两个新的环烯醚萜苷化合物及其制备方法和用图
两个新的环烯醚萜苷化合物及其制备方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药技术领域，具体是两个新的环烯醚萜苷化合物及其制备方法和用 途。
【背景技术】
[0002] 裸花紫珠 （Callicarpa nudifIora Hook, ex Arn.)为马鞭草科（Verbenaceae)紫 珠属（Callicarpa L )植物，主产于我国海南、广东、广西、江西等地，莖叶或全株入药。裸 花紫珠叶具有抗菌止血，消炎解毒，散瘀消肿，驱风祛湿，增强免疫的功效，常用于治疗脓性 炎症、急性传染性肝炎、肺结核咳血、胃肠出血、呼吸道及消化道出血、创伤出血等症，外用 治烧、烫伤及外伤出血等疾病。
[0003] 血栓病是一类严重危害人类健康的常见病和多发病，同时也是发病率、致残率和 死亡率最高的疾病。据世界卫生组织（WHO)统计，全球每年死于心脑血管疾病的人数达 1200万人，接近世界总死亡人数的1/4。我国每年死于心脑血管疾病的人数达260万人以 上，存活的患者75%致残，其中40%以上重残。随着经济快速发展，人们的生活方式改变， 体力劳动减少，营养过剩以及老龄化等因素，导致血栓性疾病的发病率逐年增长，给社会和 家庭造成了极大的负担。许多抗血栓药物具有潜在的不良反应或抗药性，主要表现为恶心、 呕吐、腹泻、皮瘆和胃肠反应，限制了它们在临床上的广泛应用。
[0004] 我国传统中药中的"活血化瘀"作用与现代医学的抗血栓理念相似，并且毒副作用 小、资源丰富。因此，通过采用现代的生物活性筛选模型，从具有活血化瘀功效的中药中寻 找到高效、毒副作用小的抗血栓药物活性成分或先导化合物，尤其是抗花生四烯酸诱导血 小板聚集作用环烯醚萜苷化合物，进而开发为对血栓有预防和治疗的药物。
【发明内容】
[0005] 发明目的：
[0006] 本发明的目的是提供两个新的环烯醚萜苷化合物及其制备方法和用途。
[0007] 本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
[0008] 1、一种环烯醚萜苷化合物，该环烯醚萜苷化合物的化学名称是：7-0-E-p-香豆 酰-8-epi-番木鳖酸；分子式为C 25H3tlO12，其化学结构式如下：
[0009]
[0010] 2、一种环烯醚萜苷化合物，该环烯醚萜苷化合物的化学名称是：7-0-E-p-香豆 酰-栀子新戒；分子式为C 25H28O12，其化学结构式如下：
[0011]
[0012] 3、7-0-E-p-香豆酰-8-印i-番木鳖酸和7-0-E-p-香豆酰-栀子新甙的制备方法， 其特征在于，操作步骤如下：
[0013] 1)浸膏的制备
[0014] 取裸花紫珠干燥叶，用7-10倍干燥的裸花紫珠叶量体积百分浓度为60%~95% 的乙醇回流提取2~3次，每次2~3小时，合并提取液，用旋转蒸发仪在低于50°C的条件 下减压回收乙醇后得浸膏；
[0015] 2)正丁醇层浸膏的制备
[0016] 将步骤1)浸膏混悬于水中，得到浸膏水混悬液，用乙酸乙酯对浸膏水混悬液萃取 四次，再用正丁醇对乙酸乙酯萃取浸膏水混悬液后的浸膏水混悬液萃取三次，合并萃取后 的正丁醇层液体，在低于50°C的条件下减压回收正丁醇层的溶剂正丁醇，得到正丁醇层浸 膏。
[0017] 3) 7-0-E-p-香豆酰-8-印i-番木鳖酸和7-0-E-p-香豆酰-栀子新甙的制备
[0018] 将正丁醇层浸膏用6-10倍蒸馏水溶解，过滤，滤液用XAD-7大孔树脂分离，分别用 水和95%乙醇洗脱，得到水洗脱部分和95%乙醇洗脱部分；
[0019] 95%乙醇洗脱部分减压浓缩，得95%乙醇洗脱部分浸膏，经硅胶常压柱层析，用氯 仿：甲醇（99:1 - 60:40)梯度洗脱，将洗脱液进行薄层检测，浓缩合并类似洗脱馏分，得13 个馏分E1-E13O
[0020] 将馏分E5经硅胶常压柱层析，用氯仿：甲醇（85:15-75:25)梯度洗脱，得到6个馏 分Ep 1-Ep6。将馏分E5-4再次硅胶常压柱层析，用氯仿：甲醇（95:5-80:20)梯度洗脱，得到 12个馏分E 5K-E^12，将馏*E5_4_1(I经中压反相柱分离，用甲醇：水（30% -100% )梯度洗脱 得到17个小馏分Ε5_4_1(Η1-Ε 5_4_1(Ι_17，馏分E5_ 4_1(i_9用制备液相色谱分离，得化合物7-0-E-p-香 豆酰-8-epi-番木鳖酸和7-0-E-p-香豆酰-栀子新戒。
[0021] 上述的7-0-E-p-香豆酰-8-印i-番木鳖酸或其衍生物用于制备抗血栓药物。
[0022] 上述的7-0-E-p-香豆酰-栀子新甙或其衍生物用于制备抗血栓药物。
[0023] 本发明的益效是：
[0024] 1、提供了 7-0-E-p-香豆酰-8-印i-番木鳖酸和7-0-E-p-香豆酰-栀子新甙的结 构鉴定方法及其制备方法。
[0025] 2、本发明得到的7-0-E-p-香豆酰-8-epi-番木鳖酸和7-0-E-p-香豆酰-栀子新 甙在0. 56mmol/L时均具有显著抗花生四烯酸诱导血小板聚集作用，IC5tl分别为0. 33mM和 0.54mM。而且来自传统中药，安全可靠，具有非常良好的药用前景，可做成包括但不限于颗 粒剂、片剂、注射剂等各种剂型。
【附图说明】
[0026] 图1为7-0-E-p-香豆酰-8-印i-番木鳖酸和7-0-E-p-香豆酰-栀子新甙的制备 工艺流程示意图，【附图说明】了 7-0-E-p-香豆酰-8-印i-番木鳖酸和7-0-E-p-香豆酰-栀 子新甙的制备步骤为：（1)乙醇回流提取；（2)浓缩乙醇提取液；（3)乙酸乙酯、正丁醇依次 萃取；(4)浓缩正丁醇萃取液；（5)大孔树脂分离；(6)柱层析分离；（7)纯化。
[0027] 图2为7-0-E-p-香豆酰-8-印i-番木鳖酸的HRESMS高分辨率质谱图；
[0028] 图3为7-O-E-p-香豆酰-8-印i-番木鳖酸的1H NMR谱图；
[0029] 图4为7-O-E-p-香豆酰-8-印i-番木鳖酸13C NMR谱图；
[0030] 图5为7-O-E-p-香豆酰-8-印i-番木鳖酸的HSQC谱图；
[0031] 图6为7-O-E-p-香豆酰-8-印i-番木鳖酸的HMBC谱图；
[0032] 图7为7-O-E-p-香豆酰-8-印i-番木鳖酸的1H-1H COSY谱图；
[0033] 图8为7-O-E-p-香豆酰-8-印i-番木鳖酸的NOESY谱图；
[0034] 图9为7-O-E-p-香豆酰-栀子新甙的HRESMS高分辨率质谱图；
[0035] 图10为7-O-E-p-香豆酰-栀子新甙的1H NMR谱图；
[0036] 图11为7-O-E-p-香豆酰-栀子新甙13C NMR谱图；
[0037] 图12为7-O-E-p-香豆酰-栀子新甙的HSQC谱图；
[0038] 图13为7-O-E-p-香豆酰-栀子新甙的HMBC谱图；
[0039] 图14为7-O-E-p-香豆酰-栀子新甙的1H-1H COSY谱图；
[0040] 图15为7-O-E-p-香豆酰-栀子新甙的NOESY谱图。
【具体实施方式】
[0041] 下面结合实施例对本发明作进一步阐述。必须说明下述实施例是用于说明本发明 而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保 护的范围。
[0042] 岛津2010系列高效液相色谱仪（日本岛津公司），BUCHi中压液相制备色谱仪（瑞 士步琪公司），Waters系列高效液相色谱仪（包括Waters 600Control，PAA2996型二极管 阵列检测器，Waters 717Plus自动进样器，Empower化学工作站）（美国Waters公司），安 捷伦1200型半制备高效液相色谱仪，Sartoris BP211A型电子天平（德国赛托利斯集团）， EYELA SB-1000旋转蒸发仪（日本EYELA公司），电热恒温水浴锅（上海跃进医疗器械厂）， UV-260分光光度计（日本岛津公司），Varian UNITY INOVA 600超导核磁共振仪（美国 Varian 公司），Micromass ZabSpec 质谱仪（美国 Micromass 公司），Autopol IV-T/V 旋光 仪（美国AKSH公司），XAD-7大孔树脂（Sigma公司），RY-IG熔点测定仪（中国天津天光光 学仪器有限公司），C 18反相填料为YMC生产，柱层析硅胶、薄层层析硅胶为青岛海洋化工厂 生产。
[0043] 甲醇为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯。
[0044] 实施例1 :裸花紫珠叶中7-O-E-p-香豆酰-8-印i-番木鳖酸和7-O-E-p-香豆 酰-栀子新甙的提取分离方法：
[0045] 取裸花紫珠干燥叶9. 6kg，用8倍量80 %的乙醇回流提取3次，每次2小时，合并 提取液，用旋转蒸发仪在低于50°C的条件下减压回收乙醇后得浸膏I. 8kg ;将浸膏混悬于 水中，得到浸膏水混悬液，用乙酸乙酯对浸膏水混悬液萃取四次，再用正丁醇对乙酸乙酯萃 取浸膏水混悬液后的浸膏水混悬液萃取三次，合并萃取后的正丁醇层液体，在低于50°C的 条件下减压回收正丁醇层的溶剂正丁醇，得到正丁醇层浸膏545g。
[004 6] 将正丁醇层浸膏用6倍蒸馏水溶解，过滤，滤液用XAD-7大孔树脂分离，分别用水 和95 %乙醇洗脱，得到水洗脱部分和95 %乙醇洗脱部分，95 %乙醇洗脱部分减压浓缩，得 到95%乙醇洗脱部分浸膏245g，经硅胶常压柱层析，用氯仿：甲醇（99:1 - 60:40)梯度洗 脱，将洗脱液进行薄层检测，浓缩合并类似洗脱馏分，得13个馏分E1-Ew
[0047] 将馏分E5(13.9g)经硅胶常压柱层析，用氯仿：甲醇（85:15-75:25)梯度洗脱，得 到6个馏分E m-Em。将馏分E5_4(7.2g)再次硅胶常压柱层析，用氯仿：甲醇（95:5-80:20) 梯度洗脱，得到12个馏分E 5I1-E5^2，将馏*E5_ 4_1(i (4. 3g)经中压反相柱分离，用甲醇：水 (30% -100% )梯度洗脱得到17个小馏分E5L1-E5L17，馏分E 5_4_1Q_9(457mg)用制备液相 色谱分离，得化合物7-O-E-p-香豆酰-8-epi-番木鳖酸（47. 4mg)和7-O-E-p-香豆酰-栀 子新戒（14mg)。
[0048] 实施例2 :裸花紫珠中两个新的环烯醚萜苷化合物结构鉴定
[0049] l、7-0-E-p-香豆酰-8-印i-番木鳖酸：白色无定形粉末，易溶于丙酮、正丁醇、 吡啶、甲醇等有机试剂，熔点为179~180 °C，光学活性[a ]2°D-58. 8 (c 0. 08, MeOH); UV(CH3OH) λ_288ηπι 和 312nm，HRESMS 给出分子量为 ι?/ζ521·1656[Μ-ΗΓ。分子式为 C25H3tlO12; 1H与13C NMR数据见表1，同时，通过测定二维H-H相关谱（1H-1H COSY)、H-C相关 谱（HSQC)、H-C远程相关谱（HMBC)以及旋转坐标系NOE (NOESY)，确定了所有碳原子和氢原 子的信号归属及该化合物的化学结构。化学结构式如下：
[0050]
[0051] 表1 7-0-E-p-香豆酰-8-epi-番木鳖酸的氢谱和碳谱数据表（δ in ppm, J in Hz)
[0052]
[0053]
[0054] 注：INOVA 600MHz ; δ化学位移单位ppm，1H-NMR和13C-NMR测试溶剂为氘代甲醇； 核磁共振信号的归属是在HSQC、HMBC等二维谱基础上完成的。
[0055] 2、7-0-E_p-香豆酰-栀子新甙：白色无定形粉末，易溶于丙酮、正丁醇、吡啶、甲 醇等有机试剂，熔点为 152 ~153°C，光学活性[a]2°D-25. 3(c 0. 07, MeOH) ;UV(CH30H) λ·288ηπι 和 312nm，HRESMS 给出分子量为 m/z 543. 1479 [M+Na]+。分子式为 C25H28O12; 1H 与13C NMR数据见表2,同时，通过测定二维H-H相关谱（1H-1H COSY)、H-C相关谱（HSQC)、 H-C远程相关谱（HMBC)以及旋转坐标系NOE (NOESY)，确定了所有碳原子和氢原子的信号归 属及该化合物的化学结构。化学结构式如下：
[0056]
[0057] 表2 7-O-E-p-香豆酰-栀子新戒的氢谱和碳谱数据表（δ in ppm, J in Hz)
[0058]
[0059] 注：INOVA 600MHz ; δ化学位移单位ppm，1H-NMR和13C-NMR测试溶剂为氘代吡啶； 核磁共振信号的归属是在HSQC、HMBC等二维谱基础上完成的。
[0060] 实施例3 :两个新的环烯醚萜苷化合物抗花生四烯酸诱导血小板聚集活性测试
[0061] 抑制率（％) =(单体组吸光度值-诱导剂组吸光度值）/单体组吸光度值
[0062] 试验方法：以3. 8%枸橼酸钠-血1:9的比例收集大鼠腹主动脉血于一次性真空 采血管中，1000 rpm离心15min，取上清液得富血小板血衆（Platelet rich plasma，PRP)，剩 余部分3000rpm离心10min，取上清液得贫血小板血衆（Platelet poorplasma，PPP)。PRP 与PPP等比稀释，混匀后取Iml于玻璃管中，各管中加入20 μ 1阳性药奥扎格雷和各单体 (终浓度约为0. 05mmol/l)，诱导剂管加入等量DMSO, 37°C温育IOmin后取出加入20 μ 1诱 导剂花生四烯酸（终浓度约为5mmol/l)，温育5min，紫外分光光度计于490nm处测吸光度 值，计算化合物的抑制率。
[0063] 表3 7-0-E-p-香豆酰-8-印i-番木鳖酸和7-0-E-p-香豆酰-栀子新甙抗花生四 烯酸诱导血小板聚集活性
[0064]
[0065] 总结：7-0-E-p-香豆酰-8-印i-番木鳖酸和7-0-E-p-香豆酰-栀子新甙对花生 四烯酸诱导血小板聚集均有显著抑制作用，可用于研制抗血栓的药物。
【主权项】
1. 一种环烯醚萜苷化合物，其特征在于，该环烯醚萜苷化合物的化学名称是： 7-仏斤/^香豆酰-8-6>/7i-番木鳖酸；分子式为C25H3tlO12，其化学结构式如下：2. -种环烯醚萜苷化合物，其特征在于，该环烯醚萜苷化合物的化学名称是： 7_香豆酰-栀子新戒；分子式为C25H28O12，其化学结构式如下：3. 按照权利要求1和2所述的7- f万-扩香豆酰-8-6>/7i-番木鳖酸和7-仏万-扩香豆 酰-栀子新甙的制备方法，其特征在于，操作步骤如下： 1) 浸膏的制备 取裸花紫珠干燥叶，用7-10倍干燥的裸花紫珠叶量体积百分浓度为60% ~ 95%的乙醇 回流提取2 ~ 3次，每次2 ~ 3小时，合并提取液，用旋转蒸发仪在低于50°C的条件下减压 回收乙醇后得浸膏； 2) 正丁醇层浸膏的制备 将步骤1)浸膏混悬于水中，得到浸膏水混悬液，用乙酸乙酯对浸膏水混悬液萃取四 次，再用正丁醇对乙酸乙酯萃取浸膏水混悬液后的浸膏水混悬液萃取三次，合并萃取后的 正丁醇层液体，在低于50°C的条件下减压回收正丁醇层的溶剂正丁醇，得到正丁醇层浸 膏； 3) 香豆酰-8-e/?i-番木鳖酸和香豆酰-栀子新戒的制备 将正丁醇层浸膏用6-10倍蒸馏水溶解，过滤，滤液用XAD-7大孔树脂分离，分别用水和 95%乙醇洗脱，得到水洗脱部分和95%乙醇洗脱部分； 95%乙醇洗脱部分减压浓缩，得95%乙醇洗脱部分浸膏，经硅胶常压柱层析，用氯仿：甲 醇（99:1 -60:40)梯度洗脱，将洗脱液进行薄层检测，浓缩合并类似洗脱馏分，得13个馏 分 E1-E13 ; 将馏分E5经硅胶常压柱层析，用氯仿：甲醇（85:15-75:25)梯度洗脱，得到6个馏分 Ε5-1_Ε5-6; 将馏分E5-4再次硅胶常压柱层析，用氯仿：甲醇（95:5-80:20)梯度洗脱，得到12个 馏分E5_4_「E5_4_12，将馏*E 5_4_1(I经中压反相柱分离，用甲醇：水（30%-100%)梯度洗脱得到 17个小馏分Ε5_4_1(Η1-Ε5_ 4_1(Ι_17，馏分E5_4_ 1(l_9用制备液相色谱分离，得化合物7- 香豆 酰-8-e/?i-番木鳖酸和香豆酰-栀子新戒。4. 按照权利要求1所述的一种环烯醚萜苷化合物的用途，其特征在于，7-仏万-扩香豆 酰番木鳖酸或其衍生物用于制备抗血栓药物。5. 按照权利要求2所述的一种环稀醚猫苷化合物的用途，其特征在于，7- iM/?~couma royl-gardoside或其衍生物用于制备抗血栓药物。6. 根据权利要求4所述的7- f香豆酰-8-e/7i-番木鳖酸在制备抗血栓药物中的 应用，其特征是7-仏万-扩香豆酰-8-e/7i-番木鳖酸在0. 56mmol/L时对花生四烯酸诱导血 小板聚集的抑制率为52. 2%，IC5tl为0. 33 mM。7. 根据权利要求5所述的7-香豆酰-8-e/7i-番木鳖酸在制备抗血栓药物中的 应用，其特征是7-仏万-扩香豆酰-栀子新甙在0. 56mmol/L时对花生四烯酸诱导血小板聚 集的抑制率为59. 8%，IC5tl为0. 54 mM。
【专利摘要】本发明公开了两个新的环烯醚萜苷化合物及其制备方法和用途。两个新的环烯醚萜苷化合物，其中：第一个环烯醚萜苷化合物的化学名称是7-O-E-p-香豆酰-8-epi-番木鳖酸；第二个环烯醚萜苷化合物的化学名称是7-O-E-p-香豆酰-栀子新甙；它们的制备方法是以马鞭草科植物裸花紫珠 (Callicarpa nudiflora Hook.)的干燥叶为原料，通过1)浸膏的制备、2)正丁醇层浸膏的制备、3)7-O-E-p-香豆酰-8-epi-番木鳖酸和7-O-E-p-香豆酰-栀子新甙的制备的制备步骤完成。7-O-E-p-香豆酰-8-epi-番木鳖酸和7-O-E-p-香豆酰-栀子新甙的化学结构式分别为式(Ⅰ)和式(Ⅱ)。本发明公开了7-O-E-p-香豆酰-8-epi-番木鳖酸和7-O-E-p-香豆酰-栀子新甙的理化性质，光学活性，这两个新的环烯醚萜苷化合物具有显著的抗花生四烯酸诱导血小板聚集作用，可用于制备抗血栓药物。
【IPC分类】C07H1/08, C07H17/04, A61P7/02
【公开号】CN104892698
【申请号】CN201510102122
【发明人】罗跃华, 马双成, 付辉政, 付剑江, 陈伟康, 黄波, 王珊
【申请人】江西省食品药品检验所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年3月9日
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药技术领域，具体是两个新的环烯醚萜苷化合物及其制备方法和用 途。
【背景技术】
[0002] 裸花紫珠 （Callicarpa nudifIora Hook, ex Arn.)为马鞭草科（Verbenaceae)紫 珠属（Callicarpa L )植物，主产于我国海南、广东、广西、江西等地，莖叶或全株入药。裸 花紫珠叶具有抗菌止血，消炎解毒，散瘀消肿，驱风祛湿，增强免疫的功效，常用于治疗脓性 炎症、急性传染性肝炎、肺结核咳血、胃肠出血、呼吸道及消化道出血、创伤出血等症，外用 治烧、烫伤及外伤出血等疾病。
[0003] 血栓病是一类严重危害人类健康的常见病和多发病，同时也是发病率、致残率和 死亡率最高的疾病。据世界卫生组织（WHO)统计，全球每年死于心脑血管疾病的人数达 1200万人，接近世界总死亡人数的1/4。我国每年死于心脑血管疾病的人数达260万人以 上，存活的患者75%致残，其中40%以上重残。随着经济快速发展，人们的生活方式改变， 体力劳动减少，营养过剩以及老龄化等因素，导致血栓性疾病的发病率逐年增长，给社会和 家庭造成了极大的负担。许多抗血栓药物具有潜在的不良反应或抗药性，主要表现为恶心、 呕吐、腹泻、皮瘆和胃肠反应，限制了它们在临床上的广泛应用。
[0004] 我国传统中药中的"活血化瘀"作用与现代医学的抗血栓理念相似，并且毒副作用 小、资源丰富。因此，通过采用现代的生物活性筛选模型，从具有活血化瘀功效的中药中寻 找到高效、毒副作用小的抗血栓药物活性成分或先导化合物，尤其是抗花生四烯酸诱导血 小板聚集作用环烯醚萜苷化合物，进而开发为对血栓有预防和治疗的药物。
【发明内容】
[0005] 发明目的：
[0006] 本发明的目的是提供两个新的环烯醚萜苷化合物及其制备方法和用途。
[0007] 本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
[0008] 1、一种环烯醚萜苷化合物，该环烯醚萜苷化合物的化学名称是：7-0-E-p-香豆 酰-8-epi-番木鳖酸；分子式为C 25H3tlO12，其化学结构式如下：
[0009]
[0010] 2、一种环烯醚萜苷化合物，该环烯醚萜苷化合物的化学名称是：7-0-E-p-香豆 酰-栀子新戒；分子式为C 25H28O12，其化学结构式如下：
[0011]
[0012] 3、7-0-E-p-香豆酰-8-印i-番木鳖酸和7-0-E-p-香豆酰-栀子新甙的制备方法， 其特征在于，操作步骤如下：
[0013] 1)浸膏的制备
[0014] 取裸花紫珠干燥叶，用7-10倍干燥的裸花紫珠叶量体积百分浓度为60%~95% 的乙醇回流提取2~3次，每次2~3小时，合并提取液，用旋转蒸发仪在低于50°C的条件 下减压回收乙醇后得浸膏；
[0015] 2)正丁醇层浸膏的制备
[0016] 将步骤1)浸膏混悬于水中，得到浸膏水混悬液，用乙酸乙酯对浸膏水混悬液萃取 四次，再用正丁醇对乙酸乙酯萃取浸膏水混悬液后的浸膏水混悬液萃取三次，合并萃取后 的正丁醇层液体，在低于50°C的条件下减压回收正丁醇层的溶剂正丁醇，得到正丁醇层浸 膏。
[0017] 3) 7-0-E-p-香豆酰-8-印i-番木鳖酸和7-0-E-p-香豆酰-栀子新甙的制备
[0018] 将正丁醇层浸膏用6-10倍蒸馏水溶解，过滤，滤液用XAD-7大孔树脂分离，分别用 水和95%乙醇洗脱，得到水洗脱部分和95%乙醇洗脱部分；
[0019] 95%乙醇洗脱部分减压浓缩，得95%乙醇洗脱部分浸膏，经硅胶常压柱层析，用氯 仿：甲醇（99:1 - 60:40)梯度洗脱，将洗脱液进行薄层检测，浓缩合并类似洗脱馏分，得13 个馏分E1-E13O
[0020] 将馏分E5经硅胶常压柱层析，用氯仿：甲醇（85:15-75:25)梯度洗脱，得到6个馏 分Ep 1-Ep6。将馏分E5-4再次硅胶常压柱层析，用氯仿：甲醇（95:5-80:20)梯度洗脱，得到 12个馏分E 5K-E^12，将馏*E5_4_1(I经中压反相柱分离，用甲醇：水（30% -100% )梯度洗脱 得到17个小馏分Ε5_4_1(Η1-Ε 5_4_1(Ι_17，馏分E5_ 4_1(i_9用制备液相色谱分离，得化合物7-0-E-p-香 豆酰-8-epi-番木鳖酸和7-0-E-p-香豆酰-栀子新戒。
[0021] 上述的7-0-E-p-香豆酰-8-印i-番木鳖酸或其衍生物用于制备抗血栓药物。
[0022] 上述的7-0-E-p-香豆酰-栀子新甙或其衍生物用于制备抗血栓药物。
[0023] 本发明的益效是：
[0024] 1、提供了 7-0-E-p-香豆酰-8-印i-番木鳖酸和7-0-E-p-香豆酰-栀子新甙的结 构鉴定方法及其制备方法。
[0025] 2、本发明得到的7-0-E-p-香豆酰-8-epi-番木鳖酸和7-0-E-p-香豆酰-栀子新 甙在0. 56mmol/L时均具有显著抗花生四烯酸诱导血小板聚集作用，IC5tl分别为0. 33mM和 0.54mM。而且来自传统中药，安全可靠，具有非常良好的药用前景，可做成包括但不限于颗 粒剂、片剂、注射剂等各种剂型。
【附图说明】
[0026] 图1为7-0-E-p-香豆酰-8-印i-番木鳖酸和7-0-E-p-香豆酰-栀子新甙的制备 工艺流程示意图，【附图说明】了 7-0-E-p-香豆酰-8-印i-番木鳖酸和7-0-E-p-香豆酰-栀 子新甙的制备步骤为：（1)乙醇回流提取；（2)浓缩乙醇提取液；（3)乙酸乙酯、正丁醇依次 萃取；(4)浓缩正丁醇萃取液；（5)大孔树脂分离；(6)柱层析分离；（7)纯化。
[0027] 图2为7-0-E-p-香豆酰-8-印i-番木鳖酸的HRESMS高分辨率质谱图；
[0028] 图3为7-O-E-p-香豆酰-8-印i-番木鳖酸的1H NMR谱图；
[0029] 图4为7-O-E-p-香豆酰-8-印i-番木鳖酸13C NMR谱图；
[0030] 图5为7-O-E-p-香豆酰-8-印i-番木鳖酸的HSQC谱图；
[0031] 图6为7-O-E-p-香豆酰-8-印i-番木鳖酸的HMBC谱图；
[0032] 图7为7-O-E-p-香豆酰-8-印i-番木鳖酸的1H-1H COSY谱图；
[0033] 图8为7-O-E-p-香豆酰-8-印i-番木鳖酸的NOESY谱图；
[0034] 图9为7-O-E-p-香豆酰-栀子新甙的HRESMS高分辨率质谱图；
[0035] 图10为7-O-E-p-香豆酰-栀子新甙的1H NMR谱图；
[0036] 图11为7-O-E-p-香豆酰-栀子新甙13C NMR谱图；
[0037] 图12为7-O-E-p-香豆酰-栀子新甙的HSQC谱图；
[0038] 图13为7-O-E-p-香豆酰-栀子新甙的HMBC谱图；
[0039] 图14为7-O-E-p-香豆酰-栀子新甙的1H-1H COSY谱图；
[0040] 图15为7-O-E-p-香豆酰-栀子新甙的NOESY谱图。
【具体实施方式】
[0041] 下面结合实施例对本发明作进一步阐述。必须说明下述实施例是用于说明本发明 而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保 护的范围。
[0042] 岛津2010系列高效液相色谱仪（日本岛津公司），BUCHi中压液相制备色谱仪（瑞 士步琪公司），Waters系列高效液相色谱仪（包括Waters 600Control，PAA2996型二极管 阵列检测器，Waters 717Plus自动进样器，Empower化学工作站）（美国Waters公司），安 捷伦1200型半制备高效液相色谱仪，Sartoris BP211A型电子天平（德国赛托利斯集团）， EYELA SB-1000旋转蒸发仪（日本EYELA公司），电热恒温水浴锅（上海跃进医疗器械厂）， UV-260分光光度计（日本岛津公司），Varian UNITY INOVA 600超导核磁共振仪（美国 Varian 公司），Micromass ZabSpec 质谱仪（美国 Micromass 公司），Autopol IV-T/V 旋光 仪（美国AKSH公司），XAD-7大孔树脂（Sigma公司），RY-IG熔点测定仪（中国天津天光光 学仪器有限公司），C 18反相填料为YMC生产，柱层析硅胶、薄层层析硅胶为青岛海洋化工厂 生产。
[0043] 甲醇为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯。
[0044] 实施例1 :裸花紫珠叶中7-O-E-p-香豆酰-8-印i-番木鳖酸和7-O-E-p-香豆 酰-栀子新甙的提取分离方法：
[0045] 取裸花紫珠干燥叶9. 6kg，用8倍量80 %的乙醇回流提取3次，每次2小时，合并 提取液，用旋转蒸发仪在低于50°C的条件下减压回收乙醇后得浸膏I. 8kg ;将浸膏混悬于 水中，得到浸膏水混悬液，用乙酸乙酯对浸膏水混悬液萃取四次，再用正丁醇对乙酸乙酯萃 取浸膏水混悬液后的浸膏水混悬液萃取三次，合并萃取后的正丁醇层液体，在低于50°C的 条件下减压回收正丁醇层的溶剂正丁醇，得到正丁醇层浸膏545g。
[004 6] 将正丁醇层浸膏用6倍蒸馏水溶解，过滤，滤液用XAD-7大孔树脂分离，分别用水 和95 %乙醇洗脱，得到水洗脱部分和95 %乙醇洗脱部分，95 %乙醇洗脱部分减压浓缩，得 到95%乙醇洗脱部分浸膏245g，经硅胶常压柱层析，用氯仿：甲醇（99:1 - 60:40)梯度洗 脱，将洗脱液进行薄层检测，浓缩合并类似洗脱馏分，得13个馏分E1-Ew
[0047] 将馏分E5(13.9g)经硅胶常压柱层析，用氯仿：甲醇（85:15-75:25)梯度洗脱，得 到6个馏分E m-Em。将馏分E5_4(7.2g)再次硅胶常压柱层析，用氯仿：甲醇（95:5-80:20) 梯度洗脱，得到12个馏分E 5I1-E5^2，将馏*E5_ 4_1(i (4. 3g)经中压反相柱分离，用甲醇：水 (30% -100% )梯度洗脱得到17个小馏分E5L1-E5L17，馏分E 5_4_1Q_9(457mg)用制备液相 色谱分离，得化合物7-O-E-p-香豆酰-8-epi-番木鳖酸（47. 4mg)和7-O-E-p-香豆酰-栀 子新戒（14mg)。
[0048] 实施例2 :裸花紫珠中两个新的环烯醚萜苷化合物结构鉴定
[0049] l、7-0-E-p-香豆酰-8-印i-番木鳖酸：白色无定形粉末，易溶于丙酮、正丁醇、 吡啶、甲醇等有机试剂，熔点为179~180 °C，光学活性[a ]2°D-58. 8 (c 0. 08, MeOH); UV(CH3OH) λ_288ηπι 和 312nm，HRESMS 给出分子量为 ι?/ζ521·1656[Μ-ΗΓ。分子式为 C25H3tlO12; 1H与13C NMR数据见表1，同时，通过测定二维H-H相关谱（1H-1H COSY)、H-C相关 谱（HSQC)、H-C远程相关谱（HMBC)以及旋转坐标系NOE (NOESY)，确定了所有碳原子和氢原 子的信号归属及该化合物的化学结构。化学结构式如下：
[0050]
[0051] 表1 7-0-E-p-香豆酰-8-epi-番木鳖酸的氢谱和碳谱数据表（δ in ppm, J in Hz)
[0052]
[0053]
[0054] 注：INOVA 600MHz ; δ化学位移单位ppm，1H-NMR和13C-NMR测试溶剂为氘代甲醇； 核磁共振信号的归属是在HSQC、HMBC等二维谱基础上完成的。
[0055] 2、7-0-E_p-香豆酰-栀子新甙：白色无定形粉末，易溶于丙酮、正丁醇、吡啶、甲 醇等有机试剂，熔点为 152 ~153°C，光学活性[a]2°D-25. 3(c 0. 07, MeOH) ;UV(CH30H) λ·288ηπι 和 312nm，HRESMS 给出分子量为 m/z 543. 1479 [M+Na]+。分子式为 C25H28O12; 1H 与13C NMR数据见表2,同时，通过测定二维H-H相关谱（1H-1H COSY)、H-C相关谱（HSQC)、 H-C远程相关谱（HMBC)以及旋转坐标系NOE (NOESY)，确定了所有碳原子和氢原子的信号归 属及该化合物的化学结构。化学结构式如下：
[0056]
[0057] 表2 7-O-E-p-香豆酰-栀子新戒的氢谱和碳谱数据表（δ in ppm, J in Hz)
[0058]
[0059] 注：INOVA 600MHz ; δ化学位移单位ppm，1H-NMR和13C-NMR测试溶剂为氘代吡啶； 核磁共振信号的归属是在HSQC、HMBC等二维谱基础上完成的。
[0060] 实施例3 :两个新的环烯醚萜苷化合物抗花生四烯酸诱导血小板聚集活性测试
[0061] 抑制率（％) =(单体组吸光度值-诱导剂组吸光度值）/单体组吸光度值
[0062] 试验方法：以3. 8%枸橼酸钠-血1:9的比例收集大鼠腹主动脉血于一次性真空 采血管中，1000 rpm离心15min，取上清液得富血小板血衆（Platelet rich plasma，PRP)，剩 余部分3000rpm离心10min，取上清液得贫血小板血衆（Platelet poorplasma，PPP)。PRP 与PPP等比稀释，混匀后取Iml于玻璃管中，各管中加入20 μ 1阳性药奥扎格雷和各单体 (终浓度约为0. 05mmol/l)，诱导剂管加入等量DMSO, 37°C温育IOmin后取出加入20 μ 1诱 导剂花生四烯酸（终浓度约为5mmol/l)，温育5min，紫外分光光度计于490nm处测吸光度 值，计算化合物的抑制率。
[0063] 表3 7-0-E-p-香豆酰-8-印i-番木鳖酸和7-0-E-p-香豆酰-栀子新甙抗花生四 烯酸诱导血小板聚集活性
[0064]
[0065] 总结：7-0-E-p-香豆酰-8-印i-番木鳖酸和7-0-E-p-香豆酰-栀子新甙对花生 四烯酸诱导血小板聚集均有显著抑制作用，可用于研制抗血栓的药物。
【主权项】
1. 一种环烯醚萜苷化合物，其特征在于，该环烯醚萜苷化合物的化学名称是： 7-仏斤/^香豆酰-8-6>/7i-番木鳖酸；分子式为C25H3tlO12，其化学结构式如下：2. -种环烯醚萜苷化合物，其特征在于，该环烯醚萜苷化合物的化学名称是： 7_香豆酰-栀子新戒；分子式为C25H28O12，其化学结构式如下：3. 按照权利要求1和2所述的7- f万-扩香豆酰-8-6>/7i-番木鳖酸和7-仏万-扩香豆 酰-栀子新甙的制备方法，其特征在于，操作步骤如下： 1) 浸膏的制备 取裸花紫珠干燥叶，用7-10倍干燥的裸花紫珠叶量体积百分浓度为60% ~ 95%的乙醇 回流提取2 ~ 3次，每次2 ~ 3小时，合并提取液，用旋转蒸发仪在低于50°C的条件下减压 回收乙醇后得浸膏； 2) 正丁醇层浸膏的制备 将步骤1)浸膏混悬于水中，得到浸膏水混悬液，用乙酸乙酯对浸膏水混悬液萃取四 次，再用正丁醇对乙酸乙酯萃取浸膏水混悬液后的浸膏水混悬液萃取三次，合并萃取后的 正丁醇层液体，在低于50°C的条件下减压回收正丁醇层的溶剂正丁醇，得到正丁醇层浸 膏； 3) 香豆酰-8-e/?i-番木鳖酸和香豆酰-栀子新戒的制备 将正丁醇层浸膏用6-10倍蒸馏水溶解，过滤，滤液用XAD-7大孔树脂分离，分别用水和 95%乙醇洗脱，得到水洗脱部分和95%乙醇洗脱部分； 95%乙醇洗脱部分减压浓缩，得95%乙醇洗脱部分浸膏，经硅胶常压柱层析，用氯仿：甲 醇（99:1 -60:40)梯度洗脱，将洗脱液进行薄层检测，浓缩合并类似洗脱馏分，得13个馏 分 E1-E13 ; 将馏分E5经硅胶常压柱层析，用氯仿：甲醇（85:15-75:25)梯度洗脱，得到6个馏分 Ε5-1_Ε5-6; 将馏分E5-4再次硅胶常压柱层析，用氯仿：甲醇（95:5-80:20)梯度洗脱，得到12个 馏分E5_4_「E5_4_12，将馏*E 5_4_1(I经中压反相柱分离，用甲醇：水（30%-100%)梯度洗脱得到 17个小馏分Ε5_4_1(Η1-Ε5_ 4_1(Ι_17，馏分E5_4_ 1(l_9用制备液相色谱分离，得化合物7- 香豆 酰-8-e/?i-番木鳖酸和香豆酰-栀子新戒。4. 按照权利要求1所述的一种环烯醚萜苷化合物的用途，其特征在于，7-仏万-扩香豆 酰番木鳖酸或其衍生物用于制备抗血栓药物。5. 按照权利要求2所述的一种环稀醚猫苷化合物的用途，其特征在于，7- iM/?~couma royl-gardoside或其衍生物用于制备抗血栓药物。6. 根据权利要求4所述的7- f香豆酰-8-e/7i-番木鳖酸在制备抗血栓药物中的 应用，其特征是7-仏万-扩香豆酰-8-e/7i-番木鳖酸在0. 56mmol/L时对花生四烯酸诱导血 小板聚集的抑制率为52. 2%，IC5tl为0. 33 mM。7. 根据权利要求5所述的7-香豆酰-8-e/7i-番木鳖酸在制备抗血栓药物中的 应用，其特征是7-仏万-扩香豆酰-栀子新甙在0. 56mmol/L时对花生四烯酸诱导血小板聚 集的抑制率为59. 8%，IC5tl为0. 54 mM。
【专利摘要】本发明公开了两个新的环烯醚萜苷化合物及其制备方法和用途。两个新的环烯醚萜苷化合物，其中：第一个环烯醚萜苷化合物的化学名称是7-O-E-p-香豆酰-8-epi-番木鳖酸；第二个环烯醚萜苷化合物的化学名称是7-O-E-p-香豆酰-栀子新甙；它们的制备方法是以马鞭草科植物裸花紫珠 (Callicarpa nudiflora Hook.)的干燥叶为原料，通过1)浸膏的制备、2)正丁醇层浸膏的制备、3)7-O-E-p-香豆酰-8-epi-番木鳖酸和7-O-E-p-香豆酰-栀子新甙的制备的制备步骤完成。7-O-E-p-香豆酰-8-epi-番木鳖酸和7-O-E-p-香豆酰-栀子新甙的化学结构式分别为式(Ⅰ)和式(Ⅱ)。本发明公开了7-O-E-p-香豆酰-8-epi-番木鳖酸和7-O-E-p-香豆酰-栀子新甙的理化性质，光学活性，这两个新的环烯醚萜苷化合物具有显著的抗花生四烯酸诱导血小板聚集作用，可用于制备抗血栓药物。
【IPC分类】C07H1/08, C07H17/04, A61P7/02
【公开号】CN104892698
【申请号】CN201510102122
【发明人】罗跃华, 马双成, 付辉政, 付剑江, 陈伟康, 黄波, 王珊
【申请人】江西省食品药品检验所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年3月9日
最新回复(0)