一种黄绿蜜环菌子实体核苷类化合物的分离纯化方法
一种黄绿蜜环菌子实体核苷类化合物的分离纯化方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及核苷类化合物的分离纯化技术领域，尤其涉及一种黄绿蜜环菌子实体 核苷类化合物的分离纯化方法。
【背景技术】
[0002] 核苷是杂环碱基与糖缩合成的糖苷，包括糖上的Cl连接到杂环碱的氧原子或碳 原子上的化合物，由碱基和五碳糖(核糖或脱氧核糖)连接而成，即嘌呤的N-9或嘧啶的N-I 与核糖或脱氧核糖的C-I通过β糖苷键连接而成的化合物。核苷根据苷元连接糖种类不 同，分为核糖核苷和脱氧核糖核苷两大类，其中核糖核苷是构成RNA的核苷，主要分为四 种：腺苷、鸟苷、胞苷及尿苷；脱氧核糖核苷是构成DNA的核苷，分为脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱 氧胞苷及脱氧胸腺苷。
[0003] 李子成及Dienstag J L等分别对核苷类化合物的生物活性进行了综述及报道，研 宄表明核苷类化合物具有广泛的药理活性，可以作为药物用于抗肿瘤、抗病毒等(李子成， 陈淑华，蒋宁等.核苷类抗病毒药物的研宄进展，化学研宄与应用，2002，14(1) :15-20; Dienstag J L， Benefits and risks of nucleoside analog therapy for hepatitis B， Hepatology, 2009, 49(5 Suppl): 112-121 ；Haubrich R Hj Riddler S A, DiRienzo A Gj et al. Metabolic outcomes in a randomized trial of nucleoside, nonnucleoside and protease inhibitor-sparing regimens for initial HIV treatment, Aids, 2009， 23(9): 1109-1118. )〇
[0004] 应高山典型蕈菌现代研宄的需要，为了揭示大型蕈菌的物质基础及其核苷类化合 物的主要药理活性，科研人员开展了有关核苷类化合物的分离纯化工作。采用的方法主要 是使用95%乙醇或蒸馏水作提取溶剂，经离子交换树脂、大孔吸附树脂及氧化铝柱层析进 行前处理，最后用硅胶柱层析、薄层分离或制备色谱分离，得到单体，常用的洗脱剂有不同 比例的氯仿-甲醇-水混合溶剂和石油醚-乙酸乙酯体系。该方法主要存在以下问题：一、 核苷类化合物极性较强，在正相洗脱溶剂中溶解性差，导致其在硅胶柱分离时易产生拖尾 和死吸附等问题；二、大多数核苷类化合物在药材中是微量成分，多次分离过程中由于死吸 附，容易造成原药材中不存在该化合物的假象；三、大部分微量的核苷类化合物(或含正电 荷）聚类存在，在常规C18色谱柱上不成峰型，对其分离能力是一种挑战；四、化合物制备可 控性差，无法实现有效的目标制备，导致大量常量化合物的重复获得，造成人力、物力的极 大浪费；五、色谱分离模式僵化，分离选择性差，使得发现新化合物的困难越来越大。
[0005] 大型高山典型蕈菌中-虫草属（Cordyceps)、蜜环菌属（Armillaria)和马勃科中 已发现的核苷类化合物不超过20种。反相C18梯度洗脱是核苷类化合物的常用分析方 法，但很难使不同核苷类化合物达到基线分离。鉴于HILIC与RP分离机理完全不同。个 别研宄报道采用HILIC超高效液相色谱分离模式分析核苷类化合物，可以实现大部分化 合物的基线分离（Yao Xin, Zhou Guisheng, Tang Yuping, et al. HILIC-UPLC-MS/MS combined with hierarchical clustering analysis to rapidly analyze and evaluate nucleobases and nucleosides in Ginkgo biloba leaves, Drug testing and analysis, 2015，7(2): 150-157.)。因目前商品化的亲水色谱分离材料种类很有限，将其用于核苷 类化合物的制备还鲜有报道。此外，有研宄报道采用高速逆流色谱（HSCCC)技术分离纯 化核苷类化合物（Ling Jianya, Zhang Guoying, Lin Jianqun, et al. Supercritical fluid extraction of cordycepin and adenosine from Cordyceps kyushuensis and purification by high-speed counter-current chromatography, Separation and purification technology, 2009，66 (3) : 625-629.)，但该方法主要适用于分离纯化一 些已知且高含量的化合物，而且合适萃取溶剂体系的选择非常困难，萃取过程中易产生乳 化现象给分离检测带来不便。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种快速、简单的黄绿蜜环菌子实体核苷类化 合物的分离纯化方法。
[0007] 为解决上述问题，本发明所述的一种黄绿蜜环菌子实体核苷类化合物的分离纯化 方法，包括以下步骤： ⑴采用二维制备液相色谱系统，将黄绿蜜环菌子实体水提物经第一维制备型高效 液相色谱分离，并按下述线性梯度洗脱方式进行洗脱：〇~1〇 min，体积浓度5% - 5%B ; 10~20 min，体积浓度 5% - 22%B ;20~25 min，体积浓度 22% - 95%B ;25~25 min，体积浓度 95% - 95%B ;收集馏分共计14个组分，每个组分减压浓缩至恒重； ⑵在第一维制备所得14个组分中，核苷类化合物主要分布在馏分5~13共9个组分中； ⑶采用二维制备液相色谱系统，将所述馏分5~13共9个组分经第二维制备型高效液相 色谱分离，即得核苷类化合物单体。
[0008] 所述步骤⑴中第一维制备型高效液相色谱分离的工作参数是指色谱柱为常用C18 反相色谱柱或耐纯水C18反相色谱柱；制备流动相A水，B为甲醇、乙醇、乙腈中的一种；分 离过程中采用紫外检测器检测，检测波长为254 nm;样品溶液浓度为50.0 mg/mL~300.0 mg/mL，其采用体积浓度50%甲醇-50%水溶解；进样体积为5. 0 mL。
[0009] 所述步骤⑶中第二维制备型高效液相色谱分离的工作参数是指色谱柱为亲水 色谱柱，其内径为4.6 mm~100.0 mm;制备流动相为乙腈-水，其中乙腈的体积浓度为 40%~95% ;样品溶液浓度为50. 0 mg/mL~300. 0 mg/mL ;进样量为L 0 μ L~40.0 mL ;流速为 0. 5 ml ,/mi η ~480. 0 ml ,/mi η ;柱温为 0~60°C。
[0010] 所述亲水色谱柱是指硅胶柱、酰胺柱、两性离子柱、二醇基柱中的任意一种。
[0011] 所述步骤⑴中减压浓缩条件是指真空度为〇. 07~0. 09 MPa，温度为60~70 °C。
[0012] 本发明与现有技术相比具有以下优点： 1、本发明采用二维制备液相色谱从黄绿蜜环菌水提取物中分离纯化核苷单体，其中第 一维采用反相色谱柱、第二维采用亲水色谱柱，无缓冲盐添加，不但快速、简单，而且便于样 品制备后处理。
[0013] 2、采用本发明方法，可实现核苷类化合物的目标制备，可获取批量的已知活性核 苷，同时富集分离微量核苷，从而可以不断丰富核苷类化合物库，为核苷类化合物的活性研 宄和单一成分的新药开发提供物质基础。
【附图说明】
[0014] 下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细的说明。
[0015] 图1为本发明的一维制备馏分收集色谱图。
[0016] 图2为本发明6个核苷类化合物单体的结构信息。
【具体实施方式】
[0017] -种黄绿蜜环菌子实体核苷类化合物的分离纯化方法，包括以下步骤： ⑴采用二维制备液相色谱系统，将黄绿蜜环菌子实体水提物经第一维制备型高效 液相色谱分离，并按下述线性梯度洗脱方式进行洗脱：〇~1〇 min，体积浓度5% - 5%B ; 10~20 min，体积浓度 5% - 22%B ;20~25 min，体积浓度 22% - 95%B ;25~25 min，体积浓度 95% - 95%B ;收集馏分共计14个组分，每个组分减压浓缩至恒重(参见图1)。
[0018] 其中： 第一维制备型高效液相色谱分离的工作参数是指色谱柱为常用C18反相色谱柱或耐 纯水C18反相色谱柱；制备流动相A水，B为甲醇、乙醇、乙腈中的一种；分离过程中采用紫 外检测器检测，检测波长为254 nm;样品溶液浓度为50. 0 mg/mL~300. 0 mg/mL，其采用体积 浓度50%甲醇-50%水溶解；进样体积为5. 0 mL。
[0019] 减压浓缩条件是指真空度为0· 07~0· 09 MPa，温度为60~70 °C。
[0020] ⑵在第一维制备所得14个组分中，核苷类化合物主要分布在馏分5~13共9个组 分中。
[0021] ⑶采用二维制备液相色谱系统，将所述馏分5~13共9个组分经第二维制备型高效 液相色谱分离，即得核苷类化合物单体。
[0022] 其中： 第二维制备型高效液相色谱分离的工作参数是指色谱柱为亲水色谱柱，其内径为4. 6 mm~100. 0 mm ;制备流动相为乙腈-水，其中乙腈的体积浓度为40%~95% ;样品溶液浓度为 50. 0 mg/mL~300. 0 mg/mL ;进样量为 I . 0 μ L~40.0 mT,;流速为 0· 5 mL/min ~480· 0 ml ,/mi η ； 柱温为0~60°C。
[0023] 亲水色谱柱是指硅胶柱（Silica)、酰胺柱（XAmide)、两性离子柱（Click XIon)、 二醇基柱（Diol)中的任意一种。
[0024] 实施例 选取黄绿蜜环菌子实体水提物第一维制备所得3个有代表性的馏分 (Fr6, Fr9和Frll)，通过第二维亲水色谱制备获得6个核苷类化合物单体。该化合物的结 构信息如表1和图2 : 表1 6个核苷类化合物单体
具体过程如下： ①选取Fraction 6采用亲水色谱分离模式进行第二维制备型高效液相色谱分离，色 谱条件：色谱柱为酰胺柱（XAmide，250X20 mm，i. d.，10 ym);水（A)和乙腈⑶流动 相体系；〇~5 min，体积浓度 100%-100%B ;5~20 min，体积浓度 100%-72%B ;20~25 min，体 积浓度72% - 5%B梯度洗脱；流速为20 mL/min ;检测波长为254 nm ;进样量为3 mL ;收集 5~20分钟内的三个色谱主峰，减压干燥回收溶剂，经1H NMR和13C NMR核磁确定获得Fr6-1、 Fr6-2及Fr6-3三个单体化合物。HPLC检测纯度均大于98%，经理化测定，数据如下： Fr6-1:白色粉末，1H-NMR (CD3OD, 600 MHz) δ: 8.00 (1H, d, J=7.8Hz, Η-4)，5·90 (1Η, d, J=4.8Hz, Η-1'），5·69 (1Η, d, J=7.8Hz, Η-5)，4·18 (1Η, m, Η-3'），4·15 (1Η， m, Η-2'），4·00 (1Η，m, Η-4'），3·83 (1Η，dd，J=3.0，12·0Ηζ，H-5'a)，3.73 (1Η，dd， J=3.0, 12.0 Hz, H-5'b) ;13C NMR:见表 2。
[0025] Fr6-2 :白色粉末，1H NMR (DMS0-d6, 600MHz) δ : 11. 27 (1H, brs, H-l)，5· 63 (1H, d, J=8. 2 Hz, H-5),7.85 (1H, d, J=8.2 Hz, H-4),6. 15 (1H, dd, J=6. 5, 7.2 Hz, Η-1'），2·08 (2H, m, Η-2'），4·23 (1H, m, Η-3'），3·78 (1H, dd, J=7.1, 3.8 Hz, H-4'）， 3.55 (2H，dd，J=12.1，3.8 Hz, H-5'）；13C NMR:见表：2。
[0026] Fr6-3 :白色粉末，1H NMR (CDCl3, 600 MHz,) δ : 2. 12 (s，6H，CH3X2)， 2.18~2.22(m，lH，H-2，a)，2.55~2.60(m，lH，H-2，b)，4.27~4.35(m，lH，H-3'）， 5·23~5·25 (m，1H，Η-4'），6·30~6·34 (m, 1H，H-l'），7.35 (s，1H，H-7)，8.28 (s，1H， H-4)，8.62 (brs, 1H, H-1);13CNMR:见表 2。
[0027] ②选取Fraction 9采用亲水色谱分离模式进行第二维制备型高效液相色谱分 离，色谱条件：色谱柱为亲水色谱柱（XIon，250X20 mm，i. d.，10 μπι);水（A)和乙 腈⑶流动相体系；〇~5 min，体积浓度100% - 100%B ;5~35 min，体积浓度100% - 88%Β ; 35~43 min，体积浓度 88% -20%B;43~53 min，体积浓度 20%-12%B;53~55 min，体积浓度 12% - 5%B ;55~60 min，体积浓度5% - 5%B梯度洗脱；流速为20 mL/min ;检测波长为254 nm;进样量为2 mL ;收集45~60 min内的两个色谱主峰，减压干燥回收溶剂，经1H NMR和13C NMR核磁确定获得Fr9-1及Fr9-2两个单体化合物。HPLC检测纯度均大于95%，经理化测 定，数据如下： Fr9-l:白色粉末，1HNMR(600 MHz，DMS0-d6)δ:5·69(lH，d，J=5·9Hz，H-l'）， 6.52 (2H, s, 2-NH2)，7.93 (1H, s, H-7)，10.63 (1H, s, H-3);13C NMR :见表 2。
[0028] Fr9-2 :白色粉末，1H-NMR (400 MHz, DMS0-d6) δ : 12. 39 (1H，brs，H-l)，8· 34 (1H, s, H-2),8.07 (1H, s, H-8), 5.87 (1H, d, J=5.6 Hz, H-Ir ),4.49 (1H, m, H-2r ),4.13 (1H, m, H-3r ),3.97 (1H, m, H-4r ),3.64 (1H, m, H-5r a),3.54 (1H, m, H-5' b) ;13C NMR :见表 2。
[0029] ③选取Fraction 11采用亲水色谱分离模式进行第二维制备型高效液相色谱分 离，色谱条件：色谱柱为亲水色谱柱（XAmide，250X20 mm，i. d.，10 μπι);水（A)和乙 腈（B)流动相体系；0~20 min，体积浓度84% - 84%Β等度洗脱；流速20 mL/min ;检测波长 为254 nm ;进样量为4. 0 mL ;收集10~20 min内的一个色谱主峰，减压干燥回收溶剂，经1H NMR和13C NMR核磁确定获得Frll-I -个单体化合物。HPLC检测纯度大于95%，经理化测 定，数据如下： 1H NMR (600 MHz, DMSO-(I6) δ： 7. 29 (H, s, H-2), 7. 26 (1H, s, H-8), 5. 86 (1H, d, J=5.6 Hz, H-Ir ),5.12 (1H, d, J=4.8Hz, H-2r ),5.37 (1H, m, H_3，），4. 59 (1H, m，H-4'），3.52 (1H, m, H-5' a)，3.67 (1H, m, H-5' b);13CNMR:见表 2。
[0030] 表2 :核苷类化合物碳谱数据
【主权项】
1. 一种黄绿蜜环菌子实体核苷类化合物的分离纯化方法，包括以下步骤： ⑴采用二维制备液相色谱系统，将黄绿蜜环菌子实体水提物经第一维制备型高效 液相色谱分离，并按下述线性梯度洗脱方式进行洗脱：〇~1〇min，体积浓度5% - 5%B; 10~20min，体积浓度 5% - 22%B;20~25min，体积浓度 22% - 95%B;25~25min，体积浓度 95% - 95%B;收集馏分共计14个组分，每个组分减压浓缩至恒重； ⑵在第一维制备所得14个组分中，核苷类化合物主要分布在馏分5~13共9个组分中； ⑶采用二维制备液相色谱系统，将所述馏分5~13共9个组分经第二维制备型高效液相 色谱分离，即得核苷类化合物单体。2. 如权利要求1所述的一种黄绿蜜环菌子实体核苷类化合物的分离纯化方法，其特征 在于：所述步骤⑴中第一维制备型高效液相色谱分离的工作参数是指色谱柱为常用C18反 相色谱柱或耐纯水C18反相色谱柱；制备流动相A水，B为甲醇、乙醇、乙腈中的一种；分离 过程中采用紫外检测器检测，检测波长为254 nm;样品溶液浓度为50.0mg/mL~300.0mg/ mL，其采用体积浓度50%甲醇-50%水溶解；进样体积为5. 0mL。3. 如权利要求1所述的一种黄绿蜜环菌子实体核苷类化合物的分离纯化方法，其特 征在于：所述步骤⑶中第二维制备型高效液相色谱分离的工作参数是指色谱柱为亲水色谱 柱，其内径为4. 6 mm~100. 0 mm ;制备流动相为乙腈-水，其中乙腈的体积浓度为40%~95% ; 样品溶液浓度为 50. 0 mg/mL~300. 0 mg/mL ;进样量为 I. 0 y L~40.0 mL ;流速为 0. 5 mL/min ~480. 0 mL/min ;柱温为 0~60°C。4. 如权利要求3所述的一种黄绿蜜环菌子实体核苷类化合物的分离纯化方法，其特征 在于：所述亲水色谱柱是指硅胶柱、酰胺柱、两性离子柱、二醇基柱中的任意一种。5. 如权利要求1所述的一种黄绿蜜环菌子实体核苷类化合物的分离纯化方法，其特征 在于：所述步骤⑴中减压浓缩条件是指真空度为〇. 07~0. 09MPa，温度为60~70 °C。
【专利摘要】本发明涉及一种黄绿蜜环菌子实体核苷类化合物的分离纯化方法，该方法包括以下步骤：⑴采用二维制备液相色谱系统，将黄绿蜜环菌子实体水提物经第一维制备型高效液相色谱分离，并按线性梯度洗脱方式进行洗脱；收集馏分共计14个组分，每个组分减压浓缩至恒重；⑵在第一维制备所得14个组分中，核苷类化合物主要分布在馏分5~13共9个组分中；⑶采用二维制备液相色谱系统，将所述馏分5~13共9个组分经第二维制备型高效液相色谱分离，即得核苷类化合物单体。本发明不但快速、简单，而且便于样品制备后处理。
【IPC分类】C07H19/067, C07H19/167, C07H19/073, C07H1/08
【公开号】CN104892686
【申请号】CN201510274647
【发明人】党军, 张莉, 王启兰, 梅丽娟, 陶燕铎, 邵赟, 赵建强, 孙策
【申请人】中国科学院西北高原生物研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月27日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及核苷类化合物的分离纯化技术领域，尤其涉及一种黄绿蜜环菌子实体 核苷类化合物的分离纯化方法。
【背景技术】
[0002] 核苷是杂环碱基与糖缩合成的糖苷，包括糖上的Cl连接到杂环碱的氧原子或碳 原子上的化合物，由碱基和五碳糖(核糖或脱氧核糖)连接而成，即嘌呤的N-9或嘧啶的N-I 与核糖或脱氧核糖的C-I通过β糖苷键连接而成的化合物。核苷根据苷元连接糖种类不 同，分为核糖核苷和脱氧核糖核苷两大类，其中核糖核苷是构成RNA的核苷，主要分为四 种：腺苷、鸟苷、胞苷及尿苷；脱氧核糖核苷是构成DNA的核苷，分为脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱 氧胞苷及脱氧胸腺苷。
[0003] 李子成及Dienstag J L等分别对核苷类化合物的生物活性进行了综述及报道，研 宄表明核苷类化合物具有广泛的药理活性，可以作为药物用于抗肿瘤、抗病毒等(李子成， 陈淑华，蒋宁等.核苷类抗病毒药物的研宄进展，化学研宄与应用，2002，14(1) :15-20; Dienstag J L， Benefits and risks of nucleoside analog therapy for hepatitis B， Hepatology, 2009, 49(5 Suppl): 112-121 ；Haubrich R Hj Riddler S A, DiRienzo A Gj et al. Metabolic outcomes in a randomized trial of nucleoside, nonnucleoside and protease inhibitor-sparing regimens for initial HIV treatment, Aids, 2009， 23(9): 1109-1118. )〇
[0004] 应高山典型蕈菌现代研宄的需要，为了揭示大型蕈菌的物质基础及其核苷类化合 物的主要药理活性，科研人员开展了有关核苷类化合物的分离纯化工作。采用的方法主要 是使用95%乙醇或蒸馏水作提取溶剂，经离子交换树脂、大孔吸附树脂及氧化铝柱层析进 行前处理，最后用硅胶柱层析、薄层分离或制备色谱分离，得到单体，常用的洗脱剂有不同 比例的氯仿-甲醇-水混合溶剂和石油醚-乙酸乙酯体系。该方法主要存在以下问题：一、 核苷类化合物极性较强，在正相洗脱溶剂中溶解性差，导致其在硅胶柱分离时易产生拖尾 和死吸附等问题；二、大多数核苷类化合物在药材中是微量成分，多次分离过程中由于死吸 附，容易造成原药材中不存在该化合物的假象；三、大部分微量的核苷类化合物(或含正电 荷）聚类存在，在常规C18色谱柱上不成峰型，对其分离能力是一种挑战；四、化合物制备可 控性差，无法实现有效的目标制备，导致大量常量化合物的重复获得，造成人力、物力的极 大浪费；五、色谱分离模式僵化，分离选择性差，使得发现新化合物的困难越来越大。
[0005] 大型高山典型蕈菌中-虫草属（Cordyceps)、蜜环菌属（Armillaria)和马勃科中 已发现的核苷类化合物不超过20种。反相C18梯度洗脱是核苷类化合物的常用分析方 法，但很难使不同核苷类化合物达到基线分离。鉴于HILIC与RP分离机理完全不同。个 别研宄报道采用HILIC超高效液相色谱分离模式分析核苷类化合物，可以实现大部分化 合物的基线分离（Yao Xin, Zhou Guisheng, Tang Yuping, et al. HILIC-UPLC-MS/MS combined with hierarchical clustering analysis to rapidly analyze and evaluate nucleobases and nucleosides in Ginkgo biloba leaves, Drug testing and analysis, 2015，7(2): 150-157.)。因目前商品化的亲水色谱分离材料种类很有限，将其用于核苷 类化合物的制备还鲜有报道。此外，有研宄报道采用高速逆流色谱（HSCCC)技术分离纯 化核苷类化合物（Ling Jianya, Zhang Guoying, Lin Jianqun, et al. Supercritical fluid extraction of cordycepin and adenosine from Cordyceps kyushuensis and purification by high-speed counter-current chromatography, Separation and purification technology, 2009，66 (3) : 625-629.)，但该方法主要适用于分离纯化一 些已知且高含量的化合物，而且合适萃取溶剂体系的选择非常困难，萃取过程中易产生乳 化现象给分离检测带来不便。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种快速、简单的黄绿蜜环菌子实体核苷类化 合物的分离纯化方法。
[0007] 为解决上述问题，本发明所述的一种黄绿蜜环菌子实体核苷类化合物的分离纯化 方法，包括以下步骤： ⑴采用二维制备液相色谱系统，将黄绿蜜环菌子实体水提物经第一维制备型高效 液相色谱分离，并按下述线性梯度洗脱方式进行洗脱：〇~1〇 min，体积浓度5% - 5%B ; 10~20 min，体积浓度 5% - 22%B ;20~25 min，体积浓度 22% - 95%B ;25~25 min，体积浓度 95% - 95%B ;收集馏分共计14个组分，每个组分减压浓缩至恒重； ⑵在第一维制备所得14个组分中，核苷类化合物主要分布在馏分5~13共9个组分中； ⑶采用二维制备液相色谱系统，将所述馏分5~13共9个组分经第二维制备型高效液相 色谱分离，即得核苷类化合物单体。
[0008] 所述步骤⑴中第一维制备型高效液相色谱分离的工作参数是指色谱柱为常用C18 反相色谱柱或耐纯水C18反相色谱柱；制备流动相A水，B为甲醇、乙醇、乙腈中的一种；分 离过程中采用紫外检测器检测，检测波长为254 nm;样品溶液浓度为50.0 mg/mL~300.0 mg/mL，其采用体积浓度50%甲醇-50%水溶解；进样体积为5. 0 mL。
[0009] 所述步骤⑶中第二维制备型高效液相色谱分离的工作参数是指色谱柱为亲水 色谱柱，其内径为4.6 mm~100.0 mm;制备流动相为乙腈-水，其中乙腈的体积浓度为 40%~95% ;样品溶液浓度为50. 0 mg/mL~300. 0 mg/mL ;进样量为L 0 μ L~40.0 mL ;流速为 0. 5 ml ,/mi η ~480. 0 ml ,/mi η ;柱温为 0~60°C。
[0010] 所述亲水色谱柱是指硅胶柱、酰胺柱、两性离子柱、二醇基柱中的任意一种。
[0011] 所述步骤⑴中减压浓缩条件是指真空度为〇. 07~0. 09 MPa，温度为60~70 °C。
[0012] 本发明与现有技术相比具有以下优点： 1、本发明采用二维制备液相色谱从黄绿蜜环菌水提取物中分离纯化核苷单体，其中第 一维采用反相色谱柱、第二维采用亲水色谱柱，无缓冲盐添加，不但快速、简单，而且便于样 品制备后处理。
[0013] 2、采用本发明方法，可实现核苷类化合物的目标制备，可获取批量的已知活性核 苷，同时富集分离微量核苷，从而可以不断丰富核苷类化合物库，为核苷类化合物的活性研 宄和单一成分的新药开发提供物质基础。
【附图说明】
[0014] 下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细的说明。
[0015] 图1为本发明的一维制备馏分收集色谱图。
[0016] 图2为本发明6个核苷类化合物单体的结构信息。
【具体实施方式】
[0017] -种黄绿蜜环菌子实体核苷类化合物的分离纯化方法，包括以下步骤： ⑴采用二维制备液相色谱系统，将黄绿蜜环菌子实体水提物经第一维制备型高效 液相色谱分离，并按下述线性梯度洗脱方式进行洗脱：〇~1〇 min，体积浓度5% - 5%B ; 10~20 min，体积浓度 5% - 22%B ;20~25 min，体积浓度 22% - 95%B ;25~25 min，体积浓度 95% - 95%B ;收集馏分共计14个组分，每个组分减压浓缩至恒重(参见图1)。
[0018] 其中： 第一维制备型高效液相色谱分离的工作参数是指色谱柱为常用C18反相色谱柱或耐 纯水C18反相色谱柱；制备流动相A水，B为甲醇、乙醇、乙腈中的一种；分离过程中采用紫 外检测器检测，检测波长为254 nm;样品溶液浓度为50. 0 mg/mL~300. 0 mg/mL，其采用体积 浓度50%甲醇-50%水溶解；进样体积为5. 0 mL。
[0019] 减压浓缩条件是指真空度为0· 07~0· 09 MPa，温度为60~70 °C。
[0020] ⑵在第一维制备所得14个组分中，核苷类化合物主要分布在馏分5~13共9个组 分中。
[0021] ⑶采用二维制备液相色谱系统，将所述馏分5~13共9个组分经第二维制备型高效 液相色谱分离，即得核苷类化合物单体。
[0022] 其中： 第二维制备型高效液相色谱分离的工作参数是指色谱柱为亲水色谱柱，其内径为4. 6 mm~100. 0 mm ;制备流动相为乙腈-水，其中乙腈的体积浓度为40%~95% ;样品溶液浓度为 50. 0 mg/mL~300. 0 mg/mL ;进样量为 I . 0 μ L~40.0 mT,;流速为 0· 5 mL/min ~480· 0 ml ,/mi η ； 柱温为0~60°C。
[0023] 亲水色谱柱是指硅胶柱（Silica)、酰胺柱（XAmide)、两性离子柱（Click XIon)、 二醇基柱（Diol)中的任意一种。
[0024] 实施例 选取黄绿蜜环菌子实体水提物第一维制备所得3个有代表性的馏分 (Fr6, Fr9和Frll)，通过第二维亲水色谱制备获得6个核苷类化合物单体。该化合物的结 构信息如表1和图2 : 表1 6个核苷类化合物单体
具体过程如下： ①选取Fraction 6采用亲水色谱分离模式进行第二维制备型高效液相色谱分离，色 谱条件：色谱柱为酰胺柱（XAmide，250X20 mm，i. d.，10 ym);水（A)和乙腈⑶流动 相体系；〇~5 min，体积浓度 100%-100%B ;5~20 min，体积浓度 100%-72%B ;20~25 min，体 积浓度72% - 5%B梯度洗脱；流速为20 mL/min ;检测波长为254 nm ;进样量为3 mL ;收集 5~20分钟内的三个色谱主峰，减压干燥回收溶剂，经1H NMR和13C NMR核磁确定获得Fr6-1、 Fr6-2及Fr6-3三个单体化合物。HPLC检测纯度均大于98%，经理化测定，数据如下： Fr6-1:白色粉末，1H-NMR (CD3OD, 600 MHz) δ: 8.00 (1H, d, J=7.8Hz, Η-4)，5·90 (1Η, d, J=4.8Hz, Η-1'），5·69 (1Η, d, J=7.8Hz, Η-5)，4·18 (1Η, m, Η-3'），4·15 (1Η， m, Η-2'），4·00 (1Η，m, Η-4'），3·83 (1Η，dd，J=3.0，12·0Ηζ，H-5'a)，3.73 (1Η，dd， J=3.0, 12.0 Hz, H-5'b) ;13C NMR:见表 2。
[0025] Fr6-2 :白色粉末，1H NMR (DMS0-d6, 600MHz) δ : 11. 27 (1H, brs, H-l)，5· 63 (1H, d, J=8. 2 Hz, H-5),7.85 (1H, d, J=8.2 Hz, H-4),6. 15 (1H, dd, J=6. 5, 7.2 Hz, Η-1'），2·08 (2H, m, Η-2'），4·23 (1H, m, Η-3'），3·78 (1H, dd, J=7.1, 3.8 Hz, H-4'）， 3.55 (2H，dd，J=12.1，3.8 Hz, H-5'）；13C NMR:见表：2。
[0026] Fr6-3 :白色粉末，1H NMR (CDCl3, 600 MHz,) δ : 2. 12 (s，6H，CH3X2)， 2.18~2.22(m，lH，H-2，a)，2.55~2.60(m，lH，H-2，b)，4.27~4.35(m，lH，H-3'）， 5·23~5·25 (m，1H，Η-4'），6·30~6·34 (m, 1H，H-l'），7.35 (s，1H，H-7)，8.28 (s，1H， H-4)，8.62 (brs, 1H, H-1);13CNMR:见表 2。
[0027] ②选取Fraction 9采用亲水色谱分离模式进行第二维制备型高效液相色谱分 离，色谱条件：色谱柱为亲水色谱柱（XIon，250X20 mm，i. d.，10 μπι);水（A)和乙 腈⑶流动相体系；〇~5 min，体积浓度100% - 100%B ;5~35 min，体积浓度100% - 88%Β ; 35~43 min，体积浓度 88% -20%B;43~53 min，体积浓度 20%-12%B;53~55 min，体积浓度 12% - 5%B ;55~60 min，体积浓度5% - 5%B梯度洗脱；流速为20 mL/min ;检测波长为254 nm;进样量为2 mL ;收集45~60 min内的两个色谱主峰，减压干燥回收溶剂，经1H NMR和13C NMR核磁确定获得Fr9-1及Fr9-2两个单体化合物。HPLC检测纯度均大于95%，经理化测 定，数据如下： Fr9-l:白色粉末，1HNMR(600 MHz，DMS0-d6)δ:5·69(lH，d，J=5·9Hz，H-l'）， 6.52 (2H, s, 2-NH2)，7.93 (1H, s, H-7)，10.63 (1H, s, H-3);13C NMR :见表 2。
[0028] Fr9-2 :白色粉末，1H-NMR (400 MHz, DMS0-d6) δ : 12. 39 (1H，brs，H-l)，8· 34 (1H, s, H-2),8.07 (1H, s, H-8), 5.87 (1H, d, J=5.6 Hz, H-Ir ),4.49 (1H, m, H-2r ),4.13 (1H, m, H-3r ),3.97 (1H, m, H-4r ),3.64 (1H, m, H-5r a),3.54 (1H, m, H-5' b) ;13C NMR :见表 2。
[0029] ③选取Fraction 11采用亲水色谱分离模式进行第二维制备型高效液相色谱分 离，色谱条件：色谱柱为亲水色谱柱（XAmide，250X20 mm，i. d.，10 μπι);水（A)和乙 腈（B)流动相体系；0~20 min，体积浓度84% - 84%Β等度洗脱；流速20 mL/min ;检测波长 为254 nm ;进样量为4. 0 mL ;收集10~20 min内的一个色谱主峰，减压干燥回收溶剂，经1H NMR和13C NMR核磁确定获得Frll-I -个单体化合物。HPLC检测纯度大于95%，经理化测 定，数据如下： 1H NMR (600 MHz, DMSO-(I6) δ： 7. 29 (H, s, H-2), 7. 26 (1H, s, H-8), 5. 86 (1H, d, J=5.6 Hz, H-Ir ),5.12 (1H, d, J=4.8Hz, H-2r ),5.37 (1H, m, H_3，），4. 59 (1H, m，H-4'），3.52 (1H, m, H-5' a)，3.67 (1H, m, H-5' b);13CNMR:见表 2。
[0030] 表2 :核苷类化合物碳谱数据
【主权项】
1. 一种黄绿蜜环菌子实体核苷类化合物的分离纯化方法，包括以下步骤： ⑴采用二维制备液相色谱系统，将黄绿蜜环菌子实体水提物经第一维制备型高效 液相色谱分离，并按下述线性梯度洗脱方式进行洗脱：〇~1〇min，体积浓度5% - 5%B; 10~20min，体积浓度 5% - 22%B;20~25min，体积浓度 22% - 95%B;25~25min，体积浓度 95% - 95%B;收集馏分共计14个组分，每个组分减压浓缩至恒重； ⑵在第一维制备所得14个组分中，核苷类化合物主要分布在馏分5~13共9个组分中； ⑶采用二维制备液相色谱系统，将所述馏分5~13共9个组分经第二维制备型高效液相 色谱分离，即得核苷类化合物单体。2. 如权利要求1所述的一种黄绿蜜环菌子实体核苷类化合物的分离纯化方法，其特征 在于：所述步骤⑴中第一维制备型高效液相色谱分离的工作参数是指色谱柱为常用C18反 相色谱柱或耐纯水C18反相色谱柱；制备流动相A水，B为甲醇、乙醇、乙腈中的一种；分离 过程中采用紫外检测器检测，检测波长为254 nm;样品溶液浓度为50.0mg/mL~300.0mg/ mL，其采用体积浓度50%甲醇-50%水溶解；进样体积为5. 0mL。3. 如权利要求1所述的一种黄绿蜜环菌子实体核苷类化合物的分离纯化方法，其特 征在于：所述步骤⑶中第二维制备型高效液相色谱分离的工作参数是指色谱柱为亲水色谱 柱，其内径为4. 6 mm~100. 0 mm ;制备流动相为乙腈-水，其中乙腈的体积浓度为40%~95% ; 样品溶液浓度为 50. 0 mg/mL~300. 0 mg/mL ;进样量为 I. 0 y L~40.0 mL ;流速为 0. 5 mL/min ~480. 0 mL/min ;柱温为 0~60°C。4. 如权利要求3所述的一种黄绿蜜环菌子实体核苷类化合物的分离纯化方法，其特征 在于：所述亲水色谱柱是指硅胶柱、酰胺柱、两性离子柱、二醇基柱中的任意一种。5. 如权利要求1所述的一种黄绿蜜环菌子实体核苷类化合物的分离纯化方法，其特征 在于：所述步骤⑴中减压浓缩条件是指真空度为〇. 07~0. 09MPa，温度为60~70 °C。
【专利摘要】本发明涉及一种黄绿蜜环菌子实体核苷类化合物的分离纯化方法，该方法包括以下步骤：⑴采用二维制备液相色谱系统，将黄绿蜜环菌子实体水提物经第一维制备型高效液相色谱分离，并按线性梯度洗脱方式进行洗脱；收集馏分共计14个组分，每个组分减压浓缩至恒重；⑵在第一维制备所得14个组分中，核苷类化合物主要分布在馏分5~13共9个组分中；⑶采用二维制备液相色谱系统，将所述馏分5~13共9个组分经第二维制备型高效液相色谱分离，即得核苷类化合物单体。本发明不但快速、简单，而且便于样品制备后处理。
【IPC分类】C07H19/067, C07H19/167, C07H19/073, C07H1/08
【公开号】CN104892686
【申请号】CN201510274647
【发明人】党军, 张莉, 王启兰, 梅丽娟, 陶燕铎, 邵赟, 赵建强, 孙策
【申请人】中国科学院西北高原生物研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月27日
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