高速逆流色谱分离纯化十大功劳叶中单体化合物的方法
高速逆流色谱分离纯化十大功劳叶中单体化合物的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于天然药物化学领域，具体涉及一种从苦丁茶十大功劳叶中快速分离纯 化绿原酸、懈皮素_3_0_ β -D-匍萄糖苷、异鼠李素-3-〇- β -D-匍萄糖苷的方法。
【背景技术】
[0002] 十大功劳叶系小聚科植物阔叶十大功劳（#aAo/?ia Aea/ei (Fort. ) Carr.)的干 燥叶，具有清热解毒、消炎止痛、燥湿泻火、清肝明目之功效。在秦岭以南各省还被广泛应用 为苦丁茶。民间广泛用其作为主治头晕耳鸣、腰膝酸软、湿热泻痢、胃火牙痛、黄疸性肝炎等 疾病。现代药理研宄发现十大功劳具有抑菌、消炎、抗病毒、抗肿瘤、抗增殖及降血压等活 性，是一种有开发价值的药用植物。
[0003] 对十大功劳化学成分的研宄多集中在其生物碱上，现未有文献报道从十大功劳 叶中分离出绿原酸、槲皮素-3-0-β-D-葡萄糖苷、异鼠李素-3-0-β-D-葡萄糖苷化合 物，现有文献报道从其它中草药中分离纯化绿原酸、槲皮素-3-0-β-D-葡萄糖苷、异鼠李 素-3-0-β-D-葡萄糖苷等的方法常采用柱层析方法。柴兴云等[山银花中酚酸类成分研 宄，中国天然药物，2004年第6期]用95 %，90 %，85 %，70 %乙醇回流，乙酸乙酯萃取 及硅胶柱，SephadexLH - 20柱纯化分离的方法分离纯化，根据化合物的理化特征和光谱 数据鉴定其结构，从山银花中分离到绿原酸等化合物。槲皮素-3-0-β-D-葡萄糖苷、异鼠 李素-3-0-β -D-葡萄糖苷为分布在大部分高等植物植物中，万春鹏[东方肉穗草黄酮类 化学成分研宄，中国中药杂志，2009年第2期]以70%乙醇室温提取，醋酸乙酯溶剂萃 取和大孔吸附树脂、SephadexLH-20, ODS及正相硅胶柱等色谱手段进行分离，分离出槲皮 素-3-0-β-D-葡萄糖苷。赵小亮等[荷叶化学成分研宄，中国中药杂志，2013年第5期] 利用硅胶柱、大孔吸附树脂柱、Sephadex LH-20柱和制备薄层色谱法等分离手段，经理化常 数和光谱分析从荷叶正丁醇部分中分离得到异鼠李素-3-0-β -D-葡萄糖苷。
[0004] 这些成分通常采用反复的柱层析，操作复杂，耗时长，溶剂消耗量大，而且样品损 失大，重复效果不够理想。
[0005] 高速逆流色谱（High-Speed Counter-Current Chromatography，HSCCC)是 Ito 等发明的一种新型的、连续高效的液-液分配色谱，是建立在一种特殊的动力学平衡现 象--单向性流体动力平衡（HDES)体系之上的一种分离方法。与常规固-液色谱分离方法 相比较，由于采用液体作为固定相载体，目标化合物在互不相容的两相由于分配系数的不 同而得以分离，解决了传统固体载体样品死吸附、变性、峰形拖尾等问题，用高速逆流色谱 法不仅使分离速度大为提高，且根据紫外吸收色谱图可良好重复收集样品，具有制备效率 高、制备量大、费用低等优点，因而近年来日益受到人们的关注，已经广泛应用于生物医药、 天然产物、环境分析、食品和化妆品等领域，特别在天然产物行业中已被认为是一种有效的 新型分离技术。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于：克服现有技术的不足，提供一种操作简便、综合成本低、 分离量大、产品纯度高、样品损失小的高效快速从十大功劳叶中分离纯化绿原酸、槲皮 素-3-〇- β -D-匍萄糖昔、异鼠李素-3-〇- β -D-匍萄糖昔的方法。
[0007] 本发明的技术解决方案是：从十大功劳叶中分离纯化绿原酸、槲皮 素-3-〇-β -D-匍萄糖昔、异鼠李素-3-〇-β -D-匍萄糖昔的方法包括以下工艺步骤： (1)十大功劳叶提取物的制备：十大功劳叶阴干、粉碎，纯乙醇为溶剂超声提取，固液 比为1 :20，提取时间2 h，过滤，滤渣重复处理2次；合并滤液并真空减压浓缩得十大 功劳叶粗提物； ⑵将步骤1中粗提物用水打散，分别用正己烧，二氯甲烧，乙酸乙醋，正丁醇萃取，萃 取液过滤，减压浓缩分别得到正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取段，4° C冰箱 保存备用； (3)单体的分离：采用正己烷-甲醇-乙酸乙酯水为溶剂体系，上相为固定相，下相 为流动相，分离柱转速为700 - 900 rpm，对十大功劳叶乙酸乙酯萃取段进行HSCCC分离， 紫外检测器在线监测，分别收集不同馏分并减压干燥，得绿原酸、槲皮素-3-Ο-β-D-葡萄 糖苷、异鼠李素 _3_0_ β -D-匍萄糖苷。
[0008] 步骤（3)所述的正己烷-甲醇-乙酸乙酯-水的体积比为1: 1:1:1-1:8:1:8,优选 I:5:1:5〇
[0009] 步骤（3)所述的流动相流速为2 mL/min。
[0010] 本发明的优点是：十大功劳叶提取物分离后各馏分经HPLC检测纯度可达85%以 上，各馏分进一步提纯可得到95%以上的纯品绿原酸、槲皮素-3-Ο-β-D-葡萄糖苷、异鼠 李素-3-0- β -D-葡萄糖苷，该方法适用于从十大功劳叶中一步纯化制备高纯度的绿原酸、 懈皮素_3_0_ β -D-匍萄糖苷、异鼠李素-3-〇- β -D-匍萄糖苷。稳定性好，操作简便。
【附图说明】
[0011] 图1是高速逆流色谱分离纯化十大功劳叶的色谱图； 图2是分离纯化得到的绿原酸的高效液相色谱图； 图3是分离纯化得到的槲皮素-3-0-β-D-葡萄糖苷的高效液相色谱图； 图4是分离纯化得到的异鼠李素-3-0-β-D-葡萄糖苷的高效液相色谱图。
【具体实施方式】
[0012] 取自然阴干的十大功劳叶5.0 kg，粉碎，纯乙醇为溶剂超声提取，固液比为1 :20 ，提取时间2 h，过滤，滤渣重复处理2次；合并滤液并真空减压浓缩得十大功劳叶粗提 物；粗提物用水打散，分别用正己烧，二氯甲烧，乙酸乙醋，正丁醇萃取，萃取液过滤，减压浓 缩分别得到正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取段，4° C冰箱保存备用。采用体 积比1:5:1:5的正己烷-甲醇-乙酸乙酯水为溶剂体系，流动相（下相）流速为2 mL/ min，分离柱转速为900 rpm，上相为固定相，对十大功劳叶乙酸乙醋萃取段进行HSCCC分 离，紫外检测器在线监测，检测波长为254 nm，收集目标成分，馏分经减压浓缩干燥，得到 相应高纯度化合物，如图1所示。
[0013] 经1H-NMR、13C-NMR鉴定化学结构如下，
即所得单体化合物分别为绿原酸18. 32mg、槲皮素-3-0-β -D-葡萄糖苷20. 46 mg、异 鼠李素-3-0- β -D-葡萄糖苷28. 36 mg，以色谱峰面积归一化法计算，纯度均高于97%，如图 2-图4所示。
【主权项】
1. 高速逆流色谱分离纯化十大功劳叶中单体化合物的方法，其特征在于，包括以下工 艺步骤： (1) 十大功劳叶提取物的制备：十大功劳叶阴干、粉碎，纯乙醇为溶剂超声提取，固液 比为1 :20,提取时间2h，过滤，滤渣重复处理2次；合并滤液并真空减压浓缩得十大功劳 叶粗提物； (2) 将步骤（1)中粗提物用水打散，分别用正己烷，二氯甲烷，乙酸乙酯，正丁醇萃取， 萃取液过滤，减压浓缩分别得到正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取段，4°C冰 箱保存备用； ⑶单体的分离：采用正己烷-甲醇-乙酸乙酯-水为溶剂体系，上相为固定相，下相 为流动相，分离柱转速为700 - 900rpm，对十大功劳叶乙酸乙酯萃取段进行HSCCC分离， 紫外检测器在线监测，分别收集不同馏分并减压干燥，得绿原酸、槲皮素-3-0-0-D-葡萄 糖苷、异鼠李素_3_0_ 0 -D-匍萄糖苷。2. 根据权利要求1所述的高速逆流色谱分离纯化十大功劳叶中单体化合物的方法，其 特征在于，步骤（3)所述的正己烷-甲醇-乙酸乙酯-水的体积比为I:I:I:I- 1:8:1: 8。3. 根据权利要求2所述的高速逆流色谱分离纯化十大功劳叶中单体化合物的方法，其 特征在于，步骤（3)所述的正己烷-甲醇-乙酸乙酯-水的体积比为1:5:1:5。4. 根据权利要求1-3任一项所述的高速逆流色谱分离纯化十大功劳叶中单体化合物 的方法，其特征在于，步骤（3)所述的流动相流速为2mL/min。
【专利摘要】本发明公开了一种从十大功劳叶中快速分离纯化单体化合物的方法，包括以下步骤：取阴干粉碎的十大功劳叶，加入乙醇溶液超声提取，过滤，滤液减压浓缩得十大功劳叶提取物；提取物经不同极性溶剂萃取后，乙酸乙酯萃取段用高速逆流色谱仪分离，根据色谱图收集相应峰组分，减压浓缩干燥，得到高纯度绿原酸、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷，克服了传统制备方法操作复杂，样品死吸附损失，收率低等缺点。本方法效率高，操作简单，制备量大，综合成本低，具有很好的推广使用价值。
【IPC分类】C07H17/07, C07H1/08, C07C67/48, C07C69/732
【公开号】CN104892687
【申请号】CN201510316229
【发明人】胡卫成, 王新风, 沈婷, 吴磊
【申请人】淮阴师范学院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月11日
【技术领域】
[0001] 本发明属于天然药物化学领域，具体涉及一种从苦丁茶十大功劳叶中快速分离纯 化绿原酸、懈皮素_3_0_ β -D-匍萄糖苷、异鼠李素-3-〇- β -D-匍萄糖苷的方法。
【背景技术】
[0002] 十大功劳叶系小聚科植物阔叶十大功劳（#aAo/?ia Aea/ei (Fort. ) Carr.)的干 燥叶，具有清热解毒、消炎止痛、燥湿泻火、清肝明目之功效。在秦岭以南各省还被广泛应用 为苦丁茶。民间广泛用其作为主治头晕耳鸣、腰膝酸软、湿热泻痢、胃火牙痛、黄疸性肝炎等 疾病。现代药理研宄发现十大功劳具有抑菌、消炎、抗病毒、抗肿瘤、抗增殖及降血压等活 性，是一种有开发价值的药用植物。
[0003] 对十大功劳化学成分的研宄多集中在其生物碱上，现未有文献报道从十大功劳 叶中分离出绿原酸、槲皮素-3-0-β-D-葡萄糖苷、异鼠李素-3-0-β-D-葡萄糖苷化合 物，现有文献报道从其它中草药中分离纯化绿原酸、槲皮素-3-0-β-D-葡萄糖苷、异鼠李 素-3-0-β-D-葡萄糖苷等的方法常采用柱层析方法。柴兴云等[山银花中酚酸类成分研 宄，中国天然药物，2004年第6期]用95 %，90 %，85 %，70 %乙醇回流，乙酸乙酯萃取 及硅胶柱，SephadexLH - 20柱纯化分离的方法分离纯化，根据化合物的理化特征和光谱 数据鉴定其结构，从山银花中分离到绿原酸等化合物。槲皮素-3-0-β-D-葡萄糖苷、异鼠 李素-3-0-β -D-葡萄糖苷为分布在大部分高等植物植物中，万春鹏[东方肉穗草黄酮类 化学成分研宄，中国中药杂志，2009年第2期]以70%乙醇室温提取，醋酸乙酯溶剂萃 取和大孔吸附树脂、SephadexLH-20, ODS及正相硅胶柱等色谱手段进行分离，分离出槲皮 素-3-0-β-D-葡萄糖苷。赵小亮等[荷叶化学成分研宄，中国中药杂志，2013年第5期] 利用硅胶柱、大孔吸附树脂柱、Sephadex LH-20柱和制备薄层色谱法等分离手段，经理化常 数和光谱分析从荷叶正丁醇部分中分离得到异鼠李素-3-0-β -D-葡萄糖苷。
[0004] 这些成分通常采用反复的柱层析，操作复杂，耗时长，溶剂消耗量大，而且样品损 失大，重复效果不够理想。
[0005] 高速逆流色谱（High-Speed Counter-Current Chromatography，HSCCC)是 Ito 等发明的一种新型的、连续高效的液-液分配色谱，是建立在一种特殊的动力学平衡现 象--单向性流体动力平衡（HDES)体系之上的一种分离方法。与常规固-液色谱分离方法 相比较，由于采用液体作为固定相载体，目标化合物在互不相容的两相由于分配系数的不 同而得以分离，解决了传统固体载体样品死吸附、变性、峰形拖尾等问题，用高速逆流色谱 法不仅使分离速度大为提高，且根据紫外吸收色谱图可良好重复收集样品，具有制备效率 高、制备量大、费用低等优点，因而近年来日益受到人们的关注，已经广泛应用于生物医药、 天然产物、环境分析、食品和化妆品等领域，特别在天然产物行业中已被认为是一种有效的 新型分离技术。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于：克服现有技术的不足，提供一种操作简便、综合成本低、 分离量大、产品纯度高、样品损失小的高效快速从十大功劳叶中分离纯化绿原酸、槲皮 素-3-〇- β -D-匍萄糖昔、异鼠李素-3-〇- β -D-匍萄糖昔的方法。
[0007] 本发明的技术解决方案是：从十大功劳叶中分离纯化绿原酸、槲皮 素-3-〇-β -D-匍萄糖昔、异鼠李素-3-〇-β -D-匍萄糖昔的方法包括以下工艺步骤： (1)十大功劳叶提取物的制备：十大功劳叶阴干、粉碎，纯乙醇为溶剂超声提取，固液 比为1 :20，提取时间2 h，过滤，滤渣重复处理2次；合并滤液并真空减压浓缩得十大 功劳叶粗提物； ⑵将步骤1中粗提物用水打散，分别用正己烧，二氯甲烧，乙酸乙醋，正丁醇萃取，萃 取液过滤，减压浓缩分别得到正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取段，4° C冰箱 保存备用； (3)单体的分离：采用正己烷-甲醇-乙酸乙酯水为溶剂体系，上相为固定相，下相 为流动相，分离柱转速为700 - 900 rpm，对十大功劳叶乙酸乙酯萃取段进行HSCCC分离， 紫外检测器在线监测，分别收集不同馏分并减压干燥，得绿原酸、槲皮素-3-Ο-β-D-葡萄 糖苷、异鼠李素 _3_0_ β -D-匍萄糖苷。
[0008] 步骤（3)所述的正己烷-甲醇-乙酸乙酯-水的体积比为1: 1:1:1-1:8:1:8,优选 I:5:1:5〇
[0009] 步骤（3)所述的流动相流速为2 mL/min。
[0010] 本发明的优点是：十大功劳叶提取物分离后各馏分经HPLC检测纯度可达85%以 上，各馏分进一步提纯可得到95%以上的纯品绿原酸、槲皮素-3-Ο-β-D-葡萄糖苷、异鼠 李素-3-0- β -D-葡萄糖苷，该方法适用于从十大功劳叶中一步纯化制备高纯度的绿原酸、 懈皮素_3_0_ β -D-匍萄糖苷、异鼠李素-3-〇- β -D-匍萄糖苷。稳定性好，操作简便。
【附图说明】
[0011] 图1是高速逆流色谱分离纯化十大功劳叶的色谱图； 图2是分离纯化得到的绿原酸的高效液相色谱图； 图3是分离纯化得到的槲皮素-3-0-β-D-葡萄糖苷的高效液相色谱图； 图4是分离纯化得到的异鼠李素-3-0-β-D-葡萄糖苷的高效液相色谱图。
【具体实施方式】
[0012] 取自然阴干的十大功劳叶5.0 kg，粉碎，纯乙醇为溶剂超声提取，固液比为1 :20 ，提取时间2 h，过滤，滤渣重复处理2次；合并滤液并真空减压浓缩得十大功劳叶粗提 物；粗提物用水打散，分别用正己烧，二氯甲烧，乙酸乙醋，正丁醇萃取，萃取液过滤，减压浓 缩分别得到正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取段，4° C冰箱保存备用。采用体 积比1:5:1:5的正己烷-甲醇-乙酸乙酯水为溶剂体系，流动相（下相）流速为2 mL/ min，分离柱转速为900 rpm，上相为固定相，对十大功劳叶乙酸乙醋萃取段进行HSCCC分 离，紫外检测器在线监测，检测波长为254 nm，收集目标成分，馏分经减压浓缩干燥，得到 相应高纯度化合物，如图1所示。
[0013] 经1H-NMR、13C-NMR鉴定化学结构如下，
即所得单体化合物分别为绿原酸18. 32mg、槲皮素-3-0-β -D-葡萄糖苷20. 46 mg、异 鼠李素-3-0- β -D-葡萄糖苷28. 36 mg，以色谱峰面积归一化法计算，纯度均高于97%，如图 2-图4所示。
【主权项】
1. 高速逆流色谱分离纯化十大功劳叶中单体化合物的方法，其特征在于，包括以下工 艺步骤： (1) 十大功劳叶提取物的制备：十大功劳叶阴干、粉碎，纯乙醇为溶剂超声提取，固液 比为1 :20,提取时间2h，过滤，滤渣重复处理2次；合并滤液并真空减压浓缩得十大功劳 叶粗提物； (2) 将步骤（1)中粗提物用水打散，分别用正己烷，二氯甲烷，乙酸乙酯，正丁醇萃取， 萃取液过滤，减压浓缩分别得到正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取段，4°C冰 箱保存备用； ⑶单体的分离：采用正己烷-甲醇-乙酸乙酯-水为溶剂体系，上相为固定相，下相 为流动相，分离柱转速为700 - 900rpm，对十大功劳叶乙酸乙酯萃取段进行HSCCC分离， 紫外检测器在线监测，分别收集不同馏分并减压干燥，得绿原酸、槲皮素-3-0-0-D-葡萄 糖苷、异鼠李素_3_0_ 0 -D-匍萄糖苷。2. 根据权利要求1所述的高速逆流色谱分离纯化十大功劳叶中单体化合物的方法，其 特征在于，步骤（3)所述的正己烷-甲醇-乙酸乙酯-水的体积比为I:I:I:I- 1:8:1: 8。3. 根据权利要求2所述的高速逆流色谱分离纯化十大功劳叶中单体化合物的方法，其 特征在于，步骤（3)所述的正己烷-甲醇-乙酸乙酯-水的体积比为1:5:1:5。4. 根据权利要求1-3任一项所述的高速逆流色谱分离纯化十大功劳叶中单体化合物 的方法，其特征在于，步骤（3)所述的流动相流速为2mL/min。
【专利摘要】本发明公开了一种从十大功劳叶中快速分离纯化单体化合物的方法，包括以下步骤：取阴干粉碎的十大功劳叶，加入乙醇溶液超声提取，过滤，滤液减压浓缩得十大功劳叶提取物；提取物经不同极性溶剂萃取后，乙酸乙酯萃取段用高速逆流色谱仪分离，根据色谱图收集相应峰组分，减压浓缩干燥，得到高纯度绿原酸、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷，克服了传统制备方法操作复杂，样品死吸附损失，收率低等缺点。本方法效率高，操作简单，制备量大，综合成本低，具有很好的推广使用价值。
【IPC分类】C07H17/07, C07H1/08, C07C67/48, C07C69/732
【公开号】CN104892687
【申请号】CN201510316229
【发明人】胡卫成, 王新风, 沈婷, 吴磊
【申请人】淮阴师范学院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月11日
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