一种高纯度蔗果聚糖单体的制备方法
一种高纯度蔗果聚糖单体的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及高纯度蔗果聚糖单体的制备方法，尤其涉及利用高效液相色谱制备高 纯度蔗果聚糖单体的方法。
【背景技术】
[0002] 蔗果低聚糖，又称低聚果糖（FOS)，是指1~5个果糖基以β-2,1键连接在蔗糖的 D-果糖基上而形成的蔗果三糖（GF2)、蔗果四糖（GF3)、蔗果五糖（GF4)和蔗果六糖（GF5) 的混合物，如式1所示。它是一种存在于水果、蔬菜、蜂蜜等物质中的天然活性成份，是优良 的水溶性膳食纤维。低聚果糖作为益生元的代表，除具有一般功能性低聚糖的物理化学性 质外，最引人注目的生理特性是它能明显改善肠道内微生物种群比例，具有润肠通便、增强 免疫力、促进矿物质的吸收、改善肠道菌群、双相调节微生态平衡的"整肠"生理功能。甜度 为蔗糖的〇. 3-0. 6倍，是一种清甜可口的功能性食品配料，以其安全性和显著功能得到世 界范围的公认。
[0003]
[0004] 由于低聚果糖具有优异的生理学功能，因此普遍地被用作保健食品配料，在我国 低聚果糖亦被用做食品配料及营养强化剂。但是，高纯度蔗果聚糖单体的制备难度非常大， 导致相关产品质量很难控制。中国专利CN102408457中采用硅胶柱色谱制备蔗果三糖和蔗 果四糖，纯度只能达到90 %，无法作为高纯度对照品使用。王涛等人采用聚丙烯酰胺凝胶柱 分离得到了高纯度的蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖，但是洗脱速度低（0. 2ml/min)、洗脱时 间需要500分钟，制备效率太低，不适合工业化的生产方式。目前，尚未见到可适用于工业 化生产的同时制备三种高纯度蔗果聚糖单体的报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种利用制备高效液相色谱技术一步分离得到纯度98%以 上的蔗果聚糖单体的方法。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0007] -种蔗果聚糖单体的制备方法，包括以下步骤：
[0008] (1)将低聚果糖样品加水溶解，用滤膜过滤，得到制备样品溶液；
[0009] (2)用制备高效液相色谱法分离制备样品溶液，收集每个馏分，色谱条件：色谱柱 为X Amide，流动相为乙腈和水，柱温为室温，流动相速度为8~12ml/min，进样量为每次 200~300 μ 1，检测器为示差检测器或者蒸发光散射检测器；
[0010] (3)将收集到的馏分分别减压浓缩、干燥，得到蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖。
[0011] 进一步地，步骤（1)所述水的用量是低聚果糖样品重量的8~12倍。
[0012] 进一步地，步骤（1)所述滤膜是0. 45 μ m微孔滤膜。
[0013] 进一步地，步骤（2)所述乙腈和水的体积比是7~9 : 1~3。
[0014] 进一步地，步骤（2)所述乙腈和水的体积比是75 : 25。
[0015] 进一步地，步骤⑵所述X Amide色谱柱的规格为20 X 250mm，30 X 250mm或 50 X 250mm。
[0016] 进一步地，步骤（2)所述X Amide色谱柱的膜厚为10 μ m。
[0017] 进一步地，步骤（2)所述流动相速度为10ml/min。
[0018] 进一步地，该制备方法还包括：(4)用HPLC-ELSD方法测定所得蔗果三糖、蔗果四 糖和蔗果五糖的纯度。
[0019] 进一步地，该制备方法还包括：（5)对所得蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖进行 MS，1H-NMR 和 13C-NMR 的测定。
[0020] 本发明的有益效果是：
[0021] 1本发明只需一步就能从低聚果糖中分离得到高纯度的蔗果三糖、蔗果四糖和蔗 果五糖，产物纯度均在98%以上，可作为高纯度对照品使用。
[0022] 2本发明分离时间短，25min内就能完成洗脱。
[0023] 3本发明的制备量较大，可以放大生产，样品浓度为80~120mg/mL，每次进样 200 μ L，能够分离20mg左右样品。
[0024] 4本发明的制备方法回收率高、样品无损失、分离环境缓和、节约溶剂、生产成本 低。
【附图说明】
[0025] 图1为实施例1中分离低聚果糖的制备高效液相色谱图。
[0026] 图2为实施例2中分离低聚果糖的制备高效液相色谱图。
【具体实施方式】 [0027] 实施例1
[0028] (1)称取200mg低聚果糖，加入2ml水溶解，用0. 45 μ m微孔滤膜过滤，得到制备样 品溶液，溶液浓度为lOOmg/mL ;
[0029] (2)用制备高效液相色谱法分离制备样品溶液，色谱条件：色谱柱为X Amide (膜 厚10 μ m，规格20 X 250mm)，流动相为乙腈和水（体积比70 :30)，柱温为室温，流动相速度 为10ml/min，采用示差检测器，将流动相泵入色谱柱，待整个体系平衡稳定后进样，进样量 为每次200 μ1，如图1所示，收集1、2、3三个馏分，17min即完成分离；
[0030] (3)将收集到的馏分分别减压浓缩、干燥，得到蔗果三糖、鹿果四糖和蔗果五糖；
[0031] (4)用HPLC-ELSD方法测定所得蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的纯度。
[0032] 测定蔗果三糖纯度的色谱条件：
[0033] 仪器：Agilent 1260液相色谱仪；
[0034] 色谱柱：X Amide (规格 250mmX 4. 6mm，膜厚 5 μ m);
[0035] 流动相：A为乙腈，B为水；
[0036] 梯度条件：0-28min，80 % A，28-33min，80 % A-IO % A，33-40min，10 % A ;
[0037] 流速：1. OmT ,/mi η ；
[0038] 柱温：30°C ;
[0039] 运行时间：40min ;
[0040] 检测器：蒸发光散射检测器，蒸发器温度80°C，喷雾器温度90°C，气体流速 I. 2SLM ；
[0041] 进样体积：IOyL;
[0042] 样品浓度：0· 5mg/mL，50%色谱甲醇溶解。
[0043] 所得蔗果三糖的纯度为99. 87%。
[0044] 测定蔗果四糖纯度的色谱条件：
[0045] 仪器：Agilent 1260液相色谱仪；
[0046] 色谱柱：X Amide (规格 250mmX 4. 6mm，膜厚 5 μ m);
[0047] 流动相：乙腈/水=80/20 ;
[0048] 流速：1. OmT ,/mi η ；
[0049] 柱温：30°C ;
[0050] 运行时间：40min ;
[0051] 检测器：蒸发光散射检测器，蒸发器温度80°C，喷雾器温度90°C，气体流速 I. 2SLM ；
[0052] 进样体积：10yL;
[0053] 样品浓度：0· 5mg/mL，50%色谱甲醇溶解。
[0054] 所得蔗果四糖的纯度为99. 82%。
[0055] 测定蔗果五糖纯度的色谱条件：
[0056] 仪器：Agilent 1260液相色谱仪；
[0057] 色谱柱：X Amide (规格 250mmX 4. 6mm，膜厚 5 μ m);
[0058] 流动相：乙腈/水=73/27 ;
[0059] 流速：1. OmT ,/mi η ；
[0060] 柱温：30°C ;
[0061] 运行时间：40min ;
[0062] 检测器：蒸发光散射检测器，蒸发器温度80°C，喷雾器温度90°C，气体流速 I. 2SLM ；
[0063] 进样体积：IOyL;
[0064] 样品浓度：0· 5mg/mL，50%色谱甲醇溶解。
[0065] 所得蔗果五糖的纯度为99. 86%。
[0066] (5)对所得蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖进行结构鉴定。
[0067] 蔗果三糖为白色粉末；
[0068] 紫外光谱：最大吸收波长λ_194ηπι ;
[0069] 红外光谱数据：3391 (ν0Η)，2933 (vCH)，1421，1384 (δ CH)，1137,1056， 1029 ( v c_0);
[0070] 旋光度：[a]L +29.5 (c = 1，H20);
[0071] 高分辨质谱：采用Agilent 5973N质谱仪，HR-ESI-MS给出m/z 503. 1614[M-Hr(Calcd for C18H31016:503. 1612)和 527. 1599 [M+Na] +(Calcd for C18H32O16Na ：527. 1588)；
[0072] 核磁：采用 Varian600MHz 核磁共振波谱仪，综合 1H NMR、13C NMR、DEPT、HMQC、HMBC、 COSY对化合物的核磁数据进行归属，结果见表1。
[0073] 表1蔗果三糖的核磁共振氢谱、碳谱数据（氘代溶剂D2O)
[0074]
[0075]
[0076] 结合红外光谱、高分辨质谱、核磁共振谱推测化合物分子式为C18H31O 16，紫外光谱、 红外光谱、旋光度、高分辨质谱、核磁共振氢谱、碳谱数据与蔗果三糖的文献报道值一致，确 定馏分1的化合物为蔗果三糖。
[0077] 蔗果四糖为白色粉末；
[0078] 紫外光谱：最大吸收波长λ_198ηπι ;
[0079] 红外光谱数据：3391 (ν0Η)，2932 (vCH)，1454,1422,1339 (δ CH)，1134， 1030 ( v c_0);
[0080] 旋光度：时2;1: +11.0 (c = 1，H20);
[0081] 高分辨质谱：采用Agilent 5973N质谱仪，HR-ESI-MS给出m/z 665. 2147[M-Hr(Calcd for C24H41021:665. 2140)和 689. 2133[M+Na] +(Calcd for C24H42O21Na ：689. 2116)；
[0082] 核磁：采用 Varian600MHz 核磁共振波谱仪，综合 1H NMR、13C NMR、DEPT、HMQC、HMBC、 TocosyJh-1H cosy对化合物的核磁数据进行归属，结果见表2。
[0083] 表2蔗果四糖的核磁共振氢谱、碳谱数据（氘代溶剂D2O)
[0084]
[0085] 结合红外光谱、高分辨质谱、核磁共振谱推测化合物分子式为C24H42O21，紫外光谱、 红外光谱、旋光度、高分辨质谱、核磁共振氢谱、碳谱数据与蔗果四糖的文献报道值一致，确 定馏分2的化合物为蔗果四糖。
[0086] 蔗果五糖为白色粉末；
[0087] 紫外光谱：最大吸收波长λ_195ηπι ;
[0088] 红外光谱数据：3369 (ν0Η)，2932 (vCH)，1456,1421，1371 (δ CH)，1134， 1029 ( v c_0);
[0089] 旋光度：[?於：+29.0 (c = 1，H2O);
[0090] 高分辨质谱：采用Agilent 5973N质谱仪，HR-ESI-MS给出m/z 827.2684[M-Hr(Calcd for C3(IH51026:827.2645)和 851.2653 [M+Na]+(Calcd for C30H52O26Na ：851. 2645)；
[0091] 核磁：采用 Varian600MHz 核磁共振波谱仪，综合 1H NMR、13C NMR、DEPT、HMQC、HMBC、 TOCOSY对化合物的核磁数据进行归属，结果见表3。
[0092] 表3蔗果五糖的核磁共振氢谱、碳谱数据（氘代溶剂D2O)
[0093]
[0095] 结合红外光谱、高分辨质谱、核磁共振谱推测化合物分子式为C3tlH52O 26，紫外光谱、 红外光谱、旋光度、高分辨质谱、核磁共振氢谱、碳谱数据与蔗果五糖的文献报道值一致，确 定馏分3的化合物为蔗果五糖。
[0096] 实施例2
[0097] (1)称取IOOmg低聚果糖，加入1ml水溶解，用0. 45 μ m微孔滤膜过滤，得到制备样 品溶液，溶液浓度为lOOmg/mL ;
[0098] (2)用制备高效液相色谱法分离制备样品溶液，色谱条件：色谱柱为X Amide (膜 厚10 μ m，规格20 X 250mm)，流动相为乙腈和水（体积比75 :25)，柱温为室温，流动相速度 为10ml/min，采用示差检测器，将流动相泵入色谱柱，待整个体系平衡稳定后进样，进样量 为每次200 μ1，如图2所示，收集1、2、3三个馏分，25min即完成分离；
[0099] (3)将收集到的馏分分别减压浓缩、干燥，得到蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖； [0100] (4)用HPLC-ELSD方法测定所得蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的纯度分别为 98. 87%、99. 12%、99. 05%，高效液相色谱条件同实施例1步骤（4);
[0101] (5)对所得蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖进行MS，1H-NMR和13C-NMR的测定。确 定馏分1是蔗果三糖，馏分2是蔗果四糖，馏分3是蔗果五糖。
[0102] 实施例3
[0103] (1)称取IOOmg低聚果糖，加入0. 8ml水溶解，用0. 45 ym微孔滤膜过滤，得到制备 样品溶液，溶液浓度为125mg/mL ;
[0104] (2)用制备高效液相色谱法分离制备样品溶液，色谱条件：色谱柱为X Amide (膜 厚10 μ m，规格30 X 250mm)，流动相为乙腈和水（体积比90 :10)，柱温为室温，流动相速度 为8ml/min，采用蒸发光散射检测器，将流动相泵入色谱柱，待整个体系平衡稳定后进样，进 样量为每次250 μ 1，收集三个馏分，22min即完成分离；
[0105] (3)将收集到的馏分分别减压浓缩、干燥，得到蔗果三糖、鹿果四糖和蔗果五糖；
[0106] (4)用HPLC-ELSD方法测定所得蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的纯度分别为 99. 47%、99. Ol %、98. 95%，高效液相色谱条件同实施例1步骤（4);
[0107] (5)对所得蔗果三糖、鹿果四糖和蔗果五糖进行MS，1H-NMR和13C-NMR的测定。证 实得到蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖。
[0108] 实施例4
[0109] (1)称取200mg低聚果糖，加入2. 4ml水溶解，用0. 45 μ m微孔滤膜过滤，得到制备 样品溶液，溶液浓度为83mg/mL ;
[0110] (2)用制备高效液相色谱法分离制备样品溶液，色谱条件：色谱柱为X Amide (膜 厚10 μ m，规格50 X 250mm)，流动相为乙腈和水（体积比90 :30)，柱温为室温，流动相速度 为12ml/min，采用蒸发光散射检测器，将流动相泵入色谱柱，待整个体系平衡稳定后进样， 进样量为每次300 μ 1，收集三个馏分，20min即完成分离；
[0111] ⑶将收集到的馏分分别减压浓缩、干燥，得到蔗果三糖、鹿果四糖和蔗果五糖
[0112] (4)用HPLC-ELSD方法测定所得蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的纯度分别为 99. 17%、98. 98%、99. 55%，高效液相色谱条件同实施例1步骤（4);
[0113] (5)对所得蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖进行MS，1H-NMR和13C-NMR的测定。证 实得到蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖。
[0114] 由实施例1~4可知，应用本发明的方法制备蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖，产 物纯度均高达98%以上，分离时间短（25min内完成分离），分离量大。
[0115] 以上所述，仅为本发明的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此，任何 属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应 涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。
【主权项】
1. 一种蔗果聚糖单体的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： (1) 将低聚果糖样品加水溶解，用滤膜过滤，得到制备样品溶液； (2) 用制备高效液相色谱法分离制备样品溶液，收集每个馏分，色谱条件：色谱柱为X Amide，流动相为乙腈和水，柱温为室温，流动相速度为8~12ml/min，进样量为每次200~ 300y1，检测器为示差检测器或者蒸发光散射检测器； (3) 将收集到的馏分分别减压浓缩、干燥，得到蔗果三糖、鹿果四糖和蔗果五糖。2. 根据权利要求1所述的蔗果聚糖单体的制备方法，其特征在于，步骤（1)所述水的用 量是低聚果糖样品重量的8~12倍。3. 根据权利要求1所述的蔗果聚糖单体的制备方法，其特征在于，步骤（1)所述滤膜是 0. 45ym微孔滤膜。4. 根据权利要求1所述的蔗果聚糖单体的制备方法，其特征在于，步骤（2)所述乙腈和 水的体积比是7~9 : 1~3。5. 根据权利要求1所述的蔗果聚糖单体的制备方法，其特征在于，步骤（2)所述乙腈和 水的体积比是75 : 25。6. 根据权利要求1所述的蔗果聚糖单体的制备方法，其特征在于，步骤（2)所述X Amide色谱柱的规格为 20X250_，30X250mm或 50X250_。7. 根据权利要求1所述的蔗果聚糖单体的制备方法，其特征在于，步骤（2)所述X Amide色谱柱的膜厚为10ym。8. 根据权利要求1所述的蔗果聚糖单体的制备方法，其特征在于，步骤（2)所述流动相 速度为10ml/min〇9. 根据权利要求1所述的蔗果聚糖单体的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包 括：（4)用HPLC-ELSD方法测定所得蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的纯度。10. 根据权利要求1所述的蔗果聚糖单体的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包 括：（5)对所得蔗果三糖、鹿果四糖和蔗果五糖进行MS，1H-NMR和13C-NMR的测定。
【专利摘要】本发明公开了一种高纯度蔗果聚糖单体的制备方法，首先将低聚果糖样品加水溶解，用滤膜过滤，得到制备样品溶液；然后用制备高效液相色谱法分离制备样品溶液，收集每个馏分，色谱条件：色谱柱为X Amide，流动相为乙腈和水，柱温为室温，流动相速度为8～12ml/min，进样量为每次200～300μl，采用示差检测器或者蒸发光散射检测器；最后将收集到的馏分分别减压浓缩、干燥，得到蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖。本发明分离得到的蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的纯度均在98％以上，而且分离时间短，制备量较大，可以放大生产，回收率高，样品无损失，分离环境缓和，节约溶剂。
【IPC分类】C07H1/06, C07H3/06
【公开号】CN104892691
【申请号】CN201510284403
【发明人】段文娟, 纪文华, 王晓, 耿岩玲, 王岱杰, 魏远安, 陈子健, 伍剑锋, 郑惠玲
【申请人】量子高科(中国)生物股份有限公司, 山东省分析测试中心
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月28日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及高纯度蔗果聚糖单体的制备方法，尤其涉及利用高效液相色谱制备高 纯度蔗果聚糖单体的方法。
【背景技术】
[0002] 蔗果低聚糖，又称低聚果糖（FOS)，是指1~5个果糖基以β-2,1键连接在蔗糖的 D-果糖基上而形成的蔗果三糖（GF2)、蔗果四糖（GF3)、蔗果五糖（GF4)和蔗果六糖（GF5) 的混合物，如式1所示。它是一种存在于水果、蔬菜、蜂蜜等物质中的天然活性成份，是优良 的水溶性膳食纤维。低聚果糖作为益生元的代表，除具有一般功能性低聚糖的物理化学性 质外，最引人注目的生理特性是它能明显改善肠道内微生物种群比例，具有润肠通便、增强 免疫力、促进矿物质的吸收、改善肠道菌群、双相调节微生态平衡的"整肠"生理功能。甜度 为蔗糖的〇. 3-0. 6倍，是一种清甜可口的功能性食品配料，以其安全性和显著功能得到世 界范围的公认。
[0003]
[0004] 由于低聚果糖具有优异的生理学功能，因此普遍地被用作保健食品配料，在我国 低聚果糖亦被用做食品配料及营养强化剂。但是，高纯度蔗果聚糖单体的制备难度非常大， 导致相关产品质量很难控制。中国专利CN102408457中采用硅胶柱色谱制备蔗果三糖和蔗 果四糖，纯度只能达到90 %，无法作为高纯度对照品使用。王涛等人采用聚丙烯酰胺凝胶柱 分离得到了高纯度的蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖，但是洗脱速度低（0. 2ml/min)、洗脱时 间需要500分钟，制备效率太低，不适合工业化的生产方式。目前，尚未见到可适用于工业 化生产的同时制备三种高纯度蔗果聚糖单体的报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种利用制备高效液相色谱技术一步分离得到纯度98%以 上的蔗果聚糖单体的方法。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0007] -种蔗果聚糖单体的制备方法，包括以下步骤：
[0008] (1)将低聚果糖样品加水溶解，用滤膜过滤，得到制备样品溶液；
[0009] (2)用制备高效液相色谱法分离制备样品溶液，收集每个馏分，色谱条件：色谱柱 为X Amide，流动相为乙腈和水，柱温为室温，流动相速度为8~12ml/min，进样量为每次 200~300 μ 1，检测器为示差检测器或者蒸发光散射检测器；
[0010] (3)将收集到的馏分分别减压浓缩、干燥，得到蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖。
[0011] 进一步地，步骤（1)所述水的用量是低聚果糖样品重量的8~12倍。
[0012] 进一步地，步骤（1)所述滤膜是0. 45 μ m微孔滤膜。
[0013] 进一步地，步骤（2)所述乙腈和水的体积比是7~9 : 1~3。
[0014] 进一步地，步骤（2)所述乙腈和水的体积比是75 : 25。
[0015] 进一步地，步骤⑵所述X Amide色谱柱的规格为20 X 250mm，30 X 250mm或 50 X 250mm。
[0016] 进一步地，步骤（2)所述X Amide色谱柱的膜厚为10 μ m。
[0017] 进一步地，步骤（2)所述流动相速度为10ml/min。
[0018] 进一步地，该制备方法还包括：(4)用HPLC-ELSD方法测定所得蔗果三糖、蔗果四 糖和蔗果五糖的纯度。
[0019] 进一步地，该制备方法还包括：（5)对所得蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖进行 MS，1H-NMR 和 13C-NMR 的测定。
[0020] 本发明的有益效果是：
[0021] 1本发明只需一步就能从低聚果糖中分离得到高纯度的蔗果三糖、蔗果四糖和蔗 果五糖，产物纯度均在98%以上，可作为高纯度对照品使用。
[0022] 2本发明分离时间短，25min内就能完成洗脱。
[0023] 3本发明的制备量较大，可以放大生产，样品浓度为80~120mg/mL，每次进样 200 μ L，能够分离20mg左右样品。
[0024] 4本发明的制备方法回收率高、样品无损失、分离环境缓和、节约溶剂、生产成本 低。
【附图说明】
[0025] 图1为实施例1中分离低聚果糖的制备高效液相色谱图。
[0026] 图2为实施例2中分离低聚果糖的制备高效液相色谱图。
【具体实施方式】 [0027] 实施例1
[0028] (1)称取200mg低聚果糖，加入2ml水溶解，用0. 45 μ m微孔滤膜过滤，得到制备样 品溶液，溶液浓度为lOOmg/mL ;
[0029] (2)用制备高效液相色谱法分离制备样品溶液，色谱条件：色谱柱为X Amide (膜 厚10 μ m，规格20 X 250mm)，流动相为乙腈和水（体积比70 :30)，柱温为室温，流动相速度 为10ml/min，采用示差检测器，将流动相泵入色谱柱，待整个体系平衡稳定后进样，进样量 为每次200 μ1，如图1所示，收集1、2、3三个馏分，17min即完成分离；
[0030] (3)将收集到的馏分分别减压浓缩、干燥，得到蔗果三糖、鹿果四糖和蔗果五糖；
[0031] (4)用HPLC-ELSD方法测定所得蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的纯度。
[0032] 测定蔗果三糖纯度的色谱条件：
[0033] 仪器：Agilent 1260液相色谱仪；
[0034] 色谱柱：X Amide (规格 250mmX 4. 6mm，膜厚 5 μ m);
[0035] 流动相：A为乙腈，B为水；
[0036] 梯度条件：0-28min，80 % A，28-33min，80 % A-IO % A，33-40min，10 % A ;
[0037] 流速：1. OmT ,/mi η ；
[0038] 柱温：30°C ;
[0039] 运行时间：40min ;
[0040] 检测器：蒸发光散射检测器，蒸发器温度80°C，喷雾器温度90°C，气体流速 I. 2SLM ；
[0041] 进样体积：IOyL;
[0042] 样品浓度：0· 5mg/mL，50%色谱甲醇溶解。
[0043] 所得蔗果三糖的纯度为99. 87%。
[0044] 测定蔗果四糖纯度的色谱条件：
[0045] 仪器：Agilent 1260液相色谱仪；
[0046] 色谱柱：X Amide (规格 250mmX 4. 6mm，膜厚 5 μ m);
[0047] 流动相：乙腈/水=80/20 ;
[0048] 流速：1. OmT ,/mi η ；
[0049] 柱温：30°C ;
[0050] 运行时间：40min ;
[0051] 检测器：蒸发光散射检测器，蒸发器温度80°C，喷雾器温度90°C，气体流速 I. 2SLM ；
[0052] 进样体积：10yL;
[0053] 样品浓度：0· 5mg/mL，50%色谱甲醇溶解。
[0054] 所得蔗果四糖的纯度为99. 82%。
[0055] 测定蔗果五糖纯度的色谱条件：
[0056] 仪器：Agilent 1260液相色谱仪；
[0057] 色谱柱：X Amide (规格 250mmX 4. 6mm，膜厚 5 μ m);
[0058] 流动相：乙腈/水=73/27 ;
[0059] 流速：1. OmT ,/mi η ；
[0060] 柱温：30°C ;
[0061] 运行时间：40min ;
[0062] 检测器：蒸发光散射检测器，蒸发器温度80°C，喷雾器温度90°C，气体流速 I. 2SLM ；
[0063] 进样体积：IOyL;
[0064] 样品浓度：0· 5mg/mL，50%色谱甲醇溶解。
[0065] 所得蔗果五糖的纯度为99. 86%。
[0066] (5)对所得蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖进行结构鉴定。
[0067] 蔗果三糖为白色粉末；
[0068] 紫外光谱：最大吸收波长λ_194ηπι ;
[0069] 红外光谱数据：3391 (ν0Η)，2933 (vCH)，1421，1384 (δ CH)，1137,1056， 1029 ( v c_0);
[0070] 旋光度：[a]L +29.5 (c = 1，H20);
[0071] 高分辨质谱：采用Agilent 5973N质谱仪，HR-ESI-MS给出m/z 503. 1614[M-Hr(Calcd for C18H31016:503. 1612)和 527. 1599 [M+Na] +(Calcd for C18H32O16Na ：527. 1588)；
[0072] 核磁：采用 Varian600MHz 核磁共振波谱仪，综合 1H NMR、13C NMR、DEPT、HMQC、HMBC、 COSY对化合物的核磁数据进行归属，结果见表1。
[0073] 表1蔗果三糖的核磁共振氢谱、碳谱数据（氘代溶剂D2O)
[0074]
[0075]
[0076] 结合红外光谱、高分辨质谱、核磁共振谱推测化合物分子式为C18H31O 16，紫外光谱、 红外光谱、旋光度、高分辨质谱、核磁共振氢谱、碳谱数据与蔗果三糖的文献报道值一致，确 定馏分1的化合物为蔗果三糖。
[0077] 蔗果四糖为白色粉末；
[0078] 紫外光谱：最大吸收波长λ_198ηπι ;
[0079] 红外光谱数据：3391 (ν0Η)，2932 (vCH)，1454,1422,1339 (δ CH)，1134， 1030 ( v c_0);
[0080] 旋光度：时2;1: +11.0 (c = 1，H20);
[0081] 高分辨质谱：采用Agilent 5973N质谱仪，HR-ESI-MS给出m/z 665. 2147[M-Hr(Calcd for C24H41021:665. 2140)和 689. 2133[M+Na] +(Calcd for C24H42O21Na ：689. 2116)；
[0082] 核磁：采用 Varian600MHz 核磁共振波谱仪，综合 1H NMR、13C NMR、DEPT、HMQC、HMBC、 TocosyJh-1H cosy对化合物的核磁数据进行归属，结果见表2。
[0083] 表2蔗果四糖的核磁共振氢谱、碳谱数据（氘代溶剂D2O)
[0084]
[0085] 结合红外光谱、高分辨质谱、核磁共振谱推测化合物分子式为C24H42O21，紫外光谱、 红外光谱、旋光度、高分辨质谱、核磁共振氢谱、碳谱数据与蔗果四糖的文献报道值一致，确 定馏分2的化合物为蔗果四糖。
[0086] 蔗果五糖为白色粉末；
[0087] 紫外光谱：最大吸收波长λ_195ηπι ;
[0088] 红外光谱数据：3369 (ν0Η)，2932 (vCH)，1456,1421，1371 (δ CH)，1134， 1029 ( v c_0);
[0089] 旋光度：[?於：+29.0 (c = 1，H2O);
[0090] 高分辨质谱：采用Agilent 5973N质谱仪，HR-ESI-MS给出m/z 827.2684[M-Hr(Calcd for C3(IH51026:827.2645)和 851.2653 [M+Na]+(Calcd for C30H52O26Na ：851. 2645)；
[0091] 核磁：采用 Varian600MHz 核磁共振波谱仪，综合 1H NMR、13C NMR、DEPT、HMQC、HMBC、 TOCOSY对化合物的核磁数据进行归属，结果见表3。
[0092] 表3蔗果五糖的核磁共振氢谱、碳谱数据（氘代溶剂D2O)
[0093]
[0095] 结合红外光谱、高分辨质谱、核磁共振谱推测化合物分子式为C3tlH52O 26，紫外光谱、 红外光谱、旋光度、高分辨质谱、核磁共振氢谱、碳谱数据与蔗果五糖的文献报道值一致，确 定馏分3的化合物为蔗果五糖。
[0096] 实施例2
[0097] (1)称取IOOmg低聚果糖，加入1ml水溶解，用0. 45 μ m微孔滤膜过滤，得到制备样 品溶液，溶液浓度为lOOmg/mL ;
[0098] (2)用制备高效液相色谱法分离制备样品溶液，色谱条件：色谱柱为X Amide (膜 厚10 μ m，规格20 X 250mm)，流动相为乙腈和水（体积比75 :25)，柱温为室温，流动相速度 为10ml/min，采用示差检测器，将流动相泵入色谱柱，待整个体系平衡稳定后进样，进样量 为每次200 μ1，如图2所示，收集1、2、3三个馏分，25min即完成分离；
[0099] (3)将收集到的馏分分别减压浓缩、干燥，得到蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖； [0100] (4)用HPLC-ELSD方法测定所得蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的纯度分别为 98. 87%、99. 12%、99. 05%，高效液相色谱条件同实施例1步骤（4);
[0101] (5)对所得蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖进行MS，1H-NMR和13C-NMR的测定。确 定馏分1是蔗果三糖，馏分2是蔗果四糖，馏分3是蔗果五糖。
[0102] 实施例3
[0103] (1)称取IOOmg低聚果糖，加入0. 8ml水溶解，用0. 45 ym微孔滤膜过滤，得到制备 样品溶液，溶液浓度为125mg/mL ;
[0104] (2)用制备高效液相色谱法分离制备样品溶液，色谱条件：色谱柱为X Amide (膜 厚10 μ m，规格30 X 250mm)，流动相为乙腈和水（体积比90 :10)，柱温为室温，流动相速度 为8ml/min，采用蒸发光散射检测器，将流动相泵入色谱柱，待整个体系平衡稳定后进样，进 样量为每次250 μ 1，收集三个馏分，22min即完成分离；
[0105] (3)将收集到的馏分分别减压浓缩、干燥，得到蔗果三糖、鹿果四糖和蔗果五糖；
[0106] (4)用HPLC-ELSD方法测定所得蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的纯度分别为 99. 47%、99. Ol %、98. 95%，高效液相色谱条件同实施例1步骤（4);
[0107] (5)对所得蔗果三糖、鹿果四糖和蔗果五糖进行MS，1H-NMR和13C-NMR的测定。证 实得到蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖。
[0108] 实施例4
[0109] (1)称取200mg低聚果糖，加入2. 4ml水溶解，用0. 45 μ m微孔滤膜过滤，得到制备 样品溶液，溶液浓度为83mg/mL ;
[0110] (2)用制备高效液相色谱法分离制备样品溶液，色谱条件：色谱柱为X Amide (膜 厚10 μ m，规格50 X 250mm)，流动相为乙腈和水（体积比90 :30)，柱温为室温，流动相速度 为12ml/min，采用蒸发光散射检测器，将流动相泵入色谱柱，待整个体系平衡稳定后进样， 进样量为每次300 μ 1，收集三个馏分，20min即完成分离；
[0111] ⑶将收集到的馏分分别减压浓缩、干燥，得到蔗果三糖、鹿果四糖和蔗果五糖
[0112] (4)用HPLC-ELSD方法测定所得蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的纯度分别为 99. 17%、98. 98%、99. 55%，高效液相色谱条件同实施例1步骤（4);
[0113] (5)对所得蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖进行MS，1H-NMR和13C-NMR的测定。证 实得到蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖。
[0114] 由实施例1~4可知，应用本发明的方法制备蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖，产 物纯度均高达98%以上，分离时间短（25min内完成分离），分离量大。
[0115] 以上所述，仅为本发明的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此，任何 属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应 涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。
【主权项】
1. 一种蔗果聚糖单体的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： (1) 将低聚果糖样品加水溶解，用滤膜过滤，得到制备样品溶液； (2) 用制备高效液相色谱法分离制备样品溶液，收集每个馏分，色谱条件：色谱柱为X Amide，流动相为乙腈和水，柱温为室温，流动相速度为8~12ml/min，进样量为每次200~ 300y1，检测器为示差检测器或者蒸发光散射检测器； (3) 将收集到的馏分分别减压浓缩、干燥，得到蔗果三糖、鹿果四糖和蔗果五糖。2. 根据权利要求1所述的蔗果聚糖单体的制备方法，其特征在于，步骤（1)所述水的用 量是低聚果糖样品重量的8~12倍。3. 根据权利要求1所述的蔗果聚糖单体的制备方法，其特征在于，步骤（1)所述滤膜是 0. 45ym微孔滤膜。4. 根据权利要求1所述的蔗果聚糖单体的制备方法，其特征在于，步骤（2)所述乙腈和 水的体积比是7~9 : 1~3。5. 根据权利要求1所述的蔗果聚糖单体的制备方法，其特征在于，步骤（2)所述乙腈和 水的体积比是75 : 25。6. 根据权利要求1所述的蔗果聚糖单体的制备方法，其特征在于，步骤（2)所述X Amide色谱柱的规格为 20X250_，30X250mm或 50X250_。7. 根据权利要求1所述的蔗果聚糖单体的制备方法，其特征在于，步骤（2)所述X Amide色谱柱的膜厚为10ym。8. 根据权利要求1所述的蔗果聚糖单体的制备方法，其特征在于，步骤（2)所述流动相 速度为10ml/min〇9. 根据权利要求1所述的蔗果聚糖单体的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包 括：（4)用HPLC-ELSD方法测定所得蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的纯度。10. 根据权利要求1所述的蔗果聚糖单体的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包 括：（5)对所得蔗果三糖、鹿果四糖和蔗果五糖进行MS，1H-NMR和13C-NMR的测定。
【专利摘要】本发明公开了一种高纯度蔗果聚糖单体的制备方法，首先将低聚果糖样品加水溶解，用滤膜过滤，得到制备样品溶液；然后用制备高效液相色谱法分离制备样品溶液，收集每个馏分，色谱条件：色谱柱为X Amide，流动相为乙腈和水，柱温为室温，流动相速度为8～12ml/min，进样量为每次200～300μl，采用示差检测器或者蒸发光散射检测器；最后将收集到的馏分分别减压浓缩、干燥，得到蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖。本发明分离得到的蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的纯度均在98％以上，而且分离时间短，制备量较大，可以放大生产，回收率高，样品无损失，分离环境缓和，节约溶剂。
【IPC分类】C07H1/06, C07H3/06
【公开号】CN104892691
【申请号】CN201510284403
【发明人】段文娟, 纪文华, 王晓, 耿岩玲, 王岱杰, 魏远安, 陈子健, 伍剑锋, 郑惠玲
【申请人】量子高科(中国)生物股份有限公司, 山东省分析测试中心
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月28日
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