3,6-二取代[1,2,4]三唑[3,4-b][1,3,4]噻二唑化合物及其用图
3,6-二取代[1,2,4]三唑[3,4-b][1,3,4]噻二唑化合物及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药物学领域，尤其涉及3, 6-二取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻 二唑类化合物及其药学上可以接受的盐或药学上可以接受的溶剂合物，以及在作为包括金 黄色葡萄球菌、酿脓杆菌、炭疽杆菌和肺炎链球菌等在内的革兰氏阳性菌转肽酶SrtA抑制 剂以及在制备治疗以革兰氏阳性菌例如金黄色葡萄球菌、酿脓杆菌、炭疽杆菌和肺炎链球 菌等转肽酶SrtA为靶点的病原菌感染性疾病的药物中的用途。
【背景技术】
[0002] 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)属于革兰氏阳性病原菌，具有很强 的感染性和致病性（Archer, G. L.，Staphylococcus aureus:a well-armed pathogen. Clin Infect Disl998, 26(5)，1179-8L)。多年来抗生素的滥用导致耐药性菌株的出现， 比如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin resistant Staphylococcus aureus， MRSA)(Hiramatsu etc., The emergence and evolution of methici11 in-resistant Staphylococcus aureus. Trends Microbiol2001, 9 (10)，486-93.)。在美国，MRSA 引起的感 染导致的死亡人数已经超过了艾滋病感染引起的死亡人数（Klevens, R. M. etc.，Invasive methici11 in-resistant Staphylococcus aureus infections in the United States. JAMA2007, 298 (15)，1763-71.)。面对病原菌耐药性问题日益严峻的挑战，人们需要不断地 发展全新的抗病原菌感染的策略以应对持续出现的耐药病原菌对人类健康的威胁。
[0003] 金黄色葡萄球菌超强的感染性和致病性与其细胞壁上锚定的表面蛋白息息相 关。金黄色葡萄球菌通常通过其表面的黏附素（最主要是一些表面蛋白）识别宿主细 胞表面的特异性受体而粘附到宿主的特定器官或组织，这是金黄色葡萄球菌侵袭宿主 并引起进一步感染的基础（Schneewind, 0·; Missiakas, D. M.，Protein secretion and surface display in Gram-positive bacteria, Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 2012, 367 (1592)，1123-39.)。芝加哥大学Olaf教授领导的研究小组发现在金黄色 葡萄球菌中多种重要的表面蛋白（例如ClfA、ClfB、FnBPA、FnBPB、SPA等）穿过胞质膜 后由转肽酶SrtA通过转肽作用锚定到细胞壁上（Mazmanian, S. Κ· Etc.，StaphyIococcus aureus sortase, an enzyme that anchors surface proteins to the cell wall. Sciencel999, 285 (5428)，760-3.)。此外，敲除转肽酶SrtA的菌株在培养基中没有表现出 生长障碍，这样就很有可能避免由于选择压力而产生耐药性。
[0004] 转肽酶SrtA作为抗金黄色葡萄球菌乃至革兰氏阳性病原菌感染的全新靶标 受到了极大地关注。革兰氏阳性病原菌SrtA的功能被确定以后，SrtA作为抗革兰氏 阳性病原菌的候选革G标受到了极大关注（Maresso，A.W. etc. ,Sortase as a target of anti-infective therapy. Pharmacol Rev2008, 60(I), 128-41)〇
【发明内容】
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明的一个目的是提供一种3,6_二取代[1，2, 4]三唑 [3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物及其药学上可以接受的盐或药学上可以接受的溶剂合物。
[0006] 本发明的另一个目的是提供根据本发明的3, 6-二取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物及其药学上可以接受的盐或药学上可以接受的溶剂合物在制备抑 制包括金黄色葡萄球菌、酿脓杆菌、炭疽杆菌和肺炎链球菌等在内的革兰氏阳性菌转肽酶 SrtA的抑制剂中的应用。
[0007] 本发明的再一个目的是提供根据本发明的3, 6-二取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物及其药学上可以接受的盐或药学上可以接受的溶剂合物在制备用 于治疗与转肽酶SrtA相关的疾病的药物中的应用，尤其是在制备用于治疗包括金黄色葡 萄球菌、酿脓杆菌、炭疽杆菌和肺炎链球菌等在内的革兰氏阳性菌感染的疾病的药物中的 应用。
[0008] 本发明的又一目的是提供包含治疗有效量的选自根据本发明的3, 6-二取代 [1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物、其药学上可以接受的盐或药学上可以接受 的溶剂合物或者其混合物中的一种或多种作为活性成分的药物组合物。
[0009] 本发明的又一目的是提供一种治疗与转肽酶SrtA相关的疾病的方法，所述方 法包括向患者给药治疗有效量的选自根据本发明的3,6_二取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物、其药学上可以接受的盐或药学上可以接受的溶剂合物或者其混 合物中的一种或多种作为活性成分。
[0010] 为了实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：
[0011] 本发明提供一种如下通式（I)所示的3, 6-二取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4] 噻二唑类化合物及其药学上可以接受的盐或药学上可以接受的溶剂合物：
[0012]
[0013] 其中，Rl和R2各自独地为U1-U6炕盎、U3-U 6补炕盎、取代现禾取代的C6-C12芳 基和取代或未取代的5-9元杂环基，其中上述用于取代的取代基为选自C 1-C6直链或支链烷 基、C1-C6烷氧基、卤素、氣基、羟基、硝基、氛基、竣基和横酸基中的1至3个取代基；
[0014] 优选地，
[0015] Rl选自取代或未取代的苯基、取代或未取代的萘基、取代或未取代的吡啶基、取代 或未取代的呋喃基、取代或未取代的吡咯基、取代或未取代的吲哚基、取代或未取代的喹啉 基、取代或未取代的咪唑基和取代或未取代的苯并咪唑基，其中上述用于取代的取代基为 选自C 1-C6直链或支链烷基、C1-C6烷氧基、羰基C 1-C6烷基、卤素、氨基、羟基、硝基、氰基、羧 基和磺酸基中的1至3个取代基；
[0016] Rl优选选自取代或未取代的苯基、取代或未取代的萘基、取代或未取代的吡啶基、 取代或未取代的呋喃基、取代或未取代的吡咯基、取代或未取代的吲哚基、取代或未取代的 喹啉基、取代或未取代的咪唑基和取代或未取代的苯并咪唑基，其中上述用于取代的取代 基为选自C1-C4直链或支链烷基、C1-C4烷氧基、卤素、氨基、羟基、硝基、氰基、羧基和磺酸基 中的1至3个取代基；
[0017] Rl更优选选自苯基、1至3个甲氧基取代的苯基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、 3, 4, 5或6-甲基-2-吡啶基、2, 4, 5或6-甲基-2-吡啶基、2或3-甲基-2-吡啶基、3, 4, 5 或6-氣-2_批陡基、2, 4, 5或6_氣_2_批陡基、2或3_氣_2_批陡基、3, 4, 5或6_氣_2_批 啶基、2, 4, 5或6-氯-2-吡啶基、2或3-氯-2-吡啶基、3, 4, 5或6-溴-2-吡啶基、2, 4, 5 或6_漠_2_批陡基、2或3_漠_2_批陡基、2, 3_二氣_4_批陡基、2, 5_二氣_4_批陡基、 2, 6- 二氣-4-批陡基、3, 4, 5或6-甲氧基?比陡基、2, 4, 5或6-甲氧基批陡基、2或 3_甲氧基_2-批陡基、3, 4, 5或6-二氣甲基?比陡基、2, 4, 5或6-二氣甲基?比陡基、 2或3-三氟甲基-2-吡啶基、2或3-吡咯基、2, 3, 4, 5, 6或7-吲哚基、2, 3, 4, 5, 6, 7或8-吲 哚基、4或5-咪唑基、2, 4, 5, 6或7-苯并咪唑基、呋喃基；更优选选自苯基、1至3个甲氧基 取代的苯基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-吲哚基和2-呋喃基；
[0018] 优选地，
[0019] R2选自C1-C6烷基、C3-C6环烷基、取代或未取代的苯基、取代或未取代的萘基、取代 或未取代的吡啶基、取代或未取代的呋喃基、取代或未取代的吡咯基、取代或未取代的噻吩 基、取代或未取代的吲哚基、取代或未取代的喹啉基、取代或未取代的咪唑基和取代或未取 代的苯并咪唑基，其中上述用于取代的取代基为选自C 1-C6直链或支链烷基、C1-C6烷氧基、 羰基C 1-C6烷基、卤素、氨基、羟基、硝基、氰基、羧基和磺酸基中的1至3个取代基；
[0020] R2优选选自C1-C6烷基、C3-C6环烷基、取代或未取代的苯基、取代 或未取代的萘基、 取代或未取代的吡啶基、取代或未取代的呋喃基、取代或未取代的吡咯基、取代或未取代的 噻吩基、取代或未取代的吲哚基、取代或未取代的咪唑基和取代或未取代的苯并咪唑基，其 中上述用于取代的取代基为选自C 1-C4直链或支链烷基、C1-C4烷氧基、卤素、氨基、羟基、硝 基、氰基、羧基和磺酸基中的1至3个取代基；
[0021] R2更优选选自甲基、乙基、丙基、异丙基、环丙基、正丁基、叔丁基、环丁基、环戊基、 环己基、苯基、2, 3或4-甲基苯基、2, 3或4-叔丁基苯基、2, 3或4-甲氧基苯基、2, 3或4-乙 氧基苯基、3, 4, 5-三甲氧基苯基、2, 3或4-氨基苯基、2, 3或4-碘代苯基、2, 3或4-氰基苯 基、2, 3或4-羧基苯基、2, 3或4-硝基苯基、2, 3或4-羟基苯基、3, 4, 5-三羟基苯基、2, 3 或4-磺酸基苯基、萘基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、3, 4, 5或6-甲基-2-吡啶基、 2, 4, 5或6-甲基-2-吡啶基、2或3-甲基-2-吡啶基、3, 4, 5或6-氟-2-吡啶基、2, 4, 5或 6_氣_2_批陡基、2或3_氣_2_批陡基、3, 4, 5或6_氣_2_批陡基、2, 4, 5或6_氣_2_批 啶基、2或3-氯-2-吡啶基、3, 4, 5或6-溴-2-吡啶基、2, 4, 5或6-溴-2-吡啶基、2或 3_漠_2_批陡基、2, 3_二氣_4_批陡基、2, 5_二氣_4_批陡基、2, 6_二氣_4_批陡基、3, 4, 5 或6-甲氧基批陡基、2, 4, 5或6-甲氧基批陡基、2或3-甲氧基批陡基、3, 4, 5 或6-三氟甲基-2-吡啶基、2, 4, 5或6-三氟甲基-2-吡啶基、2或3-三氟甲基-2-吡啶 基、2或3-呋喃基、2或3-噻吩基、2或3-吡咯基、2, 3, 4, 5, 6或7-吲哚基，2, 3, 4, 5, 6, 7 或8-吲哚基、4或5-咪唑基、2, 4, 5, 6或7-苯并咪唑基；
[0022] R2更优选选自苯基、4-甲氧基苯基、2-乙氧基苯基、4-乙氧基苯基、3-磺酸钠 苯基、2-甲基苯基、3-甲基苯基、4-甲基苯基、4-叔丁基苯基、2-碘代苯基、4-氨基苯基、 3, 4, 5-三羟基苯基、3, 4, 5-三甲氧基苯基、萘基、2-呋喃基、2-吡咯基、2-吲哚基、4-吡啶 基、3-吡啶基、2-吡啶基、2-噻吩基
[0023] 更优选地，所述具有通式（I)结构的表示的3, 6-二取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物及其药学上可以接受的盐或药学上可以接受的溶剂合物为以下通 式之一所示的化合物：
[0024]
[0025] 其中，R2的定义与上述对通式（I)中的R2的定义一样，R3不存在或者选自C1-C6 直链或支链烷基、C1-C6烷氧基、卤素、氨基、羟基和磺酸基中的1至3个取代基，R3优选不 存在或者为选自甲基、乙基、丙基、正丁基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、卤素、氨基、羟 基和磺酸基中的1至3个取代基。
[0026] 在本申请中，卤素包括氟、氯、溴和碘。
[0027] 最优选地，所述具有通式⑴所示结构的3, 6-二取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物及其药学上可以接受的盐或药学上可以接受的溶剂合物为选自下 列化合物中的一种化合物：
[0028]
[0034] 本发明还提供了所述3, 6-二取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物 及其药学上可以接受的盐或药学上可以接受的溶剂合物在制备抑制革兰氏阳性菌转肽酶 SrtA的抑制剂中的应用。
[0035] 本发明还提供了所述3, 6-二取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物 及其药学上可以接受的盐或药学上可以接受的溶剂合物在制备用于治疗革兰氏阳性菌转 肽酶SrtA为靶点的革兰氏阳性病原菌感染疾病的药物中的应用。
[0036] 本发明还提供一种药物组合物，该组合物包含治疗有效量的选自所述3, 6-二取 代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物及其药学上可以接受的盐或药学上可以 接受的溶剂合物或者其混合物中的一种或多种作为活性成分，该药物组合物用于治疗革兰 氏阳性菌感染的疾病。
[0037] 本发明还提供了所述药物组合物在制备用于治疗的革兰氏阳性菌感染的疾病的 药物中的应用。
[0038] 其中，所述革兰氏阳性菌优选包括金黄色葡萄球菌、酿脓杆菌、炭疽杆菌和肺炎链 球菌等。
[0039] 本发明还提供一种治疗与转肽酶SrtA相关的疾病的方法，所述方法包括向患者 施加治疗有效量的选自所述3, 6-二取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物、 其药学上可以接受的盐或药学上可以接受的溶剂合物或者其混合物中的一种或多种作为 活性成分的药物组合物。
[0040] 本发明的3, 6-二取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物及其药学上 可以接受的盐或药学上可以接受的溶剂合物通过抑制转肽酶SrtA发挥抑制包括金黄色葡 萄球菌、酿脓杆菌、炭疽杆菌和肺炎链球菌在内的革兰氏阳性菌感染能力。从而在一定程度 上避免了病原菌由于选择压力而产生耐药性，减轻了持续出现的耐药病原菌对人类健康的 威胁。
【附图说明】
[0041] 图1显示通过基于十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳胶（SDS-PAGE)的体外 表面蛋白质转肽活性测定方法验证3, 6-二取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化 合物对转肽酶SrtA的抑制；
[0042] 图2显示3, 6-二取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物对金黄色葡 萄球菌Newman菌株（S. aureus Newman)的生长曲线的影响；
[0043] 图3显示通过异硫氰酸荧光素标记的免疫球蛋白G(FITC-IgG)实验检测3, 6-二 取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物对细胞壁SPA含量的影响；
[0044] 图4显示蛋白质印迹法（Western Blotting)检测化合物3, 6-二取代[1，2, 4]三 唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物对细胞壁SPA含量的影响；
[0045] 图5显示3, 6-二取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物对金黄色葡 萄球菌与纤维蛋白原（Fibrinogen)包埋的板粘附的影响；
[0046] 图6显示3, 6-二取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物提高金黄色 葡萄球菌感染的小鼠生存率。
【具体实施方式】
[0047] 下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述。这些实施例仅是出于解释说明的目 的，而不是限制本发明的范围和实质。
[0048] 以下实施例药品的来源：底物Abz-LPATG-Dap(Dnp)-NH2由上海吉尔生化公司合 成；胰蛋白胨大豆肉汤（TSB)，Luria-Bertani培养基（LB)购自英国OXOID公司；FITC标 记的鼠 IgG购自eBioscience公司，蛋白质标准品（Marker)购自Fermentas公司；甘氨 酸、十二烷基磺酸钠（SDS)、二硫苏糖醇（DTT)、40%丙烯酰胺溶液和四甲基乙二胺（TEMED) 购自上海生工生物工程有限公司；溶葡球菌酶（Iysostaphin)购自Sigma公司；咪唑购自 Sigma-Fluka公司；其它试剂购自国药集团化学试剂有限公司。
[0049] 制各实施例
[0050] 本发明所述的3, 6-二取代-[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物及其 药学上可以接受的盐或药学上可以接受的溶剂合物可以通过如下路线制备：
[0052] 现以3-(4-吡啶基）-6-(3-苯磺酸钠基）-[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑 (SD-B-9)为例说明合成（即制备实施例19)。
[0053]
[0054] 步骤1:将15. 12g(0.1mol)吡啶-4-甲酸乙酯和10. 00g(0. 2mol)水合肼 (NH2NH2 · H2O)加入50mL乙醇中，回流反应24h，冷却至室温，溶液旋干，重结晶，得到 11. 62g(0. 085mol)吡啶-4-甲酰阱，产率 85%。
[0055] 1H NMR(DMS0-d6) :4, 61, 7. 71 (dd, J=4. 5, 1. 7), 8. 69 (dd, J=4. 5, I. 7), 10. 09.
[0056] 步骤 2:将 13. 71g(0.1mol)吡啶-4-甲酰阱和 8. 42g(150mmol)氢氧化钾（KOH) 加入200mL无水乙醇中，冰水浴冷却，缓慢滴加9. 90g(0. 13mol)二硫化碳（CS2)，室温反应 12h，反应结束后加过滤，得到22. 38g (0. 095mmol )钾盐，收率95%。
[0057] 步骤 3:将 25. 14g(0.1mol)钾盐和 20. 0g(0. 4mol)水合肼（NH2NH2 ·Η20)加入 IOOmL 水中，回流反应24h，反应结束后盐酸调节pH为1，过滤，重结晶，得到13. 5g(0.07mmol)产 物4-氨基-3- (4-吡啶基）-1H-1，2, 4-三氮唑-5H-硫醇，产率70%。
[0058] 1H NMR (DMS0-d6) : 4. 62 (s，2H)，7. 72 (dd, 2H，J=4. 4, 1. 6)，8. 70 (dd, 2H，J=4. 4, 1. 6) ,10. 11 (s, 1H).
[0059] 步骤4 :将22.42g(0.1mol)间甲酸苯磺酸钠和118.97mg(lmol)二氯亚砜（S(0) Cl2)加入25mL茄形瓶中，回流反应8h，反应结束后，将二氯亚砜除去，得到23. 50g (95mmol) 间甲酰氯苯磺酸钠，产率95%。
[0060] 步骤 5 :将 386. 46mg(2mmol)4-氨基-3-(4-吡啶基）-1Η-1，2, 4-三氮唑-5H-硫 醇和485. 22mg (2mmol)间甲酰氯苯磺酸钠加入5mL三氯氧磷（P (0) Cl3)中，回流反应 24h，除去三氯氧磷（P(O)Cl3)，加入5mL水，搅拌0. 5h，固体用碱中和，过滤，重结晶，得到 76mg (0· 2mmol) 3- (4-吡啶基）-6- (3-苯磺酸钠基）-[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑， 产率10%。
[0061] lHNMR(DMS0-d6):7.66(t，lH，J=8Hz)，7.93(d，lH，J=4Hz)，8.07(d，lH，J=8Hz)，8. 23 (s, 1H), 8. 56 (m, 2H, ),9.03 (m, 2H).
[0062] 以与上述制备实施例相同的方式可以合成3, 6-二取代_[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物，现将本发明所涉及的3, 6-二取代-[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物合成以及核磁数据列于表1。
[0063] 表 1
[0064]
[0065]
[0066]
[0067] _υυοο」
[0069]
[0070]
[0071]
[0073]
[0074]
[0075]
[0076]
[0077] 以下为通式（I)所示的3, 6-二取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合 物抑制转肽酶SrtA活性实验。
[0078] 实骀实施例一分子水平h转狀酶SrtA活件抑制试骀
[0079] 1、转狀酶SrtA半抑制浓度（IC50)评价
[0080] 将3, 6-二取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物40mM二甲亚砜 (DMSO)溶液与转肽酶反应缓冲液（50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl)，150mM氯 化钠（NaCl)，5mM 氯化钙（CaCl2)，0· 1% 聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100)，pH 为 7.5) 混合，使化合物终浓度为〇. 8-400 μ M(从400 μ M开始等倍稀释），然后加入终浓度为 1 μ M的转肽酶Sa-SrtA或SP-SrtA，室温下孵育IOmin后加入终浓度为10 μ M的反应底 物 Abz-LPATG-Dap(Dnp)-NH2，用 SpectraMax Flex Station3 酶标仪连续监测酶反应过 程中荧光强度的变化得到酶反应动力学曲线，通过下面公式求出每个化合物的不同浓度 (0· 8-400 μ M)所对应的抑制率（%)，用 GraphPad Prism软件（San Diego, USA)的 Sigmoidal dose-response程序计算出IC5tl。活性小分子化合物IC5tl结果列入表2中。
[0081] 抑制率（%) = (1-Vi/V。）X 100%
[0082] Vi为酶反应动力学曲线的的线性部分求出的化合物的反应初速率，Vtl为不加化合 物时所求得的反应初速率。
[0083] 从表2中可以看出，3, 6-二取代-[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物 对转肽酶SrtA有抑制活性。
[0084] 表2化合物对转肽酶SrtA酶活抑制水平
[0085]
[0086]
[0087] _8」
[0089]
[0090]
[0091]
[0092]
[0093]
[0094] 附注：NA :没有活性；ND:没有测试。
[0095] 2.转肽实验验证3, 6-二取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物对转 肽酶SrtA的抑制活性
[0096] 实验以3, 6-二取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物中的SD-B-9 和SD-B-15为例。
[0097] 通过Ni-NTA柱以及Superdex Hiload75柱两步纯化得到纯度大于95%的蛋白。 转肽反应缓冲液为50mM Tris-HCl，150mM NaCl，5mM CaCl2, pH为7. 5。在50μ L的反应体 系中加入终浓度为200 μ g/ μ L的转肽酶Sa-SrtA或是转肽酶Sp-SrtA，化合物SD-B-9和 SD-B-15的终浓度为25-200 μ M，随后加入终浓度为300 μ g/μ L的表面蛋白SasX和IsdA 以及终浓度为3mM的另一个反应底物（Gly) 3,37°C培养箱中反应2h，随后加入2 X十二烷基 磺酸钠凝胶上样缓冲液（含有200mM二硫苏糖醇（DTT))于KKTC煮沸lOmin，使反应终止 并使蛋白充分变性。跑15%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)，上样量为 10 μ L，电泳电压120V，电泳时间150min，电泳结束后考马斯亮蓝快速染色液染色。凝胶成 像系统中观察拍照并保存实验结果。ImM阳性化合物（2-甲基硫代磺酸基乙基）三甲基溴 化铵（（2-(trimethylammonium) ethyl methanethiosulfonate Bromide, MTSET)作为对照 以及200 μ M化合物SD-B-I作为阴性对照。从图1中可以看出，化合物SD-B-9和SD-B-15 可以浓度依赖性的抑制转肽酶SrtA对表面蛋白SasX和IsdA的转肽作用。化合物SD-B-9 对转肽酶SrtA的抑制活性高于化合物SD-B-15, 200 μ M化合物SD-B-9几乎可以完全抑制 转肽酶SrtA对表面蛋白SasX和I sdA的转肽作用。
[0098] 实验实施例二活体细菌水平上对3, 6-二取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二 唑类化合物的活性验证
[0099] 1. 3, 6-二取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物对金黄色葡萄球菌 生长的影响
[0100] 挑取金黄色葡萄球菌Newman菌株（S. aureus Newman)、金黄色葡萄球菌RN4220菌 株（S. aureus RN4220)、表皮葡萄球菌145菌株（S. epidermidisl457)、枯草芽抱杆菌168 菌株（B.subtilisl68)、绿胺杆菌 PAOl 菌株（P.aeruginosa PA01)、大肠杆菌 DH5a 菌株 (E. coli DH5 a )单克隆置于胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB)或Luria-Bertani培养基（LB) 中37°C培养过夜。次日用新鲜的TSB或LB培养基稀释A 6c?至0. 01，37°C摇床中培养2h后 稀释A_至0. 005。取180 μ L菌液接种到96孔板中，然后加入20 μ L用TSB或LB稀释好 的一系列浓度的表1中SD-B系列的化合物（SD-B-1至SD-B-21，共21种化合物），使化合物 的终浓度为6. 25-200 μ M(化合物从200 μ M开始等倍稀释）。将96孔板置于37°C培养箱 中培养16h，次日肉眼观察每个孔中细菌的生长情况，测出化合物的最低抑制浓度（MIC)。 每个样品做三个平行孔，测试结果列于表3。从表3中可以看出，3, 6-二取代[1，2, 4]三唑 [3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物对金黄色葡萄球菌上述6种菌株的MIC均大于200 μ M。
[0101] 表3化合物的MIC测定结果
[0103] 挑取S. aureus Newman以及S. aureus Newman SrtA单克隆置于TSB培养基中培 养过夜。次日用新鲜的TSB培养基稀释A6c?至0. 01，37 °C摇床中培养2h后用新鲜的TSB培 养基稀释A6c?至0.005。取180μ L菌液接种到96孔板中，然后加入20μ L用TSB稀释好的 不同浓度的化合物SD-B-9,使化合物的终浓度为50 μ Μ、 200 μ Μ。将96孔板置于Spectra Max Flex Station3 (Molecular Device,美国）酶标仪中连续测定A66c!的吸收值，温度控制 为37°C，每Ih读一次数，连续读数10h。用GraphPad Prism软件绘制不同浓度的化合物对 应的金黄色葡萄球菌的生长曲线(如图2所示)。每个样品做三个平行孔。从附图2可以看 出，化合物SD-B-9对金黄色葡萄球菌Newman菌株的生长影响都很小，并且与野生型菌株的 生长情况类似。
[0104] 2、异硫氰酸荧光素标记的免疫球蛋白G(FITC-IgG)实验验证3,6_二取代[1，2, 4] 三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物对细胞壁SPA含量影响
[0105] 为了在细胞水平上验证活性化合物对金黄色葡萄球菌转肽酶Sa-SrtA的抑制作 用，发明人设计了基于FITC-IgG的检测金黄色葡萄球菌细胞壁SPA含量的实验。该实验基 于的原理是：金黄色葡萄球菌SrtA通过转肽作用将SPA锚定在细胞壁肽聚糖上的五个甘氨 酸交联桥上，从而将SPA呈递在金黄色葡萄球菌的表面。荧光素 FITC标记的鼠 IgG可以特 异性地识别细胞壁上的SPA从而结合在金黄色葡萄球菌表面上，这可以通过酶标仪测定荧 光信号值。通过检测单位细菌结合的免疫球蛋白IgG的量就可以间接得知金黄色葡萄球菌 中转肽酶SrtA的活性。
[0106] 挑取S. aureusNewman以及S. aureusNewman SrtA单克隆置于TSB培养基中培 养过夜。次日按照I :200将过夜菌液重新接种到新鲜的TSB培养基中，同时加入SD-B-9 或SD-B-15,使其终浓度分别为25μΜ、50μΜ、100μΜ、200μΜ、1πιΜ阳性化合物（2-甲基硫 代横酸基乙基）三甲基溴化铵（（2 -(trimethylammonium) ethyl methanethiosulfonate Bromide, MTSET)作为对照（附图3中的对照)，37°C摇床中培养，转速为230rpm。当菌生长至 A_为0. 5时用灭菌的EP管取出ImL菌液静置lOmin，未溶解的化合物会沉淀在EP管底部。 取 600μL样品置于灭菌的1.5MLEP管中，12000rpm离心并用PBS洗两遍最后用 600μL PBS重悬菌体。加入2yL FITC标记的鼠 IgG(购自eBioscience公司），室温避光孵育1 小时。随后12000rpm离心并用PBS洗两遍最后用600 μ L PBS重悬菌体。取200 μ L样品 置于96孔黑板中测定荧光吸收值，激发波长为495nm ;发射波长为520nm。同时取200 μ L 样品置于96孔透明板中测定A6c?的吸收值。根据下面公式计算不同样品中每单位金黄色 葡萄球菌所含的SPA含量。每个样品做三个复孔作为平行对照。
[0107] 每单位菌所含的SPA含量=RFU/A_
[0108] 从附图3中可以看出，SD-B-9和SD-B-15可以明显的降低金黄色葡萄球菌细胞壁 上SPA的含量，并且与酶活水平上的抑制活性有较好的浓度相关性。
[0109] 3.蛋白质印迹法（Western Blotting)实验验证3,6_二取代[1，2, 4]三唑 [3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物对细胞壁SPA含量的影响
[0110] 本实验以3, 6-二取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物中的SD-B-9 为例。
[0111] 挑取金黄色葡萄球菌Newman菌株以及金黄色葡萄球菌Newman菌株SrtA单克隆 置于TSB培养基中培养过夜。次日按照I :200将过夜菌重新接种到新鲜的TSB培养基中， 同时加入不同浓度的化合物SD-B-9以及阳性化合物MTSET和阴性对照（200 μ M化合物 SD-B-1)，37°C摇床中培养，转速为230rpm。当菌生长至A6c?为3. 0时取ImL菌液置于干净的 1.5mL EP管中，12000rpm离心并用磷酸盐缓冲液（PBS)洗一遍最后用ImL PBS重悬菌体， 加入1 μ L浓度为5mg/mL的溶葡球菌酶（Iysostaphin)混匀后置于37?裂解样品30min。 7000g离心20min，取20 μ L上清（含有细胞壁上的SPA)加入20 μ L2 X十二烷基苯磺酸钠 (SDS)上样缓冲液，该样品用于细胞壁SPA的检测。弃掉上清后用40 μ L2 X SDS上样缓冲 液重悬原生质体，该样品用于ClpP的检测。所有样品置于KKTC煮沸IOmin使蛋白充分变 性。
[0112] 使用10%SDS_PAGE胶，将所制的胶放入电泳槽内固定好，然后在电泳槽内加满电 泳缓冲液，小心拔去梳子后上样10 μ L。接通电源，电泳电压120V，电泳时间75min。
[0113] 将滤纸、聚偏二氟乙烯膜（PVDF)剪成与凝胶相同大小，先将PVDF膜在甲醇中浸泡 10s，再在去离子水中浸泡Imin后与滤纸、凝胶一起放入电转移缓冲液中。按夹心法依次将 滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸顺序放好，小心去除所有气泡，按照PVDF膜位于阳极、凝胶位于阴 极接通半干式转膜仪转膜35min。
[0114] 转膜结束后取出PVDF膜，去离子水洗涤后将PVDF膜浸入用TBST配置的含5%脱 脂奶粉的封闭液中，置摇床上缓慢摇动，室温封闭2h。
[0115] 取出已封闭的PVDF膜，浸于TBST缓冲液中于摇床上缓慢洗涤3次，15min/次。然 后加入6mL用TBST配置的一抗孵育液中（分别为1:4000鼠抗SPA抗体、1:2000兔抗ClpP 抗体），室温孵育2h。
[0116] 一抗孵育后的PVDF膜用TBST漂洗3次，15min/次，然后加入6mL用TBST配置的 二抗孵育液中（分别为1 : 4000抗鼠抗体、1 : 4000抗兔抗体），室温孵育2h。二抗孵育 后的PVDF膜用TBST漂洗3次，15min/次。
[0117] 在暗室中将PVDF膜置于保鲜膜上，取500 μ L ECL试剂盒中等体积的A液和B液 混合，混匀后加在膜的表面，反应Imin后，吸去多余液体，保鲜膜封膜，固定在暗盒内。将X 光片放于膜上，曝光IOs到3min后（根据发光强度调整时间），取出X光片置显影液3min， 自来水冲洗底片，放入定影液中，待条带清晰后取出，自来水冲洗后晾干保存。
[0118] 附图4的Western实验结果显示浓度为50 μ M到200 μ M的化合物SD-B-9可以浓 度依赖性的降低金黄色葡萄球菌细胞壁上SPA的含量，间接的在活体水平上证明了化合物 SD-B-9对金黄色葡萄球菌转肽酶SrtA的抑制作用。
[0119] 4. 3, 6-二取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物对金黄色葡萄球菌 与纤维蛋白原（Fibrinogen)包埋的板粘附的影响
[0120] 本实验以3, 6-二取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物中的SD-B-9 和SD-B-15为例。
[0121] 挑取金黄色葡萄球菌Newman菌株以金黄色葡萄球菌Newman菌株SrtA单克隆置 于TSB培养基中培养过夜。次日按照I :200将过夜菌重新接种到新鲜的TSB培养基中，同 时加入不同浓度的SD-B-9和SD-B-15,37°C摇床中培养，转速为230rpm。当菌生长至A_ 为0. 5时取800 μ L样品置于干净的I. 5mL EP管中（该时间点作为Oh)，12000rpm离心并 用PBS洗两遍最后用800 μ L PBS重悬菌体。之后每隔0.5h取一次样品，分别在0.5h、lh、 I. 5h、2h、2. 5h取样品并重复上述操作。样品收集结束后取200 μ L样品加入到纤维蛋白原 包埋的96孔板中，同时每个样品做三个平行对照，37°C培养箱中孵育两小时保证金黄色葡 萄球菌与96孔板中的纤维蛋白充分粘附。孵育结束后小心弃掉上清并用200 μ L PBS洗掉 未粘附的金黄色葡萄球菌。随后加入100 μ L4%戊二醛溶液，室温交联lh。然后弃掉上清后 用200 μ L PBS清洗一遍，加入100 μ L结晶紫溶液对粘附在板上的金黄色葡萄球菌进行染 色，室温染色lh。染色结束后弃掉上清并用200 μ L PBS清洗两遍，用锡箔纸包住板在烘箱 内烘干。随后加入200 μ L10%(V/V)冰乙酸溶解孔内的样品测定A57tl的吸收值（测试结果 列于附图5)。
[0122] 附图5中的实验结果显示用浓度为100 μ M的化合物SD-B-9和SD-B-15处理过的 金黄色葡萄球菌可以降低细菌与包埋有纤维蛋白原的96孔板的粘附，其中浓度从50 μ M到 200 μ M的化合物SD-B-9可以浓度依赖性的降低金黄色葡萄球菌与包埋有纤维蛋白原的96 孔板的粘附。
[0123] 实验实施例三3, 6-二取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物对治疗 金黄色葡萄球菌感染的小鼠的效果
[0124] 将28只6-8周BAL B/C小鼠进行随机分成两组，每组14只：第一组为阴性对照 组，不注射任何药物；第二组为SD-B-9组，腹腔注射SD-B-9水溶液，每只老鼠注射剂量为 40mg/Kg，每日 给药两次。SD-B-9组老鼠麻醉前Ih预先腹腔注射1次化合物。两组每只小 鼠腹腔注射120 μ L1%戊巴比妥钠进行麻醉，对麻醉好的小鼠眼眶静脉注射IX IO7金黄色 葡萄球菌Newman菌株，注射完成后小鼠无死亡。大约2-3h后，待小鼠全部苏醒。SD-B-9组 每日给药两次，观察小鼠的存活情况。用SPSS软件绘制小鼠的生存曲线（图6)，并通过对数 轶（log-rank)检验计算实验组与对照组的显著性差异。log-rank中P值为2. 77 X ΚΓ6, P 值小于0. 00001，实验组与对照组存在显著性差异。
【主权项】
1. 一种如下通式（I)所示的3, 6-二取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合 物及其药学上可以接受的盐或药学上可以接受的溶剂合物：其中，Rl和R2各自独立地为C1-C6烷基、C3-C6环烷基、取代或未取代的C6-C12芳基 和取代或未取代的5-9元杂环基，其中上述用于取代的取代基为选自C1-C6直链或支链烷 基、C1-C6烷氧基、卤素、氨基、羟基、硝基、氰基、羧基和磺酸基中的1至3个取代基。2. 根据权利要求1所述的化合物及其药学上可以接受的盐或药学上可以接受的溶剂 合物，其特征在于， Rl选自取代或未取代的苯基、取代或未取代的萘基、取代或未取代的吡啶基、取代或未 取代的呋喃基、取代或未取代的吡咯基、取代或未取代的吲哚基、取代或未取代的喹啉基、 取代或未取代的咪唑基和取代或未取代的苯并咪唑基，其中上述用于取代的取代基为选自 C1-C6直链或支链烷基、C1-C6烷氧基、羰基C1-C6烷基、卤素、氨基、羟基、硝基、氰基、羧基 和磺酸基中的1至3个取代基； R2选自C1-C6烷基、C3-C6环烷基、取代或未取代的苯基、取代或未取代的萘基、取代 或未取代的吡啶基、取代或未取代的呋喃基、取代或未取代的吡咯基、取代或未取代的噻吩 基、取代或未取代的吲哚基、取代或未取代的喹啉基、取代或未取代的咪唑基和取代或未取 代的苯并咪唑基，其中上述用于取代的取代基为选自C1-C6直链或支链烷基、C1-C6烷氧 基、羰基C1-C6烷基、卤素、氨基、羟基、硝基、氰基、羧基和磺酸基中的1至3个取代基。3. 根据权利要求1所述的化合物及其药学上可以接受的盐或药学上可以接受的溶剂 合物，其特征在于， Rl选自取代或未取代的苯基、取代或未取代的萘基、取代或未取代的吡啶基、取代或未 取代的呋喃基、取代或未取代的吡咯基、取代或未取代的吲哚基、取代或未取代的喹啉基、 取代或未取代的咪唑基和取代或未取代的苯并咪唑基，其中上述用于取代的取代基为选自 CI-C4直链或支链烷基、CI-C4烷氧基、卤素、氨基、羟基、硝基、氰基、羧基和磺酸基中的1至 3个取代基； R2选自C1-C6烷基、C3-C6环烷基、取代或未取代的苯基、取代或未取代的萘基、取代 或未取代的吡啶基、取代或未取代的呋喃基、取代或未取代的吡咯基、取代或未取代的噻吩 基、取代或未取代的吲哚基、取代或未取代的咪唑基和取代或未取代的苯并咪唑基，其中上 述用于取代的取代基为选自C1-C4直链或支链烷基、C1-C4烷氧基、卤素、氨基、羟基、硝基、 氰基、羧基和磺酸基中的1至3个取代基。4. 根据权利要求1所述的化合物及其药学上可以接受的盐或药学上可以接受的溶剂 合物，其特征在于， Rl选自苯基、1至3个甲氧基取代的苯基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、3, 4, 5 或6-甲基-2-吡啶基、2, 4, 5或6-甲基-2-吡啶基、2或3-甲基-2-吡啶基、3, 4, 5或 6_氣_2_批陡基、2, 4, 5或6_氣_2_批陡基、2或3_氣_2_批陡基、3, 4, 5或6_氣_2_批 啶基、2, 4, 5或6-氯-2-吡啶基、2或3-氯-2-吡啶基、3, 4, 5或6-溴-2-吡啶基、2, 4, 5 或6_漠_2_批陡基、2或3_漠_2_批陡基、2, 3_二氣_4_批陡基、2, 5_二氣_4_批陡基、 2, 6- 二氣-4-批陡基、3, 4, 5或6-甲氧基批陡基、2, 4, 5或6-甲氧基批陡基、2或 3_甲氧基_2-批陡基、3, 4, 5或6-二氣甲基?比陡基、2, 4, 5或6-二氣甲基?比陡基、 2或3-三氟甲基-2-吡啶基、2或3-吡咯基、2, 3, 4, 5, 6或7-吲哚基、2, 3, 4, 5, 6, 7或8-吲 哚基、4,或5-咪唑基、2, 4, 5, 6或7-苯并咪唑基、呋喃基； R2选自甲基、乙基、丙基、异丙基、环丙基、正丁基、叔丁基、环丁基、环戊基、环己基、苯 基、2, 3或4-甲基苯基、2, 3或4-叔丁基苯基、2, 3或4-甲氧基苯基、2, 3或4-乙氧基苯基、 3, 4, 5-三甲氧基苯基、2, 3或4-氨基苯基、2, 3或4-碘代苯基、2, 3或4-氰基苯基、2, 3或 4-羧基苯基、2, 3或4-硝基苯基、2, 3或4-羟基苯基、3, 4, 5-三羟基苯基、2, 3或4-磺酸基 苯基、萘基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、3, 4, 5或6-甲基-2-吡啶基、2, 4, 5或6-甲 基-2_批陡基、2或3_甲基_2_批陡基、3, 4, 5或6_氣_2_批陡基、2, 4, 5或6_氣_2_批 啶基、2或3-氟-2-吡啶基、3, 4, 5或6-氯-2-吡啶基、2, 4, 5或6-氯-2-吡啶基、2或 3_氣_2_批陡基、3, 4, 5或6_漠_2_批陡基、2, 4, 5或6_漠_2_批陡基、2或3_漠_2_批 陡基、2, 3_二氣_4_批陡基、2, 5_二氣_4_批陡基、2, 6_二氣_4_批陡基、3, 4, 5或6_甲氧 基?比陡基、2, 4, 5或6-甲氧基?比陡基、2或3-甲氧基?比陡基、3, 4, 5或6-二氣 甲基_2_批陡基、2, 4, 5或6-二氣甲基批陡基、2或3-二氣甲基批陡基、2或3-咲 喃基、2或3-噻吩基、2或3-吡咯基、2, 3, 4, 5, 6或7-吲哚基，2, 3, 4, 5, 6, 7或8-吲哚基、 4或5-咪唑基、2, 4, 5, 6或7-苯并咪唑基。5. 根据权利要求1所述的化合物及其药学上可以接受的盐或药学上可以接受的溶剂 合物，其特征在于， Rl选自苯基、1至3个甲氧基取代的苯基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-吲哚基 和2-呋喃基； R2选自苯基、4-甲氧基苯基、2-乙氧基苯基、4-乙氧基苯基、3-磺酸钠苯基、2-甲基 苯基、3-甲基苯基、4-甲基苯基、4-叔丁基苯基、2-碘代苯基、4-氨基苯基、3, 4, 5-三羟基 苯基、3, 4, 5-三甲氧基苯基、萘基、2-呋喃基、2-吡咯基、2-吲哚基、4-吡啶基、3-吡啶基、 2-吡啶基、2-噻吩基.6. 如权利要求1所述的化合物及其药学上可以接受的盐或药学上可以接受的溶剂合 物，其特征在于，所述化合物为以下通式之一所示的化合物：其中，R2的定义与权利要求1-5任一项所述对通式（I)中的R2的定义一样，R3不存在 或者选自C1-C6直链或支链烷基、C1-C6烷氧基、卤素、氨基、羟基和磺酸基中的1至3个取 代基，R3优选不存在或者为选自甲基、乙基、丙基、正丁基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、 卤素、氨基、羟基和磺酸基中的1至3个取代基。7.如权利要求1所述化合物及其药学上可以接受的盐或药学上可以接受的溶剂合物， 其中，所述化合物为选自下列化合物中的一种化合物：8. 权利要求1-7任一项所述的化合物及其药学上可以接受的盐或药学上可以接受的 溶剂合物在制备抑制革兰氏阳性菌转肽酶SrtA的抑制剂中的应用，其中，所述革兰氏阳性 菌优选包括金黄色葡萄球菌、酿脓杆菌、炭疽杆菌和肺炎链球菌。9. 权利要求1-7任一项所述的化合物及其药学上可以接受的盐或药学上可以接受的 溶剂合物在制备用于治疗革兰氏阳性菌转肽酶SrtA为靶点的革兰氏阳性病原菌感染疾病 的药物中的应用，其中，所述革兰氏阳性菌优选包括金黄色葡萄球菌、酿脓杆菌、炭疽杆菌 和肺炎链球菌。10. -种用于治疗革兰氏阳性菌感染的疾病的药物组合物，其特征在于，所述组合物包 含治疗有效量的选自权利要求1-7任一项所述的化合物及其药学上可以接受的盐或药学 上可以接受的溶剂合物或者其混合物中的一种或多种作为活性成分，其中，所述革兰氏阳 性菌优选包括金黄色葡萄球菌、酿脓杆菌、炭疽杆菌和肺炎链球菌。
【专利摘要】本发明公开了具有如下通式(I)所示的3,6-二取代[1,2,4]三唑[3,4-b][1,3,4]噻二唑类化合物及其药学上可以接受的盐或药学上可以接受的溶剂合物，其可以作为包括金黄色葡萄球菌、酿脓杆菌、炭疽杆菌和肺炎链球菌在内的革兰氏阳性菌转肽酶SrtA抑制剂，可以应用于制备治疗以革兰氏阳性菌例如金黄色葡萄球菌、酿脓杆菌、炭疽杆菌和肺炎链球菌等转肽酶SrtA为靶点的病原菌感染性疾病的药物。本发明在一定程度上避免了病原菌由于选择压力而产生耐药性，减轻了持续出现的耐药病原菌对人类健康的威胁。
【IPC分类】A61K31/444, A61K31/4439, A61P31/04, A61K31/433, C07D513/04
【公开号】CN104892639
【申请号】CN201410081218
【发明人】杨财广, 罗成, 巩守哲, 刘洪川, 张瑞涵, 张婕, 蒋华良
【申请人】中国科学院上海药物研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年3月6日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药物学领域，尤其涉及3, 6-二取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻 二唑类化合物及其药学上可以接受的盐或药学上可以接受的溶剂合物，以及在作为包括金 黄色葡萄球菌、酿脓杆菌、炭疽杆菌和肺炎链球菌等在内的革兰氏阳性菌转肽酶SrtA抑制 剂以及在制备治疗以革兰氏阳性菌例如金黄色葡萄球菌、酿脓杆菌、炭疽杆菌和肺炎链球 菌等转肽酶SrtA为靶点的病原菌感染性疾病的药物中的用途。
【背景技术】
[0002] 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)属于革兰氏阳性病原菌，具有很强 的感染性和致病性（Archer, G. L.，Staphylococcus aureus:a well-armed pathogen. Clin Infect Disl998, 26(5)，1179-8L)。多年来抗生素的滥用导致耐药性菌株的出现， 比如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin resistant Staphylococcus aureus， MRSA)(Hiramatsu etc., The emergence and evolution of methici11 in-resistant Staphylococcus aureus. Trends Microbiol2001, 9 (10)，486-93.)。在美国，MRSA 引起的感 染导致的死亡人数已经超过了艾滋病感染引起的死亡人数（Klevens, R. M. etc.，Invasive methici11 in-resistant Staphylococcus aureus infections in the United States. JAMA2007, 298 (15)，1763-71.)。面对病原菌耐药性问题日益严峻的挑战，人们需要不断地 发展全新的抗病原菌感染的策略以应对持续出现的耐药病原菌对人类健康的威胁。
[0003] 金黄色葡萄球菌超强的感染性和致病性与其细胞壁上锚定的表面蛋白息息相 关。金黄色葡萄球菌通常通过其表面的黏附素（最主要是一些表面蛋白）识别宿主细 胞表面的特异性受体而粘附到宿主的特定器官或组织，这是金黄色葡萄球菌侵袭宿主 并引起进一步感染的基础（Schneewind, 0·; Missiakas, D. M.，Protein secretion and surface display in Gram-positive bacteria, Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 2012, 367 (1592)，1123-39.)。芝加哥大学Olaf教授领导的研究小组发现在金黄色 葡萄球菌中多种重要的表面蛋白（例如ClfA、ClfB、FnBPA、FnBPB、SPA等）穿过胞质膜 后由转肽酶SrtA通过转肽作用锚定到细胞壁上（Mazmanian, S. Κ· Etc.，StaphyIococcus aureus sortase, an enzyme that anchors surface proteins to the cell wall. Sciencel999, 285 (5428)，760-3.)。此外，敲除转肽酶SrtA的菌株在培养基中没有表现出 生长障碍，这样就很有可能避免由于选择压力而产生耐药性。
[0004] 转肽酶SrtA作为抗金黄色葡萄球菌乃至革兰氏阳性病原菌感染的全新靶标 受到了极大地关注。革兰氏阳性病原菌SrtA的功能被确定以后，SrtA作为抗革兰氏 阳性病原菌的候选革G标受到了极大关注（Maresso，A.W. etc. ,Sortase as a target of anti-infective therapy. Pharmacol Rev2008, 60(I), 128-41)〇
【发明内容】
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明的一个目的是提供一种3,6_二取代[1，2, 4]三唑 [3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物及其药学上可以接受的盐或药学上可以接受的溶剂合物。
[0006] 本发明的另一个目的是提供根据本发明的3, 6-二取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物及其药学上可以接受的盐或药学上可以接受的溶剂合物在制备抑 制包括金黄色葡萄球菌、酿脓杆菌、炭疽杆菌和肺炎链球菌等在内的革兰氏阳性菌转肽酶 SrtA的抑制剂中的应用。
[0007] 本发明的再一个目的是提供根据本发明的3, 6-二取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物及其药学上可以接受的盐或药学上可以接受的溶剂合物在制备用 于治疗与转肽酶SrtA相关的疾病的药物中的应用，尤其是在制备用于治疗包括金黄色葡 萄球菌、酿脓杆菌、炭疽杆菌和肺炎链球菌等在内的革兰氏阳性菌感染的疾病的药物中的 应用。
[0008] 本发明的又一目的是提供包含治疗有效量的选自根据本发明的3, 6-二取代 [1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物、其药学上可以接受的盐或药学上可以接受 的溶剂合物或者其混合物中的一种或多种作为活性成分的药物组合物。
[0009] 本发明的又一目的是提供一种治疗与转肽酶SrtA相关的疾病的方法，所述方 法包括向患者给药治疗有效量的选自根据本发明的3,6_二取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物、其药学上可以接受的盐或药学上可以接受的溶剂合物或者其混 合物中的一种或多种作为活性成分。
[0010] 为了实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：
[0011] 本发明提供一种如下通式（I)所示的3, 6-二取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4] 噻二唑类化合物及其药学上可以接受的盐或药学上可以接受的溶剂合物：
[0012]
[0013] 其中，Rl和R2各自独地为U1-U6炕盎、U3-U 6补炕盎、取代现禾取代的C6-C12芳 基和取代或未取代的5-9元杂环基，其中上述用于取代的取代基为选自C 1-C6直链或支链烷 基、C1-C6烷氧基、卤素、氣基、羟基、硝基、氛基、竣基和横酸基中的1至3个取代基；
[0014] 优选地，
[0015] Rl选自取代或未取代的苯基、取代或未取代的萘基、取代或未取代的吡啶基、取代 或未取代的呋喃基、取代或未取代的吡咯基、取代或未取代的吲哚基、取代或未取代的喹啉 基、取代或未取代的咪唑基和取代或未取代的苯并咪唑基，其中上述用于取代的取代基为 选自C 1-C6直链或支链烷基、C1-C6烷氧基、羰基C 1-C6烷基、卤素、氨基、羟基、硝基、氰基、羧 基和磺酸基中的1至3个取代基；
[0016] Rl优选选自取代或未取代的苯基、取代或未取代的萘基、取代或未取代的吡啶基、 取代或未取代的呋喃基、取代或未取代的吡咯基、取代或未取代的吲哚基、取代或未取代的 喹啉基、取代或未取代的咪唑基和取代或未取代的苯并咪唑基，其中上述用于取代的取代 基为选自C1-C4直链或支链烷基、C1-C4烷氧基、卤素、氨基、羟基、硝基、氰基、羧基和磺酸基 中的1至3个取代基；
[0017] Rl更优选选自苯基、1至3个甲氧基取代的苯基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、 3, 4, 5或6-甲基-2-吡啶基、2, 4, 5或6-甲基-2-吡啶基、2或3-甲基-2-吡啶基、3, 4, 5 或6-氣-2_批陡基、2, 4, 5或6_氣_2_批陡基、2或3_氣_2_批陡基、3, 4, 5或6_氣_2_批 啶基、2, 4, 5或6-氯-2-吡啶基、2或3-氯-2-吡啶基、3, 4, 5或6-溴-2-吡啶基、2, 4, 5 或6_漠_2_批陡基、2或3_漠_2_批陡基、2, 3_二氣_4_批陡基、2, 5_二氣_4_批陡基、 2, 6- 二氣-4-批陡基、3, 4, 5或6-甲氧基?比陡基、2, 4, 5或6-甲氧基批陡基、2或 3_甲氧基_2-批陡基、3, 4, 5或6-二氣甲基?比陡基、2, 4, 5或6-二氣甲基?比陡基、 2或3-三氟甲基-2-吡啶基、2或3-吡咯基、2, 3, 4, 5, 6或7-吲哚基、2, 3, 4, 5, 6, 7或8-吲 哚基、4或5-咪唑基、2, 4, 5, 6或7-苯并咪唑基、呋喃基；更优选选自苯基、1至3个甲氧基 取代的苯基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-吲哚基和2-呋喃基；
[0018] 优选地，
[0019] R2选自C1-C6烷基、C3-C6环烷基、取代或未取代的苯基、取代或未取代的萘基、取代 或未取代的吡啶基、取代或未取代的呋喃基、取代或未取代的吡咯基、取代或未取代的噻吩 基、取代或未取代的吲哚基、取代或未取代的喹啉基、取代或未取代的咪唑基和取代或未取 代的苯并咪唑基，其中上述用于取代的取代基为选自C 1-C6直链或支链烷基、C1-C6烷氧基、 羰基C 1-C6烷基、卤素、氨基、羟基、硝基、氰基、羧基和磺酸基中的1至3个取代基；
[0020] R2优选选自C1-C6烷基、C3-C6环烷基、取代或未取代的苯基、取代 或未取代的萘基、 取代或未取代的吡啶基、取代或未取代的呋喃基、取代或未取代的吡咯基、取代或未取代的 噻吩基、取代或未取代的吲哚基、取代或未取代的咪唑基和取代或未取代的苯并咪唑基，其 中上述用于取代的取代基为选自C 1-C4直链或支链烷基、C1-C4烷氧基、卤素、氨基、羟基、硝 基、氰基、羧基和磺酸基中的1至3个取代基；
[0021] R2更优选选自甲基、乙基、丙基、异丙基、环丙基、正丁基、叔丁基、环丁基、环戊基、 环己基、苯基、2, 3或4-甲基苯基、2, 3或4-叔丁基苯基、2, 3或4-甲氧基苯基、2, 3或4-乙 氧基苯基、3, 4, 5-三甲氧基苯基、2, 3或4-氨基苯基、2, 3或4-碘代苯基、2, 3或4-氰基苯 基、2, 3或4-羧基苯基、2, 3或4-硝基苯基、2, 3或4-羟基苯基、3, 4, 5-三羟基苯基、2, 3 或4-磺酸基苯基、萘基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、3, 4, 5或6-甲基-2-吡啶基、 2, 4, 5或6-甲基-2-吡啶基、2或3-甲基-2-吡啶基、3, 4, 5或6-氟-2-吡啶基、2, 4, 5或 6_氣_2_批陡基、2或3_氣_2_批陡基、3, 4, 5或6_氣_2_批陡基、2, 4, 5或6_氣_2_批 啶基、2或3-氯-2-吡啶基、3, 4, 5或6-溴-2-吡啶基、2, 4, 5或6-溴-2-吡啶基、2或 3_漠_2_批陡基、2, 3_二氣_4_批陡基、2, 5_二氣_4_批陡基、2, 6_二氣_4_批陡基、3, 4, 5 或6-甲氧基批陡基、2, 4, 5或6-甲氧基批陡基、2或3-甲氧基批陡基、3, 4, 5 或6-三氟甲基-2-吡啶基、2, 4, 5或6-三氟甲基-2-吡啶基、2或3-三氟甲基-2-吡啶 基、2或3-呋喃基、2或3-噻吩基、2或3-吡咯基、2, 3, 4, 5, 6或7-吲哚基，2, 3, 4, 5, 6, 7 或8-吲哚基、4或5-咪唑基、2, 4, 5, 6或7-苯并咪唑基；
[0022] R2更优选选自苯基、4-甲氧基苯基、2-乙氧基苯基、4-乙氧基苯基、3-磺酸钠 苯基、2-甲基苯基、3-甲基苯基、4-甲基苯基、4-叔丁基苯基、2-碘代苯基、4-氨基苯基、 3, 4, 5-三羟基苯基、3, 4, 5-三甲氧基苯基、萘基、2-呋喃基、2-吡咯基、2-吲哚基、4-吡啶 基、3-吡啶基、2-吡啶基、2-噻吩基
[0023] 更优选地，所述具有通式（I)结构的表示的3, 6-二取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物及其药学上可以接受的盐或药学上可以接受的溶剂合物为以下通 式之一所示的化合物：
[0024]
[0025] 其中，R2的定义与上述对通式（I)中的R2的定义一样，R3不存在或者选自C1-C6 直链或支链烷基、C1-C6烷氧基、卤素、氨基、羟基和磺酸基中的1至3个取代基，R3优选不 存在或者为选自甲基、乙基、丙基、正丁基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、卤素、氨基、羟 基和磺酸基中的1至3个取代基。
[0026] 在本申请中，卤素包括氟、氯、溴和碘。
[0027] 最优选地，所述具有通式⑴所示结构的3, 6-二取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物及其药学上可以接受的盐或药学上可以接受的溶剂合物为选自下 列化合物中的一种化合物：
[0028]
[0034] 本发明还提供了所述3, 6-二取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物 及其药学上可以接受的盐或药学上可以接受的溶剂合物在制备抑制革兰氏阳性菌转肽酶 SrtA的抑制剂中的应用。
[0035] 本发明还提供了所述3, 6-二取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物 及其药学上可以接受的盐或药学上可以接受的溶剂合物在制备用于治疗革兰氏阳性菌转 肽酶SrtA为靶点的革兰氏阳性病原菌感染疾病的药物中的应用。
[0036] 本发明还提供一种药物组合物，该组合物包含治疗有效量的选自所述3, 6-二取 代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物及其药学上可以接受的盐或药学上可以 接受的溶剂合物或者其混合物中的一种或多种作为活性成分，该药物组合物用于治疗革兰 氏阳性菌感染的疾病。
[0037] 本发明还提供了所述药物组合物在制备用于治疗的革兰氏阳性菌感染的疾病的 药物中的应用。
[0038] 其中，所述革兰氏阳性菌优选包括金黄色葡萄球菌、酿脓杆菌、炭疽杆菌和肺炎链 球菌等。
[0039] 本发明还提供一种治疗与转肽酶SrtA相关的疾病的方法，所述方法包括向患者 施加治疗有效量的选自所述3, 6-二取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物、 其药学上可以接受的盐或药学上可以接受的溶剂合物或者其混合物中的一种或多种作为 活性成分的药物组合物。
[0040] 本发明的3, 6-二取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物及其药学上 可以接受的盐或药学上可以接受的溶剂合物通过抑制转肽酶SrtA发挥抑制包括金黄色葡 萄球菌、酿脓杆菌、炭疽杆菌和肺炎链球菌在内的革兰氏阳性菌感染能力。从而在一定程度 上避免了病原菌由于选择压力而产生耐药性，减轻了持续出现的耐药病原菌对人类健康的 威胁。
【附图说明】
[0041] 图1显示通过基于十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳胶（SDS-PAGE)的体外 表面蛋白质转肽活性测定方法验证3, 6-二取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化 合物对转肽酶SrtA的抑制；
[0042] 图2显示3, 6-二取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物对金黄色葡 萄球菌Newman菌株（S. aureus Newman)的生长曲线的影响；
[0043] 图3显示通过异硫氰酸荧光素标记的免疫球蛋白G(FITC-IgG)实验检测3, 6-二 取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物对细胞壁SPA含量的影响；
[0044] 图4显示蛋白质印迹法（Western Blotting)检测化合物3, 6-二取代[1，2, 4]三 唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物对细胞壁SPA含量的影响；
[0045] 图5显示3, 6-二取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物对金黄色葡 萄球菌与纤维蛋白原（Fibrinogen)包埋的板粘附的影响；
[0046] 图6显示3, 6-二取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物提高金黄色 葡萄球菌感染的小鼠生存率。
【具体实施方式】
[0047] 下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述。这些实施例仅是出于解释说明的目 的，而不是限制本发明的范围和实质。
[0048] 以下实施例药品的来源：底物Abz-LPATG-Dap(Dnp)-NH2由上海吉尔生化公司合 成；胰蛋白胨大豆肉汤（TSB)，Luria-Bertani培养基（LB)购自英国OXOID公司；FITC标 记的鼠 IgG购自eBioscience公司，蛋白质标准品（Marker)购自Fermentas公司；甘氨 酸、十二烷基磺酸钠（SDS)、二硫苏糖醇（DTT)、40%丙烯酰胺溶液和四甲基乙二胺（TEMED) 购自上海生工生物工程有限公司；溶葡球菌酶（Iysostaphin)购自Sigma公司；咪唑购自 Sigma-Fluka公司；其它试剂购自国药集团化学试剂有限公司。
[0049] 制各实施例
[0050] 本发明所述的3, 6-二取代-[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物及其 药学上可以接受的盐或药学上可以接受的溶剂合物可以通过如下路线制备：
[0052] 现以3-(4-吡啶基）-6-(3-苯磺酸钠基）-[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑 (SD-B-9)为例说明合成（即制备实施例19)。
[0053]
[0054] 步骤1:将15. 12g(0.1mol)吡啶-4-甲酸乙酯和10. 00g(0. 2mol)水合肼 (NH2NH2 · H2O)加入50mL乙醇中，回流反应24h，冷却至室温，溶液旋干，重结晶，得到 11. 62g(0. 085mol)吡啶-4-甲酰阱，产率 85%。
[0055] 1H NMR(DMS0-d6) :4, 61, 7. 71 (dd, J=4. 5, 1. 7), 8. 69 (dd, J=4. 5, I. 7), 10. 09.
[0056] 步骤 2:将 13. 71g(0.1mol)吡啶-4-甲酰阱和 8. 42g(150mmol)氢氧化钾（KOH) 加入200mL无水乙醇中，冰水浴冷却，缓慢滴加9. 90g(0. 13mol)二硫化碳（CS2)，室温反应 12h，反应结束后加过滤，得到22. 38g (0. 095mmol )钾盐，收率95%。
[0057] 步骤 3:将 25. 14g(0.1mol)钾盐和 20. 0g(0. 4mol)水合肼（NH2NH2 ·Η20)加入 IOOmL 水中，回流反应24h，反应结束后盐酸调节pH为1，过滤，重结晶，得到13. 5g(0.07mmol)产 物4-氨基-3- (4-吡啶基）-1H-1，2, 4-三氮唑-5H-硫醇，产率70%。
[0058] 1H NMR (DMS0-d6) : 4. 62 (s，2H)，7. 72 (dd, 2H，J=4. 4, 1. 6)，8. 70 (dd, 2H，J=4. 4, 1. 6) ,10. 11 (s, 1H).
[0059] 步骤4 :将22.42g(0.1mol)间甲酸苯磺酸钠和118.97mg(lmol)二氯亚砜（S(0) Cl2)加入25mL茄形瓶中，回流反应8h，反应结束后，将二氯亚砜除去，得到23. 50g (95mmol) 间甲酰氯苯磺酸钠，产率95%。
[0060] 步骤 5 :将 386. 46mg(2mmol)4-氨基-3-(4-吡啶基）-1Η-1，2, 4-三氮唑-5H-硫 醇和485. 22mg (2mmol)间甲酰氯苯磺酸钠加入5mL三氯氧磷（P (0) Cl3)中，回流反应 24h，除去三氯氧磷（P(O)Cl3)，加入5mL水，搅拌0. 5h，固体用碱中和，过滤，重结晶，得到 76mg (0· 2mmol) 3- (4-吡啶基）-6- (3-苯磺酸钠基）-[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑， 产率10%。
[0061] lHNMR(DMS0-d6):7.66(t，lH，J=8Hz)，7.93(d，lH，J=4Hz)，8.07(d，lH，J=8Hz)，8. 23 (s, 1H), 8. 56 (m, 2H, ),9.03 (m, 2H).
[0062] 以与上述制备实施例相同的方式可以合成3, 6-二取代_[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物，现将本发明所涉及的3, 6-二取代-[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物合成以及核磁数据列于表1。
[0063] 表 1
[0064]
[0065]
[0066]
[0067] _υυοο」
[0069]
[0070]
[0071]
[0073]
[0074]
[0075]
[0076]
[0077] 以下为通式（I)所示的3, 6-二取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合 物抑制转肽酶SrtA活性实验。
[0078] 实骀实施例一分子水平h转狀酶SrtA活件抑制试骀
[0079] 1、转狀酶SrtA半抑制浓度（IC50)评价
[0080] 将3, 6-二取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物40mM二甲亚砜 (DMSO)溶液与转肽酶反应缓冲液（50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl)，150mM氯 化钠（NaCl)，5mM 氯化钙（CaCl2)，0· 1% 聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100)，pH 为 7.5) 混合，使化合物终浓度为〇. 8-400 μ M(从400 μ M开始等倍稀释），然后加入终浓度为 1 μ M的转肽酶Sa-SrtA或SP-SrtA，室温下孵育IOmin后加入终浓度为10 μ M的反应底 物 Abz-LPATG-Dap(Dnp)-NH2，用 SpectraMax Flex Station3 酶标仪连续监测酶反应过 程中荧光强度的变化得到酶反应动力学曲线，通过下面公式求出每个化合物的不同浓度 (0· 8-400 μ M)所对应的抑制率（%)，用 GraphPad Prism软件（San Diego, USA)的 Sigmoidal dose-response程序计算出IC5tl。活性小分子化合物IC5tl结果列入表2中。
[0081] 抑制率（%) = (1-Vi/V。）X 100%
[0082] Vi为酶反应动力学曲线的的线性部分求出的化合物的反应初速率，Vtl为不加化合 物时所求得的反应初速率。
[0083] 从表2中可以看出，3, 6-二取代-[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物 对转肽酶SrtA有抑制活性。
[0084] 表2化合物对转肽酶SrtA酶活抑制水平
[0085]
[0086]
[0087] _8」
[0089]
[0090]
[0091]
[0092]
[0093]
[0094] 附注：NA :没有活性；ND:没有测试。
[0095] 2.转肽实验验证3, 6-二取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物对转 肽酶SrtA的抑制活性
[0096] 实验以3, 6-二取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物中的SD-B-9 和SD-B-15为例。
[0097] 通过Ni-NTA柱以及Superdex Hiload75柱两步纯化得到纯度大于95%的蛋白。 转肽反应缓冲液为50mM Tris-HCl，150mM NaCl，5mM CaCl2, pH为7. 5。在50μ L的反应体 系中加入终浓度为200 μ g/ μ L的转肽酶Sa-SrtA或是转肽酶Sp-SrtA，化合物SD-B-9和 SD-B-15的终浓度为25-200 μ M，随后加入终浓度为300 μ g/μ L的表面蛋白SasX和IsdA 以及终浓度为3mM的另一个反应底物（Gly) 3,37°C培养箱中反应2h，随后加入2 X十二烷基 磺酸钠凝胶上样缓冲液（含有200mM二硫苏糖醇（DTT))于KKTC煮沸lOmin，使反应终止 并使蛋白充分变性。跑15%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)，上样量为 10 μ L，电泳电压120V，电泳时间150min，电泳结束后考马斯亮蓝快速染色液染色。凝胶成 像系统中观察拍照并保存实验结果。ImM阳性化合物（2-甲基硫代磺酸基乙基）三甲基溴 化铵（（2-(trimethylammonium) ethyl methanethiosulfonate Bromide, MTSET)作为对照 以及200 μ M化合物SD-B-I作为阴性对照。从图1中可以看出，化合物SD-B-9和SD-B-15 可以浓度依赖性的抑制转肽酶SrtA对表面蛋白SasX和IsdA的转肽作用。化合物SD-B-9 对转肽酶SrtA的抑制活性高于化合物SD-B-15, 200 μ M化合物SD-B-9几乎可以完全抑制 转肽酶SrtA对表面蛋白SasX和I sdA的转肽作用。
[0098] 实验实施例二活体细菌水平上对3, 6-二取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二 唑类化合物的活性验证
[0099] 1. 3, 6-二取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物对金黄色葡萄球菌 生长的影响
[0100] 挑取金黄色葡萄球菌Newman菌株（S. aureus Newman)、金黄色葡萄球菌RN4220菌 株（S. aureus RN4220)、表皮葡萄球菌145菌株（S. epidermidisl457)、枯草芽抱杆菌168 菌株（B.subtilisl68)、绿胺杆菌 PAOl 菌株（P.aeruginosa PA01)、大肠杆菌 DH5a 菌株 (E. coli DH5 a )单克隆置于胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB)或Luria-Bertani培养基（LB) 中37°C培养过夜。次日用新鲜的TSB或LB培养基稀释A 6c?至0. 01，37°C摇床中培养2h后 稀释A_至0. 005。取180 μ L菌液接种到96孔板中，然后加入20 μ L用TSB或LB稀释好 的一系列浓度的表1中SD-B系列的化合物（SD-B-1至SD-B-21，共21种化合物），使化合物 的终浓度为6. 25-200 μ M(化合物从200 μ M开始等倍稀释）。将96孔板置于37°C培养箱 中培养16h，次日肉眼观察每个孔中细菌的生长情况，测出化合物的最低抑制浓度（MIC)。 每个样品做三个平行孔，测试结果列于表3。从表3中可以看出，3, 6-二取代[1，2, 4]三唑 [3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物对金黄色葡萄球菌上述6种菌株的MIC均大于200 μ M。
[0101] 表3化合物的MIC测定结果
[0103] 挑取S. aureus Newman以及S. aureus Newman SrtA单克隆置于TSB培养基中培 养过夜。次日用新鲜的TSB培养基稀释A6c?至0. 01，37 °C摇床中培养2h后用新鲜的TSB培 养基稀释A6c?至0.005。取180μ L菌液接种到96孔板中，然后加入20μ L用TSB稀释好的 不同浓度的化合物SD-B-9,使化合物的终浓度为50 μ Μ、 200 μ Μ。将96孔板置于Spectra Max Flex Station3 (Molecular Device,美国）酶标仪中连续测定A66c!的吸收值，温度控制 为37°C，每Ih读一次数，连续读数10h。用GraphPad Prism软件绘制不同浓度的化合物对 应的金黄色葡萄球菌的生长曲线(如图2所示)。每个样品做三个平行孔。从附图2可以看 出，化合物SD-B-9对金黄色葡萄球菌Newman菌株的生长影响都很小，并且与野生型菌株的 生长情况类似。
[0104] 2、异硫氰酸荧光素标记的免疫球蛋白G(FITC-IgG)实验验证3,6_二取代[1，2, 4] 三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物对细胞壁SPA含量影响
[0105] 为了在细胞水平上验证活性化合物对金黄色葡萄球菌转肽酶Sa-SrtA的抑制作 用，发明人设计了基于FITC-IgG的检测金黄色葡萄球菌细胞壁SPA含量的实验。该实验基 于的原理是：金黄色葡萄球菌SrtA通过转肽作用将SPA锚定在细胞壁肽聚糖上的五个甘氨 酸交联桥上，从而将SPA呈递在金黄色葡萄球菌的表面。荧光素 FITC标记的鼠 IgG可以特 异性地识别细胞壁上的SPA从而结合在金黄色葡萄球菌表面上，这可以通过酶标仪测定荧 光信号值。通过检测单位细菌结合的免疫球蛋白IgG的量就可以间接得知金黄色葡萄球菌 中转肽酶SrtA的活性。
[0106] 挑取S. aureusNewman以及S. aureusNewman SrtA单克隆置于TSB培养基中培 养过夜。次日按照I :200将过夜菌液重新接种到新鲜的TSB培养基中，同时加入SD-B-9 或SD-B-15,使其终浓度分别为25μΜ、50μΜ、100μΜ、200μΜ、1πιΜ阳性化合物（2-甲基硫 代横酸基乙基）三甲基溴化铵（（2 -(trimethylammonium) ethyl methanethiosulfonate Bromide, MTSET)作为对照（附图3中的对照)，37°C摇床中培养，转速为230rpm。当菌生长至 A_为0. 5时用灭菌的EP管取出ImL菌液静置lOmin，未溶解的化合物会沉淀在EP管底部。 取 600μL样品置于灭菌的1.5MLEP管中，12000rpm离心并用PBS洗两遍最后用 600μL PBS重悬菌体。加入2yL FITC标记的鼠 IgG(购自eBioscience公司），室温避光孵育1 小时。随后12000rpm离心并用PBS洗两遍最后用600 μ L PBS重悬菌体。取200 μ L样品 置于96孔黑板中测定荧光吸收值，激发波长为495nm ;发射波长为520nm。同时取200 μ L 样品置于96孔透明板中测定A6c?的吸收值。根据下面公式计算不同样品中每单位金黄色 葡萄球菌所含的SPA含量。每个样品做三个复孔作为平行对照。
[0107] 每单位菌所含的SPA含量=RFU/A_
[0108] 从附图3中可以看出，SD-B-9和SD-B-15可以明显的降低金黄色葡萄球菌细胞壁 上SPA的含量，并且与酶活水平上的抑制活性有较好的浓度相关性。
[0109] 3.蛋白质印迹法（Western Blotting)实验验证3,6_二取代[1，2, 4]三唑 [3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物对细胞壁SPA含量的影响
[0110] 本实验以3, 6-二取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物中的SD-B-9 为例。
[0111] 挑取金黄色葡萄球菌Newman菌株以及金黄色葡萄球菌Newman菌株SrtA单克隆 置于TSB培养基中培养过夜。次日按照I :200将过夜菌重新接种到新鲜的TSB培养基中， 同时加入不同浓度的化合物SD-B-9以及阳性化合物MTSET和阴性对照（200 μ M化合物 SD-B-1)，37°C摇床中培养，转速为230rpm。当菌生长至A6c?为3. 0时取ImL菌液置于干净的 1.5mL EP管中，12000rpm离心并用磷酸盐缓冲液（PBS)洗一遍最后用ImL PBS重悬菌体， 加入1 μ L浓度为5mg/mL的溶葡球菌酶（Iysostaphin)混匀后置于37?裂解样品30min。 7000g离心20min，取20 μ L上清（含有细胞壁上的SPA)加入20 μ L2 X十二烷基苯磺酸钠 (SDS)上样缓冲液，该样品用于细胞壁SPA的检测。弃掉上清后用40 μ L2 X SDS上样缓冲 液重悬原生质体，该样品用于ClpP的检测。所有样品置于KKTC煮沸IOmin使蛋白充分变 性。
[0112] 使用10%SDS_PAGE胶，将所制的胶放入电泳槽内固定好，然后在电泳槽内加满电 泳缓冲液，小心拔去梳子后上样10 μ L。接通电源，电泳电压120V，电泳时间75min。
[0113] 将滤纸、聚偏二氟乙烯膜（PVDF)剪成与凝胶相同大小，先将PVDF膜在甲醇中浸泡 10s，再在去离子水中浸泡Imin后与滤纸、凝胶一起放入电转移缓冲液中。按夹心法依次将 滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸顺序放好，小心去除所有气泡，按照PVDF膜位于阳极、凝胶位于阴 极接通半干式转膜仪转膜35min。
[0114] 转膜结束后取出PVDF膜，去离子水洗涤后将PVDF膜浸入用TBST配置的含5%脱 脂奶粉的封闭液中，置摇床上缓慢摇动，室温封闭2h。
[0115] 取出已封闭的PVDF膜，浸于TBST缓冲液中于摇床上缓慢洗涤3次，15min/次。然 后加入6mL用TBST配置的一抗孵育液中（分别为1:4000鼠抗SPA抗体、1:2000兔抗ClpP 抗体），室温孵育2h。
[0116] 一抗孵育后的PVDF膜用TBST漂洗3次，15min/次，然后加入6mL用TBST配置的 二抗孵育液中（分别为1 : 4000抗鼠抗体、1 : 4000抗兔抗体），室温孵育2h。二抗孵育 后的PVDF膜用TBST漂洗3次，15min/次。
[0117] 在暗室中将PVDF膜置于保鲜膜上，取500 μ L ECL试剂盒中等体积的A液和B液 混合，混匀后加在膜的表面，反应Imin后，吸去多余液体，保鲜膜封膜，固定在暗盒内。将X 光片放于膜上，曝光IOs到3min后（根据发光强度调整时间），取出X光片置显影液3min， 自来水冲洗底片，放入定影液中，待条带清晰后取出，自来水冲洗后晾干保存。
[0118] 附图4的Western实验结果显示浓度为50 μ M到200 μ M的化合物SD-B-9可以浓 度依赖性的降低金黄色葡萄球菌细胞壁上SPA的含量，间接的在活体水平上证明了化合物 SD-B-9对金黄色葡萄球菌转肽酶SrtA的抑制作用。
[0119] 4. 3, 6-二取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物对金黄色葡萄球菌 与纤维蛋白原（Fibrinogen)包埋的板粘附的影响
[0120] 本实验以3, 6-二取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物中的SD-B-9 和SD-B-15为例。
[0121] 挑取金黄色葡萄球菌Newman菌株以金黄色葡萄球菌Newman菌株SrtA单克隆置 于TSB培养基中培养过夜。次日按照I :200将过夜菌重新接种到新鲜的TSB培养基中，同 时加入不同浓度的SD-B-9和SD-B-15,37°C摇床中培养，转速为230rpm。当菌生长至A_ 为0. 5时取800 μ L样品置于干净的I. 5mL EP管中（该时间点作为Oh)，12000rpm离心并 用PBS洗两遍最后用800 μ L PBS重悬菌体。之后每隔0.5h取一次样品，分别在0.5h、lh、 I. 5h、2h、2. 5h取样品并重复上述操作。样品收集结束后取200 μ L样品加入到纤维蛋白原 包埋的96孔板中，同时每个样品做三个平行对照，37°C培养箱中孵育两小时保证金黄色葡 萄球菌与96孔板中的纤维蛋白充分粘附。孵育结束后小心弃掉上清并用200 μ L PBS洗掉 未粘附的金黄色葡萄球菌。随后加入100 μ L4%戊二醛溶液，室温交联lh。然后弃掉上清后 用200 μ L PBS清洗一遍，加入100 μ L结晶紫溶液对粘附在板上的金黄色葡萄球菌进行染 色，室温染色lh。染色结束后弃掉上清并用200 μ L PBS清洗两遍，用锡箔纸包住板在烘箱 内烘干。随后加入200 μ L10%(V/V)冰乙酸溶解孔内的样品测定A57tl的吸收值（测试结果 列于附图5)。
[0122] 附图5中的实验结果显示用浓度为100 μ M的化合物SD-B-9和SD-B-15处理过的 金黄色葡萄球菌可以降低细菌与包埋有纤维蛋白原的96孔板的粘附，其中浓度从50 μ M到 200 μ M的化合物SD-B-9可以浓度依赖性的降低金黄色葡萄球菌与包埋有纤维蛋白原的96 孔板的粘附。
[0123] 实验实施例三3, 6-二取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合物对治疗 金黄色葡萄球菌感染的小鼠的效果
[0124] 将28只6-8周BAL B/C小鼠进行随机分成两组，每组14只：第一组为阴性对照 组，不注射任何药物；第二组为SD-B-9组，腹腔注射SD-B-9水溶液，每只老鼠注射剂量为 40mg/Kg，每日 给药两次。SD-B-9组老鼠麻醉前Ih预先腹腔注射1次化合物。两组每只小 鼠腹腔注射120 μ L1%戊巴比妥钠进行麻醉，对麻醉好的小鼠眼眶静脉注射IX IO7金黄色 葡萄球菌Newman菌株，注射完成后小鼠无死亡。大约2-3h后，待小鼠全部苏醒。SD-B-9组 每日给药两次，观察小鼠的存活情况。用SPSS软件绘制小鼠的生存曲线（图6)，并通过对数 轶（log-rank)检验计算实验组与对照组的显著性差异。log-rank中P值为2. 77 X ΚΓ6, P 值小于0. 00001，实验组与对照组存在显著性差异。
【主权项】
1. 一种如下通式（I)所示的3, 6-二取代[1，2, 4]三唑[3, 4-b] [1，3, 4]噻二唑类化合 物及其药学上可以接受的盐或药学上可以接受的溶剂合物：其中，Rl和R2各自独立地为C1-C6烷基、C3-C6环烷基、取代或未取代的C6-C12芳基 和取代或未取代的5-9元杂环基，其中上述用于取代的取代基为选自C1-C6直链或支链烷 基、C1-C6烷氧基、卤素、氨基、羟基、硝基、氰基、羧基和磺酸基中的1至3个取代基。2. 根据权利要求1所述的化合物及其药学上可以接受的盐或药学上可以接受的溶剂 合物，其特征在于， Rl选自取代或未取代的苯基、取代或未取代的萘基、取代或未取代的吡啶基、取代或未 取代的呋喃基、取代或未取代的吡咯基、取代或未取代的吲哚基、取代或未取代的喹啉基、 取代或未取代的咪唑基和取代或未取代的苯并咪唑基，其中上述用于取代的取代基为选自 C1-C6直链或支链烷基、C1-C6烷氧基、羰基C1-C6烷基、卤素、氨基、羟基、硝基、氰基、羧基 和磺酸基中的1至3个取代基； R2选自C1-C6烷基、C3-C6环烷基、取代或未取代的苯基、取代或未取代的萘基、取代 或未取代的吡啶基、取代或未取代的呋喃基、取代或未取代的吡咯基、取代或未取代的噻吩 基、取代或未取代的吲哚基、取代或未取代的喹啉基、取代或未取代的咪唑基和取代或未取 代的苯并咪唑基，其中上述用于取代的取代基为选自C1-C6直链或支链烷基、C1-C6烷氧 基、羰基C1-C6烷基、卤素、氨基、羟基、硝基、氰基、羧基和磺酸基中的1至3个取代基。3. 根据权利要求1所述的化合物及其药学上可以接受的盐或药学上可以接受的溶剂 合物，其特征在于， Rl选自取代或未取代的苯基、取代或未取代的萘基、取代或未取代的吡啶基、取代或未 取代的呋喃基、取代或未取代的吡咯基、取代或未取代的吲哚基、取代或未取代的喹啉基、 取代或未取代的咪唑基和取代或未取代的苯并咪唑基，其中上述用于取代的取代基为选自 CI-C4直链或支链烷基、CI-C4烷氧基、卤素、氨基、羟基、硝基、氰基、羧基和磺酸基中的1至 3个取代基； R2选自C1-C6烷基、C3-C6环烷基、取代或未取代的苯基、取代或未取代的萘基、取代 或未取代的吡啶基、取代或未取代的呋喃基、取代或未取代的吡咯基、取代或未取代的噻吩 基、取代或未取代的吲哚基、取代或未取代的咪唑基和取代或未取代的苯并咪唑基，其中上 述用于取代的取代基为选自C1-C4直链或支链烷基、C1-C4烷氧基、卤素、氨基、羟基、硝基、 氰基、羧基和磺酸基中的1至3个取代基。4. 根据权利要求1所述的化合物及其药学上可以接受的盐或药学上可以接受的溶剂 合物，其特征在于， Rl选自苯基、1至3个甲氧基取代的苯基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、3, 4, 5 或6-甲基-2-吡啶基、2, 4, 5或6-甲基-2-吡啶基、2或3-甲基-2-吡啶基、3, 4, 5或 6_氣_2_批陡基、2, 4, 5或6_氣_2_批陡基、2或3_氣_2_批陡基、3, 4, 5或6_氣_2_批 啶基、2, 4, 5或6-氯-2-吡啶基、2或3-氯-2-吡啶基、3, 4, 5或6-溴-2-吡啶基、2, 4, 5 或6_漠_2_批陡基、2或3_漠_2_批陡基、2, 3_二氣_4_批陡基、2, 5_二氣_4_批陡基、 2, 6- 二氣-4-批陡基、3, 4, 5或6-甲氧基批陡基、2, 4, 5或6-甲氧基批陡基、2或 3_甲氧基_2-批陡基、3, 4, 5或6-二氣甲基?比陡基、2, 4, 5或6-二氣甲基?比陡基、 2或3-三氟甲基-2-吡啶基、2或3-吡咯基、2, 3, 4, 5, 6或7-吲哚基、2, 3, 4, 5, 6, 7或8-吲 哚基、4,或5-咪唑基、2, 4, 5, 6或7-苯并咪唑基、呋喃基； R2选自甲基、乙基、丙基、异丙基、环丙基、正丁基、叔丁基、环丁基、环戊基、环己基、苯 基、2, 3或4-甲基苯基、2, 3或4-叔丁基苯基、2, 3或4-甲氧基苯基、2, 3或4-乙氧基苯基、 3, 4, 5-三甲氧基苯基、2, 3或4-氨基苯基、2, 3或4-碘代苯基、2, 3或4-氰基苯基、2, 3或 4-羧基苯基、2, 3或4-硝基苯基、2, 3或4-羟基苯基、3, 4, 5-三羟基苯基、2, 3或4-磺酸基 苯基、萘基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、3, 4, 5或6-甲基-2-吡啶基、2, 4, 5或6-甲 基-2_批陡基、2或3_甲基_2_批陡基、3, 4, 5或6_氣_2_批陡基、2, 4, 5或6_氣_2_批 啶基、2或3-氟-2-吡啶基、3, 4, 5或6-氯-2-吡啶基、2, 4, 5或6-氯-2-吡啶基、2或 3_氣_2_批陡基、3, 4, 5或6_漠_2_批陡基、2, 4, 5或6_漠_2_批陡基、2或3_漠_2_批 陡基、2, 3_二氣_4_批陡基、2, 5_二氣_4_批陡基、2, 6_二氣_4_批陡基、3, 4, 5或6_甲氧 基?比陡基、2, 4, 5或6-甲氧基?比陡基、2或3-甲氧基?比陡基、3, 4, 5或6-二氣 甲基_2_批陡基、2, 4, 5或6-二氣甲基批陡基、2或3-二氣甲基批陡基、2或3-咲 喃基、2或3-噻吩基、2或3-吡咯基、2, 3, 4, 5, 6或7-吲哚基，2, 3, 4, 5, 6, 7或8-吲哚基、 4或5-咪唑基、2, 4, 5, 6或7-苯并咪唑基。5. 根据权利要求1所述的化合物及其药学上可以接受的盐或药学上可以接受的溶剂 合物，其特征在于， Rl选自苯基、1至3个甲氧基取代的苯基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-吲哚基 和2-呋喃基； R2选自苯基、4-甲氧基苯基、2-乙氧基苯基、4-乙氧基苯基、3-磺酸钠苯基、2-甲基 苯基、3-甲基苯基、4-甲基苯基、4-叔丁基苯基、2-碘代苯基、4-氨基苯基、3, 4, 5-三羟基 苯基、3, 4, 5-三甲氧基苯基、萘基、2-呋喃基、2-吡咯基、2-吲哚基、4-吡啶基、3-吡啶基、 2-吡啶基、2-噻吩基.6. 如权利要求1所述的化合物及其药学上可以接受的盐或药学上可以接受的溶剂合 物，其特征在于，所述化合物为以下通式之一所示的化合物：其中，R2的定义与权利要求1-5任一项所述对通式（I)中的R2的定义一样，R3不存在 或者选自C1-C6直链或支链烷基、C1-C6烷氧基、卤素、氨基、羟基和磺酸基中的1至3个取 代基，R3优选不存在或者为选自甲基、乙基、丙基、正丁基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、 卤素、氨基、羟基和磺酸基中的1至3个取代基。7.如权利要求1所述化合物及其药学上可以接受的盐或药学上可以接受的溶剂合物， 其中，所述化合物为选自下列化合物中的一种化合物：8. 权利要求1-7任一项所述的化合物及其药学上可以接受的盐或药学上可以接受的 溶剂合物在制备抑制革兰氏阳性菌转肽酶SrtA的抑制剂中的应用，其中，所述革兰氏阳性 菌优选包括金黄色葡萄球菌、酿脓杆菌、炭疽杆菌和肺炎链球菌。9. 权利要求1-7任一项所述的化合物及其药学上可以接受的盐或药学上可以接受的 溶剂合物在制备用于治疗革兰氏阳性菌转肽酶SrtA为靶点的革兰氏阳性病原菌感染疾病 的药物中的应用，其中，所述革兰氏阳性菌优选包括金黄色葡萄球菌、酿脓杆菌、炭疽杆菌 和肺炎链球菌。10. -种用于治疗革兰氏阳性菌感染的疾病的药物组合物，其特征在于，所述组合物包 含治疗有效量的选自权利要求1-7任一项所述的化合物及其药学上可以接受的盐或药学 上可以接受的溶剂合物或者其混合物中的一种或多种作为活性成分，其中，所述革兰氏阳 性菌优选包括金黄色葡萄球菌、酿脓杆菌、炭疽杆菌和肺炎链球菌。
【专利摘要】本发明公开了具有如下通式(I)所示的3,6-二取代[1,2,4]三唑[3,4-b][1,3,4]噻二唑类化合物及其药学上可以接受的盐或药学上可以接受的溶剂合物，其可以作为包括金黄色葡萄球菌、酿脓杆菌、炭疽杆菌和肺炎链球菌在内的革兰氏阳性菌转肽酶SrtA抑制剂，可以应用于制备治疗以革兰氏阳性菌例如金黄色葡萄球菌、酿脓杆菌、炭疽杆菌和肺炎链球菌等转肽酶SrtA为靶点的病原菌感染性疾病的药物。本发明在一定程度上避免了病原菌由于选择压力而产生耐药性，减轻了持续出现的耐药病原菌对人类健康的威胁。
【IPC分类】A61K31/444, A61K31/4439, A61P31/04, A61K31/433, C07D513/04
【公开号】CN104892639
【申请号】CN201410081218
【发明人】杨财广, 罗成, 巩守哲, 刘洪川, 张瑞涵, 张婕, 蒋华良
【申请人】中国科学院上海药物研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2014年3月6日
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