葫芦素c及其类似物的制备方法与应用
葫芦素c及其类似物的制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及天然药物化学领域，具体地说，涉及一种黄瓜中萌芦素 C及其类似物 的制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 很多植物中均含有具有抗癌活性的化合物，如从太平洋紫杉（短叶红豆杉，Taxus brevifolia)树皮中提取出来的紫杉醇，从喜树（Camptotheca acuminata)皮和果实中提 取得到的羟基喜树碱即是应用广泛的抗癌药物。因此，从植物中寻找天然来源的抗癌药物 是目前癌症治疗的研宄热点。
[0003] 黄瓜（拉丁名Cucumis sativus Linn，英文名Cucumber)，萌芦科黄瓜属植物，也 称胡瓜、青瓜，是我国一种常见的蔬菜。同时，黄瓜还是一种传统的中草药，其果实和叶均能 入药。《本草纲目》记载黄瓜：主清热解渴，利水道；小儿热痢；水病肚胀，四肢浮肿；咽喉肿 痛；狐刺毒肿等。《本草拾遗》记载黄瓜叶：主小儿闪癣，一岁服一叶，生按绞汁服，得吐下良。
[0004] 黄瓜果实和叶中含有多种萌芦素成分，其中以萌芦素 C含量最高。这既是黄瓜苦 味的成因，也是黄瓜具有药用价值的物质基础。现代药理研宄表明，萌芦素类化合物具有很 强的抗癌活性。据报道，萌芦素 B、E、I，对乳腺癌、肺癌、肝癌等癌细胞的增殖具有很强的抑 制作用。甜瓜中的萌芦素 B、E已被开发成五类中药"萌芦素片"，主要应用于湿热毒盛所致 迀延性肝炎、慢性肝炎及原发性肝癌的辅助治疗。
[0005] 萌芦素 C于1954年在黄瓜叶中首次被发现，此后对萌芦素 C的研宄鲜有报道。仅 于1968年，印度研宄者介绍了从甜瓜中提取分离萌芦素 C，但没有介绍其制备方法。而从黄 瓜果实和黄瓜叶中提取制备萌芦素 C及其类似物的方法与其医药用途一直未见报道。
【发明内容】
[0006] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种黄瓜中萌芦素 C及其 类似物的制备方法与应用。
[0007] 本发明首先提供一种萌芦素 C及其类似物的制备方法，萌芦素 C如式（II)所示， 萌芦素 C类似物为去乙酰萌芦素 C如式（III)所示、二氢萌芦素 C如式（IV)所示和二氢去 乙酰萌芦素 C如式（V)所示；
[0008]
[0010] 所述提取方法包括如下步骤：
[0011] 1)用乙醇提取黄瓜叶和/或黄瓜果实，然后除去乙醇，收集提取物；
[0012] 2)将所述提取物悬浮溶解于热水中，用石油醚进行萃取脱脂、脱色，移除石油醚萃 取液，保留水层；
[0013] 3)将水层部分用大孔树脂进行分离，利用不同浓度的乙醇-水溶液梯度洗脱，收 集80 %乙醇洗脱组分；
[0014] 4)将步骤3)所得组分进行正相硅胶柱层析，用二氯甲烷和甲醇混合溶剂体系梯 度洗脱，收集体积比为10:1的二氯甲烷和甲醇混合液洗脱组分；
[0015] 5)将步骤4)所得组分进行正相硅胶柱层析，用石油醚和乙酸乙酯混合溶剂体系 梯度洗脱，收集体积比为1:1和1:2的石油醚和乙酸乙酯混合液洗脱组分；
[0016] 6)将步骤5)所得组分用半制备HPLC进行纯化，仪器型号为waterS600半制备型 高效液相，W2487双波长检测器检测，所用半制备柱型号为Agilent SB C189.4X250mm，进 行HPLC纯化；
[0017] 其中，将收集得到的体积比为1:1的石油醚和乙酸乙酯混合液洗脱组分分离纯 化，使用流动相为体积比为60:40的甲醇-水混合液，收集保留时间为15. 5min和16. 5min 的洗脱峰，分别得到式（II)和式（IV)化合物；
[0018] 将收集得到的体积比为1:2的石油醚和乙酸乙酯混合液洗脱组分分离纯化，使用 流动相为体积比为45:55的甲醇-水混合液，收集保留时间为25. 5min和28. 2min的洗脱 峰，分别得到式（III)和式（V)化合物。
[0019] 进一步地，步骤1)中所述提取可以采用回流提取。
[0020] 进一步地，步骤6)中所述流动相的流速均为2mL/min。
[0021] 本发明还提供了如式（III)、式（IV)或式（V)所示的萌芦素 C类似物，或者其药学 上可接受的盐：
[0022]
[0023] 本发明还提供了萌芦素 C及上述萌芦素 C类似物或其药学上可接受的盐在制备预 防和/或治疗肿瘤药物中的应用。
[0024] 作为优选，所述萌芦素 C及其类似物或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治 疗人肝癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、膀胱癌、前列腺癌和结肠癌药物中的应用。
[0025] 所述药物为口服制剂、外用剂或注射剂；其中口服制剂包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、 合剂、酒剂或滴丸剂；外用剂包括栓剂、搽剂、洗剂、膏剂或透皮贴剂；注射剂包括注射液、 混悬液或冻干粉针。
[0026] 上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
[0027] 所述药物以萌芦素 C及其类似物或其药学上可接受的盐为活性成分，需要的时 候，还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。
[0028] 所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、 吸收促进剂、表面活性剂、吸收载体、润滑剂等。
[0029] 所述药物可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入 机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。
[0030] 本发明的有益效果在于：
[0031] 本发明提供了一种从黄瓜中提取分离萌芦素 C及其类似物的方法，并首次从自然 界中获得去乙酰萌芦素 C(如式III所示）、二氢萌芦素 C(如式IV所示）和二氢去乙酰萌 芦素 C (如式V所示）。本发明通过实验证明，利用本发明制备方法得到的萌芦素 C及其类 似物具有抗癌细胞的细胞毒活性，可以用于癌症的治疗。
【附图说明】
[0032] 图1为本发明实施例2中所述萌芦素 C及其类似物对肺癌细胞的抑制率曲线。
[0033] 图2为本发明实施例2中所述萌芦素 C及其类似物对前列腺癌细胞的抑制率曲 线。
[0034] 图3为本发明实施例2中所述萌芦素 C及其类似物对结肠癌细胞的抑制率曲线。
【具体实施方式】
[0035] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0036] 实施例1萌芦素 C、去乙酰萌芦素 C、二氢萌芦素 C、二氢去乙酰萌芦素 C的提取
[0037] 一、提取分离
[0038] 将70kg的黄瓜叶切碎，用95%乙醇回流提取lh，共提取3次。90°C减压浓缩回收 溶剂，得到固体浸膏780g。将所述固体浸膏700g悬浮于水中，用石油醚萃取8次，移除石 油醚层，收集水层。水层离心过滤，收集滤液，用DlOl大孔树脂柱进行层析分离，柱床长度 150cm，柱内径为20cm，按照40ml/min的流速用水及不同浓度的乙醇依次进行洗脱：水洗脱 为部位1、30%乙醇洗脱为部位2、80%乙醇洗脱为部位3、95%乙醇洗脱为部位4,每个部 位洗脱六个保留体积。收集80%乙醇洗脱部位3,60°C减压浓缩至干得浸膏。将上述浸膏 用正相硅胶柱进行层析分离，用200~300目硅胶装柱，柱床长度100cm，柱内径15cm，按照 20ml/min的流速用如下四个梯度的二氯甲烷和甲醇混合液依次梯度洗脱：二氯甲烷和甲 醇的体积比20:1的混合液1、二氯甲醇和甲醇的体积比10:1的混合液2、二氯甲烷和甲醇 的体积比5:1的混合液3、二氯甲醇和甲醇的体积比1:1的混合液4,每个梯度洗脱量为五 个柱保留体积。收集二氯甲烷-甲醇体积比为10:1时的洗脱组分，并将此组分在50°C真空 减压浓缩。将上述二氯甲烷-甲醇（10:1)洗脱组分再用硅胶柱进行分离纯化，用200~300 目硅胶装柱，柱床长度40cm，柱内径5cm，按照lOml/min的流速用如下四个梯度的石油醚和 乙酸乙酯混合液依次梯度洗脱：石油醚和乙酸乙酯的体积比2:1的混合液1、石油醚和乙酸 乙酯的体积比1:1的混合液2、石油醚和乙酸乙酯的体积比1:2的混合液3、纯乙酸乙酯溶 剂4,每个梯度洗脱六个保留体积。分别收集混合液2和混合液3洗脱组分，并在50°C真空 减压浓缩。所述石油醚和乙酸乙酯混合液2洗脱组分用制备HPLC系统进行分离纯化，仪器 型号为Waters 600半制备型高效液相色谱仪，W2487双波长检测器检测，检测波长设定为 210nm和230nm，所用半制备柱型号为Agilent SB C18(9.4X250mm。以甲醇和水：体积比为 60:40)作为流动相进行分离，流速为2ml/min。收集保留时间为15. 5min、16. 5min的洗脱 峰，得到式（II)、式（IV)所示化合物，60°C进行真空减压浓缩，得到IOg萌芦素 C(式（II))、 500mg二氢萌芦素 C (式（IV))。所述石油醚和乙酸乙酯混合液3洗脱组分用制备HPLC系统 进行分离纯化，仪器型号为Waters 600半制备型高效液相色谱仪，W2487双波长检测器检 测，检测波长设定为210nm和230nm，所用半制备柱型号为Agilent SB C18(9.4X250mm。以 甲醇：水体积比为45:55)作为流动相进行分离，流速为2ml/min。收集保留时间为25. 5min、 28.2min的洗脱峰，得到式（III)、式（V)所示化合物，60°C进行真空减压浓缩，得到400mg 去乙酰萌芦素 C(式（III))、200mg二氢去乙酰萌芦素 C(式（V))。
[0039] 二、结构确认
[0040] 1、萌芦素 C，结构式如式II所示，为白色针晶，熔点为206°C~207°C，所用仪器为 X4型显微熔点测定仪（温度计未校正）。
[0041] 结构确证：
[0042] HRESIMS m/z :561. 3435 [M+H] + (calcd for C32H48O8:561. 3422)；
[0043] UV(MeOH) λ :23 Inm ;
[0044] IR(KBr) ν .:3410, 1728, 1250, 1692, 1630CHT1;
[0045] 1H-Nmr(CdcI3JOOMHz) : δ 7· 06 (lH，d，J= 15. 6Ηζ，Η-24)，6· 47 (lH，d，J= 15. 6Hz， Η-23)，5· 74 (1Η，br s，Η-6)，4· 35 (1Η，m，Η-16)，4· 32 (1Η，d，J = 10. 8Ηζ，Η-19)，3· 21 (2Η， m，Η-3)，3· 16 (1Η，m，Η-15)，3· 16 (1Η，d，J = 10. 8Ηζ，Η-19)，2· 65 (1Η，m，Η-8)，2· 57 (1Η，m， Η-15)，2· 47 (1Η，d，J = 8· 0Hz，Η-17)，2· 36 (1Η，m，Η-7)，2· 31 (1Η，m，Η-10)，2· 00 (3Η，s， CH3CO)，I. 89(lH，m，H-7)，I. 89(lH，d，J = 7· 6Ηζ，Η-12)，I. 77(lH，m，H-2)，I. 65(lH，m，H-l)， I. 56 (3Η，s，Η-27)，I. 54 (3Η，s，Η-26)，I. 44 (1Η，m，H-l)，I. 42 (3Η，s，Η-21)，I. 40 (1Η，d，J = 7. 6Hz，H-12)，I. 40 (1H，m，H-2)，I. 32 (3H，s，H-30)，I. 16 (3H，s，H-28)，I. 03 (3H，s，H-21)， 0· 94(3H，s，H-29);
[0046] 13C NMR(CDC13, 125MHz) : δ 213. 3 (C-Il)，202. 6 (C-22)，170.1 (CH3CO)， 151. 8 (C-24)，141. 6 (C-5)，120. 5 (C-23)，119. 8 (C-6)，79. 3 (C-25)，78. 3 (C-20)， 76. 3 (C-3)，71. 5 (C-16)，61. 2 (C-19)，58. 5 (C-17)，54. 4 (C-9)，51. I (C-14)，48. 9 (C-15)， 47. 9 (C-13)，45. 6 (C-12)，42. 4 (C-4)，35. I (C-10)，33. 7 (C-8)，30. 6 (C-2)，26. 5 (C-27)， 26. 3 (C-26)，24. 6 (C-I)，24. 5 (C-28)，241. I (C-21)，23. 8 (C-7)，22. 0 (CH3CO)，20. 4 (C-29)， 19. 7(C-30)，18. 7(C-18) 〇
[0047] 2、去乙酰萌芦素 C，结构式如式IV所示，为白色针晶，熔点为226°C~227°C，所用 仪器为X4型显微熔点测定仪（温度计未校正）。
[0048] 结构确证：
[0049] HRESIMS m/z :519. 3337 [M+H] + (calcd for C30H46O7:519. 3316)；
[0050] UV(MeOH) λ :23 Inm ;
[0051] IR(KBr) vmax：3413, 1728, 1695, 1633cm _1；
[0052] 1H-NMR(Pyridine-Cl5JOOMHz) : δ 7. 60 (1H，d，J = 15. 5Hz，H-24)，7. 50 (1H，d，J =15. 5Hz，H-23)，5. 82(1H，d，J = 6. 0Hz，H-6)，5. 05(1H，t，J = 7. 5Hz，H-16)，4. 86(1H， d，J = 10. 5Hz，H-19)，3. 56 (1H，d，J = 10. 5Hz，H-19)，3. 49 (1H，m，H-3)，3. 28 (1H，d，J = 10. 5Hz，H-8)，3. 21 (1H，d，J = 15. 0Hz，H-15)，3. 06 (1H，d，J = 7. 0Hz，H-17)，2. 90 (1H，d，J =15. 0Hz，H-15)，2. 65(lH，m，H-10)，2. 61(lH，m，H-7)，2. 10(lH，m，H-l)，2. 10(lH，m，H-12)， 2· 08 (1H，m，H-7)，2· 02 (1H，m，H-2)，I. 84 (1H，m，H-2)，I. 82 (1H，m，H-12)，I. 65 (3H，s，H-21)， I. 63 (3H，s，H-30)，I. 60 (3H，s，H-18)，I. 48 (3H，s，H-27)，I. 47 (1H，s，H-28)，I. 45 (3H，s， H-26)，I. 29 (3H，s，H-29)，I. 14 (1H，m，H-l);
[0053] 13C 匪R(Pyridine-d5, 125MHz) : δ 212. 3(C-11)，204. 8(C-22)，155. 8(C-24)， 143. 4(C-5)，121. 3(C-23)，119. 7(C-6)，79. 8(C-20)，76. 4(C-3)，71. 0(C-25)，70. 6(C-16)， 60. 8 (C-19)，59. 9 (C-17)，54. 5 (C-9)，51. 5 (C-14)，49. 8 (C-15)，48. 8 (C-13)，47. 2 (C-12)， 43. 4 (C-4)，36. I (C-10)，34. 0 (C-8)，32. 2 (C-2)，30. 3 (C-27)，30.1 (C-26)，25. 9 (C-I)， 25. 6 (C-28)，25. 2 (C-21)，24. 5 (C-7)，21. 4 (C-29)，20.1 (C-18)，19. 9 (C-30)。
[0054] 3、二氢萌芦素 C，结构式如式IV所示，为白色针晶，熔点为214°C~215°C，所用仪 器为X4型显微熔点测定仪（温度计未校正）。
[0055] 结构确证：
[0056] HRESIMS m/z :563. 3567 [M+H] + (calcd for C32H50O8:563. 3578)；
[0057] UV(MeOH) λ ·:202ηπι ;
[0058] IR(KBr) ν ·:3422, 2985,1731，1701，1650CHT1;
[0059] 1H-NMR (CDCl3, 500ΜΗζ) : δ 5· 74 (1Η，br s，Η-6)，4· 33 (1Η，m，Η-16)，4· 30 (1Η，d， J = 11. 0Hz，Η-19)，3· 20(1Η，m，Η-3)，3· 17(1Η，m，Η-15)，3· 16(1Η，d，J = 11. 0Hz，Η-19)， 2· 85 (2Η，m，Η-23)，2· 60 (1Η，d，J = 7· 5Ηζ，Η-8)，2· 58 (1Η，m，Η-15)，2· 50 (1Η，d，J = 7· 0Hz，Η-17)，2· 34 (1Η，m，Η-10)，2· 34 (1Η，m，Η-7)，2· 06 (2Η，m，Η-24)，L 96 (3Η，s，CH3CO)， L 90 (1Η，m，Η-7)，L 89 (1Η，m，Η-7)，L 80 (1Η，m，H-2)，L 65 (1Η，m，Η-1)，L 45 (3Η，s，Η-27)， L 43(1Η，m，Η-2, overlapped)，L 43(3Η，s，Η-21)，1· 40(3Η，s，Η-26)，L 40(1Η，m，H-I， overlapped)，L 40 (1Η，m，Η-12)，L 32 (3Η，s，Η-30)，L 16 (3Η，s，Η-28)，L 02 (3Η，s，Η-18)， 0· 94(3Η，s，Η-29);
[0060] 13C NMR(CDC13, 125ΜΗζ) : δ 214. 2 (C-22)，213. 5 (C-Il)，170. 5 (CH3CO)， 141. 6 (C-5)，119. 7 (C-6)，81. 4 (C-20)，79. I (C-25)，76. 5 (C-3)，71. 4 (C-16)，61. 2 (C-19)， 58. 0 (C-17)，54. 4 (C-9)，51. I (C-14)，48. 9 (C-15)，48. I (C-13)，45. 7 (C-12)，42. 4 (C-4)， 35. I (C-10)，35. 0 (C-24)，33. 6 (C-8)，30. 8 (C-2)，30. 8 (C-23)，26. 3 (C-27)，26. 0 (C-26)， 24. 6 (C-I)，24. 5 (C-28)，24. 5 (C-21)，23. 8 (C-7)，20. 4 (C-29)，22. 6 (CH3⑶），19. 6 (C-30)， 18. 7(C-18)〇
[0061] 4、二氢去乙酰萌芦素 C，结构式如式IV所示，为白色针晶，熔点为235°C~236°C， 所用仪器为X4型显 微熔点测定仪（温度计未校正）。
[0062] 结构确证：
[0063] HRESIMS m/z :521. 3495 [M+H] + (calcd for C30H48O7:521. 3473)；
[0064] UV(MeOH) λ ·:202ηπι ;
[0065] IR(KBr) vmax：3375, 1728, 1693, 1652cm _1；
[0066] 1H-NMR(Pyridine-Cl5JOOMHz) : δ 5· 83 (1H，d，J = 5. 5Hz，H-6)，4· 96 (1H，t，J = 7. 5Hz，H-16)，4. 86(1H，d，J = 10. 5Hz，H-19)，3. 56(1H，d，J = 10. 5Hz，H-19)，3. 54(1H， m，H-23)，3. 52 (1H，m，H-3)，3. 31 (1H，m，H-23)，3. 28 (1H，m，H-8)，3. 04 (1H，d，J = 7. 0Hz， H-17)，3. 03 (1H，m，H-15)，2. 90 (1H，m，H-15)，2. 65 (1H，m，H-10)，2. 62 (1H，m，H-7)，2. 26 (1H， m，H-24)，2. 10 (1H，m，H-l)，2. 09 (1H，m，H-7)，2. 03 (1H，m，H-2)，2. 02 (1H，m，H-12)，I. 80 (1H， m，H-2)，I. 80 (1H，m，H-12)，I. 65 (3H，s，H-30)，I. 64 (3H，s，H-21)，I. 60 (3H，s，H-18)， I. 48 (3H，s，H-28)，I. 40 (3H，s，H-26)，I. 40 (1H，s，H-27)，I. 32 (3H，s，H-29)，I. 16 (1H，m， H-l)；
[0067] 13C 匪R(Pyridine-d5, 125MHz) : δ 216. 6(C-22)，212. 6(C-11)，143. 4(C-5)， 119. 8(C-6)，80. 6(C-20)，76. 4(C-3)，70. 9(C-16)，69. 4(C-25)，60. 8(C-19)，59. 5(C-17)， 54. 6 (C-9)，51. 4 (C-14)，49. 9 (C-15)，48. 8 (C-13)，47. 2 (C-12)，43. 4 (C-4)，38. 9 (C-24)， 36. 2 (C-10)，33. 9 (C-8)，33. I (C-23)，32. 3 (C-2)，30. 4 (C-27)，30. 4 (C-26)，25. 8 (C-I)， 25. 6 (C-28)，25. 3 (C-21)，24. 5 (C-7)，21. 4 (C-29)，20. 2 (C-18)，19. 8 (C-30)。
[0068] 以上图谱结果表明所得化合物结构正确。
[0069] 实施例2萌芦素 C及其类似物的抗癌活性细胞实验
[0070] 1、实验细胞
[0071] 人肺癌细胞株A549,人前列腺癌细胞株Du 145,人结肠癌细胞株HCT116。
[0072] 将上述细胞株分别培养于添加10%灭活新生小牛血清的RPMI1640完全培养液 中。培养液中添加 lOOIU/mL青霉素和lOOyg/mL链霉素及IOmM HEPES，并置于37°C，5% CO2培养箱中培养。实验用细胞均处于对数生长期。
[0073] 2、实验药物
[0074] 实施例1中制备的4种萌芦素：萌芦素 C、去乙酰萌芦素 C、二氢萌芦素 C、二氢去 乙酰萌芦素 C ;并以紫杉醇（中国食品药品检定研宄院，批号：100382-201102)作为阳性对 照药。以培养基配制浓度为0. 1 μΜ-80 μM的药物浓度。
[0075] 3、抗癌细胞活性测定
[0076] 采用MTT法进行测定：
[0077] 取对数生长期细胞，用胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，配制成单细胞悬液，将细胞 悬液接种于96孔板，每孔加100 μ L，A549、Dul45和HCT116细胞分别为6Χ l〇VmL、I X IO5/ mL和7X 104/mL，培养24小时后，按组距1:10用培养液（即含10%胎牛血清的1640培养 基）稀释4种萌芦素和阳性对照药物紫杉醇溶液，使每种药物的浓度分别为80 μ Μ、40 μ M、 20μΜ、10μΜ、1 μΜ、(λ 5μΜ、(λ 1 μΜ，继续培养 72 小时。然后，每孔加 50yL MTT，37°C孵育 4小时后，弃去培养基和MTT，每孔立即加200 μ L DMSO溶解MTT甲臢颗粒，微型振荡器振荡 混匀后，用酶标仪测定光密度（OD)值，参考波长为450nm，检测波长为570nm，最后，根据下 述公式计算药物对肿瘤细胞的抑制率，并按照中效方程计算IC 5tl值：
[0078] 抑制率（％ )=(对照组平均OD值-给药组平均OD值）/对照组平均OD值X 100 %
[0079] (其中OD对照、0?验为已经扣除OD空白的实验值）。
[0080] 4、实验结果
[0081] 实验测得的各种药物对3种癌细胞的IC50值及抑制率曲线分别见表1和图1-3。
[0082] 表1萌芦素 C及其类似物的细胞毒活性试验结果
[0083]
[0084] 表1中数据表明，本发明提取四种萌芦素 C及其类似物对三种肿瘤细胞均有不同 程度的抑制增殖作用，其中对结肠癌细胞增殖的抑制作用较显著；萌芦素 C对前列腺癌增 殖抑制活性最强，且优于阳性对照药物紫杉醇；去乙酰萌芦素 C对前列腺癌细胞的增殖抑 制活性略弱于紫杉醇；由此可以得出结论，即本发明四种萌芦素 C及其类似物具有抗癌细 胞的细胞毒活性，可以用于癌症的治疗。
[0085] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1.萌芦素 C及其类似物的制备方法，其特征在于，萌芦素 C如式（II)所示，萌芦素 C类 似物为去乙酰萌芦素 C如式（III)所示、二氢萌芦素 C如式（IV)所示和二氢去乙酰萌芦素 C如式（V)所示；所述提取方法包括如下步骤： 1) 用乙醇提取黄瓜叶和/或黄瓜果实，然后除去乙醇，收集提取物； 2) 将所述提取物悬浮溶解于热水中，用石油醚进行萃取脱脂、脱色，移除石油醚萃取 液，保留水层； 3) 将水层部分用大孔树脂进行分离，利用不同浓度的乙醇-水溶液梯度洗脱，收集 80 %乙醇洗脱组分； 4) 将步骤3)所得组分进行正相硅胶柱层析，用二氯甲烷和甲醇混合溶剂体系梯度洗 脱，收集体积比为10:1的二氯甲烷和甲醇混合液洗脱组分； 5) 将步骤4)所得组分进行正相硅胶柱层析，用石油醚和乙酸乙酯混合溶剂体系梯度 洗脱，收集体积比为1:1和1:2的石油醚和乙酸乙酯混合液洗脱组分； 6) 将步骤5)所得组分用半制备HPLC进行纯化，仪器型号为waters600半制备型高效 液相，W2487双波长检测器检测，所用半制备柱型号为Agilent SB C18 9.4X250mm，进行 HPLC纯化； 其中，将收集得到的体积比为1:1的石油醚和乙酸乙酯混合液洗脱组分分离纯化，使 用流动相为体积比为60:40的甲醇-水混合液，收集保留时间为15. 5min和16. 5min的洗 脱峰，分别得到式（II)和式（IV)化合物； 将收集得到的体积比为1:2的石油醚和乙酸乙酯混合液洗脱组分分离纯化，使用流动 相为体积比为45:55的甲醇-水混合液，收集保留时间为25. 5min和28. 2min的洗脱峰，分 别得到式（III)和式（V)化合物。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述提取可以采用回流提取。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤6)中所述流动相的流速均为 2mL/min〇4. 如式（III)、式（IV)或式（V)所示的萌芦素 C类似物，或者其药学上可接受的盐：5. 萌芦素 C与权利要求4所述萌芦素 C类似物或其药学上可接受的盐在制备预防和/ 或治疗肿瘤药物中的应用。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述萌芦素 C及其类似物或其药学上可接 受的盐在制备预防和/或治疗人肝癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、膀胱癌、前列腺癌和结 肠癌药物中的应用。7. 根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述药物为口服制剂、外用剂或注射 剂；其中口服制剂包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、合剂、酒剂或滴丸剂；外用剂包括栓剂、搽剂、 洗剂、膏剂或透皮贴剂；注射剂包括注射液、混悬液或冻干粉针。
【专利摘要】本发明涉及天然药物化学领域，具体提供一种黄瓜中葫芦素C及其类似物的制备方法与应用，所述葫芦素C类似物为去乙酰葫芦素C、二氢葫芦素C和二氢去乙酰葫芦素C。本发明通过实验证明，所述葫芦素C及其类似物具有抗癌细胞的细胞毒活性，可以用于癌症的治疗。
【IPC分类】A61P35/00, A61K31/575, C07J9/00
【公开号】CN104892713
【申请号】CN201510181868
【发明人】黄三文, 周渊, 曾建国, 尚轶, 马永硕
【申请人】中国农业科学院蔬菜花卉研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年4月16日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及天然药物化学领域，具体地说，涉及一种黄瓜中萌芦素 C及其类似物 的制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 很多植物中均含有具有抗癌活性的化合物，如从太平洋紫杉（短叶红豆杉，Taxus brevifolia)树皮中提取出来的紫杉醇，从喜树（Camptotheca acuminata)皮和果实中提 取得到的羟基喜树碱即是应用广泛的抗癌药物。因此，从植物中寻找天然来源的抗癌药物 是目前癌症治疗的研宄热点。
[0003] 黄瓜（拉丁名Cucumis sativus Linn，英文名Cucumber)，萌芦科黄瓜属植物，也 称胡瓜、青瓜，是我国一种常见的蔬菜。同时，黄瓜还是一种传统的中草药，其果实和叶均能 入药。《本草纲目》记载黄瓜：主清热解渴，利水道；小儿热痢；水病肚胀，四肢浮肿；咽喉肿 痛；狐刺毒肿等。《本草拾遗》记载黄瓜叶：主小儿闪癣，一岁服一叶，生按绞汁服，得吐下良。
[0004] 黄瓜果实和叶中含有多种萌芦素成分，其中以萌芦素 C含量最高。这既是黄瓜苦 味的成因，也是黄瓜具有药用价值的物质基础。现代药理研宄表明，萌芦素类化合物具有很 强的抗癌活性。据报道，萌芦素 B、E、I，对乳腺癌、肺癌、肝癌等癌细胞的增殖具有很强的抑 制作用。甜瓜中的萌芦素 B、E已被开发成五类中药"萌芦素片"，主要应用于湿热毒盛所致 迀延性肝炎、慢性肝炎及原发性肝癌的辅助治疗。
[0005] 萌芦素 C于1954年在黄瓜叶中首次被发现，此后对萌芦素 C的研宄鲜有报道。仅 于1968年，印度研宄者介绍了从甜瓜中提取分离萌芦素 C，但没有介绍其制备方法。而从黄 瓜果实和黄瓜叶中提取制备萌芦素 C及其类似物的方法与其医药用途一直未见报道。
【发明内容】
[0006] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种黄瓜中萌芦素 C及其 类似物的制备方法与应用。
[0007] 本发明首先提供一种萌芦素 C及其类似物的制备方法，萌芦素 C如式（II)所示， 萌芦素 C类似物为去乙酰萌芦素 C如式（III)所示、二氢萌芦素 C如式（IV)所示和二氢去 乙酰萌芦素 C如式（V)所示；
[0008]
[0010] 所述提取方法包括如下步骤：
[0011] 1)用乙醇提取黄瓜叶和/或黄瓜果实，然后除去乙醇，收集提取物；
[0012] 2)将所述提取物悬浮溶解于热水中，用石油醚进行萃取脱脂、脱色，移除石油醚萃 取液，保留水层；
[0013] 3)将水层部分用大孔树脂进行分离，利用不同浓度的乙醇-水溶液梯度洗脱，收 集80 %乙醇洗脱组分；
[0014] 4)将步骤3)所得组分进行正相硅胶柱层析，用二氯甲烷和甲醇混合溶剂体系梯 度洗脱，收集体积比为10:1的二氯甲烷和甲醇混合液洗脱组分；
[0015] 5)将步骤4)所得组分进行正相硅胶柱层析，用石油醚和乙酸乙酯混合溶剂体系 梯度洗脱，收集体积比为1:1和1:2的石油醚和乙酸乙酯混合液洗脱组分；
[0016] 6)将步骤5)所得组分用半制备HPLC进行纯化，仪器型号为waterS600半制备型 高效液相，W2487双波长检测器检测，所用半制备柱型号为Agilent SB C189.4X250mm，进 行HPLC纯化；
[0017] 其中，将收集得到的体积比为1:1的石油醚和乙酸乙酯混合液洗脱组分分离纯 化，使用流动相为体积比为60:40的甲醇-水混合液，收集保留时间为15. 5min和16. 5min 的洗脱峰，分别得到式（II)和式（IV)化合物；
[0018] 将收集得到的体积比为1:2的石油醚和乙酸乙酯混合液洗脱组分分离纯化，使用 流动相为体积比为45:55的甲醇-水混合液，收集保留时间为25. 5min和28. 2min的洗脱 峰，分别得到式（III)和式（V)化合物。
[0019] 进一步地，步骤1)中所述提取可以采用回流提取。
[0020] 进一步地，步骤6)中所述流动相的流速均为2mL/min。
[0021] 本发明还提供了如式（III)、式（IV)或式（V)所示的萌芦素 C类似物，或者其药学 上可接受的盐：
[0022]
[0023] 本发明还提供了萌芦素 C及上述萌芦素 C类似物或其药学上可接受的盐在制备预 防和/或治疗肿瘤药物中的应用。
[0024] 作为优选，所述萌芦素 C及其类似物或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治 疗人肝癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、膀胱癌、前列腺癌和结肠癌药物中的应用。
[0025] 所述药物为口服制剂、外用剂或注射剂；其中口服制剂包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、 合剂、酒剂或滴丸剂；外用剂包括栓剂、搽剂、洗剂、膏剂或透皮贴剂；注射剂包括注射液、 混悬液或冻干粉针。
[0026] 上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
[0027] 所述药物以萌芦素 C及其类似物或其药学上可接受的盐为活性成分，需要的时 候，还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。
[0028] 所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、 吸收促进剂、表面活性剂、吸收载体、润滑剂等。
[0029] 所述药物可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入 机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。
[0030] 本发明的有益效果在于：
[0031] 本发明提供了一种从黄瓜中提取分离萌芦素 C及其类似物的方法，并首次从自然 界中获得去乙酰萌芦素 C(如式III所示）、二氢萌芦素 C(如式IV所示）和二氢去乙酰萌 芦素 C (如式V所示）。本发明通过实验证明，利用本发明制备方法得到的萌芦素 C及其类 似物具有抗癌细胞的细胞毒活性，可以用于癌症的治疗。
【附图说明】
[0032] 图1为本发明实施例2中所述萌芦素 C及其类似物对肺癌细胞的抑制率曲线。
[0033] 图2为本发明实施例2中所述萌芦素 C及其类似物对前列腺癌细胞的抑制率曲 线。
[0034] 图3为本发明实施例2中所述萌芦素 C及其类似物对结肠癌细胞的抑制率曲线。
【具体实施方式】
[0035] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0036] 实施例1萌芦素 C、去乙酰萌芦素 C、二氢萌芦素 C、二氢去乙酰萌芦素 C的提取
[0037] 一、提取分离
[0038] 将70kg的黄瓜叶切碎，用95%乙醇回流提取lh，共提取3次。90°C减压浓缩回收 溶剂，得到固体浸膏780g。将所述固体浸膏700g悬浮于水中，用石油醚萃取8次，移除石 油醚层，收集水层。水层离心过滤，收集滤液，用DlOl大孔树脂柱进行层析分离，柱床长度 150cm，柱内径为20cm，按照40ml/min的流速用水及不同浓度的乙醇依次进行洗脱：水洗脱 为部位1、30%乙醇洗脱为部位2、80%乙醇洗脱为部位3、95%乙醇洗脱为部位4,每个部 位洗脱六个保留体积。收集80%乙醇洗脱部位3,60°C减压浓缩至干得浸膏。将上述浸膏 用正相硅胶柱进行层析分离，用200~300目硅胶装柱，柱床长度100cm，柱内径15cm，按照 20ml/min的流速用如下四个梯度的二氯甲烷和甲醇混合液依次梯度洗脱：二氯甲烷和甲 醇的体积比20:1的混合液1、二氯甲醇和甲醇的体积比10:1的混合液2、二氯甲烷和甲醇 的体积比5:1的混合液3、二氯甲醇和甲醇的体积比1:1的混合液4,每个梯度洗脱量为五 个柱保留体积。收集二氯甲烷-甲醇体积比为10:1时的洗脱组分，并将此组分在50°C真空 减压浓缩。将上述二氯甲烷-甲醇（10:1)洗脱组分再用硅胶柱进行分离纯化，用200~300 目硅胶装柱，柱床长度40cm，柱内径5cm，按照lOml/min的流速用如下四个梯度的石油醚和 乙酸乙酯混合液依次梯度洗脱：石油醚和乙酸乙酯的体积比2:1的混合液1、石油醚和乙酸 乙酯的体积比1:1的混合液2、石油醚和乙酸乙酯的体积比1:2的混合液3、纯乙酸乙酯溶 剂4,每个梯度洗脱六个保留体积。分别收集混合液2和混合液3洗脱组分，并在50°C真空 减压浓缩。所述石油醚和乙酸乙酯混合液2洗脱组分用制备HPLC系统进行分离纯化，仪器 型号为Waters 600半制备型高效液相色谱仪，W2487双波长检测器检测，检测波长设定为 210nm和230nm，所用半制备柱型号为Agilent SB C18(9.4X250mm。以甲醇和水：体积比为 60:40)作为流动相进行分离，流速为2ml/min。收集保留时间为15. 5min、16. 5min的洗脱 峰，得到式（II)、式（IV)所示化合物，60°C进行真空减压浓缩，得到IOg萌芦素 C(式（II))、 500mg二氢萌芦素 C (式（IV))。所述石油醚和乙酸乙酯混合液3洗脱组分用制备HPLC系统 进行分离纯化，仪器型号为Waters 600半制备型高效液相色谱仪，W2487双波长检测器检 测，检测波长设定为210nm和230nm，所用半制备柱型号为Agilent SB C18(9.4X250mm。以 甲醇：水体积比为45:55)作为流动相进行分离，流速为2ml/min。收集保留时间为25. 5min、 28.2min的洗脱峰，得到式（III)、式（V)所示化合物，60°C进行真空减压浓缩，得到400mg 去乙酰萌芦素 C(式（III))、200mg二氢去乙酰萌芦素 C(式（V))。
[0039] 二、结构确认
[0040] 1、萌芦素 C，结构式如式II所示，为白色针晶，熔点为206°C~207°C，所用仪器为 X4型显微熔点测定仪（温度计未校正）。
[0041] 结构确证：
[0042] HRESIMS m/z :561. 3435 [M+H] + (calcd for C32H48O8:561. 3422)；
[0043] UV(MeOH) λ :23 Inm ;
[0044] IR(KBr) ν .:3410, 1728, 1250, 1692, 1630CHT1;
[0045] 1H-Nmr(CdcI3JOOMHz) : δ 7· 06 (lH，d，J= 15. 6Ηζ，Η-24)，6· 47 (lH，d，J= 15. 6Hz， Η-23)，5· 74 (1Η，br s，Η-6)，4· 35 (1Η，m，Η-16)，4· 32 (1Η，d，J = 10. 8Ηζ，Η-19)，3· 21 (2Η， m，Η-3)，3· 16 (1Η，m，Η-15)，3· 16 (1Η，d，J = 10. 8Ηζ，Η-19)，2· 65 (1Η，m，Η-8)，2· 57 (1Η，m， Η-15)，2· 47 (1Η，d，J = 8· 0Hz，Η-17)，2· 36 (1Η，m，Η-7)，2· 31 (1Η，m，Η-10)，2· 00 (3Η，s， CH3CO)，I. 89(lH，m，H-7)，I. 89(lH，d，J = 7· 6Ηζ，Η-12)，I. 77(lH，m，H-2)，I. 65(lH，m，H-l)， I. 56 (3Η，s，Η-27)，I. 54 (3Η，s，Η-26)，I. 44 (1Η，m，H-l)，I. 42 (3Η，s，Η-21)，I. 40 (1Η，d，J = 7. 6Hz，H-12)，I. 40 (1H，m，H-2)，I. 32 (3H，s，H-30)，I. 16 (3H，s，H-28)，I. 03 (3H，s，H-21)， 0· 94(3H，s，H-29);
[0046] 13C NMR(CDC13, 125MHz) : δ 213. 3 (C-Il)，202. 6 (C-22)，170.1 (CH3CO)， 151. 8 (C-24)，141. 6 (C-5)，120. 5 (C-23)，119. 8 (C-6)，79. 3 (C-25)，78. 3 (C-20)， 76. 3 (C-3)，71. 5 (C-16)，61. 2 (C-19)，58. 5 (C-17)，54. 4 (C-9)，51. I (C-14)，48. 9 (C-15)， 47. 9 (C-13)，45. 6 (C-12)，42. 4 (C-4)，35. I (C-10)，33. 7 (C-8)，30. 6 (C-2)，26. 5 (C-27)， 26. 3 (C-26)，24. 6 (C-I)，24. 5 (C-28)，241. I (C-21)，23. 8 (C-7)，22. 0 (CH3CO)，20. 4 (C-29)， 19. 7(C-30)，18. 7(C-18) 〇
[0047] 2、去乙酰萌芦素 C，结构式如式IV所示，为白色针晶，熔点为226°C~227°C，所用 仪器为X4型显微熔点测定仪（温度计未校正）。
[0048] 结构确证：
[0049] HRESIMS m/z :519. 3337 [M+H] + (calcd for C30H46O7:519. 3316)；
[0050] UV(MeOH) λ :23 Inm ;
[0051] IR(KBr) vmax：3413, 1728, 1695, 1633cm _1；
[0052] 1H-NMR(Pyridine-Cl5JOOMHz) : δ 7. 60 (1H，d，J = 15. 5Hz，H-24)，7. 50 (1H，d，J =15. 5Hz，H-23)，5. 82(1H，d，J = 6. 0Hz，H-6)，5. 05(1H，t，J = 7. 5Hz，H-16)，4. 86(1H， d，J = 10. 5Hz，H-19)，3. 56 (1H，d，J = 10. 5Hz，H-19)，3. 49 (1H，m，H-3)，3. 28 (1H，d，J = 10. 5Hz，H-8)，3. 21 (1H，d，J = 15. 0Hz，H-15)，3. 06 (1H，d，J = 7. 0Hz，H-17)，2. 90 (1H，d，J =15. 0Hz，H-15)，2. 65(lH，m，H-10)，2. 61(lH，m，H-7)，2. 10(lH，m，H-l)，2. 10(lH，m，H-12)， 2· 08 (1H，m，H-7)，2· 02 (1H，m，H-2)，I. 84 (1H，m，H-2)，I. 82 (1H，m，H-12)，I. 65 (3H，s，H-21)， I. 63 (3H，s，H-30)，I. 60 (3H，s，H-18)，I. 48 (3H，s，H-27)，I. 47 (1H，s，H-28)，I. 45 (3H，s， H-26)，I. 29 (3H，s，H-29)，I. 14 (1H，m，H-l);
[0053] 13C 匪R(Pyridine-d5, 125MHz) : δ 212. 3(C-11)，204. 8(C-22)，155. 8(C-24)， 143. 4(C-5)，121. 3(C-23)，119. 7(C-6)，79. 8(C-20)，76. 4(C-3)，71. 0(C-25)，70. 6(C-16)， 60. 8 (C-19)，59. 9 (C-17)，54. 5 (C-9)，51. 5 (C-14)，49. 8 (C-15)，48. 8 (C-13)，47. 2 (C-12)， 43. 4 (C-4)，36. I (C-10)，34. 0 (C-8)，32. 2 (C-2)，30. 3 (C-27)，30.1 (C-26)，25. 9 (C-I)， 25. 6 (C-28)，25. 2 (C-21)，24. 5 (C-7)，21. 4 (C-29)，20.1 (C-18)，19. 9 (C-30)。
[0054] 3、二氢萌芦素 C，结构式如式IV所示，为白色针晶，熔点为214°C~215°C，所用仪 器为X4型显微熔点测定仪（温度计未校正）。
[0055] 结构确证：
[0056] HRESIMS m/z :563. 3567 [M+H] + (calcd for C32H50O8:563. 3578)；
[0057] UV(MeOH) λ ·:202ηπι ;
[0058] IR(KBr) ν ·:3422, 2985,1731，1701，1650CHT1;
[0059] 1H-NMR (CDCl3, 500ΜΗζ) : δ 5· 74 (1Η，br s，Η-6)，4· 33 (1Η，m，Η-16)，4· 30 (1Η，d， J = 11. 0Hz，Η-19)，3· 20(1Η，m，Η-3)，3· 17(1Η，m，Η-15)，3· 16(1Η，d，J = 11. 0Hz，Η-19)， 2· 85 (2Η，m，Η-23)，2· 60 (1Η，d，J = 7· 5Ηζ，Η-8)，2· 58 (1Η，m，Η-15)，2· 50 (1Η，d，J = 7· 0Hz，Η-17)，2· 34 (1Η，m，Η-10)，2· 34 (1Η，m，Η-7)，2· 06 (2Η，m，Η-24)，L 96 (3Η，s，CH3CO)， L 90 (1Η，m，Η-7)，L 89 (1Η，m，Η-7)，L 80 (1Η，m，H-2)，L 65 (1Η，m，Η-1)，L 45 (3Η，s，Η-27)， L 43(1Η，m，Η-2, overlapped)，L 43(3Η，s，Η-21)，1· 40(3Η，s，Η-26)，L 40(1Η，m，H-I， overlapped)，L 40 (1Η，m，Η-12)，L 32 (3Η，s，Η-30)，L 16 (3Η，s，Η-28)，L 02 (3Η，s，Η-18)， 0· 94(3Η，s，Η-29);
[0060] 13C NMR(CDC13, 125ΜΗζ) : δ 214. 2 (C-22)，213. 5 (C-Il)，170. 5 (CH3CO)， 141. 6 (C-5)，119. 7 (C-6)，81. 4 (C-20)，79. I (C-25)，76. 5 (C-3)，71. 4 (C-16)，61. 2 (C-19)， 58. 0 (C-17)，54. 4 (C-9)，51. I (C-14)，48. 9 (C-15)，48. I (C-13)，45. 7 (C-12)，42. 4 (C-4)， 35. I (C-10)，35. 0 (C-24)，33. 6 (C-8)，30. 8 (C-2)，30. 8 (C-23)，26. 3 (C-27)，26. 0 (C-26)， 24. 6 (C-I)，24. 5 (C-28)，24. 5 (C-21)，23. 8 (C-7)，20. 4 (C-29)，22. 6 (CH3⑶），19. 6 (C-30)， 18. 7(C-18)〇
[0061] 4、二氢去乙酰萌芦素 C，结构式如式IV所示，为白色针晶，熔点为235°C~236°C， 所用仪器为X4型显 微熔点测定仪（温度计未校正）。
[0062] 结构确证：
[0063] HRESIMS m/z :521. 3495 [M+H] + (calcd for C30H48O7:521. 3473)；
[0064] UV(MeOH) λ ·:202ηπι ;
[0065] IR(KBr) vmax：3375, 1728, 1693, 1652cm _1；
[0066] 1H-NMR(Pyridine-Cl5JOOMHz) : δ 5· 83 (1H，d，J = 5. 5Hz，H-6)，4· 96 (1H，t，J = 7. 5Hz，H-16)，4. 86(1H，d，J = 10. 5Hz，H-19)，3. 56(1H，d，J = 10. 5Hz，H-19)，3. 54(1H， m，H-23)，3. 52 (1H，m，H-3)，3. 31 (1H，m，H-23)，3. 28 (1H，m，H-8)，3. 04 (1H，d，J = 7. 0Hz， H-17)，3. 03 (1H，m，H-15)，2. 90 (1H，m，H-15)，2. 65 (1H，m，H-10)，2. 62 (1H，m，H-7)，2. 26 (1H， m，H-24)，2. 10 (1H，m，H-l)，2. 09 (1H，m，H-7)，2. 03 (1H，m，H-2)，2. 02 (1H，m，H-12)，I. 80 (1H， m，H-2)，I. 80 (1H，m，H-12)，I. 65 (3H，s，H-30)，I. 64 (3H，s，H-21)，I. 60 (3H，s，H-18)， I. 48 (3H，s，H-28)，I. 40 (3H，s，H-26)，I. 40 (1H，s，H-27)，I. 32 (3H，s，H-29)，I. 16 (1H，m， H-l)；
[0067] 13C 匪R(Pyridine-d5, 125MHz) : δ 216. 6(C-22)，212. 6(C-11)，143. 4(C-5)， 119. 8(C-6)，80. 6(C-20)，76. 4(C-3)，70. 9(C-16)，69. 4(C-25)，60. 8(C-19)，59. 5(C-17)， 54. 6 (C-9)，51. 4 (C-14)，49. 9 (C-15)，48. 8 (C-13)，47. 2 (C-12)，43. 4 (C-4)，38. 9 (C-24)， 36. 2 (C-10)，33. 9 (C-8)，33. I (C-23)，32. 3 (C-2)，30. 4 (C-27)，30. 4 (C-26)，25. 8 (C-I)， 25. 6 (C-28)，25. 3 (C-21)，24. 5 (C-7)，21. 4 (C-29)，20. 2 (C-18)，19. 8 (C-30)。
[0068] 以上图谱结果表明所得化合物结构正确。
[0069] 实施例2萌芦素 C及其类似物的抗癌活性细胞实验
[0070] 1、实验细胞
[0071] 人肺癌细胞株A549,人前列腺癌细胞株Du 145,人结肠癌细胞株HCT116。
[0072] 将上述细胞株分别培养于添加10%灭活新生小牛血清的RPMI1640完全培养液 中。培养液中添加 lOOIU/mL青霉素和lOOyg/mL链霉素及IOmM HEPES，并置于37°C，5% CO2培养箱中培养。实验用细胞均处于对数生长期。
[0073] 2、实验药物
[0074] 实施例1中制备的4种萌芦素：萌芦素 C、去乙酰萌芦素 C、二氢萌芦素 C、二氢去 乙酰萌芦素 C ;并以紫杉醇（中国食品药品检定研宄院，批号：100382-201102)作为阳性对 照药。以培养基配制浓度为0. 1 μΜ-80 μM的药物浓度。
[0075] 3、抗癌细胞活性测定
[0076] 采用MTT法进行测定：
[0077] 取对数生长期细胞，用胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，配制成单细胞悬液，将细胞 悬液接种于96孔板，每孔加100 μ L，A549、Dul45和HCT116细胞分别为6Χ l〇VmL、I X IO5/ mL和7X 104/mL，培养24小时后，按组距1:10用培养液（即含10%胎牛血清的1640培养 基）稀释4种萌芦素和阳性对照药物紫杉醇溶液，使每种药物的浓度分别为80 μ Μ、40 μ M、 20μΜ、10μΜ、1 μΜ、(λ 5μΜ、(λ 1 μΜ，继续培养 72 小时。然后，每孔加 50yL MTT，37°C孵育 4小时后，弃去培养基和MTT，每孔立即加200 μ L DMSO溶解MTT甲臢颗粒，微型振荡器振荡 混匀后，用酶标仪测定光密度（OD)值，参考波长为450nm，检测波长为570nm，最后，根据下 述公式计算药物对肿瘤细胞的抑制率，并按照中效方程计算IC 5tl值：
[0078] 抑制率（％ )=(对照组平均OD值-给药组平均OD值）/对照组平均OD值X 100 %
[0079] (其中OD对照、0?验为已经扣除OD空白的实验值）。
[0080] 4、实验结果
[0081] 实验测得的各种药物对3种癌细胞的IC50值及抑制率曲线分别见表1和图1-3。
[0082] 表1萌芦素 C及其类似物的细胞毒活性试验结果
[0083]
[0084] 表1中数据表明，本发明提取四种萌芦素 C及其类似物对三种肿瘤细胞均有不同 程度的抑制增殖作用，其中对结肠癌细胞增殖的抑制作用较显著；萌芦素 C对前列腺癌增 殖抑制活性最强，且优于阳性对照药物紫杉醇；去乙酰萌芦素 C对前列腺癌细胞的增殖抑 制活性略弱于紫杉醇；由此可以得出结论，即本发明四种萌芦素 C及其类似物具有抗癌细 胞的细胞毒活性，可以用于癌症的治疗。
[0085] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1.萌芦素 C及其类似物的制备方法，其特征在于，萌芦素 C如式（II)所示，萌芦素 C类 似物为去乙酰萌芦素 C如式（III)所示、二氢萌芦素 C如式（IV)所示和二氢去乙酰萌芦素 C如式（V)所示；所述提取方法包括如下步骤： 1) 用乙醇提取黄瓜叶和/或黄瓜果实，然后除去乙醇，收集提取物； 2) 将所述提取物悬浮溶解于热水中，用石油醚进行萃取脱脂、脱色，移除石油醚萃取 液，保留水层； 3) 将水层部分用大孔树脂进行分离，利用不同浓度的乙醇-水溶液梯度洗脱，收集 80 %乙醇洗脱组分； 4) 将步骤3)所得组分进行正相硅胶柱层析，用二氯甲烷和甲醇混合溶剂体系梯度洗 脱，收集体积比为10:1的二氯甲烷和甲醇混合液洗脱组分； 5) 将步骤4)所得组分进行正相硅胶柱层析，用石油醚和乙酸乙酯混合溶剂体系梯度 洗脱，收集体积比为1:1和1:2的石油醚和乙酸乙酯混合液洗脱组分； 6) 将步骤5)所得组分用半制备HPLC进行纯化，仪器型号为waters600半制备型高效 液相，W2487双波长检测器检测，所用半制备柱型号为Agilent SB C18 9.4X250mm，进行 HPLC纯化； 其中，将收集得到的体积比为1:1的石油醚和乙酸乙酯混合液洗脱组分分离纯化，使 用流动相为体积比为60:40的甲醇-水混合液，收集保留时间为15. 5min和16. 5min的洗 脱峰，分别得到式（II)和式（IV)化合物； 将收集得到的体积比为1:2的石油醚和乙酸乙酯混合液洗脱组分分离纯化，使用流动 相为体积比为45:55的甲醇-水混合液，收集保留时间为25. 5min和28. 2min的洗脱峰，分 别得到式（III)和式（V)化合物。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述提取可以采用回流提取。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤6)中所述流动相的流速均为 2mL/min〇4. 如式（III)、式（IV)或式（V)所示的萌芦素 C类似物，或者其药学上可接受的盐：5. 萌芦素 C与权利要求4所述萌芦素 C类似物或其药学上可接受的盐在制备预防和/ 或治疗肿瘤药物中的应用。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述萌芦素 C及其类似物或其药学上可接 受的盐在制备预防和/或治疗人肝癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、膀胱癌、前列腺癌和结 肠癌药物中的应用。7. 根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述药物为口服制剂、外用剂或注射 剂；其中口服制剂包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、合剂、酒剂或滴丸剂；外用剂包括栓剂、搽剂、 洗剂、膏剂或透皮贴剂；注射剂包括注射液、混悬液或冻干粉针。
【专利摘要】本发明涉及天然药物化学领域，具体提供一种黄瓜中葫芦素C及其类似物的制备方法与应用，所述葫芦素C类似物为去乙酰葫芦素C、二氢葫芦素C和二氢去乙酰葫芦素C。本发明通过实验证明，所述葫芦素C及其类似物具有抗癌细胞的细胞毒活性，可以用于癌症的治疗。
【IPC分类】A61P35/00, A61K31/575, C07J9/00
【公开号】CN104892713
【申请号】CN201510181868
【发明人】黄三文, 周渊, 曾建国, 尚轶, 马永硕
【申请人】中国农业科学院蔬菜花卉研究所
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年4月16日
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