一种从木蝴蝶中提取、分离纯化2种黄酮苷的方法
一种从木蝴蝶中提取、分离纯化2种黄酮苷的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及木蝴蝶提取、分离纯化黄酮苷技术领域，具体是一种从木蝴蝶中提取、 分离纯化2种黄酮苷的方法。
【背景技术】
[0002] 木蝴蝶为紫葳科植物木蝴蝶Oroxylum indicum(L.) Vent.的成熟种子，味苦、甘， 性凉，入肺、肝、胃经，有清肺利咽、止咳、舒肝和胃、止痛及清热的作用。临床上用于治疗以 咳嗽为主症的上呼吸道感染、急性支气管炎、咽炎、肺炎、百日咳及声带疾患。药理研宄表 明，黄酮为木蝴蝶的主要活性成分，也是木蝴蝶及其相关制剂质量控制的主要指标。据文献 报道，分离纯化木蝴蝶种黄酮苷的方法主要有反复硅胶柱层析法及高速逆流色谱法，硅胶 柱层析法的操作过程繁琐，回收率较低，经常使用氯仿、苯等毒性较强的有机溶剂；在高速 逆流色谱法中溶剂系统的选择比较困难，缺乏理论指导。因此，建立一种高效快速的提取、 分离纯化木蝴蝶中黄酮苷的方法对于深化木蝴蝶的药理研宄及完善质量控制体系等具有 重要的意义。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种从木蝴蝶中提取、分离纯化2种黄酮苷的方法，高效、 快速、简便。
[0004] 本发明是以如下技术方案实现的：一种从木蝴蝶中提取、分离纯化2种黄酮苷的 方法，具体步骤如下：
[0005] (1)木蝴蝶中黄酮苷的提取：将木蝴蝶药材粉碎，用有机溶剂进行提取，过滤，提 取液经减压浓缩得粗提物，有机溶剂的用量是木蝴蝶药材用量的6~20倍；
[0006] (2)木蝴蝶中黄酮苷的分离分析：用分析型高效液相色谱仪对步骤⑴中粗提物 的组成进行分离分析，流动相为甲醇-水，甲醇与水的体积比45:55,流速为1.0 mL/min ;
[0007] (3)木蝴蝶中黄酮苷的分离纯化：用半制备型高效液相色谱仪对步骤1中得到的 粗提物中的成分进行分离纯化，流动相为甲醇-水，甲醇与水的体积比50:50,流速为20~ 30mL/min ;根据色谱图手动收集目标组分馏分，减压浓缩除去溶剂；
[0008] (4)化合物的纯度检测及结构鉴定：将每一个目标组分馏分减压浓缩后用甲醇 溶解，其纯度用高效液相色谱法进行检测，色谱条件见步骤（2)，2种化合物的纯度都达 到了 98%以上，经核磁共振波谱分析2种化合物分别是黄芩素-7-0-双葡萄糖苷和黄芩 素-7-0-匍萄糖苷。
[0009] 其进一步是：步骤（2)分析型高效液相色谱仪中的色谱柱采用分析型C18柱，检测 波长为220nm，柱温为室温。
[0010] 步骤（3)中半制备型高效液相色谱仪中的色谱柱采用半制备型C18柱，检测波长为 220nm，柱温为室温。
[0011] 步骤（1)提取方法为冷浸、超声或加热回流。。
[0012] 步骤（1)有机溶剂为甲醇或水或50 %乙醇或70 %乙醇或95 %乙醇。
[0013] 步骤⑴提取次数为2-5次；提取时间为1-3小时。
[0014] 步骤（1)提取次数为3次；提取时间为2小时。
[0015] 步骤（2)中分离分析用甲醇-水洗脱液进行洗脱，洗脱方式为40%甲醇-水等度 洗脱或45 %甲醇-水等度洗脱或50 %甲醇-水等度洗脱。
[0016] 步骤（3)分离纯化用甲醇-水洗脱液进行洗脱，洗脱方式有甲醇-水梯度洗脱或 45%甲醇-水等度洗脱或50%甲醇-水等度洗脱或55%甲醇-水等度洗脱。
[0017] 本发明的有益效果是：高效、快速从木蝴蝶中提取黄芩素-7-0-双葡萄糖苷和黄 芩素-7-0-葡萄糖苷，2种化合物的纯度都达到了 98%以上；工艺过程绿色环保，对环境无 严重危害，综合成本低。
【附图说明】
[0018] 图1是木蝴蝶粗提物的分析型高效液相色谱图；
[0019] 图2是木蝴蝶粗提物的半制备型高效液相色谱图；
[0020]图3是黄芩素-7-0-双葡萄糖苷的高效液相色谱图及紫外光谱图；
[0021] 图4是黄芩素-7-0-葡萄糖苷的高效液相色谱图及紫外光谱图；
【具体实施方式】
[0022] 下面结合实施例和附图详细说明本发明的技术方案，但保护范围不被此限制。实 施例中所用设备或原料皆可从市场获得。所用试剂均购自天津市化学试剂三厂，所用水为 去离子水。
[0023] 从木蝴蝶中提取、分离纯化2种黄酮苷的方法，其步骤为：
[0024] (1)木蝴蝶中黄酮苷的提取：将木蝴蝶药材粉碎，用15倍量70%乙醇加热回流提 取3次，每次2h，过滤，将提取液合并，减压浓缩得粗提物。
[0025] (2)木蝴蝶中黄酮苷的分离分析：用分析型高效液相色谱仪对粗提物的组成进行 分离分析，色谱柱为分析型C 18柱（250X4. 6mm I. D.，5 ym)，流动相为甲醇-水（45 :55, V/ V);流速为1.0 mL/min，检测波长为220nm，柱温为室温。
[0026] (3)木蝴蝶中黄酮苷的分离纯化：用半制备型高效液相色谱仪对粗提物中的成分 进行分离纯化，色谱柱为半制备型C 18柱（250 X 25. 4mm I.D.，10 μ m)，流动相为甲醇-水 (50 :50，V/V)，检测波长为220nm，柱温为室温。根据色谱图手动收集目标组分馏分，减压浓 缩除去溶剂。
[0027] (4)化合物的纯度检测及结构鉴定：将每一个目标组分馏分减压浓缩后用甲醇溶 解，其纯度用高效液相色谱法进行检测，色谱条件见步骤（2)，分析结果表明2种化合物的 纯度都达到了 98%以上。经核磁共振波谱分析2种化合物分别是黄芩素-7-0-双葡萄糖苷 和黄零素-7-0-匍萄糖苷。
[0028] 发明人通过使用不同浓度的甲醇作流动相，采用不同的洗脱方式，控制甲醇-水 洗脱液的流速为20-30mL/min (优选25mL/min)，优选出了实现本发明目的的纯化条件，有 关实验结果如下：
[0029] 表一木蝴蝶粗提物的半制备型高效液相色谱分离条件
[0030]
[0031] 在实施例1 ￥，洗脱液中甲醇的浓^较高，洗脱时间较短，2 ^目标化合物与其附 近的杂质组分之间的分离效果均不够理想，所得化合物的纯度较低。实施例2中，洗脱液中 甲醇的浓度适中，各成分之间分离良好，分离时间也较为适宜。实施例3中，洗脱液中甲醇 的浓度较低，2种目标化合物与其附近的杂质组分之间的分离情况良好，但分离时间太长。 实施例4采用甲醇-水梯度洗脱，也可以在合适的时间内获得良好的分离效果，但由于洗脱 液的浓度不断发生变化导致难以实现回收再利用。
[0032] 图1是木蝴蝶粗提物的分析型高效液相色谱图。图2是当选用实施例2体系时 木蝴蝶粗提物的半制备型高效液相色谱图，由图可见，各成分分离良好，分离时间也较为适 宜。根据色谱图手动收集各峰组分，回收溶剂后，即可得到相应的高纯度化合物。经高效液 相色谱峰面积归一化法分析测试，纯度高于98%，这一点可从图3至图4中看出。图1-4 中，I :黄零素_7_〇_双匍萄糖苷；Π :黄零素-7-0-匍萄糖苷。
[0033] 经核磁共振波谱分析证实所提取纯化得到的2个化合物的化学结构式如下：
[0034]
[0035] 2个化合物的鉴定结果如下：
[0036] 黄芩素-7-0-双葡萄糖苷,H-NMRGOOMHzJMSO-de): Sppm:12.6(lH，s，5-OH)， 8· 6 (1H，s，6-OH)，8· 0 ~8· 3 (2H，d，2'，6' -Η)，7· 5 ~7.8(3H，m，3'，4'，5'-H)，7.2(lH，s，8-Η), 7. I (1Η, s, 3-Η), 5. I (1Η, d, J = 6. 4Hz, anomeric H of inner glucose), 4. 2 (1Η, d, J =6.3Hz，anomeric H of terminal glucose) .13C-MVtR(IOOMHzjD MSO-CB): δ ppm: 182. 6 (C-5)，163. 5 (C-2)，151. 5 (C-9)，149. 3 (C-7)，146. 4 (C-6)，131. 9 (C-4,），130. 8 (C-6or C-Γ )，130. 5 (C-Γ or C-6)，129. I (C-3,，5'），126. 4 (C-2, or C-6'），106. I (C-10)，104. 6 (C-3)，104. 5 (C-4)，103. 7 (C-l"'），100. 9 (C-l")，94. 4(C-8)，77. I (C-5"'），76. 8 (C-3")，75. 7 (C-3"），75. 6(C-3"，），75. 5(C-2"，），73. 2(C-2"），70. 2(C-4"or C-4"，），69. 6(C-4"，or C-4"），69. 2(C-6"），61. l(C-6"，）·
[0037] 黄芩素-7-0-葡萄糖苷,H-NMRGOOMHz，DMS0-d6) : δ ppm: 12. 4(1H, s, 5-OH), 8. 4( 1H, s, 6-OH), 7. 9 (2H, d, 2'，6' -H), 7. 5 ~7. 7 (3H, m, 3'，4'，5' -H), 7. I (1H, s, 8-H), 7. 0 (1H, s ,3-H), 5. I (1H, d, J = 6. 4Hz, anomeric H). 13C-NMR(100MHz, DMS〇-d6) : δ ppm: 182. 9 (C-4), 163. 9 (C-2)，151. 9 (C-9)，149. 7 (C-7)，146. 8 (C-5)，132. 5 (C-4,），131. 3 (C-6)，131. 0 (C-Γ )，129. 6 (C-3,，5,），126. 8 (C-2,，6,），106. 5 (C-10)，105. 2 (C-3)，101. 3 (C-Γ，），94. 7 (C-8)， 77. 8 (C-3 "），76. 3 (C-5 "），73. 5 (C-2 "），70. 0 (C-4 "），60. 9 (C-6 "）·
[0038] 本发明从木蝴蝶中提取、分离纯化2种黄酮苷，首先用70%乙醇加热回流提取将 黄酮苷类成分提取出来；接下来用分析型高效液相色谱仪对提取物的组成进行分离分析； 然后，用半制备型高效液相色谱仪对提取物中的成分进行分离纯化就可以得到2种化合 物；最后，用高效液相色谱法对化合物的纯度进行测定，根据核磁共振波谱分析对化合物的 结构进行鉴定。该方法所得目标化合物纯度高，杂质含量极低，这一点可从图3至图4中看 出。除此之外，还具有如下优势：
[0039] (1)用70%乙醇加热回流对木蝴蝶中黄酮苷类成分进行提取是利用了"相似相 溶"的原理，黄酮苷的极性较弱，在70%乙醇中的溶解度最大，温度升高，溶解度增大。因此， 用70%乙醇加热回流提取可以使黄酮苷最大程度溶出，而脂溶性杂质尽量不被溶出。不仅 提高了提取效率，而且可以使粗提物尽可能纯净，最大限度降低了制备型C 18柱被污染的程 度。
[0040] (2)用高效液相色谱法对木蝴蝶粗提物的组成进行分离分析，用甲醇-水作流动 相等度洗脱可以在短时间内对2种目标化合物实现基线分离。
[0041] (3)用半制备型高效液相色谱法对化合物进行分离纯化，可以得到2种高纯度单 体化合物，方法操作简单，效率高，工艺周期短，节省试剂，降低了生产成本。
[0042] (4)用高效液相色谱法对制备所得化合物的纯度进行测定，该方法准确、快速。
[0043] (5)提取、分离、纯化过程中仅用到乙醇、甲醇和水，不使用对环境和人体危害大的 氯仿、苯等有机溶剂，乙醇-水提取液及甲醇-水洗脱液经减压蒸馏回收后均可以重复使用 多次，绿色环保。
[0044] (6)优化了层析方法的条件（洗脱液的组成和流速），使化合物的纯度和纯化效率 都大为提尚。
[0045] 【具体实施方式】只是本发明比较有代表性的例子，显然本发明的技术方案不限于上 述实施例。还可以有很多变形。本领域的普通技术人员，从此文件中所公开提到或是联想 到的，均应认为是本专利所要保护的范围。
【主权项】
1. 一种从木蝴蝶中提取、分离纯化2种黄酮苷的方法，其特征在于：具体步骤如下： (1) 木蝴蝶中黄酮苷的提取：将木蝴蝶药材粉碎，用有机溶剂进行提取，过滤，提取液 经减压浓缩得粗提物，有机溶剂的用量是木蝴蝶药材用量的6~20倍； (2) 木蝴蝶中黄酮苷的分离分析：用分析型高效液相色谱仪对步骤（1)中粗提物的组 成进行分离分析，流动相为甲醇-水，甲醇与水的体积比45:55,流速为I.OmL/min; (3) 木蝴蝶中黄酮苷的分离纯化：用半制备型高效液相色谱仪对步骤1中得到的粗 提物中的成分进行分离纯化，流动相为甲醇-水，甲醇与水的体积比50:50,流速为20~ 30mL/min;根据色谱图手动收集目标组分馏分，减压浓缩除去溶剂； (4) 化合物的纯度检测及结构鉴定：将每一个目标组分馏分减压浓缩后用甲醇溶解， 其纯度用高效液相色谱法进行检测，色谱条件见步骤（2)，2种化合物的纯度都达到了 98% 以上，经核磁共振波谱分析2种化合物分别是黄芩素-7-0-双葡萄糖苷和黄芩素-7-0-葡 萄糖苷。2. 根据权利要求1所述的一种从木蝴蝶中提取、分离纯化2种黄酮苷的方法，其特征在 于：步骤（2)分析型高效液相色谱仪中的色谱柱采用分析型C18柱，检测波长为220nm，柱温 为室温。3. 根据权利要求1所述的一种从木蝴蝶中提取、分离纯化2种黄酮苷的方法，其特征 在于：步骤（3)中半制备型高效液相色谱仪中的色谱柱采用半制备型C18柱，检测波长为 220nm，柱温为室温。4. 根据权利要求1所述的一种从木蝴蝶中提取、分离纯化2种黄酮苷的方法，其特征在 于：步骤（1)提取方法为冷浸、超声或加热回流。5. 根据权利要求1所述的一种从木蝴蝶中提取、分离纯化2种黄酮苷的方法，其特征在 于：步骤（1)有机溶剂为甲醇或水或50%乙醇或70%乙醇或95%乙醇。6. 根据权利要求1所述的一种从木蝴蝶中提取、分离纯化2种黄酮苷的方法，其特征在 于：步骤（1)提取次数为2-5次；提取时间为1-3小时。7. 根据权利要求5所述的一种从木蝴蝶中提取、分离纯化2种黄酮苷的方法，其特征在 于：步骤（1)提取次数为3次；提取时间为2小时。8. 根据权利要求1所述的一种从木蝴蝶中提取、分离纯化2种黄酮苷的方法，其特征在 于：步骤（2)分离分析用甲醇-水洗脱液进行洗脱，洗脱方式为40%甲醇-水等度洗脱或 45 %甲醇-水等度洗脱或50 %甲醇-水等度洗脱。9. 根据权利要求1所述的一种从木蝴蝶中提取、分离纯化2种黄酮苷的方法，其特征在 于：步骤（3)分离纯化用甲醇-水洗脱液进行洗脱，洗脱方式有甲醇-水梯度洗脱或45% 甲醇-水等度洗脱或50 %甲醇-水等度洗脱或55 %甲醇-水等度洗脱。
【专利摘要】本发明公开了一种从木蝴蝶中提取、分离纯化2种黄酮苷的方法，涉及木蝴蝶提取、分离纯化黄酮苷技术领域。本发明是以木蝴蝶药材为原料，经过下述步骤：(1)木蝴蝶中黄酮苷的提取；(2)木蝴蝶中黄酮苷的分离分析；(3)木蝴蝶中黄酮苷的分离纯化；(4)化合物的纯度检测及结构鉴定。用半制备型高效液相色谱进行分离纯化，流动相为甲醇-水，得到2种高纯度的成分，经鉴定分别是黄芩素-7-O-双葡萄糖苷和黄芩素-7-O-葡萄糖苷。优点：高效、快速从木蝴蝶中提取黄芩素-7-O-双葡萄糖苷和黄芩素-7-O-葡萄糖苷，2种化合物的纯度都达到了98％以上；工艺过程绿色环保，对环境无严重危害，综合成本低。
【IPC分类】C07H17/07, C07H1/08
【公开号】CN104892702
【申请号】CN201510252991
【发明人】杨冬芝, 董露露, 杨方秀, 汤道权, 孙世安
【申请人】徐州医学院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月18日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及木蝴蝶提取、分离纯化黄酮苷技术领域，具体是一种从木蝴蝶中提取、 分离纯化2种黄酮苷的方法。
【背景技术】
[0002] 木蝴蝶为紫葳科植物木蝴蝶Oroxylum indicum(L.) Vent.的成熟种子，味苦、甘， 性凉，入肺、肝、胃经，有清肺利咽、止咳、舒肝和胃、止痛及清热的作用。临床上用于治疗以 咳嗽为主症的上呼吸道感染、急性支气管炎、咽炎、肺炎、百日咳及声带疾患。药理研宄表 明，黄酮为木蝴蝶的主要活性成分，也是木蝴蝶及其相关制剂质量控制的主要指标。据文献 报道，分离纯化木蝴蝶种黄酮苷的方法主要有反复硅胶柱层析法及高速逆流色谱法，硅胶 柱层析法的操作过程繁琐，回收率较低，经常使用氯仿、苯等毒性较强的有机溶剂；在高速 逆流色谱法中溶剂系统的选择比较困难，缺乏理论指导。因此，建立一种高效快速的提取、 分离纯化木蝴蝶中黄酮苷的方法对于深化木蝴蝶的药理研宄及完善质量控制体系等具有 重要的意义。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种从木蝴蝶中提取、分离纯化2种黄酮苷的方法，高效、 快速、简便。
[0004] 本发明是以如下技术方案实现的：一种从木蝴蝶中提取、分离纯化2种黄酮苷的 方法，具体步骤如下：
[0005] (1)木蝴蝶中黄酮苷的提取：将木蝴蝶药材粉碎，用有机溶剂进行提取，过滤，提 取液经减压浓缩得粗提物，有机溶剂的用量是木蝴蝶药材用量的6~20倍；
[0006] (2)木蝴蝶中黄酮苷的分离分析：用分析型高效液相色谱仪对步骤⑴中粗提物 的组成进行分离分析，流动相为甲醇-水，甲醇与水的体积比45:55,流速为1.0 mL/min ;
[0007] (3)木蝴蝶中黄酮苷的分离纯化：用半制备型高效液相色谱仪对步骤1中得到的 粗提物中的成分进行分离纯化，流动相为甲醇-水，甲醇与水的体积比50:50,流速为20~ 30mL/min ;根据色谱图手动收集目标组分馏分，减压浓缩除去溶剂；
[0008] (4)化合物的纯度检测及结构鉴定：将每一个目标组分馏分减压浓缩后用甲醇 溶解，其纯度用高效液相色谱法进行检测，色谱条件见步骤（2)，2种化合物的纯度都达 到了 98%以上，经核磁共振波谱分析2种化合物分别是黄芩素-7-0-双葡萄糖苷和黄芩 素-7-0-匍萄糖苷。
[0009] 其进一步是：步骤（2)分析型高效液相色谱仪中的色谱柱采用分析型C18柱，检测 波长为220nm，柱温为室温。
[0010] 步骤（3)中半制备型高效液相色谱仪中的色谱柱采用半制备型C18柱，检测波长为 220nm，柱温为室温。
[0011] 步骤（1)提取方法为冷浸、超声或加热回流。。
[0012] 步骤（1)有机溶剂为甲醇或水或50 %乙醇或70 %乙醇或95 %乙醇。
[0013] 步骤⑴提取次数为2-5次；提取时间为1-3小时。
[0014] 步骤（1)提取次数为3次；提取时间为2小时。
[0015] 步骤（2)中分离分析用甲醇-水洗脱液进行洗脱，洗脱方式为40%甲醇-水等度 洗脱或45 %甲醇-水等度洗脱或50 %甲醇-水等度洗脱。
[0016] 步骤（3)分离纯化用甲醇-水洗脱液进行洗脱，洗脱方式有甲醇-水梯度洗脱或 45%甲醇-水等度洗脱或50%甲醇-水等度洗脱或55%甲醇-水等度洗脱。
[0017] 本发明的有益效果是：高效、快速从木蝴蝶中提取黄芩素-7-0-双葡萄糖苷和黄 芩素-7-0-葡萄糖苷，2种化合物的纯度都达到了 98%以上；工艺过程绿色环保，对环境无 严重危害，综合成本低。
【附图说明】
[0018] 图1是木蝴蝶粗提物的分析型高效液相色谱图；
[0019] 图2是木蝴蝶粗提物的半制备型高效液相色谱图；
[0020]图3是黄芩素-7-0-双葡萄糖苷的高效液相色谱图及紫外光谱图；
[0021] 图4是黄芩素-7-0-葡萄糖苷的高效液相色谱图及紫外光谱图；
【具体实施方式】
[0022] 下面结合实施例和附图详细说明本发明的技术方案，但保护范围不被此限制。实 施例中所用设备或原料皆可从市场获得。所用试剂均购自天津市化学试剂三厂，所用水为 去离子水。
[0023] 从木蝴蝶中提取、分离纯化2种黄酮苷的方法，其步骤为：
[0024] (1)木蝴蝶中黄酮苷的提取：将木蝴蝶药材粉碎，用15倍量70%乙醇加热回流提 取3次，每次2h，过滤，将提取液合并，减压浓缩得粗提物。
[0025] (2)木蝴蝶中黄酮苷的分离分析：用分析型高效液相色谱仪对粗提物的组成进行 分离分析，色谱柱为分析型C 18柱（250X4. 6mm I. D.，5 ym)，流动相为甲醇-水（45 :55, V/ V);流速为1.0 mL/min，检测波长为220nm，柱温为室温。
[0026] (3)木蝴蝶中黄酮苷的分离纯化：用半制备型高效液相色谱仪对粗提物中的成分 进行分离纯化，色谱柱为半制备型C 18柱（250 X 25. 4mm I.D.，10 μ m)，流动相为甲醇-水 (50 :50，V/V)，检测波长为220nm，柱温为室温。根据色谱图手动收集目标组分馏分，减压浓 缩除去溶剂。
[0027] (4)化合物的纯度检测及结构鉴定：将每一个目标组分馏分减压浓缩后用甲醇溶 解，其纯度用高效液相色谱法进行检测，色谱条件见步骤（2)，分析结果表明2种化合物的 纯度都达到了 98%以上。经核磁共振波谱分析2种化合物分别是黄芩素-7-0-双葡萄糖苷 和黄零素-7-0-匍萄糖苷。
[0028] 发明人通过使用不同浓度的甲醇作流动相，采用不同的洗脱方式，控制甲醇-水 洗脱液的流速为20-30mL/min (优选25mL/min)，优选出了实现本发明目的的纯化条件，有 关实验结果如下：
[0029] 表一木蝴蝶粗提物的半制备型高效液相色谱分离条件
[0030]
[0031] 在实施例1 ￥，洗脱液中甲醇的浓^较高，洗脱时间较短，2 ^目标化合物与其附 近的杂质组分之间的分离效果均不够理想，所得化合物的纯度较低。实施例2中，洗脱液中 甲醇的浓度适中，各成分之间分离良好，分离时间也较为适宜。实施例3中，洗脱液中甲醇 的浓度较低，2种目标化合物与其附近的杂质组分之间的分离情况良好，但分离时间太长。 实施例4采用甲醇-水梯度洗脱，也可以在合适的时间内获得良好的分离效果，但由于洗脱 液的浓度不断发生变化导致难以实现回收再利用。
[0032] 图1是木蝴蝶粗提物的分析型高效液相色谱图。图2是当选用实施例2体系时 木蝴蝶粗提物的半制备型高效液相色谱图，由图可见，各成分分离良好，分离时间也较为适 宜。根据色谱图手动收集各峰组分，回收溶剂后，即可得到相应的高纯度化合物。经高效液 相色谱峰面积归一化法分析测试，纯度高于98%，这一点可从图3至图4中看出。图1-4 中，I :黄零素_7_〇_双匍萄糖苷；Π :黄零素-7-0-匍萄糖苷。
[0033] 经核磁共振波谱分析证实所提取纯化得到的2个化合物的化学结构式如下：
[0034]
[0035] 2个化合物的鉴定结果如下：
[0036] 黄芩素-7-0-双葡萄糖苷,H-NMRGOOMHzJMSO-de): Sppm:12.6(lH，s，5-OH)， 8· 6 (1H，s，6-OH)，8· 0 ~8· 3 (2H，d，2'，6' -Η)，7· 5 ~7.8(3H，m，3'，4'，5'-H)，7.2(lH，s，8-Η), 7. I (1Η, s, 3-Η), 5. I (1Η, d, J = 6. 4Hz, anomeric H of inner glucose), 4. 2 (1Η, d, J =6.3Hz，anomeric H of terminal glucose) .13C-MVtR(IOOMHzjD MSO-CB): δ ppm: 182. 6 (C-5)，163. 5 (C-2)，151. 5 (C-9)，149. 3 (C-7)，146. 4 (C-6)，131. 9 (C-4,），130. 8 (C-6or C-Γ )，130. 5 (C-Γ or C-6)，129. I (C-3,，5'），126. 4 (C-2, or C-6'），106. I (C-10)，104. 6 (C-3)，104. 5 (C-4)，103. 7 (C-l"'），100. 9 (C-l")，94. 4(C-8)，77. I (C-5"'），76. 8 (C-3")，75. 7 (C-3"），75. 6(C-3"，），75. 5(C-2"，），73. 2(C-2"），70. 2(C-4"or C-4"，），69. 6(C-4"，or C-4"），69. 2(C-6"），61. l(C-6"，）·
[0037] 黄芩素-7-0-葡萄糖苷,H-NMRGOOMHz，DMS0-d6) : δ ppm: 12. 4(1H, s, 5-OH), 8. 4( 1H, s, 6-OH), 7. 9 (2H, d, 2'，6' -H), 7. 5 ~7. 7 (3H, m, 3'，4'，5' -H), 7. I (1H, s, 8-H), 7. 0 (1H, s ,3-H), 5. I (1H, d, J = 6. 4Hz, anomeric H). 13C-NMR(100MHz, DMS〇-d6) : δ ppm: 182. 9 (C-4), 163. 9 (C-2)，151. 9 (C-9)，149. 7 (C-7)，146. 8 (C-5)，132. 5 (C-4,），131. 3 (C-6)，131. 0 (C-Γ )，129. 6 (C-3,，5,），126. 8 (C-2,，6,），106. 5 (C-10)，105. 2 (C-3)，101. 3 (C-Γ，），94. 7 (C-8)， 77. 8 (C-3 "），76. 3 (C-5 "），73. 5 (C-2 "），70. 0 (C-4 "），60. 9 (C-6 "）·
[0038] 本发明从木蝴蝶中提取、分离纯化2种黄酮苷，首先用70%乙醇加热回流提取将 黄酮苷类成分提取出来；接下来用分析型高效液相色谱仪对提取物的组成进行分离分析； 然后，用半制备型高效液相色谱仪对提取物中的成分进行分离纯化就可以得到2种化合 物；最后，用高效液相色谱法对化合物的纯度进行测定，根据核磁共振波谱分析对化合物的 结构进行鉴定。该方法所得目标化合物纯度高，杂质含量极低，这一点可从图3至图4中看 出。除此之外，还具有如下优势：
[0039] (1)用70%乙醇加热回流对木蝴蝶中黄酮苷类成分进行提取是利用了"相似相 溶"的原理，黄酮苷的极性较弱，在70%乙醇中的溶解度最大，温度升高，溶解度增大。因此， 用70%乙醇加热回流提取可以使黄酮苷最大程度溶出，而脂溶性杂质尽量不被溶出。不仅 提高了提取效率，而且可以使粗提物尽可能纯净，最大限度降低了制备型C 18柱被污染的程 度。
[0040] (2)用高效液相色谱法对木蝴蝶粗提物的组成进行分离分析，用甲醇-水作流动 相等度洗脱可以在短时间内对2种目标化合物实现基线分离。
[0041] (3)用半制备型高效液相色谱法对化合物进行分离纯化，可以得到2种高纯度单 体化合物，方法操作简单，效率高，工艺周期短，节省试剂，降低了生产成本。
[0042] (4)用高效液相色谱法对制备所得化合物的纯度进行测定，该方法准确、快速。
[0043] (5)提取、分离、纯化过程中仅用到乙醇、甲醇和水，不使用对环境和人体危害大的 氯仿、苯等有机溶剂，乙醇-水提取液及甲醇-水洗脱液经减压蒸馏回收后均可以重复使用 多次，绿色环保。
[0044] (6)优化了层析方法的条件（洗脱液的组成和流速），使化合物的纯度和纯化效率 都大为提尚。
[0045] 【具体实施方式】只是本发明比较有代表性的例子，显然本发明的技术方案不限于上 述实施例。还可以有很多变形。本领域的普通技术人员，从此文件中所公开提到或是联想 到的，均应认为是本专利所要保护的范围。
【主权项】
1. 一种从木蝴蝶中提取、分离纯化2种黄酮苷的方法，其特征在于：具体步骤如下： (1) 木蝴蝶中黄酮苷的提取：将木蝴蝶药材粉碎，用有机溶剂进行提取，过滤，提取液 经减压浓缩得粗提物，有机溶剂的用量是木蝴蝶药材用量的6~20倍； (2) 木蝴蝶中黄酮苷的分离分析：用分析型高效液相色谱仪对步骤（1)中粗提物的组 成进行分离分析，流动相为甲醇-水，甲醇与水的体积比45:55,流速为I.OmL/min; (3) 木蝴蝶中黄酮苷的分离纯化：用半制备型高效液相色谱仪对步骤1中得到的粗 提物中的成分进行分离纯化，流动相为甲醇-水，甲醇与水的体积比50:50,流速为20~ 30mL/min;根据色谱图手动收集目标组分馏分，减压浓缩除去溶剂； (4) 化合物的纯度检测及结构鉴定：将每一个目标组分馏分减压浓缩后用甲醇溶解， 其纯度用高效液相色谱法进行检测，色谱条件见步骤（2)，2种化合物的纯度都达到了 98% 以上，经核磁共振波谱分析2种化合物分别是黄芩素-7-0-双葡萄糖苷和黄芩素-7-0-葡 萄糖苷。2. 根据权利要求1所述的一种从木蝴蝶中提取、分离纯化2种黄酮苷的方法，其特征在 于：步骤（2)分析型高效液相色谱仪中的色谱柱采用分析型C18柱，检测波长为220nm，柱温 为室温。3. 根据权利要求1所述的一种从木蝴蝶中提取、分离纯化2种黄酮苷的方法，其特征 在于：步骤（3)中半制备型高效液相色谱仪中的色谱柱采用半制备型C18柱，检测波长为 220nm，柱温为室温。4. 根据权利要求1所述的一种从木蝴蝶中提取、分离纯化2种黄酮苷的方法，其特征在 于：步骤（1)提取方法为冷浸、超声或加热回流。5. 根据权利要求1所述的一种从木蝴蝶中提取、分离纯化2种黄酮苷的方法，其特征在 于：步骤（1)有机溶剂为甲醇或水或50%乙醇或70%乙醇或95%乙醇。6. 根据权利要求1所述的一种从木蝴蝶中提取、分离纯化2种黄酮苷的方法，其特征在 于：步骤（1)提取次数为2-5次；提取时间为1-3小时。7. 根据权利要求5所述的一种从木蝴蝶中提取、分离纯化2种黄酮苷的方法，其特征在 于：步骤（1)提取次数为3次；提取时间为2小时。8. 根据权利要求1所述的一种从木蝴蝶中提取、分离纯化2种黄酮苷的方法，其特征在 于：步骤（2)分离分析用甲醇-水洗脱液进行洗脱，洗脱方式为40%甲醇-水等度洗脱或 45 %甲醇-水等度洗脱或50 %甲醇-水等度洗脱。9. 根据权利要求1所述的一种从木蝴蝶中提取、分离纯化2种黄酮苷的方法，其特征在 于：步骤（3)分离纯化用甲醇-水洗脱液进行洗脱，洗脱方式有甲醇-水梯度洗脱或45% 甲醇-水等度洗脱或50 %甲醇-水等度洗脱或55 %甲醇-水等度洗脱。
【专利摘要】本发明公开了一种从木蝴蝶中提取、分离纯化2种黄酮苷的方法，涉及木蝴蝶提取、分离纯化黄酮苷技术领域。本发明是以木蝴蝶药材为原料，经过下述步骤：(1)木蝴蝶中黄酮苷的提取；(2)木蝴蝶中黄酮苷的分离分析；(3)木蝴蝶中黄酮苷的分离纯化；(4)化合物的纯度检测及结构鉴定。用半制备型高效液相色谱进行分离纯化，流动相为甲醇-水，得到2种高纯度的成分，经鉴定分别是黄芩素-7-O-双葡萄糖苷和黄芩素-7-O-葡萄糖苷。优点：高效、快速从木蝴蝶中提取黄芩素-7-O-双葡萄糖苷和黄芩素-7-O-葡萄糖苷，2种化合物的纯度都达到了98％以上；工艺过程绿色环保，对环境无严重危害，综合成本低。
【IPC分类】C07H17/07, C07H1/08
【公开号】CN104892702
【申请号】CN201510252991
【发明人】杨冬芝, 董露露, 杨方秀, 汤道权, 孙世安
【申请人】徐州医学院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月18日
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