一种新的19-脱甲基蟾毒内酯化合物及其在制备抗肿瘤药物制剂中的应用
一种新的19-脱甲基蟾毒内酯化合物及其在制备抗肿瘤药物制剂中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及天然药物及化学药物领域，具体涉及一种新的19-脱甲基蟾毒内酯化 合物及其在治疗肿瘤药物制剂中的应用。
【背景技术】
[0002] 癌症是危害人类生命的第一大杀手，研宄开发抗癌药物一直是全世界医药界研宄 的热点。
[0003] 蟾皮为蟾蜍科动物中华大蟾蜍（Bufo bufo gargarizans Cantor)或黑框蟾蜍 (Bufo melanostictus Schneider)的干燥皮，主要产于我国的浙江、江苏、山东、河北等 地。该品性凉、味苦，具有清热解毒、利水消肿的功效，主治痈疽、肿毒、瘰疬等，临床常用 于治疗恶性肿瘤和慢性气管炎等（中药大辞典，1977:2713-2714)。近年来的研宄结果显 示，蟾皮不仅具有镇痛、抗炎的功效，还具有抗肿瘤、提高免疫等多种生物活性（时珍国医 国药，2009:1213-1214)。由于蟾皮及其制剂华蟾素注射液在临床治疗癌症方面的确切疗 效（实用肿瘤杂志，2007, 1:32-35)，从而引起了人们对蟾皮化学成分的广泛关注。研宄表 明，蟾皮富含一类乙型强心留类化合物，又称蟾毒内酯类化合物。该类化合物的母核通常 由24个碳原子组成，且在C-17位具有α -吡喃酮基。其中蟾毒灵（bufalin)、华蟾蜍他灵 (Cinobufotalin)等是蟾皮的主要成分，并具有抗肿瘤作用。然而，蟾皮的化学成分复杂，目 前仅报道了约40余种蟾毒内醋类成分（Chemistry&biodiversity, 2011:559-567)，其抗肿 瘤活性成分有待深入发掘。
【发明内容】
[0004] 本发明的首要目的在于提供一种新的具有抗肿瘤活性的19-脱甲基蟾毒内酯化 合物。
[0005] 本发明的另一目的在于提供上述19-脱甲基蟾毒内酯化合物在抗肿瘤药物制剂 中的应用。
[0006] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0007] -种新的19-脱甲基蟾毒内酯化合物，命名为Bufogargarin A(式I)，结构如下：
[0008]
O
[0009] Bufogargarin A从蟾皮中提取分离得到：将蟾皮粗粉用水或有机溶剂提取，再通 过硅胶柱层析、ODS柱层析、Sephadex LH-20及制备型HPLC纯化，得到Bufogargarin A。
[0010] Bufogargarin A在制备抗肿瘤药物制剂中的应用，所述药物制剂中含有治疗有效 量的Bufogargarin A，余量为药用辅料或其它可配伍的药物；
[0011] 所述药用辅料是指常规的药用赋形剂，如溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂和 粘合剂等；
[0012] 所述其它可配伍的药物，指的是以有效剂量的Bufogargarin A为药物原料，再配 伍其它天然药物或化学药品；
[0013] 所述的抗肿瘤药物制剂包括多种临床药物剂型，如片剂、注射液、脂质体纳米粒、 控释剂等；
[0014] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0015] (1)本发明发掘了蟾皮中的一种新19-脱甲基蟾毒内酯化合物，命名为 Bufogargarin A，该化合物是由23个碳原子组成骨架且10位连有氢原子的新型19-脱甲 基蟾毒内酯类化合物。
[0016] (2)本发明发现Bufogargarin A在较低浓度（0· 416~3. 481 μ M)下即可抑制多 种肿瘤细胞的增殖。
[0017] (3)本发明发现19-脱甲基蟾毒内酯Bufogargarin A的抗肿瘤活性明显优于对应 的含19位甲基的蟾毒内酯化合物，例如Bufogargarin A对多种肿瘤细胞的增殖抑制活性 强于华蟾餘他灵（cinobufotalin)5~10倍。
[0018] (4)本发明的Bufogargarin A在体内的毒性低于华蟾蜍他灵，在治疗剂量下未观 察到明显的毒副作用。
【附图说明】
[0019] 图1是19-脱甲基蟾毒内醋化合物Bufogargarin A的1H NMR谱图。
[0020] 图2是19-脱甲基蟾毒内酯化合物Bufogargarin A的13C NMR谱图。
[0021] 图3是19-脱甲基蟾毒内醋化合物Bufogargarin A的HSQC谱图。
[0022] 图4是19-脱甲基蟾毒内醋化合物Bufogargarin A的HMBC谱图。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0024] 实施例1化合物的提取分离和结构鉴定
[0025] (1)取干燥蟾皮11kg，用粉碎机粉碎成10~50目的蟾皮粗粉，用3倍质量的蒸馏 水于100°C条件下加热回流提取4次，每次Ih ;合并提取液并减压浓缩至密度为1. 15,加入 乙醇混匀使含醇量为80 % (v/v)，静置24h，吸取上清液，减压浓缩得水提取物；然后将水提 取后的蟾皮粗粉残渣用3倍质量95% (v/v)的乙醇80°C条件下加热回流提取提取4次，每 次Ih ;合并提取液并减压浓缩得到乙醇提取物；将水总提取物和乙醇总提取物合并，与6L 水混悬后，用6L氯仿萃取，重复4次，合并萃取液，减压浓缩得氯仿部位（150g)以及水部位 (400g) 〇
[0026] (2)对步骤（1)制备得到的氯仿部位进行硅胶柱层析，以环己烷-丙酮为洗脱剂， 按照环己烷和丙酮体积比为 100:0、98:2、95:5、90:10、85:15、80:20、70:30、1:1 和 0:100 的 洗脱梯度进行洗脱，经TLC分析并相似流份，得到8个主流份Fr. A~Fr. H ;
[0027] (3) Bufogargarin A 的分离纯化
[0028] ①对步骤（2)中得到的组分Fr. E(Ilg)(由环己烷：丙酮=85:15洗脱得到）进行 反相ODS柱层析，以甲醇-水（MeOH-H2O)为洗脱剂，按照甲醇和水体积比为10:90、20:80、 30:70、40:60、50:50、60:40、70:30和80:20的洗脱梯度进行洗脱，收集甲醇-水体积比为 50:50的洗脱流份；
[0029] ②将步骤（3)①得到的洗脱流份浓缩后上样于S印hadex LH-20色谱柱，以甲醇为 流动相，流速为0. 5mL/min进行洗脱，收集保留体积为100~300mL的洗脱液；
[0030] ③将步骤（3)②得到的洗脱液浓缩后用甲醇溶解，然后用反相制备型HPLC分离 纯化，以体积比为40:60的甲醇-水为洗脱剂，流速为3mL/min进行洗脱，收集保留时间 30. 8min 的色谱峰，得到 Bufogargarin A (29mg);
[0031] (4)产物 Bufogargarin A 的结构表征
[0032] 白色粉末；香草醛-浓硫酸反应（TLC)显紫色；[β]晋+13.71 (c 1.0, MeOH); UV(MeOH) Amax(l〇g ε )204(3. 83), 295(3. 70)nm ；IR(KBr) v max3428, 2938, 2877, 2368 ,1725, 1636, 1539, 1454, 1429, 1375, 1246, 1133, 1094, 834, 604cm_1；HR-ESI-MS m/z 445. 2222 [M+H]+ (计算值 C25H33O7, 445. 2221)。氢谱（1H NMR)和碳谱（13C NMR)数据见表 1。 1H NMR，13C NMR，HSQC和HMBC核磁共振图谱见图1-4。根据以上理化数据和NMR图谱，鉴定 Bufogargarin A的结构如式I所示。
[0033] 表1. Bufogargarin A 的1H (500MHz)和 13C (125MHz) NMR 数据
[0034]
[0035] 注：（CD3OD，δ 单位为 ppm，J 单位为 Hz)
[0036] 实施例2 Bufogargarin A对肿瘤细胞增殖的抑制作用
[0037] 将处于对数生长期的细胞（人肝癌细胞H印G2、人非小细胞肺癌细胞A549和人宫 颈癌细胞Hela、人结肠癌细胞Loto、人乳腺癌细胞MCF-7、人食道癌细胞Eca-109)(细胞株 均购自美国模式培养物集存库American Type Culture Collection, ATCC)用胰酶消化、离 心、重悬后进行细胞计数，以IX IO6AiL接种于96孔培养板中，每孔100 μ L，待细胞贴壁后 ， 将待测药物稀释成一定的浓度梯度，每个浓度设置4个平行复孔，同时设置空白对照组和 阳性对照组（Doxorubicin)，置于恒温培养箱（37°C，5% CO2中培养72h。吸掉培养基，每孔 加入30 μ L的MTT溶液（5mg/mL)，继续培养4h，除去上清液，每孔添加100 μ L的DMS0,充分 振荡至颗粒溶解，用酶标仪在570nm波长处检测每个孔的吸光度OD值。按下列公式计算细 胞生长抑制率，重复实验至少3次以上。细胞生长抑制率计算公式：抑制率（％) = (1-加 药组OD值）/对照组OD值X 100%。以样品浓度为横轴，以细胞生长抑制率为纵轴绘制曲 线。根据细胞生长抑制曲线，计算出半数有效抑制浓度IC5tl值。
[0038] 试验结果显示Bufogargarin A对人肝癌细胞HepG2、人非小细胞肺癌细胞A549、 人宫颈癌细胞Hela、人结肠癌细胞Lovo、人乳腺癌细胞MCF-7和人食道癌细胞Eca-109的 增殖均具有显著的抑制作用。Bufogargarin A的抗肿瘤活性明显优于对应的含19位甲基 的蟾毒内酯化合物，例如Bufogargarin A对多种肿瘤细胞的增殖抑制活性强于华蟾蜍他灵 (Cinobufotalin) 5 ~10 倍（表 2)。
[0039] 表2. Bufogargarin A对多种肿瘤细胞的生长抑制作用
[0040]
[0041] 实施例3 Bufogargarin A体内抗肿瘤作用
[0042] 试验方法：取体重18_22g的昆明种小鼠（购自广东省动物中心），随机分组，每组 10只。分别在其右前肢腋下接种瘤细胞（S180腹水瘤细胞）2 X IO7个，24小时后腹腔注射 给药，每天给药一次，连续给药10天后处死动物，取瘤称重。
[0043] 抑瘤率按如下公式计算：
[0044] 抑瘤率（％ ) = [1_(给药组平均瘤重）/对照组平均瘤重]X 100%
[0045] 统计分析采用t检验处理，P < 0. 05认为有显著性差异。结果见表3。
[0046] 表3. Bufogargarin A对小鼠 S180实体瘤生长的抑制作用（η = 10)
[0047]
[0048] 与模型组相比，*Ρ < 0. 05有显著性差异
[0049] 取体重18_22g的裸鼠（购自广东省动物中心），随机分组，每组10只。分别在其 右前肢腋下接种人肝癌细胞HepG21 X IO7个，24小时后腹腔注射给药，Bufogargarin A每 天给药一次，5-氟尿嘧啶（5-Fu，购于北京百灵威科技有限公司）隔天给药，连续注射21天 后停药并处死动物，取瘤称重。
[0050] 抑瘤率按如下公式计算：
[0051] 抑瘤率（％ ) = [1_(给药组平均瘤重）/对照组平均瘤重]X 100%
[0052] 统计分析采用t检验，P < 0. 05即有显著性差异。结果见表4。
[0053] 表4. Bufogargarin A对人肝癌细胞HepG2裸鼠移植瘤生长的抑制作用（η = 10)
[0054]
[0055] 与模型组相比，*P < 0. 05有显著性差异
[0056] 试验结果表明，Bufogargarin A对小鼠腹水瘤S180和人肝癌细胞HepG2裸鼠移 植瘤生长有明显的抑制作用。不同浓度给药组和对照组小鼠体重无明显差异，未见小鼠外 观、活动状态等方面异常，且血清CK、LDH酶水平未见明显变化，说明Bufogargarin A的毒 副作用较小。
[0057] 实施例4 Bufogargarin A急性毒性实验
[0058] 试验方法：取体重18_22g的昆明种小鼠（购自广东省动物中心），随机分组，每组 10只，腹腔注射不同剂量的Bufogargarin A，根据小鼠存活情况，计算半数致死剂量LD5(i。 半数致死量按如下公式计算：半数致死剂量（mg/kg)=(小鼠一半死亡时的剂量/对应小 鼠的体重）。
[0059] 试验结果：Bufogargarin A 的半数致死量为 22mg/kg (表 5)。Bufogargarin A 在 18mg/kg的给药剂量下，未观察到小鼠死亡。而华蟾蜍他灵在16mg/kg的给药剂量下，已观 察到小鼠死亡，说明Bufogargarin A的毒性低于华蟾蜍他灵。
[0060] 表5 Bufogargarin A对小鼠的急性毒性作用
[0061]
[0062] 实施例5片剂的制备
[0063] Bufogargarin A 5g，乳糖200g，淀粉衆适量，硬脂酸镁lg，混合，过筛，干燥后压 片。每片含Bufogargarin A 0.005g。每日口服1-2片，每日两次。
[0064] 实施例6注射液的制备
[0065] Bufogargarin A lg，丙二醇50g，研磨，再加少量注射用水稀释，混勾，然后加入氯 化钠适量，溶解后再加入注射用水至1000ml，调PH值5. 5-6. 5,滤过，灌封，灭菌，即得1000 支注射用针剂。
[0066] 实施例7脂质体纳米粒的制备
[0067] Bufogargarin A lg，大豆卵磷脂500mg，溶于25ml乙醇中，另取硬脂酸200mg和 大豆卵灵脂500mg溶于25ml环己烷中，混合搅拌均匀。于37°C恒温水浴中减压旋转蒸发 除去有机溶剂，使药物及辅料在烧瓶壁形成均匀脂质薄膜，于真空干燥器中放置过夜，除尽 有机溶剂；另取聚乙二醇单硬脂酸酯3750mg，搅拌溶解在175ml水中，加入上述薄膜中，超 声lOmin，定容至250ml，得淡黄色透明溶液。将此溶液冷冻干燥可得冻干粉。用球磨机研 磨24小时，制得粒径均勾的纳米粒，混勾并分装。每袋含Bufogargarin A 0.005g。口服， 一次一袋，每日两次。
[0068] 实施例8控释剂的制备
[0069] Bufogargarin A lg，乳糖40g和淀粉衆适量直接装到旋转制粒机/包衣器制备颗 粒，将稀释到15%固体的塑化乙基纤维素包衣剂悬浮液喷雾到Bufogargarin A颗粒的旋 转床上。在喷雾期间，用泊洛沙姆188制成的分散体载体膜包衣颗粒，形成平均颗粒度大约 为450 μ m的持续释放的颗粒。混勾装入胶囊，每个胶囊含Bufogargarin A 0. 005g，每日口 服1-2粒，每日两次。
[0070] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种新的具有抗肿瘤活性的19-脱甲基蟾毒内酯化合物，其特征在于具有如下所示 结构，命名为Bufogargarin A ;2. 权利要求1所述的19-脱甲基蟾毒内酯化合物在制备抗肿瘤药物制剂中的应用。3. 根据权利要求2所述的19-脱甲基蟾毒内酯化合物在制备抗肿瘤药物制剂中的应 用，其特征在于：所述药物制剂中含有药用辅料和治疗有效剂量的Bufogargarin A。4. 根据权利要求2所述的19-脱甲基蟾毒内酯化合物在制备抗肿瘤药物制剂中的应 用，其特征在于：所述药用辅料是指各种药用溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂或粘合 剂。5. 根据权利要求2所述的19-脱甲基蟾毒内酯化合物在制备抗肿瘤药物制剂中的应 用，其特征在于：所述的抗肿瘤药物制剂是片剂、注射液、脂质体纳米粒、控释剂。
【专利摘要】本发明涉及天然药物及化学药物领域，具体涉及一种新的19-脱甲基蟾毒内酯化合物在制备抗肿瘤药物制剂中的应用。所述的新的19-脱甲基蟾毒内酯化合物，具有式Ⅰ所示结构，命名为Bufogargarin A，为从蟾皮中提取分离得到。本发明的Bufogargarin A在体内外均具有显著抗肿瘤活性，且在治疗剂量下未观察到明显的毒副作用，预示它具有良好的药用前景，可以应用于制备抗肿瘤药物制剂。抗肿瘤药物制剂中含有Bufogargarin A，余量为药用辅料或其它可配伍的药物；所述药用辅料可以是各种药用溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂、粘合剂；所述的抗肿瘤药物制剂包括多种临床药物剂型。
【IPC分类】C07J71/00, A61K31/585, A61P35/00
【公开号】CN104892721
【申请号】CN201510270178
【发明人】叶文才, 王磊, 张冬梅, 李宝晶
【申请人】暨南大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月22日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及天然药物及化学药物领域，具体涉及一种新的19-脱甲基蟾毒内酯化 合物及其在治疗肿瘤药物制剂中的应用。
【背景技术】
[0002] 癌症是危害人类生命的第一大杀手，研宄开发抗癌药物一直是全世界医药界研宄 的热点。
[0003] 蟾皮为蟾蜍科动物中华大蟾蜍（Bufo bufo gargarizans Cantor)或黑框蟾蜍 (Bufo melanostictus Schneider)的干燥皮，主要产于我国的浙江、江苏、山东、河北等 地。该品性凉、味苦，具有清热解毒、利水消肿的功效，主治痈疽、肿毒、瘰疬等，临床常用 于治疗恶性肿瘤和慢性气管炎等（中药大辞典，1977:2713-2714)。近年来的研宄结果显 示，蟾皮不仅具有镇痛、抗炎的功效，还具有抗肿瘤、提高免疫等多种生物活性（时珍国医 国药，2009:1213-1214)。由于蟾皮及其制剂华蟾素注射液在临床治疗癌症方面的确切疗 效（实用肿瘤杂志，2007, 1:32-35)，从而引起了人们对蟾皮化学成分的广泛关注。研宄表 明，蟾皮富含一类乙型强心留类化合物，又称蟾毒内酯类化合物。该类化合物的母核通常 由24个碳原子组成，且在C-17位具有α -吡喃酮基。其中蟾毒灵（bufalin)、华蟾蜍他灵 (Cinobufotalin)等是蟾皮的主要成分，并具有抗肿瘤作用。然而，蟾皮的化学成分复杂，目 前仅报道了约40余种蟾毒内醋类成分（Chemistry&biodiversity, 2011:559-567)，其抗肿 瘤活性成分有待深入发掘。
【发明内容】
[0004] 本发明的首要目的在于提供一种新的具有抗肿瘤活性的19-脱甲基蟾毒内酯化 合物。
[0005] 本发明的另一目的在于提供上述19-脱甲基蟾毒内酯化合物在抗肿瘤药物制剂 中的应用。
[0006] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0007] -种新的19-脱甲基蟾毒内酯化合物，命名为Bufogargarin A(式I)，结构如下：
[0008]
O
[0009] Bufogargarin A从蟾皮中提取分离得到：将蟾皮粗粉用水或有机溶剂提取，再通 过硅胶柱层析、ODS柱层析、Sephadex LH-20及制备型HPLC纯化，得到Bufogargarin A。
[0010] Bufogargarin A在制备抗肿瘤药物制剂中的应用，所述药物制剂中含有治疗有效 量的Bufogargarin A，余量为药用辅料或其它可配伍的药物；
[0011] 所述药用辅料是指常规的药用赋形剂，如溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂和 粘合剂等；
[0012] 所述其它可配伍的药物，指的是以有效剂量的Bufogargarin A为药物原料，再配 伍其它天然药物或化学药品；
[0013] 所述的抗肿瘤药物制剂包括多种临床药物剂型，如片剂、注射液、脂质体纳米粒、 控释剂等；
[0014] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0015] (1)本发明发掘了蟾皮中的一种新19-脱甲基蟾毒内酯化合物，命名为 Bufogargarin A，该化合物是由23个碳原子组成骨架且10位连有氢原子的新型19-脱甲 基蟾毒内酯类化合物。
[0016] (2)本发明发现Bufogargarin A在较低浓度（0· 416~3. 481 μ M)下即可抑制多 种肿瘤细胞的增殖。
[0017] (3)本发明发现19-脱甲基蟾毒内酯Bufogargarin A的抗肿瘤活性明显优于对应 的含19位甲基的蟾毒内酯化合物，例如Bufogargarin A对多种肿瘤细胞的增殖抑制活性 强于华蟾餘他灵（cinobufotalin)5~10倍。
[0018] (4)本发明的Bufogargarin A在体内的毒性低于华蟾蜍他灵，在治疗剂量下未观 察到明显的毒副作用。
【附图说明】
[0019] 图1是19-脱甲基蟾毒内醋化合物Bufogargarin A的1H NMR谱图。
[0020] 图2是19-脱甲基蟾毒内酯化合物Bufogargarin A的13C NMR谱图。
[0021] 图3是19-脱甲基蟾毒内醋化合物Bufogargarin A的HSQC谱图。
[0022] 图4是19-脱甲基蟾毒内醋化合物Bufogargarin A的HMBC谱图。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0024] 实施例1化合物的提取分离和结构鉴定
[0025] (1)取干燥蟾皮11kg，用粉碎机粉碎成10~50目的蟾皮粗粉，用3倍质量的蒸馏 水于100°C条件下加热回流提取4次，每次Ih ;合并提取液并减压浓缩至密度为1. 15,加入 乙醇混匀使含醇量为80 % (v/v)，静置24h，吸取上清液，减压浓缩得水提取物；然后将水提 取后的蟾皮粗粉残渣用3倍质量95% (v/v)的乙醇80°C条件下加热回流提取提取4次，每 次Ih ;合并提取液并减压浓缩得到乙醇提取物；将水总提取物和乙醇总提取物合并，与6L 水混悬后，用6L氯仿萃取，重复4次，合并萃取液，减压浓缩得氯仿部位（150g)以及水部位 (400g) 〇
[0026] (2)对步骤（1)制备得到的氯仿部位进行硅胶柱层析，以环己烷-丙酮为洗脱剂， 按照环己烷和丙酮体积比为 100:0、98:2、95:5、90:10、85:15、80:20、70:30、1:1 和 0:100 的 洗脱梯度进行洗脱，经TLC分析并相似流份，得到8个主流份Fr. A~Fr. H ;
[0027] (3) Bufogargarin A 的分离纯化
[0028] ①对步骤（2)中得到的组分Fr. E(Ilg)(由环己烷：丙酮=85:15洗脱得到）进行 反相ODS柱层析，以甲醇-水（MeOH-H2O)为洗脱剂，按照甲醇和水体积比为10:90、20:80、 30:70、40:60、50:50、60:40、70:30和80:20的洗脱梯度进行洗脱，收集甲醇-水体积比为 50:50的洗脱流份；
[0029] ②将步骤（3)①得到的洗脱流份浓缩后上样于S印hadex LH-20色谱柱，以甲醇为 流动相，流速为0. 5mL/min进行洗脱，收集保留体积为100~300mL的洗脱液；
[0030] ③将步骤（3)②得到的洗脱液浓缩后用甲醇溶解，然后用反相制备型HPLC分离 纯化，以体积比为40:60的甲醇-水为洗脱剂，流速为3mL/min进行洗脱，收集保留时间 30. 8min 的色谱峰，得到 Bufogargarin A (29mg);
[0031] (4)产物 Bufogargarin A 的结构表征
[0032] 白色粉末；香草醛-浓硫酸反应（TLC)显紫色；[β]晋+13.71 (c 1.0, MeOH); UV(MeOH) Amax(l〇g ε )204(3. 83), 295(3. 70)nm ；IR(KBr) v max3428, 2938, 2877, 2368 ,1725, 1636, 1539, 1454, 1429, 1375, 1246, 1133, 1094, 834, 604cm_1；HR-ESI-MS m/z 445. 2222 [M+H]+ (计算值 C25H33O7, 445. 2221)。氢谱（1H NMR)和碳谱（13C NMR)数据见表 1。 1H NMR，13C NMR，HSQC和HMBC核磁共振图谱见图1-4。根据以上理化数据和NMR图谱，鉴定 Bufogargarin A的结构如式I所示。
[0033] 表1. Bufogargarin A 的1H (500MHz)和 13C (125MHz) NMR 数据
[0034]
[0035] 注：（CD3OD，δ 单位为 ppm，J 单位为 Hz)
[0036] 实施例2 Bufogargarin A对肿瘤细胞增殖的抑制作用
[0037] 将处于对数生长期的细胞（人肝癌细胞H印G2、人非小细胞肺癌细胞A549和人宫 颈癌细胞Hela、人结肠癌细胞Loto、人乳腺癌细胞MCF-7、人食道癌细胞Eca-109)(细胞株 均购自美国模式培养物集存库American Type Culture Collection, ATCC)用胰酶消化、离 心、重悬后进行细胞计数，以IX IO6AiL接种于96孔培养板中，每孔100 μ L，待细胞贴壁后 ， 将待测药物稀释成一定的浓度梯度，每个浓度设置4个平行复孔，同时设置空白对照组和 阳性对照组（Doxorubicin)，置于恒温培养箱（37°C，5% CO2中培养72h。吸掉培养基，每孔 加入30 μ L的MTT溶液（5mg/mL)，继续培养4h，除去上清液，每孔添加100 μ L的DMS0,充分 振荡至颗粒溶解，用酶标仪在570nm波长处检测每个孔的吸光度OD值。按下列公式计算细 胞生长抑制率，重复实验至少3次以上。细胞生长抑制率计算公式：抑制率（％) = (1-加 药组OD值）/对照组OD值X 100%。以样品浓度为横轴，以细胞生长抑制率为纵轴绘制曲 线。根据细胞生长抑制曲线，计算出半数有效抑制浓度IC5tl值。
[0038] 试验结果显示Bufogargarin A对人肝癌细胞HepG2、人非小细胞肺癌细胞A549、 人宫颈癌细胞Hela、人结肠癌细胞Lovo、人乳腺癌细胞MCF-7和人食道癌细胞Eca-109的 增殖均具有显著的抑制作用。Bufogargarin A的抗肿瘤活性明显优于对应的含19位甲基 的蟾毒内酯化合物，例如Bufogargarin A对多种肿瘤细胞的增殖抑制活性强于华蟾蜍他灵 (Cinobufotalin) 5 ~10 倍（表 2)。
[0039] 表2. Bufogargarin A对多种肿瘤细胞的生长抑制作用
[0040]
[0041] 实施例3 Bufogargarin A体内抗肿瘤作用
[0042] 试验方法：取体重18_22g的昆明种小鼠（购自广东省动物中心），随机分组，每组 10只。分别在其右前肢腋下接种瘤细胞（S180腹水瘤细胞）2 X IO7个，24小时后腹腔注射 给药，每天给药一次，连续给药10天后处死动物，取瘤称重。
[0043] 抑瘤率按如下公式计算：
[0044] 抑瘤率（％ ) = [1_(给药组平均瘤重）/对照组平均瘤重]X 100%
[0045] 统计分析采用t检验处理，P < 0. 05认为有显著性差异。结果见表3。
[0046] 表3. Bufogargarin A对小鼠 S180实体瘤生长的抑制作用（η = 10)
[0047]
[0048] 与模型组相比，*Ρ < 0. 05有显著性差异
[0049] 取体重18_22g的裸鼠（购自广东省动物中心），随机分组，每组10只。分别在其 右前肢腋下接种人肝癌细胞HepG21 X IO7个，24小时后腹腔注射给药，Bufogargarin A每 天给药一次，5-氟尿嘧啶（5-Fu，购于北京百灵威科技有限公司）隔天给药，连续注射21天 后停药并处死动物，取瘤称重。
[0050] 抑瘤率按如下公式计算：
[0051] 抑瘤率（％ ) = [1_(给药组平均瘤重）/对照组平均瘤重]X 100%
[0052] 统计分析采用t检验，P < 0. 05即有显著性差异。结果见表4。
[0053] 表4. Bufogargarin A对人肝癌细胞HepG2裸鼠移植瘤生长的抑制作用（η = 10)
[0054]
[0055] 与模型组相比，*P < 0. 05有显著性差异
[0056] 试验结果表明，Bufogargarin A对小鼠腹水瘤S180和人肝癌细胞HepG2裸鼠移 植瘤生长有明显的抑制作用。不同浓度给药组和对照组小鼠体重无明显差异，未见小鼠外 观、活动状态等方面异常，且血清CK、LDH酶水平未见明显变化，说明Bufogargarin A的毒 副作用较小。
[0057] 实施例4 Bufogargarin A急性毒性实验
[0058] 试验方法：取体重18_22g的昆明种小鼠（购自广东省动物中心），随机分组，每组 10只，腹腔注射不同剂量的Bufogargarin A，根据小鼠存活情况，计算半数致死剂量LD5(i。 半数致死量按如下公式计算：半数致死剂量（mg/kg)=(小鼠一半死亡时的剂量/对应小 鼠的体重）。
[0059] 试验结果：Bufogargarin A 的半数致死量为 22mg/kg (表 5)。Bufogargarin A 在 18mg/kg的给药剂量下，未观察到小鼠死亡。而华蟾蜍他灵在16mg/kg的给药剂量下，已观 察到小鼠死亡，说明Bufogargarin A的毒性低于华蟾蜍他灵。
[0060] 表5 Bufogargarin A对小鼠的急性毒性作用
[0061]
[0062] 实施例5片剂的制备
[0063] Bufogargarin A 5g，乳糖200g，淀粉衆适量，硬脂酸镁lg，混合，过筛，干燥后压 片。每片含Bufogargarin A 0.005g。每日口服1-2片，每日两次。
[0064] 实施例6注射液的制备
[0065] Bufogargarin A lg，丙二醇50g，研磨，再加少量注射用水稀释，混勾，然后加入氯 化钠适量，溶解后再加入注射用水至1000ml，调PH值5. 5-6. 5,滤过，灌封，灭菌，即得1000 支注射用针剂。
[0066] 实施例7脂质体纳米粒的制备
[0067] Bufogargarin A lg，大豆卵磷脂500mg，溶于25ml乙醇中，另取硬脂酸200mg和 大豆卵灵脂500mg溶于25ml环己烷中，混合搅拌均匀。于37°C恒温水浴中减压旋转蒸发 除去有机溶剂，使药物及辅料在烧瓶壁形成均匀脂质薄膜，于真空干燥器中放置过夜，除尽 有机溶剂；另取聚乙二醇单硬脂酸酯3750mg，搅拌溶解在175ml水中，加入上述薄膜中，超 声lOmin，定容至250ml，得淡黄色透明溶液。将此溶液冷冻干燥可得冻干粉。用球磨机研 磨24小时，制得粒径均勾的纳米粒，混勾并分装。每袋含Bufogargarin A 0.005g。口服， 一次一袋，每日两次。
[0068] 实施例8控释剂的制备
[0069] Bufogargarin A lg，乳糖40g和淀粉衆适量直接装到旋转制粒机/包衣器制备颗 粒，将稀释到15%固体的塑化乙基纤维素包衣剂悬浮液喷雾到Bufogargarin A颗粒的旋 转床上。在喷雾期间，用泊洛沙姆188制成的分散体载体膜包衣颗粒，形成平均颗粒度大约 为450 μ m的持续释放的颗粒。混勾装入胶囊，每个胶囊含Bufogargarin A 0. 005g，每日口 服1-2粒，每日两次。
[0070] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种新的具有抗肿瘤活性的19-脱甲基蟾毒内酯化合物，其特征在于具有如下所示 结构，命名为Bufogargarin A ;2. 权利要求1所述的19-脱甲基蟾毒内酯化合物在制备抗肿瘤药物制剂中的应用。3. 根据权利要求2所述的19-脱甲基蟾毒内酯化合物在制备抗肿瘤药物制剂中的应 用，其特征在于：所述药物制剂中含有药用辅料和治疗有效剂量的Bufogargarin A。4. 根据权利要求2所述的19-脱甲基蟾毒内酯化合物在制备抗肿瘤药物制剂中的应 用，其特征在于：所述药用辅料是指各种药用溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂或粘合 剂。5. 根据权利要求2所述的19-脱甲基蟾毒内酯化合物在制备抗肿瘤药物制剂中的应 用，其特征在于：所述的抗肿瘤药物制剂是片剂、注射液、脂质体纳米粒、控释剂。
【专利摘要】本发明涉及天然药物及化学药物领域，具体涉及一种新的19-脱甲基蟾毒内酯化合物在制备抗肿瘤药物制剂中的应用。所述的新的19-脱甲基蟾毒内酯化合物，具有式Ⅰ所示结构，命名为Bufogargarin A，为从蟾皮中提取分离得到。本发明的Bufogargarin A在体内外均具有显著抗肿瘤活性，且在治疗剂量下未观察到明显的毒副作用，预示它具有良好的药用前景，可以应用于制备抗肿瘤药物制剂。抗肿瘤药物制剂中含有Bufogargarin A，余量为药用辅料或其它可配伍的药物；所述药用辅料可以是各种药用溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂、粘合剂；所述的抗肿瘤药物制剂包括多种临床药物剂型。
【IPC分类】C07J71/00, A61K31/585, A61P35/00
【公开号】CN104892721
【申请号】CN201510270178
【发明人】叶文才, 王磊, 张冬梅, 李宝晶
【申请人】暨南大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月22日
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