氨基脲二氢青蒿素衍生物及其制备方法与应用
氨基脲二氢青蒿素衍生物及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及氨基脲二氢青蒿素衍生物及其制备方法与作为抗癌药物的应用。
【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤是危害人们生命健康的最严重的疾病之一。目前临床治疗癌症的化学药 物由于毒副作用大、耐药性高而不尽人意，急需开发毒性低、疗效高的抗癌活性成分。自赖 亨利教授发现了一种对癌细胞有很高的毒性、对正常细胞的影响很小的药物-青蒿素，并 称它可能成为无毒的高效抗癌药（US55578637)以来，对青蒿素及其衍生物的制备、活性研 宄成为了热点。国内外学者对青蒿素母核进行了大量的结构修饰，发现了多个具有较高生 理活性的青蒿素衍生物。
[0003] 现有技术中，诸多活性二氢青蒿素衍生物大都是对二氢青蒿素结构的碳9位、碳 10位和碳11位进行修饰获得，对距桥氧键较近的二氢青蒿素3-C位的修饰研宄较少。四川 大陆蓉东制药公司在二氢青蒿素的3-C位引进卤素原子，所得3-卤代二氢青蒿素活性高， 达到对体外H印G2细胞的细胞毒的IC50〈8nM的结果（CN200510020151. 4)。
[0004] 二氢青蒿素抗肿瘤活性机理：大多数肿瘤细胞表面有高密度的转铁蛋白受体，正 常细胞转铁蛋白受体较少。癌细胞分裂时需要大量铁离子才能复制DNA，含有内过氧桥结构 的二氢青蒿素进入含铁质较多的癌细胞后，通过与亚铁离子作用，产生活性自由基，杀死癌 细胞。
[0005] 不对称取代脲因其结构中存在不同取代的肽键（CO-NH)而具有广泛的生物活性。 不仅在除草、杀虫、杀菌以及植物生长调节等方面具有重要用途，而且许多像酶抑制剂、生 物模拟肽等生物活性物质亦含有不对称取代脲的结构单元，含有氨基脲结构的化合物在化 学治疗方面具有很广阔的治疗谱，包括抗疟疾，抗肿瘤，抗菌，抗锥虫及抗病毒。
[0006] 本发明人基于二氢青蒿素的抗肿瘤活性，将氨基脲结构片段经亲核取代反应引入 二氢青蒿素的3-C位，提高了二氢青蒿素的抗癌活性。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种抗癌效果好、毒性低的二氢青蒿素的衍生物。并提供了 其在抗肿瘤活性中的应用。
[0008] 本发明的另一目的在于提供上述氨基脲二氢青蒿素的制备方法。
[0009] 本发明的再一目的在于提供上述氨基脲二氢青蒿素的用途。
[0010] 以下对本发明进行详细描述。
[0011] 本发明提供以下通式I的氨基脲二氢青蒿素或其药学可接受的水合物、盐，如下 所示：
其中，R为H、各种烃基，所述烃基可以被卤素、氨基、取代氨基、羧基、羟基、酯基、氰基、 硝基、芳基和取代芳基的取代基任意取代；Z为0, S，NH。
[0012] 本发明提供了上述通式I化合物的制备方法，通式I的合成如下所示：
其中，X = Br, Cl ; Z = S，0, NH ; R = H、烃基 本发明的氨基脲二氢青蒿素的制备方法，所述反应溶剂为DMF、乙腈、THF、氯仿、二氯甲 烷、乙酸乙酯、丙酮、四氯化碳，优选DMF、乙腈、THF。
[0013] 本发明的氨基脲二氢青蒿素的制备方法，所述催化剂为碘化物、碘盐，优选碘金属 盐。
[0014] 本发明的氨基脲二氢青蒿素的制备方法，所述縛酸剂为各种有机和无机碱，优选 吡啶、三乙胺。
[0015] 本发明的氨基脲二氢青蒿素对Hela和A549细胞有显著的抑制作用，因此，本发明 的氨基脲二氢青蒿素可以应用于制备抗肿瘤药物。
[0016] 通过以下实施例进一步举例说明本发明，但应注意本发明的范围并不受这些实施 例的任何限制。
【具体实施方式】
[0017] 实施例1 (31?，5&5，61?，8&5，91?，125，12&1〇-八氢-3-(氨基硫代甲酰肼基)亚甲基-6,9-二 甲基-3，12-桥氧-12!1-吡喃并[4，3-」]-1，2-苯并二噻平-10(3!〇醇（1)的制备 化合物（1)的结构如下所示：
向干燥反应器中加入 3.62g (O.Olmol)的（3R，5aS，6R，8aS，9R，12S，12aR)-八 氢-3-溴亚甲基-6,9-二甲基-3，12-桥氧-12!1-吡喃并[4，31_]-1，2-苯并二噻平-10 (3H)醇和20mLTHF，搅拌，加入I. 58g (0· 02mol)的吡啶和I. 09g(0. 012mol)氨基硫脲，反 应12小时，减压蒸出溶剂。残渣加入20mL乙酸乙酯和20mL饱和碳酸氢钠溶液，搅拌，分 层，水层用乙酸乙酯提取15mLX2,合并有机相，干燥，过滤，浓缩，柱层析纯化，得标的化合物 (1)，收率 55%。
[0018] 实施例2 (3R，5aS，6R，8aS，9R，12S，12aR)_ 八氢-3-(氨基甲酰肼基）亚甲基-6,9-二甲 基-3，12-桥氧-12!1-吡喃并[4，3-」]-1，2-苯并二噻平-10(3!〇醇（2);化合物（2)的结 构如下所示：
向干燥反应器中加入 3.62g (O.Olmol)的（3R，5aS，6R，8aS，9R，12S，12aR)_ 八 氢-3-溴亚甲基-6,9-二甲基-3，12-桥氧-12!1-吡喃并[4，31_]-1，2-苯并二噻平-10 (3H)醇和22mLTHF，搅拌，加入I. 58g (0· 02mol)的吡啶和I. 09g(0. 012mol)氨基脲，反应 12小时，减压蒸出溶剂。残渣加入20mL乙酸乙酯和20mL饱和碳酸氢钠溶液，搅拌，分层，水 层用乙酸乙酯提取15mLX2,合并有机相，干燥，过滤，浓缩，柱层析纯化，得3-脲氨基二氢青 蒿素，收率52%。
[0019] 实施例3 (3R，5aS，6R，8aS，9R，12S，12aR)_ 八氢-3-(甲氨基甲酰肼基）亚甲基-6,9-二 甲基-3，12-桥氧-12!1-吡喃并[4，3-」]-1，2-苯并二噻平-10(3!〇醇（3); 化合物（3)的结构如下所示：
向干燥反应器中加入 3.18g (O.Olmol)的（3R，5aS，6R，8aS，9R，12S，12aR)-八 氢-3-氯亚甲基-6,9-二甲基-3,12-桥氧-12H-吡喃并[4，3-j]-l，2-苯并二噻 平-10 (3H)醇和 20mL 乙腈，搅拌，加入 1.58g (0.02mol)吡啶、0.82 g (0.0005mol)KI 和 1.07g(0.012mol)甲氨基甲酰肼，反应24小时，减压蒸出溶剂。残渣加入20mL乙酸乙酯 和20mL饱和碳酸氢钠溶液，搅拌，分层，水层用乙酸乙酯提取15mLX2,合并有机相，干燥，过 滤，浓缩，柱层析纯化，得化合物（3)，收率66%。
[0020] 实施例4 (31?，5&5，61?，8&5，91?，125，12&1〇-八氢-3-(苯氨基甲酰肼基）亚甲基-6,9-二 甲基-3，12-桥氧-12!1-吡喃并[4，3-」]-1，2-苯并二噻平-10(3!〇醇（4); 化合物（4)的结构如下所示：
向干燥反应器中加入 3.18g (O.Olmol)的（3R，5aS，6R，8aS，9R，12S，12aR)_ 八 氢-3-氯亚甲基-6,9-二甲基-3，12-桥氧-12!1-吡喃并[4，31_]-1，2-苯并二噻平-10 (3H)醇和25mL乙腈，搅拌，加入2. 02g (0· 02mol)三乙胺、I. 81g(0. 012mol)苯氨基甲酰肼 和0. 82 g(0. 0005mol)KI，反应24小时，减压蒸出溶剂。残渣加入20mL乙酸乙酯和20mL饱 和碳酸氢钠溶液，搅拌，分层，水层用乙酸乙酯提取15mLX2,合并有机相，干燥，过滤，浓缩， 柱层析纯化，得化合物（4)，收率42%。
[0021] 实施例5 (3R，5aS，6R，8aS，9R，12S，12aR)_ 八氢-3-(胍氨基）亚甲基-6,9-二甲基-3， 12-桥氧-12H-吡喃并[4，3-j]-l，2-苯并二噻平-10 (3H)醇（5); 化合物（5)的结构如下所示：
向干燥反应器中加入 3.62g (O.Olmol)的（3R，5aS，6R，8aS，9R，12S，12aR)-八 氢-3-溴亚甲基-6,9-二甲基-3，12-桥氧-12!1-吡喃并[4，31_]-1，2-苯并二噻平-10 (3H)醇和22mLDMF，搅拌，加入2. 37g (0· 03mol)的吡啶和I. 63g(0. 012mol)氨基胍重碳酸 盐，反应12小时，减压蒸出溶剂。残渣加入20mL乙酸乙酯和20mL饱和碳酸氢钠溶液，搅 拌，分层，水层用乙酸乙酯提取15mLX2,合并有机相，干燥，过滤，浓缩，柱层析纯化，得化合 物（5)，收率39%。
[0022] 实施例6 (31?，5&5，61?，8&5，91?，125，12&1〇-八氢-3-(3,4,5-三羟基苯甲氨基甲酰肼基） 亚甲基-6,9-二甲基-3,12-桥氧-12H-吡喃并[4，3-j]-l，2-苯并二噻平-KK3H)醇（6) 的制备； 化合物（6)的结构如下所示：
向干燥反应器中加入 3.62g (O.Olmol)的（3R，5aS，6R，8aS，9R，12S，12aR)_ 八 氢-3-溴亚甲基-6,9-二甲基-3，12-桥氧-12!1-吡喃并[4，31_]-1，2-苯并二噻平-10 (3H)醇和 22mLTHF，搅拌，加入 2. 02g (0· 02mol)的三乙胺和 2. 55g(0. 012mol)3,4,5-三羟 基苯甲氨基甲酰肼，反应12小时，减压蒸出溶剂。残渣加入20mL乙酸乙酯和20mL饱和碳 酸氢钠溶液，搅拌，分层，水层用乙酸乙酯提取15mLX2,合并有机相，干燥，过滤，浓缩，柱层 析纯化，得化合物（6)，收率79%。
[0023] 实施例7 (31?，5&5，61?，8&5，91?，125，12&1〇-八氢-3-(3-甲氧基-4-羟基苯乙烯甲氨基 甲酰肼基)亚甲基-6,9-二甲基-3，12-桥氧-12!1-吡喃并[4，3-」]-1，2-苯并二噻平-10 (3H)醇（7)的制备； 化合物（7 )的结构如下所示：
用2. 87g(0. 012mol) 3-甲氧基-4-羟基苯乙烯甲氨基甲酰肼代替2. 39g(0. 012mol)3， 4，5-三羟基苯甲氨基甲酰肼，其他操作同实施例6，得化合物（7 )，收率76%。
[0024] 实施例8 (3R，5aS，6R，8aS，9R，12S，12aR)_八氢-3-(3,4,5-三甲氧基苯甲氨基甲酰肼 基）亚甲基-6,9-二甲基-3，12-桥氧-12H-吡喃并[4，3-j]-l，2-苯并二噻平-10 (3H) 醇（8)的制备； 化合物（8)的结构如下所示：
用2.97g(0.012mol) 3,4,5_三甲氧基苯甲氨基甲酰肼代替2.39g(0.012mol)3,4， 5-三羟基苯甲氨基甲酰肼，其他操作同实施例6，得化合物（8 )，收率82%。
[0025] 实施例9 氨基脲二氢青蒿抑制肿瘤细胞增殖的体外评价 1材料与方法 1. 1细胞株 非小细胞肺癌A549和宫颈癌细胞Hela，购自美国ATCC。
[0026] L 2主要试剂和药品 高糖DMEM培养液，购于美国GIBCO公司； 胎牛血清，购于中科晨宇（北京）贸易有限公司； 胰蛋白酶，购于西安璟程生物科技有限公司； 青霉素，购于华北制药有限公司； 链霉素，购于华北制药有限公司； 二甲基亚砜（DMSO)，购于格里斯(天津）医药化学技术有限公司； 双氢青蒿素纯品，广州新南方青蒿药业有限公司提供。
[0027] 1. 3主要仪器 NUNC细胞培养板，Denmark公司； HF90二氧化碳培养箱，上海力申科学仪器有限公司； 细胞计数板，上海半岛实业有限公司。
[0028] L 4溶液配制 1. 4. 1 20万U/ml青霉素 青霉素（一瓶）80万U，生理盐水4mL充分溶解后0.22 ym微孔滤膜过滤除菌、分 装，-20°C保存。
[0029] L 4. 2 20 万 U/ml 链霉素 链霉素（一瓶）100万U，生理盐水5mL，充分溶解后0.22 μ m微孔滤膜过滤除菌、分 装，20°C保存。
[0030] 1.4.3高糖DMEM完全培养液 高糖DMEM基础培养基90mL,胎牛血清IOmL, 20万U/mL青霉素50 uL，20万U/mL链 霉素50 uL，配制成含10%胎牛血清，lOOU/mL青霉素及lOOU/mL链霉素的高糖DMEM完全培 养液，4° C保存备用。
[0031] 1.4. 4冻存液配制 高糖DMEM培养液7mL，DMSO ImL，胎牛血清2mL。
[0032] L 4. 5四甲基偶氮啤盐（MTT) 称 250mg MTT (Sigma 公司）溶于 50mL 0· 01mol/L PBS 溶液中，0· 2iim 滤膜过 滤，4° C避光保存，2周内使用。
[0033] 1. 4. 6 酸盐缓冲液（PBS) 8.00g NaCl，0.20g KCl，1.44g Na2HP04,0 . 24g KH2PO4溶于 800mL 双蒸水中，盐酸调 pH值为7. 4,加蒸馏水至1L，高压灭菌后备用。
[0034] 1. 4. 7细胞裂解液 20mmol/L MOPS, 0· 15mmol/LNaCl, 1% NP-40(去氧胆酸钠 1%), lmmol/L EDTA, 1%SDS，用双蒸水搅拌溶解。将上述液体混匀后配制成含10%DMS0的冻存液，分装，-20°C 保存。
[0035] 1. 4. 8双氢青蒿素溶液 用少量DMSO溶液将纯品溶解配制成lOOmmol/L的母液，超声波助溶，4° C保存，实 验前用DMEM培养液稀释至所需浓度（DMS0终浓度〈1%)。
[0036] 2实验方法 2. 1细胞的培养 肺癌A549细胞和宫颈癌Hela细胞均为贴壁细胞，培养于高糖的DMEM完全培养液，放 置于37°C，5%C02，饱和湿度的培养箱中，隔两天换液。当细胞生长接近融合，铺满约90% 培养瓶底时，进行接种。
[0037] 2. 2接种细胞 当细胞贴壁长满至80-90%时，用胰蛋白酶消化细胞，以高糖DMEM完全培养液将细胞 吹打制备成单细胞悬液。将对数生长期的细胞以3000-4000细胞/孔的量接种于96孔板， 每孔为l〇〇uL。
[0038] 2. 3加药处理 待细胞贴壁培养l-2d后，吸掉原有培养基，将药物分别配制成一定浓度，并对半稀 释，后一孔药物浓度是前一孔的一半，放入37°C，5%C02培养箱培养。
[0039] 2. 4 MTT 法检测 将加入药物的培养板放入37°C，5%C02培养箱孵育72h后，每孔加入ZOyg/mL MTT溶液，置于37°C，5%C02培养箱中保温4h，小心吸掉孔中原有培养液，每孔加入 150 μ LDMS0,振荡后静置lOmin，待结晶充分溶解后，用酶标仪测SA49(lnm值，并计算抑制 率（%) = (1-实验组OD值/空白对照组OD值）X 100。
[0040] 2. 5半数抑制浓度（IC50)计算 将配好的药物用含10%的DMEM培养基稀释，青蒿素100 μ g/mL和双氢青蒿素100 μ g/ mL溶液，根据对半稀释方法加药，每个浓度设3个复孔，空白对照9个复孔，MTT法检测， 计算出不同浓度药物的抑制率，将剂量与对应抑制率输入Shmm公司IC50. Exel. 0版本软 件计算药物的IC50。
[0041] 3 结果 所制备的氨基脲二氢青蒿素在体外对肺癌A549和宫颈癌细胞Hela有明显抑制作用。 各剂量组的抑制率与二氢青蒿素对比，具有显著性，如下表1和表2所示：
【主权项】
1. 通式I的氨基脲二氢青蒿素衍生物或其药学可接受的水合物、盐，其特征是它具有 如下通式：式中，R为H、各种烃基，所述烃基可以被卤素、氨基、取代氨基、羧基、羟基、酯基、氰基、 硝基、芳基和取代芳基的取代基任意取代；Z为0, S，NH。2. 根据权利1所述的通式I的氨基脲二氢青蒿素衍生物或其药学可接受的水合物、盐， 其特征在于：R为H、各种烃基，优选H、取代苯甲基。3. 根据权利1所述的通式I的氨基脲二氢青蒿素衍生物或其药学可接受的水合物、盐， 其特征在于：Z为0, S，NH，优选0, S。4. 根据权利1所述的通式I的氨基脲二氢青蒿素衍生物或其药学可接受的水合物、盐， 所述通式I化合物的具体实例包括： (31?，5&5，61?，8&5，91?，125，12&1〇-八氢-3-(氨基硫代甲酰肼基)亚甲基-6,9-二 甲基-3，12-桥氧-12!1-吡喃并[4，3-」]-1，2-苯并二噻平-10(3!〇醇（1); (3R，5aS，6R，8aS，9R，12S，12aR)_ 八氢-3-(氨基甲酰肼基）亚甲基-6,9-二甲 基-3，12-桥氧-12!1-吡喃并[4，3-]_]-1，2-苯并二噻平-10(3!〇醇（2); (3R，5aS，6R，8aS，9R，12S，12aR)_ 八氢-3-(甲氨基甲酰肼基）亚甲基-6,9-二 甲基-3，12-桥氧-12!1-吡喃并[4，3-」]-1，2-苯并二噻平-10(3!〇醇（3); (31?，5&5，61?，8&5，91?，125，12&1〇-八氢-3-(苯氨基甲酰肼基）亚甲基-6,9-二 甲基-3，12-桥氧-12!1-吡喃并[4，3-」]-1，2-苯并二噻平-10(3!〇醇（4); (3R，5aS，6R，8aS，9R，12S，12aR)_ 八氢-3-(胍氨基）亚甲基-6,9-二甲基-3， 12-桥氧-12H-吡喃并[4，3-j]-l，2-苯并二噻平-10 (3H)醇（5); (31?，5&5，61?，8&5，91?，125，12&1〇-八氢-3-(3,4,5-三羟基苯甲氨基甲酰肼基） 亚甲基-6,9-二甲基-3，12-桥氧-12!1-吡喃并[4，31_]-1，2-苯并二噻平-10(3!〇醇 (6)； (31?，5&5，61?，8&5，91?，125，12&1〇-八氢-3-(3-甲氧基-4-羟基苯乙烯甲氨基 甲酰肼基)亚甲基-6,9-二甲基-3，12-桥氧-12!1-吡喃并[4，3-」]-1，2-苯并二噻平-10 (3H)醇（7); (3R，5aS，6R，8aS，9R，12S，12aR)_八氢-3-(3,4,5-三甲氧基苯甲氨基甲酰肼 基）亚甲基-6,9-二甲基-3，12-桥氧-12!1-吡喃并[4，31_]-1，2-苯并二噻平-10(3!〇 醇（8)〇5. 通式为I的化合物的制备方法，如下所示：其中，X = Br, Cl ;Z = S，0，NH;R = H、烃基，其特征在于，所述方法以3-卤代二氢青 蒿素和取代的氨基脲为原料，一定的温度下，一定的溶剂中，使用特殊的催化剂和縛酸剂， 通过亲核取代反应，合成氨基脲二氢青蒿素。6. 根据权利1和5所述的通式I的合成方法，所述反应溶剂为DMF、乙腈、THF、氯仿、二 氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、四氯化碳，优选DMF、乙腈、THF。7. 根据权利1和5所述的通式I的合成方法，其特征在于，所述催化剂为碘化物、碘盐， 优选碘金属盐。8. 根据权利1和5所述的通式I的合成方法，其特征在于，所述縛酸剂为各种有机和无 机碱，优选吡啶、三乙胺。9. 根据权利1所述的通式I的氨基脲二氢青蒿素衍生物在制备抗癌药物中的应用。
【专利摘要】本发明涉及氨基脲二氢青蒿素衍生物（通式I）或其药学可接受的水合物、盐。其中，R为H、各种烃基，所述烃基可以被卤素、氨基、取代氨基、羧基、羟基、酯基、氰基、硝基、芳基和取代芳基的取代基任意取代；Z为O，S，NH。本发明的氨基脲二氢青蒿素对Hela和A549细胞有显著的抑制作用，因此，本发明的氨基脲二氢青蒿素有较好的抗肿瘤效果。本发明公开了其制法。
【IPC分类】A61P35/00, C07D493/20, A61K31/357
【公开号】CN104892626
【申请号】CN201510283438
【发明人】张宝华, 史兰香, 刘斯婕, 郭瑞霞
【申请人】石家庄学院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月29日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及氨基脲二氢青蒿素衍生物及其制备方法与作为抗癌药物的应用。
【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤是危害人们生命健康的最严重的疾病之一。目前临床治疗癌症的化学药 物由于毒副作用大、耐药性高而不尽人意，急需开发毒性低、疗效高的抗癌活性成分。自赖 亨利教授发现了一种对癌细胞有很高的毒性、对正常细胞的影响很小的药物-青蒿素，并 称它可能成为无毒的高效抗癌药（US55578637)以来，对青蒿素及其衍生物的制备、活性研 宄成为了热点。国内外学者对青蒿素母核进行了大量的结构修饰，发现了多个具有较高生 理活性的青蒿素衍生物。
[0003] 现有技术中，诸多活性二氢青蒿素衍生物大都是对二氢青蒿素结构的碳9位、碳 10位和碳11位进行修饰获得，对距桥氧键较近的二氢青蒿素3-C位的修饰研宄较少。四川 大陆蓉东制药公司在二氢青蒿素的3-C位引进卤素原子，所得3-卤代二氢青蒿素活性高， 达到对体外H印G2细胞的细胞毒的IC50〈8nM的结果（CN200510020151. 4)。
[0004] 二氢青蒿素抗肿瘤活性机理：大多数肿瘤细胞表面有高密度的转铁蛋白受体，正 常细胞转铁蛋白受体较少。癌细胞分裂时需要大量铁离子才能复制DNA，含有内过氧桥结构 的二氢青蒿素进入含铁质较多的癌细胞后，通过与亚铁离子作用，产生活性自由基，杀死癌 细胞。
[0005] 不对称取代脲因其结构中存在不同取代的肽键（CO-NH)而具有广泛的生物活性。 不仅在除草、杀虫、杀菌以及植物生长调节等方面具有重要用途，而且许多像酶抑制剂、生 物模拟肽等生物活性物质亦含有不对称取代脲的结构单元，含有氨基脲结构的化合物在化 学治疗方面具有很广阔的治疗谱，包括抗疟疾，抗肿瘤，抗菌，抗锥虫及抗病毒。
[0006] 本发明人基于二氢青蒿素的抗肿瘤活性，将氨基脲结构片段经亲核取代反应引入 二氢青蒿素的3-C位，提高了二氢青蒿素的抗癌活性。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种抗癌效果好、毒性低的二氢青蒿素的衍生物。并提供了 其在抗肿瘤活性中的应用。
[0008] 本发明的另一目的在于提供上述氨基脲二氢青蒿素的制备方法。
[0009] 本发明的再一目的在于提供上述氨基脲二氢青蒿素的用途。
[0010] 以下对本发明进行详细描述。
[0011] 本发明提供以下通式I的氨基脲二氢青蒿素或其药学可接受的水合物、盐，如下 所示：
其中，R为H、各种烃基，所述烃基可以被卤素、氨基、取代氨基、羧基、羟基、酯基、氰基、 硝基、芳基和取代芳基的取代基任意取代；Z为0, S，NH。
[0012] 本发明提供了上述通式I化合物的制备方法，通式I的合成如下所示：
其中，X = Br, Cl ; Z = S，0, NH ; R = H、烃基 本发明的氨基脲二氢青蒿素的制备方法，所述反应溶剂为DMF、乙腈、THF、氯仿、二氯甲 烷、乙酸乙酯、丙酮、四氯化碳，优选DMF、乙腈、THF。
[0013] 本发明的氨基脲二氢青蒿素的制备方法，所述催化剂为碘化物、碘盐，优选碘金属 盐。
[0014] 本发明的氨基脲二氢青蒿素的制备方法，所述縛酸剂为各种有机和无机碱，优选 吡啶、三乙胺。
[0015] 本发明的氨基脲二氢青蒿素对Hela和A549细胞有显著的抑制作用，因此，本发明 的氨基脲二氢青蒿素可以应用于制备抗肿瘤药物。
[0016] 通过以下实施例进一步举例说明本发明，但应注意本发明的范围并不受这些实施 例的任何限制。
【具体实施方式】
[0017] 实施例1 (31?，5&5，61?，8&5，91?，125，12&1〇-八氢-3-(氨基硫代甲酰肼基)亚甲基-6,9-二 甲基-3，12-桥氧-12!1-吡喃并[4，3-」]-1，2-苯并二噻平-10(3!〇醇（1)的制备 化合物（1)的结构如下所示：
向干燥反应器中加入 3.62g (O.Olmol)的（3R，5aS，6R，8aS，9R，12S，12aR)-八 氢-3-溴亚甲基-6,9-二甲基-3，12-桥氧-12!1-吡喃并[4，31_]-1，2-苯并二噻平-10 (3H)醇和20mLTHF，搅拌，加入I. 58g (0· 02mol)的吡啶和I. 09g(0. 012mol)氨基硫脲，反 应12小时，减压蒸出溶剂。残渣加入20mL乙酸乙酯和20mL饱和碳酸氢钠溶液，搅拌，分 层，水层用乙酸乙酯提取15mLX2,合并有机相，干燥，过滤，浓缩，柱层析纯化，得标的化合物 (1)，收率 55%。
[0018] 实施例2 (3R，5aS，6R，8aS，9R，12S，12aR)_ 八氢-3-(氨基甲酰肼基）亚甲基-6,9-二甲 基-3，12-桥氧-12!1-吡喃并[4，3-」]-1，2-苯并二噻平-10(3!〇醇（2);化合物（2)的结 构如下所示：
向干燥反应器中加入 3.62g (O.Olmol)的（3R，5aS，6R，8aS，9R，12S，12aR)_ 八 氢-3-溴亚甲基-6,9-二甲基-3，12-桥氧-12!1-吡喃并[4，31_]-1，2-苯并二噻平-10 (3H)醇和22mLTHF，搅拌，加入I. 58g (0· 02mol)的吡啶和I. 09g(0. 012mol)氨基脲，反应 12小时，减压蒸出溶剂。残渣加入20mL乙酸乙酯和20mL饱和碳酸氢钠溶液，搅拌，分层，水 层用乙酸乙酯提取15mLX2,合并有机相，干燥，过滤，浓缩，柱层析纯化，得3-脲氨基二氢青 蒿素，收率52%。
[0019] 实施例3 (3R，5aS，6R，8aS，9R，12S，12aR)_ 八氢-3-(甲氨基甲酰肼基）亚甲基-6,9-二 甲基-3，12-桥氧-12!1-吡喃并[4，3-」]-1，2-苯并二噻平-10(3!〇醇（3); 化合物（3)的结构如下所示：
向干燥反应器中加入 3.18g (O.Olmol)的（3R，5aS，6R，8aS，9R，12S，12aR)-八 氢-3-氯亚甲基-6,9-二甲基-3,12-桥氧-12H-吡喃并[4，3-j]-l，2-苯并二噻 平-10 (3H)醇和 20mL 乙腈，搅拌，加入 1.58g (0.02mol)吡啶、0.82 g (0.0005mol)KI 和 1.07g(0.012mol)甲氨基甲酰肼，反应24小时，减压蒸出溶剂。残渣加入20mL乙酸乙酯 和20mL饱和碳酸氢钠溶液，搅拌，分层，水层用乙酸乙酯提取15mLX2,合并有机相，干燥，过 滤，浓缩，柱层析纯化，得化合物（3)，收率66%。
[0020] 实施例4 (31?，5&5，61?，8&5，91?，125，12&1〇-八氢-3-(苯氨基甲酰肼基）亚甲基-6,9-二 甲基-3，12-桥氧-12!1-吡喃并[4，3-」]-1，2-苯并二噻平-10(3!〇醇（4); 化合物（4)的结构如下所示：
向干燥反应器中加入 3.18g (O.Olmol)的（3R，5aS，6R，8aS，9R，12S，12aR)_ 八 氢-3-氯亚甲基-6,9-二甲基-3，12-桥氧-12!1-吡喃并[4，31_]-1，2-苯并二噻平-10 (3H)醇和25mL乙腈，搅拌，加入2. 02g (0· 02mol)三乙胺、I. 81g(0. 012mol)苯氨基甲酰肼 和0. 82 g(0. 0005mol)KI，反应24小时，减压蒸出溶剂。残渣加入20mL乙酸乙酯和20mL饱 和碳酸氢钠溶液，搅拌，分层，水层用乙酸乙酯提取15mLX2,合并有机相，干燥，过滤，浓缩， 柱层析纯化，得化合物（4)，收率42%。
[0021] 实施例5 (3R，5aS，6R，8aS，9R，12S，12aR)_ 八氢-3-(胍氨基）亚甲基-6,9-二甲基-3， 12-桥氧-12H-吡喃并[4，3-j]-l，2-苯并二噻平-10 (3H)醇（5); 化合物（5)的结构如下所示：
向干燥反应器中加入 3.62g (O.Olmol)的（3R，5aS，6R，8aS，9R，12S，12aR)-八 氢-3-溴亚甲基-6,9-二甲基-3，12-桥氧-12!1-吡喃并[4，31_]-1，2-苯并二噻平-10 (3H)醇和22mLDMF，搅拌，加入2. 37g (0· 03mol)的吡啶和I. 63g(0. 012mol)氨基胍重碳酸 盐，反应12小时，减压蒸出溶剂。残渣加入20mL乙酸乙酯和20mL饱和碳酸氢钠溶液，搅 拌，分层，水层用乙酸乙酯提取15mLX2,合并有机相，干燥，过滤，浓缩，柱层析纯化，得化合 物（5)，收率39%。
[0022] 实施例6 (31?，5&5，61?，8&5，91?，125，12&1〇-八氢-3-(3,4,5-三羟基苯甲氨基甲酰肼基） 亚甲基-6,9-二甲基-3,12-桥氧-12H-吡喃并[4，3-j]-l，2-苯并二噻平-KK3H)醇（6) 的制备； 化合物（6)的结构如下所示：
向干燥反应器中加入 3.62g (O.Olmol)的（3R，5aS，6R，8aS，9R，12S，12aR)_ 八 氢-3-溴亚甲基-6,9-二甲基-3，12-桥氧-12!1-吡喃并[4，31_]-1，2-苯并二噻平-10 (3H)醇和 22mLTHF，搅拌，加入 2. 02g (0· 02mol)的三乙胺和 2. 55g(0. 012mol)3,4,5-三羟 基苯甲氨基甲酰肼，反应12小时，减压蒸出溶剂。残渣加入20mL乙酸乙酯和20mL饱和碳 酸氢钠溶液，搅拌，分层，水层用乙酸乙酯提取15mLX2,合并有机相，干燥，过滤，浓缩，柱层 析纯化，得化合物（6)，收率79%。
[0023] 实施例7 (31?，5&5，61?，8&5，91?，125，12&1〇-八氢-3-(3-甲氧基-4-羟基苯乙烯甲氨基 甲酰肼基)亚甲基-6,9-二甲基-3，12-桥氧-12!1-吡喃并[4，3-」]-1，2-苯并二噻平-10 (3H)醇（7)的制备； 化合物（7 )的结构如下所示：
用2. 87g(0. 012mol) 3-甲氧基-4-羟基苯乙烯甲氨基甲酰肼代替2. 39g(0. 012mol)3， 4，5-三羟基苯甲氨基甲酰肼，其他操作同实施例6，得化合物（7 )，收率76%。
[0024] 实施例8 (3R，5aS，6R，8aS，9R，12S，12aR)_八氢-3-(3,4,5-三甲氧基苯甲氨基甲酰肼 基）亚甲基-6,9-二甲基-3，12-桥氧-12H-吡喃并[4，3-j]-l，2-苯并二噻平-10 (3H) 醇（8)的制备； 化合物（8)的结构如下所示：
用2.97g(0.012mol) 3,4,5_三甲氧基苯甲氨基甲酰肼代替2.39g(0.012mol)3,4， 5-三羟基苯甲氨基甲酰肼，其他操作同实施例6，得化合物（8 )，收率82%。
[0025] 实施例9 氨基脲二氢青蒿抑制肿瘤细胞增殖的体外评价 1材料与方法 1. 1细胞株 非小细胞肺癌A549和宫颈癌细胞Hela，购自美国ATCC。
[0026] L 2主要试剂和药品 高糖DMEM培养液，购于美国GIBCO公司； 胎牛血清，购于中科晨宇（北京）贸易有限公司； 胰蛋白酶，购于西安璟程生物科技有限公司； 青霉素，购于华北制药有限公司； 链霉素，购于华北制药有限公司； 二甲基亚砜（DMSO)，购于格里斯(天津）医药化学技术有限公司； 双氢青蒿素纯品，广州新南方青蒿药业有限公司提供。
[0027] 1. 3主要仪器 NUNC细胞培养板，Denmark公司； HF90二氧化碳培养箱，上海力申科学仪器有限公司； 细胞计数板，上海半岛实业有限公司。
[0028] L 4溶液配制 1. 4. 1 20万U/ml青霉素 青霉素（一瓶）80万U，生理盐水4mL充分溶解后0.22 ym微孔滤膜过滤除菌、分 装，-20°C保存。
[0029] L 4. 2 20 万 U/ml 链霉素 链霉素（一瓶）100万U，生理盐水5mL，充分溶解后0.22 μ m微孔滤膜过滤除菌、分 装，20°C保存。
[0030] 1.4.3高糖DMEM完全培养液 高糖DMEM基础培养基90mL,胎牛血清IOmL, 20万U/mL青霉素50 uL，20万U/mL链 霉素50 uL，配制成含10%胎牛血清，lOOU/mL青霉素及lOOU/mL链霉素的高糖DMEM完全培 养液，4° C保存备用。
[0031] 1.4. 4冻存液配制 高糖DMEM培养液7mL，DMSO ImL，胎牛血清2mL。
[0032] L 4. 5四甲基偶氮啤盐（MTT) 称 250mg MTT (Sigma 公司）溶于 50mL 0· 01mol/L PBS 溶液中，0· 2iim 滤膜过 滤，4° C避光保存，2周内使用。
[0033] 1. 4. 6 酸盐缓冲液（PBS) 8.00g NaCl，0.20g KCl，1.44g Na2HP04,0 . 24g KH2PO4溶于 800mL 双蒸水中，盐酸调 pH值为7. 4,加蒸馏水至1L，高压灭菌后备用。
[0034] 1. 4. 7细胞裂解液 20mmol/L MOPS, 0· 15mmol/LNaCl, 1% NP-40(去氧胆酸钠 1%), lmmol/L EDTA, 1%SDS，用双蒸水搅拌溶解。将上述液体混匀后配制成含10%DMS0的冻存液，分装，-20°C 保存。
[0035] 1. 4. 8双氢青蒿素溶液 用少量DMSO溶液将纯品溶解配制成lOOmmol/L的母液，超声波助溶，4° C保存，实 验前用DMEM培养液稀释至所需浓度（DMS0终浓度〈1%)。
[0036] 2实验方法 2. 1细胞的培养 肺癌A549细胞和宫颈癌Hela细胞均为贴壁细胞，培养于高糖的DMEM完全培养液，放 置于37°C，5%C02，饱和湿度的培养箱中，隔两天换液。当细胞生长接近融合，铺满约90% 培养瓶底时，进行接种。
[0037] 2. 2接种细胞 当细胞贴壁长满至80-90%时，用胰蛋白酶消化细胞，以高糖DMEM完全培养液将细胞 吹打制备成单细胞悬液。将对数生长期的细胞以3000-4000细胞/孔的量接种于96孔板， 每孔为l〇〇uL。
[0038] 2. 3加药处理 待细胞贴壁培养l-2d后，吸掉原有培养基，将药物分别配制成一定浓度，并对半稀 释，后一孔药物浓度是前一孔的一半，放入37°C，5%C02培养箱培养。
[0039] 2. 4 MTT 法检测 将加入药物的培养板放入37°C，5%C02培养箱孵育72h后，每孔加入ZOyg/mL MTT溶液，置于37°C，5%C02培养箱中保温4h，小心吸掉孔中原有培养液，每孔加入 150 μ LDMS0,振荡后静置lOmin，待结晶充分溶解后，用酶标仪测SA49(lnm值，并计算抑制 率（%) = (1-实验组OD值/空白对照组OD值）X 100。
[0040] 2. 5半数抑制浓度（IC50)计算 将配好的药物用含10%的DMEM培养基稀释，青蒿素100 μ g/mL和双氢青蒿素100 μ g/ mL溶液，根据对半稀释方法加药，每个浓度设3个复孔，空白对照9个复孔，MTT法检测， 计算出不同浓度药物的抑制率，将剂量与对应抑制率输入Shmm公司IC50. Exel. 0版本软 件计算药物的IC50。
[0041] 3 结果 所制备的氨基脲二氢青蒿素在体外对肺癌A549和宫颈癌细胞Hela有明显抑制作用。 各剂量组的抑制率与二氢青蒿素对比，具有显著性，如下表1和表2所示：
【主权项】
1. 通式I的氨基脲二氢青蒿素衍生物或其药学可接受的水合物、盐，其特征是它具有 如下通式：式中，R为H、各种烃基，所述烃基可以被卤素、氨基、取代氨基、羧基、羟基、酯基、氰基、 硝基、芳基和取代芳基的取代基任意取代；Z为0, S，NH。2. 根据权利1所述的通式I的氨基脲二氢青蒿素衍生物或其药学可接受的水合物、盐， 其特征在于：R为H、各种烃基，优选H、取代苯甲基。3. 根据权利1所述的通式I的氨基脲二氢青蒿素衍生物或其药学可接受的水合物、盐， 其特征在于：Z为0, S，NH，优选0, S。4. 根据权利1所述的通式I的氨基脲二氢青蒿素衍生物或其药学可接受的水合物、盐， 所述通式I化合物的具体实例包括： (31?，5&5，61?，8&5，91?，125，12&1〇-八氢-3-(氨基硫代甲酰肼基)亚甲基-6,9-二 甲基-3，12-桥氧-12!1-吡喃并[4，3-」]-1，2-苯并二噻平-10(3!〇醇（1); (3R，5aS，6R，8aS，9R，12S，12aR)_ 八氢-3-(氨基甲酰肼基）亚甲基-6,9-二甲 基-3，12-桥氧-12!1-吡喃并[4，3-]_]-1，2-苯并二噻平-10(3!〇醇（2); (3R，5aS，6R，8aS，9R，12S，12aR)_ 八氢-3-(甲氨基甲酰肼基）亚甲基-6,9-二 甲基-3，12-桥氧-12!1-吡喃并[4，3-」]-1，2-苯并二噻平-10(3!〇醇（3); (31?，5&5，61?，8&5，91?，125，12&1〇-八氢-3-(苯氨基甲酰肼基）亚甲基-6,9-二 甲基-3，12-桥氧-12!1-吡喃并[4，3-」]-1，2-苯并二噻平-10(3!〇醇（4); (3R，5aS，6R，8aS，9R，12S，12aR)_ 八氢-3-(胍氨基）亚甲基-6,9-二甲基-3， 12-桥氧-12H-吡喃并[4，3-j]-l，2-苯并二噻平-10 (3H)醇（5); (31?，5&5，61?，8&5，91?，125，12&1〇-八氢-3-(3,4,5-三羟基苯甲氨基甲酰肼基） 亚甲基-6,9-二甲基-3，12-桥氧-12!1-吡喃并[4，31_]-1，2-苯并二噻平-10(3!〇醇 (6)； (31?，5&5，61?，8&5，91?，125，12&1〇-八氢-3-(3-甲氧基-4-羟基苯乙烯甲氨基 甲酰肼基)亚甲基-6,9-二甲基-3，12-桥氧-12!1-吡喃并[4，3-」]-1，2-苯并二噻平-10 (3H)醇（7); (3R，5aS，6R，8aS，9R，12S，12aR)_八氢-3-(3,4,5-三甲氧基苯甲氨基甲酰肼 基）亚甲基-6,9-二甲基-3，12-桥氧-12!1-吡喃并[4，31_]-1，2-苯并二噻平-10(3!〇 醇（8)〇5. 通式为I的化合物的制备方法，如下所示：其中，X = Br, Cl ;Z = S，0，NH;R = H、烃基，其特征在于，所述方法以3-卤代二氢青 蒿素和取代的氨基脲为原料，一定的温度下，一定的溶剂中，使用特殊的催化剂和縛酸剂， 通过亲核取代反应，合成氨基脲二氢青蒿素。6. 根据权利1和5所述的通式I的合成方法，所述反应溶剂为DMF、乙腈、THF、氯仿、二 氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、四氯化碳，优选DMF、乙腈、THF。7. 根据权利1和5所述的通式I的合成方法，其特征在于，所述催化剂为碘化物、碘盐， 优选碘金属盐。8. 根据权利1和5所述的通式I的合成方法，其特征在于，所述縛酸剂为各种有机和无 机碱，优选吡啶、三乙胺。9. 根据权利1所述的通式I的氨基脲二氢青蒿素衍生物在制备抗癌药物中的应用。
【专利摘要】本发明涉及氨基脲二氢青蒿素衍生物（通式I）或其药学可接受的水合物、盐。其中，R为H、各种烃基，所述烃基可以被卤素、氨基、取代氨基、羧基、羟基、酯基、氰基、硝基、芳基和取代芳基的取代基任意取代；Z为O，S，NH。本发明的氨基脲二氢青蒿素对Hela和A549细胞有显著的抑制作用，因此，本发明的氨基脲二氢青蒿素有较好的抗肿瘤效果。本发明公开了其制法。
【IPC分类】A61P35/00, C07D493/20, A61K31/357
【公开号】CN104892626
【申请号】CN201510283438
【发明人】张宝华, 史兰香, 刘斯婕, 郭瑞霞
【申请人】石家庄学院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月29日
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