带鱼肝脏抗菌肽的制备方法
带鱼肝脏抗菌肽的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种鱼类内脏活性多肽的制备方法，尤其涉及带鱼肝脏抗菌肽的制备 方法。
[0002]
【背景技术】
[0003] 抗菌肽（Antibacterial peptide，ABP)又叫抗微生物肽、多肽抗生素，是指氨基酸 数目小于1〇〇,具广谱抗性的一类小肽。由于抗菌肽对细菌、真菌、寄生虫等有着广泛的抑制 作用，并且随着越来越多的抗生素耐药微生物的出现，使得抗菌肽在医药行业和食品添加 剂等领域有这更为良好的应用前景。抗菌肽在广义上是指存在于生物体内具有抵抗外界微 生物侵害、消除体内突变细胞的一类小分子阳离子多肽。抗菌肽由生物细胞特定基因编码， 经特定外界条件诱导产生。目前为止，世界上已知的抗菌肽共有1200多种，而以天然阳离 子抗菌肽作模板进行人工合成的模拟肽有数千种。
[0004] 基于此，申请人以带鱼肝脏为原料，利用现代生物技术制备抗菌肽，既增加了带鱼 资源的利用率，减少了肝脏等下脚料对环境的危害，同时也为海洋抗菌药物的开发提供候 选药物。
[0005]
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种工艺科学合理、易于操作、提取的多肽具 有良好抗菌效果的带鱼肝脏抗菌肽的制备方法。
[0007] 本发明为解决上述技术问题所采取的技术方案为：一种带鱼肝脏抗菌肽的制备方 法，其特征在于包括以下步骤： 1) 带鱼肝脏酶解物的制备：带鱼肝脏从冰冻带鱼中取出、解冻，用高速组织捣碎机匀 浆，然后按照固液比I g :8~IOmL加入磷酸盐缓冲液（0. 02 mol/L，pH 6. 5~7. 5)混匀， 加热至20~30°C，在功率为900W，频率为30~50kHz超声波发生器内超声提取90~120 min，按照肝脏质量的0. 3~0. 5%加入中性蛋白酶(酶活力彡2. OXlO4 U/g)，于温度55~ 65°C下酶解6~8 h，10 000 r/min离心25~30 min，取上清液采用3 kDa超滤膜进行超 滤处理，收集分子量小于3 kDa部分，冷冻干燥，得超滤酶解物； 2) 带鱼肝脏抗菌肽的制备：将制备的带鱼肝脏超滤酶解物依次经大孔树脂除杂、凝胶 过滤层析、细胞膜色谱纯化和反相高效液相色谱（RP-HPLC)制备，得到带鱼肝脏抗菌肽。
[0008] 作为优选，所述步骤1)中的带鱼为带鱼（Aawffie/a)。
[0009] 作为优选，所述步骤2)中的大孔树脂除杂、凝胶过滤层析、细胞膜色谱纯化和反相 高效液相色谱（RP-HPLC)制备的具体过程为： 大孔树脂除杂：将得到的超滤酶解物用双蒸水制成浓度为10~15 mg/mL溶液，以2~ 3 mL/min的流速加入到D201大孔树脂层析柱，用2~3倍柱体积的双蒸水洗脱除去杂质， 然后用3~5倍柱体积75%乙醇进行洗脱，洗脱液于50 °C以下低压旋蒸除去乙醇后，冷冻 干燥得大孔树脂制备酶解物。
[0010] 凝胶过滤层析：将上述大孔树脂制备酶解物溶于三蒸水配成浓度为1〇~15 mg/ mL的溶液，经过葡聚糖凝胶G-25柱层析分离，用三蒸水进行洗脱，根据225 nm下的吸光 度曲线收集洗脱组分，其中，对大肠杆菌（ikcAericAia co/i)和巨大芽孢杆菌（ ?egaieriw?)抑制率最高组分为凝胶过滤层析酶解物。
[0011] 细胞膜色谱纯化：将上述凝胶过滤层析酶解物用三蒸水配成80~100 μ g/mL的 溶液，加入到细胞膜色谱柱进行纯化，根据225 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对 大肠杆菌co7i)和巨大芽抱杆菌抑制率最高组分为 细胞膜色谱纯化酶解物。
[0012] RP-HPLC制备：将上述细胞膜色谱纯化酶解物用双蒸水配成80~ 100 yg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化，根据对大肠杆菌 coJ7)和巨大芽孢杆菌?egaieriw?)的抑制率得1个高活性抗菌肽 Lys-Val-Phe-Trp-Gly-Leu-Hi s-Pro (KVFffGLHP)〇
[0013] 优选，所述细胞膜色谱条件为：细胞膜为巨大芽孢杆菌（SaciBw1S ?egaieriw?)的 细胞膜；进样量为15~20 μ L ;细胞膜色谱柱（150 _ X 4. 6_，5 μ m);柱温为37 °C; 流动相为三蒸水；紫外检测波长225 nm ;流速为0. 3~0. 5 mL/min。
[0014] 优选，所述RP-HPLC条件为：进样量为15~20 μ L ;色谱柱为Zorbax C18 (250 _ X 4. 6_，5 μ m);流动相为20%乙腈(含0. 1%三氟乙酸）；洗脱速度为0. 8~I. 0 mL/ min ;紫外检测波长为225 nm〇
[0015] 与现有技术相比，本发明的优点在于： (1)本发明以带鱼肝脏为原料，提高了带鱼资源的利用率，减少了环境污染。
[0016] (2)本发明制备的抗菌肽 Lys-Val-Phe-Trp-Gly-Leu-His-Pro (KVFWGLHP) 对革兰氏阴性菌（G)(大肠杆菌（co/i)、焚光假单抱菌（ /7Wore1Scefl1S )、绿胺杆菌（aerwgiflosa))和革兰氏阳性菌（G+)(金黄色葡 萄球（成r/ococciAs aareiAs)、巨大芽抱杆菌（膨辟ieria?)、藤黄八叠球菌 均有较强的抑制作用，且安全性高，可应用于医药、化妆品和食品等行 业。
[0017]
【附图说明】
[0018] 图1是本发明步骤流程示意图； 图2是本发明大孔树脂制备酶解物的葡聚糖凝胶G-25层析图； 图3是本发明的葡聚糖凝胶G-25制备酶解物（Fr. C)的细胞膜色谱图。
[0019] 图4是本发明的细胞膜色谱制备酶解物（Fr. C-I)的反相高效液相色谱（RP-HPLC) 图。
[0020]
【具体实施方式】
[0021] 以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
[0022] -种带鱼肝脏抗菌肽的制备方法，制备工艺流程如下：带鱼肝脏一蛋白抽提、酶解 -超滤一大孔树脂除杂一凝胶过滤层析一细胞膜色谱纯化一高效液相色谱制备一抗菌肽。
[0023] 实施例： 1) 带鱼肝脏酶解物的制备：带鱼（Aawffie/a)肝脏从冰冻带鱼中取出、解冻， 用高速组织捣碎机匀浆，然后按照固液比I g: IOmL加入磷酸盐缓冲液（0.02 mol/L，pH 7. 0)混匀，加热至25°C，在功率为900W，频率为40kHz超声波发生器内超声提取120 min， 按照肝脏质量的0. 5%加入中性蛋白酶(酶活力彡2. OX IO4 U/g)，于温度60°C下酶解8 h，10 000 r/min离心30 min，取上清液采用3 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3 kDa 部分，冷冻干燥，得超滤酶解物； 2) 带鱼肝脏抗菌肽的制备：将制备的带鱼肝脏超滤酶解物依次经大孔树脂除杂、凝胶 过滤层析、细胞膜色谱纯化和反相高效液相色谱（RP-HPLC)制备，得到带鱼肝脏抗菌肽。
[002 4] ①大孔树脂除杂：将得到的超滤酶解物用双蒸水制成浓度为15 mg/mL溶液，以3 mL/min的流速加入到D201大孔树脂层析柱，用2倍柱体积的双蒸水洗脱除去杂质，然后用 5倍柱体积75%乙醇进行洗脱，洗脱液于50 °C以下低压旋蒸除去乙醇后，冷冻干燥得大孔 树脂制备酶解物。
[0025] ②凝胶过滤层析：将上述大孔树脂制备酶解物溶于三蒸水配成浓度为15 mg/ mL的溶液，经过葡聚糖凝胶G-25柱层析分离，用三蒸水进行洗脱，根据225 nm下的吸光 度曲线收集洗脱组分，其中，对大肠杆菌（ikcAericAia co/i)和巨大芽孢杆菌（ ?egaieriw?)抑制率最高组分为凝胶过滤层析酶解物Fr. C (图2)。
[0026] ③细胞膜色谱纯化：将上述凝胶过滤层析酶解物用三蒸水配成100 μ g/mL的溶 液，加入到细胞膜色谱柱进行纯化(条件：细胞膜为巨大芽孢杆菌?egaieriw?) 的细胞膜；进样量为15以1^细胞膜色谱柱（15〇111111\4.6111111，5^111);柱温为37°0;流动 相为三蒸水；紫外检测波长225 nm;流速为0.3 mL/min)，根据225 nm下的吸光度曲线收集 洗脱组分，其中，对大肠杆菌（AscAericAia co/i)和巨大芽抱杆菌 抑制率最高组分为细胞膜色谱纯化酶解物Fr. C-I (图3)。
[0027] ④RP-HPLC制备：将上述细胞膜色谱纯化酶解物用双蒸水配成100 μ g/mL的 溶液，利用RP-HPLC进行纯化(条件：进样量为20 μ L ;色谱柱为Zorbax C18 (250 mm X 4. 6mm，5 μ m);流动相为20%乙腈(含0. 1%三氟乙酸）；洗脱速度为0. 8 mL/min ;紫外 检测波长为225 nm)，根据对大肠杆菌co/i)和巨大芽孢杆菌（ifeciBws ?egaieriw?)抑制率得1个高活性抗菌肽（图4)。
[0028] ⑤结构测定：高活性抗菌肽经检测为单一峰，利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨 基酸序列为Lys-Val-Phe-Trp-Gly-Leu-His-Pro (KVFWGLHP)，ESI-MS检测分子量为983. 15 Da0
[0029] ⑥抑菌活性测定：如表1所示：抗菌肽Lys-Val-Phe-Trp-Gly-Leu-His-Pro (KVFWGLHP)对革兰氏阴性菌（G_)(大肠杆菌m7i)、荧光假单孢菌 (/?^饥绿胺杆菌饥和革兰氏阳性菌（G +) (金黄色葡萄球（巨大芽抱杆菌（你藤黄八 叠球菌（均有较强的抑制作用，具有广谱抑菌性，其中对0-菌抑菌效果总 体强于G+菌。
[0030] 表 1 抗菌肽 Lys-Val-Phe-Trp-Gly-Leu-His-Pro (KVFWGLHP)的抑菌谱（η = 3)
注：灭菌打孔器(直径=4mm)打孔，每孔加入抗菌液20 μ L ;表中数据为抑菌圈直径平 均值土标准差（η=3)。
[0031] 最后，尚需注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不 限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接 导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【主权项】
1. 带鱼肝脏抗菌肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 带鱼肝脏酶解物的制备：带鱼肝脏从冰冻带鱼中取出、解冻，用高速组织捣碎机匀 浆，然后按照固液比Ig:8~IOmL加入0. 02mol/L，pH6. 5~7. 5的磷酸盐缓冲液混匀， 并加热至20~30°C;在功率为900W，频率为30~50kHz超声波发生器内超声提取90~ 120min，按照肝脏质量的0. 3~0. 5%加入中性蛋白酶，于温度55~65°C下酶解6~8h， 10 000r/min离心25~30min，取上清液采用3kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小 于3kDa部分，冷冻干燥，得超滤酶解物； 2) 带鱼肝脏抗菌肽的制备：将制备的带鱼肝脏超滤酶解物依次经大孔树脂除杂、凝胶 过滤层析、细胞膜色谱纯化和反相高效液相色谱（RP-HPLC)制备，得到带鱼肝脏抗菌肽。2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤2)的大孔树脂除杂、凝胶过 滤层析、细胞膜色谱纯化和反相高效液相色谱（RP-HPLC)制备的具体过程为： 大孔树脂除杂：将得到的超滤酶解物用双蒸水制成浓度为10~15 mg/mL溶液，以2~ 3 mL/min的流速加入到D201大孔树脂层析柱，用2~3倍柱体积的双蒸水洗脱除去杂质， 然后用3~5倍柱体积75%乙醇进行洗脱，洗脱液于50 °C以下低压旋蒸除去乙醇后，冷冻 干燥得大孔树脂制备酶解物。3. 将上述大孔树脂制备酶解物溶于三蒸水配成浓度为10~15mg/mL的溶液，经过葡 聚糖凝胶G-25柱层析分离，用三蒸水进行洗脱，根据225nm下的吸光度曲线收集洗脱组 分，其中，对大肠杆菌（hcAericAiaco/i)和巨大芽抱杆菌抑制率 最高组分为凝胶过滤层析酶解物。4. 将上述凝胶过滤层析酶解物用三蒸水配成80~100yg/mL的溶液，加入到细胞膜 色谱柱进行纯化，根据225nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对大肠杆菌和巨大芽孢 杆菌抑制率最高组分为细胞膜色谱纯化酶解物。5. 将上述细胞膜色谱纯化酶解物用双蒸水配成80~100yg/mL的溶液，利用RP-HPLC 进行纯化得到高活性抗菌肽Lys-Val-Phe-Trp-Gly-Leu-His-Pro。6. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述细胞膜色谱条件为：细胞膜为巨 大芽孢杆菌（你ffiegateriys?)的细胞膜；进样量15~20yL;细胞膜色谱柱规格为 150mmX4.6mm，5ym;柱温为37 °C;流动相为三蒸水；紫外检测波长225nm;流速为 0? 3 ~0? 5ml,/min〇7. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述RP-HPLC条件为：进样量15~20 UL;色谱柱是规格为250mmX4. 6mm，5ym的ZorbaxC18 ;流动相为含0? 1%三氟乙酸 的20%乙腈；洗脱速度为0. 8~I. 0mL/min;紫外检测波长为225nm。
【专利摘要】本发明公开了一种带鱼肝脏抗菌肽的制备方法，该制备时以带鱼肝脏作为原料，经肝脏粗蛋白抽提、酶解、超滤和色谱制备，得抗菌肽。抗菌肽的氨基酸序列为Lys-Val-Phe-Trp-Gly-Leu-His-Pro，ESI-MS检测分子量为983.15Da。本发明制备的抗菌肽Lys-Val-Phe-Trp-Gly-Leu-His-Pro对革兰氏阴性菌、荧光假单孢菌、绿脓杆菌和革兰氏阳性菌、巨大芽孢杆菌、藤黄八叠球菌均有较强的抑制作用。
【IPC分类】C07K1/20, C07K1/34, C07K1/22
【公开号】CN104892723
【申请号】CN201510238562
【发明人】郁迪, 王斌, 迟长凤, 陈荫, 赵玉勤, 孙坤来
【申请人】浙江海洋学院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月12日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种鱼类内脏活性多肽的制备方法，尤其涉及带鱼肝脏抗菌肽的制备 方法。
[0002]
【背景技术】
[0003] 抗菌肽（Antibacterial peptide，ABP)又叫抗微生物肽、多肽抗生素，是指氨基酸 数目小于1〇〇,具广谱抗性的一类小肽。由于抗菌肽对细菌、真菌、寄生虫等有着广泛的抑制 作用，并且随着越来越多的抗生素耐药微生物的出现，使得抗菌肽在医药行业和食品添加 剂等领域有这更为良好的应用前景。抗菌肽在广义上是指存在于生物体内具有抵抗外界微 生物侵害、消除体内突变细胞的一类小分子阳离子多肽。抗菌肽由生物细胞特定基因编码， 经特定外界条件诱导产生。目前为止，世界上已知的抗菌肽共有1200多种，而以天然阳离 子抗菌肽作模板进行人工合成的模拟肽有数千种。
[0004] 基于此，申请人以带鱼肝脏为原料，利用现代生物技术制备抗菌肽，既增加了带鱼 资源的利用率，减少了肝脏等下脚料对环境的危害，同时也为海洋抗菌药物的开发提供候 选药物。
[0005]
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种工艺科学合理、易于操作、提取的多肽具 有良好抗菌效果的带鱼肝脏抗菌肽的制备方法。
[0007] 本发明为解决上述技术问题所采取的技术方案为：一种带鱼肝脏抗菌肽的制备方 法，其特征在于包括以下步骤： 1) 带鱼肝脏酶解物的制备：带鱼肝脏从冰冻带鱼中取出、解冻，用高速组织捣碎机匀 浆，然后按照固液比I g :8~IOmL加入磷酸盐缓冲液（0. 02 mol/L，pH 6. 5~7. 5)混匀， 加热至20~30°C，在功率为900W，频率为30~50kHz超声波发生器内超声提取90~120 min，按照肝脏质量的0. 3~0. 5%加入中性蛋白酶(酶活力彡2. OXlO4 U/g)，于温度55~ 65°C下酶解6~8 h，10 000 r/min离心25~30 min，取上清液采用3 kDa超滤膜进行超 滤处理，收集分子量小于3 kDa部分，冷冻干燥，得超滤酶解物； 2) 带鱼肝脏抗菌肽的制备：将制备的带鱼肝脏超滤酶解物依次经大孔树脂除杂、凝胶 过滤层析、细胞膜色谱纯化和反相高效液相色谱（RP-HPLC)制备，得到带鱼肝脏抗菌肽。
[0008] 作为优选，所述步骤1)中的带鱼为带鱼（Aawffie/a)。
[0009] 作为优选，所述步骤2)中的大孔树脂除杂、凝胶过滤层析、细胞膜色谱纯化和反相 高效液相色谱（RP-HPLC)制备的具体过程为： 大孔树脂除杂：将得到的超滤酶解物用双蒸水制成浓度为10~15 mg/mL溶液，以2~ 3 mL/min的流速加入到D201大孔树脂层析柱，用2~3倍柱体积的双蒸水洗脱除去杂质， 然后用3~5倍柱体积75%乙醇进行洗脱，洗脱液于50 °C以下低压旋蒸除去乙醇后，冷冻 干燥得大孔树脂制备酶解物。
[0010] 凝胶过滤层析：将上述大孔树脂制备酶解物溶于三蒸水配成浓度为1〇~15 mg/ mL的溶液，经过葡聚糖凝胶G-25柱层析分离，用三蒸水进行洗脱，根据225 nm下的吸光 度曲线收集洗脱组分，其中，对大肠杆菌（ikcAericAia co/i)和巨大芽孢杆菌（ ?egaieriw?)抑制率最高组分为凝胶过滤层析酶解物。
[0011] 细胞膜色谱纯化：将上述凝胶过滤层析酶解物用三蒸水配成80~100 μ g/mL的 溶液，加入到细胞膜色谱柱进行纯化，根据225 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对 大肠杆菌co7i)和巨大芽抱杆菌抑制率最高组分为 细胞膜色谱纯化酶解物。
[0012] RP-HPLC制备：将上述细胞膜色谱纯化酶解物用双蒸水配成80~ 100 yg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化，根据对大肠杆菌 coJ7)和巨大芽孢杆菌?egaieriw?)的抑制率得1个高活性抗菌肽 Lys-Val-Phe-Trp-Gly-Leu-Hi s-Pro (KVFffGLHP)〇
[0013] 优选，所述细胞膜色谱条件为：细胞膜为巨大芽孢杆菌（SaciBw1S ?egaieriw?)的 细胞膜；进样量为15~20 μ L ;细胞膜色谱柱（150 _ X 4. 6_，5 μ m);柱温为37 °C; 流动相为三蒸水；紫外检测波长225 nm ;流速为0. 3~0. 5 mL/min。
[0014] 优选，所述RP-HPLC条件为：进样量为15~20 μ L ;色谱柱为Zorbax C18 (250 _ X 4. 6_，5 μ m);流动相为20%乙腈(含0. 1%三氟乙酸）；洗脱速度为0. 8~I. 0 mL/ min ;紫外检测波长为225 nm〇
[0015] 与现有技术相比，本发明的优点在于： (1)本发明以带鱼肝脏为原料，提高了带鱼资源的利用率，减少了环境污染。
[0016] (2)本发明制备的抗菌肽 Lys-Val-Phe-Trp-Gly-Leu-His-Pro (KVFWGLHP) 对革兰氏阴性菌（G)(大肠杆菌（co/i)、焚光假单抱菌（ /7Wore1Scefl1S )、绿胺杆菌（aerwgiflosa))和革兰氏阳性菌（G+)(金黄色葡 萄球（成r/ococciAs aareiAs)、巨大芽抱杆菌（膨辟ieria?)、藤黄八叠球菌 均有较强的抑制作用，且安全性高，可应用于医药、化妆品和食品等行 业。
[0017]
【附图说明】
[0018] 图1是本发明步骤流程示意图； 图2是本发明大孔树脂制备酶解物的葡聚糖凝胶G-25层析图； 图3是本发明的葡聚糖凝胶G-25制备酶解物（Fr. C)的细胞膜色谱图。
[0019] 图4是本发明的细胞膜色谱制备酶解物（Fr. C-I)的反相高效液相色谱（RP-HPLC) 图。
[0020]
【具体实施方式】
[0021] 以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
[0022] -种带鱼肝脏抗菌肽的制备方法，制备工艺流程如下：带鱼肝脏一蛋白抽提、酶解 -超滤一大孔树脂除杂一凝胶过滤层析一细胞膜色谱纯化一高效液相色谱制备一抗菌肽。
[0023] 实施例： 1) 带鱼肝脏酶解物的制备：带鱼（Aawffie/a)肝脏从冰冻带鱼中取出、解冻， 用高速组织捣碎机匀浆，然后按照固液比I g: IOmL加入磷酸盐缓冲液（0.02 mol/L，pH 7. 0)混匀，加热至25°C，在功率为900W，频率为40kHz超声波发生器内超声提取120 min， 按照肝脏质量的0. 5%加入中性蛋白酶(酶活力彡2. OX IO4 U/g)，于温度60°C下酶解8 h，10 000 r/min离心30 min，取上清液采用3 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3 kDa 部分，冷冻干燥，得超滤酶解物； 2) 带鱼肝脏抗菌肽的制备：将制备的带鱼肝脏超滤酶解物依次经大孔树脂除杂、凝胶 过滤层析、细胞膜色谱纯化和反相高效液相色谱（RP-HPLC)制备，得到带鱼肝脏抗菌肽。
[002 4] ①大孔树脂除杂：将得到的超滤酶解物用双蒸水制成浓度为15 mg/mL溶液，以3 mL/min的流速加入到D201大孔树脂层析柱，用2倍柱体积的双蒸水洗脱除去杂质，然后用 5倍柱体积75%乙醇进行洗脱，洗脱液于50 °C以下低压旋蒸除去乙醇后，冷冻干燥得大孔 树脂制备酶解物。
[0025] ②凝胶过滤层析：将上述大孔树脂制备酶解物溶于三蒸水配成浓度为15 mg/ mL的溶液，经过葡聚糖凝胶G-25柱层析分离，用三蒸水进行洗脱，根据225 nm下的吸光 度曲线收集洗脱组分，其中，对大肠杆菌（ikcAericAia co/i)和巨大芽孢杆菌（ ?egaieriw?)抑制率最高组分为凝胶过滤层析酶解物Fr. C (图2)。
[0026] ③细胞膜色谱纯化：将上述凝胶过滤层析酶解物用三蒸水配成100 μ g/mL的溶 液，加入到细胞膜色谱柱进行纯化(条件：细胞膜为巨大芽孢杆菌?egaieriw?) 的细胞膜；进样量为15以1^细胞膜色谱柱（15〇111111\4.6111111，5^111);柱温为37°0;流动 相为三蒸水；紫外检测波长225 nm;流速为0.3 mL/min)，根据225 nm下的吸光度曲线收集 洗脱组分，其中，对大肠杆菌（AscAericAia co/i)和巨大芽抱杆菌 抑制率最高组分为细胞膜色谱纯化酶解物Fr. C-I (图3)。
[0027] ④RP-HPLC制备：将上述细胞膜色谱纯化酶解物用双蒸水配成100 μ g/mL的 溶液，利用RP-HPLC进行纯化(条件：进样量为20 μ L ;色谱柱为Zorbax C18 (250 mm X 4. 6mm，5 μ m);流动相为20%乙腈(含0. 1%三氟乙酸）；洗脱速度为0. 8 mL/min ;紫外 检测波长为225 nm)，根据对大肠杆菌co/i)和巨大芽孢杆菌（ifeciBws ?egaieriw?)抑制率得1个高活性抗菌肽（图4)。
[0028] ⑤结构测定：高活性抗菌肽经检测为单一峰，利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨 基酸序列为Lys-Val-Phe-Trp-Gly-Leu-His-Pro (KVFWGLHP)，ESI-MS检测分子量为983. 15 Da0
[0029] ⑥抑菌活性测定：如表1所示：抗菌肽Lys-Val-Phe-Trp-Gly-Leu-His-Pro (KVFWGLHP)对革兰氏阴性菌（G_)(大肠杆菌m7i)、荧光假单孢菌 (/?^饥绿胺杆菌饥和革兰氏阳性菌（G +) (金黄色葡萄球（巨大芽抱杆菌（你藤黄八 叠球菌（均有较强的抑制作用，具有广谱抑菌性，其中对0-菌抑菌效果总 体强于G+菌。
[0030] 表 1 抗菌肽 Lys-Val-Phe-Trp-Gly-Leu-His-Pro (KVFWGLHP)的抑菌谱（η = 3)
注：灭菌打孔器(直径=4mm)打孔，每孔加入抗菌液20 μ L ;表中数据为抑菌圈直径平 均值土标准差（η=3)。
[0031] 最后，尚需注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不 限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接 导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【主权项】
1. 带鱼肝脏抗菌肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 带鱼肝脏酶解物的制备：带鱼肝脏从冰冻带鱼中取出、解冻，用高速组织捣碎机匀 浆，然后按照固液比Ig:8~IOmL加入0. 02mol/L，pH6. 5~7. 5的磷酸盐缓冲液混匀， 并加热至20~30°C;在功率为900W，频率为30~50kHz超声波发生器内超声提取90~ 120min，按照肝脏质量的0. 3~0. 5%加入中性蛋白酶，于温度55~65°C下酶解6~8h， 10 000r/min离心25~30min，取上清液采用3kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小 于3kDa部分，冷冻干燥，得超滤酶解物； 2) 带鱼肝脏抗菌肽的制备：将制备的带鱼肝脏超滤酶解物依次经大孔树脂除杂、凝胶 过滤层析、细胞膜色谱纯化和反相高效液相色谱（RP-HPLC)制备，得到带鱼肝脏抗菌肽。2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤2)的大孔树脂除杂、凝胶过 滤层析、细胞膜色谱纯化和反相高效液相色谱（RP-HPLC)制备的具体过程为： 大孔树脂除杂：将得到的超滤酶解物用双蒸水制成浓度为10~15 mg/mL溶液，以2~ 3 mL/min的流速加入到D201大孔树脂层析柱，用2~3倍柱体积的双蒸水洗脱除去杂质， 然后用3~5倍柱体积75%乙醇进行洗脱，洗脱液于50 °C以下低压旋蒸除去乙醇后，冷冻 干燥得大孔树脂制备酶解物。3. 将上述大孔树脂制备酶解物溶于三蒸水配成浓度为10~15mg/mL的溶液，经过葡 聚糖凝胶G-25柱层析分离，用三蒸水进行洗脱，根据225nm下的吸光度曲线收集洗脱组 分，其中，对大肠杆菌（hcAericAiaco/i)和巨大芽抱杆菌抑制率 最高组分为凝胶过滤层析酶解物。4. 将上述凝胶过滤层析酶解物用三蒸水配成80~100yg/mL的溶液，加入到细胞膜 色谱柱进行纯化，根据225nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对大肠杆菌和巨大芽孢 杆菌抑制率最高组分为细胞膜色谱纯化酶解物。5. 将上述细胞膜色谱纯化酶解物用双蒸水配成80~100yg/mL的溶液，利用RP-HPLC 进行纯化得到高活性抗菌肽Lys-Val-Phe-Trp-Gly-Leu-His-Pro。6. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述细胞膜色谱条件为：细胞膜为巨 大芽孢杆菌（你ffiegateriys?)的细胞膜；进样量15~20yL;细胞膜色谱柱规格为 150mmX4.6mm，5ym;柱温为37 °C;流动相为三蒸水；紫外检测波长225nm;流速为 0? 3 ~0? 5ml,/min〇7. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述RP-HPLC条件为：进样量15~20 UL;色谱柱是规格为250mmX4. 6mm，5ym的ZorbaxC18 ;流动相为含0? 1%三氟乙酸 的20%乙腈；洗脱速度为0. 8~I. 0mL/min;紫外检测波长为225nm。
【专利摘要】本发明公开了一种带鱼肝脏抗菌肽的制备方法，该制备时以带鱼肝脏作为原料，经肝脏粗蛋白抽提、酶解、超滤和色谱制备，得抗菌肽。抗菌肽的氨基酸序列为Lys-Val-Phe-Trp-Gly-Leu-His-Pro，ESI-MS检测分子量为983.15Da。本发明制备的抗菌肽Lys-Val-Phe-Trp-Gly-Leu-His-Pro对革兰氏阴性菌、荧光假单孢菌、绿脓杆菌和革兰氏阳性菌、巨大芽孢杆菌、藤黄八叠球菌均有较强的抑制作用。
【IPC分类】C07K1/20, C07K1/34, C07K1/22
【公开号】CN104892723
【申请号】CN201510238562
【发明人】郁迪, 王斌, 迟长凤, 陈荫, 赵玉勤, 孙坤来
【申请人】浙江海洋学院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月12日
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