合并，减压蒸干得黄褐色粉末； 将上述得到的黄褐色粉末溶解，通过HPLC制备色谱柱制备，乙腈-水梯度洗脱，UV检 测器检测，依次收集洗脱之色谱峰，相同部分合并，分别浓缩至干得到如权利要求1或2所 述化合物。4. 根据权利要求3所述的方法，其中步骤b中所述固体发酵培养基，固体颗粒状基质为 大米、小米、小麦、麸皮或玉米渣，粉状基质为热轧黄豆饼粉、棉籽粉或玉米蛋白粉，无机盐 为磷酸盐、硫酸镁或氯化钠。5. 根据权利要求3所述的方法，其中步骤e中所述石油醚：氯仿：甲醇按7:3:0~ 0:10:0~0:7:3的梯度洗脱。6. -种药物组合物，包括权利要求1或2任意一项所述的治疗有效量的化合物以及药 学上可接受的载体。7. 根据权利要求1或2所述化合物或根据权利要求6所述的药物组合物，在制备预防 或治疗PTP介导的疾病的药物中的应用。8. 权利要求7所述的应用，其中所述PTP所介导疾病是肥胖。9. 权利要求7所述的应用，其中所述PTP所介导疾病是糖尿病。10. 一株弯头曲霉（菌株 NCC0415,其保藏编号为 CGMCC No. 9095〇
【专利摘要】本发明提供了一类结构新颖的嗜氮酮类化合物，其制备方法以及用于制备预防或治疗PTP所介导疾病的药物用途。本发明还涉及能够产生该类化合物的新的弯头曲霉（Aspergillus deflectus）菌株，所述弯头曲霉的保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号是CGMCC No.9095。CGMCC No.909520140430
【IPC分类】C07D493/04, C12P17/18, A61P3/10, A61P3/04, C12R1/66, C12N1/14, A61K31/35
【公开号】CN104892622
【申请号】CN201510301156
【发明人】路新华, 郑智慧, 可爱兵, 李业英, 郑海洲, 徐岩, 崔晓兰, 沈文斌, 范玉玲, 曹霖, 霍培元, 蔡喜田, 张雪霞, 段宝玲, 高任龙
【申请人】华北制药集团新药研究开发有限责任公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月5日
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物化学领域，具体地说涉及一类新嗜氮酮类化合物及其制备方法和 用途，以及该类化合物的产生菌。
【背景技术】
[0002] 蛋白质酪氨酸磷酸酶（Protein-tyrosine phosphatase，PTP)在细胞信号传导中 具有重要的作用，它们通过调节细胞内蛋白酪氨酸的磷酸化水平来控制细胞的生长、分化、 代谢；细胞迀移、基因转录、离子通道开闭、免疫反应、细胞凋亡以及成骨发育也受到调控。 蛋白质酪氨酸磷酸酶的紊乱可导致多种疾病，如糖尿病、肥胖症和骨质疏松症（Desai，et al., 1996, Cell, 84: 599-609; Kishiharaetal., 1993, Cell, 74:143-156; Hardy S, et al. , Anticaner Agents Med Chem 2011, Jun 27. )〇
[0003] 蛋白质酪氨酸磷酸酶是一个大家族，按其在细胞内所处的位置可分为跨膜受体型 和胞内非受体型。目前的研宄结果证明其中PTP1B、SHP2与胰岛素信号通路关系最为密切。 蛋白酪氨酸磷酸酶一 IB(Protein tyrosine Phosphatase 1B，PTP1B)是在体内广泛表达的 胞内蛋白质酪氨酸磷酸酶，由PTPNl基因编码（Brown-Shimer S·，et al. ,Proc Nat Acad Sci, 1990，87: 5148-5152)。蛋白酪氨酸磷酸酶 SHP2[Src homology 2 (SH2) domain containing phosphotyrosine- phosphatase 2，SHP2]是一种由 PTPNll 基因编码，细胞 质内广泛表达的非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶。SHP2分子结构包括N端两个Src同源区、中部 一个酪氨酸磷酸（酯）酶活性区域、C端一个包含多个酪氨酸磷酸化位点及一个富含脯氨酸 Motif 尾巴的区域[Neel B.G·，etal·，Trends Biochem Sci, 2003，28(6): 284-293]。
[0004] 胰岛素（Insulin)通过与胰岛素受体（Insulin receptor，IR)的α亚基结合，激 活受体胞内β亚基内在的酪氨酸激酶活性，从而导致酪氨酸参加自身的磷酸化。而被激活 的胰岛素受体酪氨酸激酶再通过磷酸化胰岛素受体底物（Insulin receptor substrate， IRS)，从而将胰岛素信号传递下去。胰岛素抵抗的主要原因是胰岛素信号通路的阻断或减 弱。研宄发现PTPlB通过对胰岛素受体激酶（insulin receptor kinase，IRK)或IRK活性 片段的磷酸化酪氨酸残基去磷酸化作用，对胰岛素信号传导进行负调节。PTPlB通过无催化 活性的C-末端结构域与内质网相连，与其他PTPase相比，有更高的去IR0和IRS磷酸化 活性，从而抑制IRS和PI3K的P85亚基复合物的形成以及Akt、MAPK的磷酸化水平，而且胰 岛素诱导的糖原合成被抑制，因此，PTPlB可在胰岛素信号级联中的多个位点发挥负调控作 用。过度表达PTPlB能增加胰岛素受体脱磷酸化、下调受体后信号；相反，抑制受体一 PTPlB 结合、PTPlB的定点突变以及给与抑制性抗体的实验方法均可增强胰岛素信号。[Elchebly M.,et al. , Science 1999, 283: 1544-1548. ]〇
[0005] 更重要的研宄证明，PTPlB基因敲除小鼠的基础代谢水平和总体能量消耗升高， 体重减轻，膜岛素敏感性增强[Klaman L.D·，et al. Molecular and Cellular Biology, 20 (15) ,5479-5489]。Tonks 等[Tonks N.K·，et al·，Mol Cell Biol, 1990, 10:458-463] 的实验表明，给爪蟾卵显微注射PTPlB阻断了胰岛素的作用。最近的基因敲除小鼠模型的 研宄已充分证明了 PTPlB是胰岛素作用的特异性调控子，PTPlB可影响体重和能量消耗的 调节。Elchebly等报道，PTPlB基因敲除鼠在表型上是健康的，同时有较低的空腹血胰岛 素和血糖水平、在胰岛素耐量实验中血糖明显下降等胰岛素敏感性增加的表现，且这种增 敏效应具有组织特异性，它可增加骨骼肌对葡萄糖的摄取，但对脂肪组织无明显影响。更 加令人振奋的是，敲除鼠在高脂饮食喂养时不会出现肥胖或体重增加，也不发生IR的加重 [Elchebly M.，et al.，Science 1999，283: 1544-1548]。这一研宄结果提出了一个可 能性：抑制PTPlB能有效的解决代谢综合征的两个主要问题，糖耐量减低和肥胖，PTPlB是 研宄开发抗糖尿病药物的一个重要的新靶点。
[0006] 蛋白质酪氨酸磷酸酶 SHP-l(SH2_containing tyrosine phosphatase 1，SHP-1)， 是含有SH2结构域的胞内非受体型酪氨酸磷酸酶。SHP-I在一些造血细胞中表达量较高， 并在造血细胞信号传导过程中起负调节作用，如JAK-STATs通路[Yajun Han，et al.， Blood, 2006 Vol. 108，2796-2803];近些年来，有研宄发现SHP-I在控制血糖方面也有 作用[Dubois MJ, etal·，NatMed, 2006，Vol. 12，549-556]，它可以通过调节肝脏和 肌肉中的胰岛素信号通路，以及肝脏的胰岛素清除率，维持血糖浓度的稳定。有研宄表明， 先天功能性缺失SHP-I的小鼠，与野生型小鼠相比，其肝脏和肌肉中的胰岛素信号通路得 到了加强，并且具有明显的葡萄糖耐受以及胰岛素敏感性[Witkiewicz A, et al.，Hum Pathol，2007，38(3): 462-7])。因此，SHP-I活性的增强是引起2型糖尿病的重要原因 之一，将SHP-I作为治疗2型糖尿病及胰岛素抵抗的药物靶标蛋白具有广阔的应用前景。
[0007] 巨噬细胞蛋白酪氨酸磷酸酶2 (MEG2)，最初是从人的巨噬细胞MEG-01和脐 静脉内皮细胞的cDNA文库中克隆，并因此而得名。MEG2表达于多种细胞，在人脑、胰 脏、白细胞、巨·细胞等中表达量较高[Kruger JM, et al·，J Biol Chem. 2002 Jan 25;277 (4):2620-8; Wang X，et al·，J Immunol, 2002，168(9): 4612-9]。Cho CY 等 发现MEG2是胰岛素依赖性的F0X01亚细胞定位的调控因子，该基因在细胞中的异常表达可 抑制胰岛素诱导的胰岛素受体磷酸化，从而抑制胰岛素的信号通路。利用RNAi技术使MEG2 表达降低，可明显增加胰岛素的作用，从而使糖尿病小鼠对糖尿病的耐受性得到改善[Cho CY，Cell Metab，2006，3(5): 367-78] "MEG2的抑制剂被证明具有潜在的抗II型糖尿病 的作用[Zhang S，et al·，J Am Chem Soc, 2012，134(43): 18116-24]。
[0008] 糖尿病（diabetes mellitus)是一种由遗传和环境相互作用而引起的、以高血糖、 胰岛素抵抗为特征的临床综合征。糖尿病是因胰岛素分泌绝对或相当不足以及靶组织细胞 对胰岛素灵敏性降低，引起糖、蛋白、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱的疾病。高血糖是 糖尿病的临床主要标志，但久病可引起多个系统的损害。由于糖尿病人群中高发冠心病、 缺铁性或出血性血管病、失明、肢端环疽等严重的并发症，所以糖尿病具有很高的致死率和 致残率。据国际糖尿病联盟2012年发布的《糖尿病地图》估计，2012年糖尿病患病人数为 3. 71亿，其中死亡人数为480万。最新数据显示，糖尿病上升趋势仍在持续。截止到2013 年年末，共计510万人死于糖尿病并发症。并居当今世界死亡原因的第4位，已严重危害了 人类的健康。中国糖尿病人数超过1亿，并随着生活方式改变和老龄化的问题并呈快速的 上升趋势。另外，据2012年世界卫生组织数据，全球肥胖人数超5亿，肥胖以及肥胖带来的 相关疾病也早已成为全球面临的重大卫生健康难题。
[0009] 目前一般讲糖尿病分为两类，I型糖尿病(胰岛素依赖糖尿病，IDDM)与II型糖尿 病(非胰岛素依赖型糖尿病，NIDDM)。I型糖尿病的病因是胰岛细胞被破坏，从而引起胰岛 素的绝对不足，患者必须依赖胰岛素维持生命；而II型糖尿病原因复杂，是由于胰岛素的 相对不足或胰岛素抵抗引起的。糖尿病中90%以上是II型。所以II型糖尿病药物的治疗 策略是增加胰岛素分泌以及胰岛素增敏。
[0010] 总之，大量的研宄结果已经证明蛋白酪氨酸磷酸酶介导多种疾病的发生和发展， 蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂具有预防和治疗肥胖、糖尿病以及相关并发症的药物作用。蛋白 酪氨酸磷酸酶已经作为新的抗糖尿病、肥胖等药物研宄的祀点[Darry A.J., Future Med Chem, 2010，2(10): 1563-1576]。
[0011] 嗜氮酮类化合物（azaphi Iones )是一类结构新颖的真菌来源的聚酮类次级代谢产 物，含有插烯γ-吡啶酮骨架(见式1)，具有多种生物活性。截止到2012年，共发现该类化 合物近400个，根据不同位置取代基团的差异分为18小类（Gao JM，Chemical Review， 2013，113: 4755-4811)。本发明化合物属于8位连接脂肪酮取代的角型γ-内酯结构类。 文献报道的该类化合物有12个，包括从helotialean子囊菌中分离的helotialins A-C、 来源于红树林内生真菌鲜红青霉ZH4-E2)的Chermesinones A-C、盘单毛抱属真菌COffi jDia PRL 1754)的 monochaetin 和分离自弯头 曲霉i/e/yeciiASy* 的弯头霉素 la, lb, lc, 2a, 2b。Anke H 等报道弯头霉 素 la, lb，lc，2a，2b具有抗细菌、抗真菌和小鼠腹水瘤抑制作用[Anke H，et al. J Antibiot, 1981，34(8): 923-928] ;Musso L 等报道，弯头霉素 la, lb, 2a, 2b 对热激蛋 白90 (HSP90)具有很弱的抑制活性(对Hsp90-ATPase抑制活性IC5tl大于5〇μΜ，对Hsp90 结合IC 5tl大于100μΜ )，弯头霉素 Ib对人卵巢癌细胞株IGR0V-1、人黑色素瘤细胞株JR8、人 上皮癌细胞株Α431具有一定的抑制活性，IC5tl约为26μΜ (Musso L, et al. Bioorg Med Chem, 2010，18: 6031-6043)。本发明涉及的化合物、制备方法及活性未见报道。
[0012] a i啃mm失1七甘籾官栄。
【发明内容】
[0013] 本发明的目的是提供一种具有PTP抑制作用的嗜氮酮类化合物，以及该类化合物 的制备方法和医药用途，并提供了产生此类化合物的菌株。
[0014] 为实现本发明目的，本发明提供了一种嗜氮酮类化合物，其结构如下式：
其中，R为7~12个碳的直链或支链烷基、烯基。
[0015] 优选 R 为：n-C7H15、C (CH3) =CH (C7H15)、n-C9H19、CH (CH3) (C8H17)、Ii-C1 而3或 CH (CH 3) (CltlH21)中的任意一种。
[0016] 本发明所提供的嗜氮酮类化合物产生菌株为弯头曲霉，其保藏名称为弯头曲霉 (NCC0415,保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心，保藏日期2014年4月30日，保藏编号为CGMCC No. 9095,保藏地址为：北京市朝 阳区北辰西路1号院3号中国科院微生物研宄所。
[0017] 本发明所提供的真菌菌株NCC0415,经宏观及显微形态观察将其鉴定为弯头曲霉 QAspergillus defIectus)。
[0018] 本发明所述的鉴定方法为将菌株NCC0415的孢子液涂布于载玻片上，于400倍显 微镜下进行显微形态观察。将菌株NCC0415的孢子液点种于3种曲霉鉴定培养基：CYA (查 氏酵母粉琼脂)、MEA (麦芽粉琼脂)、CY20S (20%蔗糖查氏酵母粉琼脂)25°C下培养7~14天， 进行宏观形态观察。经过宏观及显微形态观察，将NCC0415鉴定为弯头曲霉价7ΛΛ5 deflectus )〇
[0019] 本发明所使用的弯头曲霉真菌菌株NCC0415是从四川 古澜黄荆老林土壤中分离得到的一株野生菌株。
[0020] 本发明所述的土壤样品采集方法为用无菌铲铲去靠近植物根部土壤的表层的腐 殖土，然后取距离地表深度为5-lOcm的土样约30克置于已灭菌的纸袋中保存。
[0021] 本发明所述的土壤样品的分离方法为取1克该样品加入到IOmL无菌水中充分振 荡，随后取ImL混悬液加入到另一支装有9mL无菌水的试管中充分振荡，依此类推进行梯度 稀释值至KT ltl浓度。每个浓度取0. 2mL涂布PDA双碟，随后在26°C下进行静置培养，双碟 培养周期为3~10天，在此期间从双碟中挑取形态不同的菌落于TOA (北京双旋）斜面中进 行培养，斜面培养时间为14天。通过上述方法获得了一株真菌，将其命名为NCC0415。
[0022] 本发明提供了上述嗜氮酮类化合物的制备方法，该方法是采用上述弯头曲霉 (As/76?r^77A/5· 发酵制备所述嗜氮酮类化合物。具体地说，包括以下步骤： a、制备弯头曲霉的种子液： 将菌株NCC0415的斜面培养物或孢子液接种于种子培养基，培养温度为22~30 °C、转 速为100~220 rpm，培养时间为48~72 h获得种子液； 其中所述的种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉10. 〇~40.0 克、葡萄糖10. 0~40.0 克、热榨黄豆饼粉4. 0~20. 0克、麦芽粉I. 0~6. 0克、酵母粉I. 0~3. 0克、氯化钠0. 5~2. 0克、 七水硫酸镁〇· 5~2. 0克，加自来水定容至lOOOmL，ρΗ6· 5~7· 0, 121°C灭菌30min。
[0023] b、制备弯头曲霉i/e/yeciiAs) NCC0415 的发酵产物： 将上述种子液以体积百分比3~10 %的接种量接种于固体发酵培养基，发酵温度22 °C ~37 °C、发酵时间10~20天，得到发酵液。
[0024] 其中所说的固体发酵培养基包括固体颗粒状基质、粉状基质、无机盐，所述粉状基 质或无机盐任选添加或不添加。
[0025] c、向上述发酵液中加入有机溶剂浸泡，过滤，滤液浓缩得到粗浸膏，所述有机溶剂 为甲醇、乙醇、丙酮或乙酸乙酯。
[0026] d、上述粗浸膏中加入非极性有机溶剂，搅拌，静置，固液分离得到下层固体相为干 浸膏A。
[0027] e、将干浸膏A过硅胶柱层析，石油醚：氯仿：甲醇梯度洗脱，收集洗脱液，HPLC检 测，分组合并，将具有245, 350nm特征吸收峰的部分合并，减压蒸干得黄褐色粉末。
[0028] 将上述得到的黄褐色粉末溶解，通过HPLC制备色谱柱制备，乙腈-水梯度洗脱，UV 检测器检测，依次收集洗脱之色谱峰，相同部分合并，分别浓缩至干得到如权利要求1或2 所述化合物。
[0029] 其中步骤b中固体发酵培养基所包括的固体颗粒状基质为大米、小米、小麦、麸 皮、玉米渣，所包括的粉状基质为热轧黄豆饼粉、棉籽粉、玉米蛋白粉，所包括的无机盐成份 为磷酸盐、硫酸镁、氯化钠；121°C灭菌30min。
[0030] 其中步骤C中有机溶剂加入量优选用发酵液2倍以上体积，浸泡2~4小时。
[0031] 其中步骤d中粗浸膏中加入4~6倍体积的石油醚或正己烧，搅拌均勾，-4°C静置 2~4小时分相。
[0032] 其中步骤f干浸膏A过硅胶300~400目硅胶柱，干法上样。石油醚：氯仿：甲醇 (7:3:0~0:10:0~0:7:3 )梯度洗脱，收集洗脱液。
[0033] 其中步骤f中得到的黄褐色粉末以DMSO溶解，0. 45um滤膜过滤后进行HPLC制 备，乙腈-水梯度洗脱，UV检测器检测波长设为254nm。依次收集洗脱之色谱峰，相同部分 合并分别减压蒸干得 NCC0415-81、NCC0415-82、NCC0415-83、NCC0415-84、NCC0415-85 和 NCC0415-87。
[0034] 除上述制备方法外，本发明所述新嗜氮酮类化合物还可以按照常规方法，通过合 成、半合成或生物转化的方式获得。
[0035] 本发明还提供了上述新嗜氮酮类化合物的一种医药用途：将该化合物用于制备预 防或治疗PTP所介导疾病的药物。
[0036] 本发明所述PTP所介导疾病，具体地说是指糖尿病或肥胖症。
[0037] 涉及上述医药用途时，根据本领域技术人员的公知常识，不仅是本发明所述新嗜 氮酮类化合物本身，其药学上可接受的盐、异构体、酯或前体药物都可以具有与其相同或相 近的医药用途。上述药学上可接受的盐包括钠、钾、钙盐，以及胺盐；所述胺包括氨、烷基胺、 苯胺和氨基酸；所述氨基酸包括精氨酸、赖氨酸。上述药学上可接受的盐还可以形成溶剂化 物，并具有与之相同或相近的医药用途；所述溶剂化物包括水合物、醇合物。上述前药在体 内代谢变化后能够释放出本发明所述嗜氮酮类化合物。
[0038] 本发明所述嗜氮酮类化合物的医药用途，具体来说是通过以下方法实现的： 按照常规方法制备药物组合物，其包含上述嗜氮酮类化合物和可药用载体。其中，所 述嗜氮酮类化合物的质量百分含量为〇. 1-99%，优选5-75%。该药物组合物按照给药途径不 同，可分为口服制剂、舌下或颊给药制剂、吸入制剂、注射剂、直肠给药制剂、经皮给药制剂 等。其中，优选口服制剂。
[0039] 当制备口服制剂时，单位剂型中所述嗜氮酮类化合物的含量为l_500mg，优选 l-250mg。可选择的剂型包括片剂、丸剂、锭剂、胶囊剂、液体、凝胶、糖浆剂、浆液、悬液等。其 中，优选片剂、胶囊剂。可药用载体包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇、淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维 素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯啦咯烷酮、琼脂、藻酸、藻酸钠、滑石粉、硬 脂酸镁、微粉硅胶、脂肪油、液体石蜡、液体聚乙二醇等。
[0040] 当制备舌下或颊给药制剂时，可以采取片剂或糖锭剂的形式，按照常规方法配制。
[0041] 当制备吸入制剂时，可以采取加压气雾剂的形式。适合的推进剂包括二氯二氟甲 烷、三氯氟代甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳。可药用载体包括乳糖、淀粉。
[0042] 当制备注射剂时，单位剂型中所述嗜氮酮类化合物的含量为0. l-100mg，优选 0. l-25mg。可选择的剂型包括油性注射液、水性注射液或冻干粉针剂。可药用载体包括脂 肪油、油酸乙酯、甘油三酯、脂质体、羧甲基纤维素钠、葡聚糖、交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、 藻酸、藻酸钠。
[0043] 当制备直肠给药制剂时，可以采取栓剂或灌肠剂的形式。可药用载体包括可可脂、 甘油酯。
[0044] 当制备经皮给药制剂时，可以采取贴剂的形式。可药用载体包括聚丙烯酸钠、聚丙 烯酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇。
[0045] 上述药物组合物在应用时，应达到有效治疗剂量，并根据疾病的性质、患者的年 龄、体重进行合理调整。通常，所述嗜氮酮类化合物的给药剂量为0. 01-100mg/kg体重，优 选为0. l-10mg/kg体重，更优选的是l-5mg/kg体重。给药剂量和频率最终应由医生决定。
【附图说明】
[0046] 图1为菌株的分生孢子梗及分生孢子结构。
[0047] 图2为菌株在CYA上25°C培养7天的菌落形态。
[0048] 图3为菌株在MEA上25°C培养7天的菌落形态。
[0049] 图4为菌株在CY20S上25°C培养7天的菌落形态。
[0050] 图5为菌株在CYA上37°C培养7天的菌落形态。
【具体实施方式】
[0051] 下面用具体实施例来进一步说明本发明的内容，但并不以任何方式意味着对本发 明进行限制。下列实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
[0052] 下列实施例所涉及的部分原材料的规格型号如下： 核磁共振仪：Bruker Avance III 500, TMS为内标 高分辨质谱：LTQ Orbitrap Discovery (Thermo Scientific, Germany) 中压层析系统：Buchi公司 高压液相系统(分析）：Waters公司，2个515型泵，996检测器 高压液相系统(制备）：Waters公司，600型泵，2487检测器 酶标仪：Perkin Elmer 公司 Victor2 1420 Multilabel Counter 分析型色谱柱：Chromasil ODS column (4· 6 X 250 mm, 10 mm) 制备色谱柱：Phenomenex ODS column (21. 2 X 250 mm, 10 mm) 层析硅胶：300~400目，青岛海洋化工厂 色谱级甲醇和乙腈购自德国Merck公司，其他试剂均为分析纯，购自北京化学试剂厂。
[0053] 实施 例 1、弯头曲霉ofefYecNCC0415的分离 真菌菌株NCC0415的分离用培养基为PDA (北京双旋）； 取1克土壤样品(采自四川古澜黄荆老林土壤)，放入装有9mL无菌水的50mL离心管中， 充分振荡。取ImL悬浊液放入装有9mL无菌水的试管中，混匀。依次进行系列梯度稀释直 到KT'每个梯度下取0.2mL涂板。所涂平板置于25°C下进行培养，从中获得了一株真菌， 将其命名为NCC0415。
[0054] 实施例2、菌株NCC0415的鉴定 将菌株NCC0415的孢子液涂布于载玻片上，于400倍显微镜下进行显微形态观察。将 菌株NCC0415的孢子液点种于曲霉鉴定培养基上：CYA (查氏酵母粉琼脂)、MEA (麦芽粉琼 脂)、CY20S (20%蔗糖查氏酵母粉琼脂)中，25°C下培养7天，进行宏观形态观察，同时做CYA 上37 °C培养。
[0055] 菌株NCC0415的分生孢子梗及分生孢子结构（如图1所示）；该菌株产生的分生孢 梗子较短，壁光滑。分生孢子梗顶端弯曲，呈烟斗状。顶囊呈球形，1/3表面可育，产孢结构 双层，分生孢子呈球形，壁光滑。
[0056] 菌株NCC0415在培养基中的形态特征如下： NCC0415在CYA (查氏酵母粉琼脂）上25°C培养7天的菌落形态（如图2所示)，菌落 生长局限，菌落直径达到15-20mm ;质地丝绒状，质地紧密，菌丝体呈橙黄色；菌落边缘不整 齐；菌落反面呈橙红色。
[0057] NCC0415在MEA (麦芽粉琼脂）上25°C培养7天的菌落形态(如图3所示)，菌落生 长局限，直径达到15-20mm，菌落隆起，质地絮状，菌落颜色近于奶油浅黄色；菌落反面呈褐 色。
[0058] NCC0415在CY20S (20%蔗糖查氏酵母粉琼脂）上25°C培养7天的菌落形态(如图 4所示)，菌落直径达到28-32mm，菌落平坦，中央部位稍隆起，菌株质地呈奶油状，质地软，中 央部位呈淡橘红色，其余呈奶油白，有少量菌丝存在。
[0059] NCC0415在CYA (查氏酵母粉琼脂）上37°C培养7天的菌落形态(如图5所示)，生 长良好，7天菌落直径达到23-26mm。菌落平坦或中央隆起，质地致密，呈白色或灰褐色。
[0060] 实施例3嗜氮酮类化合物的制备 按照以下步骤制备嗜氮酮类化合物： (a)制备弯头曲霉i/e/yeciiAs) NCC0415 的种子液 将弯头曲霉（￡/e/7eciw5·)真菌NCC0415接种于种子培养基，25 °C、转速 200 rpm培养72 h获得种子液。种子培养基的制备方法为：玉米淀粉30.0 克、葡萄糖10.0 克，热榨黄豆饼粉4.0克、麦芽粉5.0克、酵母粉3.0克，氯化钠2.0克，七水硫酸镁1.0克， 加自来水溶解定容至1000 ml，pH值6. 5,121 °C灭菌30 min。
[0061] (b)制备弯头曲霉NCC0415 的固体发酵产物 将种子液以5%的接种量接种于装有100克固体大米发酵培养基的750mL三角瓶中， 22°C、静置培养20天。发酵培养基的制备方法为：大米与水按4:1比例混合均匀，浸泡时 间3-10小时。然后按总重的2. 5%加入热榨黄豆饼粉，混合均匀后分装于750mL三角瓶中， 每瓶装量100克，胶塞，121°C下灭菌30min ; (c)嗜氮酮类化合物的制备 真菌NCC0415大米发酵产物4kg，加入乙酸乙酯8L，搅拌均匀，浸泡2小时，过滤。重复 一次。合并两次滤液，加无水硫酸钠干燥。过滤，滤液减压蒸干得到粗浸膏125g。
[0062] (d)NCC0415提取浸膏125g加入625ml石油醚，搅拌均匀，-4°C静置2小时，分相。 下层固体相32g为干浸膏A ; (e)干浸膏A过硅胶柱层析粗分。硅胶300~400目装柱49x310mm，干法上样。梯度洗 脱，流速80ml/min，梯度设置:_
以50ml/份收集洗脱液。HPLC检测，分组合并。在石油醚-氯仿洗脱部分将有245， 350nm特征吸收峰的部分合并，减压蒸干得3. 2g黄褐色粉末。
[0063] 将上述得到的粉末以DMSO溶解，0. 45um滤膜过滤后进行HPLC制备。乙腈-水梯 度洗脱，流速18ml/min，梯度设置：
UV检测器检测波长设为254nm。依次收集色谱峰，分别减压蒸干得NCC0415-81(21mg， RT :20. lmin)、NCC0415-82 (20mg，RT :21.8min)、NCC0415-83 (74mg，RT :22.4min)、 NCC0415-84 (90mg，RT :23. 2min)、NCC0415-85 (12mg，RT :24.4min)、NCC0415-87 (88mg， RT :25. Omin)。
[0064] 所得上述各化合物的化学结构、理化性质和核磁数据如下： (I)NCOMl5-8U 弯头曲菌素 Kl): 淡黄色结晶性粉末，HRMS给出m/z:
359. 1853,分子式：021112605,? NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.36 (s, 1H), 6.01 (s, 1H), 5.35 (s, 1H), 3.85 (d, 1H), 3.74 (d， 1H), 3. 10(ddd, 1H), 2.49 (ddd, 1H), 2. 15(s, 3H), 1.60(m, 2H),1.57(s, 3H), I. 18~1. 32(m, 8H), 0· 87(t, 3H) ;13C 匪R (126 MHz, CDCl3) 5 202.45, 191.60, 168.74, 159.53, 147.64, 144.79, 114.61, 107.46, 105.60, 82.97, 56.62, 43.06, 42.89, 31.76，29.15, 29.01，23.32, 23.21, 22.70, 19.58，14.19。
[0065] (2)NCC0415_82 (弯头曲菌素 K2):
淡黄?结瞄?王物、木，甘卞 A :<-Z4hl；jUUb，'hl NMK〈bUU MHz, UUUJV 0 V. 2? (,s, 1H), 6. 65 (t, 1H), 6. 01(s, 1H), 5. 38 (s, 1H), 4. 33 (d, 1H), 4. 03 (d, 1H), 2. 30(m, H), 2. 14(s, 3H), 1.83(s, 3H), 1.59(s, 3H), 1.47(m, 2H), 1.20-1. 37 (m, 10H), 0.88(t, 3H) ；13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 192.19, 192.13, 168.77, 159.43, 150.03, 147.25, 144.73, 136.49, 114.72, 107.44, 105.73, 83.01, 51.67, 44.06, 31.84, 29.86, 29.54, 29.19, 28.48, 23.29, 22.76, 19.61, 14.22, 11. 74〇
[0066] (3)NCC0415_83 (弯头曲菌素 K3):
淡黄色结晶性粉末，HRMS给出m/z: 387. 2166,分子式：C23H3005,1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.36 (s, 1H), 6.03 (s，1H), 5.35 (s, 1H), 3.85 (d, 1H), 3.76 (d， 1H), 3.10 (ddd, 1H), 2.49 (ddd, 1H), 2.16 (s, 3H), 1.60 (m, Η), 1.57 (s, 3H)， I. 18~1· 32(m，12H)，0· 87(t, 3H) ;13C 匪R (126 MHz, CDCl3) δ 202.40, 191.49, 168.77, 159.48, 147.57, 144.75, 114.53, 107.41, 105.51, 82.92, 56.57, 43.01, 42.85, 31.91, 29.46, 29.44, 29.29, 29.00,23.26,23.14,22.71, 19.51, 14. 17〇
[0067] (4)NCC0415_84 (弯头曲菌素 K4):
淡黄色结晶性粉末，HRMS 给出 m/z: 401. 2325[M+1]+，分子式：024113205,? NMR (500 MHz, CDCl3) δ7. 29(s, 1H), 6. 04(s, 1H), 5. 36 (s, 1H), 3. 95 (d, 1H), 3. 87(d, 1H), 3. 08(m, 1H), 2. 16(s, 3H), 1.72(m, 1H), 1.58(s, 3H), I. 15~1. 37 (m, 13H), 1.04(d, 3H), 0.87 (t, 3H);13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 206.19，191.57，168.63，159.52， 147.20, 144.63, 114.53, 107.40, 105.57, 82.87, 54.80, 45.78, 43.12, 31.91, 31.55, 29.80, 29.46, 29.32, 27.11, 23.30, 22.70, 19.53, 16.70, 14. 17〇
[0068] (5)NCC0415-85 (弯头曲菌素 K5):
淡黄色结晶性粉末，分子式：C25H3405/HNMR (500 MHz, CDCl3) δ7. 35(s, 1H)， 6. 00(s, 1H), 5. 35(s, 1H), 3. 85 (d, 1H), 3. 72 (d, 1H), 3. 10(ddd, 1H), 2. 48 (ddd, 1H), 2. 15(s, 3H), 1.60(m, 2H), 1.57(s, 3H), I. 18-1.32 (m, 16H), 0.88 (t, 3H)； 13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 202.45, 191. 54, 168. 74, 159.44, 147. 59, 144.66, 114.59, 107.43, 105.65, 82.98, 56.63, 43.09, 42.90, 32.04, 29.74, 29.72, 29.58, 29.52, 29.46, 29.08, 23.33, 23.22, 22.82, 19.59, 14. 26〇
[0069] (6)NCC0415_87 (弯头曲菌素 K6):
淡黄色结晶性粉末，HRMS 给出 m/z: 429. 2644[M+1]+，分子式：0261 13605,? NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.30 (s, 1H), 6.04 (s, 1H), 5.37 (s, 1H), 3.94 (d, 1H), 3.87 (d， 1H), 3.08(m, 1H), 2. 16(s, 3H), 1.71(m, 1H), I. 16-1.40 (m, 17H), 1.04(d, 3H), 0.88(t, 3H) ；13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 206.24, 191.67, 168.63, 159.58, 147.27, 144.74, 114.55, 107.44, 105.55, 82.87, 54.79, 45.77, 43.08, 31.97, 31.57, 29.82, 29.68, 29.67, 29.53, 29.40, 27.13, 23.32, 22.75, 19.56, 16.73, 14. 20〇
[0070] 实施例4 NCC0415的发酵和含嗜氮酮类化合物粗提取物的制备 (a)制备弯头曲霉i/e/yeciiAs) NCC0415 的种子液 将弯头曲霉（真菌NCC0415接种于种子培养基，22 °C、转速 100 rpm培养72 h获得种子液。种子培养基的制备方法为：玉米淀粉10.0克、葡萄糖40.0 克，热榨黄豆饼粉14.0克、麦芽粉6.0克、酵母粉1.0克，氯化钠1.0克，七水硫酸镁0.5 克，加自来水溶解定容至1000 ml，pH值7.0,121 °C灭菌30 min。
[0071] (b)制备弯头曲霉NCC0415 的固体发酵产物 将种子液以7%的接种量接种于装有100克固体玉米渣发酵培养基的750mL三角瓶中， 30°C、静置培养14天。发酵培养基的制备方法为：玉米渣与水按3:1比例混合均匀，加入 少许氯化钠（1克)，浸泡时间3-10小时。然后分装于750mL三角瓶中，每瓶装量100克，胶 塞，121°C下灭菌30min ; (c)含嗜氮酮类化合物粗提取物的制备 真菌NCC0415大米发酵产物4kg，加入工业丙酮4L提取，搅拌均匀，浸泡2小时，分相。 重复一次。合并两次上清液，加无水硫酸钠干燥。过滤，滤液减压蒸干得到粗浸膏ll〇g。
[0072] 实施例5 NCC0415的发酵和含嗜氮酮类化合物粗提取物的制备 (a)制备弯头曲霉i/e/yeciiAs) NCC0415 的种子液 将弯头曲霉（真菌NCC0415接种于种子培养基，30 °C、转速 220 rpm培养48 h获得种子液。种子培养基的制备方法为：玉米淀粉40.0克、葡萄糖30.0 克，热榨黄豆饼粉20. 0克、麦芽粉1.0克、酵母粉2.0克，氯化钠0.5克，七水硫酸镁2.0 克，加自来水溶解定容至1000 ml，pH值6. 7,121 °C灭菌30 min。
[0073] (b)制备弯头曲霉NCC0415 的固体发酵产物 将种子液以3%的接种量接种于装有100克固体小米发酵培养基的750mL三角瓶中， 37°C、静置培养10天。发酵培养基的制备方法为：小米与水按8:3比例混合均匀，浸泡时间 3-10小时。然后按总重的2. 5%加入玉米蛋白粉，加入少许无水硫酸镁（0. 5克)，混合均匀 后分装于750mL三角瓶中，每瓶装量100克，胶塞，121°C下灭菌30min ; (c)含嗜氮酮类化合物粗提取物的制备 真菌NCC0415大米发酵产物4kg，加入甲醇12L，搅拌均匀，浸泡3小时，过滤。重复一 次。合并两次滤液，加无水硫酸钠干燥。过滤，滤液减压蒸干得到粗浸膏96g。
[0074] 实施例6 NCC0415的发酵和含嗜氮酮类化合物粗提取物的制备 按照以下步骤制备嗜氮酮类化合物： (a)制备弯头曲霉i/e/yeciiAs) NCC0415 的种子液 将弯头曲霉（真菌NCC0415接种于种子培养基，26 °C、转速 200 rpm培养72 h获得种子液。种子培养基的制备方法为：玉米淀粉20.0克、葡萄糖20.0 克，热榨黄豆饼粉8. 0克、麦芽粉3. 0克、酵母粉2. 5克，氯化钠1. 5克，七水硫酸镁1. 5克， 加自来水溶解定容至1000 ml，pH值6. 8,121 °C灭菌30 min。
[0075] (b)制备弯头曲霉NCC0415 的固体发酵产物 将种子液以10%的接种量接种于装有100克麸皮与棉籽粉混合发酵培养基的750mL三 角瓶中，26°C、静置培养20天。发酵培养基的制备方法为：麸皮：棉籽粉：水按1:1:2比例 混合均匀，加入少许磷酸钠（1. 5克)，然后分装于750mL三角瓶中，每瓶装量100克，胶塞， 121°C 下灭菌 30min ; (c)含嗜氮酮类化合物粗提取物的制备 真菌NCC0415大米发酵产物4kg，加入工业乙醇8L浸提，搅拌均匀，浸泡2小时，分相。 重复一次。合并两次液体，加无水硫酸钠干燥。过滤，滤液减压蒸干得到粗浸膏l〇〇g。
[0076] 实施例7 ]\^62、5即1、5即2和？了？18的抑制活性测定 MEG2、SHP1、SHP2和PTPlB均为利用基因工程方法在大肠杆菌中表达后，经亲和层析纯 化获得的活性人重组蛋白质酪氨酸磷酸酶。
[0077] 抑制活性的测定方法如下：将实施例3制备的嗜氮酮类化合物稀释后加入到96孔 板中，并分别加入每孔100 μ 1含MEG2、SHPl、SHP2或PTPlB任一酶蛋白的反应缓冲液，室温 下孵育15分钟后，加入100mL含5 mM对硝基苯磷酸二钠（pNPP)反应底物的缓冲液。37°C 反应保温30 min，加0. 2 M NaOH终止反应，用酶标仪测定405nm下的光吸收变化。
[0078] 按以下公式计算抑制率： 抑制率=(1-实验组吸光度平均值/空白对照组吸光度平均值）X 100%。
[0079] 抑制活性的评价标准： IC5tl值为抑制率为50%时的嗜氮酮类化合物浓度（mg/ml) 所述嗜氮酮类化合物的抑制活性如表1所示。
[0080] 表 1
上述结果表明，本发明制备的嗜氮酮类化合物具有显著的PTP抑制活性，可用于制备 预防或治疗PTP所介导疾病的药物。
[0081] 实施例8具有PTP抑制作用的药物组合物的制备 称取IOg实施例1制备的嗜氮酮类化合物，加入蔗糖50g、糊精100g，混匀后加乙醇制 成湿颗粒，干燥，加入微粉硅胶2g，再次混匀，装入胶囊壳，制成具有PTP抑制作用的药物 500 粒。
[0082] 以本发明所述化合物为活性成分，按照本领域已知的方法制备，均可以制备成各 种临床所需制剂，在此不再一一赘述。
【主权项】
1. 结构如下式所示的嗜氮酮类化合物：其中R为7~12个碳的直链或支链烷基、烯基。2. 根据权利要求1所述化合物，其中所述R为：n-C 7H15、C(CH3)=CH(C7H15)、n-C 9H19、 CH(CH3) (C8H17)、Ii-C11H2^ CH (CH3) (CltlH21)中的任意一种。3. 权利要求1或2所述嗜氮酮类化合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤： a、 制备弯头曲霉的种子液： 将弯头曲霉ofe/VeciiAs)的斜面培养物或孢子液接种于种子培养基，培 养温度为22~30°C、转速为100~220rpm，培养时间为48~72 h获得种子液； 所述弯头曲霉为菌株 NCC0415,保藏号 CGMCC No. 9095; 所述种子培养基按以下方法制得：玉米淀粉10. 〇~40. 0克、葡萄糖10. 0~40. 0克、热 榨黄豆饼粉4. 0~20. 0克、麦芽粉I. 0~6. 0克、酵母粉I. 0~3. 0克、氯化钠0. 5~2. 0 克、七水硫酸镁〇· 5~2. 0克，加自来水定容至lOOOmL，ρΗ6· 5~7. 0，121°C灭菌30min ; b、 制备弯头曲霉（ofefYecNCC0415的发酵产物： 将上述种子液以体积百分比3-10%的接种量接种于固体发酵培养基，发酵温度 22°C -37°C、发酵时间10~20天，得到发酵液； 其中所说的固体发酵培养基包括固体颗粒状基质、粉状基质、无机盐，所述粉状基质或 无机盐任选添加或不添加； c、 向上述发酵液中加入有机溶剂浸泡，过滤，滤液浓缩得到粗浸膏，所述有机溶剂为甲 醇、乙醇、丙酮或乙酸乙酯； d、 上述粗浸膏中加入非极性有机溶剂，搅拌，静置，固液分离得到下层固体相为干浸膏 A； e、 将干浸膏A过硅胶柱层析，石油醚：氯仿：甲醇梯度洗脱，收集洗脱液，HPLC检测，分 组合并，将具有245, 350nm特征吸收峰的部分合并，减压蒸干得黄褐色粉末； 将上述得到的黄褐色粉末溶解，通过HPLC制备色谱柱制备，乙腈-水梯度洗脱，UV检 测器检测，依次收集洗脱之色谱峰，相同部分合并，分别浓缩至干得到如权利要求1或2所 述化合物。4. 根据权利要求3所述的方法，其中步骤b中所述固体发酵培养基，固体颗粒状基质为 大米、小米、小麦、麸皮或玉米渣，粉状基质为热轧黄豆饼粉、棉籽粉或玉米蛋白粉，无机盐 为磷酸盐、硫酸镁或氯化钠。5. 根据权利要求3所述的方法，其中步骤e中所述石油醚：氯仿：甲醇按7:3:0~ 0:10:0~0:7:3的梯度洗脱。6. -种药物组合物，包括权利要求1或2任意一项所述的治疗有效量的化合物以及药 学上可接受的载体。7. 根据权利要求1或2所述化合物或根据权利要求6所述的药物组合物，在制备预防 或治疗PTP介导的疾病的药物中的应用。8. 权利要求7所述的应用，其中所述PTP所介导疾病是肥胖。9. 权利要求7所述的应用，其中所述PTP所介导疾病是糖尿病。10. 一株弯头曲霉（菌株 NCC0415,其保藏编号为 CGMCC No. 9095〇
【专利摘要】本发明提供了一类结构新颖的嗜氮酮类化合物，其制备方法以及用于制备预防或治疗PTP所介导疾病的药物用途。本发明还涉及能够产生该类化合物的新的弯头曲霉（Aspergillus deflectus）菌株，所述弯头曲霉的保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号是CGMCC No.9095。CGMCC No.909520140430
【IPC分类】C07D493/04, C12P17/18, A61P3/10, A61P3/04, C12R1/66, C12N1/14, A61K31/35
【公开号】CN104892622
【申请号】CN201510301156
【发明人】路新华, 郑智慧, 可爱兵, 李业英, 郑海洲, 徐岩, 崔晓兰, 沈文斌, 范玉玲, 曹霖, 霍培元, 蔡喜田, 张雪霞, 段宝玲, 高任龙
【申请人】华北制药集团新药研究开发有限责任公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月5日
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